オートファジー促進遺伝子産物の変調によりオートファジーを変調する方法
本発明は、オートファジーの変調、並びに癌、神経変性疾患および膵炎を含むオートファジー関連疾患の治療のための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、ここにその全てを引用する、２００９年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２４７２５１号、および２００９年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２４７３０９号への優先権の恩恵を主張するものである。
【政府の支援】
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された助成第ＡＧ０１２８５９号および第ＡＧ０２７９１６号の下で政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、オートファジー阻害遺伝子産物の変調によりオートファジーを変調する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
オートファジーは、リソソーム依存様式で細胞内成分の代謝回転を媒介する異化プロセスである（非特許文献１）。オートファジーは隔離膜の形成によって開始される。この膜は、細胞質の一部分を飲み込むように拡大して、オートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞を形成する。次いで、オートファゴソームはリソソームと融合してオートリソソームを形成する。ここで、捕捉された物質および内側の膜はリソソーム加水分解酵素により分解される。したがって、オートファジーは、大きいタンパク質複合体および欠陥細胞小器官のクリアランスにとって重大であり、細胞増殖、生存およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。
【０００５】
オートファジーは、単細胞真核生物において主に研究されており、ここで、飢餓状態での生存にとって重大であることが知られている。単細胞真核生物が栄養飢餓条件下で培養される場合、アミノ酸、脂肪酸およびヌクレオチドなどのオートファジー分解の産生物が、構造成分として、かつエネルギー源として細胞により使用され得る（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
哺乳類などの複雑な多細胞真核生物における細胞は、正常な生理条件下では栄養飢餓をめったに経験しない。しかしながら、そのような細胞が栄養飢餓または細胞ストレスを経験すると、オートファジーがしばしばアップレギュレーションされ、これにより細胞の生存が向上する。それらの急激な増殖および遺伝的不安定性のために、癌細胞は、形質転換されていない細胞よりも、生存と増殖に関してオートファジーに一層依存する（非特許文献３）。さらに、オートファジーは、化学療法薬により生じる細胞ストレスに応答する癌細胞における生存機構としてしばしば活性化される。したがって、オートファジー阻害剤が、単独または他の癌治療との組合せのいずれかで、抗癌治療剤として働き得る（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００７】
細胞ストレスに応答する役割に加え、オートファジーは、機能不全の、加齢のまたは損傷したタンパク質および細胞小器官の代謝回転による細胞ホメオスタシスを維持するための重要な細胞内機構である（非特許文献２）。その結果、低減したレベルのオートファジーは、ミスフォールドタンパク質の蓄積を増加させることによって、神経変性に寄与する（非特許文献６；非特許文献７）。オートファジーのアップレギュレーションが、凝集タンパク質のレベルおよび神経変性疾患の症状の両方を減少させることが示されてきた（非特許文献８）。したがって、細胞オートファジーを促進させる作用物質(agent)が、神経変性疾患の予防または治療のための治療剤として働き得る。
【０００８】
癌および神経変性に加え、オートファジーの変調が、幅広い様々な追加の疾患および障害における治療戦略である。例えば、いくつかの肝疾患、心臓病および筋疾患が、ミスフォールドタンパク質凝集塊の蓄積に関連付けられている。そのような疾患において、細胞オートファジーを増加させる作用物質は、疾患発症凝集塊のクリアランスを向上させ、それによって、治療に寄与し、疾患の重症度が減少するであろう（非特許文献２）。その上、上昇したレベルのオートファジーも膵臓病において観察され、急性膵炎の経過の初期事象であることが示されてきた（非特許文献９）。したがって、オートファジーの阻害剤が、膵炎の治療における治療剤として機能するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Levine and Klionsky, (2004) Dev Cell 6, 463-377
【非特許文献２】Levine and Kroemer, (2008), Cell 132, 27-42
【非特許文献３】Ding et al., (2009), Mol. Cancer Ther., 8(7), 2036-2045
【非特許文献４】Maiuri et al., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752
【非特許文献５】Amaravadi et al., (2007) J. Clin. Invest. 117, 326-336
【非特許文献６】Hara et al., (2006), Nature, 441, 885-889
【非特許文献７】Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884
【非特許文献８】Rubinsztein et al., (2007), Nat. Rev. Drug Discov. 6, 304-312
【非特許文献９】Fortunato and Kroemer, (2009), Autophagy, 5(6)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、オートファジーの変調が幅広い疾患と障害の治療のための有用な手法であることを示す十分な証拠がある。しかしながら、哺乳類のオートファジーの調節を担う遺伝子および経路は不十分にしか理解されていないので、そのような疾患を治療するための新規の治療剤および方法の開発のための標的になり得る有効なオートファジー調節因子は数少ない。したがって、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規の方法が非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、オートファジーの変調、並びに癌、神経変性疾患、肝疾患、筋疾患および膵炎を含む、オートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を提供する。本発明の方法を特定するために、ヒトｓｉＲＮＡライブラリの高スループットの画像に基づく全ゲノムスクリーニングを使用して、２３６のオートファジー関連遺伝子を特定した。これらの遺伝子は、高スループットアッセイ、低スループットアッセイおよびバイオインフォマティクス解析の組合せを使用して、広範囲に亘って特徴付けた。これらの研究の結果に基づいて、これらの遺伝子およびその遺伝子産物の変調に有用な生物剤および治療剤を特定し、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を開発した。
【００１２】
いくつかの実施の形態において、本発明は、細胞におけるオートファジーを誘発する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。ある実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGFである。本発明のある態様において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。他の態様において、作用物質は、TK1258, PF 04494700, PMX53, タムスロシン、ドキサゾシン、塩酸プラゾシン、塩酸アルフゾシン、ウロテンシンII、塩酸メカミラミン、ISIS 3521、ゲムシタビン、LY900003, MK-5108, U73122またはD609である。
【００１３】
本発明のある実施の形態は、細胞におけるオートファジーを阻害する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。
【００１４】
ある態様において、本発明は、細胞におけるオートファジーを阻害する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGFである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。いくつかの実施の形態において、作用物質は、FGF-1, 酸性FGF-1, XRP0038, RhaFGF, GW501516, メシル酸イブタモレン, KP-102LN, EP1572, TRH, S-0373, Poly-ICR, CQ-07001またはクリプトタンシノンである。いくつかの実施の形態において、作用物質は成長因子である。他の実施の形態において、成長因子は、CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGF1である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施の形態は、細胞におけるオートファジーを誘発する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。
【００１６】
いくつかの実施の形態において、本発明は、対象(subject)における神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質を投与する工程を含む方法に関する。ある実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, SDF1, LIF, FGF2またはIGFである。いくつかの実施の形態において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。他の態様において、作用物質は、TK1258, PF 04494700, PMX53, タムスロシン、ドキサゾシン、塩酸プラゾシン、塩酸アルフゾシン、ウロテンシンII、塩酸メカミラミン、ISIS 3521、ゲムシタビン、LY900003, MK-5108, U73122またはD609である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施の形態は、本発明は、対象における神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。
【００１８】
ある実施の形態において、神経変性疾患は、副腎白質萎縮症、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症、カナバン病、脳性小児まひ、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドオフ病、シルダー病、悪性貧血の次の脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、中毒性脳症およびこれらの疾患の併発である。いくつかの実施の形態において、タンパク質症は、α１−アンチトリプシン欠乏症、孤発性封入体筋炎、２Ｂ型肢体型筋ジストロフィー症および三好型ミオパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、球脊髄性筋萎縮症およびこれらの疾患の併発である。
【００１９】
本発明のある実施の形態は、対象の癌または膵炎を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質を投与する工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。
【００２０】
ある態様において、本発明は、対象の癌または膵炎を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, SDF1, LIF, FGF2またはIGFである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。いくつかの実施の形態において、作用物質は、FGF-1, 酸性FGF-1, XRP0038, RhaFGF, GW501516, メシル酸イブタモレン, KP-102LN, EP1572, TRH, S-0373, Poly-ICR, CQ-07001またはクリプトタンシノンである。いくつかの実施の形態において、作用物質は成長因子である。他の実施の形態において、成長因子は、CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGF1である。
【００２１】
いくつかの実施の形態において、癌を治療する方法は、化学療法薬の投与および／または放射線療法などの公知の癌治療法をさらに含む。ある実施の形態において、化学療法薬は、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、２−クロロデオキシアデノシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、イミダゾールカルボキサミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン−ダウノマイシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルダラビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンαｎ３、イリノテカン、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メゲストロール、メルファラン、Ｌ−サルコシリン(sarcosylin)、メルファラン塩酸塩、ＭＥＳＮＡ、メクロレタミン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、メルカプトプリン、パクリタキセル、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、または酒石酸ビレノルビンである。
【００２２】
本発明の他の実施の形態は、作用物質がオートファジー阻害剤であるか否かを決定する方法であって、細胞を作用物質に接触させる工程を有してなり、細胞が本発明の異種(heterologous)オートファジー促進遺伝子を発現し、それによって、細胞におけるオートファジーの低減が、その作用物質がオートファジー阻害剤であることを示す方法に関する。ある態様において、作用物質は、小分子、抗体、または抑制性ＲＮＡ分子である。
【００２３】
本発明のある実施の形態は、作用物質がオートファジー阻害剤であるか否かを決定する方法であって、細胞を作用物質に接触させる工程を有してなり、本発明のオートファジー促進遺伝子の発現が細胞中で阻害され、それによって、細胞中のオートファジーの低減が、その作用物質がオートファジー阻害剤であることを示す方法に関する。ある態様において、作用物質は、小分子、抗体、または阻害性ＲＮＡ分子である。いくつかの実施の形態において、細胞は、オートファジー関連遺伝子に対する突然変異を含む。他の実施の形態において、オートファジー関連遺伝子は、抑制性ＲＮＡまたは小分子により阻害される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａは、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたＧＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。図１Ｂは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞の溶解物およびＬＣ３またはチューブリンいずれかに特異的な抗体を使用して行ったウェスタンブロットの結果を示す。
【図２】図２は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図３−１】図３は、本発明のオートファジー変調遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図３−２】図３−１の続き
【図３−３】図３−２の続き
【図３−４】図３−３の続き
【図３−５】図３−４の続き
【図３−６】図３−５の続き
【図３−７】図３−６の続き
【図４】図４は、本発明のオートファジー変調遺伝子を特定し、特徴付けるために使用したスクリーニングおよび特徴付けアッセイの選択を示す説明図を示す。
【図５】ｍＴＯＲＣ１活性を測定する一連のｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）ブロットアッセイの数量化を示す。アスタリスクは、表示のサンプルとｎｔＲＮＡ対照サンプルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図６】図６は、その産物の阻害がｍＴＯＲＣの発現の減少をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図７】図７は、その産物の阻害が、ラパマイシンの存在下でｍＴＯＲＣの低減した発現およびオートファジーのダウンレギュレーションの両方をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図８】図８Ａは、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたＲＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。図８Ｂは、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＲＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図９−１】図９は、その産物の阻害がＬａｍｐ１−ＲＦＰ発現細胞中のオートファゴソーム関連Ｌａｍｐ１−ＲＦＰのレベルにおける著しい変化をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図９−２】図９−１の続き
【図９−３】図９−２の続き
【図１０】図１０Ａは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、Ｖｐｒｓ３４またはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたｄｓＲｅｄの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。図１０Ｂは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、Ｖｐｒｓ３４またはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図１０Ｃは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、ＲａｐｔｏｒまたはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。
【図１１−１】図１１は、その産物の阻害がＰｔｄＩｎｓ３Ｐのレベルにおける著しい変化をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図１１−２】図１１−１の続き
【図１１−３】図１１−２の続き
【図１１−４】図１１−３の続き
【図１２】図１２は、その産物の阻害がオートファジーの誘導をもたらす遺伝子の、III型ＰＩ３キナーゼ活性、リソソーム機能およびｍＴＯＲＣ１活性への依存性に基づく機能別カテゴリーへの細分を示すベン図を示す。
【図１３】図１３は、ｓｉＲＮＡ（Ｈ４＋Ｂｃｌ−２）を標的とするオートファジー関連遺伝子がトランスフェクションされたＢｃｌ−２発現Ｈ４細胞と比べた、ｓｉＲＮＡ（Ｈ４）を標的とするオートファジー関連遺伝子がトランスフェクションされた野生型Ｈ４細胞の相対的平均生存率を示す。
【図１４−１】図１４は、その産物の阻害がＢｃｌ−２発現細胞におけるオートファジーの促進をもたらす遺伝子の相対生存率、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図１４−２】図１４−１の続き
【図１４−３】図１４−２の続き
【図１５−１】図１５は、その産物の阻害が、Ｂｃｌ−２発現細胞ではなく、野生型細胞におけるオートファジーの促進をもたらす遺伝子の相対生存率、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図１５−２】図１５−１の続き
【図１５−３】図１５−２の続き
【図１５−４】図１５−３の続き
【図１６】図１６は、ツニカマイシンにより処理されたＨ４細胞中のＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４のレベルの増加を示す「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイの数量化を示す。アスタリスクは統計的有意を示す。
【図１７】図１７は、その産物の阻害が、オートファジーの向上および小胞体（ＥＲ）ストレスレベルにおける変化をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図１８】図１８は、ｐＢａｂｅ−Ｂｃｌ−２レトロウイルスへの感染およびプロマイシンの選択後のＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰおよびＨ４ ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ細胞におけるＢｃｌ−２発現を示すウェスタンブロットを示す。
【図１９】図１９Ａは、ＬＣ３−ＧＦＰおよびＢｃｌ−２を安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図１９Ｂは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄおよびＢｃｌ−２を安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図１９Ｃは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、Ｂｃｌ−２（Ｈ４）も発現せず、Ｂｃｌ−２（Ｈ４＋Ｂｃｌ−２）も発現しないオートファジー関連遺伝子産物に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルの間の差が統計的有意であることを示す。
【図２０】図２０は、そのノックダウンが、低ＰｔｄＩｎｓ３Ｐの条件下でオートファジーを誘発することができたオートファジー関連遺伝子の、III型ＰＩ３キナーゼ活性をアップレギュレーションするまたはリソソーム機能を変更する能力に基づく機能的カテゴリーへの細分を示す。
【図２１】図２１Ａは、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのように特定のタンパク質複合体に関連付けられるかを示す。図２１Ｂは、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのように転写調節因子およびクロマチン修飾酵素のネットワークに関連付けられるかを示す。
【図２２】図２２は、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのようにコアのオートファジー機構と相互作用するかを示す。
【図２３】図２３は、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのように軸索誘導調節経路内で相互作用するかを示す。
【図２４】図２４は、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのようにアクチン細胞骨格調節経路内で相互作用するかを示す。
【図２５】図２５Ａは、本発明のオートファジー関連遺伝子の分子機能別カテゴリーへの細分を示す。図２５Ｂは、図２５Ａにおいて受容体と分類された本発明のオートファジー関連遺伝子の受容体別カテゴリーへのさらなる細分を示す。
【図２６−１】図２６は、本発明のオートファジー関連遺伝子の分子機能別カテゴリー、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図２６−２】図２６−１の続き
【図２６−３】図２６−２の続き
【図２６−４】図２６−３の続き
【図２６−５】図２６−４の続き
【図２６−６】図２６−５の続き
【図２６−７】図２６−６の続き
【図２６−８】図２６−７の続き
【図２７】図２７Ａは、本発明のオートファジー関連遺伝子の生物学的プロセス別カテゴリーへの細分を示す。図２７Ｂは、図２７Ａにおけるシグナル伝達のメディエータとして分類された本発明のオートファジー関連遺伝子のシグナル伝達別カテゴリーへのさらなる細分を示す。
【図２８】図２８は、示された成長因子（ＩＧＦ１、ＦＧＦ２、ＬＩＦ、ＣＬＣＦ１およびＳＤＦ１）の存在下で増殖したＨ４ ＣＬ３−ＧＦＰ細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルと未処理細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図２９】図２９は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、栄養飢餓条件下で未処理の（未処理）、通常の(normal)増殖条件下で未処理の（血清）、または栄養飢餓条件下でＣＬＣＦ１、ＬＩＦ、ＦＧＦ２またはＩＧＦ１で処理した（それぞれ、ＣＬＣＦ１、ＬＩＦ、ＦＧＦ２およびＩＧＦ１）Ｈ４細胞中で発現されたＧＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。
【図３０】図３０は、サイトカインが、ラパマイシンの不在下と存在下でオートファジーを抑制できることを示す。Ｈ４細胞を無血清培地中で増殖させ、その後、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＧ１（Ａ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｂ）、５０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦ（Ｃ）、５０ｎｇ／ｍＬのＣＬＣＦ１（Ｄ）または１０μｇ／ｍＬのＥ６４ｄ（Ｅ）を添加した。示された場合、サイトカインの添加前に、細胞を１時間に亘り５０ｎＭのラパマイシンで前処理した。オートファジーのレベルは、ＬＣ３に対する抗体を使用してウェスタンブロットにより評価した；ｍＴＯＲＣ１活性は、ホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６、Ｐ−Ｓ６）およびホスホ−Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９、Ｐ−Ｓ６Ｋ）に対する抗体により評価した。ＬＣ３ ＩＩ／チューブリン比の数量化が示されている。
【図３１】図３１Ａは、５、２０、１００または２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαの存在下またはラパマイシンの存在下で増殖したＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルと未処理細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図３１Ｂは、栄養飢餓条件下で未処理の（−）、通常の増殖条件下で未処理の（血清）、ラパマイシンで処理された（Ｒａｐ）、または栄養飢餓条件下で５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理されたＨ４細胞中のｐ６２のレベルを示すウェスタンブロットを示す。
【図３２】図３２は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたＧＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。
【図３３】図３３は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＲＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルとｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図３４】図３４Ａは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡの内の１つがトランスフェクションされたＨ４細胞中のＲｅｌＡ ｍＲＮＡのレベルを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図３４Ｂは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）、ＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡの内の１つ、または４つのＲｅｌＡ特異的ｓｉＲＮＡのプールがトランスフェクションされたＨ４細胞中のｐ６５のレベルを検出するウェスタンブロットの結果を示している。
【図３５】図３５Ａは、野生型（ｗｔ）Ｈ４細胞並びにＲｅｌＡ-/-およびＮＦκＢ-/-ダブルノックアウト（ＤＫＯ）Ｈ４細胞中のＲｅｌＡおよびＬＣ３のレベルを示すウェスタンブロットを示す。図３５Ｂは、ＲｅｌＡに特異的なｓｉＲＮＡ、非標的ｓｉＲＮＡ（ｎｔ）、ｍＴまたはＡｔｇ５がトランスフェクションされたＨ４細胞中のＲｅｌＡ、ｐ６２およびＬＣ３のレベルを示すウェスタンブロットを示す。
【図３６】図３６Ａは、通常の増殖条件下（ｍｏｃｋ）および栄養飢餓条件下（飢餓）での野生型Ｈ４細胞並びにＲｅｌＡ-/-およびＮＦκＢ-/-ダブルノックアウト（ＤＫＯ）Ｈ４細胞中の反応性酸素種のレベルを示すＦＡＣＳヒストグラムを示す。図３６Ｂは、図３６Ａに示されたデータの数量化を示す。図３６Ｃは、通常（＋血清）または飢餓（ＨＢＳＳ）条件下で増殖した、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中の反応性酸素種のレベルの数量化を示す。
【図３７】図３７は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、栄養飢餓条件下で、酸化防止剤存在下（ＮＡＣ）または酸化防止剤の不在下で増殖した、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。
【図３８】図３８は、その産物がミトコンドリアに局在化されることが予測される本発明のオートファジー関連遺伝子に関する、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および予測理由を示す。
【図３９−１】図３９は、酸化的損傷または反応性酸素種の調節に対する関連が知られている、本発明のオートファジー関連遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および名称を示す。
【図３９−２】図３９−１の続き
【図３９−３】図３９−２の続き
【図４０】図４０Ａは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のＳＯＤ１、ｐ６２およびＬＣ３のレベルを示すウェスタンブロットを示す。図４０Ｂは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされた、もしくは１００ｍＭのＴＢＨＰにより処理された細胞中の反応性酸素種のレベルを示す蛍光顕微鏡画像を示す。図４０Ｃは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔ）またはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされた細胞中の反応性酸素種のレベルの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルとｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図４１】ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、酸化防止剤の存在下（ＮＡＣ）または酸化防止剤の不在下（−）いずれかで、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。
【図４２−１】図４２は、その産物の阻害により、酸化防止剤の存在下ではなく不在下でオートファジーの促進がもたらされる遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および名称を示す。
【図４２−２】図４２−１の続き
【図４２−３】図４２−２の続き
【図４２−４】図４２−３の続き
【図４３】図４３は、酸化防止剤の存在下（ＮＡＣ）でオートファジーを誘発できる（ｙｅｓ）またはできない（ｎｏ）本発明のオートファジー関連遺伝子の産物の阻害後の平均のIII型ＰＩ３キナーゼ活性の数量化を示す。
【図４４−１】図４４は、その産物の阻害が、酸化防止剤の存在下でオートファジーの向上をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および名称を示す。
【図４４−２】図４４−１の続き
【図４４−３】図４４−２の続き
【図４５】図４５は、スクリーニングにおいて調査した全ての遺伝子に対するヒット(hit)遺伝子の中での標準経路（ＭＳｉｇＤＢ）のＥＡ法(enrichment analysis)を示す。ｐ値＜０．０５（超幾何分布）が有意であると考えられる。少なくとも５つの遺伝子を有するカテゴリーのみが示されている。
【図４６】図４６は、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２によるオートファジーのダウンレギュレーションが、ＭＥＫ阻害因子ＵＯ１２６の添加により妨げられることを示す。Ｈ４細胞は、無血清培地中で増殖させ、１０μｇ／ｍＬのＥ６４ｄの存在下で、ＬＣ３に対する抗体、ホスホ−ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＲＳＫおよびホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）に関するＭＥＫの阻害について、オートファジーのレベルを評価した。ＬＣ３ＩＩ／チューブリン比の数量化が示されている。
【図４７】図４７は、ＭＳｉｇＤＢからのモチーフに基づく遺伝子セットおよびＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースに定義されたＴＦ−結合部位を使用して、ヒット遺伝子のプロモータ中のシスエレメント／転写因子（ＴＦ）−結合部位のＥＡ法を示す。ＳＲＦ部位が強調されている。
【図４８】図４８は、５０ｎｇ／ｍＬのＣＬＣＦ１による処理後のＳｔａｔ３のリン酸化を示すウェスタンブロットを示す。
【図４９】図４９は、５０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦによるオートファジーのダウンレギュレーションが、Ｓｔａｔ３のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンにより妨げられることを示す。Ｈ４細胞に表示のｓｉＲＮＡを７２時間に亘りトランスフェクションし、次いで、細胞を、図４６について記載したように処理した。タンパク質レベルおよびＳｔａｔ３のリン酸化が示されている。
【図５０】図５０は、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１によるオートファジーの抑制が、Ａｋｔ阻害因子ＶＩＩＩにより妨げられることを示す。細胞を図４６について記載したように処理した。Ａｋｔ活性を、ホスホ−Ｆｏｘｏ３ａおよびホスホ−ｒｐＳ６に対する抗体について評価した。
【図５１】図５１は、若年（４０才以下）または老年（７０才以上）のヒトの脳のサンプルにおける選択されたオートファジーヒット遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルのクラスター分析を示す。
【図５２】図５２は、図４５に示されたデータに関する相関行列を示す。
【図５３】図５３は、若年（４０才以下）または老年（７０才以上）のヒトの脳のサンプルにおける選択されたオートファジーヒット遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルのクラスター分析（ｄＣｈｉｐ）を示す。
【図５４】図５４は、年齢依存性調節が最も著しい、本発明のオートファジー関連遺伝子に関する相関行列を示す。
【図５５−１】図５５は、老化中にヒトの脳において特異に調節される本発明のオートファジー関連遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、倍率変化およびｐ値を示す。
【図５５−２】図５５−１の続き
【図５６】図５６は、老化中の本発明のオートファジー関連遺伝子の発現レベルを示す。
【図５７】図５７は、特異な遺伝子発現によりアルツハイマー病におけるオートファジーのアップレギュレーションがもたらされることを示す。スクリーンニングヒット遺伝子セットに関する標準偏差と共にNormarized Enrichment Score（ＮＥＳ）推定値のフォレスト・プロットが示されている。図５７Ａは、影響を受けていない同年齢の対照と比べたＡＤ脳の異なる領域における全体のスクリーニングヒット遺伝子発現のＧＳＥＡ解析を示す。図５７Ｂおよび５７Ｃは、オートファジーフラックス(flux)の陰性（Ｂ）および陽性（Ｃ）調節因子として機能することが決定されたヒット遺伝子のＧＳＥＡ解析を示す。正方形のサイズは、それぞれのＳＤに反比例する。
【図５８】図５８は、Ｈ４細胞の５μＭのＡβによる処理後の１０μＭのＥ６４ｄの存在下と不在下でのＬＣ３−ＩＩの蓄積のレベルの比較を示す。
【図５９】図５９は、ＡβがＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積を誘発することを示す。ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ細胞を図５８に記載したように調製し、固定化し、画像化した。示された場合、III型ＰＩ３キナーゼ阻害因子３ＭＡ（１０ｍＭ）を、固定化前に８時間に亘り加えた。
【図６０】図６０は、ＡβによるIII型ＰＩ３キナーゼ活性の誘発が、酸化防止剤の存在下で抑制されることを示す。細胞を、図５９に記載したように調製し、酸化防止剤ＮＡＣの存在下または不在下で処理した。
【図６１】図６１は、Ａβによるオートファジーの誘発が、III型ＰＩ３キナーゼ活性に依存することを示す。Ｈ４ＧＦＰ−ＬＣ３細胞を、図５９に記載したように処理し、画像化した。
【図６２】図６２は、Ａβによるオートファジーの誘発が、III型ＰＩ３キナーゼ活性に依存することを示す。Ｈ４細胞に、III型ＰＩ３キナーゼサブユニットＶｐｓ３４に対するｓｉＲＮＡまたは非標的の対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、次いで、図５９に記載したように処理した。それぞれ、ＬＣ３およびＬａｍｐ２に対する抗体を使用して、オートファジーおよびリソソーム変化を決定した。
【図６３−１】図６３は、本発明のオートファジー関連遺伝子の活性を変調させる選択された小分子作用物質の化学構造を示す。
【図６３−２】図６３−１の続き
【図６３−３】図６３−２の続き
【図６３−４】図６３−３の続き
【図６３−５】図６３−４の続き
【図６４】本発明のオートファジー関連遺伝子のＧｅｎｂａｎｋ登録番号、名称、遺伝子記号およびｍＲＮＡ配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
オートファジーは、細胞成分の代謝回転を媒介し、幅広い疾患から多細胞真核生物を保護するリソソーム依存性代謝プロセスである。オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規な方法を開発するために、ヒトのｓｉＲＮＡライブラリの高スループットの画像に基づく全ゲノムスクリーニングを行って、オートファジー変調および調節に関与する遺伝子を特定した。このスクリーニングにより、ノックダウンされたときに、通常の栄養条件下でオートファジーのレベルの増加または減少のいずれかをもたらした２３６のオートファジー関連遺伝子を特定した。本発明のオートファジー関連遺伝子が図３に列記されている。これらの遺伝子を、高スループットアッセイ、低スループットアッセイおよびバイオインフォマティクス解析の組合せを使用して、広範囲に亘って特徴付けた。これらの研究の結果に基づいて、これらの遺伝子およびその遺伝子産物の変調に有用な生物剤および治療剤を特定し、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を特定した。したがって、本発明は、オートファジーの変調、並びに癌、神経変性疾患、肝疾患、筋疾患および膵炎を含む、オートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を提供する。
【００２６】
１． 定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語および語句を以下、明細書に亘り定義する。
【００２７】
単数形は、物品の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を意味するためにここに用いられる。一例として、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００２８】
ここに用いたように、「投与する(administering)」という用語は、対象に治療剤または組成物を提供することを意味し、以下に限られないが、医療専門家による投与および自己投与を含む。
【００２９】
ここに用いたように、「作用物質(agent)」という用語は、対象または細胞に所望の生物学的作用を及ぼすことのできる実体を称する。様々な治療剤(therapeutic agent)が、当該技術分野において公知であり、その作用により特定されるであろう。生物学的起源の治療剤の例としては、成長因子、ホルモン、およびサイトカインが挙げられる。様々な治療剤が、当該技術分野において公知であり、その作用により特定されるであろう。その例としては、小分子（例えば、薬剤）、抗体、ペプチド、タンパク質（例えば、サイトカイン、ホルモン、可溶性受容体および非特異的タンパク質）、オリゴヌクレオチド（例えば、ペプチドコード化ＤＮＡおよびＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ）およびペプチドミメティクスが挙げられる。
【００３０】
ここに用いたように、「抗体」という用語は、全長の抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または一本鎖を含む。「抗体」という用語は、以下に限られないが、ジスルフィド結合により相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を含む。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく；異種、同種、または同系であってよく；またはその修飾形態（例えば、ヒト化、キメラ）であってもよい。
【００３１】
ここに用いたように、抗体の「抗原結合タンパク質」という語句は、抗原に特異的に結合する能力を維持する抗体の１つ以上の断片を称する。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片により行うことができる。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶH、ＶL、ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶHおよびＣＨ１領域からなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶHおよびＶL領域からなるＦｖ断片；（ｖ）ＶH領域からなる、ｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544 546）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）合成リンカーにより必要に応じて結合してよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ；が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つの領域ＶHおよびＶLは、別々の遺伝子によりコード化されているが、それらは、組換え方法を使用して、ＶHおよびＶL領域が対になって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423 426; および Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883を参照のこと）を形成する１つのタンパク質鎖としてそれらを作製することのできる合成リンカーによって、結合することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」の用語に包含されることが意図されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、その断片は、完全な抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００３２】
ここに用いたように、「癌」という用語は、以下に限られないが、固形腫瘍および血液性腫瘍を含む。癌という用語は、皮膚、組織、器官、骨、軟骨組織、血液および体内の管の疾患を含む。「癌」という用語はさらに、原発性癌および転移性癌の両方を包含する。
【００３３】
ここに用いたように、「遺伝子産物」および「遺伝子の産物」という用語は、遺伝子によりコード化され、遺伝子の転写により、直接的または間接的いずれかで産生され得る物質を称する。「遺伝子産物」および「遺伝子の産物」という用語は、ＲＮＡ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ遺伝子産物（例えば、ｃＤＮＡ）およびポリペプチド遺伝子産物（例えば、タンパク質）を含む。
【００３４】
ここに用いたように、遺伝子産物の「活性を向上させる」という語句は、遺伝子産物に関連する特定の活性の増加を称する。向上した活性の例としては、以下に限られないが、ｍＲＮＡの増加した翻訳、ポリペプチドまたはタンパク質による増加したシグナル伝達および酵素による増加した触媒作用が挙げられる。活性の向上は、例えば、個々の遺伝子産物により生じる活性の増加量により、その活性を生じる遺伝子産物の増加した数により、またはその任意の組合せにより、起こり得る。遺伝子産物が生物学的プロセス（例えば、オートファジー）を向上させる場合、そのような遺伝子産物の「活性を向上させる」ことは、一般に、そのプロセスを向上させる。逆に、遺伝子産物が生物学的プロセスの阻害因子として働く場合、そのような遺伝子産物の「活性を向上させる」ことは、一般に、そのプロセスを阻害する。
【００３５】
ここに用いたように、遺伝子産物の「活性を阻害する」という語句は、その遺伝子産物に関連する特定の活性の減少を称する。阻害される活性の例としては、以下に限られないが、ｍＲＮＡの減少した翻訳、ポリペプチドまたはタンパク質による減少したシグナル伝達および酵素による減少した触媒作用が挙げられる。活性の阻害は、例えば、個々の遺伝子産物により生じる減少した量の活性により、活性を生じる遺伝子産物の減少した数により、またはそれらの任意の組合せにより、起こり得る。遺伝子産物が生物学的プロセスを向上させる場合、そのような遺伝子産物の「活性の阻害」は、一般に、そのプロセスを阻害する。逆に、遺伝子産物が生物学的プロセスの阻害因子として機能する場合、そのような遺伝子産物の「活性の阻害」は、一般に、そのプロセスを促進させる。
【００３６】
ここに用いたように、「単離された」という用語は、物質（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）が、自然環境またはそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）において、それらと共に見つかる他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの、それらが天然に関連している物質を含まないまたは実質的に含まない状態を称する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、希釈剤またはアジュバントを配合しても差し支えなく、それでも、「単離されている」と考えられる。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または治療に使用するときに、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合して差し支えない。
【００３７】
ここに用いたように、「変調」という用語は、生物活性のアップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激）、ダウンレギュレーション（すなわち、阻害または抑制）、もしくはそれら２つの組合せまたは別々を称する。
【００３８】
ここに用いたように、「神経変性疾患 」および「神経変性疾病」という語句は、神経病理学などの中枢および末梢神経系の幅広い疾病および／または疾患を称し、以下に限られないが、パーキンソン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脱神経性萎縮、耳硬化症、脳梗塞、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連する脳障害、並びに神経性細胞毒性および細胞死に関連する他の疾病を含む。
【００３９】
ここに用いたように、「薬学的に許容される」という語句は、有効な医学判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または妥当なリスク便益比に相応の他の問題および合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した作用物質、化合物、材料、組成物、および／または投与形態を称する。
【００４０】
ここに用いたように、「薬学的に許容される担体」という語句は、作用物質をある器官または体の部分から別の器官または体の部分に運ぶまたは輸送するのに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒被包材料などの、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、配合物の他の成分と相溶性であり、患者にとって有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として働ける材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスルロースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）カカオバターおよび座薬ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンガ溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物、および（２２）薬剤配合物中に使用される他の非毒性相溶性物質が挙げられる。
【００４１】
ここに用いたように、「薬学的に許容される塩」という語句は、化合物の比較的非毒性の無機および有機塩を称する。
【００４２】
ここに用いたように、「対象」という用語は、治療または療法のために選択されたヒトまたはヒトではない動物を意味する。
【００４３】
ここに用いたように、「有することが疑われる対象」という語句は、疾病またはよくない健康状態の１つ以上の臨床的指標を示す対象を意味する。ある実施の形態において、その疾病またはよくない健康状態は、癌、神経変性疾患または膵炎である。
【００４４】
ここに用いたように、「その必要のある対象」という語句は、本発明の療法または治療を必要としていると認定された対象を意味する。
【００４５】
ここに用いたように、「治療効果」という語句は、作用物質により生じる、動物、特に哺乳類、とりわけヒトにおける局所効果または全身的な効果を称する。「治療に効果的な量」および「効果的な量」という語句は、少なくとも細胞の部分的個体群においてある程度所望の効果を生じる作用物質の量を意味する。治療に効果的な量は、任意の治療に適用できる妥当なリスク便益比である程度の所望の局所効果または全身的な効果を生じる作用物質の量を含む。例えば、本発明の方法に使用される特定の作用物質は、そのような治療に適用できる妥当なリスク便益比を生じるのに十分な量で投与してよい。
【００４６】
ここに用いたように、対象における疾病を「治療する」もしくは疾病を有するまたは有すると疑われる対象を「治療する」という用語は、疾病の少なくとも１つの症状が軽減される、または悪化するのが防がれるように、対象に、薬品治療を施す、例えば、作用物質を投与することを称する。
【００４７】
２． オートファジー関連遺伝子
本発明のオートファジー関連遺伝子は、その産物がオートファジーを阻害する遺伝子（すなわち、表１に列記されたオートファジー阻害遺伝子）およびその産物がオートファジーを促進させる遺伝子（すなわち、表２に列記されたオートファジー促進遺伝子）に分類できる。
【００４８】
オートファジー阻害遺伝子の産物の活性を変調する作用物質が、オートファジー関連疾病の治療において有用である。オートファジー阻害遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質は、上昇したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを促進する方法、並びに神経変性疾患およびタンパク質症などの、オートファジーの上昇したレベルに応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。他方で、オートファジー阻害遺伝子の産物の活性を促進する作用物質は、減少したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを阻害する方法、並びに癌および膵炎などの、オートファジーの阻害に応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【００４９】
オートファジー促進遺伝子の産物の活性を変調する作用物質も、オートファジー関連疾病の治療において有用である。例えば、オートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質は、減少したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを阻害する方法、並びに癌および膵炎などの、オートファジーの阻害に応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。オートファジー促進遺伝子の産物の活性を促進する作用物質は、上昇したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを促進する方法、並びに神経変性疾患およびタンパク質症などの、オートファジーの上昇したレベルに応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。
【表２】
【００５０】
それゆえ、本発明のある実施の形態は、表１に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性化の阻害により、または表２に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の向上により、オートファジーを促進させるおよび／または神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法に関する。本発明の他の実施の形態は、表１に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性の向上により、または表２に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の阻害により、オートファジーを阻害するおよび／または癌または膵炎を治療する方法に関する。
【００５１】
本発明の他の実施の形態は、表３に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性の阻害により、または表４に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の向上により、オートファジーを促進させるおよび／または神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法に関する。本発明の他の実施の形態は、表３に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性の向上により、または表４に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の阻害により、オートファジーを阻害するおよび／または癌または膵炎を治療する方法に関する。
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表４】
【００５２】
本発明のオートファジー関連遺伝子の産物は、数多くの相互排他的ではない部類に分類できる。例えば、本発明のある遺伝子産物は、酸化還元酵素、受容体、プロテアーゼ、リガーゼ、キナーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、シャペロン、加水分解酵素、膜交通タンパク質(membrane traffic proteins)、カルシウム結合タンパク質および／または調節分子と分類できる。選択されたオートファジー阻害遺伝子産物の分類が表５に列記されており、一方で、選択されたオートファジー促進遺伝子産物の分類が表６に列記されている。あるタイプの作用物質が、特定の部類の遺伝子産物の活性の変調により適しているが、いくつかの実施の形態において、本発明は、オートファジー関連遺伝子産物の１つ以上の部類の変調に関する。
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【表５−４】
【表５−５】
【表５−６】
【表６】
【００５３】
３． オートファジー関連遺伝子産物の変調物質(modulators)
本発明のある実施の形態は、オートファジーを変調するまたはオートファジー関連疾病（例えば、神経変性疾患、肝疾患、心臓病、癌、膵炎）を治療する方法に関する。これらの方法は、本発明の１種類以上のオートファジー関連遺伝子産物の活性を変調する作用物質を投与する工程を含む。ある実施の形態において、本発明の方法は、対象に、表１〜４に列記された遺伝子の１種類以上の産物の活性を減少させる作用物質を投与することによる、オートファジー関連疾病の治療を含む。他の実施の形態において、本発明の方法は、対象に、表１〜４に列記された遺伝子の１種類以上の産物の活性を増加させる作用物質を投与することによる、オートファジー関連疾病の治療を含む。表１〜４に列記された遺伝子産物の活性を変調し、それにより、オートファジー関連疾病を治療するまたは予防するのに使用してよい作用物質としては、抗体（例えば、結合(conjugated)抗体）、タンパク質、ペプチド、小分子、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５４】
本発明のある方法を実施するために、本発明のオートファジー関連遺伝子産物の活性を変調するどのような作用物質を使用しても差し支えない。そのような作用物質は、ここに記載されたもの、当該技術分野に公知のもの、または決まりきったスクリーニングアッセイ（例えば、ここに記載されたスクリーニングアッセイ）により特定されたものであって差し支えない。
【００５５】
いくつかの実施の形態において、本発明の方法に有用な作用物質を特定するために使用されるアッセイは、オートファジー関連遺伝子産物と１種類以上のアッセイ成分との反応を含む。他の成分は、試験化合物（例えば、潜在的な作用物質）、または試験化合物とオートファジー関連遺伝子産物の天然の結合パートナーとの組合せのいずれであってもよい。ここに記載されたものなどのそのようなアッセイにより特定された作用物質は、例えば、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾病の治療のために有用であろう。
【００５６】
本発明の方法に有用な作用物質は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリを含む、どのような入手可能な供給源から得てもよい。作用物質は、生物学的ライブラリ；ペプチドライブラリ（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に対して耐性であるが、それにもかかわらず生物活性のままである新規の非ペプチド主鎖を有する分子のライブラリ；例えば、Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85を参照）；空間的にアドレス可能な並列固相または溶液相ライブラリ；デコンボリューションを要する合成ライブラリ法；「１ビーズ−１化合物」ライブラリ法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ法を含めた当該技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法の中の多数の手法のうちのいずれにより得てもよい。生物学的ライブラリおよびペプチドライブラリの手法は、ペプチドライブラリに限られるが、その他の４つの手法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリに適用することができる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。
【００５７】
分子ライブラリの合成に関する方法の例は、当該技術分野、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; および in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見出すことができる。
【００５８】
作用物質のライブラリは、溶液中（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421）、ビーズ上（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ上（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌および／または胞子上（Ladner、米国特許第5,223,409号明細書）、プラスミド上（Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）、またはファージ上（Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, 前出）に提示されるであろう。
【００５９】
本発明の方法において有用な作用物質は、例えば、本発明のオートファジー関連遺伝子産物またはその生物学的活性部分の担体である候補すなわち試験化合物をスクリーニングするアッセイを使用して特定してもよい。別の実施の形態において、本発明の方法において有用な作用物質は、本発明のオートファジー関連遺伝子産物またはその生物学的活性部分に結合する候補すなわち試験化合物をスクリーニングするアッセイを使用して特定してもよい。オートファジー関連遺伝子産物に直接結合する試験化合物の能力を決定することは、例えば、その化合物のオートファジー関連遺伝子産物との結合が、複合体における標識された化合物を検出することにより決定できるように化合物を放射性同位体または酵素標識に結合させることによって行っても差し支えない。例えば、化合物は、直接的または間接的いずれかで、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈで標識付けることができ、その放射性同位体は、放射線の直接計数またはシンチレーション計数により検出できる。あるいは、アッセイ成分に、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識し、酵素標識を、適切な基質の生成物への転化の決定により検出することができる。
【００６０】
本発明の方法において有用な作用物質は、例えば、オートファジー関連遺伝子産物とその担体および／または結合パートナーとの間の相互作用を変調する（例えば、プラスまたはマイナスいずれかに影響を与える）化合物を特定するアッセイを使用して特定してもよい。そのような化合物としては、以下に限られないが、抗体、ペプチド、ホルモン、オリゴヌクレオチド、核酸、その類似体などの分子が挙げられる。そのような化合物は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリを含むどのような利用可能な供給源から得てもよい。
【００６１】
オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用を変調する化合物を特定するために使用されるアッセイシステムの基本原理は、オートファジー関連遺伝子産物およびその結合パートナーを含有する反応混合物を、この２つの産物が相互作用し、結合する条件下で十分な時間に亘り調製し、それゆえ、複合体を形成する工程を含む。阻害活性について作用物質を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在下と不在下で調製される。試験化合物は、反応混合物中に最初に含ませても、またはオートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーの添加後に加えても差し支えない。対照反応混合物は、試験化合物を含まず、またはプラシーボと共に、インキュベーションされる。次いで、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間のどのような複合体の形成も検出される。対照反応における複合体の形成と、試験化合物を含有する反応混合物中にそのような形成がわずかしかまたは全くないことは、その化合物が、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーの相互作用に干渉することを示す。逆に、対照反応中ではなく、化合物の存在下でより多くの複合体が形成されたことは、その化合物がオートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの相互作用を促進させるであろうことを示す。
【００６２】
オートファジー関連遺伝子産物のその結合パートナーとの相互作用を変調する化合物に関するアッセイは、不均一または均一形態で行ってもよい。不均一アッセイは、オートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーいずれかを固相に固定化し、反応の終わりで固相に固定化された複合体を検出する各工程を含む。均一アッセイにおいて、全反応は液相中で行われる。いずれの手法においても、反応体の添加順序は、試験されている化合物についての異なる情報を得るために、変えても差し支えない。例えば、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用に干渉する（例えば、競合により）試験化合物は、試験基質の存在下で反応を行うことにより、すなわち、試験物質を、オートファジー関連遺伝子産物とその反応性の結合パートナーと同時に、またはその添加後に、反応混合物に添加することによって、特定することができる。あるいは、予め形成された複合体を妨害する試験化合物、例えば、その複合体からの成分の内の１つを置換する、結合定数が高い化合物は、複合体が形成された後に、試験化合物を反応混合物に添加することによって、試験できる。様々な形態を以下に手短に記載する。
【００６３】
不均一アッセイシステムにおいて、オートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーのいずれかを固体表面またはマトリクスに固定化し、一方で、他方の対応する非固定化成分に、直接的または間接的いずれかで標識付けてもよい。実際には、この手法のために、マイクロタイタプレートをよく利用する。固定化種は、典型的に当業者によく知られた数多くの方法により、非共有または共有いずれで、固定化して差し支えない。非共有結合は、しばしば、固体表面をオートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーの溶液で被覆し、乾燥することにより、単純に行うことができる。あるいは、固定化すべきアッセイ成分に特異的な固定化抗体を、この目的に使用しても差し支えない。
【００６４】
関連するアッセイにおいて、アッセイ成分の一方または両方をマトリクスに固定化できる領域を加える融合タンパク質を提供しても差し支えない。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／マーカー融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／結合パートナーを、グルタチオンセファロースビーズ（ミズーリ州、セントルイス所在のシグマケミカル社(Sigma Chemical)）またはグルタチオン誘導マイクロタイタプレートに固定化することができ、次いで、これを試験化合物または試験化合物および非固定化オートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーいずれかと組み合わせ、その混合物を、複合体形成を助長する条件下（例えば、生理的条件下）でインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタプレートのウェルを洗浄して、どのような未結合のアッセイ成分も除去し、固定化された複合体を、例えば、上述したように、直接的または間接的いずれかで評価する。あるいは、複合体をマトリクスから解離させ、標準技法を使用して、オートファジー関連遺伝子産物の結合または活性のレベルを決定しても差し支えない。
【００６５】
均一アッセイを使用して、オートファジー関連遺伝子産物の変調物質を特定してもよい。これは、典型的に、上述したものと類似の反応であり、これは、その試験化合物の存在下または不在下で液相中において行われる。次いで、形成された複合体を未反応成分から分離し、形成された複合体の量を決定する。不均一アッセイシステムについて述べたように、反応体の液相への添加順序によって、どの試験化合物が複合体の形成を変調する（阻害するまたは促進する）かについて、および予め形成された複合体を妨害するかについての情報を生成することができる。
【００６６】
そのような均一アッセイにおいて、反応生成物は、以下に限られないが、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈降を含む数多くの標準技法のいずれによって、未反応アッセイ成分から分離してもよい。分画遠心法において、分子の複合体は、その異なるサイズおよび密度に基づいて、複合体の異なる沈降平衡のために、一連の遠心工程により、複合体を形成していない分子から分離してもよい（例えば、Rivas, G., and Minton, A.P., Trends Biochem Sci 1993 Aug;18(8):284-7を参照）。標準的なクロマトグラフィー技法を利用して、複合体を形成していないものから、複合体を形成した分子を分離してもよい。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づいて分子を分離し、例えば、カラム形態にある適切なゲル濾過樹脂を利用することにより、比較的大きな複合体が、比較的小さい、複合体を形成していない成分から分離されるであろう。同様に、複合体を形成していない分子と比べて、複合体の比較的異なる電荷特性を活用して、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用することにより、複合体を、残りの個々の反応体から区別して分離してもよい。そのような樹脂およびクロマトグラフィー技法が、当業者によく知られている（例えば、Heegaard, 1998, J Mol. Recognit. 11:141-148; Hage and Tweed, 1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 699:499-525を参照）。ゲル電気泳動を利用して、未結合種から複合体を形成した分子を分離してもよい（例えば、Ausubel et al (eds.), In: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999を参照）。この技法において、タンパク質または核酸の複合体は、例えば、サイズまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動プロセス中に結合相互作用を維持するために、還元剤の不在下での非変性ゲルが典型的に好ましいが、特定の反応体に適切な条件が、当業者によく知られているであろう。免疫沈降は、溶液からタンパク質−タンパク質複合体を単離するために利用される別の一般的な技法である（例えば、Ausubel et al (eds.), In: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999を参照）。この技法において、結合分子の内の１つに特異的な抗体に結合する全てのタンパク質が、遠心法により容易に収集されるポリマービーズにその抗体を結合させる(conjugating)ことによって、溶液から沈降される。結合したアッセイ成分は、ビーズから放出され（特異的タンパク質分解事象または複合体中のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害しない当該技術分野によく知られた他の技法により）、この時には対応する異なる相互作用アッセイ成分に特異的な抗体を利用して、第２の免疫沈降工程が行われる。このようにして、唯一の形成された複合体がビーズに結合したままになるはずである。試験化合物の存在下と不在下の両方における複合体の形成における変異を比べることができ、それゆえ、その化合物の、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用を変調する能力についての情報が提供される。
【００６７】
オートファジー関連遺伝子産物の発現の変調物質は、例えば、細胞を候補の化合物と接触させ、細胞中のオートファジー関連遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法を使用して特定してもよい。候補の化合物の存在下でのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルが、候補の化合物の不在下でのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比べられる。次いで、候補の化合物を、この比較に基づいて、オートファジー関連遺伝子産物の発現の変調物質として特定することができる。例えば、オートファジー関連遺伝子産物の発現が、候補の化合物の存在下でのほうが、不在下でよりも大きい場合、候補の化合物が、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤(stimulator)として特定される。逆に、オートファジー関連遺伝子産物の発現が、候補の化合物の存在下でのほうが、不在下でよりも小さい場合、候補の化合物が、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤(inhibitor)として特定される。細胞中のオートファジー関連遺伝子産物の発現レベルは、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための、ここに記載された方法によって決定できる。
【００６８】
オートファジー阻害遺伝子産物の活性を阻害する作用物質は、例えば、オートファジーの促進および神経変性疾患の治療において、有用である。オートファジー阻害遺伝子産物のそのような阻害剤の例が、表７および図６３に列記されている。
【表７】
【００６９】
あるいは、オートファジー阻害遺伝子産物の活性を促進させる作用物質は、例えば、オートファジーの阻害並びに癌および膵炎の治療において、有用である。オートファジー阻害遺伝子産物のそのような促進物質の例が、表８および図６３に列記されている。
【表８】
【００７０】
表１〜４に列記されたオートファジー関連遺伝子産物を変調する作用物質のさらに別の例が、例えば、米国特許第7,348,140号; 同第6,982,265号; 同第6,723,694号; 同第6,617,311号; 同第6,372,250号; 同第6,334,998号; 同第6,319,905号; 同第6,312,949号; 同第6,297,238号; 同第6,228,835号; 同第6,214,334号; 同第6,096,778号; 同第5,990,083号; 同第5,834,457号; 同第5,783,683号; 同第5,681,747号; 同第5,556,837号; 同第5,464,614号の各明細書に見られ、これらの各々の全てがここに具体的に引用される。表１〜４に列記されたオートファジー関連遺伝子産物を変調する作用物質の例が、例えば、米国特許出願公開第2009/0137572号; 同第2009/0136475号; 同第2009/0105149号; 同第2009/0088401号; 同第2009/0087454号; 同第2009/0087410号; 同第2009/0075900号; 同第2009/0074774号; 同第2009/0074711号; 同第2009/0074676号; 同第2009/0069245号; 同第2009/0068194号; 同第2009/0068168号; 同第2009/0060898号; 同第2009/0047240号; 同第2009/0042803号; 同第2009/0029992号; 同第2009/0011994号; 同第2009/0005431号; 同第2009/0005309号; 同第2009/0004194号; 同第2008/0319026号; 同第2008/0312247号; 同第2008/0300316号; 同第2008/0300180号; 同第2008/0299138号; 同第2008/0280991号; 同第2008/0280886号; 同第2008/0268071号; 同第2008/0262086号; 同第2008/0255200号; 同第2008/0255084号; 同第2008/0255036号; 同第2008/0242687号; 同第2008/0241289号; 同第2008/0234284号; 同第2008/0234257号; 同第2008/0221132号; 同第2008/0194672号; 同第2008/0194555号; 同第2008/0187490号; 同第2008/0171769号; 同第2008/0167312号; 同第2008/0146573号; 同第2008/0132555号; 同第2008/0125386号; 同第2008/0124379号; 同第2008/0103189号; 同第2008/0051465号; 同第2008/0051383号; 同第2008/0045588号; 同第2008/0045561号; 同第2008/0045558号; 同第2008/0039473号; 同第2008/0033056号; 同第2008/0021036号; 同第2008/0021029号; 同第2008/0004300号; 同第2007/0293525号; 同第2007/0293494号; 同第2007/0287734号; 同第2007/0286853号; 同第2007/0281965号; 同第2007/0281894号; 同第2007/0280886号; 同第2007/0274981号; 同第2007/0259891号; 同第2007/0259827号; 同第2007/0254877号; 同第2007/0249519号; 同第2007/0248605号; 同第2007/0219235号; 同第2007/0219114号; 同第2007/0203064号; 同第2007/0173440号; 同第2007/0155820号; 同第2007/0149622号; 同第2007/0149580号; 同第2007/0134273号; 同第2007/0129389号; 同第2007/0112031号; 同第2007/0099964号; 同第2007/0099952号; 同第2007/0098716号; 同第2007/0093480号; 同第2007/0082929号; 同第2007/0004765号; 同第2007/0004654号; 同第2006/0286102号; 同第2006/0276381号; 同第2006/0265767号; 同第2006/0263368号; 同第2006/0257867号; 同第2006/0223742号; 同第2006/0211752号; 同第2006/0199796号; 同第2006/0194821号; 同第2006/0166871号; 同第2006/0147456号; 同第2006/0134128号; 同第2006/0115475号; 同第2006/0110746号; 同第2006/0058255号; 同第2006/0025566号; 同第2006/0009454号; 同第2006/0009452号; 同第2006/0002866号; 同第2005/0288316号; 同第2005/0288243号; 同第2005/0250719号; 同第2005/0249751号; 同第2005/0246794号; 同第2005/0227921号; 同第2005/0222171号; 同第2005/0197341号; 同第2005/0187237号; 同第2005/0182006号; 同第2005/0175581号; 同第2005/0171182号; 同第2005/0164298号; 同第2005/0153955号; 同第2005/0153878号; 同第2005/0148511号; 同第2005/0143381号; 同第2005/0119273号; 同第2005/0106142号; 同第2005/0096363号; 同第2005/0070493号; 同第2005/0043233号; 同第2005/0043221号; 同第2005/0038049号; 同第2005/0015263号; 同第2005/0009870号; 同第2004/0266777号; 同第2004/0261190号; 同第2004/0248965号; 同第2004/0248884号; 同第2004/0242559号; 同第2004/0241797号; 同第2004/0229250号; 同第2004/0220270号; 同第2004/0204368号; 同第2004/0192629号; 同第2004/0186157号; 同第2004/0132648号; 同第2004/0091919号; 同第2004/0072836号; 同第2004/0063708号; 同第2004/0063707号; 同第2004/0057950号; 同第2003/0225098号; 同第2003/0220246号; 同第2003/0211967号; 同第2003/0199525号; 同第2003/0187001号; 同第2003/0186844号; 同第2003/0166574号; 同第2003/0166573号; 同第2003/0166001号; 同第2003/0153752号; 同第2003/0077298号; 同第2003/0069430号; 同第2003/0059455号; 同第2003/0040612号; 同第2009/0099069号; 同第2008/0312413号; 同第2008/0280845号; 同第2008/0248462号; 同第2008/0248462号; 同第2008/0213250号; 同第2008/0145313号; 同第2008/0021080号; 同第2008/0021036号; 同第2008/0004309号; 同第2007/0298124号; 同第2007/0298104号; 同第2007/0281986号; 同第2007/0264195号; 同第2007/0232556号; 同第2007/0190149号; 同第2007/0111934号; 同第2007/0071675号; 同第2007/0021360号; 同第2007/0010658号; 同第2006/0235034号; 同第2006/0233799号; 同第2006/0160737号; 同第2006/0128696号; 同第2006/0121042号; 同第2006/0039904号; 同第2006/0019882号; 同第2005/0272655号; 同第2005/0197293号; 同第2004/0247592号; 同第2004/0204356号; 同第2004/0132023号; 同第2004/0116669号; 同第2004/0072836号; 同第2004/0048895号; 同第2004/0022765号; 同第2003/0165485号; 同第2003/0162964号; 同第2003/0153503号; 同第2003/0125276号; 同第2003/0114657号; 同第2003/0091569号; 同第2003/0078199号; 同第2002/0137095号; 同第2001/0006793号; 同第2001/0002393号; 同第2002/0183319号; および 同第2002/0156081号の各明細書にも見られ、これらの各々の全てがここに具体的に引用される。
【００７１】
４． オートファジー関連遺伝子産物のオリゴヌクレオチド阻害剤
本発明のある実施の形態において、オートファジー関連ＲＮＡ遺伝子産物のオリゴヌクレオチド阻害剤が、オートファジーを変調し、オートファジー関連疾病を治療するために使用される。オリゴヌクレオチド阻害剤としては、以下に限られないが、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、リボザイムおよび三重分子(triplex molecules)が挙げられる。そのような分子が当該技術分野において公知であり、当業者は、所定の方法を使用して、本発明のオートファジー関連遺伝子のいずれについてのオリゴヌクレオチド阻害剤も作製することができるであろう。
【００７２】
アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子、リボザイムまたは三重分子は、細胞と接触させても、または生物に投与してもよい。あるいは、そのような分子をコード化する構築体(constructs)を細胞と接触させても、もしくは細胞または生物に導入してもよい。アンチセンス構築体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ干渉構築体またはｓｉＲＮＡ二重ＲＮＡ分子を使用して、関心のあるタンパク質、例えば、本発明のオートファジー関連遺伝子の発現を妨げても差し支えない。典型的にｍＲＮＡ配列の補体の少なくとも１５、１７、１９、または２１のヌクレオチドが、アンチセンス分子にとって十分である。典型的に標的配列の少なくとも１５、１７、１９、または２１のヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉分子にとって十分である。いくつかの実施の形態において、ＲＮＡ干渉分子は２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する。ＲＮＡ干渉分子が、構築体からの、例えば、ヘアピン分子からまたは所望のオートファジー関連遺伝子配列の逆繰返し配列からの細胞中で発現される場合、内因性細胞機構により、オーバーハングが作製されるであろう。ｓｉＲＮＡは、化学合成、インビトロ転写、またはＲｎａｓｅ ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒによる長いｄｓＲＮＡの消化によって調製できる。これらは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞内感染または当該技術分野に公知の他の方法により細胞中に導入できる。例えば、Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418: 244-251; Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7: 1509-1521; Hutvagner G et al., RNAi: Nature abhors a double-strand. Cur. Open. Genetics & Development 12: 225-232; Brummelkamp, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, and Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M, and Taira K. (2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, and Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Dev. 16:948-958; Paul CP, Good PD, Winer I, and Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, and Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520; Yu J-Y, DeRuiter SL, and Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052;国際公開第２００６／０６６０４８号、同第２００９／０２９６８８号の各パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０１２３４２６号明細書を参照のこと。これらの各々を全て引用する。
【００７３】
アンチセンスまたはＲＮＡ干渉分子は、細胞にインビトロで、または例えば、腫瘍または哺乳類の疾病組織にインビボで、送達することができる。当該技術分野に公知の典型的な送達手段を使用することができる。例えば、腫瘍への送達は、腫瘍内注射により行うことができる。制限なく、静脈内、筋肉内、腹膜内、動脈内、手術中の局部送達、内視鏡、皮下、および経口を含む送達の他の態様を使用することができる。任意の特定の施用に関する所望の特性のために、ベクターを選択しても差し支えない。ベクターは、ウイルス、細菌またはプラスミドであり得る。この点に関して、アデノウイルスベクターが有用である。組織特異的、細胞タイプ特異的、または他の調節可能なプロモータを使用して、抑制性ポリヌクレオチド分子の転写を調節するために使用することができる。リポソームまたはナノスフェアなどの非ウイルス担体を使用しても差し支えない。
【００７４】
本発明の方法において、ＲＮＡ干渉分子またはＲＮＡ干渉コード化オリゴヌクレオチドを、例えば、送達試薬とも組合せた裸ＲＮＡとして、および／またはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子を発現する配列を含む核酸として、対象に投与することができる。いくつかの実施の形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子を発現する配列を含む核酸は、ベクター、例えば、プラスミド、ウイルスおよび細菌ベクター内で送達される。当該技術分野に公知のどのような核酸送達法を本発明に使用しても差し支えない。適切な送達試薬としては、以下に限られないが、例えば、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ脂肪親和性試薬、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン（例えば、ポリリシン）、アテロコラーゲン、ｎａｎｏｐｌｅｘ（商標）およびリポソームが挙げられる。
【００７５】
核酸分子の送達ビヒクルとしてのアテロコラーゲンの使用が、Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); および Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)に記載されており、その各々の全てがここに引用される。
【００７６】
本発明のいくつかの実施の形態において、抑制性オリゴヌクレオチドを対象に送達するために、リポソームが使用される。本発明に使用するのに適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成でき、これは、一般に、中性のまたは負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームのサイズおよび血流中のリポソームの半減期などの要因の検討により導かれる。例えば、Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467;および米国特許第4,235,871号, 同第4,501,728号, 同第4,837,028号, および同第5,019,369号の各明細書に記載されているような、リポソームを調製するための様々な方法が公知である。その全ての開示がここに引用される。
【００７７】
本発明の方法に使用するためのリポソームは、リポソームを癌細胞、膵炎細胞またはニューロンに向けるリガンド分子を含み得る。細胞タイプに特異的な抗原に結合するモノクローナル抗体などの、癌細胞、膵炎細胞またはニューロン中に蔓延した受容体に結合するリガンドが好ましい。
【００７８】
本発明に使用するためのリポソームは、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを避けるように修飾することもできる。そのような修飾リポソームは、表面上にまたはリポソーム構造中に組み込まれたオプソニン作用阻害部位を有する。ある実施の形態において、本発明のリポソームは、オプソニン作用阻害部位およびリガンドの両方を含み得る。
【００７９】
本発明のリポソームを調製するのに使用するオプソニン作用阻害部位は、典型的に、リポソーム膜に結合した大きい親水性ポリマーである。ここに用いたように、オプソニン作用阻害部位は、例えば、膜自体中に脂質可溶性アンカーのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基への直接的な結合により、化学的または物理的に膜に付着されたときに、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン作用阻害親水性ポリマーは、例えば、ここにその開示を引用する、米国特許第４９２００１６号明細書に記載されているように、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの摂取を著しく減少させる保護表面層を形成する。
【００８０】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部位は、好ましくは約５００から約４０，００００ダルトン、より好ましくは約２，０００から約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖、分岐鎖、またはデンドリマーポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学的に結合するポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、並びにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、またはメトキシＰＰＧ、もしくはその誘導体のコポリマーも適している。その上、オプソニン作用阻害ポリマーは、ＰＥＧおよびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドいずれかのブロックコポリマーであって差し支えない。オプソニン作用阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナンを含有する天然の多糖類；アミン化多糖類またはオリゴ糖類（直鎖または分岐鎖）；またはカルボキシル化多糖類またはオリゴ糖類、例えば、カルボキシル基の結果としての結合によるカルボン酸の誘導体と反応した；であって差し支えない。オプソニン作用阻害部位がＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体であることが好ましい。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは、ときには、「ＰＥＧ化(PEGylated)リポソーム」と呼ばれる。
【００８１】
オプソニン作用阻害部位は、数多くのよく知られた技法のいずれか１つによってリポソーム膜に結合させても差し支えない。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーに結合させ、次いで、膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃での３０：１２の比率のテトラヒドロフランと水などの、溶媒混合物およびＮａ（ＣＮ）ＢＨ3を使用した還元性アミン化により、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーにより誘導体化できる。
【００８２】
オプソニン作用阻害部位により修飾されたリポソームは、未修飾のリポソームよりもずっと長く、循環中に残る。この理由のために、そのようなリポソームは、ときには「ステルス(stealth)」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔質または「漏れ孔のある(leaky)」微小血管系により供給される組織中に蓄積することが知られている。それゆえ、そのような微小血管系欠陥により特徴付けられる組織、例えば、固形癌は、これらのリポソームを効率的に蓄積する。Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 18:6949-53を参照のこと。その上、ＲＥＳによる摂取の減少により、肝臓および脾臓中のリポソームの著しい蓄積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性が低下する。
【００８３】
５． オートファジー関連遺伝子産物に特異的な抗体
高い特異性で特定の標的に結合する能力のために、ポリペプチドオートファジー関連遺伝子産物に特異的な抗体は、そのような遺伝子産物の活性を阻害するかまたは促進し、それによって、オートファジーを阻害するかまたは促進することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、受容体に特異的な抗体は、活性化リガンドとの相互作用を遮断することによって、その受容体の活性を阻害することができる。同様に、可溶性リガンド（例えば、サイトカインまたは成長因子）または膜結合リガンドに特異的な抗体は、リガンドの受容体への結合を阻害することによって、リガンドに結合できる受容体の活性を阻害することができる。他の実施の形態において、受容体に特異的な抗体を使用して、架橋させ、それによって、受容体を活性化させることもできる。抗体は、細胞外タンパク質（例えば、受容体および／またはリガンド）の活性を阻害または促進するのに特に有用であるが、細胞中のタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の使用も、当該技術分野において公知である（例えば、Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Marasco et al.による国際公開第94/02610号パンフレッ; および Duan et al.による国際公開第95/03832号パンフレットを参照のこと）。したがって、オートファジー関連遺伝子のペプチド産物に特異的な抗体は、本発明の方法のための生物学的作用物質として有用である。
【００８４】
オートファジー関連遺伝子のペプチド産物に特異的に結合する抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)により記載されている標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法などの様々な公知の技法を使用して産生できる。さらに、当該技術分野に公知のモノクローナル抗体を製造するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリを使用したファージディスプレイ技法を利用しても差し支えない。
【００８５】
ポリクローナル抗体は、適切な対象をポリペプチド免疫原で免疫化させることによって調製することができる。免疫化された対象におけるポリペプチド抗体の力価は、固定化ポリペプチドを使用した酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準技法によって、時間の経過でモニタすることができる。所望であれば、抗原に対して作られた抗体を哺乳類から（例えば、血液から）単離し、さらに、ＩｇＧ分画を得るためのタンパク質Ａクロマトグラフィーなどの、よく知られた技法によって精製しても差し支えない。免疫化後の適切な時間で、例えば、抗体の力価が最高であるときに、抗体産生細胞を、対象から得て、モノクローナル抗体を調製するために使用することができる。
【００８６】
リンパ球および不死化された細胞系統を融合するために使用される多くのよく知られたプロトコルのいずれを、オートファジー関連遺伝子の産物に対して特異的なモノクローナル抗体を産生する目的に適用しても差し支えない（例えば、Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) 前出; Lerner (1981) 前出; Kenneth (1980) 前出を参照のこと）。さらに、当業者には、有用であろうそのような方法の多くの変種があることが認識されよう。典型的に、不死細胞系統（例えば、骨髄腫細胞系統）が、リンパ球と同じ哺乳類種から誘導される。例えば、ネズミ・ハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物により免疫化されたネズミからのリンパ球を、不死化されたネズミ細胞系統と融合することによって作製することができる。適切なネズミ細胞系統の例は、ハイポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のあるネズミ骨髄腫細胞系統である。標準技法による融合パートナーとして、数多くの骨髄腫細胞系統のいずれを、例えば、P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 または Sp2/O-Ag14骨髄腫系統を使用しても差し支えない。これらの骨髄腫系統は、メリーランド州、ロックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる。典型的に、ＨＡＴ−感受性ネズミ骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用して、ネズミ脾細胞に融合される。次いで、融合から生じたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を使用して選択する。この培地は、未融合のおよび非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺す（形質転換されていないので、未融合の脾細胞は数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的ＥＬＩＳＡ検定法を使用して、所定のポリペプチドに結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００８７】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の代案として、適切なオートファジー関連遺伝子産物に関する組換え組合せイムノグロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージまたは酵母ディスプレイライブラリ）をスクリーニングし、それによって、オートファジー関連遺伝子産物に結合するイムノグロブリンライブラリの構成員を単離することによって、上述したオートファジー関連遺伝子産物の内の１つに特に特異的なモノクローナル抗体を特定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリを生成し、スクリーニングするためのキットが市販されており（例えば、the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; および the Stratagene SurfZAP（商標） Phage Display Kit, Catalog No. 240612）、ファージおよび酵母ディスプレイライブラリをスクリーニングする方法が当該技術分野において公知である。抗体ディスプレイライブラリを生成し、スクリーニングするのに特に使用しやすい方法および試薬の例が、例えば、Ladner et al. 米国特許第5,223,409号明細書; Kang et al. 国際公開第92/18619号パンフレット; Dower et al. 国際公開第91/17271号パンフレット; Winter et al. 国際公開第92/20791号パンフレット; Markland et al. 国際公開第92/15679号パンフレット; Breitling et al. 国際公開第93/01288号パンフレット; McCafferty et al. 国際公開第92/01047号パンフレット; Garrard et al. 国際公開第92/09690号パンフレット; Ladner et al. 国際公開第90/02809号パンフレット; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; および McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554に見つけられる。
【００８８】
その上、オートファジー関連遺伝子産物に対するキメラヒト化抗体は、米国特許第5,565,332号明細書に開示されたものなどの標準プロトコルにしたがって作製することができる。別の実施の形態において、抗体鎖または特異的結合対構成員は、例えば、米国特許第5,565,332号, 同第5,871,907号, または同第5,733,743号の各明細書に記載されているような、当該技術分野に公知の技法を使用して、再生可能な包括的ディスプレイパッケージの成分および特定の結合対構成員のポリペプチド鎖の融合をコード化する核酸分子を含むベクターと、１つの結合対構成員の第２のポリペプチド鎖をコード化する核酸分子を含有するベクターとの間の組換えによって、産生することができる。
【００８９】
別の実施の形態において、オートファジー関連遺伝子産物に対して作られたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を担持する遺伝子導入または染色体導入マウスを使用して、生成できる。ある実施の形態において、ここでは「ヒト化マウス」と称される遺伝子導入マウスは、内因性μおよびκ鎖座を不活性化させるまたは削除する標的突然変異と共に、未再配列ヒト重鎖および軽鎖可変部位イムノグロブリン配列をコード化するヒトイムノグロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する（Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859）。このマウスは、ヒト重鎖定常部位イムノグロブリン配列も含有するであろう。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκをわずかしかまたは全く発現せず、免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖可変部位導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒト可変部位抗体を生成する（Lonberg, N. et al. (1994), 前出; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93, および Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536 546）。上述した技法または当該技術分野に公知の任意の他の技法を使用して、完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、これらのマウスを使用することができる。ヒト化マウスの調製は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287 6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647 656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720 3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117 123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856 859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579 591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536 546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 851に記載されている。さらに、全てLonberg および Kayの米国特許第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,789,650号; 同第5,877,397号; 同第5,661,016号; 同第5,814,318号; 同第5,874,299号; および 同第5,770,429号; Surani等の米国特許第5,545,807号の各明細書も参照のこと。
【００９０】
６． 薬剤組成物
本発明は、オートファジー関連遺伝子産物の変調物質を含む薬剤組成物を提供する。ある態様において、本発明は、１種類以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤が共に配合された、上述した作用物質を１種類以上、治療に効果的な量で含む薬学的に許容される組成物を提供する。別の態様において、本発明の作用物質は、そのままで投与しても、または薬学的に許容される担体との混合物で投与しても差し支えなく、他の作用物質と共に投与しても差し支えない。それゆえ、併合療法は、本発明の１種類以上の作用物質の連続、同時および別々の投与または同時投与を含み、ここで、最初に投与されたものの治療効果は、その後の化合物が投与されたときに、完全には消えていない。
【００９１】
以下に詳しく記載するように、本発明の薬剤組成物は、以下のために適用されたものを含む、固体または液体の形態で投与するために特別に配合してもよい：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口内、舌下、および全身吸収を目的としたもの、大きい丸薬、粉末、顆粒、舌に施すためのペースト；（２）例えば、滅菌溶液または懸濁液、または持効性配合物として、皮下、筋肉内または硬膜外注射による、非経口投与；（３）例えば、クリーム、軟膏、または制御放出貼布または皮膚に塗布されるスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリームまたは泡としての膣内または直腸内；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮；または（８）鼻。
【００９２】
上述したように、ある実施の形態において、本発明の作用物質は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有する化合物であってよく、それゆえ、薬学的に許容される酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの塩は、投与ビヒクルまたは投与形態製造プロセス中にその場で、または遊離塩基形態にある本発明の精製化合物の適切な有機または無機酸との別の反応、およびそのように形成された塩のその後の精製中の単離によって、調製しても差し支えない。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。
【００９３】
主題の化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性有機または無機酸からの、その化合物の従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような従来の非毒性塩としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来の塩；並びに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、オキサル酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が挙げられる。
【００９４】
他の場合において、本発明の作用物質は、１種類以上の酸性官能基を含有する化合物であってよく、それゆえ、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの塩は同様に、投与ビヒクルまたは投与形態製造プロセス中にその場で、または遊離酸形態にある精製化合物を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩などの適切な塩基と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級、第二級または第三級アミンと別々に反応させることによって、調製しても差し支えない。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウムの塩などが挙げられる。塩基性付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチレンアミン、ジエチレンアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる（例えば、Berge et al.前出を参照のこと）。
【００９５】
湿潤剤、乳化剤およびラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料および酸化防止剤が、前記組成物中に存在しても差し支えない。
【００９６】
薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。
【００９７】
本発明の作用物質の配合物は、単位投与形態で提示されてもよく、製薬学の当該技術分野でよく知られたどの方法により調製されてもよい。単一投与形態を生成するために担体材料と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療されている宿主および投与の特定の形態に応じて、様々である。単一投与形態を生成するために担体材料と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる作用物質のその量である。
【００９８】
ある実施の形態において、本発明の配合物は、以下に限られないが、シクロデキストリン、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、および高分子担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物を含む賦形剤；および本発明の作用物質を含む。ある実施の形態において、上述した配合物により、本発明の作用物質が経口的に生物学的に利用可能になる。
【００９９】
これらの配合物または組成物を調製する方法は、本発明の作用物質を担体、および必要に応じて１種類以上の副成分と会合させる工程を含んでよい。
【０１００】
本発明の化合物の経口投与のための液体投与形態としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。活性剤に加え、この液体投与形態は、例えば、水または他の溶媒などの当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤、およびそれらの混合物を含有してもよい。
【０１０１】
この経口組成物は、不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、着色剤、香料および保存料などのアジュバントも含有して差し支えない。
【０１０２】
懸濁液は、活性化合物に加え、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天(agar-agar)およびトラガカントなどの懸濁剤、およびそれらの混合物を含有するであろう。
【０１０３】
経口投与に適した本発明の配合物は、各々が活性成分として本発明の化合物を所定の量で含有する、カプセル、カシェ剤(cachets)、丸薬、錠剤、トローチ剤(loenges)（風味基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用した）、粉末、顆粒の形態にある、または水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油または油中水液体エマルション、またはエリキシル剤またはシロップ、もしくはトローチ剤（pastilles）（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用した）としておよび／またはマウスウォッシュなどとしてであってよい。本発明の化合物は、大きい丸薬、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【０１０４】
経口投与のための本発明の固体投与形態（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など）において、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１種類以上の薬学的に許容される担体および／または以下の内のいずれか：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの湿潤剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、および非イオン界面活性剤などの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの滑剤；および（１０）着色剤；と混合される。カプセル、錠剤および丸薬の場合、薬剤組成物は緩衝剤も含んでよい。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用した殻の軟らかいおよび硬いゼラチンカプセル内に充填剤して使用してもよい。
【０１０５】
錠剤は、１種類以上の副成分と共に、圧縮または成形により製造してもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用して調製してもよい。成形錠剤は、適切な装置内で、不活性液体希釈剤で湿らされた粉末化合物の混合物を成形することによって、製造してもよい。
【０１０６】
本発明の薬剤組成物の錠剤、および糖衣錠、カプセル、丸薬および顆粒などの他の固体投与形態は、必要に応じて、刻み目を入れても、薬剤配合の技術分野においてよく知られた腸溶コーティングまたは他のコーティングなどの、コーティングおよび殻と共に調製してもよい。それらは、所望の放出プロファイルを提供するための様々な比率での、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／または微小球を使用して、その中の活性成分の放出を遅くするまたは制御するように配合されてもよい。本発明の組成物は、迅速な放出のために配合されても、例えば、凍結乾燥されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルタに通す濾過により、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射用媒質中に溶解させられる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含ませることにより、滅菌されてもよい。これらの組成物は、必要に応じて、隠蔽剤を含有してもよく、胃腸管の特定の部分内のみで、またはそこで優先的に、必要に応じて、遅延様式で、活性成分が放出されるような組成物の形態にあってよい。使用できる包埋組成物の例としては、高分子物質および蝋が挙げられる。活性成分は、適切な場合、１種類以上の上述した賦形剤と共に、微小被包形態にあっても差し支えない。
【０１０７】
直腸または膣投与のための本発明の薬剤組成物の配合物は、座薬として提供してもよく、これは、本発明の１種類以上の化合物を、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックスまたはサリチル酸エステルを含む１種類以上の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することにより調製してよく、室温で固体であるが、体温で液体であり、したがって、直腸または膣の腔内で溶融し、活性化合物を放出する。
【０１０８】
膣投与に適した本発明の配合物としては、適切であることが当該技術分野において知られているような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー配合物が挙げられる。
【０１０９】
本発明の化合物の局所または経皮投与のための投与形態としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、貼布および吸入薬が挙げられる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体と、また要求されるであろう任意の保存料、緩衝剤、または噴霧剤と混合してもよい。
【０１１０】
これらの軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加え、獣脂および植物油、蝋、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。
【０１１１】
粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加え、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有して差し支えない。スプレーは、それに加え、クロロフルオロ炭化水素、並びにブタンおよびプロパンなどの揮発性未置換炭化水素などの通例の噴霧剤を含有し得る。
【０１１２】
経皮貼布には、本発明の化合物の体への制御された送達を提供する追加の利点がある。そのような投与形態は、化合物を適切な媒質中に溶解させるまたは分散させることによって製造することができる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通過する化合物の流れを増加させても差し支えない。そのような流れの速度は、速度制御膜を提供する、または化合物を高分子マトリクスまたはゲル中に分散させることによって、制御することができる。
【０１１３】
眼内配合物、眼用軟膏粉末、溶液なども、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１１４】
非経口投与に適した本発明の薬剤組成物は、使用直前に滅菌注射用溶液または分散液中でもどされ、糖類、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、配合物を意図する受容者の血液と等張性にする溶質、もしくは懸濁剤または増粘剤を含有してよい、１種類以上の薬学的に許容される滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、もしくは滅菌粉末と組み合わせて、本発明の１種類以上の化合物を含む。
【０１１５】
本発明の薬剤組成物に使用してよい適切な水性および非水性溶液の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合の要求される粒径の維持により、また界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０１１６】
ある場合には、薬物の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。このことは、水溶性が不十分な結晶質または非晶質材料の懸濁液の使用により行われるであろう。その結果、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、この速度は、次に、結晶サイズおよび結晶形態に依存するであろう。あるいは、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクル中に溶解させるまたは懸濁させることによって行われる。
【０１１７】
注射用デポー剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性高分子中に主題の化合物の微小カプセルマトリクスを形成することによって製造される。薬物対高分子の比、および使用される特定の高分子の性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性高分子の例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー剤注射用配合物は、体内組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を取り込むことによって調製される。
【０１１８】
本発明の作用物質を含む例示の配合物は、以下に限られないが、体温での化学的安定性、放出の機能的効率時間、毒性および最適投与量を含む様々な性質に基づいて決定される。
【０１１９】
本発明の調製物は、経口、非経口、局所、または直腸で与えられる。それらは、もちろん、各投与経路に適した形態で与えられる。例えば、それらは、錠剤またはカプセル形態で、注射、吸入、眼用ローション、軟膏、座薬により、注射、注入または吸入による投与；ローションまたは軟膏により局所；および座薬による直腸で投与される。
【０１２０】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用してよい本発明の化合物、および／または本発明の薬剤組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される投与形態に配合される。
【０１２１】
ある実施の形態において、上述した薬剤組成物は、本発明の１種類以上の作用物質、化学療法薬、および必要に応じての薬学的に許容される担体を含む。
【０１２２】
化学療法薬という用語は、制限するものではなく、カルボプラチンおよびシスプラチンなどの白金系作用物質；窒素マスタードアルキル化剤；カルムスチン（ＢＣＮＵ）などのニトロソウレアアルキル化剤および他のアルキル化剤；メトトレキサートなどの代謝拮抗物質；プリン類似体代謝拮抗物質；フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビンなどのピリミジン類似体代謝拮抗物質；ゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェンなどのホルモン抗腫瘍薬；タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、アルデスロイキン、インターロイキン−２、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンα、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）などの天然抗腫瘍薬；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびマイトマイシンなどの抗生物質である天然抗腫瘍薬；並びにビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイドである天然抗腫瘍薬が挙げられる。
【０１２３】
さらに、それ自体では化学療法薬と考えられていなくても、以下の薬物を、化学療法薬と組み合わせて使用してもよい：ダクチノマイシン；ダウノルビシンＨＣｌ；ドセタキセル；ドキソルビシンＨＣｌ；エポエチンα；エトポシド（ＶＰ−１６）；ガンシクロビルナトリウム；ゲンタマイシン硫酸塩；インターフェロンα；ロイプロリド酢酸塩；メペリジンＨＣｌ；メタドンＨＣｌ；ビンブラスチン硫酸塩；およびジドブジン（ＡＺＴ）。例えば、フルオロウラシルは、最近、特に効果的な組合せを形成するために、エピネフリンおよびウシのコラーゲンと共に配合されている。
【０１２４】
さらにまた、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、および他の巨大分子の以下のリストを使用してもよい：突然変異体および類似体を含む、インターロイキン１から１８；インターフェロンα、βおよびγなどのインターフェロンまたはサイトカイン；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体、並びにゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）などのホルモン；トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）などの成長因子；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）；浸潤阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ−１−７）；ソマトスタチン；サンモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドディムスターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；血管新生阻害因子；抗原性物質；およびプロドラッグ。
【０１２５】
ここに記載された組成物および治療方法に使用するための化学療法薬としては、以下に限られないが、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ-２１８９およびＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えば、エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素蛋白エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；葉酸類似体、例えば、デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリン類似体、例えば、フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６−アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン、例えば、カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロ
スタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えば、フロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド(maytansinoid)、例えば、メイタンシン(maytansine)およびアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａおよびアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ-１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン(capecitabine)；および上述したものの任意のものの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１２６】
別の実施の形態において、本発明の組成物は、治療薬またはプロドラッグ、例えば、他の化学療法薬、スカベンジャー化合物、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌剤、抗炎症剤、血管収縮薬および抗凝血薬、癌ワクチン用途に有用な抗原または対応するプロドラッグを含んでよい。
【０１２７】
例示のスカベンジャー化合物としては、以下に限られないが、グルタチオン、チオウレア、およびシステインなどのチオール含有化合物；マンニトール、置換フェノールなどのアルコール；キノン、置換フェノール、アリールアミンおよびニトロ化合物が挙げられる。
【０１２８】
化学療法薬および／または他の生物学的に活性な作用物質の様々な形態を使用してよい。これらは、制限するものではなく、生物学的に活性である、非荷電分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミドなどの形態を含む。
【０１２９】
７． 本発明の治療法
本発明はさらに、癌、神経変性疾患、肝疾患、筋疾患および膵炎を含むオートファジー関連疾病を治療する新規の治療方法であって、対象（例えば、その必要がある対象）に、本発明のオートファジー関連遺伝子産物の変調物質を効果的な量、投与する工程を含む方法を提供する。
【０１３０】
その必要がある対象としては、例えば、前癌状態腫瘍を含む腫瘍、癌と診断された対象、または以前の治療では効果がなかった対象を含む、治療されてきた対象が挙げられる。
【０１３１】
オートファジーは、神経損傷後に生じる軸索変性において役割を果たすのに関係すると見なされてきた。例えば、外傷性脊髄損傷により、軸索内カルシウムレベルが急激に上昇し、これにより、ニューロンのオートファジーおよび細胞死が増加する（Knoferle et al., (2009), PNAS, 107, 6064-6069）。カルシウムの流れまたはオートファジーいずれかの阻害により、軸索変性が軽減される。特に、本発明のオートファジー変調物質のスクリーニングにおいて、数多くのカルシウム結合タンパク質が特定された（表５）。それゆえ、ある実施の形態において、本発明は、カルシウム結合オートファジー変調遺伝子産物の変調による、または他のオートファジー関連遺伝子産物の変調による、神経外傷後の軸索変性の治療または予防に関する。
【０１３２】
本発明の方法は、どのような癌性または前癌状態の腫瘍を治療するために使用してもよい。本発明の方法および組成物により治療されるであろう癌としては、以下に限られないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮からの癌細胞が挙げられる。その上、癌は、具体的には、以下に限られないが、以下の組織タイプのものであってよい：腫瘍、悪性；癌；癌、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管癌の合併；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性結腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞癌；乳頭腺癌；嫌色素癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭腺癌および濾胞状腺癌；非被嚢性硬化性癌；副腎皮質細胞癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺；ムチン性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性乳癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質性腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；神経芽細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯芽肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；および有毛細胞白血病。
【０１３３】
ある実施の形態において、本発明の方法は、化学療法薬と組み合わせた本発明のオートファジー阻害剤の投与を含む、癌の治療を含む。そのようなオートファジー阻害剤としては、オートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質（表２）およびオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質（表１）が挙げられる。どのような化学療法薬も、本発明の方法に使用するのに適しており、特に、癌細胞中に細胞ストレスを誘発する化学療法薬が適している。本発明に有用な化学療法薬としては、以下に限られないが、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ-２１８９およびＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えば、エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素蛋白エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；葉酸類似体、例えば、デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリン類似体、例えば、フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６−アザウリジン(az
auridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン、例えば、カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えば、フロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド(maytansinoid)、例えば、メイタンシン(maytansine)およびアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａおよびアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ-１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン(capecitabine)；および上述したものの任意のものの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１３４】
ある実施の形態において、本発明の方法は、放射線療法と組み合わせた本発明のオートファジー阻害剤の投与を含む、癌の治療を含む。放射線療法の最適線量は、一日当たりの線量として対象に与えられる。放射線療法の最適の一日当たりの線量は、例えば、約０．２５から０．５Ｇｙ、約０．５から１．０Ｇｙ、約１．０から１．５Ｇｙ、約１．５から２．０Ｇｙ、約２．０から２．５Ｇｙ、および約２．５から３．０Ｇｙであってよい。例示の一日当たりの線量は、例えば、約２．０から３．０Ｇｙであってよい。例えば、腫瘍が放射線の低線量に対して耐性である場合、より高い線量の放射線を照射してもよい。放射線の高線量は、例えば、４Ｇｙに到達するであろう。さらに、治療の過程で照射される放射線の総線量は、例えば、約５０から２００Ｇｙに及んでよい。例示の実施の形態において、治療の過程で照射される放射線の総線量は、例えば、約５０から８０Ｇｙに及んでよい。ある実施の形態において、放射線の線量は、例えば、１、２、３、４、または５分間の時間に亘り与えられてよく、ここで、時間は、放射線源の線量率に依存する。
【０１３５】
ある実施の形態において、最適化された放射線の一日当たりの線量を、約４から８週間に亘り、例えば、一週当たり４または５日、照射してよい。代わりの実施の形態において、最適化された放射線の一日当たりの線量を、約４から８週間に亘り、一週当たり７日、すなわち毎日、照射してよい。放射線の毎日の線量は、一回の線量として与えてもよい。あるいは、放射線の毎日の線量は、複数回の線量として与えてもよい。さらに別の実施の形態において、放射線の最適化された線量は、毎日の基準で患者が許容できる線量よりも高い放射線線量であってよい。それゆえ、放射線の高線量を患者に照射してよいが、少ない頻度の照射計画においてである。
【０１３６】
癌治療に使用してよい放射線のタイプが当該技術分野においてよく知られており、その例としては、電子ビーム、線形加速装置からもしくはコバルトやセシウムなどの放射性線源からの高エネルギー光子、陽子、および中性子が挙げられる。例示の電離放射線は、Ｘ線である。
【０１３７】
放射線を照射する方法が当該技術分野においてよく知られている。例示の方法としては、以下に限られないが、外部ビーム照射、内部ビーム照射、および放射性医薬品が挙げられる。外部ビーム照射において、癌の影響を受けている体の区域に高エネルギーＸ線を送達するために、線形加速装置が使用される。放射線源が体外にあるので、均一な放射線量で、体の広い区域を治療するために、外部ビーム照射を使用することができる。近接照射療法としても知られている内部照射療法は、体内の特定の部位に高線量の放射線を送達することを含む。内部照射療法の２つの主要なタイプには、影響を受けた組織内に放射線源が配置される組織内照射、および影響を受けた区域から短距離にある体腔内に放射線源が配置される腔内照射がある。放射性物質は、腫瘍特異的抗体に結合させることによって、腫瘍細胞に送達してもよい。内部照射療法に使用される放射性物質は、典型的に、小さなカプセル、ペレット、ワイヤ、管、またはインプラント内に収容される。反対に、放射性医療品は、体腔中に、経口、静脈または直接与えてもよい非密封線源である。
【０１３８】
放射線療法は、線形加速装置またはガンマナイフを使用して正確な量の放射線を小さい腫瘍区域に送達できる定位手術または定位放射線療法、および放射線治療の前に腫瘍の位置をマッピングするためのコンピュータ支援療法である三次元原体照射療法（３ＤＣＲＴ）を含んでもよい。
【０１３９】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、神経変性疾患について治療されている対象または神経変性疾患と診断された対象が挙げられる。
【０１４０】
本発明の方法を使用して、どのような神経変性疾患を治療してもよい。ある実施の形態において、神経変性疾患は、タンパク質症、またはタンパク質フォールディング病である。そのようなタンパク質症の例としては、以下に限られないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症が挙げられる。他の実施の形態において、本発明の方法を使用してどのような神経変性疾患も治療することができる。本発明の方法により治療できる神経変性疾患としては、以下に限られないが、副腎白質萎縮症、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症、カナバン病、脳性小児まひ、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドオフ病、シルダー病、悪性貧血の次の脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、および中毒性脳症が挙げられる。
【０１４１】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、肝疾患について治療されている対象または肝疾患と診断された対象が挙げられる。ある実施の形態において、肝疾患は、タンパク質症、またはタンパク質フォールディング病である。そのようなタンパク質症の例は、α１−アンチトリプシン欠乏症である。
【０１４２】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、筋疾患について治療されている対象または筋疾患と診断された対象が挙げられる。ある実施の形態において、筋疾患は、タンパク質症、またはタンパク質フォールディング病である。そのようなタンパク質症の例は、以下に限られないが、孤発性封入体筋炎、２Ｂ型肢体型筋ジストロフィー症および三好型ミオパチーが挙げられる。
【０１４３】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、タンパク質症と診断された対象が挙げられる。タンパク質症の例としては、以下に限られないが、アルツハイマー病、脳βアミロイド血管障害、網膜神経節細胞の変性、プリオン病（例えば、牛海綿状脳症、クル病、クロイツフェルト・ヤコブ病、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症）、タウオパチー（例えば、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症）、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（アイスランド型）、ＣＡＤＡＳＩＬ、アレキサンダー病、セルピン病、家族性アミロイドニューロパシー、老人性全身性アミロイドーシス、セルピン病、ＡＬアミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、２型糖尿病、大動脈内側アミロイドーシス、ＡｐｏＡＩアミロイドーシス、ＡｐｏＩＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス、フィンランド型家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎／ミオパチー、白内障、甲状腺髄様癌、心房アミロイドーシス、下垂体プロラクチノーマ、遺伝性格子状角膜異栄養症、皮膚苔癬アミロイドーシス、隔膜ラクトフェリンアミロイドーシス、肺胞蛋白症、アミロイド産生性歯原性腫瘍、精嚢アミロイドーシス、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症および重症疾患ミオパチーが挙げられる。
【０１４４】
いくつかの実施の形態において、本発明の主題の薬剤組成物は、予防または治療上の処置の一部として、含まれる治療薬または他の材料の治療に効果的な量を患者に送達するのに十分な量で送達されるべき物質を含む。活性剤の所望の濃度は、吸収、不活性化、および薬物の排泄速度並びに化合物の送達速度に依存する。用量値も、緩和すべき症状の重症度により様々であろうことに留意すべきである。任意の特定の対象について、個々の必要性および組成物を投与するまたはその投与を管理する人の専門的な判断力にしたがって、特定の投与計画を時間の経過と共に調節すべきことがさらに理解すべきである。典型的に、投与は、当業者に公知の技法を使用して決定される。
【０１４５】
主題の作用物質の投与は、その作用物質の血漿濃度を参照して決定してよい。例えば、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）および時間の０から無限大までの血漿濃度対時間の曲線の下の面積（ＡＵＣ（０−４））を使用してもよい。本発明の服用量は、ＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−４）に関する上述した値を生じるもの、およびそれらのパラメータについてより大きいまたは小さい値を生じる他の服用量を含む。
【０１４６】
本発明の薬剤組成物中の活性成分の実際の服用量レベルは、患者にとって毒性ではない、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療反応を達成するのに効果的である活性成分の量を得るように変えてもよい。
【０１４７】
選択される服用量レベルは、使用する特定の作用物質の活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用されている特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および以前の病歴、および医術でよく知られた同様に要因を含む様々な要因に依存する。
【０１４８】
当該技術分野において通常の技術を備えた医師または獣医は、要求される薬剤組成物の効果的な量を容易に決定し、処方できる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要な容量よりも少ないレベルで薬剤組成物中に用いられる本発明の作用物質の用量を処方および／または投与し、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させても差し支えない。
【０１４９】
一般に、本発明の作用物質の適切な毎日の用量は、治療効果を生じるのに効果的な最小の容量である作用物質の量である。そのような効果的な用量は、一般に、上述した要因に依存する。
【０１５０】
所望であれば、作用物質の効果的な毎日の用量は、必要に応じて、単位投与形態で、一日中、適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６回以上の副用量として投与してもよい。
【０１５１】
所定の患者において最も効果的な治療を生じる、投与の正確な時間および任意の特定の作用物質の量は、特定の作用物質の活性、薬物動力学、および生物学的利用率、患者の生理的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよび段階、一般的な健康状態、所定の服用量に対する感応性および医薬品のタイプ）、投与経路などに依存する。ここに提示されたガイドラインを使用して治療を最適化する、例えば、投与の最適時間および／または量を決定してもよく、これには、対象をモニタすること、および服用量および／またはタイミングを調節することからなる決まりきった実験以上は必要としない。
【０１５２】
対象が治療されている間、対象の健康状態は、２４時間中の所定の時間で関連する指標の１つ以上を測定することによってモニタしてもよい。補給物、量、投与の時間および配合を含む、治療の全ての態様は、そのようなモニタの結果にしたがって、最適化してもよい。患者は、同じパラメータを測定することによって、改善の程度を決定するために、定期的に再評価してもよく、そのような再評価の最初のものは、典型的に、治療の始まりから４週間後に行われ、その後の再評価は、治療中４から８週間毎に行われ、次いで、その後は、３ヶ月毎に行われる。治療は、数ヶ月または数年に亘り継続してもよく、最小で１ヶ月が、ヒトにとっての典型的な治療期間である。例えば、投与される作用物質の量および投与の時間に対する、調節は、これらの再評価に基づいて行ってよい。
【０１５３】
治療は、化合物の最適用量未満の少ない服用量で開始してもよい。その後、服用量は、最適な治療効果が得られるまで、わずかな増分だけ増加させてもよい。オートファジー関連遺伝子産物を変調する作用物質、および第２の作用物質、例えば、オートファジー関連疾患の治療に有用な別の作用物質の併用により、任意の個々の作用物質の必要服用量が減少するかもしれない。何故ならば、異なる化合物および／または作用物質の効果の開始と期間が相補的であるかもしれないからである。
【実施例】
【０１５４】
材料および方法
細胞株および培養条件
Ｈ４ヒト神経芽細胞腫細胞を、１０％の正常子牛血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）および適切であれば、０．４〜１．２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を補給したＤＭＥＭ培地中において標準組織培養条件下で培養した。ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄＨ４細胞を、Zhang et al., PNAS, 102, 15545-15550 (2007)に記載されたように生成した。Ｌａｍｐ１を発現する安定株を生成するために、ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ１試薬（Mirus）を使用して、Ｈ４細胞にＬａｍｐ１−ＲＦＰをトランスフェクションし、その後、０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８で選択した。ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄＨ４細胞をｐＢａｂｅ−Ｂｃｌ−２レトロウイルスに感染させることによりＢｃｌ−２発現細胞株を生成し、その後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンにより選択した。
【０１５５】
サイトカインアッセイのために、２４ウェル（ウェスタン）または９６ウェル（ＬＣ３−ＧＦＰ数量化）プレートいずれか内で完全培地中０．５×１０5で播種した。２４時間後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、さらに２４時間に亘り、無血清ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Invitrogen）を、表示の成長因子および／またはサイトカインと共に加えた。使用した成長因子およびサイトカインとしては、ヒトＴＮＦα（Cell Science）、ヒトＬＩＦ（GeneScript Corporation）、ヒトＦＧＦ２（ProSpec）、ヒトＩＧＦ１（ProSpec）、ヒトＳＤＦ１（ProSpec）およびヒトＣＬＣＦ１（R&D Systems）が挙げられる。飢餓を誘発するために、細胞を２４時間に亘り完全培地中で培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＨＢＳＳ培地（Invitrogen）中でさらに４時間に亘り培養した。表示されている場合、２．５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（NAC, Sigma）を、培地の交換時に加えた。
【０１５６】
酸化防止剤アッセイについて、細胞を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に２．５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（NAC, Sigma）で処理し、固定化と画像解析（詳細については以下参照）前に、さらに４８時間に亘り培養した。ウェスタンブロット分析について、細胞溶解の前に最後の８〜１２時間に亘り、リソソームプロテアーゼ阻害剤Ｅ６４ｄ（Sigma）を加えた。
【０１５７】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
一次スクリーニングについて、ヒトゲノムの大半を網羅する２１，１２１のｓｉＲＮＡプールのアレイ・ライブラリを使用した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ｓｉＡＲＲＡＹｓｉＲＮＡライブラリ（ヒトゲノム、Ｇ−００５０００−０５）、コロラド州、ラフィーエット、Thermo Fisher Scientific）。各プールは、同じ遺伝子からの異なる配列を標的とする４つの特有のオリゴヌクレオチドを含んでいた。各アッセイプレートは、以下の対照も含んだ：非標的ｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲｓｉＲＮＡ、ＡＴＧ５ｓｉＲＮＡおよびＰＬＫ１ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション効率の対照）。ｓｉＲＮＡを、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬（Qiagen）によるリバーストランスフェクションを使用して、４０ｎＭの最終濃度でＬＣ３−ＧＦＰレポーターを安定に発現するＨ４細胞中に三重で一時的にトランスフェクションした。ＨｉＰｅｒｆｅｃｔをＤＭＥＭ中で１：２０に希釈し、この混合物８μｌを３８４ウェルプレートのウェルに加えた。これらのプレートを１，０００ｒｐｍで遠心分離し、その後、１μＭのアレイｓｉＲＮＡプール２μｌを各ウェルに加えた。３０分間のインキュベーション後、ウェルに４０μｌの培地中の５００の細胞を加えた。細胞を、標準培養条件下で７２時間に亘りインキュベーションし、１時間に亘り０．５μＭのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Invitrogen）で対比染色し、３０μｌの８％パラホルムアルデヒドの添加により固定化した。３０分後、解析前に、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
【０１５８】
二次スクリーニングについて、各ｓｉＲＮＡプールの４つのｓｉＲＮＡが個々のウェル中に分けられたｓｉＲＮＡライブラリを使用した。ｓｉＲＮＡを３０ｎＭの最終濃度（１．５μＬ／１μＭの株のウェル）で使用し、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔをＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen）中で１：３０に希釈したことを除いて、細胞を、一次スクリーニングにおけるようにトランスフェクションし、処理した。二次スクリーニングのトランスフェクションは、２ラウンドで行った：最初のラウンドでは、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現するＨ４細胞のＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄとの１：１の混合物を三重でトランスフェクションした；二回目のラウンドでは、ＬＣ３−ＧＦＰを発現するＨ４細胞のＬａｍｐ１−ＲＦＰとの１：１の混合物を二重でトランスフェクションした。三次特徴付けスクリーニングの全ては、ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ細胞の混合物を使用して二重で行った。各アッセイプレートは、非標的ｓｉＲＮＡ並びにｍＴＯＲ、ＡＴＧ５、ＰＬＫ１およびスクリーニングに応じて、Ｖｐｓ３４またはＳＯＤ１ｓｉＲＮＡ対照の１０〜１２ウェルを含んだ。
【０１５９】
スクリーニングヒットの低スループット確認について、培地１ｍＬ当たり２μｌまたは６μｌのＨｉＰｅｒｆｅｃｔ、４０ｎＭまたは１０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度およびそれぞれ、Ｈ４およびＭＣＦ７細胞について、５×１０4または２×１０5細胞／ｍＬでの細胞によるリバーストランスフェクションを使用して、１２または６ウェルプレート内で細胞をトランスフェクションした。ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析のために、７２時間後に細胞を収穫した。ウェスタンおよびイメージング分析のために、細胞を、トランスフェクションの２４時間後に２．５×１０4または１×１０5細胞／ｍＬで２４ウェルプレートに分割し、さらに４８時間後に収穫した。
【０１６０】
イメージングおよび画像数量化
高スループットスクリーニングについて、一次スクリーニングについては２つの波長（Ｈｏｅｃｈｓｔを検出するために３５０ｎｍ、ＬＣ３−ＧＦＰを検出するために４８８ｎｍ）を、二次スクリーニングについては３つの波長（Ｌａｍｐ１−ＲＦＰまたはＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを検出するために３５０ｎｍ、４８８ｎｍおよび５５０ｎｍ）を使用して、１０倍の倍率で自動化ＣｅｌｌＷｏＲｘ顕微鏡（Applied Precision）により細胞をイメージングした。全ての画像を、ＶＨＳｓｃａｎおよびＶＨＳｖｉｅｗ画像解析ソフトウェア（Cellomics）を使用して数量化した。合計細胞数、合計ＬＣ３−ＧＦＰ強度／細胞並びにＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソーム／細胞の数、面積および強度を記録した。核発色強度に基づく解析から、死細胞および分裂細胞の全ては排除した。各ウェルについての最終的なオートファジースコアは、合計オートファゴソーム強度／細胞をオートファゴソーム／細胞の数で乗じ、平均細胞強度で割ることによって、得た。この式は、ｍＴＯＲおよびＡｔｇ５対照に対してｓｉＲＮＡを使用したときの一貫して有意であるｚ−スコアおよびｐ−値により反映されるように、サイトゾルからオートファゴソームへのＬＣ３−ＧＦＰ転座を正確に測定するために、経験的に決定した。転座よりむしろ、レポーターの合計累積を測定する、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰについて、平均細胞強度による除算を除外したことを除いて、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄおよびＬａｍｐ１−ＲＦＰスコアは、ＬＣ３−ＧＦＰと類似の様式で得た。
【０１６１】
低スループット追加解析について、細胞をガラス製カバースリップ上で増殖させた。４％のパラホルムアルデヒド中の固定化およびＨｏｅｃｈｓｔによる対比染色後、カバースリップを５０％のグリセロール、０．１％の没食子酸ｎ−プロピル／ＰＢＳ中に取り付けた。細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡で４０倍の倍率でイメージングした。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して、細胞数、細胞面積および強度、並びにオートファゴソーム数および強度を数量化した。オートファジーを、細胞当たりのオートファゴソームの数として記録した。
【０１６２】
「Ｉｎ−ｃｅｌｌ−ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイ
ｍＴＯＲＣ１信号伝達および小胞体ストレスの誘発の定量分析について、それぞれ、ｒｐＳ６リン酸化反応およびＫＤＥＬ（ＧＲＰ７８／ＧＲＰ９４）発現の「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」分析を行った。Ｈ４細胞を、ＬＣ３−ＧＦＰアッセイについて記載したように、３８４ウェルプレート内で培養し、固定化し、対比染色した。イメージング後、細胞を、０．２％のＴｘ−１００を含有するＰＢＳ中で透過性にし、１５分間に亘り２０ｎｇ／ｍＬで、相対的細胞数を測定するために使用される非特異的リジン反応性プローブである、Ａｌｅｘａ−６８０ ＮＨＳ−エステルで染色した。その後、細胞を、０．２％のＴｘ−１００を含有するＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋０．２．％のＴｘ−１００で１：１に希釈されたＬｉＣＯＲブロッキング緩衝液）中で３０分間に亘りインキュベーションした。次いで、細胞を、ブロッキング緩衝液中で１：１０００に希釈されたウサギ−抗−ｒｐＳ６ホスホ−２３５／２３６（Cell Signaling Technologies）、またはマウス−抗−ＫＤＥＬ（Stressgen）抗体と共にインキュベーションした。一次抗体の染色後、細胞を、ＰＢＳ＋０．２％のＴｘ−１００中で洗浄し、ブロッキング緩衝液中で１：１０００に希釈されたＩＲＤｙｅ−８００−結合二次抗体（ＬｉＣＯＲ）で染色した。プレートをＡｅｒｉｕｍ赤外イメージングシステム（ＬｉＣＯＲ）で走査した。ｒｐＳ６ホスホ−２３５／２３６またはＫＤＥＬ染色と、ＮＨＳ−エステル染色の両方の強度を積算し、ホスホ−ｒｐＳ６またはＫＤＥＬ強度をＮＨＳ−エステル強度で割ることによって、正規化ホスホ−Ｓ６またはＫＤＥＬスコアを計算した。
【０１６３】
統計分析
全てのスクリーニングデータを、対数目盛（ｌｏｇ１０）への変換によって正規化した。一次スクリーニングについて、ｚ−スコアは、プレート中央値（対照は除外した）および中央絶対的偏差（ＭＡＤ）に基づいて計算した。ここで、ｚ−スコア＝（細胞スコア−中央プレートスコア）／（プレートＭＡＤ×１．４８２６）。次いで、ｚ−スコア＞１．７または＜−１．９にカットオフを設定して、スクリーニングヒットを３つのレプリカ・プレートの中央ｚ−スコアに基づいて選択し、これにより、０．０２のｐ値が得られる。アッセイを二重に行ったことを除いて、ｒｐＳ６およびＫＤＥＬ二次スクリーニングについても同じ方法を使用した。ＬＣ３−ＧＦＰ、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄおよびＬａｍｐ１−ＲＦＰ二次スクリーニングについて、ｚ−スコアは、非標的ｓｉＲＮＡ対照平均および標準偏差に基づいて計算した。ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおけるヒットの二次確認について、各遺伝子について、４つの個別のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの内の少なくとも２つが、５つのレプリカ・プレートに基づいて中央ｚ−スコア＞１．５または＜−１．５を有し、一次スクリーニングのｚ−スコアと一貫していることが要求される。これにより、ｐ＜０．０１が得られた。全ての他の二次アッセイにおいて、ｚ−スコア＞１．５または＜−１．５も有意であると考えられた。確認された遺伝子に関する最終的なｚ−スコアは、二次ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおいて陽性であると考えられたオリゴヌクレオチドについて、全てのウェルの平均ｚ−スコアに基づいて計算した。
【０１６４】
ＬＣ３−ＧＦＰおよび他の二次アッセイの間の相関分析を、個々のアッセイのウェルの四分割分析に基づいて行った：各ウェルについて、両方の特徴についてのｚ−スコアが＞１．５または＜−１．５の場合、＋１のスコアを割り当て；ｚ−スコアのいずれかがカットオフに到達しなかった場合、０のスコアを割り当てた。次いで、個々のウェルのスコアを、ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおいて有意であると考えられた全てのオリゴヌクレオチドの各遺伝子について、合計し、これらのオリゴヌクレオチドについてアッセイを行ったウェルの総数で割った。特徴間の相関は、最終的なスコアが≧０．５であれば、陽性であり、≦−０．５であれば、陰性であると考えた。
【０１６５】
相対生存率は、Ｈｏｅｃｈｓｔイメージングに基づく各ウェル内の細胞数をプレート内の平均細胞数により割ることによって計算した。各ヒット遺伝子について報告された生存率は、二次ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおいて陽性のオリゴヌクレオチドについての全てのウェルの平均生存率を反映している。５０％未満の平均生存率を有する陽性オリゴヌクレオチドの数も報告されている。＋ＮＡＣおよびＢｃｌ−２三次アッセイに関する相対生存率は、各ウェル中の細胞数を、それぞれ、ＮＡＣまたはＢｃｌ−２を含まない対応の対照プレート中の平均細胞数で割ることによって計算した。
【０１６６】
別記しない限り、残りのｐ値の全ては、等しい変化の両側のスチューデントのｔ検定から計算した。全てのエラーバーは標準誤差である。
【０１６７】
ウェスタン分析
ウェスタンブロットについて、細胞を、Ｌａｍｍｅｌｉサンプル緩衝液中で溶解させ、１０〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。以下の抗体を使用した：全て１：１０００での、ＬＣ３（Novus）、ｐ６２（Pharmigen）、ホスホ−Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−Ｓｔａｔ３（Ｔｈｒ７０５）、ＲｅｌＡ、Ｓｏｄ１、ホスホ−ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０／Ｔｈｒ３８２／３８３）（全てCell Signaling）、Ｂｃｌ−２（Santa Cruz）、１：２０００でのホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Cell Signaling）およびホスホ−ＥＲＫ１／２（Sigma）、１：５０００でのチューブリン（Sigma）。表示されている場合、ブロットは、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ６４ソフトウェアを使用して数量化した。
【０１６８】
半定量ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、製造業者の使用説明書にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）を使用して調製した。ｃＤＮＡ合成について、オリゴｄＴプライマーによるＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）に１．２５μｇのＲＮＡを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応に、以下のプライマーを使用した：RelA AGCGCATCCAGACCAACAACAACC および CCGCCGCAGCTGCATGGAGACC, AMPKα2 CACCTCGCCTGGGCAGTCACACC および ATTGGGGGCATAAACACAGCATAA, Sod1 GGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTC および ACCAGTGTGCGGCCAATGATG, βアクチン GACCTGACAGACTACCTCAT および AGACAGCACTGTGTTGGCTA。ＰＣＲ産物は、２％のアガロースゲル上で分離し、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ６４ソフトウェアを使用して数量化した。
【０１６９】
細胞反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルの数量化
ＲＯＳレベルを、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に、製造業者の使用説明書にしたがってＩｍａｇｅ−ｉＴ ＬＩＶＥ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、数量化した。画像を、４０倍の倍率でＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡で得て、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して数量化した。あるいは、ＲＯＳレベルは、ＨＢＳＳにおける４時間の飢餓後に数量化した。細胞を、３７℃で２０分間に亘り１０μＭのジヒドロエチジウムにより染色し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７０】
バイオインフォマティクス分析
解析(enrichment analyses)について、ｓｉＲＮＡスクリーニングヒット遺伝子を、生物学的プロセス、分子機能（ＰＡＮＴＨＥＲ分類システム）、細胞成分（遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類システム）、古典的(canonical)経路（ＭＳｉｇＤＢ）および転写調節因子結合部位（ＭＳｉｇＤＢおよびＴＲＡＮＳＦＡＣｖ７．４）などの機能別カテゴリーに分類した。ｓｉＲＮＡスクリーニングにおいて調査される遺伝子の広域なセットにおけるそれらの表示に対するヒット遺伝子に関するこれらのカテゴリーの統計的集積または過剰な表示を評価するために、超幾何学的確率分布を使用してｐ−値を計算し、これは、Ｒ原語で実行した。
【０１７１】
タンパク質相互作用ネットワークについて、このネットワークは、相互作用タンパク質を、データベース：ＨＰＲＤ、ＭＩＮＴ、ＲＥＡＣＴＯＭＥおよび管理された文献記載事項からの、全ゲノムのインタラクトームスクリーニングから抽出されたデータと反復して結び付けることによって、構築した。酵母相互作用データについて、酵母タンパク質をヒトオルソログにマッピングした（相互Ｂｌａｓｔｐ分析およびＨｏｍｏｌｏｇｅｎｅ）。このネットワークでは、グラフ理論表示を使用し、これは、Ｐｅｒｌプログラミング原語で実行される、ノードとしての成分（遺伝子産物）およびエッジとしての成分間の関係（相互作用）を抽出する。
【０１７２】
老化中のヒット遺伝子発現の分析
老化分析中の遺伝子発現は、若年（４０才以下）および老年（７０才以上）のヒトの脳のサンプルのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ＿２マイクロアレイデータに基づいた。アレイ正規化、発現値計算およびクラスター分析は、ｄＣｈｉｐソフトウェアを使用して行った。階層的クラスター分析を使用して、同様の発現パターンを有する遺伝子またはサンプルを分類した。最も近い距離の２つの遺伝子またはサンプルを、最初に超遺伝子または超サンプルにマージさせ、その距離を表す長さを有する枝により接続し、将来のマージから削除した。次いで、最小の距離を有する遺伝子またはサンプルの次の対（超遺伝子または超サンプル）を、マージさせるものとして選択した。全ての遺伝子およびサンプルが１つのクラスターにマージされるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１７３】
実施例１． オートファジーの調節に関与する遺伝子に関する高スループット画像ベースｓｉＲＮＡスクリーニング
哺乳類におけるオートファジーの調節に関与する遺伝子を特定するために、ＬＣ３−ＧＦＰレポーターを安定に発現するヒト神経芽細胞腫Ｈ４細胞を使用した。通常の増殖条件下で、これらの細胞中のＬＣ３−ＧＦＰは拡散したサイトゾル局在化を示す。これらの細胞においてオートファジーが誘発された場合、ＬＣ３−ＧＦＰは、サイトゾルから動員され、オートファゴソームに対応する点状パターンで視覚化できる。このシステムを検証するために、必須オートファジー媒介物質のＡＴＧ５または飢餓誘発オートファジーのサプレッサであるｍＴＯＲいずれかに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。通常の栄養条件下での７２時間のインキュベーション後、細胞をＡＴＧ５ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。これにより、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの数および強度の減少（図１Ａ）、並びにウェスタンブロットでのＬＣ３ＩＩ対ＬＣ３Ｉの比の減少（図１Ｂ）により評価されるような、オートファジーの著しいダウンレギュレーションがもたらされた。反対に、ｍＴＯＲＣ１の触媒サブユニットであるｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡの発現により、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの数および強度の増加（図１Ａ）、並びにＬＣ３ＩＩ対ＬＣ３Ｉの比の増加（図１Ｂ）がもたらされた。高スループット自動化蛍光顕微鏡で得られた３８４ウェル形式のＬＣ３−ＧＦＰ画像の数量化により、ＡＴＧ５またはｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のオートファジーのレベルにおける変化は、非標的の対照ｓｉＲＮＡと比べて、統計的に有意であることが示された（図２）。
【０１７４】
各プールが、各遺伝子について４つの独立したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有している、２１，１２１の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡプールを含有するヒトゲノムｓｉＲＮＡライブラリをスクリーニングするために、このシステムを使用した。一次スクリーニングを三重で行い、５７４の遺伝子（試験した全遺伝子の２．７％）が特定され、そのノックダウンにより、少なくとも１．９の標準偏差（ＳＤ）だけＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの形成が中央値で減少するか、またはプレート中央値から少なくとも１．７ＳＤだけ増加した。
【０１７５】
一次スクリーニングにおいて特定された候補遺伝子を、各プールから４つのｓｉＲＮＡが別々に評価された逆重畳ライブラリを使用して確認した。５４７の候補遺伝子の内、２３６（４１％）が、少なくとも２つの独立したｓｉＲＮＡを有すると確認され、非標的ｓｉＲＮＡ対照と比べて、少なくとも１．５のＳＤだけオートファジーのレベルが中央値で増加または減少する（図３、ｐ＜０．０５）。これらのヒットの大半（２１９、確認した全遺伝子の９３％、表１）のノックダウンにより、オートファジーの誘発がもたらされ、これらの遺伝子がオートファジー阻害遺伝子であることを示したのに対し、残りの１７のヒットのノックダウンでは、オートファジーが阻害させ、これらの遺伝子がオートファジー促進遺伝子であることを示した（表２）。
【０１７６】
実施例２． 候補遺伝子の二次高スループット特徴付け
新たに特定された遺伝子によるオートファジーの調節に関与する分子経路を解明するために、追加の高スループットアッセイを開発し、実施して、ヒットを特徴付けた（図４）。これらのアッセイの内の１つにおいて、飢餓誘発オートファジーの必須媒介物質であるｍＴＯＲＣ１の機能を調査した。候補遺伝子の内のどれが、ｍＴＯＲＣ１活性を変えることによってオートファジーを調節するかを決定するために、「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイを使用して、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達の下流標的であるリボソームＳ６タンパク質（ｒｐＳ６）のリン酸化反応状態を評価した。このシステムを検証するために、Ｈ４細胞をｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。非標的ｓｉＲＮＡと比べて、ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡトランスフェクション済み細胞においてｒｐＳ６リン酸化反応のレベルの著しい減少が観察された（図５）。「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイを使用して、そのノックダウンによりオートファジーの誘発がもたらされた２１９の確認された遺伝子の内の１４（６％）のみが、ｍＴＯＲＣ１活性のダウンレギュレーションと強力に相関したのに対し、そのノックダウンによりオートファジーとｍＴＯＲＣ１活性のアップレギュレーションがもたらされた９の遺伝子（４％）が特定された（図６）。
【０１７７】
そのノックダウンによりオートファジーが抑制された１７の確認された遺伝子の追加の三次スクリーニングにおいて、これらの遺伝子の３５％が、ｍＴＯＲＣ１の効力のある阻害剤であるラパマイシンの存在下でオートファジーをダウンレギュレーションできることが分かり、このことは、そのような遺伝子がｍＴＯＲＣ１の下流で機能することを示す（図７）。
【０１７８】
ＬＣ３−ＧＦＰの蓄積は、例えば、オートファジーの開始の増加またはオートファゴソームの分解の遮断によるものであろう。リソソーム部分の形状およびサイズを評価するために、リソソームタンパク質Ｌａｍｐ１−ＲＦＰを安定に発現するＨ４細胞を使用した。ｍＴＯＲのノックダウンにより、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰのレベルにおける著しい増加並びに再分布がもたらされ（図８）、オートファジーのアップレギュレーションに加え、ｍＴＯＲの阻害によっても、リソソーム部分の拡張が生じることを示唆している。このシステムを使用して、７８の遺伝子（３０％）に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰのレベルが著しく（±１．５のＳＤ）変化し、このことは、オートファジーのレベルの変化と正相関しており、これらの遺伝子が、リソソーム機能を変えることによって、オートファジーを調節することを示唆している（図９）。
【０１７９】
酵母および哺乳類細胞両方におけるオートファジーの重要な媒介物質である、III型ＰＩ３キナーゼの活性への、個々のヒットのノックダウンの影響も決定した。III型ＰＩ３キナーゼの活性を変えることによって、オートファジーを誘発するまたは抑制する遺伝子を特定するために、III型ＰＩ３キナーゼの産物であるＰｔｄＩｎｓ３Ｐに特異的に結合するＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄレポーターを安定に発現するＨ４細胞を使用した。上昇したIII型ＰＩ３キナーゼの活性により生じるＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積により、このレポーターの点状小胞局在化がもたらされる。このキナーゼの触媒成分である、Ｖｐｓ３４に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞動員が著しく減少した（図１０ＡおよびＢ）。ラパマイシンの効果と一致して、ｍＴＯＲＣ１成分のｍＴＯＲおよびＲａｐｔｏｒのノックダウンにより、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞シグナルが強力に増加した（図１０Ｃ）。このシステムを使用して、２３６の確認した遺伝子の内の１１０（４７％）のノックダウンにより、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐレベルが著しく（±１．５のＳＤ）変わり、これは、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの形成における変化と正相関する（図１１）ことも実証され、これらの遺伝子が、オートファジーの調節においてIII型ＰＩ３キナーゼの上流で働くことを示唆している。ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞動員の両方のレベルを増加させる作用物質が、オートファジー変性を誘発しそうなものの内にある。
【０１８０】
そのノックダウンがオートファジーを誘発した２１９の遺伝子をさらに細分するために、二次特徴付けアッセイにおいて特定されたサブグループの各々に属するヒットを比較した（図１２）。ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄの小胞局在化が増加したヒットと、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰを蓄積したヒットとの間の相当な重複が示された。これらの内のこの遺伝子のサブセットの活性を阻害する作用物質は、III型ＰＩ３キナーゼ、オートファジーおよびリソソーム活性を同時に調節しそうである。
【０１８１】
実施例３． 細胞死およびＥＲストレスは、ｓｉＲＮＡのスクリーニング中に誘発されたオートファジーの誘発に対する主要な要因ではない
ｓｉＲＮＡのスクリーニング中に観察されたオートファジーの誘発が、必須遺伝子のノックダウン後の細胞ストレスに対する一般的な応答を、オートファジーの調節におけるその遺伝子の特異的な機能よりも、反映したか否かを調査した。Ｂｃｌ−２の発現により、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の平均細胞生存率が著しく改善された（図１３〜１５）。Ｋｉｆ１１およびインテグリンα５を除いて、Ｂｃｌ−２を発現する細胞中でオートファジーを誘発できる９１の遺伝子のノックダウンでは、これらの細胞中の生存率の実質的な損失を生じなかった。このことは、これらの遺伝子の阻害後のオートファジーのアップレギュレーションは、細胞死応答の誘発に依存しなかったことを示唆している。そのノックダウンにより、Ｂｃｌ−２を発現する細胞においてオートファジーをアップレギュレーションできなかった遺伝子の内、８１の遺伝子が、野生型細胞において高い（８５％超の）生存率を有した。したがって、１２９の特定したオートファジー阻害剤遺伝子の１７０の活性の阻害が、細胞死に無関係の機構によるオートファジーの誘発をもたらす。
【０１８２】
細胞死に加え、ＥＲストレスを含む細胞ストレスの様々な形態に応答して、オートファジーがしばしば誘発される。我々のヒット遺伝子のノックダウンに応答したオートファジーの刺激が、ＥＲストレスによるものであり得るか否かを決定するために、ＥＲストレスの特異的マーカーであるＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４の発現レベルを評価する「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイを行った。ＥＲストレスの強力な誘導物質であるツニカマイシンによる処理が、ＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４の用量依存性アップレギュレーション（図１６）、並びにオートファジーの増加を引き起こした。試験した遺伝子の９７％において（試験した１８８の遺伝子の内の１８２、図１７）、遺伝子のノックダウン後に、オートファジーの刺激をもたらすＥＲストレスの著しいアップレギュレーションはなかった。したがって、ＥＲストレスは、スクリーニングにおいて観察されたオートファジーの誘発に対する主要な要因ではない。したがって、データは、ヒットの大半のノックダウン後のオートファジーの誘発は、広まったＥＲストレスの結果または細胞死により誘発された一般的な細胞ストレス応答の一部というよりむしろ、特異的なシグナル伝達事象の誘発のためであることを示唆している。
【０１８３】
実施例４． オートファジーの誘発へのＢｃｌ−２の影響
最初に、III型ＰＩ３キナーゼの調節オートファジー特異的成分であるｂｅｃｌｉｎ １が、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の結合パートナーとして特定された。アポトーシス細胞死の調節におけるその突出した機能に加え、Ｂｃｌ−２は、ｂｅｃｌｉｎ １との相互作用および結果として生じるIII型ＰＩ３キナーゼの活性の阻害により、オートファジーをマイナスに調節すると示唆されてきた。Ｂｃｌ−２の機能を評価するために、三次特徴付けスクリーニングを行って、野生型Ｈ４細胞およびＢｃｌ−２を安定に発現する細胞におけるオートファジーの誘発およびIII型ＰＩ３キナーゼの活性を比較した（図１８）。対照として、ｍＴＯＲのノックダウンが、Ｂｃｌ−２発現細胞においてＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞動員の両方を著しく誘発できたことが示された（図１９ＡおよびＢ）。Ｂｃｌ−２によるIII型ＰＩ３キナーゼの提案されたマイナスの調節と一致して、野生型対照と比べて、Ｂｃｌ−２を発現するＨ４細胞におけるヒット遺伝子のノックダウン後の平均ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ誘発の著しい減少が生じた（図１９Ｃ）。２１５の試験した遺伝子の内の９１（４２％）のノックダウンが、Ｂｃｌ−２の存在下でＬＣ３−ＧＦＰのオートファゴソームへの転座を誘発できた（図１４および２０）。これらの９１の遺伝子の内の１７（１９％）において、オートファジーの誘発は、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄの小胞動員により評価されるIII型ＰＩ３キナーゼの活性における増加と相関し、これらの遺伝子がＢｃｌ−２の下流のＰｔｄＩｎｓ３Ｐの産生を調節する追加の機構に関与することを示した。他方で、残りの７４の遺伝子のノックダウンが、III型ＰＩ３キナーゼを追加に起動させずに、オートファジーを誘発することができた。これらの遺伝子の３１のノックダウンが、野生型Ｈ４細胞中のＬａｍｐ１−ＲＦＰの蓄積を引き起こし、これらの場合、リソソーム分解の遮断が、Ｂｃｌ−２発現細胞におけるオートファジーの増加に寄与するであろうことを示した。残りの４３の遺伝子について、リソソーム機能における変化は観察されなかった。それゆえ、III型ＰＩ３キナーゼへのＢｃｌ−２の阻害効果は、オートファジーの誘発と常に相容れないわけではなく、その起動は、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐレベルを上昇させずに行うことができる。最後に、残りの１２４（５８％）の遺伝子のノックダウンは、Ｂｃｌ−２を過剰発現する細胞中の小胞ＬＣ３−ＧＦＰの蓄積を誘発できなかった（図１５）。
【０１８４】
実施例５． オートファジー関連遺伝子のバイオインフォマティクスネットワーク解析
オートファジーの調節に関与する生物学的ネットワークをさらに解明するために、ヒット遺伝子間の相互作用を、哺乳類および酵母データの両方に基づくその直接的な物理的相互作用をマッピングすることによって、調査した。ヒットの中には、ＮＦ−κＢの２つのサブユニット（ＮＦκＢ１およびＲｅｌＡ）、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシングに関与する３つのリボ核タンパク質（ＨＮＲＰＫ、ＨＮＲＰＭおよびＨＮＲＰＮＵ）、３つのコートマー成分（ＣｏｐＢ２、ＣｏｐＥおよびＡｒｃｎ１）および２つのＡＭＰＫサブユニット（ＡＭＰＫα２およびＡＭＰＫγ３）を含むいくつかの公知のタンパク質複合体の多数の構成員が含まれた（図２１Ａ）。さらに、ｐ３００ＨＡＴおよびＮＦκＢに集中するクロマチン修飾酵素および相互作用する転写調節因子の大きなネットワークを特定した（図２１Ｂ）。後者は、転写調節がオートファジーの調節において重大な役割を果たすであろうことを示す。
【０１８５】
スクリーニングにおいて特定した遺伝子とコアオートファジー成分との間のＩｎｔｅｒｏｌｏｇ解析（タンパク質−タンパク質の相互作用の酵母−ヒトのオルソロガス・マッピング）により、ヒットの少なくとも２つ、Ｘｐｏ１およびＯＧＤＨが、コアオートファジー機構と物理的に相互作用するであろうことが判明した（図２２）。Ｘｐｏ１は、酵母ＣＲＭ１の哺乳類ホモログであり、核外輸送機構の必須成分である。Ｂｅｃｌｉｎ １およびＡｔｇ１２とのその相互作用は、これらのタンパク質の核外輸送における機能を反映するようである。他方で、ミトコンドリアマトリックスに局在化された代謝酵素であるＯＧＤＨは、関連する複合体の酵素活性とは関係ない細胞保護活性を有することが報告されており、ミトコンドリアの損傷により誘発されるオートファジーの調節に関する候補になる。
【０１８６】
オートファジー、軸索誘導およびアクチン動態の間の関係を調査するために、これらの標準経路に属するヒット遺伝子により繋ぎ留められたタンパク質−タンパク質相互作用ネットワークを作成した（図２３および２４）。この解析により、それぞれ、２７および６１のヒット遺伝子を網羅する２つの関連したネットワークが判明した。
【０１８７】
これらの解析は、ここでオートファジーの調節に関連すると特定された特有の経路および複合体の活性を変調する作用物質の使用により、オートファジーを変調できることを示す。
【０１８８】
実施例６． オートファジーの変調におけるサイトカインの使用
遺伝子オントロジー（ＧＯ）を使用した２３６の確認したヒットの分子機能解析により、キナーゼコード化遺伝子（ｐ＝０．０００６）、受容体活性を有するタンパク質（ｐ＝７．７×１０-5）および細胞外基質タンパク質（ｐ＝０．０３）における非常に著しい増加を示した（図２５および２６）。後者のカテゴリーは、成長因子、ホルモンおよびサイトカインの存在を含む細胞外環境が、通常の栄養条件下でオートファジーの調節に役割を果たすことを示す。ＧＯ生物学的プロセス解析の結果も、シグナル伝達分子の著しい増加（ｐ＝２．８×１０-7）を示した（図２７Ａ）。オートファジーの調節における細胞外因子の提案された機能に一致して、これらのシグナル伝達分子のさらなる細分により、最大のサブグループ（４９％）が細胞表面受容体シグナル伝達に関与したことが判明した（図２７Ｂ）。
【０１８９】
細胞を、我々のスクリーニングにおいてヒットと特定されたサイトカインおよび成長因子のいくつかで処理した。特徴付けアッセイの結果に基づいて、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２、ＬＩＦ、ＣＬＣＦ１およびケモカインＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２）のノックダウンにより、オートファジーの開始の際にｍＴＯＲＣ１が独立して増加した。これと一致して、無血清培地中で増殖したＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞のこれらのサイトカインのいずれかによる処理が、ＬＣ３−ＧＦＰ転座により測定されるオートファジーの著しいダウンレギュレーションをもたらした（図２８および２９）。このデータを、ウェスタンブロット法により多数の細胞株（Ｈ４、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａおよびＭＣＦ７）において確認した（図３０）。オートファジーの調節におけるサイトカインの提案された機能に一致して、それらがない状態で培養した細胞は、ＬＣ３ＩＩの蓄積により評価された高い基礎レベルのオートファジーを示し、オートファジーは、スクリーニングにおいて特定されたサイトカインを１種類だけでも添加することによって、ある程度抑制された。それゆえ、特定されたサイトカインおよび成長因子は、オートファジーの調節にとって必要かつ十分である。
【０１９０】
上述したスクリーニングにおいて、ＴＮＦ遺伝子のノックダウンにより、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの形成が増加し、基礎オートファジーの調節にけるこのサイトカインの陰性の役割を示した。オートファジーにおけるＴＮＦαの役割をさらに調査するために、既知組成培地中で増殖したＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞を、ＴＮＦαの用量を増加させながら処理した。低用量のＴＮＦαはオートファジーのダウンレギュレーションをもたらすのに対し、より高い用量では、オートファジーのアップレギュレーションをもたらした（図３１Ａ）。これを、低レベルのＴＮＦαによる処理後のｐ６２の蓄積を示すウェスタンブロット法により確認した。ＴＮＦαの生理的レベルは非常に低いので、このことは、このサイトカインはオートファジーの陰性調節因子として通常機能することを示唆している。他方で、病理状況下でのＴＮＦαの増加した濃度はオートファジーのアップレギュレーションをもたらす。
【０１９１】
実施例７． オートファジーの調節におけるＮＦ−κＢの機能
上述した標準経路は、ＮＦ−κＢ（ｐ＝８．７×１０-6）およびＲｅｌＡ（ｐ＝１．２×１０-6）経路におけるオートファジーヒットの増加を示した。スクリーニングの確認として、ＲｅｌＡに対してｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞を個々にイメージングした。蛍光顕微鏡検査法によるＬＣ３−ＧＦＰの転座を数量化することによるオートファジーのレベルを、代わりの低スループット法を使用して評価した。我々のスクリーニングの結果に一致して、ＲｅｌＡに対する４つのオリゴヌクレオチド全てによる処理が、オートファゴソームの数と強度の強力なダウンレギュレーションをもたらした（図３２および３３）。オートファジーのレベルにおいて観察した差が、標的遺伝子のノックダウンのためであったことを確認して、ｍＲＮＡ（図３４Ａ）およびタンパク質レベル（図３４Ｂ）の両方でＲｅｌＡの強力なダウンレギュレーションが観察された。オートファジーの陽性媒介物質としてのＮＦ−κＢの機能に関する発見はＨ４細胞に限られないことを確認するために、野生型でダブルノックアウトＲｅｌＡ-/-；ＮＦ−κＢ-/-（ＤＫＯ）ＭＥＦおよびいずれかのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたヒト乳癌ＭＣＦ７細胞におけるオートファジーのレベルを、ＲｅｌＡまたは対照非標的ｓｉＲＮＡに対して比較した。ＲｅｌＡ／ＮＦκＢの不在またはダウンレギュレーションは、ＬＣ３ＩＩの減少およびｐ６２の蓄積により評価されるようにオートファジーの抑制をもたらした（図３５）。これらのデータにより、ＮＦκＢが基礎オートファジーの陽性調節因子として確認される。
【０１９２】
ここに記載した結果とは対照的に、ＮＦ−κＢの活性化が、栄養飢餓または死受容体連結などの有害な刺激に応答して誘発された細胞死に関連するオートファジーをマイナスに調節することが以前に報告された（Djavaheri-Mergy et al., J. Biol. Chem 281, 30373-30382 (2006)）。反応性酸素種（ＲＯＳ）が、飢餓誘発オートファジーの媒介に関与することが提案されているので、栄養欠乏条件下で、オートファジーのダウンレギュレーションは、ＮＦ−κＢによるＲＯＳ産生が弱まった結果であろうと推測された。野生型でｄＫＯＭＥＦおよび非標的ｓｉＲＮＡまたはＲｅｌＡに対するｓｉＲＮＡいずれかでトランスフェクションされたＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞を栄養欠乏に曝した。ＲｅｌＡ／ＮＦ−κＢ欠乏細胞の飢餓は、野生型対照に観察されたよりも高いＲＯＳ蓄積をもたらした（図３６）。ＲｅｌＡ欠乏Ｈ４細胞における飢餓に応答して観察されたオートファジーの上昇した誘発は、酸化防止剤Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）の存在下で弱まった（図３７）。
【０１９３】
これらのデータは、ＮＦ−κＢが基礎オートファジーの調節においてプラスの機能を果たすのに対し、ＲＯＳ産生を弱めるその能力は、栄養欠乏条件下で観察されたオートファジーのレベルの減少を間接的にもたらし得ることを示す。それゆえ、以前の報告とは反対に、ＮＦ−κＢは、多細胞生物において最も優勢な非飢餓条件下ではオートファジー促進因子として働く。したがって、ＮＦ−κＢの成分（ＮＦＫＢ１およびＲＥＬＡ）の活性を阻害する作用物質は、オートファジーの阻害因子として働き、癌および／または膵炎の治療に有用である。
【０１９４】
実施例８． オートファジーの調節における反応性酸素種（ＲＯＳ）の機能
ノックダウンされたときにオートファジーを誘発する遺伝子は、ＲＯＳ無害化経路の主成分であるＳＯＤ１およびＧＰｘ２、並びにその多くが酸化呼吸と電子伝達に関与するいくつかのミトコンドリアタンパク質を含んだ（図３８）。これらの遺伝子のいずれの活性の阻害も、それらの産生を増加させるか、またはそれらの分解を遮断することによって、ＲＯＳのレベルのアップレギュレーションをもたらすと予測されるであろう。さらに、多くの追加のスクリーニングのヒットが、調節に関与する、またはＲＯＳにより調節されると報告されてきた（図３９）。オートファジーの一般的な媒介因子としてのＲＯＳの潜在的な役割を評価するために、最初に、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、オートファジーの誘発並びにＲＯＳの上昇したレベルの両方をもたらしたことを確認した（図４０）。ＲＯＳの因果関係の役割を確認して、酸化防止剤ＮＡＣによる処理によって、Ｓｏｄ１のノックダウンにより生じたオートファジーの誘発が著しく弱まった（図４１）。したがって、正常な細胞ＲＯＳホメオスタシスの干渉が、オートファジーの誘発にとって十分である。
【０１９５】
オートファジーの誘発中にＲＯＳに一般的なシグナル伝達の役割があるか否かを決定するために、ＮＡＣの存在下と不在下で、我々のヒット遺伝子のノックダウンにより誘発されるIII型ＰＩ３キナーゼの活性およびオートファジーのレベルを比較する三次特徴付けスクリーニングを行った。確認した遺伝子のグループ（１１７、または試験した全遺伝子の５４％）のノックダウンにより、酸化防止剤の不在下で小胞ＬＣ３−ＧＦＰが蓄積したが、存在下では蓄積せず、オートファジーの誘発にとってＲＯＳが必要であったことを示す（図４２）。これらの遺伝子のノックダウンは、ＮＡＣの存在下で小胞関連ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄの蓄積をおおむね増加させられなかった（図４２および４３）。このことは、ＲＯＳはIII型ＰＩ３キナーゼの活性化において一般的な機能を果たし、それらを、オートファジー経路の初期段階で重要なシグナル伝達分子として関係させる。
【０１９６】
他方で、残りの９８（４６％）の遺伝子の活性の阻害は、ＮＡＣの存在下でＬＣ３−ＧＦＰの蓄積を誘発させることができ、これらの場合、オートファジーはＲＯＳとは関係なく誘発できることを示した（図４４）。これらの遺伝子のノックダウンは、ＮＡＣの存在下と不在下で類似の平均レベルの小胞ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを誘発することもできた（図４３）。それゆえ、このグループの遺伝子の活性化の阻害は、ＲＯＳとは関係ない機構によって、III型ＰＩ３キナーゼの誘発をもたらした。
【０１９７】
実施例９． 成長促進経路は、オートファジーをマイナスに調節する
オートファジースクリーニングのヒットのバイオインフォマティクス解析は、細胞表面受容体からのシグナル伝達を媒介することが知られているいくつかの標準経路について著しい増加を示した（図４５）。これらの経路は、スクリーニングにおいて特定したサイトカインにより調節されるＭＡＰＫ（ｐ＝０．０３９）、Ｓｔａｔ３（ｐ＝０．００８）およびＣＸＣＲ４（ｐ＝１．１×１０-5）経路を含んだ。ＦＧＦ２は、ＭＡＰＫ経路を活性化させことが知られており、ホスホ−ＥＲＫ１／２およびホスホ−ＲＳＫの増加レベルが、ＦＧＦ２による処理後に観察された（図４６）。ＭＡＰＫ経路の必須機能を確認して、ＭＥＫの阻害因子であるＵＯ１２６による前処理で、ＦＧＦ２の添加後にオートファジーの阻害が弱まった（図４６）。さらに、ヒット遺伝子の全ての促進因子部分の解析により、ＲＳＲＦＣ４の３つの強化部位、血清応答因子（ＳＲＦ）ファミリーの一員およびＭＡＰＫシグナル伝達の下流標的を含むいくつかの転写調節因子のコンセンサス部位の著しい増加が示され（図４７）、通常の増殖条件下でのオートファジーの制御においてＭＡＰＫ経路による転写調節の追加の関与を示唆している。
【０１９８】
オートファジーのマイナスの調節因子としてのスクリーニングから抜粋された別のヒット遺伝子は、ＬＩＦおよびＣＬＣＦ１信号伝達の媒介因子である、転写調節因子Ｓｔａｔ３であった。実際に、ＬＩＦまたはＣＬＣＦ１いずれかによる処理で、Ｓｔａｔ３のリン酸化反応の活性化が上昇した（図４８および４９）。Ｓｔａｔ３の必須機能と一致して、そのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＬＩＦに応答してオートファジーのダウンレギュレーションを弱めた（図４９）。したがって、ＬＩＦおよびＣＬＣＦ１は、Ｓｔａｔ３経路を通じてオートファジーを調節する。
【０１９９】
ｍＴＯＲＣ１を活性化することに加え、Ａｋｔは、筋変性中にオートファジーをプラスに調節する転写調節因子であり、Ｆｏｘｏ３ａを直接リン酸化し、阻害する。実際に、ＡｋｔおよびＦｏｘｏ３ａの両方のリン酸化は、ラパマイシンの不在下と存在下の両方において、ＩＧＦ−１処理後に増加した（図５０）。Ａｋｔ阻害因子ＶＩＩＩでの処理によるＡｋｔの阻害により、Ｆｏｘｏ３ａおよびｍＴＯＲＣ１標的Ｓ６キナーゼ両方のリン酸化を弱め、ＩＧＦ１によるオートファジーの阻害を防いだ（図５０）。したがって、通常の栄養条件下で、ＩＧＦ−１は、おそらくｍＴＯＲＣ１およびＦｏｘｏ３ａ経路の両方を通じて、Ｉ型ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ依存様式で、オートファジーを調節する。
【０２００】
実施例１０． ヒトの老化中のオートファジーのダウンレギュレーション
老化に関連する神経変性におけるオートファジー関連遺伝子の潜在的機能に特異的に対処するために、オートファジーヒット遺伝子のｍＲＮＡ発現を一連の若年対老年のヒトの脳のサンプルにおいて解析した。年齢と共に、著しく（ｐ＜０．０５）アップレギュレーションされた３２の遺伝子および著しくダウンレギュレーションされた４６の遺伝子のグループ（図５３〜５５）を含む遺伝子の大きいサブセット（図５１および５２）の発現差異が観察された。興味深いことに、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセス解析により、年齢のアップレギュレーションされたグループは、ＭＡＰＫ経路の媒介および調節に関与した遺伝子が非常に豊富である（ｐ＝１．６×１０-4）ことが判明し、その増加した活性は、オートファジーの抑制をもたらすと我々の分析により予測される。逆に、鍵となるオートファジー遺伝子、Ａｔｇ５およびＡｔｇ７の発現は、老化中にダウンレギュレーションされた（図５５）。これらのデータは、遺伝子発現差異により、老化中に脳におけるオートファジーのダウンレギュレーションがもたらされることを示唆しており、このことは、慢性神経変性疾患の発症に寄与するであろう。この仮説と一致して、中年の個人からのサンプルを含む、サンプルのより広範囲に及ぶセットのさらなる解析により、Ａｔｇ５およびＡｔｇ７は、その発現が６０歳代前半で始まる年齢依存様式で徐々にダウンレギュレーションされた哺乳類細胞におけるオートファジーの媒介にとって必要な遺伝子のグループの中にあったことが判明し（図５６）、この年齢は、しばしば、アルツハイマー病（ＡＤ）などの散発性神経変性疾患に関する兆候の最も早い年齢である。したがって、我々のスクリーニングにおいて特定された遺伝子の年齢依存性調節は、正常なヒトの老化中のオートファジーのダウンレギュレーションに寄与しそうであり、それゆえ、年齢関連神経変性疾患を予防し、治療するための治療標的として有用である。
【０２０１】
実施例１１． アルツハイマー病の脳サンプルにおけるオートファジー調節因子の発現差異
ＲＯＳおよびオートファジー小胞（ＡＶ）の両方の蓄積が、ＡＤにおける初期の特徴である。この疾患におけるオートファジーの調節に関与する遺伝子の発現の変化を検出できるか否かを決定するために、１４才の適合した正常な対照およびＡＤを有する３４の場合の６つの脳領域からのオートファジースクリーニングヒット遺伝子の発現を分析した。特に、この疾患により最も影響した脳領域である海馬状隆起および嗅内皮質において対照に匹敵するＡＤ患者のサンプルにおいてヒット遺伝子の全体的な著しい低発現が観察された（図５７Ａ）。ＡＤにより影響を受けた他の脳領域（上前頭回、後帯状皮質、および大脳側頭葉の外面）において、一貫した傾向が観察された。特に、ＡＤ病状に対して比較的抵抗性である視覚皮質において、これらの変化がなかった。さらに、ヒット遺伝子のさらなる細分により、嗅内皮質において、オートファジーの流れの負の調節因子が特異的に負に強化されたことが判明した（図５７Ｂ）。ＡＤの影響を受けた他の脳領域においても、同様の傾向が観察された。逆に、オートファジーのプラスの調節因子は、嗅内皮質において、プラスに強化された（図５７Ｃ）。オートファジー調節因子のそのような発現差異パターンは、ＡＤ脳におけるオートファジーのアップレギュレーションを示唆している。
【０２０２】
実施例１２． ＲＯＳがアミロイドβに応答してオートファジーを媒介する
アミロイドβ（Ａβ）は、ＡＤにおける主要な病原因子である。Ａβによるオートファジーの誘発がＲＯＳにより媒介されたか否かを調査した。Ｈ４細胞のＡβによる処理後、増加したレベルのオートファジーが観察された（図５８）。これが、オートファジーの開始の増加によるものか、またはリソソームの分解の遮断によるものかを決定するために、リソソームプロテアーゼ阻害因子Ｅ６４ｄの不在下と存在下で、Ａβ処理後のＬＣ３−ＩＩの蓄積を観察した（図５８）。処理してから８時間後まで、ＣＬ３−ＩＩの蓄積はＥ６４ｄの存在下のみで観察できた。Ａβを添加してから４８時間後で、Ｅ６４ｄの不在下でさえ、増加したレベルのＬＣ３−ＩＩが観察されたが、Ｅ６４ｄの存在下では、さらに増加していた。その上、Ａβ処理の４時間後から始まるＡｔｇ１２−Ａｔｇ５の増加した結合(conjugation)が観察された。これらのデータは共に、Ａβに応答したオートファジーの増加した開始を示す。
【０２０３】
Ａβによるオートファジーの誘発におけるIII型ＰＩ３キナーゼの関与を調査した。ＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積が観察され、これは３ＭＡの存在下で抑制され（図５９）、III型ＰＩ３キナーゼの関与が確認された。ＲＯＳの因果関係の役割と一致して、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積がＮＡＣの存在下で抑制された（図６０）。最後に、３ＭＡによる処理（図６１）またはＶｐｓ３４のノックダウン（図６２）が、Ａβに応答するオートファジーの誘発を弱めることができた。
【０２０４】
同等物
本発明は、オートファジーを変調する方法およびオートファジー関連疾患の治療法を提供する。本発明の特定の実施の形態を論じてきたが、先の明細書は、説明であって、制限的ではない。本発明の多くの変種が、この明細書を検討した際に当業者には明白となるであろう。添付の特許請求の範囲は、そのような実施の形態および変種の全てをクレームすることが意図されており、本発明の全範囲は、同等範囲と共に請求項を、変種と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
【０２０５】
ここに述べられた全ての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が参照により含まれることが具体的に個別に示されているかのように、その全てが参照によりここに含まれる。係争の場合、ここでの任意の定義を含む本出願が規制する。
【関連出願】
【０００１】
本出願は、ここにその全てを引用する、２００９年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２４７２５１号、および２００９年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／２４７３０９号への優先権の恩恵を主張するものである。
【政府の支援】
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された助成第ＡＧ０１２８５９号および第ＡＧ０２７９１６号の下で政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、オートファジー阻害遺伝子産物の変調によりオートファジーを変調する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
オートファジーは、リソソーム依存様式で細胞内成分の代謝回転を媒介する異化プロセスである（非特許文献１）。オートファジーは隔離膜の形成によって開始される。この膜は、細胞質の一部分を飲み込むように拡大して、オートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞を形成する。次いで、オートファゴソームはリソソームと融合してオートリソソームを形成する。ここで、捕捉された物質および内側の膜はリソソーム加水分解酵素により分解される。したがって、オートファジーは、大きいタンパク質複合体および欠陥細胞小器官のクリアランスにとって重大であり、細胞増殖、生存およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。
【０００５】
オートファジーは、単細胞真核生物において主に研究されており、ここで、飢餓状態での生存にとって重大であることが知られている。単細胞真核生物が栄養飢餓条件下で培養される場合、アミノ酸、脂肪酸およびヌクレオチドなどのオートファジー分解の産生物が、構造成分として、かつエネルギー源として細胞により使用され得る（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００６】
哺乳類などの複雑な多細胞真核生物における細胞は、正常な生理条件下では栄養飢餓をめったに経験しない。しかしながら、そのような細胞が栄養飢餓または細胞ストレスを経験すると、オートファジーがしばしばアップレギュレーションされ、これにより細胞の生存が向上する。それらの急激な増殖および遺伝的不安定性のために、癌細胞は、形質転換されていない細胞よりも、生存と増殖に関してオートファジーに一層依存する（非特許文献３）。さらに、オートファジーは、化学療法薬により生じる細胞ストレスに応答する癌細胞における生存機構としてしばしば活性化される。したがって、オートファジー阻害剤が、単独または他の癌治療との組合せのいずれかで、抗癌治療剤として働き得る（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００７】
細胞ストレスに応答する役割に加え、オートファジーは、機能不全の、加齢のまたは損傷したタンパク質および細胞小器官の代謝回転による細胞ホメオスタシスを維持するための重要な細胞内機構である（非特許文献２）。その結果、低減したレベルのオートファジーは、ミスフォールドタンパク質の蓄積を増加させることによって、神経変性に寄与する（非特許文献６；非特許文献７）。オートファジーのアップレギュレーションが、凝集タンパク質のレベルおよび神経変性疾患の症状の両方を減少させることが示されてきた（非特許文献８）。したがって、細胞オートファジーを促進させる作用物質(agent)が、神経変性疾患の予防または治療のための治療剤として働き得る。
【０００８】
癌および神経変性に加え、オートファジーの変調が、幅広い様々な追加の疾患および障害における治療戦略である。例えば、いくつかの肝疾患、心臓病および筋疾患が、ミスフォールドタンパク質凝集塊の蓄積に関連付けられている。そのような疾患において、細胞オートファジーを増加させる作用物質は、疾患発症凝集塊のクリアランスを向上させ、それによって、治療に寄与し、疾患の重症度が減少するであろう（非特許文献２）。その上、上昇したレベルのオートファジーも膵臓病において観察され、急性膵炎の経過の初期事象であることが示されてきた（非特許文献９）。したがって、オートファジーの阻害剤が、膵炎の治療における治療剤として機能するであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Levine and Klionsky, (2004) Dev Cell 6, 463-377
【非特許文献２】Levine and Kroemer, (2008), Cell 132, 27-42
【非特許文献３】Ding et al., (2009), Mol. Cancer Ther., 8(7), 2036-2045
【非特許文献４】Maiuri et al., (2007) Nat. Rev. Cell Biol. 8, 741-752
【非特許文献５】Amaravadi et al., (2007) J. Clin. Invest. 117, 326-336
【非特許文献６】Hara et al., (2006), Nature, 441, 885-889
【非特許文献７】Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884
【非特許文献８】Rubinsztein et al., (2007), Nat. Rev. Drug Discov. 6, 304-312
【非特許文献９】Fortunato and Kroemer, (2009), Autophagy, 5(6)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、オートファジーの変調が幅広い疾患と障害の治療のための有用な手法であることを示す十分な証拠がある。しかしながら、哺乳類のオートファジーの調節を担う遺伝子および経路は不十分にしか理解されていないので、そのような疾患を治療するための新規の治療剤および方法の開発のための標的になり得る有効なオートファジー調節因子は数少ない。したがって、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規の方法が非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、オートファジーの変調、並びに癌、神経変性疾患、肝疾患、筋疾患および膵炎を含む、オートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を提供する。本発明の方法を特定するために、ヒトｓｉＲＮＡライブラリの高スループットの画像に基づく全ゲノムスクリーニングを使用して、２３６のオートファジー関連遺伝子を特定した。これらの遺伝子は、高スループットアッセイ、低スループットアッセイおよびバイオインフォマティクス解析の組合せを使用して、広範囲に亘って特徴付けた。これらの研究の結果に基づいて、これらの遺伝子およびその遺伝子産物の変調に有用な生物剤および治療剤を特定し、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を開発した。
【００１２】
いくつかの実施の形態において、本発明は、細胞におけるオートファジーを誘発する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。ある実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGFである。本発明のある態様において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。他の態様において、作用物質は、TK1258, PF 04494700, PMX53, タムスロシン、ドキサゾシン、塩酸プラゾシン、塩酸アルフゾシン、ウロテンシンII、塩酸メカミラミン、ISIS 3521、ゲムシタビン、LY900003, MK-5108, U73122またはD609である。
【００１３】
本発明のある実施の形態は、細胞におけるオートファジーを阻害する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。
【００１４】
ある態様において、本発明は、細胞におけるオートファジーを阻害する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGFである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。いくつかの実施の形態において、作用物質は、FGF-1, 酸性FGF-1, XRP0038, RhaFGF, GW501516, メシル酸イブタモレン, KP-102LN, EP1572, TRH, S-0373, Poly-ICR, CQ-07001またはクリプトタンシノンである。いくつかの実施の形態において、作用物質は成長因子である。他の実施の形態において、成長因子は、CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGF1である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施の形態は、細胞におけるオートファジーを誘発する方法であって、細胞を、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質に接触させる工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。
【００１６】
いくつかの実施の形態において、本発明は、対象(subject)における神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質を投与する工程を含む方法に関する。ある実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, SDF1, LIF, FGF2またはIGFである。いくつかの実施の形態において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。他の態様において、作用物質は、TK1258, PF 04494700, PMX53, タムスロシン、ドキサゾシン、塩酸プラゾシン、塩酸アルフゾシン、ウロテンシンII、塩酸メカミラミン、ISIS 3521、ゲムシタビン、LY900003, MK-5108, U73122またはD609である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施の形態は、本発明は、対象における神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。
【００１８】
ある実施の形態において、神経変性疾患は、副腎白質萎縮症、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症、カナバン病、脳性小児まひ、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドオフ病、シルダー病、悪性貧血の次の脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、中毒性脳症およびこれらの疾患の併発である。いくつかの実施の形態において、タンパク質症は、α１−アンチトリプシン欠乏症、孤発性封入体筋炎、２Ｂ型肢体型筋ジストロフィー症および三好型ミオパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、球脊髄性筋萎縮症およびこれらの疾患の併発である。
【００１９】
本発明のある実施の形態は、対象の癌または膵炎を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質を投与する工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、表２、表４および／または表６に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー促進遺伝子は、TPR, GPR18, RelAまたはNFκBである。ある実施の形態において、作用物質は、抗体、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、および／またはアンチセンスＲＮＡ分子である。
【００２０】
ある態様において、本発明は、対象の癌または膵炎を治療する方法であって、対象に、本発明のオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を含む方法に関する。いくつかの実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、表１、表３、表５、表７、図１４、図１５、図３９、図４４、および／または図５５に列記された遺伝子から選択される。他の実施の形態において、オートファジー阻害遺伝子は、TRPM3, TMPRSS5, IRAK3, ADMR, FGFR1, UNC13B, PTGER2, AGER, BGN, GABBR2, PPARD, GHSR, BAIAIP2, SORCS2, PAQR6, EPHA6, TRHR, C5AR1, BAI3, TLR3, PTPRH, ADRA1A, UTS2R, RORC, CHRND, TACR2, P2RX1, PLXNA2, PTPRU, FCER1A, CD300C, TNFRSF19L CLCF1, SDF1, LIF, FGF2またはIGFである。ある実施の形態において、作用物質は抗体である。いくつかの実施の形態において、作用物質は、FGF-1, 酸性FGF-1, XRP0038, RhaFGF, GW501516, メシル酸イブタモレン, KP-102LN, EP1572, TRH, S-0373, Poly-ICR, CQ-07001またはクリプトタンシノンである。いくつかの実施の形態において、作用物質は成長因子である。他の実施の形態において、成長因子は、CLCF1, LIF, FGF2, SDF1またはIGF1である。
【００２１】
いくつかの実施の形態において、癌を治療する方法は、化学療法薬の投与および／または放射線療法などの公知の癌治療法をさらに含む。ある実施の形態において、化学療法薬は、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、２−クロロデオキシアデノシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、イミダゾールカルボキサミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン−ダウノマイシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルダラビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンαｎ３、イリノテカン、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メゲストロール、メルファラン、Ｌ−サルコシリン(sarcosylin)、メルファラン塩酸塩、ＭＥＳＮＡ、メクロレタミン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、メルカプトプリン、パクリタキセル、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、または酒石酸ビレノルビンである。
【００２２】
本発明の他の実施の形態は、作用物質がオートファジー阻害剤であるか否かを決定する方法であって、細胞を作用物質に接触させる工程を有してなり、細胞が本発明の異種(heterologous)オートファジー促進遺伝子を発現し、それによって、細胞におけるオートファジーの低減が、その作用物質がオートファジー阻害剤であることを示す方法に関する。ある態様において、作用物質は、小分子、抗体、または抑制性ＲＮＡ分子である。
【００２３】
本発明のある実施の形態は、作用物質がオートファジー阻害剤であるか否かを決定する方法であって、細胞を作用物質に接触させる工程を有してなり、本発明のオートファジー促進遺伝子の発現が細胞中で阻害され、それによって、細胞中のオートファジーの低減が、その作用物質がオートファジー阻害剤であることを示す方法に関する。ある態様において、作用物質は、小分子、抗体、または阻害性ＲＮＡ分子である。いくつかの実施の形態において、細胞は、オートファジー関連遺伝子に対する突然変異を含む。他の実施の形態において、オートファジー関連遺伝子は、抑制性ＲＮＡまたは小分子により阻害される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａは、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたＧＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。図１Ｂは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞の溶解物およびＬＣ３またはチューブリンいずれかに特異的な抗体を使用して行ったウェスタンブロットの結果を示す。
【図２】図２は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図３−１】図３は、本発明のオートファジー変調遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図３−２】図３−１の続き
【図３−３】図３−２の続き
【図３−４】図３−３の続き
【図３−５】図３−４の続き
【図３−６】図３−５の続き
【図３−７】図３−６の続き
【図４】図４は、本発明のオートファジー変調遺伝子を特定し、特徴付けるために使用したスクリーニングおよび特徴付けアッセイの選択を示す説明図を示す。
【図５】ｍＴＯＲＣ１活性を測定する一連のｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）ブロットアッセイの数量化を示す。アスタリスクは、表示のサンプルとｎｔＲＮＡ対照サンプルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図６】図６は、その産物の阻害がｍＴＯＲＣの発現の減少をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図７】図７は、その産物の阻害が、ラパマイシンの存在下でｍＴＯＲＣの低減した発現およびオートファジーのダウンレギュレーションの両方をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図８】図８Ａは、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたＲＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。図８Ｂは、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＡｔｇ５に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＲＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図９−１】図９は、その産物の阻害がＬａｍｐ１−ＲＦＰ発現細胞中のオートファゴソーム関連Ｌａｍｐ１−ＲＦＰのレベルにおける著しい変化をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図９−２】図９−１の続き
【図９−３】図９−２の続き
【図１０】図１０Ａは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、Ｖｐｒｓ３４またはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたｄｓＲｅｄの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。図１０Ｂは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、Ｖｐｒｓ３４またはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図１０Ｃは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、ＲａｐｔｏｒまたはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。
【図１１−１】図１１は、その産物の阻害がＰｔｄＩｎｓ３Ｐのレベルにおける著しい変化をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号および名称を示す。
【図１１−２】図１１−１の続き
【図１１−３】図１１−２の続き
【図１１−４】図１１−３の続き
【図１２】図１２は、その産物の阻害がオートファジーの誘導をもたらす遺伝子の、III型ＰＩ３キナーゼ活性、リソソーム機能およびｍＴＯＲＣ１活性への依存性に基づく機能別カテゴリーへの細分を示すベン図を示す。
【図１３】図１３は、ｓｉＲＮＡ（Ｈ４＋Ｂｃｌ−２）を標的とするオートファジー関連遺伝子がトランスフェクションされたＢｃｌ−２発現Ｈ４細胞と比べた、ｓｉＲＮＡ（Ｈ４）を標的とするオートファジー関連遺伝子がトランスフェクションされた野生型Ｈ４細胞の相対的平均生存率を示す。
【図１４−１】図１４は、その産物の阻害がＢｃｌ−２発現細胞におけるオートファジーの促進をもたらす遺伝子の相対生存率、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図１４−２】図１４−１の続き
【図１４−３】図１４−２の続き
【図１５−１】図１５は、その産物の阻害が、Ｂｃｌ−２発現細胞ではなく、野生型細胞におけるオートファジーの促進をもたらす遺伝子の相対生存率、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図１５−２】図１５−１の続き
【図１５−３】図１５−２の続き
【図１５−４】図１５−３の続き
【図１６】図１６は、ツニカマイシンにより処理されたＨ４細胞中のＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４のレベルの増加を示す「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイの数量化を示す。アスタリスクは統計的有意を示す。
【図１７】図１７は、その産物の阻害が、オートファジーの向上および小胞体（ＥＲ）ストレスレベルにおける変化をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図１８】図１８は、ｐＢａｂｅ−Ｂｃｌ−２レトロウイルスへの感染およびプロマイシンの選択後のＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰおよびＨ４ ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ細胞におけるＢｃｌ−２発現を示すウェスタンブロットを示す。
【図１９】図１９Ａは、ＬＣ３−ＧＦＰおよびＢｃｌ−２を安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図１９Ｂは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄおよびＢｃｌ−２を安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルと、ｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図１９Ｃは、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを安定に発現し、Ｂｃｌ−２（Ｈ４）も発現せず、Ｂｃｌ−２（Ｈ４＋Ｂｃｌ−２）も発現しないオートファジー関連遺伝子産物に対するｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ｄｓＲｅｄのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、表示したレベルの間の差が統計的有意であることを示す。
【図２０】図２０は、そのノックダウンが、低ＰｔｄＩｎｓ３Ｐの条件下でオートファジーを誘発することができたオートファジー関連遺伝子の、III型ＰＩ３キナーゼ活性をアップレギュレーションするまたはリソソーム機能を変更する能力に基づく機能的カテゴリーへの細分を示す。
【図２１】図２１Ａは、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのように特定のタンパク質複合体に関連付けられるかを示す。図２１Ｂは、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのように転写調節因子およびクロマチン修飾酵素のネットワークに関連付けられるかを示す。
【図２２】図２２は、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのようにコアのオートファジー機構と相互作用するかを示す。
【図２３】図２３は、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのように軸索誘導調節経路内で相互作用するかを示す。
【図２４】図２４は、本発明の選択されたオートファジー関連遺伝子産物がどのようにアクチン細胞骨格調節経路内で相互作用するかを示す。
【図２５】図２５Ａは、本発明のオートファジー関連遺伝子の分子機能別カテゴリーへの細分を示す。図２５Ｂは、図２５Ａにおいて受容体と分類された本発明のオートファジー関連遺伝子の受容体別カテゴリーへのさらなる細分を示す。
【図２６−１】図２６は、本発明のオートファジー関連遺伝子の分子機能別カテゴリー、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、および名称を示す。
【図２６−２】図２６−１の続き
【図２６−３】図２６−２の続き
【図２６−４】図２６−３の続き
【図２６−５】図２６−４の続き
【図２６−６】図２６−５の続き
【図２６−７】図２６−６の続き
【図２６−８】図２６−７の続き
【図２７】図２７Ａは、本発明のオートファジー関連遺伝子の生物学的プロセス別カテゴリーへの細分を示す。図２７Ｂは、図２７Ａにおけるシグナル伝達のメディエータとして分類された本発明のオートファジー関連遺伝子のシグナル伝達別カテゴリーへのさらなる細分を示す。
【図２８】図２８は、示された成長因子（ＩＧＦ１、ＦＧＦ２、ＬＩＦ、ＣＬＣＦ１およびＳＤＦ１）の存在下で増殖したＨ４ ＣＬ３−ＧＦＰ細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルと未処理細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図２９】図２９は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、栄養飢餓条件下で未処理の（未処理）、通常の(normal)増殖条件下で未処理の（血清）、または栄養飢餓条件下でＣＬＣＦ１、ＬＩＦ、ＦＧＦ２またはＩＧＦ１で処理した（それぞれ、ＣＬＣＦ１、ＬＩＦ、ＦＧＦ２およびＩＧＦ１）Ｈ４細胞中で発現されたＧＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。
【図３０】図３０は、サイトカインが、ラパマイシンの不在下と存在下でオートファジーを抑制できることを示す。Ｈ４細胞を無血清培地中で増殖させ、その後、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＧ１（Ａ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（Ｂ）、５０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦ（Ｃ）、５０ｎｇ／ｍＬのＣＬＣＦ１（Ｄ）または１０μｇ／ｍＬのＥ６４ｄ（Ｅ）を添加した。示された場合、サイトカインの添加前に、細胞を１時間に亘り５０ｎＭのラパマイシンで前処理した。オートファジーのレベルは、ＬＣ３に対する抗体を使用してウェスタンブロットにより評価した；ｍＴＯＲＣ１活性は、ホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６、Ｐ−Ｓ６）およびホスホ−Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９、Ｐ−Ｓ６Ｋ）に対する抗体により評価した。ＬＣ３ ＩＩ／チューブリン比の数量化が示されている。
【図３１】図３１Ａは、５、２０、１００または２００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαの存在下またはラパマイシンの存在下で増殖したＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルと未処理細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。図３１Ｂは、栄養飢餓条件下で未処理の（−）、通常の増殖条件下で未処理の（血清）、ラパマイシンで処理された（Ｒａｐ）、または栄養飢餓条件下で５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理されたＨ４細胞中のｐ６２のレベルを示すウェスタンブロットを示す。
【図３２】図３２は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中で発現されたＧＦＰの局在を示す蛍光顕微鏡画像を示す。
【図３３】図３３は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＲＦＰのレベルの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルとｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図３４】図３４Ａは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡの内の１つがトランスフェクションされたＨ４細胞中のＲｅｌＡ ｍＲＮＡのレベルを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図３４Ｂは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）、ＲｅｌＡに特異的な４つの別個のｓｉＲＮＡの内の１つ、または４つのＲｅｌＡ特異的ｓｉＲＮＡのプールがトランスフェクションされたＨ４細胞中のｐ６５のレベルを検出するウェスタンブロットの結果を示している。
【図３５】図３５Ａは、野生型（ｗｔ）Ｈ４細胞並びにＲｅｌＡ-/-およびＮＦκＢ-/-ダブルノックアウト（ＤＫＯ）Ｈ４細胞中のＲｅｌＡおよびＬＣ３のレベルを示すウェスタンブロットを示す。図３５Ｂは、ＲｅｌＡに特異的なｓｉＲＮＡ、非標的ｓｉＲＮＡ（ｎｔ）、ｍＴまたはＡｔｇ５がトランスフェクションされたＨ４細胞中のＲｅｌＡ、ｐ６２およびＬＣ３のレベルを示すウェスタンブロットを示す。
【図３６】図３６Ａは、通常の増殖条件下（ｍｏｃｋ）および栄養飢餓条件下（飢餓）での野生型Ｈ４細胞並びにＲｅｌＡ-/-およびＮＦκＢ-/-ダブルノックアウト（ＤＫＯ）Ｈ４細胞中の反応性酸素種のレベルを示すＦＡＣＳヒストグラムを示す。図３６Ｂは、図３６Ａに示されたデータの数量化を示す。図３６Ｃは、通常（＋血清）または飢餓（ＨＢＳＳ）条件下で増殖した、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中の反応性酸素種のレベルの数量化を示す。
【図３７】図３７は、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、栄養飢餓条件下で、酸化防止剤存在下（ＮＡＣ）または酸化防止剤の不在下で増殖した、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＲｅｌＡに特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。
【図３８】図３８は、その産物がミトコンドリアに局在化されることが予測される本発明のオートファジー関連遺伝子に関する、遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および予測理由を示す。
【図３９−１】図３９は、酸化的損傷または反応性酸素種の調節に対する関連が知られている、本発明のオートファジー関連遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および名称を示す。
【図３９−２】図３９−１の続き
【図３９−３】図３９−２の続き
【図４０】図４０Ａは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のＳＯＤ１、ｐ６２およびＬＣ３のレベルを示すウェスタンブロットを示す。図４０Ｂは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）またはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされた、もしくは１００ｍＭのＴＢＨＰにより処理された細胞中の反応性酸素種のレベルを示す蛍光顕微鏡画像を示す。図４０Ｃは、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔ）またはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされた細胞中の反応性酸素種のレベルの数量化を示す。アスタリスクは、示したレベルとｎｔＲＮＡがトランスフェクションされた細胞のレベルとの間の差が統計的有意であることを示す。
【図４１】ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現し、酸化防止剤の存在下（ＮＡＣ）または酸化防止剤の不在下（−）いずれかで、非標的の対照ｓｉＲＮＡ（ｎｔＲＮＡ）もしくはｍＴＯＲまたはＳＯＤ１に特異的なｓｉＲＮＡがトランスフェクションされたＨ４細胞中のオートファゴソーム関連ＧＦＰのレベルの数量化を示す。
【図４２−１】図４２は、その産物の阻害により、酸化防止剤の存在下ではなく不在下でオートファジーの促進がもたらされる遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および名称を示す。
【図４２−２】図４２−１の続き
【図４２−３】図４２−２の続き
【図４２−４】図４２−３の続き
【図４３】図４３は、酸化防止剤の存在下（ＮＡＣ）でオートファジーを誘発できる（ｙｅｓ）またはできない（ｎｏ）本発明のオートファジー関連遺伝子の産物の阻害後の平均のIII型ＰＩ３キナーゼ活性の数量化を示す。
【図４４−１】図４４は、その産物の阻害が、酸化防止剤の存在下でオートファジーの向上をもたらす遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号および名称を示す。
【図４４−２】図４４−１の続き
【図４４−３】図４４−２の続き
【図４５】図４５は、スクリーニングにおいて調査した全ての遺伝子に対するヒット(hit)遺伝子の中での標準経路（ＭＳｉｇＤＢ）のＥＡ法(enrichment analysis)を示す。ｐ値＜０．０５（超幾何分布）が有意であると考えられる。少なくとも５つの遺伝子を有するカテゴリーのみが示されている。
【図４６】図４６は、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２によるオートファジーのダウンレギュレーションが、ＭＥＫ阻害因子ＵＯ１２６の添加により妨げられることを示す。Ｈ４細胞は、無血清培地中で増殖させ、１０μｇ／ｍＬのＥ６４ｄの存在下で、ＬＣ３に対する抗体、ホスホ−ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＲＳＫおよびホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）に関するＭＥＫの阻害について、オートファジーのレベルを評価した。ＬＣ３ＩＩ／チューブリン比の数量化が示されている。
【図４７】図４７は、ＭＳｉｇＤＢからのモチーフに基づく遺伝子セットおよびＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースに定義されたＴＦ−結合部位を使用して、ヒット遺伝子のプロモータ中のシスエレメント／転写因子（ＴＦ）−結合部位のＥＡ法を示す。ＳＲＦ部位が強調されている。
【図４８】図４８は、５０ｎｇ／ｍＬのＣＬＣＦ１による処理後のＳｔａｔ３のリン酸化を示すウェスタンブロットを示す。
【図４９】図４９は、５０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦによるオートファジーのダウンレギュレーションが、Ｓｔａｔ３のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンにより妨げられることを示す。Ｈ４細胞に表示のｓｉＲＮＡを７２時間に亘りトランスフェクションし、次いで、細胞を、図４６について記載したように処理した。タンパク質レベルおよびＳｔａｔ３のリン酸化が示されている。
【図５０】図５０は、１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１によるオートファジーの抑制が、Ａｋｔ阻害因子ＶＩＩＩにより妨げられることを示す。細胞を図４６について記載したように処理した。Ａｋｔ活性を、ホスホ−Ｆｏｘｏ３ａおよびホスホ−ｒｐＳ６に対する抗体について評価した。
【図５１】図５１は、若年（４０才以下）または老年（７０才以上）のヒトの脳のサンプルにおける選択されたオートファジーヒット遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルのクラスター分析を示す。
【図５２】図５２は、図４５に示されたデータに関する相関行列を示す。
【図５３】図５３は、若年（４０才以下）または老年（７０才以上）のヒトの脳のサンプルにおける選択されたオートファジーヒット遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルのクラスター分析（ｄＣｈｉｐ）を示す。
【図５４】図５４は、年齢依存性調節が最も著しい、本発明のオートファジー関連遺伝子に関する相関行列を示す。
【図５５−１】図５５は、老化中にヒトの脳において特異に調節される本発明のオートファジー関連遺伝子の遺伝子記号、Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ番号、倍率変化およびｐ値を示す。
【図５５−２】図５５−１の続き
【図５６】図５６は、老化中の本発明のオートファジー関連遺伝子の発現レベルを示す。
【図５７】図５７は、特異な遺伝子発現によりアルツハイマー病におけるオートファジーのアップレギュレーションがもたらされることを示す。スクリーンニングヒット遺伝子セットに関する標準偏差と共にNormarized Enrichment Score（ＮＥＳ）推定値のフォレスト・プロットが示されている。図５７Ａは、影響を受けていない同年齢の対照と比べたＡＤ脳の異なる領域における全体のスクリーニングヒット遺伝子発現のＧＳＥＡ解析を示す。図５７Ｂおよび５７Ｃは、オートファジーフラックス(flux)の陰性（Ｂ）および陽性（Ｃ）調節因子として機能することが決定されたヒット遺伝子のＧＳＥＡ解析を示す。正方形のサイズは、それぞれのＳＤに反比例する。
【図５８】図５８は、Ｈ４細胞の５μＭのＡβによる処理後の１０μＭのＥ６４ｄの存在下と不在下でのＬＣ３−ＩＩの蓄積のレベルの比較を示す。
【図５９】図５９は、ＡβがＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積を誘発することを示す。ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ細胞を図５８に記載したように調製し、固定化し、画像化した。示された場合、III型ＰＩ３キナーゼ阻害因子３ＭＡ（１０ｍＭ）を、固定化前に８時間に亘り加えた。
【図６０】図６０は、ＡβによるIII型ＰＩ３キナーゼ活性の誘発が、酸化防止剤の存在下で抑制されることを示す。細胞を、図５９に記載したように調製し、酸化防止剤ＮＡＣの存在下または不在下で処理した。
【図６１】図６１は、Ａβによるオートファジーの誘発が、III型ＰＩ３キナーゼ活性に依存することを示す。Ｈ４ＧＦＰ−ＬＣ３細胞を、図５９に記載したように処理し、画像化した。
【図６２】図６２は、Ａβによるオートファジーの誘発が、III型ＰＩ３キナーゼ活性に依存することを示す。Ｈ４細胞に、III型ＰＩ３キナーゼサブユニットＶｐｓ３４に対するｓｉＲＮＡまたは非標的の対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、次いで、図５９に記載したように処理した。それぞれ、ＬＣ３およびＬａｍｐ２に対する抗体を使用して、オートファジーおよびリソソーム変化を決定した。
【図６３−１】図６３は、本発明のオートファジー関連遺伝子の活性を変調させる選択された小分子作用物質の化学構造を示す。
【図６３−２】図６３−１の続き
【図６３−３】図６３−２の続き
【図６３−４】図６３−３の続き
【図６３−５】図６３−４の続き
【図６４】本発明のオートファジー関連遺伝子のＧｅｎｂａｎｋ登録番号、名称、遺伝子記号およびｍＲＮＡ配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
オートファジーは、細胞成分の代謝回転を媒介し、幅広い疾患から多細胞真核生物を保護するリソソーム依存性代謝プロセスである。オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規な方法を開発するために、ヒトのｓｉＲＮＡライブラリの高スループットの画像に基づく全ゲノムスクリーニングを行って、オートファジー変調および調節に関与する遺伝子を特定した。このスクリーニングにより、ノックダウンされたときに、通常の栄養条件下でオートファジーのレベルの増加または減少のいずれかをもたらした２３６のオートファジー関連遺伝子を特定した。本発明のオートファジー関連遺伝子が図３に列記されている。これらの遺伝子を、高スループットアッセイ、低スループットアッセイおよびバイオインフォマティクス解析の組合せを使用して、広範囲に亘って特徴付けた。これらの研究の結果に基づいて、これらの遺伝子およびその遺伝子産物の変調に有用な生物剤および治療剤を特定し、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を特定した。したがって、本発明は、オートファジーの変調、並びに癌、神経変性疾患、肝疾患、筋疾患および膵炎を含む、オートファジー関連疾患の治療のための新規の方法を提供する。
【００２６】
１． 定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語および語句を以下、明細書に亘り定義する。
【００２７】
単数形は、物品の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を意味するためにここに用いられる。一例として、「要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００２８】
ここに用いたように、「投与する(administering)」という用語は、対象に治療剤または組成物を提供することを意味し、以下に限られないが、医療専門家による投与および自己投与を含む。
【００２９】
ここに用いたように、「作用物質(agent)」という用語は、対象または細胞に所望の生物学的作用を及ぼすことのできる実体を称する。様々な治療剤(therapeutic agent)が、当該技術分野において公知であり、その作用により特定されるであろう。生物学的起源の治療剤の例としては、成長因子、ホルモン、およびサイトカインが挙げられる。様々な治療剤が、当該技術分野において公知であり、その作用により特定されるであろう。その例としては、小分子（例えば、薬剤）、抗体、ペプチド、タンパク質（例えば、サイトカイン、ホルモン、可溶性受容体および非特異的タンパク質）、オリゴヌクレオチド（例えば、ペプチドコード化ＤＮＡおよびＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ）およびペプチドミメティクスが挙げられる。
【００３０】
ここに用いたように、「抗体」という用語は、全長の抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または一本鎖を含む。「抗体」という用語は、以下に限られないが、ジスルフィド結合により相互に接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を含む。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく；異種、同種、または同系であってよく；またはその修飾形態（例えば、ヒト化、キメラ）であってもよい。
【００３１】
ここに用いたように、抗体の「抗原結合タンパク質」という語句は、抗原に特異的に結合する能力を維持する抗体の１つ以上の断片を称する。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片により行うことができる。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶH、ＶL、ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶHおよびＣＨ１領域からなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶHおよびＶL領域からなるＦｖ断片；（ｖ）ＶH領域からなる、ｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544 546）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）合成リンカーにより必要に応じて結合してよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ；が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つの領域ＶHおよびＶLは、別々の遺伝子によりコード化されているが、それらは、組換え方法を使用して、ＶHおよびＶL領域が対になって一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423 426; および Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 5883を参照のこと）を形成する１つのタンパク質鎖としてそれらを作製することのできる合成リンカーによって、結合することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」の用語に包含されることが意図されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、その断片は、完全な抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００３２】
ここに用いたように、「癌」という用語は、以下に限られないが、固形腫瘍および血液性腫瘍を含む。癌という用語は、皮膚、組織、器官、骨、軟骨組織、血液および体内の管の疾患を含む。「癌」という用語はさらに、原発性癌および転移性癌の両方を包含する。
【００３３】
ここに用いたように、「遺伝子産物」および「遺伝子の産物」という用語は、遺伝子によりコード化され、遺伝子の転写により、直接的または間接的いずれかで産生され得る物質を称する。「遺伝子産物」および「遺伝子の産物」という用語は、ＲＮＡ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ遺伝子産物（例えば、ｃＤＮＡ）およびポリペプチド遺伝子産物（例えば、タンパク質）を含む。
【００３４】
ここに用いたように、遺伝子産物の「活性を向上させる」という語句は、遺伝子産物に関連する特定の活性の増加を称する。向上した活性の例としては、以下に限られないが、ｍＲＮＡの増加した翻訳、ポリペプチドまたはタンパク質による増加したシグナル伝達および酵素による増加した触媒作用が挙げられる。活性の向上は、例えば、個々の遺伝子産物により生じる活性の増加量により、その活性を生じる遺伝子産物の増加した数により、またはその任意の組合せにより、起こり得る。遺伝子産物が生物学的プロセス（例えば、オートファジー）を向上させる場合、そのような遺伝子産物の「活性を向上させる」ことは、一般に、そのプロセスを向上させる。逆に、遺伝子産物が生物学的プロセスの阻害因子として働く場合、そのような遺伝子産物の「活性を向上させる」ことは、一般に、そのプロセスを阻害する。
【００３５】
ここに用いたように、遺伝子産物の「活性を阻害する」という語句は、その遺伝子産物に関連する特定の活性の減少を称する。阻害される活性の例としては、以下に限られないが、ｍＲＮＡの減少した翻訳、ポリペプチドまたはタンパク質による減少したシグナル伝達および酵素による減少した触媒作用が挙げられる。活性の阻害は、例えば、個々の遺伝子産物により生じる減少した量の活性により、活性を生じる遺伝子産物の減少した数により、またはそれらの任意の組合せにより、起こり得る。遺伝子産物が生物学的プロセスを向上させる場合、そのような遺伝子産物の「活性の阻害」は、一般に、そのプロセスを阻害する。逆に、遺伝子産物が生物学的プロセスの阻害因子として機能する場合、そのような遺伝子産物の「活性の阻害」は、一般に、そのプロセスを促進させる。
【００３６】
ここに用いたように、「単離された」という用語は、物質（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）が、自然環境またはそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）において、それらと共に見つかる他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの、それらが天然に関連している物質を含まないまたは実質的に含まない状態を称する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、希釈剤またはアジュバントを配合しても差し支えなく、それでも、「単離されている」と考えられる。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、診断または治療に使用するときに、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合して差し支えない。
【００３７】
ここに用いたように、「変調」という用語は、生物活性のアップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激）、ダウンレギュレーション（すなわち、阻害または抑制）、もしくはそれら２つの組合せまたは別々を称する。
【００３８】
ここに用いたように、「神経変性疾患 」および「神経変性疾病」という語句は、神経病理学などの中枢および末梢神経系の幅広い疾病および／または疾患を称し、以下に限られないが、パーキンソン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脱神経性萎縮、耳硬化症、脳梗塞、痴呆、多発性硬化症、ハンチントン病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連する脳障害、並びに神経性細胞毒性および細胞死に関連する他の疾病を含む。
【００３９】
ここに用いたように、「薬学的に許容される」という語句は、有効な医学判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または妥当なリスク便益比に相応の他の問題および合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した作用物質、化合物、材料、組成物、および／または投与形態を称する。
【００４０】
ここに用いたように、「薬学的に許容される担体」という語句は、作用物質をある器官または体の部分から別の器官または体の部分に運ぶまたは輸送するのに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒被包材料などの、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、配合物の他の成分と相溶性であり、患者にとって有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として働ける材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスルロースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）カカオバターおよび座薬ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンガ溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物、および（２２）薬剤配合物中に使用される他の非毒性相溶性物質が挙げられる。
【００４１】
ここに用いたように、「薬学的に許容される塩」という語句は、化合物の比較的非毒性の無機および有機塩を称する。
【００４２】
ここに用いたように、「対象」という用語は、治療または療法のために選択されたヒトまたはヒトではない動物を意味する。
【００４３】
ここに用いたように、「有することが疑われる対象」という語句は、疾病またはよくない健康状態の１つ以上の臨床的指標を示す対象を意味する。ある実施の形態において、その疾病またはよくない健康状態は、癌、神経変性疾患または膵炎である。
【００４４】
ここに用いたように、「その必要のある対象」という語句は、本発明の療法または治療を必要としていると認定された対象を意味する。
【００４５】
ここに用いたように、「治療効果」という語句は、作用物質により生じる、動物、特に哺乳類、とりわけヒトにおける局所効果または全身的な効果を称する。「治療に効果的な量」および「効果的な量」という語句は、少なくとも細胞の部分的個体群においてある程度所望の効果を生じる作用物質の量を意味する。治療に効果的な量は、任意の治療に適用できる妥当なリスク便益比である程度の所望の局所効果または全身的な効果を生じる作用物質の量を含む。例えば、本発明の方法に使用される特定の作用物質は、そのような治療に適用できる妥当なリスク便益比を生じるのに十分な量で投与してよい。
【００４６】
ここに用いたように、対象における疾病を「治療する」もしくは疾病を有するまたは有すると疑われる対象を「治療する」という用語は、疾病の少なくとも１つの症状が軽減される、または悪化するのが防がれるように、対象に、薬品治療を施す、例えば、作用物質を投与することを称する。
【００４７】
２． オートファジー関連遺伝子
本発明のオートファジー関連遺伝子は、その産物がオートファジーを阻害する遺伝子（すなわち、表１に列記されたオートファジー阻害遺伝子）およびその産物がオートファジーを促進させる遺伝子（すなわち、表２に列記されたオートファジー促進遺伝子）に分類できる。
【００４８】
オートファジー阻害遺伝子の産物の活性を変調する作用物質が、オートファジー関連疾病の治療において有用である。オートファジー阻害遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質は、上昇したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを促進する方法、並びに神経変性疾患およびタンパク質症などの、オートファジーの上昇したレベルに応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。他方で、オートファジー阻害遺伝子の産物の活性を促進する作用物質は、減少したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを阻害する方法、並びに癌および膵炎などの、オートファジーの阻害に応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。
【表１−１】
【表１−２】
【表１−３】
【表１−４】
【表１−５】
【表１−６】
【表１−７】
【表１−８】
【表１−９】
【００４９】
オートファジー促進遺伝子の産物の活性を変調する作用物質も、オートファジー関連疾病の治療において有用である。例えば、オートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質は、減少したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを阻害する方法、並びに癌および膵炎などの、オートファジーの阻害に応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。オートファジー促進遺伝子の産物の活性を促進する作用物質は、上昇したオートファジーレベルをもたらし、したがって、オートファジーを促進する方法、並びに神経変性疾患およびタンパク質症などの、オートファジーの上昇したレベルに応答するオートファジー関連疾病の治療において有用である。
【表２】
【００５０】
それゆえ、本発明のある実施の形態は、表１に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性化の阻害により、または表２に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の向上により、オートファジーを促進させるおよび／または神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法に関する。本発明の他の実施の形態は、表１に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性の向上により、または表２に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の阻害により、オートファジーを阻害するおよび／または癌または膵炎を治療する方法に関する。
【００５１】
本発明の他の実施の形態は、表３に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性の阻害により、または表４に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の向上により、オートファジーを促進させるおよび／または神経変性疾患および／またはタンパク質症を治療する方法に関する。本発明の他の実施の形態は、表３に列記されたオートファジー阻害遺伝子の産物の活性の向上により、または表４に列記されたオートファジー促進遺伝子の産物の活性の阻害により、オートファジーを阻害するおよび／または癌または膵炎を治療する方法に関する。
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【表３−７】
【表３−８】
【表４】
【００５２】
本発明のオートファジー関連遺伝子の産物は、数多くの相互排他的ではない部類に分類できる。例えば、本発明のある遺伝子産物は、酸化還元酵素、受容体、プロテアーゼ、リガーゼ、キナーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、シャペロン、加水分解酵素、膜交通タンパク質(membrane traffic proteins)、カルシウム結合タンパク質および／または調節分子と分類できる。選択されたオートファジー阻害遺伝子産物の分類が表５に列記されており、一方で、選択されたオートファジー促進遺伝子産物の分類が表６に列記されている。あるタイプの作用物質が、特定の部類の遺伝子産物の活性の変調により適しているが、いくつかの実施の形態において、本発明は、オートファジー関連遺伝子産物の１つ以上の部類の変調に関する。
【表５−１】
【表５−２】
【表５−３】
【表５−４】
【表５−５】
【表５−６】
【表６】
【００５３】
３． オートファジー関連遺伝子産物の変調物質(modulators)
本発明のある実施の形態は、オートファジーを変調するまたはオートファジー関連疾病（例えば、神経変性疾患、肝疾患、心臓病、癌、膵炎）を治療する方法に関する。これらの方法は、本発明の１種類以上のオートファジー関連遺伝子産物の活性を変調する作用物質を投与する工程を含む。ある実施の形態において、本発明の方法は、対象に、表１〜４に列記された遺伝子の１種類以上の産物の活性を減少させる作用物質を投与することによる、オートファジー関連疾病の治療を含む。他の実施の形態において、本発明の方法は、対象に、表１〜４に列記された遺伝子の１種類以上の産物の活性を増加させる作用物質を投与することによる、オートファジー関連疾病の治療を含む。表１〜４に列記された遺伝子産物の活性を変調し、それにより、オートファジー関連疾病を治療するまたは予防するのに使用してよい作用物質としては、抗体（例えば、結合(conjugated)抗体）、タンパク質、ペプチド、小分子、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ分子、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５４】
本発明のある方法を実施するために、本発明のオートファジー関連遺伝子産物の活性を変調するどのような作用物質を使用しても差し支えない。そのような作用物質は、ここに記載されたもの、当該技術分野に公知のもの、または決まりきったスクリーニングアッセイ（例えば、ここに記載されたスクリーニングアッセイ）により特定されたものであって差し支えない。
【００５５】
いくつかの実施の形態において、本発明の方法に有用な作用物質を特定するために使用されるアッセイは、オートファジー関連遺伝子産物と１種類以上のアッセイ成分との反応を含む。他の成分は、試験化合物（例えば、潜在的な作用物質）、または試験化合物とオートファジー関連遺伝子産物の天然の結合パートナーとの組合せのいずれであってもよい。ここに記載されたものなどのそのようなアッセイにより特定された作用物質は、例えば、オートファジーの変調およびオートファジー関連疾病の治療のために有用であろう。
【００５６】
本発明の方法に有用な作用物質は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリを含む、どのような入手可能な供給源から得てもよい。作用物質は、生物学的ライブラリ；ペプチドライブラリ（ペプチドの機能を有するが、酵素分解に対して耐性であるが、それにもかかわらず生物活性のままである新規の非ペプチド主鎖を有する分子のライブラリ；例えば、Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85を参照）；空間的にアドレス可能な並列固相または溶液相ライブラリ；デコンボリューションを要する合成ライブラリ法；「１ビーズ−１化合物」ライブラリ法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ法を含めた当該技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法の中の多数の手法のうちのいずれにより得てもよい。生物学的ライブラリおよびペプチドライブラリの手法は、ペプチドライブラリに限られるが、その他の４つの手法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリに適用することができる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145）。
【００５７】
分子ライブラリの合成に関する方法の例は、当該技術分野、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; および in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見出すことができる。
【００５８】
作用物質のライブラリは、溶液中（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421）、ビーズ上（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ上（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌および／または胞子上（Ladner、米国特許第5,223,409号明細書）、プラスミド上（Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869）、またはファージ上（Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, 前出）に提示されるであろう。
【００５９】
本発明の方法において有用な作用物質は、例えば、本発明のオートファジー関連遺伝子産物またはその生物学的活性部分の担体である候補すなわち試験化合物をスクリーニングするアッセイを使用して特定してもよい。別の実施の形態において、本発明の方法において有用な作用物質は、本発明のオートファジー関連遺伝子産物またはその生物学的活性部分に結合する候補すなわち試験化合物をスクリーニングするアッセイを使用して特定してもよい。オートファジー関連遺伝子産物に直接結合する試験化合物の能力を決定することは、例えば、その化合物のオートファジー関連遺伝子産物との結合が、複合体における標識された化合物を検出することにより決定できるように化合物を放射性同位体または酵素標識に結合させることによって行っても差し支えない。例えば、化合物は、直接的または間接的いずれかで、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または3Ｈで標識付けることができ、その放射性同位体は、放射線の直接計数またはシンチレーション計数により検出できる。あるいは、アッセイ成分に、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識し、酵素標識を、適切な基質の生成物への転化の決定により検出することができる。
【００６０】
本発明の方法において有用な作用物質は、例えば、オートファジー関連遺伝子産物とその担体および／または結合パートナーとの間の相互作用を変調する（例えば、プラスまたはマイナスいずれかに影響を与える）化合物を特定するアッセイを使用して特定してもよい。そのような化合物としては、以下に限られないが、抗体、ペプチド、ホルモン、オリゴヌクレオチド、核酸、その類似体などの分子が挙げられる。そのような化合物は、天然および／または合成化合物の系統的ライブラリを含むどのような利用可能な供給源から得てもよい。
【００６１】
オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用を変調する化合物を特定するために使用されるアッセイシステムの基本原理は、オートファジー関連遺伝子産物およびその結合パートナーを含有する反応混合物を、この２つの産物が相互作用し、結合する条件下で十分な時間に亘り調製し、それゆえ、複合体を形成する工程を含む。阻害活性について作用物質を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在下と不在下で調製される。試験化合物は、反応混合物中に最初に含ませても、またはオートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーの添加後に加えても差し支えない。対照反応混合物は、試験化合物を含まず、またはプラシーボと共に、インキュベーションされる。次いで、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間のどのような複合体の形成も検出される。対照反応における複合体の形成と、試験化合物を含有する反応混合物中にそのような形成がわずかしかまたは全くないことは、その化合物が、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーの相互作用に干渉することを示す。逆に、対照反応中ではなく、化合物の存在下でより多くの複合体が形成されたことは、その化合物がオートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの相互作用を促進させるであろうことを示す。
【００６２】
オートファジー関連遺伝子産物のその結合パートナーとの相互作用を変調する化合物に関するアッセイは、不均一または均一形態で行ってもよい。不均一アッセイは、オートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーいずれかを固相に固定化し、反応の終わりで固相に固定化された複合体を検出する各工程を含む。均一アッセイにおいて、全反応は液相中で行われる。いずれの手法においても、反応体の添加順序は、試験されている化合物についての異なる情報を得るために、変えても差し支えない。例えば、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用に干渉する（例えば、競合により）試験化合物は、試験基質の存在下で反応を行うことにより、すなわち、試験物質を、オートファジー関連遺伝子産物とその反応性の結合パートナーと同時に、またはその添加後に、反応混合物に添加することによって、特定することができる。あるいは、予め形成された複合体を妨害する試験化合物、例えば、その複合体からの成分の内の１つを置換する、結合定数が高い化合物は、複合体が形成された後に、試験化合物を反応混合物に添加することによって、試験できる。様々な形態を以下に手短に記載する。
【００６３】
不均一アッセイシステムにおいて、オートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーのいずれかを固体表面またはマトリクスに固定化し、一方で、他方の対応する非固定化成分に、直接的または間接的いずれかで標識付けてもよい。実際には、この手法のために、マイクロタイタプレートをよく利用する。固定化種は、典型的に当業者によく知られた数多くの方法により、非共有または共有いずれで、固定化して差し支えない。非共有結合は、しばしば、固体表面をオートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーの溶液で被覆し、乾燥することにより、単純に行うことができる。あるいは、固定化すべきアッセイ成分に特異的な固定化抗体を、この目的に使用しても差し支えない。
【００６４】
関連するアッセイにおいて、アッセイ成分の一方または両方をマトリクスに固定化できる領域を加える融合タンパク質を提供しても差し支えない。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／マーカー融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／結合パートナーを、グルタチオンセファロースビーズ（ミズーリ州、セントルイス所在のシグマケミカル社(Sigma Chemical)）またはグルタチオン誘導マイクロタイタプレートに固定化することができ、次いで、これを試験化合物または試験化合物および非固定化オートファジー関連遺伝子産物またはその結合パートナーいずれかと組み合わせ、その混合物を、複合体形成を助長する条件下（例えば、生理的条件下）でインキュベーションする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタプレートのウェルを洗浄して、どのような未結合のアッセイ成分も除去し、固定化された複合体を、例えば、上述したように、直接的または間接的いずれかで評価する。あるいは、複合体をマトリクスから解離させ、標準技法を使用して、オートファジー関連遺伝子産物の結合または活性のレベルを決定しても差し支えない。
【００６５】
均一アッセイを使用して、オートファジー関連遺伝子産物の変調物質を特定してもよい。これは、典型的に、上述したものと類似の反応であり、これは、その試験化合物の存在下または不在下で液相中において行われる。次いで、形成された複合体を未反応成分から分離し、形成された複合体の量を決定する。不均一アッセイシステムについて述べたように、反応体の液相への添加順序によって、どの試験化合物が複合体の形成を変調する（阻害するまたは促進する）かについて、および予め形成された複合体を妨害するかについての情報を生成することができる。
【００６６】
そのような均一アッセイにおいて、反応生成物は、以下に限られないが、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動および免疫沈降を含む数多くの標準技法のいずれによって、未反応アッセイ成分から分離してもよい。分画遠心法において、分子の複合体は、その異なるサイズおよび密度に基づいて、複合体の異なる沈降平衡のために、一連の遠心工程により、複合体を形成していない分子から分離してもよい（例えば、Rivas, G., and Minton, A.P., Trends Biochem Sci 1993 Aug;18(8):284-7を参照）。標準的なクロマトグラフィー技法を利用して、複合体を形成していないものから、複合体を形成した分子を分離してもよい。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、サイズに基づいて分子を分離し、例えば、カラム形態にある適切なゲル濾過樹脂を利用することにより、比較的大きな複合体が、比較的小さい、複合体を形成していない成分から分離されるであろう。同様に、複合体を形成していない分子と比べて、複合体の比較的異なる電荷特性を活用して、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用することにより、複合体を、残りの個々の反応体から区別して分離してもよい。そのような樹脂およびクロマトグラフィー技法が、当業者によく知られている（例えば、Heegaard, 1998, J Mol. Recognit. 11:141-148; Hage and Tweed, 1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 699:499-525を参照）。ゲル電気泳動を利用して、未結合種から複合体を形成した分子を分離してもよい（例えば、Ausubel et al (eds.), In: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999を参照）。この技法において、タンパク質または核酸の複合体は、例えば、サイズまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動プロセス中に結合相互作用を維持するために、還元剤の不在下での非変性ゲルが典型的に好ましいが、特定の反応体に適切な条件が、当業者によく知られているであろう。免疫沈降は、溶液からタンパク質−タンパク質複合体を単離するために利用される別の一般的な技法である（例えば、Ausubel et al (eds.), In: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, New York. 1999を参照）。この技法において、結合分子の内の１つに特異的な抗体に結合する全てのタンパク質が、遠心法により容易に収集されるポリマービーズにその抗体を結合させる(conjugating)ことによって、溶液から沈降される。結合したアッセイ成分は、ビーズから放出され（特異的タンパク質分解事象または複合体中のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害しない当該技術分野によく知られた他の技法により）、この時には対応する異なる相互作用アッセイ成分に特異的な抗体を利用して、第２の免疫沈降工程が行われる。このようにして、唯一の形成された複合体がビーズに結合したままになるはずである。試験化合物の存在下と不在下の両方における複合体の形成における変異を比べることができ、それゆえ、その化合物の、オートファジー関連遺伝子産物とその結合パートナーとの間の相互作用を変調する能力についての情報が提供される。
【００６７】
オートファジー関連遺伝子産物の発現の変調物質は、例えば、細胞を候補の化合物と接触させ、細胞中のオートファジー関連遺伝子に対応するｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法を使用して特定してもよい。候補の化合物の存在下でのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルが、候補の化合物の不在下でのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比べられる。次いで、候補の化合物を、この比較に基づいて、オートファジー関連遺伝子産物の発現の変調物質として特定することができる。例えば、オートファジー関連遺伝子産物の発現が、候補の化合物の存在下でのほうが、不在下でよりも大きい場合、候補の化合物が、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤(stimulator)として特定される。逆に、オートファジー関連遺伝子産物の発現が、候補の化合物の存在下でのほうが、不在下でよりも小さい場合、候補の化合物が、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤(inhibitor)として特定される。細胞中のオートファジー関連遺伝子産物の発現レベルは、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための、ここに記載された方法によって決定できる。
【００６８】
オートファジー阻害遺伝子産物の活性を阻害する作用物質は、例えば、オートファジーの促進および神経変性疾患の治療において、有用である。オートファジー阻害遺伝子産物のそのような阻害剤の例が、表７および図６３に列記されている。
【表７】
【００６９】
あるいは、オートファジー阻害遺伝子産物の活性を促進させる作用物質は、例えば、オートファジーの阻害並びに癌および膵炎の治療において、有用である。オートファジー阻害遺伝子産物のそのような促進物質の例が、表８および図６３に列記されている。
【表８】
【００７０】
表１〜４に列記されたオートファジー関連遺伝子産物を変調する作用物質のさらに別の例が、例えば、米国特許第7,348,140号; 同第6,982,265号; 同第6,723,694号; 同第6,617,311号; 同第6,372,250号; 同第6,334,998号; 同第6,319,905号; 同第6,312,949号; 同第6,297,238号; 同第6,228,835号; 同第6,214,334号; 同第6,096,778号; 同第5,990,083号; 同第5,834,457号; 同第5,783,683号; 同第5,681,747号; 同第5,556,837号; 同第5,464,614号の各明細書に見られ、これらの各々の全てがここに具体的に引用される。表１〜４に列記されたオートファジー関連遺伝子産物を変調する作用物質の例が、例えば、米国特許出願公開第2009/0137572号; 同第2009/0136475号; 同第2009/0105149号; 同第2009/0088401号; 同第2009/0087454号; 同第2009/0087410号; 同第2009/0075900号; 同第2009/0074774号; 同第2009/0074711号; 同第2009/0074676号; 同第2009/0069245号; 同第2009/0068194号; 同第2009/0068168号; 同第2009/0060898号; 同第2009/0047240号; 同第2009/0042803号; 同第2009/0029992号; 同第2009/0011994号; 同第2009/0005431号; 同第2009/0005309号; 同第2009/0004194号; 同第2008/0319026号; 同第2008/0312247号; 同第2008/0300316号; 同第2008/0300180号; 同第2008/0299138号; 同第2008/0280991号; 同第2008/0280886号; 同第2008/0268071号; 同第2008/0262086号; 同第2008/0255200号; 同第2008/0255084号; 同第2008/0255036号; 同第2008/0242687号; 同第2008/0241289号; 同第2008/0234284号; 同第2008/0234257号; 同第2008/0221132号; 同第2008/0194672号; 同第2008/0194555号; 同第2008/0187490号; 同第2008/0171769号; 同第2008/0167312号; 同第2008/0146573号; 同第2008/0132555号; 同第2008/0125386号; 同第2008/0124379号; 同第2008/0103189号; 同第2008/0051465号; 同第2008/0051383号; 同第2008/0045588号; 同第2008/0045561号; 同第2008/0045558号; 同第2008/0039473号; 同第2008/0033056号; 同第2008/0021036号; 同第2008/0021029号; 同第2008/0004300号; 同第2007/0293525号; 同第2007/0293494号; 同第2007/0287734号; 同第2007/0286853号; 同第2007/0281965号; 同第2007/0281894号; 同第2007/0280886号; 同第2007/0274981号; 同第2007/0259891号; 同第2007/0259827号; 同第2007/0254877号; 同第2007/0249519号; 同第2007/0248605号; 同第2007/0219235号; 同第2007/0219114号; 同第2007/0203064号; 同第2007/0173440号; 同第2007/0155820号; 同第2007/0149622号; 同第2007/0149580号; 同第2007/0134273号; 同第2007/0129389号; 同第2007/0112031号; 同第2007/0099964号; 同第2007/0099952号; 同第2007/0098716号; 同第2007/0093480号; 同第2007/0082929号; 同第2007/0004765号; 同第2007/0004654号; 同第2006/0286102号; 同第2006/0276381号; 同第2006/0265767号; 同第2006/0263368号; 同第2006/0257867号; 同第2006/0223742号; 同第2006/0211752号; 同第2006/0199796号; 同第2006/0194821号; 同第2006/0166871号; 同第2006/0147456号; 同第2006/0134128号; 同第2006/0115475号; 同第2006/0110746号; 同第2006/0058255号; 同第2006/0025566号; 同第2006/0009454号; 同第2006/0009452号; 同第2006/0002866号; 同第2005/0288316号; 同第2005/0288243号; 同第2005/0250719号; 同第2005/0249751号; 同第2005/0246794号; 同第2005/0227921号; 同第2005/0222171号; 同第2005/0197341号; 同第2005/0187237号; 同第2005/0182006号; 同第2005/0175581号; 同第2005/0171182号; 同第2005/0164298号; 同第2005/0153955号; 同第2005/0153878号; 同第2005/0148511号; 同第2005/0143381号; 同第2005/0119273号; 同第2005/0106142号; 同第2005/0096363号; 同第2005/0070493号; 同第2005/0043233号; 同第2005/0043221号; 同第2005/0038049号; 同第2005/0015263号; 同第2005/0009870号; 同第2004/0266777号; 同第2004/0261190号; 同第2004/0248965号; 同第2004/0248884号; 同第2004/0242559号; 同第2004/0241797号; 同第2004/0229250号; 同第2004/0220270号; 同第2004/0204368号; 同第2004/0192629号; 同第2004/0186157号; 同第2004/0132648号; 同第2004/0091919号; 同第2004/0072836号; 同第2004/0063708号; 同第2004/0063707号; 同第2004/0057950号; 同第2003/0225098号; 同第2003/0220246号; 同第2003/0211967号; 同第2003/0199525号; 同第2003/0187001号; 同第2003/0186844号; 同第2003/0166574号; 同第2003/0166573号; 同第2003/0166001号; 同第2003/0153752号; 同第2003/0077298号; 同第2003/0069430号; 同第2003/0059455号; 同第2003/0040612号; 同第2009/0099069号; 同第2008/0312413号; 同第2008/0280845号; 同第2008/0248462号; 同第2008/0248462号; 同第2008/0213250号; 同第2008/0145313号; 同第2008/0021080号; 同第2008/0021036号; 同第2008/0004309号; 同第2007/0298124号; 同第2007/0298104号; 同第2007/0281986号; 同第2007/0264195号; 同第2007/0232556号; 同第2007/0190149号; 同第2007/0111934号; 同第2007/0071675号; 同第2007/0021360号; 同第2007/0010658号; 同第2006/0235034号; 同第2006/0233799号; 同第2006/0160737号; 同第2006/0128696号; 同第2006/0121042号; 同第2006/0039904号; 同第2006/0019882号; 同第2005/0272655号; 同第2005/0197293号; 同第2004/0247592号; 同第2004/0204356号; 同第2004/0132023号; 同第2004/0116669号; 同第2004/0072836号; 同第2004/0048895号; 同第2004/0022765号; 同第2003/0165485号; 同第2003/0162964号; 同第2003/0153503号; 同第2003/0125276号; 同第2003/0114657号; 同第2003/0091569号; 同第2003/0078199号; 同第2002/0137095号; 同第2001/0006793号; 同第2001/0002393号; 同第2002/0183319号; および 同第2002/0156081号の各明細書にも見られ、これらの各々の全てがここに具体的に引用される。
【００７１】
４． オートファジー関連遺伝子産物のオリゴヌクレオチド阻害剤
本発明のある実施の形態において、オートファジー関連ＲＮＡ遺伝子産物のオリゴヌクレオチド阻害剤が、オートファジーを変調し、オートファジー関連疾病を治療するために使用される。オリゴヌクレオチド阻害剤としては、以下に限られないが、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、リボザイムおよび三重分子(triplex molecules)が挙げられる。そのような分子が当該技術分野において公知であり、当業者は、所定の方法を使用して、本発明のオートファジー関連遺伝子のいずれについてのオリゴヌクレオチド阻害剤も作製することができるであろう。
【００７２】
アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子、リボザイムまたは三重分子は、細胞と接触させても、または生物に投与してもよい。あるいは、そのような分子をコード化する構築体(constructs)を細胞と接触させても、もしくは細胞または生物に導入してもよい。アンチセンス構築体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ干渉構築体またはｓｉＲＮＡ二重ＲＮＡ分子を使用して、関心のあるタンパク質、例えば、本発明のオートファジー関連遺伝子の発現を妨げても差し支えない。典型的にｍＲＮＡ配列の補体の少なくとも１５、１７、１９、または２１のヌクレオチドが、アンチセンス分子にとって十分である。典型的に標的配列の少なくとも１５、１７、１９、または２１のヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉分子にとって十分である。いくつかの実施の形態において、ＲＮＡ干渉分子は２ヌクレオチド３’オーバーハングを有する。ＲＮＡ干渉分子が、構築体からの、例えば、ヘアピン分子からまたは所望のオートファジー関連遺伝子配列の逆繰返し配列からの細胞中で発現される場合、内因性細胞機構により、オーバーハングが作製されるであろう。ｓｉＲＮＡは、化学合成、インビトロ転写、またはＲｎａｓｅ ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒによる長いｄｓＲＮＡの消化によって調製できる。これらは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞内感染または当該技術分野に公知の他の方法により細胞中に導入できる。例えば、Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418: 244-251; Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7: 1509-1521; Hutvagner G et al., RNAi: Nature abhors a double-strand. Cur. Open. Genetics & Development 12: 225-232; Brummelkamp, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, and Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M, and Taira K. (2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, and Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Dev. 16:948-958; Paul CP, Good PD, Winer I, and Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, and Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520; Yu J-Y, DeRuiter SL, and Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052;国際公開第２００６／０６６０４８号、同第２００９／０２９６８８号の各パンフレット、米国特許出願公開第２００９／０１２３４２６号明細書を参照のこと。これらの各々を全て引用する。
【００７３】
アンチセンスまたはＲＮＡ干渉分子は、細胞にインビトロで、または例えば、腫瘍または哺乳類の疾病組織にインビボで、送達することができる。当該技術分野に公知の典型的な送達手段を使用することができる。例えば、腫瘍への送達は、腫瘍内注射により行うことができる。制限なく、静脈内、筋肉内、腹膜内、動脈内、手術中の局部送達、内視鏡、皮下、および経口を含む送達の他の態様を使用することができる。任意の特定の施用に関する所望の特性のために、ベクターを選択しても差し支えない。ベクターは、ウイルス、細菌またはプラスミドであり得る。この点に関して、アデノウイルスベクターが有用である。組織特異的、細胞タイプ特異的、または他の調節可能なプロモータを使用して、抑制性ポリヌクレオチド分子の転写を調節するために使用することができる。リポソームまたはナノスフェアなどの非ウイルス担体を使用しても差し支えない。
【００７４】
本発明の方法において、ＲＮＡ干渉分子またはＲＮＡ干渉コード化オリゴヌクレオチドを、例えば、送達試薬とも組合せた裸ＲＮＡとして、および／またはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子を発現する配列を含む核酸として、対象に投与することができる。いくつかの実施の形態において、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子を発現する配列を含む核酸は、ベクター、例えば、プラスミド、ウイルスおよび細菌ベクター内で送達される。当該技術分野に公知のどのような核酸送達法を本発明に使用しても差し支えない。適切な送達試薬としては、以下に限られないが、例えば、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ脂肪親和性試薬、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、ポリカチオン（例えば、ポリリシン）、アテロコラーゲン、ｎａｎｏｐｌｅｘ（商標）およびリポソームが挙げられる。
【００７５】
核酸分子の送達ビヒクルとしてのアテロコラーゲンの使用が、Minakuchi et al. Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanai et al. Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); および Kawata et al. Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)に記載されており、その各々の全てがここに引用される。
【００７６】
本発明のいくつかの実施の形態において、抑制性オリゴヌクレオチドを対象に送達するために、リポソームが使用される。本発明に使用するのに適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成でき、これは、一般に、中性のまたは負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールを含む。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームのサイズおよび血流中のリポソームの半減期などの要因の検討により導かれる。例えば、Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467;および米国特許第4,235,871号, 同第4,501,728号, 同第4,837,028号, および同第5,019,369号の各明細書に記載されているような、リポソームを調製するための様々な方法が公知である。その全ての開示がここに引用される。
【００７７】
本発明の方法に使用するためのリポソームは、リポソームを癌細胞、膵炎細胞またはニューロンに向けるリガンド分子を含み得る。細胞タイプに特異的な抗原に結合するモノクローナル抗体などの、癌細胞、膵炎細胞またはニューロン中に蔓延した受容体に結合するリガンドが好ましい。
【００７８】
本発明に使用するためのリポソームは、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを避けるように修飾することもできる。そのような修飾リポソームは、表面上にまたはリポソーム構造中に組み込まれたオプソニン作用阻害部位を有する。ある実施の形態において、本発明のリポソームは、オプソニン作用阻害部位およびリガンドの両方を含み得る。
【００７９】
本発明のリポソームを調製するのに使用するオプソニン作用阻害部位は、典型的に、リポソーム膜に結合した大きい親水性ポリマーである。ここに用いたように、オプソニン作用阻害部位は、例えば、膜自体中に脂質可溶性アンカーのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基への直接的な結合により、化学的または物理的に膜に付着されたときに、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン作用阻害親水性ポリマーは、例えば、ここにその開示を引用する、米国特許第４９２００１６号明細書に記載されているように、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの摂取を著しく減少させる保護表面層を形成する。
【００８０】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部位は、好ましくは約５００から約４０，００００ダルトン、より好ましくは約２，０００から約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖、分岐鎖、またはデンドリマーポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学的に結合するポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、並びにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、またはメトキシＰＰＧ、もしくはその誘導体のコポリマーも適している。その上、オプソニン作用阻害ポリマーは、ＰＥＧおよびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドいずれかのブロックコポリマーであって差し支えない。オプソニン作用阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナンを含有する天然の多糖類；アミン化多糖類またはオリゴ糖類（直鎖または分岐鎖）；またはカルボキシル化多糖類またはオリゴ糖類、例えば、カルボキシル基の結果としての結合によるカルボン酸の誘導体と反応した；であって差し支えない。オプソニン作用阻害部位がＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体であることが好ましい。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは、ときには、「ＰＥＧ化(PEGylated)リポソーム」と呼ばれる。
【００８１】
オプソニン作用阻害部位は、数多くのよく知られた技法のいずれか１つによってリポソーム膜に結合させても差し支えない。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーに結合させ、次いで、膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーは、６０℃での３０：１２の比率のテトラヒドロフランと水などの、溶媒混合物およびＮａ（ＣＮ）ＢＨ3を使用した還元性アミン化により、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーにより誘導体化できる。
【００８２】
オプソニン作用阻害部位により修飾されたリポソームは、未修飾のリポソームよりもずっと長く、循環中に残る。この理由のために、そのようなリポソームは、ときには「ステルス(stealth)」リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは、多孔質または「漏れ孔のある(leaky)」微小血管系により供給される組織中に蓄積することが知られている。それゆえ、そのような微小血管系欠陥により特徴付けられる組織、例えば、固形癌は、これらのリポソームを効率的に蓄積する。Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 18:6949-53を参照のこと。その上、ＲＥＳによる摂取の減少により、肝臓および脾臓中のリポソームの著しい蓄積を防ぐことによって、ステルスリポソームの毒性が低下する。
【００８３】
５． オートファジー関連遺伝子産物に特異的な抗体
高い特異性で特定の標的に結合する能力のために、ポリペプチドオートファジー関連遺伝子産物に特異的な抗体は、そのような遺伝子産物の活性を阻害するかまたは促進し、それによって、オートファジーを阻害するかまたは促進することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、受容体に特異的な抗体は、活性化リガンドとの相互作用を遮断することによって、その受容体の活性を阻害することができる。同様に、可溶性リガンド（例えば、サイトカインまたは成長因子）または膜結合リガンドに特異的な抗体は、リガンドの受容体への結合を阻害することによって、リガンドに結合できる受容体の活性を阻害することができる。他の実施の形態において、受容体に特異的な抗体を使用して、架橋させ、それによって、受容体を活性化させることもできる。抗体は、細胞外タンパク質（例えば、受容体および／またはリガンド）の活性を阻害または促進するのに特に有用であるが、細胞中のタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の使用も、当該技術分野において公知である（例えば、Carlson, J. R. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646; Biocca, S. et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Werge, T. M. et al. (1990) FEBS Lett. 274:193-198; Carlson, J. R. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428; Marasco, W. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893; Biocca, S. et al. (1994) Biotechnology (NY) 12:396-399; Chen, S-Y. et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Duan, L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079; Chen, S-Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936; Beerli, R. R. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23931-23936; Beerli, R. R. et al. (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672; Mhashilkar, A. M. et al. (1995) EMBO J. 14:1542-1551; Richardson, J. H. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141; Marasco et al.による国際公開第94/02610号パンフレッ; および Duan et al.による国際公開第95/03832号パンフレットを参照のこと）。したがって、オートファジー関連遺伝子のペプチド産物に特異的な抗体は、本発明の方法のための生物学的作用物質として有用である。
【００８４】
オートファジー関連遺伝子のペプチド産物に特異的に結合する抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)により記載されている標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法などの様々な公知の技法を使用して産生できる。さらに、当該技術分野に公知のモノクローナル抗体を製造するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリを使用したファージディスプレイ技法を利用しても差し支えない。
【００８５】
ポリクローナル抗体は、適切な対象をポリペプチド免疫原で免疫化させることによって調製することができる。免疫化された対象におけるポリペプチド抗体の力価は、固定化ポリペプチドを使用した酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準技法によって、時間の経過でモニタすることができる。所望であれば、抗原に対して作られた抗体を哺乳類から（例えば、血液から）単離し、さらに、ＩｇＧ分画を得るためのタンパク質Ａクロマトグラフィーなどの、よく知られた技法によって精製しても差し支えない。免疫化後の適切な時間で、例えば、抗体の力価が最高であるときに、抗体産生細胞を、対象から得て、モノクローナル抗体を調製するために使用することができる。
【００８６】
リンパ球および不死化された細胞系統を融合するために使用される多くのよく知られたプロトコルのいずれを、オートファジー関連遺伝子の産物に対して特異的なモノクローナル抗体を産生する目的に適用しても差し支えない（例えば、Galfre, G. et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. (1977) 前出; Lerner (1981) 前出; Kenneth (1980) 前出を参照のこと）。さらに、当業者には、有用であろうそのような方法の多くの変種があることが認識されよう。典型的に、不死細胞系統（例えば、骨髄腫細胞系統）が、リンパ球と同じ哺乳類種から誘導される。例えば、ネズミ・ハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物により免疫化されたネズミからのリンパ球を、不死化されたネズミ細胞系統と融合することによって作製することができる。適切なネズミ細胞系統の例は、ハイポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のあるネズミ骨髄腫細胞系統である。標準技法による融合パートナーとして、数多くの骨髄腫細胞系統のいずれを、例えば、P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 または Sp2/O-Ag14骨髄腫系統を使用しても差し支えない。これらの骨髄腫系統は、メリーランド州、ロックビル所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる。典型的に、ＨＡＴ−感受性ネズミ骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用して、ネズミ脾細胞に融合される。次いで、融合から生じたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を使用して選択する。この培地は、未融合のおよび非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺す（形質転換されていないので、未融合の脾細胞は数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的ＥＬＩＳＡ検定法を使用して、所定のポリペプチドに結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。
【００８７】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の代案として、適切なオートファジー関連遺伝子産物に関する組換え組合せイムノグロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージまたは酵母ディスプレイライブラリ）をスクリーニングし、それによって、オートファジー関連遺伝子産物に結合するイムノグロブリンライブラリの構成員を単離することによって、上述したオートファジー関連遺伝子産物の内の１つに特に特異的なモノクローナル抗体を特定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリを生成し、スクリーニングするためのキットが市販されており（例えば、the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; および the Stratagene SurfZAP（商標） Phage Display Kit, Catalog No. 240612）、ファージおよび酵母ディスプレイライブラリをスクリーニングする方法が当該技術分野において公知である。抗体ディスプレイライブラリを生成し、スクリーニングするのに特に使用しやすい方法および試薬の例が、例えば、Ladner et al. 米国特許第5,223,409号明細書; Kang et al. 国際公開第92/18619号パンフレット; Dower et al. 国際公開第91/17271号パンフレット; Winter et al. 国際公開第92/20791号パンフレット; Markland et al. 国際公開第92/15679号パンフレット; Breitling et al. 国際公開第93/01288号パンフレット; McCafferty et al. 国際公開第92/01047号パンフレット; Garrard et al. 国際公開第92/09690号パンフレット; Ladner et al. 国際公開第90/02809号パンフレット; Fuchs et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Biotechnology (NY) 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; および McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554に見つけられる。
【００８８】
その上、オートファジー関連遺伝子産物に対するキメラヒト化抗体は、米国特許第5,565,332号明細書に開示されたものなどの標準プロトコルにしたがって作製することができる。別の実施の形態において、抗体鎖または特異的結合対構成員は、例えば、米国特許第5,565,332号, 同第5,871,907号, または同第5,733,743号の各明細書に記載されているような、当該技術分野に公知の技法を使用して、再生可能な包括的ディスプレイパッケージの成分および特定の結合対構成員のポリペプチド鎖の融合をコード化する核酸分子を含むベクターと、１つの結合対構成員の第２のポリペプチド鎖をコード化する核酸分子を含有するベクターとの間の組換えによって、産生することができる。
【００８９】
別の実施の形態において、オートファジー関連遺伝子産物に対して作られたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を担持する遺伝子導入または染色体導入マウスを使用して、生成できる。ある実施の形態において、ここでは「ヒト化マウス」と称される遺伝子導入マウスは、内因性μおよびκ鎖座を不活性化させるまたは削除する標的突然変異と共に、未再配列ヒト重鎖および軽鎖可変部位イムノグロブリン配列をコード化するヒトイムノグロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する（Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859）。このマウスは、ヒト重鎖定常部位イムノグロブリン配列も含有するであろう。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκをわずかしかまたは全く発現せず、免疫に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖可変部位導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒト可変部位抗体を生成する（Lonberg, N. et al. (1994), 前出; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93, および Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536 546）。上述した技法または当該技術分野に公知の任意の他の技法を使用して、完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、これらのマウスを使用することができる。ヒト化マウスの調製は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287 6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647 656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720 3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117 123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856 859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579 591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65 93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536 546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845 851に記載されている。さらに、全てLonberg および Kayの米国特許第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,789,650号; 同第5,877,397号; 同第5,661,016号; 同第5,814,318号; 同第5,874,299号; および 同第5,770,429号; Surani等の米国特許第5,545,807号の各明細書も参照のこと。
【００９０】
６． 薬剤組成物
本発明は、オートファジー関連遺伝子産物の変調物質を含む薬剤組成物を提供する。ある態様において、本発明は、１種類以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤が共に配合された、上述した作用物質を１種類以上、治療に効果的な量で含む薬学的に許容される組成物を提供する。別の態様において、本発明の作用物質は、そのままで投与しても、または薬学的に許容される担体との混合物で投与しても差し支えなく、他の作用物質と共に投与しても差し支えない。それゆえ、併合療法は、本発明の１種類以上の作用物質の連続、同時および別々の投与または同時投与を含み、ここで、最初に投与されたものの治療効果は、その後の化合物が投与されたときに、完全には消えていない。
【００９１】
以下に詳しく記載するように、本発明の薬剤組成物は、以下のために適用されたものを含む、固体または液体の形態で投与するために特別に配合してもよい：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口内、舌下、および全身吸収を目的としたもの、大きい丸薬、粉末、顆粒、舌に施すためのペースト；（２）例えば、滅菌溶液または懸濁液、または持効性配合物として、皮下、筋肉内または硬膜外注射による、非経口投与；（３）例えば、クリーム、軟膏、または制御放出貼布または皮膚に塗布されるスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリームまたは泡としての膣内または直腸内；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮；または（８）鼻。
【００９２】
上述したように、ある実施の形態において、本発明の作用物質は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有する化合物であってよく、それゆえ、薬学的に許容される酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの塩は、投与ビヒクルまたは投与形態製造プロセス中にその場で、または遊離塩基形態にある本発明の精製化合物の適切な有機または無機酸との別の反応、およびそのように形成された塩のその後の精製中の単離によって、調製しても差し支えない。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。
【００９３】
主題の化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性有機または無機酸からの、その化合物の従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような従来の非毒性塩としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来の塩；並びに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、オキサル酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が挙げられる。
【００９４】
他の場合において、本発明の作用物質は、１種類以上の酸性官能基を含有する化合物であってよく、それゆえ、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの塩は同様に、投与ビヒクルまたは投与形態製造プロセス中にその場で、または遊離酸形態にある精製化合物を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩などの適切な塩基と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級、第二級または第三級アミンと別々に反応させることによって、調製しても差し支えない。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウムの塩などが挙げられる。塩基性付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチレンアミン、ジエチレンアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる（例えば、Berge et al.前出を参照のこと）。
【００９５】
湿潤剤、乳化剤およびラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料および酸化防止剤が、前記組成物中に存在しても差し支えない。
【００９６】
薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が挙げられる。
【００９７】
本発明の作用物質の配合物は、単位投与形態で提示されてもよく、製薬学の当該技術分野でよく知られたどの方法により調製されてもよい。単一投与形態を生成するために担体材料と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療されている宿主および投与の特定の形態に応じて、様々である。単一投与形態を生成するために担体材料と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる作用物質のその量である。
【００９８】
ある実施の形態において、本発明の配合物は、以下に限られないが、シクロデキストリン、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、および高分子担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物を含む賦形剤；および本発明の作用物質を含む。ある実施の形態において、上述した配合物により、本発明の作用物質が経口的に生物学的に利用可能になる。
【００９９】
これらの配合物または組成物を調製する方法は、本発明の作用物質を担体、および必要に応じて１種類以上の副成分と会合させる工程を含んでよい。
【０１００】
本発明の化合物の経口投与のための液体投与形態としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。活性剤に加え、この液体投与形態は、例えば、水または他の溶媒などの当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなどの可溶化剤および乳化剤、およびそれらの混合物を含有してもよい。
【０１０１】
この経口組成物は、不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、着色剤、香料および保存料などのアジュバントも含有して差し支えない。
【０１０２】
懸濁液は、活性化合物に加え、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天(agar-agar)およびトラガカントなどの懸濁剤、およびそれらの混合物を含有するであろう。
【０１０３】
経口投与に適した本発明の配合物は、各々が活性成分として本発明の化合物を所定の量で含有する、カプセル、カシェ剤(cachets)、丸薬、錠剤、トローチ剤(loenges)（風味基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用した）、粉末、顆粒の形態にある、または水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油または油中水液体エマルション、またはエリキシル剤またはシロップ、もしくはトローチ剤（pastilles）（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用した）としておよび／またはマウスウォッシュなどとしてであってよい。本発明の化合物は、大きい丸薬、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【０１０４】
経口投与のための本発明の固体投与形態（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など）において、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１種類以上の薬学的に許容される担体および／または以下の内のいずれか：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの湿潤剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、および非イオン界面活性剤などの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの滑剤；および（１０）着色剤；と混合される。カプセル、錠剤および丸薬の場合、薬剤組成物は緩衝剤も含んでよい。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースすなわち乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用した殻の軟らかいおよび硬いゼラチンカプセル内に充填剤して使用してもよい。
【０１０５】
錠剤は、１種類以上の副成分と共に、圧縮または成形により製造してもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を使用して調製してもよい。成形錠剤は、適切な装置内で、不活性液体希釈剤で湿らされた粉末化合物の混合物を成形することによって、製造してもよい。
【０１０６】
本発明の薬剤組成物の錠剤、および糖衣錠、カプセル、丸薬および顆粒などの他の固体投与形態は、必要に応じて、刻み目を入れても、薬剤配合の技術分野においてよく知られた腸溶コーティングまたは他のコーティングなどの、コーティングおよび殻と共に調製してもよい。それらは、所望の放出プロファイルを提供するための様々な比率での、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／または微小球を使用して、その中の活性成分の放出を遅くするまたは制御するように配合されてもよい。本発明の組成物は、迅速な放出のために配合されても、例えば、凍結乾燥されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルタに通す濾過により、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射用媒質中に溶解させられる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を含ませることにより、滅菌されてもよい。これらの組成物は、必要に応じて、隠蔽剤を含有してもよく、胃腸管の特定の部分内のみで、またはそこで優先的に、必要に応じて、遅延様式で、活性成分が放出されるような組成物の形態にあってよい。使用できる包埋組成物の例としては、高分子物質および蝋が挙げられる。活性成分は、適切な場合、１種類以上の上述した賦形剤と共に、微小被包形態にあっても差し支えない。
【０１０７】
直腸または膣投与のための本発明の薬剤組成物の配合物は、座薬として提供してもよく、これは、本発明の１種類以上の化合物を、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、座薬ワックスまたはサリチル酸エステルを含む１種類以上の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することにより調製してよく、室温で固体であるが、体温で液体であり、したがって、直腸または膣の腔内で溶融し、活性化合物を放出する。
【０１０８】
膣投与に適した本発明の配合物としては、適切であることが当該技術分野において知られているような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー配合物が挙げられる。
【０１０９】
本発明の化合物の局所または経皮投与のための投与形態としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、貼布および吸入薬が挙げられる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体と、また要求されるであろう任意の保存料、緩衝剤、または噴霧剤と混合してもよい。
【０１１０】
これらの軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加え、獣脂および植物油、蝋、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。
【０１１１】
粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加え、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有して差し支えない。スプレーは、それに加え、クロロフルオロ炭化水素、並びにブタンおよびプロパンなどの揮発性未置換炭化水素などの通例の噴霧剤を含有し得る。
【０１１２】
経皮貼布には、本発明の化合物の体への制御された送達を提供する追加の利点がある。そのような投与形態は、化合物を適切な媒質中に溶解させるまたは分散させることによって製造することができる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通過する化合物の流れを増加させても差し支えない。そのような流れの速度は、速度制御膜を提供する、または化合物を高分子マトリクスまたはゲル中に分散させることによって、制御することができる。
【０１１３】
眼内配合物、眼用軟膏粉末、溶液なども、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１１４】
非経口投与に適した本発明の薬剤組成物は、使用直前に滅菌注射用溶液または分散液中でもどされ、糖類、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、配合物を意図する受容者の血液と等張性にする溶質、もしくは懸濁剤または増粘剤を含有してよい、１種類以上の薬学的に許容される滅菌等張水性または非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、もしくは滅菌粉末と組み合わせて、本発明の１種類以上の化合物を含む。
【０１１５】
本発明の薬剤組成物に使用してよい適切な水性および非水性溶液の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合の要求される粒径の維持により、また界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０１１６】
ある場合には、薬物の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。このことは、水溶性が不十分な結晶質または非晶質材料の懸濁液の使用により行われるであろう。その結果、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、この速度は、次に、結晶サイズおよび結晶形態に依存するであろう。あるいは、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクル中に溶解させるまたは懸濁させることによって行われる。
【０１１７】
注射用デポー剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性高分子中に主題の化合物の微小カプセルマトリクスを形成することによって製造される。薬物対高分子の比、および使用される特定の高分子の性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性高分子の例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー剤注射用配合物は、体内組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を取り込むことによって調製される。
【０１１８】
本発明の作用物質を含む例示の配合物は、以下に限られないが、体温での化学的安定性、放出の機能的効率時間、毒性および最適投与量を含む様々な性質に基づいて決定される。
【０１１９】
本発明の調製物は、経口、非経口、局所、または直腸で与えられる。それらは、もちろん、各投与経路に適した形態で与えられる。例えば、それらは、錠剤またはカプセル形態で、注射、吸入、眼用ローション、軟膏、座薬により、注射、注入または吸入による投与；ローションまたは軟膏により局所；および座薬による直腸で投与される。
【０１２０】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用してよい本発明の化合物、および／または本発明の薬剤組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される投与形態に配合される。
【０１２１】
ある実施の形態において、上述した薬剤組成物は、本発明の１種類以上の作用物質、化学療法薬、および必要に応じての薬学的に許容される担体を含む。
【０１２２】
化学療法薬という用語は、制限するものではなく、カルボプラチンおよびシスプラチンなどの白金系作用物質；窒素マスタードアルキル化剤；カルムスチン（ＢＣＮＵ）などのニトロソウレアアルキル化剤および他のアルキル化剤；メトトレキサートなどの代謝拮抗物質；プリン類似体代謝拮抗物質；フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびゲムシタビンなどのピリミジン類似体代謝拮抗物質；ゴセレリン、ロイプロリド、およびタモキシフェンなどのホルモン抗腫瘍薬；タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、アルデスロイキン、インターロイキン−２、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンα、およびトレチノイン（ＡＴＲＡ）などの天然抗腫瘍薬；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、およびマイトマイシンなどの抗生物質である天然抗腫瘍薬；並びにビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイドである天然抗腫瘍薬が挙げられる。
【０１２３】
さらに、それ自体では化学療法薬と考えられていなくても、以下の薬物を、化学療法薬と組み合わせて使用してもよい：ダクチノマイシン；ダウノルビシンＨＣｌ；ドセタキセル；ドキソルビシンＨＣｌ；エポエチンα；エトポシド（ＶＰ−１６）；ガンシクロビルナトリウム；ゲンタマイシン硫酸塩；インターフェロンα；ロイプロリド酢酸塩；メペリジンＨＣｌ；メタドンＨＣｌ；ビンブラスチン硫酸塩；およびジドブジン（ＡＺＴ）。例えば、フルオロウラシルは、最近、特に効果的な組合せを形成するために、エピネフリンおよびウシのコラーゲンと共に配合されている。
【０１２４】
さらにまた、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、および他の巨大分子の以下のリストを使用してもよい：突然変異体および類似体を含む、インターロイキン１から１８；インターフェロンα、βおよびγなどのインターフェロンまたはサイトカイン；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体、並びにゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）などのホルモン；トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子相同因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）などの成長因子；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）；浸潤阻害因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ−１−７）；ソマトスタチン；サンモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドディムスターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；血管新生阻害因子；抗原性物質；およびプロドラッグ。
【０１２５】
ここに記載された組成物および治療方法に使用するための化学療法薬としては、以下に限られないが、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ-２１８９およびＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えば、エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素蛋白エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；葉酸類似体、例えば、デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリン類似体、例えば、フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６−アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン、例えば、カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロ
スタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えば、フロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド(maytansinoid)、例えば、メイタンシン(maytansine)およびアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａおよびアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ-１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン(capecitabine)；および上述したものの任意のものの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１２６】
別の実施の形態において、本発明の組成物は、治療薬またはプロドラッグ、例えば、他の化学療法薬、スカベンジャー化合物、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌剤、抗炎症剤、血管収縮薬および抗凝血薬、癌ワクチン用途に有用な抗原または対応するプロドラッグを含んでよい。
【０１２７】
例示のスカベンジャー化合物としては、以下に限られないが、グルタチオン、チオウレア、およびシステインなどのチオール含有化合物；マンニトール、置換フェノールなどのアルコール；キノン、置換フェノール、アリールアミンおよびニトロ化合物が挙げられる。
【０１２８】
化学療法薬および／または他の生物学的に活性な作用物質の様々な形態を使用してよい。これらは、制限するものではなく、生物学的に活性である、非荷電分子、分子複合体、塩、エーテル、エステル、アミドなどの形態を含む。
【０１２９】
７． 本発明の治療法
本発明はさらに、癌、神経変性疾患、肝疾患、筋疾患および膵炎を含むオートファジー関連疾病を治療する新規の治療方法であって、対象（例えば、その必要がある対象）に、本発明のオートファジー関連遺伝子産物の変調物質を効果的な量、投与する工程を含む方法を提供する。
【０１３０】
その必要がある対象としては、例えば、前癌状態腫瘍を含む腫瘍、癌と診断された対象、または以前の治療では効果がなかった対象を含む、治療されてきた対象が挙げられる。
【０１３１】
オートファジーは、神経損傷後に生じる軸索変性において役割を果たすのに関係すると見なされてきた。例えば、外傷性脊髄損傷により、軸索内カルシウムレベルが急激に上昇し、これにより、ニューロンのオートファジーおよび細胞死が増加する（Knoferle et al., (2009), PNAS, 107, 6064-6069）。カルシウムの流れまたはオートファジーいずれかの阻害により、軸索変性が軽減される。特に、本発明のオートファジー変調物質のスクリーニングにおいて、数多くのカルシウム結合タンパク質が特定された（表５）。それゆえ、ある実施の形態において、本発明は、カルシウム結合オートファジー変調遺伝子産物の変調による、または他のオートファジー関連遺伝子産物の変調による、神経外傷後の軸索変性の治療または予防に関する。
【０１３２】
本発明の方法は、どのような癌性または前癌状態の腫瘍を治療するために使用してもよい。本発明の方法および組成物により治療されるであろう癌としては、以下に限られないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮からの癌細胞が挙げられる。その上、癌は、具体的には、以下に限られないが、以下の組織タイプのものであってよい：腫瘍、悪性；癌；癌、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌および胆管癌の合併；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性結腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞癌；乳頭腺癌；嫌色素癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭腺癌および濾胞状腺癌；非被嚢性硬化性癌；副腎皮質細胞癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺；ムチン性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性乳癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質性腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；神経芽細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯芽肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；および有毛細胞白血病。
【０１３３】
ある実施の形態において、本発明の方法は、化学療法薬と組み合わせた本発明のオートファジー阻害剤の投与を含む、癌の治療を含む。そのようなオートファジー阻害剤としては、オートファジー促進遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質（表２）およびオートファジー阻害遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質（表１）が挙げられる。どのような化学療法薬も、本発明の方法に使用するのに適しており、特に、癌細胞中に細胞ストレスを誘発する化学療法薬が適している。本発明に有用な化学療法薬としては、以下に限られないが、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ-２１８９およびＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えば、エネジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素蛋白エネジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；葉酸類似体、例えば、デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリン類似体、例えば、フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６−アザウリジン(az
auridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン、例えば、カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えば、フロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド(maytansinoid)、例えば、メイタンシン(maytansine)およびアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａおよびアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ-１６）；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート(edatrexate)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン(capecitabine)；および上述したものの任意のものの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１３４】
ある実施の形態において、本発明の方法は、放射線療法と組み合わせた本発明のオートファジー阻害剤の投与を含む、癌の治療を含む。放射線療法の最適線量は、一日当たりの線量として対象に与えられる。放射線療法の最適の一日当たりの線量は、例えば、約０．２５から０．５Ｇｙ、約０．５から１．０Ｇｙ、約１．０から１．５Ｇｙ、約１．５から２．０Ｇｙ、約２．０から２．５Ｇｙ、および約２．５から３．０Ｇｙであってよい。例示の一日当たりの線量は、例えば、約２．０から３．０Ｇｙであってよい。例えば、腫瘍が放射線の低線量に対して耐性である場合、より高い線量の放射線を照射してもよい。放射線の高線量は、例えば、４Ｇｙに到達するであろう。さらに、治療の過程で照射される放射線の総線量は、例えば、約５０から２００Ｇｙに及んでよい。例示の実施の形態において、治療の過程で照射される放射線の総線量は、例えば、約５０から８０Ｇｙに及んでよい。ある実施の形態において、放射線の線量は、例えば、１、２、３、４、または５分間の時間に亘り与えられてよく、ここで、時間は、放射線源の線量率に依存する。
【０１３５】
ある実施の形態において、最適化された放射線の一日当たりの線量を、約４から８週間に亘り、例えば、一週当たり４または５日、照射してよい。代わりの実施の形態において、最適化された放射線の一日当たりの線量を、約４から８週間に亘り、一週当たり７日、すなわち毎日、照射してよい。放射線の毎日の線量は、一回の線量として与えてもよい。あるいは、放射線の毎日の線量は、複数回の線量として与えてもよい。さらに別の実施の形態において、放射線の最適化された線量は、毎日の基準で患者が許容できる線量よりも高い放射線線量であってよい。それゆえ、放射線の高線量を患者に照射してよいが、少ない頻度の照射計画においてである。
【０１３６】
癌治療に使用してよい放射線のタイプが当該技術分野においてよく知られており、その例としては、電子ビーム、線形加速装置からもしくはコバルトやセシウムなどの放射性線源からの高エネルギー光子、陽子、および中性子が挙げられる。例示の電離放射線は、Ｘ線である。
【０１３７】
放射線を照射する方法が当該技術分野においてよく知られている。例示の方法としては、以下に限られないが、外部ビーム照射、内部ビーム照射、および放射性医薬品が挙げられる。外部ビーム照射において、癌の影響を受けている体の区域に高エネルギーＸ線を送達するために、線形加速装置が使用される。放射線源が体外にあるので、均一な放射線量で、体の広い区域を治療するために、外部ビーム照射を使用することができる。近接照射療法としても知られている内部照射療法は、体内の特定の部位に高線量の放射線を送達することを含む。内部照射療法の２つの主要なタイプには、影響を受けた組織内に放射線源が配置される組織内照射、および影響を受けた区域から短距離にある体腔内に放射線源が配置される腔内照射がある。放射性物質は、腫瘍特異的抗体に結合させることによって、腫瘍細胞に送達してもよい。内部照射療法に使用される放射性物質は、典型的に、小さなカプセル、ペレット、ワイヤ、管、またはインプラント内に収容される。反対に、放射性医療品は、体腔中に、経口、静脈または直接与えてもよい非密封線源である。
【０１３８】
放射線療法は、線形加速装置またはガンマナイフを使用して正確な量の放射線を小さい腫瘍区域に送達できる定位手術または定位放射線療法、および放射線治療の前に腫瘍の位置をマッピングするためのコンピュータ支援療法である三次元原体照射療法（３ＤＣＲＴ）を含んでもよい。
【０１３９】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、神経変性疾患について治療されている対象または神経変性疾患と診断された対象が挙げられる。
【０１４０】
本発明の方法を使用して、どのような神経変性疾患を治療してもよい。ある実施の形態において、神経変性疾患は、タンパク質症、またはタンパク質フォールディング病である。そのようなタンパク質症の例としては、以下に限られないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症が挙げられる。他の実施の形態において、本発明の方法を使用してどのような神経変性疾患も治療することができる。本発明の方法により治療できる神経変性疾患としては、以下に限られないが、副腎白質萎縮症、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症、カナバン病、脳性小児まひ、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドオフ病、シルダー病、悪性貧血の次の脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、および中毒性脳症が挙げられる。
【０１４１】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、肝疾患について治療されている対象または肝疾患と診断された対象が挙げられる。ある実施の形態において、肝疾患は、タンパク質症、またはタンパク質フォールディング病である。そのようなタンパク質症の例は、α１−アンチトリプシン欠乏症である。
【０１４２】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、筋疾患について治療されている対象または筋疾患と診断された対象が挙げられる。ある実施の形態において、筋疾患は、タンパク質症、またはタンパク質フォールディング病である。そのようなタンパク質症の例は、以下に限られないが、孤発性封入体筋炎、２Ｂ型肢体型筋ジストロフィー症および三好型ミオパチーが挙げられる。
【０１４３】
その必要がある対象の例としては、以前の治療では効果のない対象を含む、タンパク質症と診断された対象が挙げられる。タンパク質症の例としては、以下に限られないが、アルツハイマー病、脳βアミロイド血管障害、網膜神経節細胞の変性、プリオン病（例えば、牛海綿状脳症、クル病、クロイツフェルト・ヤコブ病、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症）、タウオパチー（例えば、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭葉変性症）、前頭側頭葉変性症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（アイスランド型）、ＣＡＤＡＳＩＬ、アレキサンダー病、セルピン病、家族性アミロイドニューロパシー、老人性全身性アミロイドーシス、セルピン病、ＡＬアミロイドーシス、ＡＡアミロイドーシス、２型糖尿病、大動脈内側アミロイドーシス、ＡｐｏＡＩアミロイドーシス、ＡｐｏＩＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス、フィンランド型家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎／ミオパチー、白内障、甲状腺髄様癌、心房アミロイドーシス、下垂体プロラクチノーマ、遺伝性格子状角膜異栄養症、皮膚苔癬アミロイドーシス、隔膜ラクトフェリンアミロイドーシス、肺胞蛋白症、アミロイド産生性歯原性腫瘍、精嚢アミロイドーシス、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症および重症疾患ミオパチーが挙げられる。
【０１４４】
いくつかの実施の形態において、本発明の主題の薬剤組成物は、予防または治療上の処置の一部として、含まれる治療薬または他の材料の治療に効果的な量を患者に送達するのに十分な量で送達されるべき物質を含む。活性剤の所望の濃度は、吸収、不活性化、および薬物の排泄速度並びに化合物の送達速度に依存する。用量値も、緩和すべき症状の重症度により様々であろうことに留意すべきである。任意の特定の対象について、個々の必要性および組成物を投与するまたはその投与を管理する人の専門的な判断力にしたがって、特定の投与計画を時間の経過と共に調節すべきことがさらに理解すべきである。典型的に、投与は、当業者に公知の技法を使用して決定される。
【０１４５】
主題の作用物質の投与は、その作用物質の血漿濃度を参照して決定してよい。例えば、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）および時間の０から無限大までの血漿濃度対時間の曲線の下の面積（ＡＵＣ（０−４））を使用してもよい。本発明の服用量は、ＣｍａｘおよびＡＵＣ（０−４）に関する上述した値を生じるもの、およびそれらのパラメータについてより大きいまたは小さい値を生じる他の服用量を含む。
【０１４６】
本発明の薬剤組成物中の活性成分の実際の服用量レベルは、患者にとって毒性ではない、特定の患者、組成物、および投与様式について所望の治療反応を達成するのに効果的である活性成分の量を得るように変えてもよい。
【０１４７】
選択される服用量レベルは、使用する特定の作用物質の活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用されている特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および以前の病歴、および医術でよく知られた同様に要因を含む様々な要因に依存する。
【０１４８】
当該技術分野において通常の技術を備えた医師または獣医は、要求される薬剤組成物の効果的な量を容易に決定し、処方できる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要な容量よりも少ないレベルで薬剤組成物中に用いられる本発明の作用物質の用量を処方および／または投与し、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させても差し支えない。
【０１４９】
一般に、本発明の作用物質の適切な毎日の用量は、治療効果を生じるのに効果的な最小の容量である作用物質の量である。そのような効果的な用量は、一般に、上述した要因に依存する。
【０１５０】
所望であれば、作用物質の効果的な毎日の用量は、必要に応じて、単位投与形態で、一日中、適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６回以上の副用量として投与してもよい。
【０１５１】
所定の患者において最も効果的な治療を生じる、投与の正確な時間および任意の特定の作用物質の量は、特定の作用物質の活性、薬物動力学、および生物学的利用率、患者の生理的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよび段階、一般的な健康状態、所定の服用量に対する感応性および医薬品のタイプ）、投与経路などに依存する。ここに提示されたガイドラインを使用して治療を最適化する、例えば、投与の最適時間および／または量を決定してもよく、これには、対象をモニタすること、および服用量および／またはタイミングを調節することからなる決まりきった実験以上は必要としない。
【０１５２】
対象が治療されている間、対象の健康状態は、２４時間中の所定の時間で関連する指標の１つ以上を測定することによってモニタしてもよい。補給物、量、投与の時間および配合を含む、治療の全ての態様は、そのようなモニタの結果にしたがって、最適化してもよい。患者は、同じパラメータを測定することによって、改善の程度を決定するために、定期的に再評価してもよく、そのような再評価の最初のものは、典型的に、治療の始まりから４週間後に行われ、その後の再評価は、治療中４から８週間毎に行われ、次いで、その後は、３ヶ月毎に行われる。治療は、数ヶ月または数年に亘り継続してもよく、最小で１ヶ月が、ヒトにとっての典型的な治療期間である。例えば、投与される作用物質の量および投与の時間に対する、調節は、これらの再評価に基づいて行ってよい。
【０１５３】
治療は、化合物の最適用量未満の少ない服用量で開始してもよい。その後、服用量は、最適な治療効果が得られるまで、わずかな増分だけ増加させてもよい。オートファジー関連遺伝子産物を変調する作用物質、および第２の作用物質、例えば、オートファジー関連疾患の治療に有用な別の作用物質の併用により、任意の個々の作用物質の必要服用量が減少するかもしれない。何故ならば、異なる化合物および／または作用物質の効果の開始と期間が相補的であるかもしれないからである。
【実施例】
【０１５４】
材料および方法
細胞株および培養条件
Ｈ４ヒト神経芽細胞腫細胞を、１０％の正常子牛血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）および適切であれば、０．４〜１．２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を補給したＤＭＥＭ培地中において標準組織培養条件下で培養した。ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄＨ４細胞を、Zhang et al., PNAS, 102, 15545-15550 (2007)に記載されたように生成した。Ｌａｍｐ１を発現する安定株を生成するために、ＴｒａｎｓＩＴ ＬＴ１試薬（Mirus）を使用して、Ｈ４細胞にＬａｍｐ１−ＲＦＰをトランスフェクションし、その後、０．４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８で選択した。ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄＨ４細胞をｐＢａｂｅ−Ｂｃｌ−２レトロウイルスに感染させることによりＢｃｌ−２発現細胞株を生成し、その後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンにより選択した。
【０１５５】
サイトカインアッセイのために、２４ウェル（ウェスタン）または９６ウェル（ＬＣ３−ＧＦＰ数量化）プレートいずれか内で完全培地中０．５×１０5で播種した。２４時間後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、さらに２４時間に亘り、無血清ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Invitrogen）を、表示の成長因子および／またはサイトカインと共に加えた。使用した成長因子およびサイトカインとしては、ヒトＴＮＦα（Cell Science）、ヒトＬＩＦ（GeneScript Corporation）、ヒトＦＧＦ２（ProSpec）、ヒトＩＧＦ１（ProSpec）、ヒトＳＤＦ１（ProSpec）およびヒトＣＬＣＦ１（R&D Systems）が挙げられる。飢餓を誘発するために、細胞を２４時間に亘り完全培地中で培養し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＨＢＳＳ培地（Invitrogen）中でさらに４時間に亘り培養した。表示されている場合、２．５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（NAC, Sigma）を、培地の交換時に加えた。
【０１５６】
酸化防止剤アッセイについて、細胞を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に２．５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（NAC, Sigma）で処理し、固定化と画像解析（詳細については以下参照）前に、さらに４８時間に亘り培養した。ウェスタンブロット分析について、細胞溶解の前に最後の８〜１２時間に亘り、リソソームプロテアーゼ阻害剤Ｅ６４ｄ（Sigma）を加えた。
【０１５７】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
一次スクリーニングについて、ヒトゲノムの大半を網羅する２１，１２１のｓｉＲＮＡプールのアレイ・ライブラリを使用した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ｓｉＡＲＲＡＹｓｉＲＮＡライブラリ（ヒトゲノム、Ｇ−００５０００−０５）、コロラド州、ラフィーエット、Thermo Fisher Scientific）。各プールは、同じ遺伝子からの異なる配列を標的とする４つの特有のオリゴヌクレオチドを含んでいた。各アッセイプレートは、以下の対照も含んだ：非標的ｓｉＲＮＡ、ｍＴＯＲｓｉＲＮＡ、ＡＴＧ５ｓｉＲＮＡおよびＰＬＫ１ｓｉＲＮＡ（トランスフェクション効率の対照）。ｓｉＲＮＡを、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔ試薬（Qiagen）によるリバーストランスフェクションを使用して、４０ｎＭの最終濃度でＬＣ３−ＧＦＰレポーターを安定に発現するＨ４細胞中に三重で一時的にトランスフェクションした。ＨｉＰｅｒｆｅｃｔをＤＭＥＭ中で１：２０に希釈し、この混合物８μｌを３８４ウェルプレートのウェルに加えた。これらのプレートを１，０００ｒｐｍで遠心分離し、その後、１μＭのアレイｓｉＲＮＡプール２μｌを各ウェルに加えた。３０分間のインキュベーション後、ウェルに４０μｌの培地中の５００の細胞を加えた。細胞を、標準培養条件下で７２時間に亘りインキュベーションし、１時間に亘り０．５μＭのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Invitrogen）で対比染色し、３０μｌの８％パラホルムアルデヒドの添加により固定化した。３０分後、解析前に、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
【０１５８】
二次スクリーニングについて、各ｓｉＲＮＡプールの４つのｓｉＲＮＡが個々のウェル中に分けられたｓｉＲＮＡライブラリを使用した。ｓｉＲＮＡを３０ｎＭの最終濃度（１．５μＬ／１μＭの株のウェル）で使用し、ＨｉＰｅｒｆｅｃｔをＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen）中で１：３０に希釈したことを除いて、細胞を、一次スクリーニングにおけるようにトランスフェクションし、処理した。二次スクリーニングのトランスフェクションは、２ラウンドで行った：最初のラウンドでは、ＬＣ３−ＧＦＰを安定に発現するＨ４細胞のＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄとの１：１の混合物を三重でトランスフェクションした；二回目のラウンドでは、ＬＣ３−ＧＦＰを発現するＨ４細胞のＬａｍｐ１−ＲＦＰとの１：１の混合物を二重でトランスフェクションした。三次特徴付けスクリーニングの全ては、ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ細胞の混合物を使用して二重で行った。各アッセイプレートは、非標的ｓｉＲＮＡ並びにｍＴＯＲ、ＡＴＧ５、ＰＬＫ１およびスクリーニングに応じて、Ｖｐｓ３４またはＳＯＤ１ｓｉＲＮＡ対照の１０〜１２ウェルを含んだ。
【０１５９】
スクリーニングヒットの低スループット確認について、培地１ｍＬ当たり２μｌまたは６μｌのＨｉＰｅｒｆｅｃｔ、４０ｎＭまたは１０ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度およびそれぞれ、Ｈ４およびＭＣＦ７細胞について、５×１０4または２×１０5細胞／ｍＬでの細胞によるリバーストランスフェクションを使用して、１２または６ウェルプレート内で細胞をトランスフェクションした。ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析のために、７２時間後に細胞を収穫した。ウェスタンおよびイメージング分析のために、細胞を、トランスフェクションの２４時間後に２．５×１０4または１×１０5細胞／ｍＬで２４ウェルプレートに分割し、さらに４８時間後に収穫した。
【０１６０】
イメージングおよび画像数量化
高スループットスクリーニングについて、一次スクリーニングについては２つの波長（Ｈｏｅｃｈｓｔを検出するために３５０ｎｍ、ＬＣ３−ＧＦＰを検出するために４８８ｎｍ）を、二次スクリーニングについては３つの波長（Ｌａｍｐ１−ＲＦＰまたはＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを検出するために３５０ｎｍ、４８８ｎｍおよび５５０ｎｍ）を使用して、１０倍の倍率で自動化ＣｅｌｌＷｏＲｘ顕微鏡（Applied Precision）により細胞をイメージングした。全ての画像を、ＶＨＳｓｃａｎおよびＶＨＳｖｉｅｗ画像解析ソフトウェア（Cellomics）を使用して数量化した。合計細胞数、合計ＬＣ３−ＧＦＰ強度／細胞並びにＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソーム／細胞の数、面積および強度を記録した。核発色強度に基づく解析から、死細胞および分裂細胞の全ては排除した。各ウェルについての最終的なオートファジースコアは、合計オートファゴソーム強度／細胞をオートファゴソーム／細胞の数で乗じ、平均細胞強度で割ることによって、得た。この式は、ｍＴＯＲおよびＡｔｇ５対照に対してｓｉＲＮＡを使用したときの一貫して有意であるｚ−スコアおよびｐ−値により反映されるように、サイトゾルからオートファゴソームへのＬＣ３−ＧＦＰ転座を正確に測定するために、経験的に決定した。転座よりむしろ、レポーターの合計累積を測定する、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰについて、平均細胞強度による除算を除外したことを除いて、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄおよびＬａｍｐ１−ＲＦＰスコアは、ＬＣ３−ＧＦＰと類似の様式で得た。
【０１６１】
低スループット追加解析について、細胞をガラス製カバースリップ上で増殖させた。４％のパラホルムアルデヒド中の固定化およびＨｏｅｃｈｓｔによる対比染色後、カバースリップを５０％のグリセロール、０．１％の没食子酸ｎ−プロピル／ＰＢＳ中に取り付けた。細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡で４０倍の倍率でイメージングした。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して、細胞数、細胞面積および強度、並びにオートファゴソーム数および強度を数量化した。オートファジーを、細胞当たりのオートファゴソームの数として記録した。
【０１６２】
「Ｉｎ−ｃｅｌｌ−ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイ
ｍＴＯＲＣ１信号伝達および小胞体ストレスの誘発の定量分析について、それぞれ、ｒｐＳ６リン酸化反応およびＫＤＥＬ（ＧＲＰ７８／ＧＲＰ９４）発現の「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」分析を行った。Ｈ４細胞を、ＬＣ３−ＧＦＰアッセイについて記載したように、３８４ウェルプレート内で培養し、固定化し、対比染色した。イメージング後、細胞を、０．２％のＴｘ−１００を含有するＰＢＳ中で透過性にし、１５分間に亘り２０ｎｇ／ｍＬで、相対的細胞数を測定するために使用される非特異的リジン反応性プローブである、Ａｌｅｘａ−６８０ ＮＨＳ−エステルで染色した。その後、細胞を、０．２％のＴｘ−１００を含有するＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋０．２．％のＴｘ−１００で１：１に希釈されたＬｉＣＯＲブロッキング緩衝液）中で３０分間に亘りインキュベーションした。次いで、細胞を、ブロッキング緩衝液中で１：１０００に希釈されたウサギ−抗−ｒｐＳ６ホスホ−２３５／２３６（Cell Signaling Technologies）、またはマウス−抗−ＫＤＥＬ（Stressgen）抗体と共にインキュベーションした。一次抗体の染色後、細胞を、ＰＢＳ＋０．２％のＴｘ−１００中で洗浄し、ブロッキング緩衝液中で１：１０００に希釈されたＩＲＤｙｅ−８００−結合二次抗体（ＬｉＣＯＲ）で染色した。プレートをＡｅｒｉｕｍ赤外イメージングシステム（ＬｉＣＯＲ）で走査した。ｒｐＳ６ホスホ−２３５／２３６またはＫＤＥＬ染色と、ＮＨＳ−エステル染色の両方の強度を積算し、ホスホ−ｒｐＳ６またはＫＤＥＬ強度をＮＨＳ−エステル強度で割ることによって、正規化ホスホ−Ｓ６またはＫＤＥＬスコアを計算した。
【０１６３】
統計分析
全てのスクリーニングデータを、対数目盛（ｌｏｇ１０）への変換によって正規化した。一次スクリーニングについて、ｚ−スコアは、プレート中央値（対照は除外した）および中央絶対的偏差（ＭＡＤ）に基づいて計算した。ここで、ｚ−スコア＝（細胞スコア−中央プレートスコア）／（プレートＭＡＤ×１．４８２６）。次いで、ｚ−スコア＞１．７または＜−１．９にカットオフを設定して、スクリーニングヒットを３つのレプリカ・プレートの中央ｚ−スコアに基づいて選択し、これにより、０．０２のｐ値が得られる。アッセイを二重に行ったことを除いて、ｒｐＳ６およびＫＤＥＬ二次スクリーニングについても同じ方法を使用した。ＬＣ３−ＧＦＰ、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄおよびＬａｍｐ１−ＲＦＰ二次スクリーニングについて、ｚ−スコアは、非標的ｓｉＲＮＡ対照平均および標準偏差に基づいて計算した。ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおけるヒットの二次確認について、各遺伝子について、４つの個別のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの内の少なくとも２つが、５つのレプリカ・プレートに基づいて中央ｚ−スコア＞１．５または＜−１．５を有し、一次スクリーニングのｚ−スコアと一貫していることが要求される。これにより、ｐ＜０．０１が得られた。全ての他の二次アッセイにおいて、ｚ−スコア＞１．５または＜−１．５も有意であると考えられた。確認された遺伝子に関する最終的なｚ−スコアは、二次ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおいて陽性であると考えられたオリゴヌクレオチドについて、全てのウェルの平均ｚ−スコアに基づいて計算した。
【０１６４】
ＬＣ３−ＧＦＰおよび他の二次アッセイの間の相関分析を、個々のアッセイのウェルの四分割分析に基づいて行った：各ウェルについて、両方の特徴についてのｚ−スコアが＞１．５または＜−１．５の場合、＋１のスコアを割り当て；ｚ−スコアのいずれかがカットオフに到達しなかった場合、０のスコアを割り当てた。次いで、個々のウェルのスコアを、ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおいて有意であると考えられた全てのオリゴヌクレオチドの各遺伝子について、合計し、これらのオリゴヌクレオチドについてアッセイを行ったウェルの総数で割った。特徴間の相関は、最終的なスコアが≧０．５であれば、陽性であり、≦−０．５であれば、陰性であると考えた。
【０１６５】
相対生存率は、Ｈｏｅｃｈｓｔイメージングに基づく各ウェル内の細胞数をプレート内の平均細胞数により割ることによって計算した。各ヒット遺伝子について報告された生存率は、二次ＬＣ３−ＧＦＰアッセイにおいて陽性のオリゴヌクレオチドについての全てのウェルの平均生存率を反映している。５０％未満の平均生存率を有する陽性オリゴヌクレオチドの数も報告されている。＋ＮＡＣおよびＢｃｌ−２三次アッセイに関する相対生存率は、各ウェル中の細胞数を、それぞれ、ＮＡＣまたはＢｃｌ−２を含まない対応の対照プレート中の平均細胞数で割ることによって計算した。
【０１６６】
別記しない限り、残りのｐ値の全ては、等しい変化の両側のスチューデントのｔ検定から計算した。全てのエラーバーは標準誤差である。
【０１６７】
ウェスタン分析
ウェスタンブロットについて、細胞を、Ｌａｍｍｅｌｉサンプル緩衝液中で溶解させ、１０〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。以下の抗体を使用した：全て１：１０００での、ＬＣ３（Novus）、ｐ６２（Pharmigen）、ホスホ−Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ホスホ−Ｓｔａｔ３（Ｔｈｒ７０５）、ＲｅｌＡ、Ｓｏｄ１、ホスホ−ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０／Ｔｈｒ３８２／３８３）（全てCell Signaling）、Ｂｃｌ−２（Santa Cruz）、１：２０００でのホスホ−Ｓ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Cell Signaling）およびホスホ−ＥＲＫ１／２（Sigma）、１：５０００でのチューブリン（Sigma）。表示されている場合、ブロットは、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ６４ソフトウェアを使用して数量化した。
【０１６８】
半定量ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、製造業者の使用説明書にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）を使用して調製した。ｃＤＮＡ合成について、オリゴｄＴプライマーによるＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）に１．２５μｇのＲＮＡを使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応に、以下のプライマーを使用した：RelA AGCGCATCCAGACCAACAACAACC および CCGCCGCAGCTGCATGGAGACC, AMPKα2 CACCTCGCCTGGGCAGTCACACC および ATTGGGGGCATAAACACAGCATAA, Sod1 GGTGCTGGTTTGCGTCGTAGTCTC および ACCAGTGTGCGGCCAATGATG, βアクチン GACCTGACAGACTACCTCAT および AGACAGCACTGTGTTGGCTA。ＰＣＲ産物は、２％のアガロースゲル上で分離し、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪ６４ソフトウェアを使用して数量化した。
【０１６９】
細胞反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルの数量化
ＲＯＳレベルを、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に、製造業者の使用説明書にしたがってＩｍａｇｅ−ｉＴ ＬＩＶＥ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、数量化した。画像を、４０倍の倍率でＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡で得て、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して数量化した。あるいは、ＲＯＳレベルは、ＨＢＳＳにおける４時間の飢餓後に数量化した。細胞を、３７℃で２０分間に亘り１０μＭのジヒドロエチジウムにより染色し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７０】
バイオインフォマティクス分析
解析(enrichment analyses)について、ｓｉＲＮＡスクリーニングヒット遺伝子を、生物学的プロセス、分子機能（ＰＡＮＴＨＥＲ分類システム）、細胞成分（遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類システム）、古典的(canonical)経路（ＭＳｉｇＤＢ）および転写調節因子結合部位（ＭＳｉｇＤＢおよびＴＲＡＮＳＦＡＣｖ７．４）などの機能別カテゴリーに分類した。ｓｉＲＮＡスクリーニングにおいて調査される遺伝子の広域なセットにおけるそれらの表示に対するヒット遺伝子に関するこれらのカテゴリーの統計的集積または過剰な表示を評価するために、超幾何学的確率分布を使用してｐ−値を計算し、これは、Ｒ原語で実行した。
【０１７１】
タンパク質相互作用ネットワークについて、このネットワークは、相互作用タンパク質を、データベース：ＨＰＲＤ、ＭＩＮＴ、ＲＥＡＣＴＯＭＥおよび管理された文献記載事項からの、全ゲノムのインタラクトームスクリーニングから抽出されたデータと反復して結び付けることによって、構築した。酵母相互作用データについて、酵母タンパク質をヒトオルソログにマッピングした（相互Ｂｌａｓｔｐ分析およびＨｏｍｏｌｏｇｅｎｅ）。このネットワークでは、グラフ理論表示を使用し、これは、Ｐｅｒｌプログラミング原語で実行される、ノードとしての成分（遺伝子産物）およびエッジとしての成分間の関係（相互作用）を抽出する。
【０１７２】
老化中のヒット遺伝子発現の分析
老化分析中の遺伝子発現は、若年（４０才以下）および老年（７０才以上）のヒトの脳のサンプルのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ１３３＿Ｐｌｕｓ＿２マイクロアレイデータに基づいた。アレイ正規化、発現値計算およびクラスター分析は、ｄＣｈｉｐソフトウェアを使用して行った。階層的クラスター分析を使用して、同様の発現パターンを有する遺伝子またはサンプルを分類した。最も近い距離の２つの遺伝子またはサンプルを、最初に超遺伝子または超サンプルにマージさせ、その距離を表す長さを有する枝により接続し、将来のマージから削除した。次いで、最小の距離を有する遺伝子またはサンプルの次の対（超遺伝子または超サンプル）を、マージさせるものとして選択した。全ての遺伝子およびサンプルが１つのクラスターにマージされるまで、このプロセスを繰り返した。
【０１７３】
実施例１． オートファジーの調節に関与する遺伝子に関する高スループット画像ベースｓｉＲＮＡスクリーニング
哺乳類におけるオートファジーの調節に関与する遺伝子を特定するために、ＬＣ３−ＧＦＰレポーターを安定に発現するヒト神経芽細胞腫Ｈ４細胞を使用した。通常の増殖条件下で、これらの細胞中のＬＣ３−ＧＦＰは拡散したサイトゾル局在化を示す。これらの細胞においてオートファジーが誘発された場合、ＬＣ３−ＧＦＰは、サイトゾルから動員され、オートファゴソームに対応する点状パターンで視覚化できる。このシステムを検証するために、必須オートファジー媒介物質のＡＴＧ５または飢餓誘発オートファジーのサプレッサであるｍＴＯＲいずれかに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。通常の栄養条件下での７２時間のインキュベーション後、細胞をＡＴＧ５ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。これにより、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの数および強度の減少（図１Ａ）、並びにウェスタンブロットでのＬＣ３ＩＩ対ＬＣ３Ｉの比の減少（図１Ｂ）により評価されるような、オートファジーの著しいダウンレギュレーションがもたらされた。反対に、ｍＴＯＲＣ１の触媒サブユニットであるｍＴＯＲに対するｓｉＲＮＡの発現により、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの数および強度の増加（図１Ａ）、並びにＬＣ３ＩＩ対ＬＣ３Ｉの比の増加（図１Ｂ）がもたらされた。高スループット自動化蛍光顕微鏡で得られた３８４ウェル形式のＬＣ３−ＧＦＰ画像の数量化により、ＡＴＧ５またはｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のオートファジーのレベルにおける変化は、非標的の対照ｓｉＲＮＡと比べて、統計的に有意であることが示された（図２）。
【０１７４】
各プールが、各遺伝子について４つの独立したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含有している、２１，１２１の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡプールを含有するヒトゲノムｓｉＲＮＡライブラリをスクリーニングするために、このシステムを使用した。一次スクリーニングを三重で行い、５７４の遺伝子（試験した全遺伝子の２．７％）が特定され、そのノックダウンにより、少なくとも１．９の標準偏差（ＳＤ）だけＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの形成が中央値で減少するか、またはプレート中央値から少なくとも１．７ＳＤだけ増加した。
【０１７５】
一次スクリーニングにおいて特定された候補遺伝子を、各プールから４つのｓｉＲＮＡが別々に評価された逆重畳ライブラリを使用して確認した。５４７の候補遺伝子の内、２３６（４１％）が、少なくとも２つの独立したｓｉＲＮＡを有すると確認され、非標的ｓｉＲＮＡ対照と比べて、少なくとも１．５のＳＤだけオートファジーのレベルが中央値で増加または減少する（図３、ｐ＜０．０５）。これらのヒットの大半（２１９、確認した全遺伝子の９３％、表１）のノックダウンにより、オートファジーの誘発がもたらされ、これらの遺伝子がオートファジー阻害遺伝子であることを示したのに対し、残りの１７のヒットのノックダウンでは、オートファジーが阻害させ、これらの遺伝子がオートファジー促進遺伝子であることを示した（表２）。
【０１７６】
実施例２． 候補遺伝子の二次高スループット特徴付け
新たに特定された遺伝子によるオートファジーの調節に関与する分子経路を解明するために、追加の高スループットアッセイを開発し、実施して、ヒットを特徴付けた（図４）。これらのアッセイの内の１つにおいて、飢餓誘発オートファジーの必須媒介物質であるｍＴＯＲＣ１の機能を調査した。候補遺伝子の内のどれが、ｍＴＯＲＣ１活性を変えることによってオートファジーを調節するかを決定するために、「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイを使用して、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達の下流標的であるリボソームＳ６タンパク質（ｒｐＳ６）のリン酸化反応状態を評価した。このシステムを検証するために、Ｈ４細胞をｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。非標的ｓｉＲＮＡと比べて、ｍＴＯＲ ｓｉＲＮＡトランスフェクション済み細胞においてｒｐＳ６リン酸化反応のレベルの著しい減少が観察された（図５）。「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイを使用して、そのノックダウンによりオートファジーの誘発がもたらされた２１９の確認された遺伝子の内の１４（６％）のみが、ｍＴＯＲＣ１活性のダウンレギュレーションと強力に相関したのに対し、そのノックダウンによりオートファジーとｍＴＯＲＣ１活性のアップレギュレーションがもたらされた９の遺伝子（４％）が特定された（図６）。
【０１７７】
そのノックダウンによりオートファジーが抑制された１７の確認された遺伝子の追加の三次スクリーニングにおいて、これらの遺伝子の３５％が、ｍＴＯＲＣ１の効力のある阻害剤であるラパマイシンの存在下でオートファジーをダウンレギュレーションできることが分かり、このことは、そのような遺伝子がｍＴＯＲＣ１の下流で機能することを示す（図７）。
【０１７８】
ＬＣ３−ＧＦＰの蓄積は、例えば、オートファジーの開始の増加またはオートファゴソームの分解の遮断によるものであろう。リソソーム部分の形状およびサイズを評価するために、リソソームタンパク質Ｌａｍｐ１−ＲＦＰを安定に発現するＨ４細胞を使用した。ｍＴＯＲのノックダウンにより、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰのレベルにおける著しい増加並びに再分布がもたらされ（図８）、オートファジーのアップレギュレーションに加え、ｍＴＯＲの阻害によっても、リソソーム部分の拡張が生じることを示唆している。このシステムを使用して、７８の遺伝子（３０％）に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰのレベルが著しく（±１．５のＳＤ）変化し、このことは、オートファジーのレベルの変化と正相関しており、これらの遺伝子が、リソソーム機能を変えることによって、オートファジーを調節することを示唆している（図９）。
【０１７９】
酵母および哺乳類細胞両方におけるオートファジーの重要な媒介物質である、III型ＰＩ３キナーゼの活性への、個々のヒットのノックダウンの影響も決定した。III型ＰＩ３キナーゼの活性を変えることによって、オートファジーを誘発するまたは抑制する遺伝子を特定するために、III型ＰＩ３キナーゼの産物であるＰｔｄＩｎｓ３Ｐに特異的に結合するＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄレポーターを安定に発現するＨ４細胞を使用した。上昇したIII型ＰＩ３キナーゼの活性により生じるＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積により、このレポーターの点状小胞局在化がもたらされる。このキナーゼの触媒成分である、Ｖｐｓ３４に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞動員が著しく減少した（図１０ＡおよびＢ）。ラパマイシンの効果と一致して、ｍＴＯＲＣ１成分のｍＴＯＲおよびＲａｐｔｏｒのノックダウンにより、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞シグナルが強力に増加した（図１０Ｃ）。このシステムを使用して、２３６の確認した遺伝子の内の１１０（４７％）のノックダウンにより、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐレベルが著しく（±１．５のＳＤ）変わり、これは、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの形成における変化と正相関する（図１１）ことも実証され、これらの遺伝子が、オートファジーの調節においてIII型ＰＩ３キナーゼの上流で働くことを示唆している。ＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞動員の両方のレベルを増加させる作用物質が、オートファジー変性を誘発しそうなものの内にある。
【０１８０】
そのノックダウンがオートファジーを誘発した２１９の遺伝子をさらに細分するために、二次特徴付けアッセイにおいて特定されたサブグループの各々に属するヒットを比較した（図１２）。ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄの小胞局在化が増加したヒットと、Ｌａｍｐ１−ＲＦＰを蓄積したヒットとの間の相当な重複が示された。これらの内のこの遺伝子のサブセットの活性を阻害する作用物質は、III型ＰＩ３キナーゼ、オートファジーおよびリソソーム活性を同時に調節しそうである。
【０１８１】
実施例３． 細胞死およびＥＲストレスは、ｓｉＲＮＡのスクリーニング中に誘発されたオートファジーの誘発に対する主要な要因ではない
ｓｉＲＮＡのスクリーニング中に観察されたオートファジーの誘発が、必須遺伝子のノックダウン後の細胞ストレスに対する一般的な応答を、オートファジーの調節におけるその遺伝子の特異的な機能よりも、反映したか否かを調査した。Ｂｃｌ−２の発現により、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後の平均細胞生存率が著しく改善された（図１３〜１５）。Ｋｉｆ１１およびインテグリンα５を除いて、Ｂｃｌ−２を発現する細胞中でオートファジーを誘発できる９１の遺伝子のノックダウンでは、これらの細胞中の生存率の実質的な損失を生じなかった。このことは、これらの遺伝子の阻害後のオートファジーのアップレギュレーションは、細胞死応答の誘発に依存しなかったことを示唆している。そのノックダウンにより、Ｂｃｌ−２を発現する細胞においてオートファジーをアップレギュレーションできなかった遺伝子の内、８１の遺伝子が、野生型細胞において高い（８５％超の）生存率を有した。したがって、１２９の特定したオートファジー阻害剤遺伝子の１７０の活性の阻害が、細胞死に無関係の機構によるオートファジーの誘発をもたらす。
【０１８２】
細胞死に加え、ＥＲストレスを含む細胞ストレスの様々な形態に応答して、オートファジーがしばしば誘発される。我々のヒット遺伝子のノックダウンに応答したオートファジーの刺激が、ＥＲストレスによるものであり得るか否かを決定するために、ＥＲストレスの特異的マーカーであるＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４の発現レベルを評価する「ｉｎ−ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎ」アッセイを行った。ＥＲストレスの強力な誘導物質であるツニカマイシンによる処理が、ＧＲＰ７８およびＧＲＰ９４の用量依存性アップレギュレーション（図１６）、並びにオートファジーの増加を引き起こした。試験した遺伝子の９７％において（試験した１８８の遺伝子の内の１８２、図１７）、遺伝子のノックダウン後に、オートファジーの刺激をもたらすＥＲストレスの著しいアップレギュレーションはなかった。したがって、ＥＲストレスは、スクリーニングにおいて観察されたオートファジーの誘発に対する主要な要因ではない。したがって、データは、ヒットの大半のノックダウン後のオートファジーの誘発は、広まったＥＲストレスの結果または細胞死により誘発された一般的な細胞ストレス応答の一部というよりむしろ、特異的なシグナル伝達事象の誘発のためであることを示唆している。
【０１８３】
実施例４． オートファジーの誘発へのＢｃｌ−２の影響
最初に、III型ＰＩ３キナーゼの調節オートファジー特異的成分であるｂｅｃｌｉｎ １が、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の結合パートナーとして特定された。アポトーシス細胞死の調節におけるその突出した機能に加え、Ｂｃｌ−２は、ｂｅｃｌｉｎ １との相互作用および結果として生じるIII型ＰＩ３キナーゼの活性の阻害により、オートファジーをマイナスに調節すると示唆されてきた。Ｂｃｌ−２の機能を評価するために、三次特徴付けスクリーニングを行って、野生型Ｈ４細胞およびＢｃｌ−２を安定に発現する細胞におけるオートファジーの誘発およびIII型ＰＩ３キナーゼの活性を比較した（図１８）。対照として、ｍＴＯＲのノックダウンが、Ｂｃｌ−２発現細胞においてＬＣ３−ＧＦＰおよびＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ小胞動員の両方を著しく誘発できたことが示された（図１９ＡおよびＢ）。Ｂｃｌ−２によるIII型ＰＩ３キナーゼの提案されたマイナスの調節と一致して、野生型対照と比べて、Ｂｃｌ−２を発現するＨ４細胞におけるヒット遺伝子のノックダウン後の平均ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄ誘発の著しい減少が生じた（図１９Ｃ）。２１５の試験した遺伝子の内の９１（４２％）のノックダウンが、Ｂｃｌ−２の存在下でＬＣ３−ＧＦＰのオートファゴソームへの転座を誘発できた（図１４および２０）。これらの９１の遺伝子の内の１７（１９％）において、オートファジーの誘発は、ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄの小胞動員により評価されるIII型ＰＩ３キナーゼの活性における増加と相関し、これらの遺伝子がＢｃｌ−２の下流のＰｔｄＩｎｓ３Ｐの産生を調節する追加の機構に関与することを示した。他方で、残りの７４の遺伝子のノックダウンが、III型ＰＩ３キナーゼを追加に起動させずに、オートファジーを誘発することができた。これらの遺伝子の３１のノックダウンが、野生型Ｈ４細胞中のＬａｍｐ１−ＲＦＰの蓄積を引き起こし、これらの場合、リソソーム分解の遮断が、Ｂｃｌ−２発現細胞におけるオートファジーの増加に寄与するであろうことを示した。残りの４３の遺伝子について、リソソーム機能における変化は観察されなかった。それゆえ、III型ＰＩ３キナーゼへのＢｃｌ−２の阻害効果は、オートファジーの誘発と常に相容れないわけではなく、その起動は、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐレベルを上昇させずに行うことができる。最後に、残りの１２４（５８％）の遺伝子のノックダウンは、Ｂｃｌ−２を過剰発現する細胞中の小胞ＬＣ３−ＧＦＰの蓄積を誘発できなかった（図１５）。
【０１８４】
実施例５． オートファジー関連遺伝子のバイオインフォマティクスネットワーク解析
オートファジーの調節に関与する生物学的ネットワークをさらに解明するために、ヒット遺伝子間の相互作用を、哺乳類および酵母データの両方に基づくその直接的な物理的相互作用をマッピングすることによって、調査した。ヒットの中には、ＮＦ−κＢの２つのサブユニット（ＮＦκＢ１およびＲｅｌＡ）、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプロセシングに関与する３つのリボ核タンパク質（ＨＮＲＰＫ、ＨＮＲＰＭおよびＨＮＲＰＮＵ）、３つのコートマー成分（ＣｏｐＢ２、ＣｏｐＥおよびＡｒｃｎ１）および２つのＡＭＰＫサブユニット（ＡＭＰＫα２およびＡＭＰＫγ３）を含むいくつかの公知のタンパク質複合体の多数の構成員が含まれた（図２１Ａ）。さらに、ｐ３００ＨＡＴおよびＮＦκＢに集中するクロマチン修飾酵素および相互作用する転写調節因子の大きなネットワークを特定した（図２１Ｂ）。後者は、転写調節がオートファジーの調節において重大な役割を果たすであろうことを示す。
【０１８５】
スクリーニングにおいて特定した遺伝子とコアオートファジー成分との間のＩｎｔｅｒｏｌｏｇ解析（タンパク質−タンパク質の相互作用の酵母−ヒトのオルソロガス・マッピング）により、ヒットの少なくとも２つ、Ｘｐｏ１およびＯＧＤＨが、コアオートファジー機構と物理的に相互作用するであろうことが判明した（図２２）。Ｘｐｏ１は、酵母ＣＲＭ１の哺乳類ホモログであり、核外輸送機構の必須成分である。Ｂｅｃｌｉｎ １およびＡｔｇ１２とのその相互作用は、これらのタンパク質の核外輸送における機能を反映するようである。他方で、ミトコンドリアマトリックスに局在化された代謝酵素であるＯＧＤＨは、関連する複合体の酵素活性とは関係ない細胞保護活性を有することが報告されており、ミトコンドリアの損傷により誘発されるオートファジーの調節に関する候補になる。
【０１８６】
オートファジー、軸索誘導およびアクチン動態の間の関係を調査するために、これらの標準経路に属するヒット遺伝子により繋ぎ留められたタンパク質−タンパク質相互作用ネットワークを作成した（図２３および２４）。この解析により、それぞれ、２７および６１のヒット遺伝子を網羅する２つの関連したネットワークが判明した。
【０１８７】
これらの解析は、ここでオートファジーの調節に関連すると特定された特有の経路および複合体の活性を変調する作用物質の使用により、オートファジーを変調できることを示す。
【０１８８】
実施例６． オートファジーの変調におけるサイトカインの使用
遺伝子オントロジー（ＧＯ）を使用した２３６の確認したヒットの分子機能解析により、キナーゼコード化遺伝子（ｐ＝０．０００６）、受容体活性を有するタンパク質（ｐ＝７．７×１０-5）および細胞外基質タンパク質（ｐ＝０．０３）における非常に著しい増加を示した（図２５および２６）。後者のカテゴリーは、成長因子、ホルモンおよびサイトカインの存在を含む細胞外環境が、通常の栄養条件下でオートファジーの調節に役割を果たすことを示す。ＧＯ生物学的プロセス解析の結果も、シグナル伝達分子の著しい増加（ｐ＝２．８×１０-7）を示した（図２７Ａ）。オートファジーの調節における細胞外因子の提案された機能に一致して、これらのシグナル伝達分子のさらなる細分により、最大のサブグループ（４９％）が細胞表面受容体シグナル伝達に関与したことが判明した（図２７Ｂ）。
【０１８９】
細胞を、我々のスクリーニングにおいてヒットと特定されたサイトカインおよび成長因子のいくつかで処理した。特徴付けアッセイの結果に基づいて、ＩＧＦ１、ＦＧＦ２、ＬＩＦ、ＣＬＣＦ１およびケモカインＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２）のノックダウンにより、オートファジーの開始の際にｍＴＯＲＣ１が独立して増加した。これと一致して、無血清培地中で増殖したＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞のこれらのサイトカインのいずれかによる処理が、ＬＣ３−ＧＦＰ転座により測定されるオートファジーの著しいダウンレギュレーションをもたらした（図２８および２９）。このデータを、ウェスタンブロット法により多数の細胞株（Ｈ４、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａおよびＭＣＦ７）において確認した（図３０）。オートファジーの調節におけるサイトカインの提案された機能に一致して、それらがない状態で培養した細胞は、ＬＣ３ＩＩの蓄積により評価された高い基礎レベルのオートファジーを示し、オートファジーは、スクリーニングにおいて特定されたサイトカインを１種類だけでも添加することによって、ある程度抑制された。それゆえ、特定されたサイトカインおよび成長因子は、オートファジーの調節にとって必要かつ十分である。
【０１９０】
上述したスクリーニングにおいて、ＴＮＦ遺伝子のノックダウンにより、ＬＣ３−ＧＦＰ陽性オートファゴソームの形成が増加し、基礎オートファジーの調節にけるこのサイトカインの陰性の役割を示した。オートファジーにおけるＴＮＦαの役割をさらに調査するために、既知組成培地中で増殖したＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞を、ＴＮＦαの用量を増加させながら処理した。低用量のＴＮＦαはオートファジーのダウンレギュレーションをもたらすのに対し、より高い用量では、オートファジーのアップレギュレーションをもたらした（図３１Ａ）。これを、低レベルのＴＮＦαによる処理後のｐ６２の蓄積を示すウェスタンブロット法により確認した。ＴＮＦαの生理的レベルは非常に低いので、このことは、このサイトカインはオートファジーの陰性調節因子として通常機能することを示唆している。他方で、病理状況下でのＴＮＦαの増加した濃度はオートファジーのアップレギュレーションをもたらす。
【０１９１】
実施例７． オートファジーの調節におけるＮＦ−κＢの機能
上述した標準経路は、ＮＦ−κＢ（ｐ＝８．７×１０-6）およびＲｅｌＡ（ｐ＝１．２×１０-6）経路におけるオートファジーヒットの増加を示した。スクリーニングの確認として、ＲｅｌＡに対してｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞を個々にイメージングした。蛍光顕微鏡検査法によるＬＣ３−ＧＦＰの転座を数量化することによるオートファジーのレベルを、代わりの低スループット法を使用して評価した。我々のスクリーニングの結果に一致して、ＲｅｌＡに対する４つのオリゴヌクレオチド全てによる処理が、オートファゴソームの数と強度の強力なダウンレギュレーションをもたらした（図３２および３３）。オートファジーのレベルにおいて観察した差が、標的遺伝子のノックダウンのためであったことを確認して、ｍＲＮＡ（図３４Ａ）およびタンパク質レベル（図３４Ｂ）の両方でＲｅｌＡの強力なダウンレギュレーションが観察された。オートファジーの陽性媒介物質としてのＮＦ−κＢの機能に関する発見はＨ４細胞に限られないことを確認するために、野生型でダブルノックアウトＲｅｌＡ-/-；ＮＦ−κＢ-/-（ＤＫＯ）ＭＥＦおよびいずれかのｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたヒト乳癌ＭＣＦ７細胞におけるオートファジーのレベルを、ＲｅｌＡまたは対照非標的ｓｉＲＮＡに対して比較した。ＲｅｌＡ／ＮＦκＢの不在またはダウンレギュレーションは、ＬＣ３ＩＩの減少およびｐ６２の蓄積により評価されるようにオートファジーの抑制をもたらした（図３５）。これらのデータにより、ＮＦκＢが基礎オートファジーの陽性調節因子として確認される。
【０１９２】
ここに記載した結果とは対照的に、ＮＦ−κＢの活性化が、栄養飢餓または死受容体連結などの有害な刺激に応答して誘発された細胞死に関連するオートファジーをマイナスに調節することが以前に報告された（Djavaheri-Mergy et al., J. Biol. Chem 281, 30373-30382 (2006)）。反応性酸素種（ＲＯＳ）が、飢餓誘発オートファジーの媒介に関与することが提案されているので、栄養欠乏条件下で、オートファジーのダウンレギュレーションは、ＮＦ−κＢによるＲＯＳ産生が弱まった結果であろうと推測された。野生型でｄＫＯＭＥＦおよび非標的ｓｉＲＮＡまたはＲｅｌＡに対するｓｉＲＮＡいずれかでトランスフェクションされたＨ４ ＬＣ３−ＧＦＰ細胞を栄養欠乏に曝した。ＲｅｌＡ／ＮＦ−κＢ欠乏細胞の飢餓は、野生型対照に観察されたよりも高いＲＯＳ蓄積をもたらした（図３６）。ＲｅｌＡ欠乏Ｈ４細胞における飢餓に応答して観察されたオートファジーの上昇した誘発は、酸化防止剤Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）の存在下で弱まった（図３７）。
【０１９３】
これらのデータは、ＮＦ−κＢが基礎オートファジーの調節においてプラスの機能を果たすのに対し、ＲＯＳ産生を弱めるその能力は、栄養欠乏条件下で観察されたオートファジーのレベルの減少を間接的にもたらし得ることを示す。それゆえ、以前の報告とは反対に、ＮＦ−κＢは、多細胞生物において最も優勢な非飢餓条件下ではオートファジー促進因子として働く。したがって、ＮＦ−κＢの成分（ＮＦＫＢ１およびＲＥＬＡ）の活性を阻害する作用物質は、オートファジーの阻害因子として働き、癌および／または膵炎の治療に有用である。
【０１９４】
実施例８． オートファジーの調節における反応性酸素種（ＲＯＳ）の機能
ノックダウンされたときにオートファジーを誘発する遺伝子は、ＲＯＳ無害化経路の主成分であるＳＯＤ１およびＧＰｘ２、並びにその多くが酸化呼吸と電子伝達に関与するいくつかのミトコンドリアタンパク質を含んだ（図３８）。これらの遺伝子のいずれの活性の阻害も、それらの産生を増加させるか、またはそれらの分解を遮断することによって、ＲＯＳのレベルのアップレギュレーションをもたらすと予測されるであろう。さらに、多くの追加のスクリーニングのヒットが、調節に関与する、またはＲＯＳにより調節されると報告されてきた（図３９）。オートファジーの一般的な媒介因子としてのＲＯＳの潜在的な役割を評価するために、最初に、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションが、オートファジーの誘発並びにＲＯＳの上昇したレベルの両方をもたらしたことを確認した（図４０）。ＲＯＳの因果関係の役割を確認して、酸化防止剤ＮＡＣによる処理によって、Ｓｏｄ１のノックダウンにより生じたオートファジーの誘発が著しく弱まった（図４１）。したがって、正常な細胞ＲＯＳホメオスタシスの干渉が、オートファジーの誘発にとって十分である。
【０１９５】
オートファジーの誘発中にＲＯＳに一般的なシグナル伝達の役割があるか否かを決定するために、ＮＡＣの存在下と不在下で、我々のヒット遺伝子のノックダウンにより誘発されるIII型ＰＩ３キナーゼの活性およびオートファジーのレベルを比較する三次特徴付けスクリーニングを行った。確認した遺伝子のグループ（１１７、または試験した全遺伝子の５４％）のノックダウンにより、酸化防止剤の不在下で小胞ＬＣ３−ＧＦＰが蓄積したが、存在下では蓄積せず、オートファジーの誘発にとってＲＯＳが必要であったことを示す（図４２）。これらの遺伝子のノックダウンは、ＮＡＣの存在下で小胞関連ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄの蓄積をおおむね増加させられなかった（図４２および４３）。このことは、ＲＯＳはIII型ＰＩ３キナーゼの活性化において一般的な機能を果たし、それらを、オートファジー経路の初期段階で重要なシグナル伝達分子として関係させる。
【０１９６】
他方で、残りの９８（４６％）の遺伝子の活性の阻害は、ＮＡＣの存在下でＬＣ３−ＧＦＰの蓄積を誘発させることができ、これらの場合、オートファジーはＲＯＳとは関係なく誘発できることを示した（図４４）。これらの遺伝子のノックダウンは、ＮＡＣの存在下と不在下で類似の平均レベルの小胞ＦＹＶＥ−ｄｓＲｅｄを誘発することもできた（図４３）。それゆえ、このグループの遺伝子の活性化の阻害は、ＲＯＳとは関係ない機構によって、III型ＰＩ３キナーゼの誘発をもたらした。
【０１９７】
実施例９． 成長促進経路は、オートファジーをマイナスに調節する
オートファジースクリーニングのヒットのバイオインフォマティクス解析は、細胞表面受容体からのシグナル伝達を媒介することが知られているいくつかの標準経路について著しい増加を示した（図４５）。これらの経路は、スクリーニングにおいて特定したサイトカインにより調節されるＭＡＰＫ（ｐ＝０．０３９）、Ｓｔａｔ３（ｐ＝０．００８）およびＣＸＣＲ４（ｐ＝１．１×１０-5）経路を含んだ。ＦＧＦ２は、ＭＡＰＫ経路を活性化させことが知られており、ホスホ−ＥＲＫ１／２およびホスホ−ＲＳＫの増加レベルが、ＦＧＦ２による処理後に観察された（図４６）。ＭＡＰＫ経路の必須機能を確認して、ＭＥＫの阻害因子であるＵＯ１２６による前処理で、ＦＧＦ２の添加後にオートファジーの阻害が弱まった（図４６）。さらに、ヒット遺伝子の全ての促進因子部分の解析により、ＲＳＲＦＣ４の３つの強化部位、血清応答因子（ＳＲＦ）ファミリーの一員およびＭＡＰＫシグナル伝達の下流標的を含むいくつかの転写調節因子のコンセンサス部位の著しい増加が示され（図４７）、通常の増殖条件下でのオートファジーの制御においてＭＡＰＫ経路による転写調節の追加の関与を示唆している。
【０１９８】
オートファジーのマイナスの調節因子としてのスクリーニングから抜粋された別のヒット遺伝子は、ＬＩＦおよびＣＬＣＦ１信号伝達の媒介因子である、転写調節因子Ｓｔａｔ３であった。実際に、ＬＩＦまたはＣＬＣＦ１いずれかによる処理で、Ｓｔａｔ３のリン酸化反応の活性化が上昇した（図４８および４９）。Ｓｔａｔ３の必須機能と一致して、そのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＬＩＦに応答してオートファジーのダウンレギュレーションを弱めた（図４９）。したがって、ＬＩＦおよびＣＬＣＦ１は、Ｓｔａｔ３経路を通じてオートファジーを調節する。
【０１９９】
ｍＴＯＲＣ１を活性化することに加え、Ａｋｔは、筋変性中にオートファジーをプラスに調節する転写調節因子であり、Ｆｏｘｏ３ａを直接リン酸化し、阻害する。実際に、ＡｋｔおよびＦｏｘｏ３ａの両方のリン酸化は、ラパマイシンの不在下と存在下の両方において、ＩＧＦ−１処理後に増加した（図５０）。Ａｋｔ阻害因子ＶＩＩＩでの処理によるＡｋｔの阻害により、Ｆｏｘｏ３ａおよびｍＴＯＲＣ１標的Ｓ６キナーゼ両方のリン酸化を弱め、ＩＧＦ１によるオートファジーの阻害を防いだ（図５０）。したがって、通常の栄養条件下で、ＩＧＦ−１は、おそらくｍＴＯＲＣ１およびＦｏｘｏ３ａ経路の両方を通じて、Ｉ型ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ依存様式で、オートファジーを調節する。
【０２００】
実施例１０． ヒトの老化中のオートファジーのダウンレギュレーション
老化に関連する神経変性におけるオートファジー関連遺伝子の潜在的機能に特異的に対処するために、オートファジーヒット遺伝子のｍＲＮＡ発現を一連の若年対老年のヒトの脳のサンプルにおいて解析した。年齢と共に、著しく（ｐ＜０．０５）アップレギュレーションされた３２の遺伝子および著しくダウンレギュレーションされた４６の遺伝子のグループ（図５３〜５５）を含む遺伝子の大きいサブセット（図５１および５２）の発現差異が観察された。興味深いことに、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセス解析により、年齢のアップレギュレーションされたグループは、ＭＡＰＫ経路の媒介および調節に関与した遺伝子が非常に豊富である（ｐ＝１．６×１０-4）ことが判明し、その増加した活性は、オートファジーの抑制をもたらすと我々の分析により予測される。逆に、鍵となるオートファジー遺伝子、Ａｔｇ５およびＡｔｇ７の発現は、老化中にダウンレギュレーションされた（図５５）。これらのデータは、遺伝子発現差異により、老化中に脳におけるオートファジーのダウンレギュレーションがもたらされることを示唆しており、このことは、慢性神経変性疾患の発症に寄与するであろう。この仮説と一致して、中年の個人からのサンプルを含む、サンプルのより広範囲に及ぶセットのさらなる解析により、Ａｔｇ５およびＡｔｇ７は、その発現が６０歳代前半で始まる年齢依存様式で徐々にダウンレギュレーションされた哺乳類細胞におけるオートファジーの媒介にとって必要な遺伝子のグループの中にあったことが判明し（図５６）、この年齢は、しばしば、アルツハイマー病（ＡＤ）などの散発性神経変性疾患に関する兆候の最も早い年齢である。したがって、我々のスクリーニングにおいて特定された遺伝子の年齢依存性調節は、正常なヒトの老化中のオートファジーのダウンレギュレーションに寄与しそうであり、それゆえ、年齢関連神経変性疾患を予防し、治療するための治療標的として有用である。
【０２０１】
実施例１１． アルツハイマー病の脳サンプルにおけるオートファジー調節因子の発現差異
ＲＯＳおよびオートファジー小胞（ＡＶ）の両方の蓄積が、ＡＤにおける初期の特徴である。この疾患におけるオートファジーの調節に関与する遺伝子の発現の変化を検出できるか否かを決定するために、１４才の適合した正常な対照およびＡＤを有する３４の場合の６つの脳領域からのオートファジースクリーニングヒット遺伝子の発現を分析した。特に、この疾患により最も影響した脳領域である海馬状隆起および嗅内皮質において対照に匹敵するＡＤ患者のサンプルにおいてヒット遺伝子の全体的な著しい低発現が観察された（図５７Ａ）。ＡＤにより影響を受けた他の脳領域（上前頭回、後帯状皮質、および大脳側頭葉の外面）において、一貫した傾向が観察された。特に、ＡＤ病状に対して比較的抵抗性である視覚皮質において、これらの変化がなかった。さらに、ヒット遺伝子のさらなる細分により、嗅内皮質において、オートファジーの流れの負の調節因子が特異的に負に強化されたことが判明した（図５７Ｂ）。ＡＤの影響を受けた他の脳領域においても、同様の傾向が観察された。逆に、オートファジーのプラスの調節因子は、嗅内皮質において、プラスに強化された（図５７Ｃ）。オートファジー調節因子のそのような発現差異パターンは、ＡＤ脳におけるオートファジーのアップレギュレーションを示唆している。
【０２０２】
実施例１２． ＲＯＳがアミロイドβに応答してオートファジーを媒介する
アミロイドβ（Ａβ）は、ＡＤにおける主要な病原因子である。Ａβによるオートファジーの誘発がＲＯＳにより媒介されたか否かを調査した。Ｈ４細胞のＡβによる処理後、増加したレベルのオートファジーが観察された（図５８）。これが、オートファジーの開始の増加によるものか、またはリソソームの分解の遮断によるものかを決定するために、リソソームプロテアーゼ阻害因子Ｅ６４ｄの不在下と存在下で、Ａβ処理後のＬＣ３−ＩＩの蓄積を観察した（図５８）。処理してから８時間後まで、ＣＬ３−ＩＩの蓄積はＥ６４ｄの存在下のみで観察できた。Ａβを添加してから４８時間後で、Ｅ６４ｄの不在下でさえ、増加したレベルのＬＣ３−ＩＩが観察されたが、Ｅ６４ｄの存在下では、さらに増加していた。その上、Ａβ処理の４時間後から始まるＡｔｇ１２−Ａｔｇ５の増加した結合(conjugation)が観察された。これらのデータは共に、Ａβに応答したオートファジーの増加した開始を示す。
【０２０３】
Ａβによるオートファジーの誘発におけるIII型ＰＩ３キナーゼの関与を調査した。ＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積が観察され、これは３ＭＡの存在下で抑制され（図５９）、III型ＰＩ３キナーゼの関与が確認された。ＲＯＳの因果関係の役割と一致して、ＰｔｄＩｎｓ３Ｐの蓄積がＮＡＣの存在下で抑制された（図６０）。最後に、３ＭＡによる処理（図６１）またはＶｐｓ３４のノックダウン（図６２）が、Ａβに応答するオートファジーの誘発を弱めることができた。
【０２０４】
同等物
本発明は、オートファジーを変調する方法およびオートファジー関連疾患の治療法を提供する。本発明の特定の実施の形態を論じてきたが、先の明細書は、説明であって、制限的ではない。本発明の多くの変種が、この明細書を検討した際に当業者には明白となるであろう。添付の特許請求の範囲は、そのような実施の形態および変種の全てをクレームすることが意図されており、本発明の全範囲は、同等範囲と共に請求項を、変種と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
【０２０５】
ここに述べられた全ての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が参照により含まれることが具体的に個別に示されているかのように、その全てが参照によりここに含まれる。係争の場合、ここでの任意の定義を含む本出願が規制する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるオートファジーを阻害する方法であって、前記細胞を、表２に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質と接触させる工程を有してなる方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記作用物質が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞においてオートファジーを誘発する方法であって、前記細胞を、表２に列記された遺伝子（オートファジーを減少させるヒット）からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質と接触させる工程を有してなる方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
対象における神経変性疾患を治療する方法であって、前記対象に、表２に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を有してなる方法。
【請求項１７】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記神経変性疾患が、副腎白質萎縮症、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症、カナバン病、脳性小児まひ、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドオフ病、シルダー病、悪性貧血の次の脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、および中毒性脳症からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
前記神経変性疾患がタンパク質症であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症からなる群より選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に、表２に列記された遺伝子（オートファジーを減少させるヒット）からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質を投与する工程を有してなり、前記疾患が癌または膵炎であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記作用物質が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が癌であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
化学療法薬の投与をさらに含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記化学療法薬が、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、２−クロロデオキシアデノシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、イミダゾールカルボキサミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン−ダウノマイシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルダラビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンαｎ３、イリノテカン、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メゲストロール、メルファラン、Ｌ−サルコシリン、メルファラン塩酸塩、ＭＥＳＮＡ、メクロレタミン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、メルカプトプリン、パクリタキセル、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および酒石酸ビレノルビンからなる群より選択されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
放射線療法の実施をさらに含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患が膵炎であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３９】
対象におけるタンパク質症を治療する方法であって、前記対象に、表２に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を有してなる方法。
【請求項４０】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質症が、α１−アンチトリプシン欠乏症、孤発性封入体筋炎、２Ｂ型肢体型筋ジストロフィー症および三好型ミオパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症からなる群より選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
作用物質がオートファジー阻害剤であるか否かを決定する方法であって、細胞を前記作用物質に接触させる工程を有してなり、前記細胞が異種オートファジー促進遺伝子を発現し、該オートファジー促進遺伝子が、表２に列記された遺伝子からなる群より選択され、それによって、前記細胞におけるオートファジーの低減が、前記作用物質がオートファジー阻害剤であることを示す方法。
【請求項４８】
前記作用物質が小分子であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記作用物質が抗体であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記作用物質が阻害性ＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項１】
細胞におけるオートファジーを阻害する方法であって、前記細胞を、表２に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質と接触させる工程を有してなる方法。
【請求項２】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記作用物質が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞においてオートファジーを誘発する方法であって、前記細胞を、表２に列記された遺伝子（オートファジーを減少させるヒット）からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質と接触させる工程を有してなる方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
対象における神経変性疾患を治療する方法であって、前記対象に、表２に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を有してなる方法。
【請求項１７】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記神経変性疾患が、副腎白質萎縮症、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症、カナバン病、脳性小児まひ、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドオフ病、シルダー病、悪性貧血の次の脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、および中毒性脳症からなる群より選択されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２４】
前記神経変性疾患がタンパク質症であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質症が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症からなる群より選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に、表２に列記された遺伝子（オートファジーを減少させるヒット）からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を阻害する作用物質を投与する工程を有してなり、前記疾患が癌または膵炎であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
前記作用物質が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が癌であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
化学療法薬の投与をさらに含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記化学療法薬が、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、２−クロロデオキシアデノシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、イミダゾールカルボキサミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン−ダウノマイシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フルダラビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、インターフェロンα、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンαｎ３、イリノテカン、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メゲストロール、メルファラン、Ｌ−サルコシリン、メルファラン塩酸塩、ＭＥＳＮＡ、メクロレタミン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、メルカプトプリン、パクリタキセル、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、および酒石酸ビレノルビンからなる群より選択されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
放射線療法の実施をさらに含むことを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患が膵炎であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３９】
対象におけるタンパク質症を治療する方法であって、前記対象に、表２に列記された遺伝子からなる群より選択される遺伝子の産物の活性を向上させる作用物質を投与する工程を有してなる方法。
【請求項４０】
前記遺伝子が、表４に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝子が、表６に列記された遺伝子からなる群より選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝子がTPRまたはGPR18であることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記作用物質が、前記遺伝子の産物に特異的な抗体であることを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子がRelAまたはNFκBであることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子がRelAであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質症が、α１−アンチトリプシン欠乏症、孤発性封入体筋炎、２Ｂ型肢体型筋ジストロフィー症および三好型ミオパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ＡＬＳ、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調、および球脊髄性筋萎縮症からなる群より選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４７】
作用物質がオートファジー阻害剤であるか否かを決定する方法であって、細胞を前記作用物質に接触させる工程を有してなり、前記細胞が異種オートファジー促進遺伝子を発現し、該オートファジー促進遺伝子が、表２に列記された遺伝子からなる群より選択され、それによって、前記細胞におけるオートファジーの低減が、前記作用物質がオートファジー阻害剤であることを示す方法。
【請求項４８】
前記作用物質が小分子であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記作用物質が抗体であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記作用物質が阻害性ＲＮＡ分子であることを特徴とする請求項４７記載の方法。
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１５−３】
【図１５−４】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２６−１】
【図２６−２】
【図２６−３】
【図２６−４】
【図２６−５】
【図２６−６】
【図２６−７】
【図２６−８】
【図２８】
【図２９】
【図３２】
【図３３】
【図３７】
【図３８】
【図３９−１】
【図３９−２】
【図３９−３】
【図４２−１】
【図４２−２】
【図４２−３】
【図４２−４】
【図４４−１】
【図４４−２】
【図４４−３】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５−１】
【図５５−２】
【図５６】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６３−１】
【図６３−２】
【図６３−３】
【図６３−４】
【図６３−５】
【図６４−１】
【図６４−２】
【図６４−３】
【図６４−４】
【図６４−５】
【図６４−６】
【図６４−７】
【図６４−８】
【図６４−９】
【図６４−１０】
【図６４−１１】
【図６４−１２】
【図６４−１３】
【図６４−１４】
【図６４−１５】
【図６４−１６】
【図６４−１７】
【図６４−１８】
【図６４−１９】
【図６４−２０】
【図６４−２１】
【図６４−２２】
【図６４−２３】
【図６４−２４】
【図６４−２５】
【図６４−２６】
【図６４−２７】
【図６４−２８】
【図６４−２９】
【図６４−３０】
【図６４−３１】
【図６４−３２】
【図６４−３３】
【図６４−３４】
【図６４−３５】
【図６４−３６】
【図６４−３７】
【図６４−３８】
【図６４−３９】
【図６４−４０】
【図６４−４１】
【図６４−４２】
【図６４−４３】
【図６４−４４】
【図６４−４５】
【図６４−４６】
【図６４−４７】
【図６４−４８】
【図６４−４９】
【図６４−５０】
【図６４−５１】
【図６４−５２】
【図６４−５３】
【図６４−５４】
【図６４−５５】
【図６４−５６】
【図６４−５７】
【図６４−５８】
【図６４−５９】
【図６４−６０】
【図６４−６１】
【図６４−６２】
【図６４−６３】
【図６４−６４】
【図６４−６５】
【図６４−６６】
【図６４−６７】
【図６４−６８】
【図６４−６９】
【図６４−７０】
【図６４−７１】
【図６４−７２】
【図６４−７３】
【図６４−７４】
【図６４−７５】
【図６４−７６】
【図６４−７７】
【図６４−７８】
【図６４−７９】
【図６４−８０】
【図６４−８１】
【図６４−８２】
【図６４−８３】
【図６４−８４】
【図６４−８５】
【図６４−８６】
【図６４−８７】
【図６４−８８】
【図６４−８９】
【図６４−９０】
【図６４−９１】
【図６４−９２】
【図６４−９３】
【図６４−９４】
【図６４−９５】
【図６４−９６】
【図６４−９７】
【図６４−９８】
【図６４−９９】
【図６４−１００】
【図６４−１０１】
【図６４−１０２】
【図６４−１０３】
【図６４−１０４】
【図６４−１０５】
【図６４−１０６】
【図６４−１０７】
【図６４−１０８】
【図６４−１０９】
【図６４−１１０】
【図６４−１１１】
【図６４−１１２】
【図６４−１１３】
【図６４−１１４】
【図６４−１１５】
【図６４−１１６】
【図６４−１１７】
【図６４−１１８】
【図６４−１１９】
【図６４−１２０】
【図６４−１２１】
【図６４−１２２】
【図６４−１２３】
【図６４−１２４】
【図６４−１２５】
【図６４−１２６】
【図６４−１２７】
【図６４−１２８】
【図６４−１２９】
【図６４−１３０】
【図６４−１３１】
【図６４−１３２】
【図６４−１３３】
【図６４−１３４】
【図６４−１３５】
【図６４−１３６】
【図６４−１３７】
【図６４−１３８】
【図６４−１３９】
【図６４−１４０】
【図６４−１４１】
【図６４−１４２】
【図６４−１４３】
【図６４−１４４】
【図６４−１４５】
【図６４−１４６】
【図６４−１４７】
【図６４−１４８】
【図６４−１４９】
【図６４−１５０】
【図６４−１５１】
【図６４−１５２】
【図６４−１５３】
【図６４−１５４】
【図６４−１５５】
【図６４−１５６】
【図６４−１５７】
【図６４−１５８】
【図６４−１５９】
【図６４−１６０】
【図６４−１６１】
【図６４−１６２】
【図６４−１６３】
【図６４−１６４】
【図６４−１６５】
【図６４−１６６】
【図６４−１６７】
【図６４−１６８】
【図６４−１６９】
【図６４−１７０】
【図６４−１７１】
【図６４−１７２】
【図６４−１７３】
【図６４−１７４】
【図６４−１７５】
【図６４−１７６】
【図６４−１７７】
【図６４−１７８】
【図６４−１７９】
【図６４−１８０】
【図６４−１８１】
【図６４−１８２】
【図６４−１８３】
【図６４−１８４】
【図６４−１８５】
【図６４−１８６】
【図６４−１８７】
【図１】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１８】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図３０】
【図３１】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図４０】
【図４１】
【図４３】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５７】
【図５８】
【図６２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【図３−５】
【図３−６】
【図３−７】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９−１】
【図９−２】
【図９−３】
【図１１−１】
【図１１−２】
【図１１−３】
【図１１−４】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１５−１】
【図１５−２】
【図１５−３】
【図１５−４】
【図１６】
【図１７】
【図１９】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２６−１】
【図２６−２】
【図２６−３】
【図２６−４】
【図２６−５】
【図２６−６】
【図２６−７】
【図２６−８】
【図２８】
【図２９】
【図３２】
【図３３】
【図３７】
【図３８】
【図３９−１】
【図３９−２】
【図３９−３】
【図４２−１】
【図４２−２】
【図４２−３】
【図４２−４】
【図４４−１】
【図４４−２】
【図４４−３】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５−１】
【図５５−２】
【図５６】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６３−１】
【図６３−２】
【図６３−３】
【図６３−４】
【図６３−５】
【図６４−１】
【図６４−２】
【図６４−３】
【図６４−４】
【図６４−５】
【図６４−６】
【図６４−７】
【図６４−８】
【図６４−９】
【図６４−１０】
【図６４−１１】
【図６４−１２】
【図６４−１３】
【図６４−１４】
【図６４−１５】
【図６４−１６】
【図６４−１７】
【図６４−１８】
【図６４−１９】
【図６４−２０】
【図６４−２１】
【図６４−２２】
【図６４−２３】
【図６４−２４】
【図６４−２５】
【図６４−２６】
【図６４−２７】
【図６４−２８】
【図６４−２９】
【図６４−３０】
【図６４−３１】
【図６４−３２】
【図６４−３３】
【図６４−３４】
【図６４−３５】
【図６４−３６】
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【図６４−４０】
【図６４−４１】
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【図６４−４３】
【図６４−４４】
【図６４−４５】
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【図６４−４７】
【図６４−４８】
【図６４−４９】
【図６４−５０】
【図６４−５１】
【図６４−５２】
【図６４−５３】
【図６４−５４】
【図６４−５５】
【図６４−５６】
【図６４−５７】
【図６４−５８】
【図６４−５９】
【図６４−６０】
【図６４−６１】
【図６４−６２】
【図６４−６３】
【図６４−６４】
【図６４−６５】
【図６４−６６】
【図６４−６７】
【図６４−６８】
【図６４−６９】
【図６４−７０】
【図６４−７１】
【図６４−７２】
【図６４−７３】
【図６４−７４】
【図６４−７５】
【図６４−７６】
【図６４−７７】
【図６４−７８】
【図６４−７９】
【図６４−８０】
【図６４−８１】
【図６４−８２】
【図６４−８３】
【図６４−８４】
【図６４−８５】
【図６４−８６】
【図６４−８７】
【図６４−８８】
【図６４−８９】
【図６４−９０】
【図６４−９１】
【図６４−９２】
【図６４−９３】
【図６４−９４】
【図６４−９５】
【図６４−９６】
【図６４−９７】
【図６４−９８】
【図６４−９９】
【図６４−１００】
【図６４−１０１】
【図６４−１０２】
【図６４−１０３】
【図６４−１０４】
【図６４−１０５】
【図６４−１０６】
【図６４−１０７】
【図６４−１０８】
【図６４−１０９】
【図６４−１１０】
【図６４−１１１】
【図６４−１１２】
【図６４−１１３】
【図６４−１１４】
【図６４−１１５】
【図６４−１１６】
【図６４−１１７】
【図６４−１１８】
【図６４−１１９】
【図６４−１２０】
【図６４−１２１】
【図６４−１２２】
【図６４−１２３】
【図６４−１２４】
【図６４−１２５】
【図６４−１２６】
【図６４−１２７】
【図６４−１２８】
【図６４−１２９】
【図６４−１３０】
【図６４−１３１】
【図６４−１３２】
【図６４−１３３】
【図６４−１３４】
【図６４−１３５】
【図６４−１３６】
【図６４−１３７】
【図６４−１３８】
【図６４−１３９】
【図６４−１４０】
【図６４−１４１】
【図６４−１４２】
【図６４−１４３】
【図６４−１４４】
【図６４−１４５】
【図６４−１４６】
【図６４−１４７】
【図６４−１４８】
【図６４−１４９】
【図６４−１５０】
【図６４−１５１】
【図６４−１５２】
【図６４−１５３】
【図６４−１５４】
【図６４−１５５】
【図６４−１５６】
【図６４−１５７】
【図６４−１５８】
【図６４−１５９】
【図６４−１６０】
【図６４−１６１】
【図６４−１６２】
【図６４−１６３】
【図６４−１６４】
【図６４−１６５】
【図６４−１６６】
【図６４−１６７】
【図６４−１６８】
【図６４−１６９】
【図６４−１７０】
【図６４−１７１】
【図６４−１７２】
【図６４−１７３】
【図６４−１７４】
【図６４−１７５】
【図６４−１７６】
【図６４−１７７】
【図６４−１７８】
【図６４−１７９】
【図６４−１８０】
【図６４−１８１】
【図６４−１８２】
【図６４−１８３】
【図６４−１８４】
【図６４−１８５】
【図６４−１８６】
【図６４−１８７】
【図１】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１８】
【図２０】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２７】
【図３０】
【図３１】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図４０】
【図４１】
【図４３】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５７】
【図５８】
【図６２】
【公表番号】特表２０１３−５０６６８７（Ｐ２０１３−５０６６８７Ａ）
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３２３２６（Ｐ２０１２−５３２３２６）
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０９６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４１５８４
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５０９６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４１５８４
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５０２０７２１３４）プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ (92)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ
【Ｆターム（参考）】
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