カイロマイクロンの分析方法
【課題】カイロマイクロン（ＣＭ）の定量は、脂質代謝異常症患者の病態を把握するための重要な情報の一つとなるため、簡便で正確なＣＭを定量するための分析方法を提供する。
【解決手段】ＣＭの密度は水よりわずかに小さく、放置することにより浮上するため、正確なＣＭの定量のためには試料を分析する前に撹拌することが必要であるが、強い撹拌ではリポ蛋白の変質を引き起こしてしまう問題があった。そこで、測定試料を採取し、分析する前にリポ蛋白の変質を引き起こさないように、かつ、ＣＭを均一に混合するように、ニードルあるいはノズルによる吸引吐出による撹拌することにより、ＣＭの正確な分離及び定量を可能とした。なお、吸引吐出の線速は６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下であることが好ましい。
【解決手段】ＣＭの密度は水よりわずかに小さく、放置することにより浮上するため、正確なＣＭの定量のためには試料を分析する前に撹拌することが必要であるが、強い撹拌ではリポ蛋白の変質を引き起こしてしまう問題があった。そこで、測定試料を採取し、分析する前にリポ蛋白の変質を引き起こさないように、かつ、ＣＭを均一に混合するように、ニードルあるいはノズルによる吸引吐出による撹拌することにより、ＣＭの正確な分離及び定量を可能とした。なお、吸引吐出の線速は６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は測定試料中に含まれるリポ蛋白の変質を引き起こさないような攪拌方法、そのような攪拌を行なった後に試料を採取する方法、そして、そのようにして採取した試料を分析することによる、カイロマイクロンの正確な定量を可能とする分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症は糖尿病に並ぶ生活習慣病の一つであり、従来、スクリーニングやモニタリングの目的に血清中の総コレステロール値が用いられてきた。コレステロールは一般的に、リポ蛋白質の形で血液中を運搬され、密度の高い順に、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白質（ＩＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、カイロマイクロン（ＣＭ）の５分画に分けることができるが、この中でＣＭは、高脂血症の世界保健機構（ＷＨＯ）分類によると、空腹時のＣＭの存在がＩ型およびＶ型高脂血症の判断の一つとなっている。
【０００３】
ＣＭの分析方法には、セルロースアセテート電気泳動法、アガロース電気泳動法、アクリルアミド電気泳動法、超遠心分析法、ゲルろ過クロマトグラフィ等の方法がある（非特許文献１）。セルロースアセテート電気泳動法及びアガロース電気泳動法においては、ＣＭは電荷を有さないため原点に留まり泳動しないとされている（非特許文献１）。アクリルアミド電気泳動も同様で、濃縮ゲルに留まったままとされている（非特許文献１）。これら電気泳動法は、試料（血清）中に分散している浮遊微粒子の影響を受けるため、多くの患者検体の場合、正確な定量は困難である。超遠心分析法では、ＣＭの密度は０．９４ｇ／ｃｍ３未満と水よりもわずかに軽いため、浮上時間を算出して分離することにより、その定量分析を行なうことも可能である。しかしながら、操作は煩雑で熟練した技術が必要である。臨床現場では、ＣＭの密度が血清より小さいことから、冷蔵庫に１６から２４時間放置し、上層に白い層（ＣＭの層）が確認できるか否かで、その患者血清中にＣＭが存在するか否か判断されている（非特許文献２）。
【０００４】
以上のような分析方法に対して、ゲルろ過クロマトグラフィでは、簡易にＣＭの定量分析を行なうことが可能であり、例えばその定量分析のためのゲルろ過カラムが市販されている（商品名；ＴＳＫｇｅｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｃｋ、東ソー製）（非特許文献３）。
【０００５】
昨今、イオン交換クロマトグラフィにより、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの各成分を分離する方法が開発された（特許文献１、非特許文献４及び５）。陽イオン交換クロマトグラフィでは、マグネシウムイオン濃度依存的に試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの各成分が溶出する（非特許文献４）（なおこのＣＭ画分は、レムナントと呼ばれる粒子系の小さなＣＭのみが溶出されることが知られている）。陰イオン交換クロマトグラフィでは、カオトロピックイオンの濃度依存的に試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの各成分が溶出する（非特許文献５）。これらのイオン交換クロマトグラフィは、ＣＭを十分に分離することが可能であり、定量法として適切な方法である。
【０００６】
試料中に含まれる被分析物を液体クロマトグラフィ等によって分離、定量する際には、通常、カラムに供する試料を採取する以前に試料を攪拌する操作が行なわれる。係る攪拌としては、例えば、吸引吐出する方法、試料中にノズルから空気を吹き出す方法、攪拌棒で攪拌する方法、試料容器を振動や回転させる方法、内径の不連続に変化する配管に試料を流すことで生じる乱流により攪拌する方法等がある（特許文献２、非特許文献６）。より具体的には、例えば、液体クロマトグラフィを用いたカテコールアミン分析装置において、自動で反応試薬、反応助剤及び試料を混合する機構として、反応容器に予め反応試薬と反応助剤を分注し、その容器に試料を高速で吐出するもの（特許文献３）、尿中の有形成分を測定するために、吸引吐出により攪拌を行なうための内径の比較的大きなピペットと試料を吸引採取するための内径の小さなピペットの２つのピペットを有するもの（特許文献４）、全血中の赤血球を破砕し赤血球中に含まれるヘモグロビンを溶出するため、内径が変化した乱流が起こりやすい流路に、希釈した全血を往復させることにより、混合及び赤血球の破砕を行なう機構（非特許文献６）等がある。
【０００７】
上記した攪拌操作は、しかしながら、試料と希釈液等を混合するための操作として、又は、尿中の有形成分や血液中の血球成分等の不溶物を均一に混合するための操作として検討されているため、例えば吸引吐出による攪拌を行なっているものでは、乱流作用によって混合を促すために１２０００から２４０００ｃｍ／ｍｉｎの線速で吸引吐出を行なっている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２９６２６１
【特許文献２】特開昭６３−６６４６６
【特許文献３】特開第３３２９９３９号
【特許文献４】特許第３２７６５５１号
【非特許文献１】山本 章 編著、血清脂質−その臨床、基礎、分析法、内外医学社、ｐ．３７８−４０１、１９８１
【非特許文献２】金井 正光 編、臨床検査法提要第２９版、金原出版、ｐ．４５２、１９８３
【非特許文献３】Ｓｈｉｎｉｃｈｉ Ｕｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３，８０５−８１４，２００２
【非特許文献４】Ｙｕｊｉ Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０８，３３６−３４２，２００２
【非特許文献５】Ｙｕｊｉ Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４４，１４０４−１４１２，２００３
【非特許文献６】福永 信吾ら、東ソー研究報告、４０、７５−８４、１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
リポ蛋白は、強い攪拌等の衝撃により変質することが知られている。このため、従来行なわれているような吸引吐出する方法、試料中にノズルから空気を吹き出す方法、攪拌棒で攪拌する方法、試料容器を振動や回転させる方法、内径の不連続に変化する配管に試料を流すことで生じる乱流により攪拌する方法では、混合時に発生する比較的強い衝撃による変性の可能性を否定できない。その一方でＣＭは、その密度が０．９４ｇ／ｃｍ３未満と水よりもわずかに軽く、放置することにより浮上するため、正確なＣＭの定量のためには、試料を採取し、分析する前に変質を引き起こさないように攪拌することが必要である。
【００１０】
もしも、攪拌の際の衝撃が強くなり、リポ蛋白が変質を起こした場合には、表面に存在するタンパク質に変性が生じることにより疎水性が上昇し、ＣＭと同様の大きなリポ蛋白となることが想像される。そのためＣＭの定量値が偽高値を示すことが懸念される。
【００１１】
そこで本願発明は、高脂血症患者の病態を把握するために重要な情報の一つとなるＣＭを正確に定量するための、リポ蛋白の変質を引き起こさない攪拌方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行ない、その結果本発明を完成するに至った。前記課題を解決する本願請求項１の発明は、ＣＭを含有し得る測定試料に対し、試料が含有するリポ蛋白の変質が引き起こされることにより、ＣＭの定量値への影響を及ぼさないように、ニードルあるいはノズルの吸引吐出により攪拌する測定試料の攪拌方法である。本願請求項２の発明は、本願請求項１の発明に係り、ニードルあるいはノズルの吸引吐出の線速が６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下であることを特徴とする。本願請求項３の発明は、ＣＭを含有し得る測定試料を採取する前に、本願請求項１又は２の攪拌を行なうことを特徴とする測定試料の採取方法である。本願請求項４の発明は、ＣＭを含有し得る測定試料を分析する前に、本願請求項３の測定試料の採取を行なうことを特徴とする、測定試料中に含まれるＣＭの正確な分離及び定量が可能となる分析方法である。そして、本願請求項５の発明は、前記請求項４の発明に係り、試料中のＣＭを分離及び定量する分析手段が液体クロマトグラフィであることを特徴とする。
【００１３】
以下、本発明の詳細について説明する。本願発明は、ニードルあるいはノズル（以下、ノズル等ということがある）の吸引吐出、即ち、測定試料をノズル等で吸引し吐出する操作により、リポ蛋白の変質を引き起こさないように攪拌するものである。試料中へのノズル等からの空気の吐出、攪拌棒の攪拌、試料容器の振動等又は内径が不連続に変化する配管に測定試料を流すことによる攪拌では、操作時に比較的強い衝撃が生じるため、リポ蛋白の変質が引き起こされる可能性があり、不適切である。特に、試料中へのノズル等からの空気の吐出では、リポ蛋白が変質する可能性に加え、吐出された空気が測定試料中で気泡を形成し、分析のために測定試料を採取する際に吸引され、結果的に測定試料の採取量に変動を生じて正確な分析を阻害する可能性がある。
【００１４】
本願発明では、６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下という、従来の吸引吐出による攪拌において採用されている線速（１２０００から２４０００ｃｍ／ｍｉｎ）からみると、比較的遅い線速により測定試料をゆっくりと吸引吐出するために、ＣＭに対し強い衝撃を与えず、しかも、気泡形成のない攪拌が可能である。このように遅い線速による吸引吐出によって十分な攪拌が可能であるのは、ＣＭが水に比べて少しだけ密度の小さい画分であるためである。なお、ＣＭはリポ蛋白の中で最も密度が小さい画分であり、その値は０．９４ｇ／ｃｍ３未満と水よりわずかに小さいだけであるため、ノズル等による吸引吐出の線速の下限値に特に制限はないが、攪拌に引き続き、例えば後述する液体クロマトグラフィを用いてＣＭ分析を行なうような場合には、５００ｃｍ／ｍｉｎ程度以上の線速で攪拌することが、分析速度の向上等の面から好ましい。
【００１５】
ノズル等による吸引吐出は、例えば、図１に示したように行なうことが好ましい。まず、試料カップ（４）中の測定試料にニードル（３）の先端を浸漬する。どの程度までニードル先端を浸漬するかについて特別の制限はないが、後に測定試料の吸引を完了した段階で、ニードル中に空気が吸引されないようにすれば良い。次に、浸漬したニードルの先端から測定試料をシリンジ（１）で吸引する。吸引する測定試料の量は、全測定試料の７０％程度以上とすることが好ましい。係る量を吸引し、吐出すれば、吸引しなかった測定試料との間で十分な攪拌が見込めるからである。そして、ニードル（３）の先端が測定試料液面からわずかに離れた位置かそれ以下の位置（吸引しなかった測定試料中に浸漬された状態でも良い）から、シリンジ（１）で６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下の線速で吸引した測定試料を吐出する。６０００ｃｍ／ｍｉｎの攪拌は比較的ゆっくりとしたマイルドな攪拌である。しかし、ＣＭは比重が水よりわずかに軽いという特質を持つため試料の上層に浮いた状態となっており、吸引工程の終段階で吸引された後、吐出時に液面からわずかに離れた位置かそれ以下の位置で吐出することにより、容易に混合される。一方、一般的に行なわれる攪拌（血球や尿沈渣）の場合、試料を強く攪拌し巻き上げることにより均一状態となるように混合を行なわなければならない。
【００１６】
以上の吸引吐出を１回行なうことにより、液体中に気泡を発生させず、かつ、リポ蛋白の変性を引き起こさずに、ＣＭを容易かつ効率よく攪拌できるが、より信頼性を高めるために２から５回程度、繰り返し実施することが好ましい。
【００１７】
ノズル等は、いわゆる手動のピペッターや、前記例示の如くシリンジであっても良いが、複数の測定試料について均一な攪拌を実現するためには自動的に測定試料の吸引吐出を行なうものが好適である。測定試料のサンプリング用サンプラー（オートサンプラー）を備える液体クロマトグラフィ装置等では、当該サンプラーのノズル等を利用することができる。この場合には、試料を吸引して分析系に導入するためのノズル等と試料を攪拌するノズル等を共有でき、分析装置としてシンプルな設計にできる。
【００１８】
ＣＭの測定を行なうための測定試料を採取する前に攪拌を行なう場合には、上記説明したノズル等をそのまま測定試料採取用のノズル等として使用することのほかに、攪拌に使用したのとは異なるノズル等を採取専用のノズル等として使用することもできる。このようにして採取された測定試料は、ＣＭの正確な分析を行なうための測定試料として、従来公知の種々の分析に供することができるが、簡便で定量性に優れるという特徴を有する液体クロマトグラフィ、中でも他のリポ蛋白との分離能が非常に高いイオン交換クロマトグラフィが、好ましいＣＭ分析方法として例示できる。
【００１９】
本願発明は、液体クロマトグラフィにより複数の測定試料中のＣＭを連続的に分析する場合、本願発明は特に好ましい結果をもたらすものである。すなわち、液体クロマトグラフィにより一度に分析し得る測定試料は基本的に一種類であるため、複数の測定試料を連続的に分析する場合、オートサンプラーに当該複数の測定試料をセットしておくのが普通である。ここで、測定試料をセットしてから測定が開始されるまでの時間は、測定順序の後になればなるほど長くなり、その間にＣＭが浮上するからである。従って、測定試料を採取して液体クロマトグラフィによる分析に供する直前に、本願発明を適用して測定試料を攪拌することにより、正確なＣＭの定量を行なうことが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、ＣＭを含有し得る測定試料を分析する前に、リポ蛋白の変質を引き起こさないように攪拌した後、採取を行なうことで、測定試料中に含まれるＣＭの正確な分離及び定量を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
測定試料を分析する前に、吸引吐出による攪拌の実施の有無による、カイロマイクロン及び総コレステロール定量値への影響を検討した。
【００２２】
測定試料に含まれるリポ蛋白質のコレステロールの定量は図２に示す高速液体クロマトグラフを用いて行なった。溶離液Ａ（５）及びＢ（６）はそれぞれのポンプ（８及び９）へ送られる前にデガッサー（７）で溶存する気体成分を除去し、ポンプ（８及び９）出口のミキサー（１０）により攪拌され、オートサンプラー（１１）より採取された測定試料とともに、カラム（１３）へと送られる。なお、カラム（１３）の入り口にはフィルター（１２）を接続した。一方、コレステロール反応液（１５）はエアートラップ（１６）を経由してポンプ（１７）へ送られる。なお、ポンプ（１７）出口には、抵抗管（１８）（内径０．１ｍｍ×２ｍ）を２本接続した。カラム（１３）からの溶出液とコレステロール反応液とがリアクター（１９）内の反応コイル（内径０．２５ｍｍ×３０ｍ）にて反応し、リアクター（１９）出口にある検出器（２０）にて検出する。
【００２３】
溶離液Ａ（５）には５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＮＯ３＋１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．５）を、溶離液Ｂ（６）には５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＮＯ３＋１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．５）＋５００ｍｍｏｌ／Ｌ 過塩素酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を用いた。オートサンプラー（１１）は、試料カップを設置する場所（２１）、上下左右に移動が可能なニードル（２２）、試料を吸引吐出するためのシリンジポンプ（２３）、流路を切り替えるための６方モーターバルブ（２４）、試料を採取するための４μＬ容量のサンプルループ（２５）、ニードル洗浄のための洗浄液（２６）及び電磁弁（２７）を有している。カラム（１３）にはＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（カラムサイズ：内径３．０ｍｍ×２５ｍｍ、東ソー製）を用いた。コレステロール反応液（１５）はコレステロールＥテストワコー（和光純薬製）を用いた。溶離液は０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブン（１４）は２５℃に保ち、反応コイル（１９）は３７℃に保った。検出器（２０）の検出波長は６００ｎｍとした。
【００２４】
溶離液のステップグラジエントパターンは０から３分まではＢ液の組成を２０％に固定、３から８．５分まではＢ液の組成を２３％に固定、８．５から１１分まではＢ液の組成を２７％に固定、１１から１４．５分まではＢ液の組成を３２％に固定、１４．５から１６．５分まではＢ液の組成を１００％に固定、１６．５分以降はＢ液の組成を２０％に固定し試料注入は２４分毎に行なった。以上の分析条件により、試料中のリポ蛋白はカラム中で分離され、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの順にカラムより溶出され、コレステロール反応液と混合し、反応、検出することにより、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールを定量することができる。また、すべての定量値を合計することにより、測定試料中の総コレステロール値を算出できる。
【００２５】
ＣＭ高濃度含有検体として、高脂血症患者血清のうち、冷蔵庫内に１２時間放置した際にＣＭが浮上分離する血清を用いた。また、健常者の血清も別途用意した。ＣＭ高濃度含有検体及び健常人検体をそれぞれ試料カップに５０μＬ分注し、１０℃に冷却したオートサンプラー上で１６時間放置し、測定を行なった。
【００２６】
吸引吐出による攪拌の方法はオートサンプラーに試料カップを設置し、測定試料採取の際に、試料カップ内に５０μＬの試料を入れ、４０μＬの吸引吐出の繰り返しを３回行ない通常の採取を行なった。この際、試料の吸引吐出はともに３２００ｃｍ／ｍｉｎに設定した。なお、オートサンプラーのニードルの位置は、各吸引終了時にニードルの先端が試料液面よりも２ｍｍ高い位置になるように動作させてから吐出動作を行なうようにした。なお、試料採取量はいずれの場合においても４μＬとした。
【００２７】
測定で得られたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロール測定値及び比率を表１に示した。また、同じく測定で得られたＣＭ高感度含有検体及び健常人検体のクロマトグラムをそれぞれ図３及び４に示した。
【００２８】
【表１】
ＣＭ高濃度含有検体の測定において吸引吐出による攪拌の有無の影響について比較してみると、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬでは大きな数値の変化はみられなかったが、ＣＭにおいては２３．１ｍｇ／ｄＬから３０．４ｍｇ／ｄＬと大幅に増加した。これは、攪拌により密度の低いＣＭ画分が均一に混合されたためと判断する。また、これに伴い、総コレステロール値（すべてのリポ蛋白の合計値）も１７６．１ｍｇ／ｄＬから１８６．８ｍｇ／ｄＬへと増加した。これらの結果から、事前攪拌のない場合においては、ＣＭ中のコレステロール値が低く、また、総コレステロール値も低く測定してしまい、正確性に欠けることがわかる。
【００２９】
また、検出されたコレステロールの濃度から算出されるそれぞれのリポ蛋白の比率は高脂血症患者の病態を把握するための指標となり得るが、この比率においても、攪拌がない場合においては、ＨＤＬ、ＬＤＬの高密度成分が高く見積もられ、ＣＭのような低密度成分が低く見積もられていた。
【００３０】
一方、ＣＭが高濃度で含有されない健常人検体においては攪拌の有無による影響がほとんどなく、各画分のコレステロール濃度及び総コレステロール濃度にも、組成比についてもほとんど影響はなかった。
実施例２
攪拌強度による、リポ蛋白コレステロール濃度及び総コレステロール定量値への影響を検討した。
【００３１】
ＣＭ高濃度含有検体及び健常人検体（検体は実施例１で使用したものとは異なる）をピペッティングにて１０回吸引吐出させての攪拌（吸引吐出量は実施例１と同じ）、あるいはミキサーにて１０分間の攪拌にて測定検体を混合させ、実施例１で使用した高速液体クロマトグラフィにて測定を行なった。測定で得られたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロール測定値を表２に示した。
【００３２】
【表２】
発明が解決しようとする課題の中でリポ蛋白が強い衝撃により変質すると述べたが、実際に、ＣＭが含有された試料をミキサーで勢いよく１０分間攪拌操作を行なった後、イオン交換クロマトグラフィにて分析するとリポ蛋白が変質し、疎水性が増加し、凝集した結果として、ＨＤＬの測定値に偽低値、ＣＭの測定値に偽高値が見られた。また、総コレステロール定量値は変化していなかったことから、ＣＭの偽高値はＨＤＬの低下に伴うものであることが確認された。
実施例３
ＣＭ高濃度含有検体を用いて吸引吐出での線速の違いによるＣＭ及び総コレステロール定量値への影響を検討した。
【００３３】
ＣＭ高濃度含有検体（実施例１及び２で用いた試料とは異なる）を生理食塩水で１０倍希釈した試料を用いて、線速２６００ｃｍ／ｍｉｎ、８８００ｃｍ／ｍｉｎ、４４０００ｃｍ／ｍｉｎにてそれぞれ試料を３回吸引吐出することで攪拌し（吸引吐出量は実施例１と同じ）、実施例１で使用した高速液体クロマトグラフィにて測定を行なった。測定で得られたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロール測定値を表３に示した。
【００３４】
【表３】
発明が解決しようとする課題の中でリポ蛋白が強い衝撃により変質すると述べたが、実際に、変質しやすい検体を線速４４０００ｃｍ／ｍｉｎで３回攪拌操作を行なった後、イオン交換クロマトグラフィにて分析すると、ＨＤＬ及びＬＤＬの測定値に偽低値、ＣＭの測定値に偽高値が見られた。これは、ＨＤＬおよびＬＤＬが変質して、表面の性質が変化して、ＣＭの位置に溶出するようになったことに起因する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】吸引吐出による攪拌とそのときの攪拌状態の模式図
【図２】リポ蛋白分析装置の概要
【図３】実施例１にて測定試料を分析する前に吸引吐出にて攪拌した場合（Ａ）、及び攪拌しなかった場合（Ｂ）の、ＣＭ高濃度含有検体に含まれるリポ蛋白質中のコレステロール測定のクロマトグラム。図中、ＨＤＬは高密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＬＤＬは低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＩＤＬは中間型リポ蛋白質中のコレステロール、ＶＬＤＬは超低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＣＭはカイロマイクロン中のコレステロールをそれぞれ示している。
【図４】実施例１にて測定試料を分析する前に吸引吐出にて攪拌した場合（Ａ）、及び攪拌しなかった場合（Ｂ）の、健常人検体に含まれるリポ蛋白質中のコレステロール測定のクロマトグラム。図中、ＨＤＬは高密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＬＤＬは低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＩＤＬは中間型リポ蛋白質中のコレステロール、ＶＬＤＬは超低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＣＭはカイロマイクロン中のコレステロールをそれぞれ示している。
【符号の説明】
【００３６】
１ 吸引吐出用シリンジ
２ 導管
３ ニードル
４ 試料カップ
５ 溶離液Ａ
６ 溶離液Ｂ
７ デガッサー
８ 溶離液Ａ用ポンプ
９ 溶離液Ｂ用ポンプ
１０ スタティックミキサー
１１ オートサンプラー
１２ フィルター
１３ カラム
１４ カラムオーブン
１５ コレステロール反応液
１６ エアートラップ
１７ コレステロール反応液用ポンプ
１８ 抵抗管
１９ リアクター
２０ 検出器
２１ 試料カップ
２２ ニードル
２３ シリンジポンプ
２４ 流路切り替えのための６方モーターバルブ
２５ サンプルループ
２６ ニードル洗浄のための洗浄液（精製水）
２７ ニードル洗浄のための電磁弁
【技術分野】
【０００１】
本発明は測定試料中に含まれるリポ蛋白の変質を引き起こさないような攪拌方法、そのような攪拌を行なった後に試料を採取する方法、そして、そのようにして採取した試料を分析することによる、カイロマイクロンの正確な定量を可能とする分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症は糖尿病に並ぶ生活習慣病の一つであり、従来、スクリーニングやモニタリングの目的に血清中の総コレステロール値が用いられてきた。コレステロールは一般的に、リポ蛋白質の形で血液中を運搬され、密度の高い順に、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、中間型リポ蛋白質（ＩＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、カイロマイクロン（ＣＭ）の５分画に分けることができるが、この中でＣＭは、高脂血症の世界保健機構（ＷＨＯ）分類によると、空腹時のＣＭの存在がＩ型およびＶ型高脂血症の判断の一つとなっている。
【０００３】
ＣＭの分析方法には、セルロースアセテート電気泳動法、アガロース電気泳動法、アクリルアミド電気泳動法、超遠心分析法、ゲルろ過クロマトグラフィ等の方法がある（非特許文献１）。セルロースアセテート電気泳動法及びアガロース電気泳動法においては、ＣＭは電荷を有さないため原点に留まり泳動しないとされている（非特許文献１）。アクリルアミド電気泳動も同様で、濃縮ゲルに留まったままとされている（非特許文献１）。これら電気泳動法は、試料（血清）中に分散している浮遊微粒子の影響を受けるため、多くの患者検体の場合、正確な定量は困難である。超遠心分析法では、ＣＭの密度は０．９４ｇ／ｃｍ３未満と水よりもわずかに軽いため、浮上時間を算出して分離することにより、その定量分析を行なうことも可能である。しかしながら、操作は煩雑で熟練した技術が必要である。臨床現場では、ＣＭの密度が血清より小さいことから、冷蔵庫に１６から２４時間放置し、上層に白い層（ＣＭの層）が確認できるか否かで、その患者血清中にＣＭが存在するか否か判断されている（非特許文献２）。
【０００４】
以上のような分析方法に対して、ゲルろ過クロマトグラフィでは、簡易にＣＭの定量分析を行なうことが可能であり、例えばその定量分析のためのゲルろ過カラムが市販されている（商品名；ＴＳＫｇｅｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｃｋ、東ソー製）（非特許文献３）。
【０００５】
昨今、イオン交換クロマトグラフィにより、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの各成分を分離する方法が開発された（特許文献１、非特許文献４及び５）。陽イオン交換クロマトグラフィでは、マグネシウムイオン濃度依存的に試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの各成分が溶出する（非特許文献４）（なおこのＣＭ画分は、レムナントと呼ばれる粒子系の小さなＣＭのみが溶出されることが知られている）。陰イオン交換クロマトグラフィでは、カオトロピックイオンの濃度依存的に試料中のＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの各成分が溶出する（非特許文献５）。これらのイオン交換クロマトグラフィは、ＣＭを十分に分離することが可能であり、定量法として適切な方法である。
【０００６】
試料中に含まれる被分析物を液体クロマトグラフィ等によって分離、定量する際には、通常、カラムに供する試料を採取する以前に試料を攪拌する操作が行なわれる。係る攪拌としては、例えば、吸引吐出する方法、試料中にノズルから空気を吹き出す方法、攪拌棒で攪拌する方法、試料容器を振動や回転させる方法、内径の不連続に変化する配管に試料を流すことで生じる乱流により攪拌する方法等がある（特許文献２、非特許文献６）。より具体的には、例えば、液体クロマトグラフィを用いたカテコールアミン分析装置において、自動で反応試薬、反応助剤及び試料を混合する機構として、反応容器に予め反応試薬と反応助剤を分注し、その容器に試料を高速で吐出するもの（特許文献３）、尿中の有形成分を測定するために、吸引吐出により攪拌を行なうための内径の比較的大きなピペットと試料を吸引採取するための内径の小さなピペットの２つのピペットを有するもの（特許文献４）、全血中の赤血球を破砕し赤血球中に含まれるヘモグロビンを溶出するため、内径が変化した乱流が起こりやすい流路に、希釈した全血を往復させることにより、混合及び赤血球の破砕を行なう機構（非特許文献６）等がある。
【０００７】
上記した攪拌操作は、しかしながら、試料と希釈液等を混合するための操作として、又は、尿中の有形成分や血液中の血球成分等の不溶物を均一に混合するための操作として検討されているため、例えば吸引吐出による攪拌を行なっているものでは、乱流作用によって混合を促すために１２０００から２４０００ｃｍ／ｍｉｎの線速で吸引吐出を行なっている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２９６２６１
【特許文献２】特開昭６３−６６４６６
【特許文献３】特開第３３２９９３９号
【特許文献４】特許第３２７６５５１号
【非特許文献１】山本 章 編著、血清脂質−その臨床、基礎、分析法、内外医学社、ｐ．３７８−４０１、１９８１
【非特許文献２】金井 正光 編、臨床検査法提要第２９版、金原出版、ｐ．４５２、１９８３
【非特許文献３】Ｓｈｉｎｉｃｈｉ Ｕｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３，８０５−８１４，２００２
【非特許文献４】Ｙｕｊｉ Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０８，３３６−３４２，２００２
【非特許文献５】Ｙｕｊｉ Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４４，１４０４−１４１２，２００３
【非特許文献６】福永 信吾ら、東ソー研究報告、４０、７５−８４、１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
リポ蛋白は、強い攪拌等の衝撃により変質することが知られている。このため、従来行なわれているような吸引吐出する方法、試料中にノズルから空気を吹き出す方法、攪拌棒で攪拌する方法、試料容器を振動や回転させる方法、内径の不連続に変化する配管に試料を流すことで生じる乱流により攪拌する方法では、混合時に発生する比較的強い衝撃による変性の可能性を否定できない。その一方でＣＭは、その密度が０．９４ｇ／ｃｍ３未満と水よりもわずかに軽く、放置することにより浮上するため、正確なＣＭの定量のためには、試料を採取し、分析する前に変質を引き起こさないように攪拌することが必要である。
【００１０】
もしも、攪拌の際の衝撃が強くなり、リポ蛋白が変質を起こした場合には、表面に存在するタンパク質に変性が生じることにより疎水性が上昇し、ＣＭと同様の大きなリポ蛋白となることが想像される。そのためＣＭの定量値が偽高値を示すことが懸念される。
【００１１】
そこで本願発明は、高脂血症患者の病態を把握するために重要な情報の一つとなるＣＭを正確に定量するための、リポ蛋白の変質を引き起こさない攪拌方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行ない、その結果本発明を完成するに至った。前記課題を解決する本願請求項１の発明は、ＣＭを含有し得る測定試料に対し、試料が含有するリポ蛋白の変質が引き起こされることにより、ＣＭの定量値への影響を及ぼさないように、ニードルあるいはノズルの吸引吐出により攪拌する測定試料の攪拌方法である。本願請求項２の発明は、本願請求項１の発明に係り、ニードルあるいはノズルの吸引吐出の線速が６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下であることを特徴とする。本願請求項３の発明は、ＣＭを含有し得る測定試料を採取する前に、本願請求項１又は２の攪拌を行なうことを特徴とする測定試料の採取方法である。本願請求項４の発明は、ＣＭを含有し得る測定試料を分析する前に、本願請求項３の測定試料の採取を行なうことを特徴とする、測定試料中に含まれるＣＭの正確な分離及び定量が可能となる分析方法である。そして、本願請求項５の発明は、前記請求項４の発明に係り、試料中のＣＭを分離及び定量する分析手段が液体クロマトグラフィであることを特徴とする。
【００１３】
以下、本発明の詳細について説明する。本願発明は、ニードルあるいはノズル（以下、ノズル等ということがある）の吸引吐出、即ち、測定試料をノズル等で吸引し吐出する操作により、リポ蛋白の変質を引き起こさないように攪拌するものである。試料中へのノズル等からの空気の吐出、攪拌棒の攪拌、試料容器の振動等又は内径が不連続に変化する配管に測定試料を流すことによる攪拌では、操作時に比較的強い衝撃が生じるため、リポ蛋白の変質が引き起こされる可能性があり、不適切である。特に、試料中へのノズル等からの空気の吐出では、リポ蛋白が変質する可能性に加え、吐出された空気が測定試料中で気泡を形成し、分析のために測定試料を採取する際に吸引され、結果的に測定試料の採取量に変動を生じて正確な分析を阻害する可能性がある。
【００１４】
本願発明では、６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下という、従来の吸引吐出による攪拌において採用されている線速（１２０００から２４０００ｃｍ／ｍｉｎ）からみると、比較的遅い線速により測定試料をゆっくりと吸引吐出するために、ＣＭに対し強い衝撃を与えず、しかも、気泡形成のない攪拌が可能である。このように遅い線速による吸引吐出によって十分な攪拌が可能であるのは、ＣＭが水に比べて少しだけ密度の小さい画分であるためである。なお、ＣＭはリポ蛋白の中で最も密度が小さい画分であり、その値は０．９４ｇ／ｃｍ３未満と水よりわずかに小さいだけであるため、ノズル等による吸引吐出の線速の下限値に特に制限はないが、攪拌に引き続き、例えば後述する液体クロマトグラフィを用いてＣＭ分析を行なうような場合には、５００ｃｍ／ｍｉｎ程度以上の線速で攪拌することが、分析速度の向上等の面から好ましい。
【００１５】
ノズル等による吸引吐出は、例えば、図１に示したように行なうことが好ましい。まず、試料カップ（４）中の測定試料にニードル（３）の先端を浸漬する。どの程度までニードル先端を浸漬するかについて特別の制限はないが、後に測定試料の吸引を完了した段階で、ニードル中に空気が吸引されないようにすれば良い。次に、浸漬したニードルの先端から測定試料をシリンジ（１）で吸引する。吸引する測定試料の量は、全測定試料の７０％程度以上とすることが好ましい。係る量を吸引し、吐出すれば、吸引しなかった測定試料との間で十分な攪拌が見込めるからである。そして、ニードル（３）の先端が測定試料液面からわずかに離れた位置かそれ以下の位置（吸引しなかった測定試料中に浸漬された状態でも良い）から、シリンジ（１）で６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下の線速で吸引した測定試料を吐出する。６０００ｃｍ／ｍｉｎの攪拌は比較的ゆっくりとしたマイルドな攪拌である。しかし、ＣＭは比重が水よりわずかに軽いという特質を持つため試料の上層に浮いた状態となっており、吸引工程の終段階で吸引された後、吐出時に液面からわずかに離れた位置かそれ以下の位置で吐出することにより、容易に混合される。一方、一般的に行なわれる攪拌（血球や尿沈渣）の場合、試料を強く攪拌し巻き上げることにより均一状態となるように混合を行なわなければならない。
【００１６】
以上の吸引吐出を１回行なうことにより、液体中に気泡を発生させず、かつ、リポ蛋白の変性を引き起こさずに、ＣＭを容易かつ効率よく攪拌できるが、より信頼性を高めるために２から５回程度、繰り返し実施することが好ましい。
【００１７】
ノズル等は、いわゆる手動のピペッターや、前記例示の如くシリンジであっても良いが、複数の測定試料について均一な攪拌を実現するためには自動的に測定試料の吸引吐出を行なうものが好適である。測定試料のサンプリング用サンプラー（オートサンプラー）を備える液体クロマトグラフィ装置等では、当該サンプラーのノズル等を利用することができる。この場合には、試料を吸引して分析系に導入するためのノズル等と試料を攪拌するノズル等を共有でき、分析装置としてシンプルな設計にできる。
【００１８】
ＣＭの測定を行なうための測定試料を採取する前に攪拌を行なう場合には、上記説明したノズル等をそのまま測定試料採取用のノズル等として使用することのほかに、攪拌に使用したのとは異なるノズル等を採取専用のノズル等として使用することもできる。このようにして採取された測定試料は、ＣＭの正確な分析を行なうための測定試料として、従来公知の種々の分析に供することができるが、簡便で定量性に優れるという特徴を有する液体クロマトグラフィ、中でも他のリポ蛋白との分離能が非常に高いイオン交換クロマトグラフィが、好ましいＣＭ分析方法として例示できる。
【００１９】
本願発明は、液体クロマトグラフィにより複数の測定試料中のＣＭを連続的に分析する場合、本願発明は特に好ましい結果をもたらすものである。すなわち、液体クロマトグラフィにより一度に分析し得る測定試料は基本的に一種類であるため、複数の測定試料を連続的に分析する場合、オートサンプラーに当該複数の測定試料をセットしておくのが普通である。ここで、測定試料をセットしてから測定が開始されるまでの時間は、測定順序の後になればなるほど長くなり、その間にＣＭが浮上するからである。従って、測定試料を採取して液体クロマトグラフィによる分析に供する直前に、本願発明を適用して測定試料を攪拌することにより、正確なＣＭの定量を行なうことが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、ＣＭを含有し得る測定試料を分析する前に、リポ蛋白の変質を引き起こさないように攪拌した後、採取を行なうことで、測定試料中に含まれるＣＭの正確な分離及び定量を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
測定試料を分析する前に、吸引吐出による攪拌の実施の有無による、カイロマイクロン及び総コレステロール定量値への影響を検討した。
【００２２】
測定試料に含まれるリポ蛋白質のコレステロールの定量は図２に示す高速液体クロマトグラフを用いて行なった。溶離液Ａ（５）及びＢ（６）はそれぞれのポンプ（８及び９）へ送られる前にデガッサー（７）で溶存する気体成分を除去し、ポンプ（８及び９）出口のミキサー（１０）により攪拌され、オートサンプラー（１１）より採取された測定試料とともに、カラム（１３）へと送られる。なお、カラム（１３）の入り口にはフィルター（１２）を接続した。一方、コレステロール反応液（１５）はエアートラップ（１６）を経由してポンプ（１７）へ送られる。なお、ポンプ（１７）出口には、抵抗管（１８）（内径０．１ｍｍ×２ｍ）を２本接続した。カラム（１３）からの溶出液とコレステロール反応液とがリアクター（１９）内の反応コイル（内径０．２５ｍｍ×３０ｍ）にて反応し、リアクター（１９）出口にある検出器（２０）にて検出する。
【００２３】
溶離液Ａ（５）には５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＮＯ３＋１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．５）を、溶離液Ｂ（６）には５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＮＯ３＋１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．５）＋５００ｍｍｏｌ／Ｌ 過塩素酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を用いた。オートサンプラー（１１）は、試料カップを設置する場所（２１）、上下左右に移動が可能なニードル（２２）、試料を吸引吐出するためのシリンジポンプ（２３）、流路を切り替えるための６方モーターバルブ（２４）、試料を採取するための４μＬ容量のサンプルループ（２５）、ニードル洗浄のための洗浄液（２６）及び電磁弁（２７）を有している。カラム（１３）にはＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ（カラムサイズ：内径３．０ｍｍ×２５ｍｍ、東ソー製）を用いた。コレステロール反応液（１５）はコレステロールＥテストワコー（和光純薬製）を用いた。溶離液は０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブン（１４）は２５℃に保ち、反応コイル（１９）は３７℃に保った。検出器（２０）の検出波長は６００ｎｍとした。
【００２４】
溶離液のステップグラジエントパターンは０から３分まではＢ液の組成を２０％に固定、３から８．５分まではＢ液の組成を２３％に固定、８．５から１１分まではＢ液の組成を２７％に固定、１１から１４．５分まではＢ液の組成を３２％に固定、１４．５から１６．５分まではＢ液の組成を１００％に固定、１６．５分以降はＢ液の組成を２０％に固定し試料注入は２４分毎に行なった。以上の分析条件により、試料中のリポ蛋白はカラム中で分離され、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの順にカラムより溶出され、コレステロール反応液と混合し、反応、検出することにより、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールを定量することができる。また、すべての定量値を合計することにより、測定試料中の総コレステロール値を算出できる。
【００２５】
ＣＭ高濃度含有検体として、高脂血症患者血清のうち、冷蔵庫内に１２時間放置した際にＣＭが浮上分離する血清を用いた。また、健常者の血清も別途用意した。ＣＭ高濃度含有検体及び健常人検体をそれぞれ試料カップに５０μＬ分注し、１０℃に冷却したオートサンプラー上で１６時間放置し、測定を行なった。
【００２６】
吸引吐出による攪拌の方法はオートサンプラーに試料カップを設置し、測定試料採取の際に、試料カップ内に５０μＬの試料を入れ、４０μＬの吸引吐出の繰り返しを３回行ない通常の採取を行なった。この際、試料の吸引吐出はともに３２００ｃｍ／ｍｉｎに設定した。なお、オートサンプラーのニードルの位置は、各吸引終了時にニードルの先端が試料液面よりも２ｍｍ高い位置になるように動作させてから吐出動作を行なうようにした。なお、試料採取量はいずれの場合においても４μＬとした。
【００２７】
測定で得られたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロール測定値及び比率を表１に示した。また、同じく測定で得られたＣＭ高感度含有検体及び健常人検体のクロマトグラムをそれぞれ図３及び４に示した。
【００２８】
【表１】
ＣＭ高濃度含有検体の測定において吸引吐出による攪拌の有無の影響について比較してみると、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬでは大きな数値の変化はみられなかったが、ＣＭにおいては２３．１ｍｇ／ｄＬから３０．４ｍｇ／ｄＬと大幅に増加した。これは、攪拌により密度の低いＣＭ画分が均一に混合されたためと判断する。また、これに伴い、総コレステロール値（すべてのリポ蛋白の合計値）も１７６．１ｍｇ／ｄＬから１８６．８ｍｇ／ｄＬへと増加した。これらの結果から、事前攪拌のない場合においては、ＣＭ中のコレステロール値が低く、また、総コレステロール値も低く測定してしまい、正確性に欠けることがわかる。
【００２９】
また、検出されたコレステロールの濃度から算出されるそれぞれのリポ蛋白の比率は高脂血症患者の病態を把握するための指標となり得るが、この比率においても、攪拌がない場合においては、ＨＤＬ、ＬＤＬの高密度成分が高く見積もられ、ＣＭのような低密度成分が低く見積もられていた。
【００３０】
一方、ＣＭが高濃度で含有されない健常人検体においては攪拌の有無による影響がほとんどなく、各画分のコレステロール濃度及び総コレステロール濃度にも、組成比についてもほとんど影響はなかった。
実施例２
攪拌強度による、リポ蛋白コレステロール濃度及び総コレステロール定量値への影響を検討した。
【００３１】
ＣＭ高濃度含有検体及び健常人検体（検体は実施例１で使用したものとは異なる）をピペッティングにて１０回吸引吐出させての攪拌（吸引吐出量は実施例１と同じ）、あるいはミキサーにて１０分間の攪拌にて測定検体を混合させ、実施例１で使用した高速液体クロマトグラフィにて測定を行なった。測定で得られたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロール測定値を表２に示した。
【００３２】
【表２】
発明が解決しようとする課題の中でリポ蛋白が強い衝撃により変質すると述べたが、実際に、ＣＭが含有された試料をミキサーで勢いよく１０分間攪拌操作を行なった後、イオン交換クロマトグラフィにて分析するとリポ蛋白が変質し、疎水性が増加し、凝集した結果として、ＨＤＬの測定値に偽低値、ＣＭの測定値に偽高値が見られた。また、総コレステロール定量値は変化していなかったことから、ＣＭの偽高値はＨＤＬの低下に伴うものであることが確認された。
実施例３
ＣＭ高濃度含有検体を用いて吸引吐出での線速の違いによるＣＭ及び総コレステロール定量値への影響を検討した。
【００３３】
ＣＭ高濃度含有検体（実施例１及び２で用いた試料とは異なる）を生理食塩水で１０倍希釈した試料を用いて、線速２６００ｃｍ／ｍｉｎ、８８００ｃｍ／ｍｉｎ、４４０００ｃｍ／ｍｉｎにてそれぞれ試料を３回吸引吐出することで攪拌し（吸引吐出量は実施例１と同じ）、実施例１で使用した高速液体クロマトグラフィにて測定を行なった。測定で得られたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロール測定値を表３に示した。
【００３４】
【表３】
発明が解決しようとする課題の中でリポ蛋白が強い衝撃により変質すると述べたが、実際に、変質しやすい検体を線速４４０００ｃｍ／ｍｉｎで３回攪拌操作を行なった後、イオン交換クロマトグラフィにて分析すると、ＨＤＬ及びＬＤＬの測定値に偽低値、ＣＭの測定値に偽高値が見られた。これは、ＨＤＬおよびＬＤＬが変質して、表面の性質が変化して、ＣＭの位置に溶出するようになったことに起因する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】吸引吐出による攪拌とそのときの攪拌状態の模式図
【図２】リポ蛋白分析装置の概要
【図３】実施例１にて測定試料を分析する前に吸引吐出にて攪拌した場合（Ａ）、及び攪拌しなかった場合（Ｂ）の、ＣＭ高濃度含有検体に含まれるリポ蛋白質中のコレステロール測定のクロマトグラム。図中、ＨＤＬは高密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＬＤＬは低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＩＤＬは中間型リポ蛋白質中のコレステロール、ＶＬＤＬは超低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＣＭはカイロマイクロン中のコレステロールをそれぞれ示している。
【図４】実施例１にて測定試料を分析する前に吸引吐出にて攪拌した場合（Ａ）、及び攪拌しなかった場合（Ｂ）の、健常人検体に含まれるリポ蛋白質中のコレステロール測定のクロマトグラム。図中、ＨＤＬは高密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＬＤＬは低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＩＤＬは中間型リポ蛋白質中のコレステロール、ＶＬＤＬは超低密度リポ蛋白質中のコレステロール、ＣＭはカイロマイクロン中のコレステロールをそれぞれ示している。
【符号の説明】
【００３６】
１ 吸引吐出用シリンジ
２ 導管
３ ニードル
４ 試料カップ
５ 溶離液Ａ
６ 溶離液Ｂ
７ デガッサー
８ 溶離液Ａ用ポンプ
９ 溶離液Ｂ用ポンプ
１０ スタティックミキサー
１１ オートサンプラー
１２ フィルター
１３ カラム
１４ カラムオーブン
１５ コレステロール反応液
１６ エアートラップ
１７ コレステロール反応液用ポンプ
１８ 抵抗管
１９ リアクター
２０ 検出器
２１ 試料カップ
２２ ニードル
２３ シリンジポンプ
２４ 流路切り替えのための６方モーターバルブ
２５ サンプルループ
２６ ニードル洗浄のための洗浄液（精製水）
２７ ニードル洗浄のための電磁弁
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カイロマイクロンを含有し得る測定試料に対し、試料が含有するリポ蛋白の変質を引き起こさないように、ニードルあるいはノズルの吸引吐出により撹拌する測定試料の撹拌方法。
【請求項２】
ニードルあるいはノズルの吸引吐出の線速が６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下であることを特徴とする請求項１の撹拌方法。
【請求項３】
カイロマイクロンを含有し得る測定試料を採取する前に、請求項１から２のいずれかに記載の撹拌を行なうことを特徴とする測定試料の採取方法。
【請求項４】
カイロマイクロンを含有し得る測定試料を分析する前に、請求項３に記載の採取を行なうことで測定試料中に含まれるカイロマイクロンの正確な分離及び定量が可能となることを特徴とするカイロマイクロンの分析方法。
【請求項５】
試料中のカイロマイクロンを分離及び定量する分析手段が液体クロマトグラフィであることを特徴とする請求項４の分析方法。
【請求項１】
カイロマイクロンを含有し得る測定試料に対し、試料が含有するリポ蛋白の変質を引き起こさないように、ニードルあるいはノズルの吸引吐出により撹拌する測定試料の撹拌方法。
【請求項２】
ニードルあるいはノズルの吸引吐出の線速が６０００ｃｍ／ｍｉｎ以下であることを特徴とする請求項１の撹拌方法。
【請求項３】
カイロマイクロンを含有し得る測定試料を採取する前に、請求項１から２のいずれかに記載の撹拌を行なうことを特徴とする測定試料の採取方法。
【請求項４】
カイロマイクロンを含有し得る測定試料を分析する前に、請求項３に記載の採取を行なうことで測定試料中に含まれるカイロマイクロンの正確な分離及び定量が可能となることを特徴とするカイロマイクロンの分析方法。
【請求項５】
試料中のカイロマイクロンを分離及び定量する分析手段が液体クロマトグラフィであることを特徴とする請求項４の分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２５６５４０（Ｐ２００８−２５６５４０Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９９２６４（Ｐ２００７−９９２６４）
【出願日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
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