【課題】組織の再生または修復を必要とする身体部位に適用できる組織再生組成物の提供。
【解決手段】三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含む、組織を再生または修復するための組成物であって、ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、第１および第２の層が互いに別個のものであり、組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、ウェビングの第１および第２の層が組織の第１の層および第２の層に一致する組成物。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングを含むカスタマイズされた組成物に関する。さらに本発明は、３Ｄナノファイバーウェビングを含む組成物の製造プロセスおよび加齢黄斑変性の治療または組織の再生／修復等のその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は身体の最大の器官であるが、有害な微生物や化学物質の体内への侵入を防ぐのに役立つ物理的なバリアを形成するので、生物が生きていくためになくてはならないものである。皮膚は、有害な成分の体内への侵入を阻止するだけでなく、体から特定の老廃物を分泌する役割を有する。さらに、皮膚は身体への衝撃となる可能性のあるものを和らげるので、内部器官にとっての保護構造体である。また皮膚は体液の喪失を抑制し、かつ太陽からの紫外線によって内部器官がダメージを受けるのを防ぐ。
【０００３】
皮膚は厚さ１．４〜４．０ｍｍである。通常、皮膚は最も見え易い場所（例えば大腿、前腕、顔等）では比較的薄く、最も厚い部分は、掌や足裏等の擦れや摩擦を受け易い体の部分である。
【０００４】
厚さに関係なく、皮膚は２つの別個の層、表皮および真皮からなる。表皮は皮膚の外層であり、頑丈で水を通ない保護層である。真皮、すなわち内層は表皮よりも厚く、皮膚に強度と弾力を与えている。皮膚のこれらの２つの層は、皮膚を結びつける役割を果たし、精巧に相互接続している一連の分子からなる基底膜として知られる組織の薄いけれども複雑な層によって互いに固定し合っている。真皮の下は皮下層である下皮であるが、下皮はタンパク繊維からなる組織と脂肪組織との層である。厳密には皮膚の一部ではないが、皮下層は分泌腺および他の皮膚構造ならびに触覚に含まれる感覚受容器を含む。
【０００５】
非常に弾力性はあるが、皮膚は様々な形でダメージを受ける可能性があり、それが恒久的な場合もある。皮膚は損傷を受けるとすぐに修復を始める。
【０００６】
創傷治癒または創傷修復は、皮膚（またはその他の器官−組織）が損傷後に自己修復する複雑なプロセスである。正常な皮膚においては、表皮（最外層）と真皮（内層または深層）とは定常状態平衡にあり、外部環境に対する防護壁を形成している。防護壁が破壊されると、創傷治癒の正常（生理的）過程がただちに始動する。創傷治癒の古典的モデルは、重複もあるが逐次的な３つまたは４つの段階（期）に分類される：（１）うっ血（著者によっては段階（期）と見なしていない）、（２）炎症、（３）増殖、および（４）再構築。皮膚が損傷を受けると、一連の複雑な生化学的事象が、損傷を修復するために綿密に組織化された流れに基づいて起こる。損傷後数分以内に血小板（栓球）が損傷部位に凝集してフィブリン塊を形成する。この塊は活動性出血（うっ血）を制御するために働く。
【０００７】
炎症期では、細菌および壊死組織片が貪食されて取り除かれ、増殖期に含まれる細胞の移動および分裂を引き起こす因子が放出される。
【０００８】
増殖期は、血管新生、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮形成および創傷収縮を特徴とする。血管新生では、血管内皮細胞により新しい血管が形成される。線維組織形成および肉芽組織形成では、線維芽細胞が増殖し、コラーゲンやフィブロネクチンを分泌することにより新しい暫定的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を形成する。同時に、上皮細胞が増殖して創傷床の上をゆっくりと広がり、新しい組織を覆う表皮の再上皮化が起こる。
【０００９】
収縮では筋線維芽細胞の作用により創傷が小さくなるが、筋線維芽細胞は創傷端をしっかりとつかみ、平滑筋細胞の場合と同様のメカニズムにより自ら収縮する。細胞の役割が終了に近付くと、不要な細胞はアポトーシスを遂げる。
【００１０】
成熟期および再構築期では、コラーゲンが再構築されて割線に沿って再整列し、必要なくなった細胞はアポトーシスにより取り除かれる。
【００１１】
皮膚への損傷は頻度が高いため、創傷治癒または創傷修復過程は多くの場合皮膚で起こる。侵襲的な皮膚手術（例えば癌性皮膚組織の切除）、または物体との偶発的な衝突もしくは火傷による重度の損傷は、皮膚の全ての層に影響し（全層創傷）、創傷修復が長引いて、はっきりと見える瘢痕が残る可能性がある。皮膚の奇形や恒久的異常は、深い創傷の治癒や修復の結果として表れる可能性がある。創傷治癒の過程は脆弱であり中断や失敗が起こり易く、慢性的な非治癒性創傷の形成につながる。この一因となり得る要素としては、糖尿病、静脈または動脈疾患、老齢および感染が挙げられる。
【００１２】
慢性創傷とは、ほとんどの創傷が治癒するはずの順序だった一連の段階や予測可能な時間では治癒しない創傷であり、３カ月以内に治癒しない創傷は多くの場合慢性と見なされる。慢性創傷は、創傷治癒における１つまたは複数の段階（期）において留められるようである。例えば、慢性創傷は過度に長い時間炎症段階に留まることがしばしばある。急性創傷においてはコラーゲンのような分子の産生と分解に適切なバランスがあるが、慢性創傷ではこのバランスが失われ、分解の果たす役割が大き過ぎる。
【００１３】
慢性創傷は、永遠に治癒しない場合もあれば治癒に何年もかかる場合もある。これらの創傷は患者に重度の精神的かつ肉体的ストレスを引き起こすだけでなく、患者および医療制度全体に著しい経済的負担を負わせる。慢性創傷が関わる皮膚の完全性および外観は満足の行くものではなく、皮膚の強度は約５０％以下になる。慢性創傷の効果的な治療は存在しない。
【００１４】
皮膚の外観に関して言えば、皮膚の身体的異常に伴う深い精神的ストレスが存在する。これらの異常は、先天的な場合や、環境によって引き起こされる（例えば重度の火傷により）場合があり、例えば顔に深いくぼみや割れ目として存在して視認できる場合がある。組織を修復および再形成する手法は、皮膚移植と効果が乏しい代用皮膚とに限られている。しかしながら、これらの治療のほとんどは、次のような様々な欠点に関連しており、最適までには至っていない：
・利用可能な提供者の組織が限られること；
・移植した真皮が再生せず、収縮した傷跡となる；
・移植片収縮を補うためにより大きな提供者の部位を必要になる；
・採取した提供者の部位が有痛性、掻痒性かつ赤色である；
・治癒過程における提供者の皮膚または代用皮膚の度重なる取り換えの必要性；
・創傷部位のうろこ状、でこぼこ、干からびの出現；
・組織拒絶反応の可能性；
・移植箇所の堅さ；
・機能上また美容上の点で不本意な結果となること。
【００１５】
本発明は、全てではないが現在の皮膚移植や現在利用可能となっている代用皮膚治療の欠点の多くを克服する、３Ｄナノファイバーウェビングを含むカスタマイズされた組織再生組成物の発見に基づいている。この組成物は、特有の皮膚の変形や異常を呈している個々の対象者をよりよく治療するために、組織組成物をカスタマイズする独特のプロセスから作製される。
【００１６】
本発明は、体の表面における美容および医療用途に有用であるだけでなく、体内で組織を再生するのにも有用である。体内の内部器官や構造体が組織再生を必要とする状況は数多く存在する。アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、寿命に達した細胞等の不要な細胞（例えば赤血球）を死滅させるために、身体が依存しているプロセスである。しかしながら、無用に誘発された場合、アポトーシスは有害な影響を有し得る。一酸化窒素はアポトーシスに過剰に刺激を与え得る化合物である。一度に過度に刺激されたか、または長期間にわたって刺激されたアポトーシスは、身体に害を及ぼす力があり、また様々な症状に関連している。アポトーシスは加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の主因であることが明らかとなっている。ＡＭＤとは、通常は高齢者を襲い、眼の後方、例えば網膜やブルッフ膜（ＢＭ）における解剖学的な部位の損傷が原因で視野の中心の視力喪失につながる病状である。「萎縮型」および「滲出型」で起きる。高齢者（＞５０歳）における失明および視力障害の主な原因である。黄斑変性によって、表情を読んだり顔を識別したりすることが困難になるかまたは不可能になる場合がある。
【００１７】
黄斑は網膜の中心領域であり、ここで最も細密な中心視が得られる。網膜は眼の後方にある３つの主要な層の１つである。３つの主要な層とは、眼の内側から後方に向かって、網膜、血液供給を含む脈絡膜および白眼の部分である強膜である。「萎縮型」の進行ＡＭＤは、網膜の下の網膜色素上皮層の委縮に起因し、眼の中心部の光受容器（杆体および錐体）の喪失を通じて視力喪失を引き起こす。この症状に対して有効な内科療法や外科療法は全くない。
【００１８】
委縮とは、組織の再吸収および分解の一般的な生理的過程であり、細胞レベルのアポトーシスも含まれる。疾患の結果または他の疾患が原因の栄養支援の喪失の結果として生じる場合、病理性委縮と呼ばれるが、同様に正常な身体発育やホメオスタシスの一部の場合もある。したがって、委縮は体内のいずれかの組織の喪失に関連している可能性がある。
【００１９】
「滲出型」ＡＭＤでは、ブルッフ膜と呼ばれる網膜の基質層（土台）の下で新血管新生が起こる。ブルッフ膜とは脈絡膜の最内層である。滲出型ＡＭＤに対しては現在利用可能な治療法があるが、それは抗ＶＥＧＦの投与である。
【００２０】
本発明は、例えばある特定の細胞の送達や増殖によって組織を再生したり、種々の剤の送達によって組織を修復したりするのに使用できるように、新規なナノファイバーエレクトロスピニングプロセスによってカスタマイズされる能力を有する３Ｄナノファイバーウェビングを含む組成物の発見に基づいている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ferris, F.L., 3rd, S.L. Fine, and L. Hyman, Age-related macular degeneration and blindness due to neovascular maculopathy. Arch Ophthalmol, 1984. 102(11): p. 1640-2.
【非特許文献２】Bressler, N.M., S.B. Bressler, and S.L. Fine, Age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol, 1988. 32(6): p. 375-413.
【非特許文献３】Okubo, A., et al., The relationships of age changes in retinal pigment epithelium and Bruch’s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999. 40(2): p. 443-9.
【非特許文献４】Hogan, M.J., Ultrastructure of the choroid. Its role in the pathogenesis of chorioretinal disease. , in Transactions of the Pacific Coast Oto-Ophthalmological Society Annual Meetining 421961. p. 61-87.
【非特許文献５】Strauss, O., The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev, 2005. 85(3): p. 845-81.
【非特許文献６】Liao, J.L., et al., Molecular signature of primary retinal pigment epithelium and stem cellderived RPE cells. Hum Mol Genet, 2010. 19(21): p. 4229-38.
【非特許文献７】Gouras, P., M.T. Flood, and H. Kjeldbye, Transplantation of cultured human retinal cells to monkey retina. An Acad Bras Cienc, 1984. 56(4): p. 431-43.
【非特許文献８】Li, L.X. and J.E. Turner, Inherited retinal dystrophy in the RCS rat: prevention of photoreceptor degeneration by pigment epithelial cell transplantation. Exp Eye Res, 1988. 47(6): p. 911-7.
【非特許文献９】Lopez, R., et al., Transplanted retinal pigment epithelium modifies the retinal degeneration in the RCS rat. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1989. 30(3): p. 586-8.
【非特許文献１０】Lund, R.D., et al., Cell transplantation as a treatment for retinal disease. Prog Retin Eye Res, 2001. 20(4): p. 415-49.
【非特許文献１１】Whiteley, S.J., et al., Improvement of the pupillary light reflex of Royal College of Surgeons rats following RPE cell grafts. Exp Neurol, 1996. 140(1): p. 100-4.
【非特許文献１２】Peyman, G.A., et al., A technique for retinal pigment epithelium transplantation for agerelated macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surg, 1991. 22(2): p. 102-8.
【非特許文献１３】Binder, S., et al., Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res, 2007. 26(5): p. 516-54.
【非特許文献１４】Binder, S., et al., Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004. 45(11): p. 4151-60.
【非特許文献１５】Phillips, S.J., et al., Autologous transplantation of retinal pigment epithelium after mechanical debridement of Bruch’s membrane. Curr Eye Res, 2003. 26(2): p. 81-8.
【非特許文献１６】Verma, L., et al., New approaches in the management of choroidal neovascular membrane in age-related macular degeneration. Indian J Ophthalmol, 2000. 48(4): p. 263-78.
【非特許文献１７】Radtke, N.D., et al., Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. Am J Ophthalmol, 2008. 146(2): p. 172-182.
【非特許文献１８】Radtke, N.D., et al., Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. Am J Ophthalmol, 2002. 133(4): p. 544-50.
【非特許文献１９】Klimanskaya, I., et al., Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells, 2004. 6(3): p. 217-45.
【非特許文献２０】Lund, R.D., et al., Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells, 2006. 8(3): p. 189-99.
【非特許文献２１】Carr, A.J., et al., Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis, 2009. 15: p. 283-95.
【非特許文献２２】Vugler, A., et al., Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol, 2008. 214(2): p. 347-61.
【非特許文献２３】Vugler, A., et al., Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev, 2007. 124(1112): p. 807-29.
【非特許文献２４】Gong, J., et al., Effects of extracellular matrix and neighboring cells on induction of human embryonic stem cells into retinal or retinal pigment epithelial progenitors. Exp Eye Res, 2008. 86(6): p. 957-65.
【非特許文献２５】Lu, B., et al., Long-term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells, 2009. 27(9): p. 2126-35.
【非特許文献２６】Lu, B., et al., Mesh-supported submicron parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices, 2012.
【非特許文献２７】Hynes, S.R. and E.B. Lavik, A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2010. 248(6): p. 763-78.
【非特許文献２８】da Cruz, L., et al., RPE transplantation and its role in retinal disease. Prog Retin Eye Res, 2007. 26(6): p. 598-635.
【非特許文献２９】Lim, J.M., et al., Retinal pigment epithelial cell behavior is modulated by alterations in focal cell-substrate contacts. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2004. 45(11): p. 4210-6.
【非特許文献３０】Srivastava, G.K., et al., Elastin-like recombinamers as substrates for retinal pigment epithelial cell growth. J Biomed Mater Res A, 2011. 97(3): p. 243-50.
【非特許文献３１】Bhatt, N.S., et al., Experimental transplantation of human retinal pigment epithelial cells on collagen substrates. Am J Ophthalmol, 1994. 117(2): p. 214-21.
【非特許文献３２】Thumann, G., et al., Characteristics of iris and retinal pigment epithelial cells cultured on collagen type I membranes. Curr Eye Res, 2006. 31(3): p. 241-9.
【非特許文献３３】Lu, J.T., et al., Thin collagen film scaffolds for retinal epithelial cell culture. Biomaterials, 2007. 28(8): p. 1486-94.
【非特許文献３４】Imai, H., et al., The upregulation of angiogenic gene expression in cultured retinal pigment epithelial cells grown on type I collagen. Curr Eye Res, 2007. 32(10): p. 903-10.
【非特許文献３５】Thomson, R.C., et al., Manufacture and characterization of poly(alpha-hydroxy ester) thin films as temporary substrates for retinal pigment epithelium cells. Biomaterials, 1996. 17(3): p. 321-7.
【非特許文献３６】Giordano, G.G., et al., Retinal pigment epithelium cells cultured on synthetic biodegradable polymers. J Biomed Mater Res, 1997. 34(1): p. 87-93.
【非特許文献３７】Lu, L., M.J. Yaszemski, and A.G. Mikos, Retinal pigment epithelium engineering using synthetic biodegradable polymers. Biomaterials, 2001. 22(24): p. 3345-55.
【非特許文献３８】Shadforth, A.M.A., et al., The cultivation of human retinal pigment epithelial cells on Bombyx mori silk fibroin. Biomaterials, 2012. 33(16): p. 4110-4117.
【非特許文献３９】Curtis, A. and C. Wilkinson, Topographical control of cells. Biomaterials, 1997. 18(24): p. 1573-83.
【非特許文献４０】Berthiaume, F., et al., Effect of extracellular matrix topology on cell structure, function, and physiological responsiveness: hepatocytes cultured in a sandwich configuration. FASEB J, 1996. 10(13): p. 1471-84.
【非特許文献４１】Bettinger, C.J., R. Langer, and J.T. Borenstein, Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl, 2009. 48(30): p. 5406-15.
【非特許文献４２】Nisbet, D.R., et al., Review paper: a review of the cellular response on electrospun nanofibers for tissue engineering. J Biomater Appl, 2009. 24(1): p. 7-29.
【非特許文献４３】Chew, S.Y., et al., The role of electrospinning in the emerging field of nanomedicine. Curr Pharm Des, 2006. 12(36): p. 4751-70.
【非特許文献４４】Kumbar, S.G., et al., Electrospun nanofiber scaffolds: engineering soft tissues. Biomed Mater, 2008. 3(3): p. 034002.
【非特許文献４５】Sill, T.J. and H.A. von Recum, Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials, 2008. 29(13): p. 1989-2006.
【非特許文献４６】Kuijpers, A.J., et al., Cross-linking and characterisation of gelatin matrices for biomedical applications. J Biomater Sci Polym Ed, 2000. 11(3): p. 225-43.
【非特許文献４７】Wang, H., et al., Retinal pigment epithelium wound healing in human Bruch’s membrane explants. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003. 44(5): p. 2199-210.
【非特許文献４８】Leibowitz, H.M., et al., The Framingham Eye Study monograph: An ophthalmological and epidemiological study of cataract, glaucoma, diabetic retinopathy, macular degeneration, and visual acuity in a general population of 2631 adults, 1973-1975. Surv Ophthalmol, 1980. 24(Suppl): p. 335-610.
【非特許文献４９】Seiler, M.J. and R.B. Aramant, Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Prog Retin Eye Res, 2012.
【非特許文献５０】Gullapalli, V.K., et al., Retinal pigment epithelium resurfacing of aged submacular human Bruch’s membrane. Trans Am Ophthalmol Soc, 2004. 102: p. 123-37; discussion 137-8.
【非特許文献５１】Sun, K., et al., Bruch’s membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol Vis, 2007. 13: p. 2310-9.
【非特許文献５２】Paik, D.C., et al., The nitrite/collagen reaction: non-enzymatic nitration as a model system for age-related damage. Connect Tissue Res, 2001. 42(2): p. 111-22.
【非特許文献５３】Deberg, M., et al., New serum biochemical markers (Coll 2-1 and Coll 2-1 NO2) for studying oxidative-related type II collagen network degradation in patients with osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Osteoarthritis Cartilage, 2005. 13(3): p. 258-65.
【非特許文献５４】Booij, J.C., et al., The dynamic nature of Bruch’s membrane. Prog Retin Eye Res, 2010. 29(1): p. 1-18.
【非特許文献５５】Ramrattan, R.S., et al., Morphometric analysis of Bruch’s membrane, the choriocapillaris, and the choroid in aging. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994. 35(6): p. 2857-64.
【非特許文献５６】Beatty, S., et al., The role of oxidative stress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol, 2000. 45(2): p. 115-34.
【非特許文献５７】Lavik, E.B., et al., Fabrication of degradable polymer scaffolds to direct the integration and differentiation of retinal progenitors. Biomaterials, 2005. 26(16): p. 3187 3196.
【非特許文献５８】Tomita, M., et al., Biodegradable polymer composite grafts promote the survival and differentiation of retinal progenitor cells. Stem Cells, 2005. 23(10): p. 1579-88.
【非特許文献５９】Schindler, M., et al., A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials, 2005. 26(28): p. 5624-31.
【非特許文献６０】Dong, Y., et al., Degradation behaviors of electrospun resorbable polyester nanofibers. Tissue Eng Part B Rev, 2009. 15(3): p. 333-51.
【非特許文献６１】Han, D. and P.I. Gouma, Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine, 2006. 2(1): p. 37-41.
【非特許文献６２】Mano, J.F., et al., Natural origin biodegradable systems in tissue engineering and regenerative medicine: present status and some moving trends. J R Soc Interface, 2007. 4(17): p. 999-1030.
【非特許文献６３】Engel, E., et al., Nanotechnology in regenerative medicine: the materials side. Trends Biotechnol, 2008. 26(1): p. 39-47.
【非特許文献６４】Nur, E.K.A., et al., Three-dimensional nanofibrillar surfaces promote self-renewal in mouse embryonic stem cells. Stem Cells, 2006. 24(2): p. 426-33.
【非特許文献６５】Guaccio, A., et al., Influence of electrospun fiber mesh size on hMSC oxygen metabolism in 3D collagen matrices: experimental and theoretical evidences. Biotechnol Bioeng, 2011. 108(8): p. 1965-76.
【非特許文献６６】Prabhakaran, M.P., J. Venugopal, and S. Ramakrishna, Electrospun nanostructured scaffolds for bone tissue engineering. Acta Biomater, 2009. 5(8): p. 2884-93.
【非特許文献６７】Yang, F., et al., Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials, 2005. 26(15): p. 2603-10.
【非特許文献６８】Thieltges, F., et al., A nanofibrillar surface promotes superior growth characteristics in cultured human retinal pigment epithelium. Ophthalmic Res, 2011. 46(3): p. 133-40.
【非特許文献６９】Marmor, M.F., Mechanisms of fluid accumulation in retinal edema. Doc Ophthalmol, 1999. 97(3-4): p. 239-49.
【非特許文献７０】Bonilha, V.L., et al., The retinal pigment epithelium apical microvilli and retinal function. Adv Exp Med Biol, 2006. 572: p. 519-24.
【非特許文献７１】Harman, A.M., et al., Development and aging of cell topography in the human retinal pigment epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1997. 38(10): p. 2016-26.
【非特許文献７２】Panda-Jonas, S., J.B. Jonas, and M. Jakobczyk-Zmija, Retinal pigment epithelial cell count, distribution, and correlations in normal human eyes. Am J Ophthalmol, 1996. 121(2): p. 181-9.
【非特許文献７３】Rizzolo, L.J., et al., Integration of tight junctions and claudins with the barrier functions of the retinal pigment epithelium. Prog Retin Eye Res, 2011. 30(5): p. 296-323.
【非特許文献７４】Wenzel, A., et al., RPE65 is essential for the function of cone photoreceptors in NRL deficient mice. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2007. 48(2): p. 534-42.
【非特許文献７５】Redmond, T.M., et al., Rpe65 is necessary for production of 11-cis-vitamin A in the retinal visual cycle. Nat Genet, 1998. 20(4): p. 344-51.
【非特許文献７６】Barnes, C.P., et al., Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Adv Drug Deliv Rev, 2007. 59(14): p. 1413-33.
【発明の概要】
【００２２】
本発明の第１の態様によれば、三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含む、組織を再生または修復するための組成物であって、ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、第１および第２の層が互いに別個のものであり、組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、ウェビングの第１および第２の層が組織の第１の層および第２の層に一致する組成物が提供される。
【００２３】
一実施形態においては、組成物の第１の層および第２の層は細胞外マトリックスや細胞の層を模倣することにより組織の第１の層および第２の層に一致し得る。さらなる実施形態においては、組織中の細胞の層と一致する組成物の層に１つまたは複数の細胞が播種されている。播種されている細胞は組織層中の細胞と同じ細胞型であってもよい。あるいは、播種されている細胞は組織層中の細胞の細胞型と異なってもよいが、培養を通じて同じ細胞型に分化することが可能である。播種されている細胞は幹細胞であってもよい。幹細胞はヒト幹細胞であってもよい。培養は、修復または再生を必要とする組織を組成物と接触させる前に生じてもよい。
【００２４】
別の実施形態においては、組成物は３層、４層またはそれ以上の層を含む。組成物は改変可能であり、かつ組織の形状に合わせられている。
【００２５】
さらなる実施形態においては、層は織り交ぜられている。
【００２６】
さらなる実施形態において、層はシートの形態である。シートを織り交ぜられ、シート同士が相互につなげられてもよい。シートが丸められて開管を形成してもよい。さらなる実施形態においては、組成物は３層以上の層を含有し、３つの層はそれぞれ以下の細胞型のうちの１つを含む：光受容細胞（杆体、錐体）、各種神経細胞または神経由来の細胞、網膜色素上皮細胞。第４の層は網膜色素上皮細胞と同類の細胞を含有してもよい。視神経と連絡するための神経系細胞または他の層の細胞を支持して他の層の細胞と連絡するための細胞を有するさらなる層が加えられてもよい。
【００２７】
さらに別の実施形態において、各層は、ポリマーまたはポリマーの混合物を含む液体を撒布することにより、電場を介して別の層またはコレクターの表面上に塗布することができる。コレクターはギプスまたは模型の形態であってもよい。
【００２８】
別の実施形態において、ウェビングの第１、第２、第３、第４またはそれ以上の層のそれぞれは、１種のポリマーまたは２種以上のポリマーの混合物からなってもよい。１つまたは複数の層は、１種のポリマーもしくはこのポリマーとは異なる２種以上のポリマーの混合物、または別の１つもしくは複数の層を形成する２種以上のポリマーの混合物によって形成されてもよい。２層以上の層は同じポリマーまたは２種以上のポリマーの混合物を有してもよいが、異なる配向に配置される。ポリマーは天然でも合成でもよく、生分解性でもよい。
【００２９】
さらなる実施形態においては、剤は生理化学剤または治療剤であってもよい。剤は、遅延放出用にカプセル化またはコーティングされてもよい。剤は、修復または再生を必要とする組織内に挿入されると同時に組成物から放出されてもよい。剤は抗ＶＥＧＦであってもよい。
【００３０】
組成物は、合成でも天然由来でもよく、ゲル、気体、クリーム、軟膏または固体の形態であってもよい材料をさらに含んでもよい。
【００３１】
一実施形態においては、再生または修復を必要とする組織は、顔、胸部、耳、首、腋窩
、鼠径部、手、肘、腕、脚部、足、膝、生殖器、眼瞼、鼻、口唇、皮膚、角膜、網膜（ブルッフ膜（ＢＭ）を含む）、視神経およびここでは具体的には挙げないが眼の他のいずれかの解剖学的な後壁を含む眼、肝臓、胆管および胆嚢、腎臓、腸、心臓、膵臓、脾臓、ＧＡＬＴ、ＭＡＬＴ、咽喉、食道、喉頭、肺、静脈、動脈、胃、小腸、十二指腸、回腸、空腸、結腸、大腸、脳、脊髄および脊髄神経、筋肉（平滑筋、骨格筋および混合筋）、血管、子宮、膀胱および尿道および尿管、卵巣、膣、直腸、甲状腺、舌、口腔粘膜、胃腸粘膜および鼻咽頭粘膜、歯周組織および歯組織、平滑筋および骨格筋、毛髪、乳頭、アポクリン腺、エクリン腺および内分泌腺、毛包、骨軟骨、腱、ならびに骨膜および軟骨膜を含む群より選択される身体部位または臓器に属してもよい。
【００３２】
組成物は規模が大きく人工皮膚の形態であってもよい。組成物は規模が小さく網膜、ＢＭまたは眼の後壁のいずれかの解剖学的な部位用に超薄であってもよい。
【００３３】
本発明の第２の態様によれば、対象者の組織を再生または修復する方法であって、組織を含有する対象者の身体の部位への組成物の投与を含み、組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、第１および第２の層が互いに別個のものであり、組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、ウェビングの第１および第２の層が組織の第１の層および第２の層に一致する方法が提供される。
【００３４】
一実施形態においては、剤は１つまたは複数の細胞である。組成物の第１の層および第２の層は、細胞の層を模倣することにより組織の第１の層および第２の層に一致し得る。１つまたは複数の細胞は組織層中の細胞と同じ細胞型であってもよい。あるいは、１つまたは複数の細胞は組織層中の細胞の細胞型と異なってもよいが、培養を通じて同じ細胞型に分化することが可能である。１つまたは複数の細胞は幹細胞であってもよい。幹細胞はヒト幹細胞であってもよい。
【００３５】
本発明の第３の態様によれば、対象者の黄斑変性を治療する方法であって、対象者の網膜の黄斑組織への組成物の投与を含み、組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、第１および第２の層が互いに別個のものであり、組成物の厚さまたは構造が健康状態の組織の厚さまたは構造に一致し、ウェビングの第１および第２の層が組織の第１の層および第２の層に一致する方法が提供される。
【００３６】
一実施形態においては、剤は１つまたは複数の幹細胞である。１つまたは複数の幹細胞は、該細胞をインビトロで培養することにより組成物にコロニーを作ることができる。この方法で用いてもよい組成物は、少なくとも１種のポリマーを含む超薄膜である。ポリマーは、いずれかの型のコラーゲンもしくは種々の型のコラーゲンの組合せ（例えばＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲン）またはＰＬＧＡ、ＰＣＬ、エラスチンおよび他のポリマー等の他のいずれかのポリマーであってもよい。幹細胞を含む膜は眼の後壁につぎ当てられるかまたは外科的に統合される。膜は時間とともに分解し、損傷黄斑内に細胞および剤を放出する。幹細胞は、網膜の光受容細胞または他の細胞に分化し、その結果元の組織では黄斑が再生する。
【００３７】
第４の態様によれば、本発明により、対象者の組織を修復または再生するための組成物の使用であって、該組織を含有する対象者の身体の部位への組成物の投与を含み、組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、第１および第２の層が互いに別個のものであり、組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、ウェビングの第１および第２の層が組織の第１の層および第２の層に一致する使用が提供される。
【００３８】
さらなる実施形態においては、第３の態様の方法および第４の態様の使用は、随意により第５の態様のプロセスの工程およびそれらの実施形態を含む。
【００３９】
第５の態様によれば、本発明により、組織を再生または修復するための組成物の製造プロセスであって、組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、第１および第２の層が互いに別個のものであり、組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、ウェビングの第１および第２の層が組織の第１の層および第２の層に一致し、以下の工程：
（ａ）再生または修復を必要とする組織の厚さおよび／または構造を測定する工程；
（ｂ）組織の第１および第２の層の厚さおよび／または構造を測定する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の測定工程に基づき組成物の望ましい厚さおよび／または構造を決定する工程；
（ｄ）ナノファイバーウェビング機の電場にコレクターを設置する工程；
（ｅ）１種または複数のポリマーを、電場を介して撒布して、組成物の第１の層を作製するのに十分な時間と条件下でコレクターに接触させる工程；
（ｆ）（ｅ）の１種または複数のポリマーの撒布の後に１種または複数の剤を第１の層に添加する工程；
（ｇ）１種または複数のポリマーを、電場を介して撒布して、組成物の第２の層を作製するのに十分な時間と条件下でコレクターに接触させる工程；
（ｈ）所望により１種または複数のポリマーの撒布を繰り返してさらなる層を作製する工程；
（ｉ）コレクターから層を取り外す工程；および
（ｊ）組成物の層を組織の形状に合わせる工程
を含むプロセスが提供される。
【００４０】
一実施形態においては、すでに第１の層に添加した１種または複数の剤に加えて、またはその代わりに１種または複数の剤を第２の層に添加する。１種または複数の剤は組織特異的であるかまたは幹細胞もしくは前駆細胞であってもよい。
【００４１】
さらなる実施形態においては、該プロセスにより作製される組成物は少なくとも３つの層を含む。ある層に光受容細胞を播種する。別の層に網膜色素上皮細胞を播種する。第３の層に１つまたは複数の神経細胞または神経由来の細胞を播種する。あるいは、組成物に光受容細胞、網膜色素上皮細胞および１つまたは複数の神経細胞に分化する１つまたは複数の幹細胞を播種する。第４の層は網膜色素上皮細胞と同類の細胞を含有してもよい。視神経と連絡するための神経系細胞または他の層の細胞を支持して他の層の細胞と連絡するための細胞を有するさらなる層を加えてもよい。
【００４２】
別の実施形態においては、撒布は１種または複数のポリマーを噴霧またはスピニングすることにより行われる。
【００４３】
さらに別の実施形態においては、コレクターは、組織の再生または修復を必要とする身体部位のインプレッション型から調製するギプスである。型からギプスを調製する代わりに以下の工程を採用してもよい：
（ａ）３Ｄ画像化技術により組織の再生または修復を必要とする身体部位の輪郭を測定する工程；
（ｂ）測定値をデザインアプリケーションに入力して身体の物理模型を調製する工程；および
（ｃ）模型をコレクターとして使用する工程。
【００４４】
上記実施形態においては、３Ｄ画像化技術は、スキャンＸ線、ＣＴスキャン、コーンビームＸ線、ＭＲＩおよび３Ｄ写真を含む群より選択してもよい。さらなる実施形態においては、デザインアプリケーションは、コンピューター支援設計（ＣＡＤ）およびラピッドプロトタイピングを含む群より選択される。さらなる実施形態においては、ラピッドプロトタイピングは、３Ｄ印刷、３Ｄ選択的レーザー加工、３Ｄ選択的焼結、３Ｄ流延、３Ｄバーリング、３Ｄ研削またはこれらのいずれかの組合せを含み得る。
【００４５】
電場はスピン電極に電圧を印加した際に発生する。型または模型はいずれも、電極の間に設置してもよいし、接地してもよく、その結果集電極として使用することができる。
【００４６】
該プロセスは、３Ｄナノファイバーウェビングの硬化の工程をさらに含んでもよい。硬化の工程は化学的または物理的硬化を含み得る。硬化は、ポリマーの光硬化等、重合により行うことができる。
【００４７】
第６の態様によれば、第５の態様のプロセスにより得ることができる組成物が提供される。
【００４８】
第７の態様によれば、第５の態様のプロセスにより得られる組成物が提供される。
【００４９】
第８の態様によれば、本発明により、黄斑変性の治療または皮膚の奇形や異常の矯正に使用する場合の、第６または第７の態様の組成物が提供される。
【００５０】
上記の態様の一般的な実施形態を以下に示す。
【００５１】
１種または複数の剤は、１種または複数の、抗生物質、抗菌ペプチド、抗菌デフェンシン、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、細胞に影響を与え相互に作用する物質、小分子、表面接着分子およびタンパク質等の細胞挙動に影響を与えるシグナル因子、ヒト細胞、天然組織ファイバーまたはこれらのいずれかの組合せを含む群より選択される。
【００５２】
組成物は、ゲル、気体、クリーム、軟膏または固体の形態であってもよいさらなる材料を含む。さらなる材料は無機材料であってもよい。無機材料は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、金属または合金、ヒドロキシアパタイトおよび銀粒子を含む群より選択されてもよい。
【００５３】
別の実施形態においては、組成物は、組成物に構造安定性を付与するために少なくとも１種の硬化性ポリマー、少なくとも１種の硬化性樹脂、少なくとも１種の自硬性粘土またはそれらの組合せを含有することができる。
【００５４】
さらに別の実施形態においては、１種または複数のポリマーを、直接撒布エレクトロスピニング、共蒸着およびエマルションエレクトロスピニングを含む群より選択されるエレクトロスピニング技術により組成物の層に組み込むことができる。
【００５５】
さらなる実施形態においては、組成物の厚さは、治療を必要とする身体部位の変形や異常によって異なる。通常、組成物の厚さは約５μｍ〜約４ｍｍである。別の実施形態においては、厚さは少なくとも１００ｎｍで上限はなくてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
以下、ほんの一例であるが、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態について説明する。
【００５７】
【図１】顔型の作製工程を表した図である。この工程では型を作るために混凝紙を使用する。（図面代用写真）
【図２】ナノファイバー加工を表した図である。テイラーコーンの形成が左パネルに見てとれる。中央パネルでは、電場を通るナノファイバーの集中が増していることが示されている。右パネルでは、ナノファイバーウェビングで完全に覆われたギプスによってナノファイバー加工がほぼ完了していることが示されている。（図面代用写真）
【図３Ａ】顔ギプスから取り外した、ナノファイバー加工の結果得られた組成物を表した図である。（図面代用写真）
【図３Ｂ】縮尺を大きくした人工皮膚を表した図である。（図面代用写真）
【図３Ｃ】眼、例えば、網膜、ＢＭまたは眼の後壁のいずれかの解剖学的な部位にて使用するための超薄膜である。（図面代用写真）
【図３Ｄ】３Ｄ画像化技術を実施した結果の３Ｄ写真である。（図面代用写真）
【図３Ｅ】３Ｄ画像化技術を実施した結果の３Ｄ写真である。（図面代用写真）
【図３Ｆ】３Ｄ画像化技術を実施した結果の３Ｄ写真である。（図面代用写真）
【図４Ａ】ＷＳＴ−Ｉ試験：ＰＣＬ、ゼラチン、ＰＬＧＡ、カバーグラスおよびＢｉｏＧｉｄｅコラーゲン膜に播種したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖。
【図４Ｂ】調製し調べたそれぞれの膜上での細胞増殖を示す、細胞のＳＥＭイメージング。（図面代用写真）
【図５】ゼラチン膜による生分解試験。
【図６】コラーゲンとＰＬＧＡ組成物とを含有する層の調製：ＷＳＴ−Ｉ試験：以下の膜に播種したヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖（０％コラーゲン：１００％ＰＬＧＡ；２５％コラーゲン：７５％ＰＬＧＡ（１：３）；５０％コラーゲン：５０％ＰＬＧＡ（１：１）；７５％コラーゲン：２５％ＰＬＧＡ（３：１）；ＢｉｏＧｉｄｅコラーゲン膜；およびカバーグラス）
【図７】ゼラチン膜（上）および生分解性高分子膜（下）の顕微鏡写真である。（図面代用写真）
【図８】代用全顔の図であり、剥離のプロセスを示している。鼻と上唇のみ（全顔から切り出しているが、代用部位としてその形状を保持している）が示されている。（図面代用写真）
【図９】平膜および骨を覆うための顎へのその適用の図である。（図面代用写真）
【図１０】眼の中の黄斑および幹細胞を含むパッチ／膜としての組成物の画像である。（図面代用写真）
【図１１】コラーゲンゲルを含むナノファイバー膜としての組成物の画像である。下側パネル（Ｂ）では、ゲルを膜状に押し固めて二層組成物を形成している。（図面代用写真）
【図１２】７９日間（１８９６時間）にわたるベバシズマブの累積放出を示す、ナノファイバーメッシュ／膜とフィルムとを比較した際のグラフである。
【図１３】本発明の組成物を調製するための、ナノファイバーの臨床グレードの無針エレクトロスピニングを示す写真である。ａ）臨床グレードの製造に必要とされるクリーンルーム適正製造基準（ＧＭＰ）と同等の条件下にてＮａｎｏＳｐｉｄｅｒ（商標）が稼働している環境を示している。ｂ）無針エレクトロスピニングの構成、溶液タブ（ＳＴ）内に取り付けられたワイヤスピン電極（ＳＥ）およびＳＥの２１ｃｍ上に位置する集電極（ＣＥ）を示しており、空気吸入口（ＡＩ）も示されている。ｃ）ＮＦ−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）膜を大量生産するために使用される多数のランダムなナノファイバー（ＮＦ）マルチジェットを有する６ワイヤスピン電極。ｄ）パイク電極を示しており、エレクトロスピニングパラメータの試験に使用する。ｅ）歯周再生療法におけるＨＭＳＣ送達に恐らく使用可能であるゆえにヒトの下顎の模型に隣接させた、ＰＬＧＡからなるＮＦ−ＥＣＭ膜（矢印）の構造形態を示している。（図面代用写真）
【図１４】ＮＦ−ＥＣＭ膜およびフィルムのモルフォロジーである。ＮＦ−ＥＣＭは臨床グレードのエレクトロスピニングにより作製した。自由表面エレクトロスピニングおよびフィルム流延により調製した膜の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像：×４０００倍におけるＰＬＧＡ、ＰＣＬ、ゼラチンおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭ（ＮＦ）とフィルム。コラーゲンのＮＦ−ＥＣＭ（安定したコラーゲンのフィルムの調製はできなかった）および臨床的に承認されたコラーゲン膜（ＣＣＭ）のＳＥＭ像も示されている。水平な４０μｍスケールバーは全てのＳＥＭ像に適用される。ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭとフィルムの原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像は、ＮＦ−ＥＣＭとフィルムとで表面トポグラフィーが異なることの実例として示されている。ＡＦＭ画像は１２×１２μｍのエリアで撮影した。ＡＦＭ画像に示されるスケールバーはそれぞれの膜の深さを表しており、ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭは２μｍ、ＰＬＧＡのフィルムは５０ｎｍである。（図面代用写真）
【図１５】エレクトロスピニングの際のコラーゲンの安定性。ａ）非架橋コラーゲンのＮＦ−ＥＣＭ（ＮＦ）と同一のスペクトルを示しているコラーゲン（ｃｏｌｌ）粉末（未加工）のフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）、安定したコラーゲンの二次構造の特徴を示している（標識ピーク）。さらにこれらは１より大きい１４５０：１２４０ｃｍ^−１比を有していた。架橋コラーゲンのＮＦは１７１５のピークがより低く、１４５０：１２４０ｃｍ^−１比が１未満であった。ゼラチン（ｇｅｌ）のＮＦとＣＣＭは１７１５ｃｍ^−１が無い同一のスペクトルを有し、また１４５０：１２４０ｃｍ^−１比はやはり１未満であった。ｂ）酸可溶化「Ａ」、またペプシン消化「Ｐ」した、コラーゲンおよびゼラチン粉末またはＮＦ−ＥＣＭのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。横線は分子量を示し、矢印で特異的なコラーゲンバンドを強調している。コラーゲン粉末（未加工）を除く全てのサンプルにおいて、これらのバンドはペプシンによりほぼ完全に消化された。注：ゼラチンのＮＦ（非架橋）はゼラチンのＮＦ（架橋）と未加工ゼラチン粉末も表している（これら全てのサンプルについての結果がＦＴＩＲもＳＤＳ−ＰＡＧＥも同一であったため）。酸性溶液に非可溶であったためＣＣＭの（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はできなかった。
【図１６】膜の機械的特性および水接触角。臨床グレードと同等の、ＰＬＧＡ、ＰＣＬ、ゼラチンおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭ膜（ＮＦ）ならびにフィルム、さらには臨床的に承認されたコラーゲン膜（ＣＣＭ）の、ａ）剛性（ヤング率）、ｂ）最大引張応力、ｃ）最大引張ひずみ、およびｄ）水接触角を特徴付けた。ゼラチンおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭならびにＣＣＭでは水滴が即座に分散してしまったため、水接触角の測定は不可能であった。
【図１７】８日目の膜の生体適合性。生体適合性の基準としてＨＭＳＣの増殖をＷＳＴ−１を用いて調査した。種々のＮＦ−ＥＣＭ（ＮＦ）およびフィルムを試験して比較した。統計的確率は示した通りであり、臨床的に承認されたコラーゲン膜（ＣＣＭ；横の点線）との比較を基準としている。追加のコントロールとしてのカバーグラス（ＣＧ）（横の実線）。エラーバーは平均値の標準誤差を示している。
【図１８】ＨＭＳＣの骨形成アッセイ。２４ウェルプレート内でのカルシウム石灰化およびＡＬＰ活性の評価：ＰＬＧＡ、ＰＣＬ、コラーゲン（ｃｏｌｌ）またはゼラチン（ｇｅｌ）のＮＦ−ＥＣＭ（ＮＦ）、およびコポリマーのＮＦ−ＥＣＭに１４日間播種したＨＭＳＣに、アリザリンレッド（カルシウム沈着用に赤に染色）およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＡＬＰ活性用に紫／青に染色）を使用。純粋ポリマーの２Ｄフィルム、カバーグラスおよび臨床的に承認されたコラーゲン膜（ＣＣＭ）をコントロールとした。コラーゲンのＮＦ−ＥＣＭおよびＣＣＭは、アリザリンレッドで自動的に染色された（これは、ＨＭＳＣを播種していないサンプルにおいて、背景染色についても確認された）。しかしながら、ＨＭＳＣの有無にかかわらず、非骨形成培地で培養したＣＣＭおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭに関してはＡＬＰの自動染色はなかった。紫／青および赤染色の度合は、白黒の図では灰色の度合として表わされる。
【図１９】臨床グレードのＮＦ−ＥＣＭ膜（ＮＦ）に関する細胞接着および統合。ＰＣＬおよびＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭ膜ならびにカバーグラス（ＣＧ）に播種したＨＭＳＣのＳＥＭ像、着色部（ほぼ画像の中央に位置している構造を参照）。細胞培養２日目にＰＣＬに播種したＨＭＳＣ、密集したＮＦ−ＥＣＭ膜上での細胞接着および糸状仮足の伸長を示している。ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭ膜に播種したＨＭＳＣは、細胞内規模のナノファイバーメッシュによって形成されたニッチ様空隙への多層状の細胞統合を示している。この統合は非常に深いため、統合した細胞とナノファイバーとの接合部は多くの箇所において識別不能であった。細胞は網目構造の内部に「密閉」されているように見えた。カバーグラスに播種したＨＭＳＣは、２Ｄ構造に予想された通り３Ｄ形状がほとんどないほぼ完全に平坦な形態を示している（ＳＥＭ：ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ ＳＣ５．１．による材料へのＨＭＳＣの仮想染色、×１０００倍）。（図面代用写真）
【図２０】純粋膜に播種したＨＭＳＣのモルフォロジー。ＮＦ−ＥＣＭは臨床グレードのエレクトロスピニングにより作製した。ＰＬＧＡ、ＰＣＬ、ゼラチンおよびコラーゲンのナノファイバー３ＤＥＣＭ（ＮＦ）ならびにそれらに対応する２Ｄフィルムにおける培養２日後のＨＭＳＣのＳＥＭ像。ＮＦ−ＥＣＭでは、ナノファイバーメッシュニッチ内への細胞の多面的な密閉様統合が示された。フィルムコントロール上の細胞は平坦であり３Ｄ配向がなかった。３Ｄコントロールとして臨床的に承認されたコラーゲン膜（ＣＣＭ）を用いた。（×１０００倍）。（図面代用写真）
【図２１】材料上のＨＭＳＣの配向およびモルフォロジー。ＮＦ−ＥＣＭは臨床グレードのエレクトロスピニングにより作製した。ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭ（ＮＦ）およびフィルムで２日間培養したＨＭＳＣならびに臨床的に承認されたコラーゲン膜（ＣＣＭ）で培養したＨＭＳＣの、ローダミン−ファロイジンで標識（カラー写真では赤；白黒写真では灰色）した共焦点画像。ＰＬＧＡのＮＦおよびＣＣＭでは、細胞の３Ｄ配向は良好であった。対照的にＰＬＧＡのフィルムでは、細胞は広がりがより大きく平坦であった。ＨＭＳＣの表現型はゼラチンおよびＰＣＬのＮＦ／フィルムと同様であった。×１００倍および×２００倍。（図面代用写真）
【図２２】ａ）ｎａｎｏｓｐｉｄｅｒ装置およびｂ）ナノファイバーマトリックスから代用顔を製造するためのエレクトロスピニングの設定を示す画像である。ナノファイバーを、患者の顔の個々の寸法の三次元の顔型に向けて電場内で噴霧する。ｃ）エレクトロスピニングによりナノファイバーマトリックスから作成した代用人工皮膚の大量生産品。大量生産品は１平方メートルのナノファイバー材料より大きい場合がある。ｄ）ナノファイバーマトリックスから作成した鼻および上唇用の個人用代用皮膚。この代用品は代用顔の製造と同じプロセスで作成した後、適宜輪郭に合わせる。（図面代用写真）
【図２３】図２２の上記説明文に記載のエレクトロスピニングによる代用眼を示す画像である。ａ）眼型と伝導性表面カバー。ｂ）眼型へのナノファイバースピニング加工。（図面代用写真）
【図２４】三次元ナノファイバー眼型を示す画像である。（図面代用写真）
【図２５】自然のナノファイバー膜、カバーグラスおよびヒトＢＭの内コラーゲン層のＳＥＭ像である。Ａ：ＰＬＧＡのナノファイバー膜；Ｂ：コラーゲンのナノファイバー膜；Ｃ：カバーグラス。Ｄ：ヒトＢＭの内コラーゲン層、参考文献［４７］からの許可の下に転載。作製した本発明のナノファイバー膜内のファイバーモルフォロジーおよび３Ｄ構造は、ヒトＢＭの内コラーゲン層との高い類似性を示した。対照的に、カバーグラスは全く３Ｄモルフォロジーを示さなかった。スケールバー＝２０μｍ。（図面代用写真）
【図２６】ヒトＲＰＥ細胞の増殖アッセイ。ヒトＲＰＥ細胞をＰＬＧＡおよびコラーゲンのナノファイバー膜ならびにカバーグラス（コントロール）上で培養した。１日目、３日目および５日目に、ＷＳＴ試験により増殖アッセイを実施した。垂直軸は分光光度計による吸光度を示しており、様々な基質における生存細胞の数を示している。ナノファイバー膜は総じて、滑らかなカバーグラス表面に比べてＲＰＥ細胞の増殖を有意に大きく促進した。エラーバーは標準偏差を示している。^＊：ｐ＜０．０５ ：ｐ＜０．０１、ナノファイバー膜とカバーグラスとを各時点において比較するため。
【図２７】３日後および１１日後の膜の細胞のＳＥＭ像。Ａ：ＰＬＧＡ膜；Ｂ：コラーゲン膜；Ｃ：カバーグラス。画像は×６００倍で撮影した。スケールバー＝５０μｍ。３日後、培養した細胞は全ての基質において多角形、最も典型的には六角形を呈した。１１日後、広範囲に局所コンフルエンスが見られ、細胞が密集していた。（図面代用写真）
【図２８】１１日後のナノファイバー状膜の細胞のＳＥＭ像。画像は×１５００、×４０００および×１００００倍で撮影した。スケールバーはそれぞれ２０μｍ、５μｍおよび２μｍである。カバーグラスをコントロールとした。全体的に、平坦なカバーグラスよりも本発明者らの新規なＰＬＧＡおよびコラーゲンのナノファイバー膜において、細胞はより自然な三次元単層を形成した。ナノ膜で培養した全てのＲＰＥ細胞が、ベースがナノ膜に向かって配向した、ほとんどが六／多角形細胞の良く配向した単層を示した。大量のシート状の微絨毛を頂端面に確認することができたが、微絨毛はヒト網膜の生物学的配向と同じであり、ヒト網膜においては光受容細胞を包んでいる。平坦なカバーグラスのＲＰＥ細胞の配向および微絨毛の発現は、それほど組織化されていないように見えた。（図面代用写真）
【図２９】ナノファイバー膜のヒトＲＰＥ細胞によるＺＯ−１の発現。ヒトＲＰＥ細胞をＰＬＧＡ（ａ）およびコラーゲン（ｂ）のナノファイバー状膜ならびにカバーグラス（ｃ）で１１日間培養してから、密着結合のマーカーであるＺＯ−１抗体（緑色）で蛍光免疫染色した。どの基質で培養した細胞も、重要な生体機能的特徴である密着結合の形成および六角形を示した。スケールバー＝２０μｍ。（図面代用写真）
【図３０】ナノファイバー膜のヒトＲＰＥ細胞によるＲＰＥ６５タンパク質の発現。ヒトＲＰＥ細胞をＰＬＧＡ（ａ）およびコラーゲン（ｂ）のナノファイバー状膜ならびにカバーグラス（ｃ）で１１日間培養してから、ＲＰＥ６５抗体で蛍光免疫染色した。ナノファイバー膜およびカバーグラスのどちらで増殖している細胞も、主要な生体機能性タンパク質であるＲＰＥ６５に対して陽性であった。スケールバー＝２０μｍ。（図面代用写真）
【図３１】純粋ＰＬＧＡ、８０μＭのプルモルファミンを有するＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ８０）および１６０μＭのプルモルファミンを有するＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ１６０）に対する１４日目のカルシウム沈着を示すグラフである。
【図３２】網膜、ＢＭまたは眼の後壁のいずれかの解剖学的な部位にて使用するための、本明細書に記載のプロセスによって作製した超薄膜の画像である。（図面代用写真）
【００５８】
定義
本明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という語、または「含む（comprises）」や「含む（comprising）」等の変化形は、記載した
工程、要素、整数、または工程、要素もしくは整数の群を含むものの、工程、要素、整数、または要素もしくは整数の群のどれ１つも除外することはないということを意味すると理解されよう。本明細書および特許請求の範囲で用いる、「含む（comprising）」（および「含む（comprise）」や「含む（comprises）」等の「含む（comprising）」のいずれ
かの形態）、「有する（having）」（および「有する（have）」や「有する（has）」等
の「有する（having）」のいずれかの形態）、「含む（including）」（および「含む（includes）」や「含む（include）」等の「含む（including）」のいずれかの形態）また
は「含有する（containing）」（および「含有する（contains）」や「含有する（contain）」等の「含有する（containing）」のいずれかの形態）という語は、包括的または無
制限であり、さらなる記載していない要素や方法工程を除外するものではない。
【００５９】
「１（a）」または「１（an）」という語を本特許請求の範囲および／または本明細書
中にて「含む（comprising）」という語とともに使用した場合「１」も意味し得るが、「１以上」「少なくとも１」および「１または１より大きい」の意味とも一致している。本明細書で用いる「別の（another）」は、少なくとも２番目またはそれ以上を意味し得る
。
【００６０】
本明細書で用いる「層」は、化学的に、形態学的に、かつ／または機構的に別の層とは別個のものである。２層以上の層には複合体が含まれる。本明細書で用いる当業者に公知の「複合体」という用語は、完成構造内において肉眼や顕微鏡スケールでも依然として別個のものである、有意に異なる物理的および／または化学的性質を持つ２種以上の構成材
料が存在することである。この場合、２種以上の構成材料は２層以上の層であってもよい。３層以上の層にはサンドイッチの形態の複合体が含まれる。各層には厚さがあり、その長さおよび幅よりは実質的に小さい。層は改変可能な場合があり、任意の形状または輪郭に形成し得る。層は、任意の形状または輪郭を維持するために硬化してもよい。層は、１枚のシートまたは複数のシート（正方形シート、例えば「トルティーヤ」状構造のような丸いシート、長方形シートおよび不規則な形状のシート等）の形態であり得る。これらのシートは互いに織り交ぜることによって相互につながっていてもよい。シートを丸めて「ブリトー」に似た開管状にしてもよい。また、閉管、管の切片（例えば帯状物）、球体、または再生もしくは修復を必要とする組織を含む身体部位に組成物を正しく設置することが可能ないずれかの形状もしくは形態が企図されている。層は別の層に対して任意の配向を有し得る。例えば、ある層が別の層に対して平行または垂直であってもよい。また、ある層が１つまたは複数の他の層を横断することも可能であるし、その層自身に折り重なることも別の層の周りに折り重なることも可能である。１つまたは複数の層が、連続して繰り返すことも可能であるし、１つまたは複数の違う層が加えられた後に繰り返すことも可能である。例えば、第１の層がＡで層ＢまたはＣが続くとすると、別の層が続いて再びＡになることもある。
【００６１】
「組成物」という用語は当技術分野において公知であり、本明細書においてはその最も広い意味が企図されている。
【００６２】
組成物の「マトリックス（matrice）」または「マトリックス（matrix）」という用語
は、「ウェビング」および「膜」という用語と交換可能に用いられる。
【００６３】
本明細書で用いる「生分解性」という用語は、１つまたは複数の層の１種または複数のポリマーがインビボで結合開裂を起こしたことを意味する。開裂は、例えば加水分解、酸化、酵素的分解等、化学結合の破壊をもたらすいずれかの化学反応を介して起こり得る。時間の経過に伴うインビボにおけるポリマーの質量損失は、組成物をインビボに入れる前の元々のポリマー質量の４０％〜８０％〜９３％〜９８％〜９９％以上の範囲であってもよく、また生分解を完了させるための時間は数分から数年であってもよい。
【００６４】
本明細書における「別個の」または「差異」という用語は、各層が化学的に、機械的に、かつ／または形態学的に互いに異なり得ることを意味する。
【００６５】
「化学的」という用語は非常に広範であり、層内の化学的含有物、したがって起こり得る化学的相互作用も含む。層内の化学的含有物としては、限定するものではないが、プロトン、中性子、電子、元素、様々な電荷、イオン、化合物、分子、剤、タンパク質、ペプチド、細胞が挙げられる。相互作用はＳＮ１反応、ＳＮ２反応を介して起こり得る。「化学的差異」とは、ある層が化学的含有物や相互作用において別の層と異なることを意味する。層同士の「化学的差異」は、異なるポリマーおよび／または異なる剤を用いることにより実現できる。２層以上の層は同じポリマーを含み異なる剤（１種または複数）を含んでもよい。あるいは、２層以上の層は異なるポリマーを含み同じ剤（１種または複数）を含んでもよい。一例として、ある層がポリマーを含有し、一方で別の層もポリマーを含有しているが後で起こる増殖のためにある力価の細胞が播種されている。これら２つの層は化学的に別個と見なされる。
【００６６】
「形態」という用語は、層の形状、大きさおよび／または質感を意味する。「形態学的差異」とは、ある層が形状、大きさおよび／または質感において別の層と異なることを意味する。「形態学的差異」は、場の電圧および／または場を生み出す電極の距離を変えること、および／または異なるポリマーを用いること、および／または同じポリマーまたは同じポリマーの混合物の配向を変化させることにより実現できる。
【００６７】
「機械的」という用語は、力を加えたり変位させたりした時のポリマー、剤、または層の材料の挙動を意味する。機械的側面には、構造的支持を与えるポリマーの強剛性が含まれ得る。層同士の「機械的差異」は、異なるポリマーおよび／もしくは異なる剤を用いること、ならびに／または電場の電圧および／もしくは場を生み出す電極の距離を変えることにより実現し得る。
【００６８】
「剤」という用語は、人体に影響するいずれかの物質を意味し得る。この用語には「生理化学剤」と「治療剤」とが含まれる。「生理化学剤」という用語は、体内に存在する化学的または物理的機能を実行する生体分子の相互作用を含む生体のいずれかの機能に影響する剤を意味する。「治療剤（１種または複数）」は、「薬剤的に活性な剤」、「薬剤的に活性な材料」、「薬」および「生物学的に活性な剤」を意味し得り、また含み得る。他の関連語は本明細書中に置いて交換可能に用いることができ、遺伝子治療剤、非遺伝子治療剤および細胞が挙げられる。組成物中の剤または材料はいずれも遅延放出用にカプセル化されてもよい。
【００６９】
「材料」とは、組成物のいずれかの層に添加される任意の合成または天然由来物質である。材料を用いて、（ａ）組成物の構造をより強固またはより柔軟にする、（ｂ）分子または細胞を３Ｄナノファイバーウェビング内に取り込む、（ｃ）３Ｄナノファイバーウェビング内に存在する１種または複数の剤を分解から保護する、もしくは分解を遅らせる、かつ／または（ｄ）１種または複数の剤を活性化させる、もしくは阻害することができる。材料はゲル、気体、クリーム、軟膏または固体の形態であってもよい。材料は有機材料でも無機材料でもよい。本明細書において企図されているが、材料としては、限定するものではないが、鉱物、セラミック、ナノダイヤモンド、結晶、非晶質鉱物およびヒドロキシアパタイト、フッ素リン灰石、リン酸三カルシウム、骨のためのリン酸カルシウムならびに硬（石灰化）組織が挙げられる。また、金属、および金、銀、銅、亜鉛、スズ、白金、チタン、マグネシウム合金等の合金、Ｎａ、Ｃａ、Ｆ、Ｌｉ、Ｋ、Ｍｇ等のアルカリ金属、ならびにＣｌ、Ｂｒおよびヨウ素が本明細書において企図されている。
【００７０】
本明細書に記載の「組織」とは、必ずしも同一でないが起源は同じである、共同して特定の機能を実行する細胞の集合である。これらは同一に機能することから組織と呼ばれている。複数の組織が機能的に寄せ集まることにより次に器官が形成される。
【００７１】
本明細書で用いる「薬」という用語は、疾患や病状の治療に役立つか、または疾患や病状に付随するいずれかの生理的または病理的症状を抑えたり改善したりする化合物と定義される。
【００７２】
本明細書で用いる「抗癌薬」という用語は、固形腫瘍用等、癌の治療用の薬と定義される。抗癌薬は、腫瘍の大きさを縮小、腫瘍の増殖や転移を阻害または抑制、かつ／または腫瘍を排除することが好ましい。「抗癌薬」、「抗癌剤」および「抗癌化合物」という用語は、本明細書中において交換可能に用いられる。
【００７３】
当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の組成物に形態学的および／または化学的改変を行えることがわかるであろう。
【００７４】
本出願を通して、「約」または「一致する」という用語は、組成物の厚さを再生または修復を必要とする組織と同じにすることが目的ではあるけれども、厚さ等の測定することができる２つの値や態様は必ずしも同一でなく、また値の違いには、（例えば厚さの測定用に）値を決定するために採用されている方法における固有の誤差変動、組成物の製造プロセスにおける変動が含まれる、ということを示すために用いる。
【００７５】
特許請求の範囲における「または」という用語は、代替物のみを指すことが明示されていない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために用いられる。
【００７６】
本明細書において考察されているあらゆる実施形態は本発明のあらゆる方法や組成物に対して実行することができ逆もまた同様である、ということが企図されている。さらに、本発明の組成物を用いて本発明の方法を達成することができる。
【００７７】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内での種々の変更および改変が以下の詳細な説明から当業者にとって明らかとなるため、詳細な説明および具体的な例は本発明の具体的な実施形態を示しているが単なる例示にすぎないと理解すべきである。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明者は、組織の再生または修復を必要とするいずれかの身体部位に適用できる、三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビング（図７参照）を含むカスタマイズされた組織再生組成物を発見した。身体部位としては、顔、胸部、耳、首、腋窩、鼠径部、手、肘、腕、脚部、足、膝、生殖器、眼瞼、鼻、口唇、皮膚、角膜、網膜、ＢＭ、視神経または眼の後壁の他のいずれかの解剖学的な部位を含む眼、肝臓、胆管および胆嚢、腎臓、腸、心臓、膵臓、脾臓、ＧＡＬＴ、ＭＡＬＴ、咽喉、食道、喉頭、肺、静脈、動脈、胃、小腸、十二指腸、回腸、空腸、結腸、大腸、脳、脊髄および脊髄神経、筋肉（平滑筋、骨格筋および混合筋）、血管、子宮、膀胱および尿道および尿管、卵巣、膣、直腸、甲状腺、舌、口腔粘膜、胃腸粘膜および鼻咽頭粘膜、歯周組織および歯組織、平滑筋および骨格筋、毛髪、乳頭、アポクリン腺、エクリン腺および内分泌腺、毛包、骨軟骨、腱、ならびに骨膜および軟骨膜が挙げられる。
【００７９】
本発明の範囲には、組織を修復または再生するための組成物の使用および方法が含まれる。疾患、症状または遺伝的欠陥の結果損なわれた任意の組織が本明細書において企図されており、本発明の組成物を適用することで利益を受ける組織と考えられる。例えば組成物を用いて、パッチまたは膜の形態であり幹細胞を含む組成物を黄斑に適用することにより黄斑変性を治療することができる。一例として、黄斑変性は加齢黄斑変性であってもよい。
【００８０】
この発見には、本発明の範囲内において、三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングを含むカスタマイズされた組織再生組成物を得るプロセスが含まれる。この独特のプロセスには、（ａ）少なくとも組織の再生または修復を必要とする身体部位のインプレッション型を調製する工程、（ｂ）型からギプスを調製する工程、（ｃ）ナノファイバーウェビング機の電場にギプスを設置する工程、（ｄ）３Ｄナノファイバーウェビングをギプスに所望の厚さに塗布する工程、（ｅ）ギプスから３Ｄナノファイバーウェビングを取り外す工程、および（ｆ）ウェビングを組織の再生または修復を必要とする身体部位に取り付ける工程、が含まれる。
【００８１】
上記のプロセスの工程（ａ）〜（ｅ）は、以下の工程に置き換えることができる：（ｇ）３Ｄ画像化技術により組織の再生または修復を必要とする身体部位の輪郭を測定する工程、（ｆ）測定値をデザインアプリケーションに入力して身体の物理模型を調製する工程、（ｈ）模型を調製する工程、（ｉ）ナノファイバーウェビング機の電場に模型を設置すること、（ｊ）３Ｄナノファイバーウェビングを模型に所望の厚さに塗布する工程、および（ｋ）模型から３Ｄナノファイバーウェビングを取り外す工程。本明細書においては、組織の再生または修復を必要とする身体部位の輪郭を測定することができる任意の３Ｄ画
像化技術が企図されている。当技術分野において公知である３Ｄ画像化技術の非限定的な例としては、スキャンＸ線、ＣＴスキャン、コーンビームＸ線、ＭＲＩおよび３Ｄ写真が挙げられる。３Ｄ写真の例を図３Ｄ〜３Ｆに示す。本発明者は、２種類以上の３Ｄ画像化技術を使用することを企図している。本明細書においては、正確な測定を実現するための３Ｄ画像化技術のあらゆる組合せが企図されている。本明細書においては、１種または複数の３Ｄ画像化技術の使用によって収集した輪郭測定値に基づいた模型のデザインが可能なあらゆるデザインアプリケーションが企図されている。デザインアプリケーションの非限定的な例としては、コンピューター支援設計（ＣＡＤ）およびラピッドプロトタイピング等の、当技術分野において公知であるいずれかのデザインアプリケーションが挙げられる。ラピッドプロトタイピングの非限定的な例としては、３Ｄ印刷、３Ｄ選択的レーザー加工、３Ｄ選択的焼結、３Ｄ流延、３Ｄバーリング、３Ｄ研削またはこれらのいずれかの組合せが挙げられる。
【００８２】
プレナノファイバー加工
いずれかの組織の再生または修復を必要とする身体部位に適用するための三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングを含むカスタマイズされた組織再生組成物を生成するために、本明細書に記載の型または模型を調製する。一例として本発明者は混凝紙を用いて顔の型を調製したが（例として図１参照）、型の作製が可能なあらゆる材料が企図されている。型を作製した後、材料を詰めてギプスを作る。ギプスを作るのに好適である当技術分野において公知の材料が各種存在する。非限定的な例では焼石膏がそのような材料の１つであり、本明細書において企図されている。
【００８３】
ナノファイバー加工
好ましい実施形態においては、ギプス（または３Ｄ画像化技術（１種または複数）およびデザインアプリケーション（１種または複数）により作製した模型）をナノウェビング機に設置する。本明細書においては、無針でナノウェビングを作り出す全ての機械が企図されている。ナノウェビング機の非限定的な例としては、ＮＳ Ｌａｂ ２００ｓ（Ｎａｎｏ−ｓｐｉｄｅｒ（登録商標））がある。
【００８４】
ギプスまたは模型を２電極間に置いて電場を作り出すが、好適な電場を作り出す全てのデザインが本明細書において企図されており、本発明の範囲内である。好ましい実施形態においては、電極間距離は２１ｃｍである。
【００８５】
好ましい実施形態においては、ナノファイバーの３Ｄ構造体であるナノウェビングは、ナノウェビング加工の際にギプスまたは模型の表面上にバイオポリマー液を噴霧することにより作製する（例として図２参照）。ナノファイバーが電場を通過してギプスまたは模型に当たる。一例として、電場を作り出すための印加電圧は３５ｋＶであるが、ナノファイバーの場の通過を可能にする全ての電圧が本発明の範囲内である。ナノファイバーの機械的構成や化学組成はこのプロセスの間に変更可能であり、本明細書において企図されている。また、ファイバーの形態は加工条件を変えることに影響される。加工条件は溶液特性に比べればファイバーの製造への影響は少ないが、それでもやはり、このようなパラメータを理解することは特定の形態のファイバーを得る上で重要なことである［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００８６】
ファイバーの形成および形態に影響し得る処理パラメータのいくつかとしては、印加電圧、スピン電極の回転、使用する電極の種類、２電極間の距離、ならびに雰囲気の種類、湿度、温度および圧力がある。これらのパラメータの変更は、飛行時間、加速スピード、テイラーコーンの安定性および電場強度を変えることによって、ファイバーの形態に影響し得る［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００８７】
電圧
通常、印加電圧を上昇させるとファイバーに印加される電場が強くなる。これによりファイバーの伸びが良くなり、その結果ファイバー径が小さくなる［Ramakrishna et. al. (2005); Jalili et. al. (2006)］。噴流がシリンジの先端に後退するときは、その噴流
の伸びはテイラーコーンの不安定性によるものと思われる［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００８８】
低粘度のポリマー溶液の場合、高電圧を与えると第２の噴流が形成される場合があり、その結果径の小さいファイバーが形成されることとなる。しかしながら、さらに粘度が低いと、場合によっては、電圧を低下させても径の小さいファイバーとなることがある。このケースでは、電圧を低下させることで噴流の加速が弱まり、その結果、噴流が回収される前に伸びて細長くなるのにより長い時間がかかるようになり、よってファイバー径が小さくなる［Ramakrishna et. al. (2005); Ki et. al. (2005)］。
【００８９】
電極回転
電極の回転は、帯電噴流がポリマー溶液を噴射させる流速と等しい流速で溶液を送達するように設定する。電荷が臨界点に達すると、流体噴流が溶液から噴出する。噴出した流体噴流がテイラーコーンを形成し、電位がより低い領域、すなわち集電極に向かって移動する。対応電圧に対して安定なテイラーコーンを維持するためには、スピン電極の回転を調整することによって溶液の流量を調整することができる。流量を増やすと引き出される利用可能なポリマーの量が増加し、その結果形成されるファイバーの径が大きくなる。しかしながら、引き出される溶液の量が増加することで、噴流が溶媒を蒸発させるために必要な時間がより長くなる可能性がある［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００９０】
温度
ファイバーが溶融するのに十分なほど温度が高いと、大きな孔が形成される［Ramakrishna et. al. (2005)］。高温はエレクトロスピニングしたファイバーの結晶化度にも影響し得る。エレクトロスピニングしたナノファイバーの結晶化度を評価するためにＸ線回折を用いた研究が行われている。
温度を上げると溶液の粘度は低下する。また溶媒蒸発の速度は上がる［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００９１】
コレクターの効果
コレクターは、必要とされるファイバーの充填密度次第で、伝導性でも非伝導性でもよい。伝導性コレクターに沈着したファイバーがその電荷を散逸させ、より多くのファイバーがコレクターに引き付けられることができるようになる。この結果充填密度がより高くなる。自然の細胞外マトリックスを模倣している輪郭のはっきりした構造の足場は組織工学において大きな可能性がある。コレクターデザインを用いて、収集したファイバーの結果的な配向を、整列させたりランダムであったり、細胞外マトリックスと同様の配向を示すように変えることができる。Zhongとそのグループは、回転シリンダーを用いて整列し
たコラーゲン足場を製作し、それによって線維芽細胞増殖が増加するということを実証した［Zhong et. al. (2006)］。
【００９２】
電極間距離
電極間距離を変えると噴流の飛行時間と電場強度に影響する。距離が短めであると飛行時間は少なくなる。さらに、電場が強まって噴流の加速が増す。これによって溶媒が蒸発するまでの時間が減少し、その結果ファイバーが併合する場合がある［Khil et. al. (2003)］。
【００９３】
いくつかの溶媒に関しては、針とコレクターとの距離を短くすると電場強度の上昇の結
果ビーズが形成されることがあり、それによって噴流が加速されることになり、その結果ファイバーが伸びるための時間が少なくなる［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００９４】
溶液特性
溶融ポリマーをエレクトロスピニングすることも可能ではあるが、ポリマー溶液が好ましい。エレクトロスピニングに使用できる溶媒は、水、有機溶媒および油と広範囲である。また多くのポリマー、コポリマーおよびポリマーの混合物がエレクトロスピニングすることができる。ポリマーおよび溶媒の選択は、溶液の表面張力、伝導性、粘弾性および他の特性に影響する。これらの溶液特性は、得られるファイバーの形態、化学的特性および機械的特性に大きく影響する［Liang et. al. (2007)］。
【００９５】
表面張力
エレクトロスピニングプロセスを開始するためには、溶液に印加する電荷が表面張力に打ち勝たなければならない。ポリマー溶液の表面張力は液体の単位質量当たりの表面積を減少させる働きをし、それによってファイバー長に沿ったビーズの形成が起き易くなる［Khil et. al. (2003)］。高濃度の自由溶媒分子が存在する低い粘度においては、表面張
力のために、球形状をとるための溶媒分子に対する親和性が高くなる［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００９６】
粘度
ポリマーの分子量は溶液の粘度に影響する。一般的には、分子量の高いポリマーを溶媒に溶解させると、分子量の低いポリマーよりも粘度が高いポリマー溶液になる。溶液は妥当な分子量のポリマーを有していなければならず、かつエレクトロスピニングが起きるのに十分な粘度を有していなければいけない。分子鎖の絡み合いによって、ポリマー噴流が伸びている間の噴流の破断が防がれる［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００９７】
粘度を上げる別の方法は、溶液中のポリマーの濃度を高くすることによるものである。この方法では、エレクトロスピニングの際の噴流の連続性を保持するために必須であるポリマーの絡み合いも増加させることになる［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００９８】
前述の通り、粘度が低過ぎると表面張力が支配的な影響力を持つため、ファイバー長に沿ってビーズが確認されるのは普通である。粘度が高くなるにつれ、滑らかなファイバーが得られるまでビーズの形状が球から紡錘状に変化する。しかしながら、高粘度においては形成されるファイバーの径が大きくなる。これは、絡み合いの量が増加した結果より大きな抵抗が生じるためである［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【００９９】
高粘度においては、溶液が乾燥してスピン電極と溶液との間に孤立した層を形成する可能性がより高く、エレクトロスピニングの効率に大きく影響することとなる。
【０１００】
溶液の粘度が高いと噴流の曲げ不安定性も低下するが、それによって沈着面積が小さくなり、また伸びも少なくなり、その結果さらに径が大きくなる［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【０１０１】
溶液の揮発性（蒸発速度）
噴流がコレクターに向かって進むにつれて溶媒は蒸発する。溶媒の蒸発の速度が遅すぎて溶媒がコレクターに達する時までに十分に蒸発していないと、ファイバーが併合して層間結合や層内結合を形成することがある。これは、得られる足場にさらなる強度を付与するための有用な技術であり得る［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【０１０２】
ＮＳ Ｌａｂ２００Ｓでは自由表面エレクトロスピニングの原理を使用している。この
方法を用いる場合、揮発性溶媒の使用に注意しなければならない。揮発性溶媒を用いる場合は共溶媒を用いることが推奨される。通常、溶媒は以下を満たさなければならない。
・常圧での沸騰温度が８０℃〜２００℃
・２０℃での飽和圧力が０．３５〜１０ｋＰａ
溶液の伝導性
【０１０３】
エレクトロスピニングは、溶液の表面の電荷の反発によって溶液の伸びが生じた結果起こる。溶液の伝導性が高まるにつれて、噴流が搬送する電荷は多くなる。したがって溶液の伝導性が高まると噴流の伸びがより大きくなり、径のより小さいより滑らかなファイバーが得られる。噴流によって搬送される電荷の量が増加すると曲げ不安定性が増すことにもなり、その結果より大きな沈着面積が達成される。しかしながら、溶液の伝導性が高まることによるファイバーの伸びには限界がある。これは、電荷のクーロン力に対して作用する粘弾性力の有意性による［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【０１０４】
伝導性を高めることは、イオンの添加または溶液のｐＨの変更により達成できる。タンパク質等の天然ポリマーは、水等の溶媒中で混合した時にイオンが形成されるために伝導性が高い［Ramakrishna et. al. (2005)］。
【０１０５】
溶媒の誘電効果
溶媒の誘電率はファイバーの伸びに大きく影響する。誘電率が上昇すると溶液の曲げ不安定性が増し、その結果噴流路が大きくなる。その結果、より大きな沈着面積およびより微細なファイバーとなる［Ramakrishna et. al. (2005); Ki et. al. (2005)］。
【０１０６】
硬化性
少なくとも１種の、硬化性バイオポリマーもしくは樹脂または自硬性粘土を加えると、組成物に形状安定性および構造的完全性を付与することができる。
【０１０７】
組成物の層
組成物は多層である。好ましい実施形態においては、組成物は膜の形態である。組成物は異なるポリマーの層を含んで複合体を形成し得る。２種またはそれ以上のポリマーは、同じ液体で分散させてもよいし、異なる液体に含ませて別々に分散させてもどちらでもよく、またはポリマーが液体の形態でない場合は２種またはそれ以上のポリマーを用いるさらに別の方法でもよい。各層は、様々な機械的、形態学的または化学的性質を有し得る。ポリマーは、不活性で、組成物の構造全体を支持して強剛性を付与し得る。層は、エレクトロスピニングプロセス中に織り交ぜることで相互につながっていてもよい。
【０１０８】
さらに、組成物は剤を含有してもよい。非限定的な例であるが、剤は生理化学剤または治療剤であってもよい。本明細書において企図されているが、生理化学剤は、体内に存在する化学的または物理的機能を実行する生体分子の相互作用を含む生体のいずれかの機能に影響するいずれかの物質を包含する。生理化学剤は、天然、天然由来または合成である。治療剤は、例えば、身体部位の炎症を軽減または改善したり、いずれかの微生物感染を防止する際に予防薬として機能したりといった医療目的を有するか、または身体部位やその周辺の組織の全体的な健康を補助するいずれの治療剤でもよく、組成物の３Ｄナノファイバーウェビング中に存在してもよい。
【０１０９】
治療剤
皮膚組織または体の中、すなわち体内に存在する組織等の、組織に関連する多種多様の疾患および症状の治療に使用するものを含む、多種多様の治療剤を使用することができる。一例として、内部組織は、ＡＭＤの治療のための、網膜組織、ＢＭ、または眼の後壁の他のいずれかの組織等の眼組織であってもよい。治療剤の例としては、限定するものでは
ないが、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸類似体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ペプチド核酸、アプタマー、抗体またはその断片もしくは一部、抗原またはエピトープ、ホルモン、ホルモン拮抗物質、増殖因子または組換え増殖因子ならびにそれらの断片および変異体、細胞接着メディエーター（ＲＧＤ等）、サイトカイン、酵素、抗炎症剤、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗プリオン、毒素、ナノダイヤモンド、プロドラッグ、化学療法剤、転写阻害タンパク質、小分子、薬物（例えば、薬物、染料、アミノ酸、ビタミン、酸化防止剤）、他の抗菌性化合物、ポリエン、グアニン類似体、チミジン類似体、真菌類、動植物またはウイルス（バクテリオファージを含む）等の生物、神経伝達物質、ホルモン、細胞内シグナル伝達剤、薬剤的に活性な剤、毒剤、農薬、化学的毒素、生物学的毒素、微生物、ならびにニューロン／神経、肝臓細胞および免疫系細胞等の動物細胞、薬理学的材料、ビタミン、鎮静剤、睡眠薬、プロスタグランジンおよび放射性医薬品が挙げられる。
【０１１０】
抗生物質
本発明の組成物の３Ｄナノファイバーウェビングに包埋することができる抗生物質または抗菌剤としては、限定するものではないが、アクチノマイシン；アミノグリコシド（例えば、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン）；βラクタマーゼ阻害剤（例えば、クラブラン酸、スルバクタム）；グリコペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン、ポリミキシン）；アンサマイシン；バシトラシン；カルバセフェム；カルバペネム；セファロスポリン（例えば、セファゾリン、セファクロル、セフジトレン、セフトビプロール、セフロキシム、セフォタキシム、セフェピム、セファドロキシル、セフォキシチン、セフプロジル、セフジニル）；グラミシジン；イソニアジド；リネゾリド；マクロライド（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン）；ムピロシン；ペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、オキサシリン、ピペラシリン）；オキソリン酸；ポリペプチド（例えば、バシトラシン、ポリミキシンＢ）；キノロン（例えば、シプロフロキサシン、ナリジクス酸、エノキサシン、ガチフロキサシン、レバキン、オフロキサシン等）；スルホンアミド（例えば、スルファサラジン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）、スルファジアジン）；テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン等）；アズトレオナム等のモノバクタム；クロラムフェニコール；リンコマイシン；クリンダマイシン；エタンブトール；ムピロシン；メトロニダゾール；ペフロキサシン；ピラジナミド；チアンフェニコール；リファンピシン；チアンフェニコール；ダプソン；クロファジミン；キヌプリスチン；メトロニダゾール；リネゾリド；イソニアジド；ピラシル；ノボビオシン；トリメトプリム；ホスホマイシン；フシジン酸；またはその他の局所性抗生物質が挙げられる。微生物汚染、特に手術部位感染によって引き起こされるものの防止および／または処置の方法が本発明に包含されている。上記で列挙した抗生物質のいずれかの１種または複数を含む本発明の組成物を用いることによって処置または防止し得る手術部位感染としては、限定するものではないが、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、緑色連鎖球菌、ａ群連鎖球
菌、緑膿菌（P. aeruginosa）、大便連鎖球菌（E. faecalis）、ミラビリス変形菌（P. mirabilis）、霊菌（S. marcescens）、プレボテラ属、バクテロイデス属、エンテロバク
ター・クロアカエ（E. clocae）、アセチノバクター（Acetinobacter）・アニトラタス（A. anitratus）、肺炎桿菌（K. pneumonia）、大腸菌、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、および腸球菌属、クロストリジウム属、マイコバクテリア科、紡錘状菌、スピロヘータ類、レジオネラ属、ボレリア属、芽胞等の細菌感染が挙げられる。本発明の組成物は、限定するものではないが、美容手術、婦人科手術、産科手術、腹部手術、整形手術、口腔および顎顔面手術、頭頸部手術、心胸郭手術、血管手術および結腸直腸手術を含むいずれかの手術部位感染に有用である。
【０１１１】
抗菌物質またはペプチド
抗生剤はさらに、デフェンシン、マガイニン、ナイシン、溶菌バクテリオファージ、インドリシジンおよびプロテグリン−１等の抗菌タンパク質または抗菌ペプチドであってもよい。抗生剤はさらに、上記で列挙した剤のいずれかの組合せであってもよい。
サイトカイン
【０１１２】
本発明の組成物の３Ｄナノファイバーウェビング内に存在してもよい剤として、インターフェロンまたはインターロイキン等のいずれかのサイトカインが企図されている。非限定的な例であるが、インターロイキン１〜３３、３５（ＩＬ−１〜ＩＬ−３３、ＩＬ−３５）ならびにＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ωおよびＩＦＮ−γが本明細書において企図されている。
【０１１３】
増殖および形態形成因子
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３を含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ベバシズマブ（アバスチン（商標））等の抗ＶＥＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、インスリン様増殖因子、骨形成増殖因子、骨形成様タンパク質、トランスフォーミング増殖因子、神経成長因子等の増殖および形態形成因子が本明細書において企図されており、関連するタンパク質（すなわち当技術分野において公知の増殖因子）が本発明の組成物の３Ｄナノファイバーウェビング内に存在してもよい剤として企図されている。
【０１１４】
ホルモン
本発明の組成物の３Ｄナノファイバーウェビング内に存在してもよい剤として、任意のホルモンが企図されている。非限定的な例であるが、ホルモンは、ＴＲＨ、バソプレシン、インスリン、成長ホルモン、糖タンパク質ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモンおよび甲状腺刺激ホルモン等のペプチドホルモン；テストステロンやコルチゾール等の、コレステロールに由来するステロイドホルモン等の脂質またはリン脂質由来ホルモンおよびエイコサノイド；または芳香族アミノ酸脱炭酸酵素の作用によってフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンのような芳香族アミノ酸から誘導されるモノアミンであってもよい。カルシトニンもまた企図されている。
【０１１５】
抗炎症剤
コルチコステロン、ブデソニド、デキサメタゾン、プレドニゾロン、エストロゲン、スルファサラジンおよびメサラミン等のステロイド系の抗炎症剤が本明細書において企図されている。本明細書において企図されている非ステロイド抗炎症剤としては、限定するものではないが、アスピリン（アセチルサリチル酸）、ジフルニサル、サルサラート等のサリチル酸塩；イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン等のプロピオン酸誘導体；インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン等の酢酸誘導体；ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム等のエノール酸（オキシカム）誘導体；メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸等のフェナム酸誘導体（フェナム酸塩）；およびセレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブおよびエトリコキシブ等の選択的ＣＯＸ−２阻害剤（コキシブ）が挙げられる。
【０１１６】
キナーゼ阻害剤
本発明の組成物の３Ｄナノファイバーウェビング内に存在してもよい剤として、任意のプロテインキナーゼまたはチロシンキナーゼ阻害剤が企図されている。キナーゼ阻害剤の例としては、限定するものではないが、チロホスチン、ゲニステインおよびキノキサリンが挙げられる。
【０１１７】
抗がん剤
本明細書においては任意の抗がん剤が企図されており、例えば、限定するものではないが、タモキシフェン、トポテカン、ＬＨＲＨ、ポドフィロトキシン、コルヒチン、エンドスタチン、ラルチトレキセド、チオテパ、シクロホスファミド、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ
（meturedopa）、ウレドーパ（uredopa）、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、ト
リエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、トリメチロールメラミン、ブラタシン、ブラタシノン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、アドゼレシン、カルゼレシン、ビゼレシン、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、デュオカルマイシン、ＫＷ−２１８９、ＣＢ１−ＴＭ１、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンギスタチン、クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムヌスチン（ranimnustine）、カリケアマイシン、ダイネミシン、クロドロネート、エスペラマイシン、ネオカルチノスタチン発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラルナイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイ
シン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミコフェノール酸、ノガラルナイシン（nogalarnycin）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フォリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート（edatraxate）、デフォファミン（defofamine）、デメコルチン、ジアジクオン、エルフォルミチン（elformithine）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダイニン（lonidainine）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、モピダンモール（mopidanmol）、ニトラエリン
（nitraerine）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ多糖類複合体、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン（gacytosine）、アラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、ドキセタキセル（doxetaxel）、クロランブシル、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラ
チン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、白金、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダトレキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、ゼローダ、イバンドロネート、イリノテカン、レチノイン酸、カペシタビン、ドセタキセル、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エポチロン、エンドスタチン、アンジオスタチン、アンジオペプチン、細胞や組織の増殖を阻止する能力のあるモノクローナル抗体、ならびにチミジンキナーゼ阻害剤、ＲＦＳ２０００およびジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦ
Ｏ）；（ｌ）ブピバカインおよびリドカインロピバカイン等の麻酔薬；（ｍ）抗凝固剤等のＲＧＤペプチド含有化合物、ヘパリン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ヒルジン、抗トロンビン化合物、プロスタグランジン阻害剤、血小板阻害剤、血小板受容体拮抗薬、抗トロンビンおよび抗血小板受容体抗体、ならびにアスピリン；（ｎ）翻訳プロモーター、増殖因子および転写活性化因子等の血管細胞成長促進物質が挙げられる。
【０１１８】
細胞
本明細書において企図されているが、本発明の組成物は、組織を再生するために必要とされる細胞を再現する細胞を含有してもよい。再現とは、組成物中の細胞が、組織の細胞と（ａ）同じである、（ｂ）同じ型に分化する類似型である、（ｃ）同じ起源である、かつ／または（ｄ）同じ機能を有する異なる型であることを意味する。例えば、網膜組織がダメージを受けると光受容細胞の喪失につながることがある。本発明の組成物は、多数の光受容細胞または光受容細胞に分化する細胞が播種されてもよい。また組成物は、網膜色素細胞および各種神経細胞をさらに含んでもよい。組成物が組織再生を必要とする身体部位と接触する前に細胞を培養することが本明細書において企図されている。
【０１１９】
本発明での使用に好適な細胞の例としては、限定するものではないが、前駆細胞または幹細胞、成体幹細胞または胚性幹細胞、成体分化細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、尿路上皮細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、皮膚細胞、毛包細胞、受容器細胞、メラニン細胞、血液細胞、筋肉、骨、軟骨および血管の全ての細胞、内皮細胞、粘膜細胞、免疫細胞、神経細胞、口の細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞、破骨細胞、角化細胞、腎尿細管細胞、腎臓基底膜細胞、外皮細胞、骨髄細胞、肝細胞、胆管細胞、膵島細胞、甲状腺、副甲状腺、副腎細胞、視床下部細胞、下垂体細胞、卵巣細胞、睾丸細胞、唾液腺細胞、脂肪細胞、角膜または網膜細胞、網膜色素上皮細胞、ＢＭ細胞、眼の後壁のいずれかの解剖学的部位に存在するいずれかの細胞等の眼の細胞、ならびに前駆細胞が挙げられる。幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または非常に小さな幹細胞等の各種ヒト幹細胞であってもよい。幹細胞はさらに、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリおよびヒツジ等のいずれかの脊椎動物を含む非ヒト由来であってもよい。３Ｄナノファイバーウェビングの層は２種類以上の細胞からなってもよい。例えば、ＡＭＤに冒された網膜組織または他のいずれかの眼組織の再生においては、再生を必要とする眼の部位への杆体および錐体ならびにニューロン／神経を含む光受容細胞の送達が必要な場合がある。この例においては、本発明の組成物は、３Ｄナノファイバーウェビング中に少なくとも３つの層、例えば７〜８層を含み、１つの層が光受容細胞を含有し、別の層が網膜色素上皮細胞を含有し、さらなる層が種々の神経細胞を含有し、組成物の厚さがほぼ再生を必要とする組織の厚さである、ということが本明細書において企図されている。
【０１２０】
天然組織ファイバー
本明細書において企図されている天然組織ファイバーの例としては、限定するものではないが、α−エラスチン、トロポエラスチン等のエラスチン、いずれかの型のコラーゲン、マトリゲル、ゲルトレックス（geltrex）、ラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−
リジンが挙げられる。
【０１２１】
酵素
本発明での使用に好適な酵素の例としては、限定するものではないが、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミロース、有機リン酸デヒドロゲナーゼ、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラッカーゼ等が挙げられる。
【０１２２】
細胞に影響を与え相互に作用する物質
プルモルファミン、アクチビンＡ、タウリンおよびレチノイン酸等の物質、ならびに線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３を含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ベバシズマブ（アバスチン（商標））等の抗ＶＥＧＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、インスリン様増殖因子、骨形成増殖因子、骨形成様タンパク質、ＭＴＡ（ミネラルトリオキサイドアグリゲート）、トランスフォーミング増殖因子、神経成長因子および当技術分野において公知の関連するタンパク質が本明細書において企図されている。
【０１２３】
麻酔剤
本明細書において企図されている麻酔剤としては、限定するものではないが、リドカイン、アルチカイン、プリロカイン、テトラカイン、ブピバカインおよびロピバカインが挙げられる。
【０１２４】
厚さ
ナノウェビング加工に長くかかるほど、またギプスまたは模型に積層されるナノファイバーが多ければ多いほど、ウェビングは厚くなる。１種または複数のさらなるバイオポリマー、１種または複数の材料および１種または複数の物質は、ナノファイバーウェビングの塗布により同時的または逐次的に模型またはギプスに塗布することができる。
【０１２５】
好ましい実施形態においては、完全に形成された３Ｄナノファイバーウェビングは（他の材料および／または物質の有無にかかわらず）硬化プロセスを経、その結果組成物は、ギプスまたは模型から組成物を除去（例えば「剥離」）した後も組織の再生または修復を必要とする身体部位の形状または輪郭を維持するようになる。ナノファイバーは、化学的または物理的に硬化または重合することができる。あるいは重合は、歯科医でのポリマー充填物の光硬化と同様に光硬化を通じて誘発することができる。
【０１２６】
組成物の厚さは、治療を必要とする身体部位の変形や異常によって異なる。通常、組成物の厚さは約５μｍ〜約４ｍｍである。別の実施形態においては、厚さは少なくとも１００ｎｍで上限はなくてもよい。
【０１２７】
ナノファイバー径の厚さ（層の径や厚さではなくナノファイバー径）は約１０ｎｍ〜約２０００ｎｍであってもよい。別の実施形態においては、組成物中のファイバーの厚さは約１００ｎｍ〜約１００μｍであってもよい（マクロファイバー径、層の径や厚さではない）。得られる組成物（層）の全体の厚さは５μｍより厚くてもよい。膜の厚さは皮膚または他の臓器の厚さと一致することが可能であり、かつ１．４〜４．０ｍｍであることが可能であり、またはそれより厚くてもよく天然器官の他の厚さに達してもよい。
【０１２８】
材料
組成物のいずれかの層に添加される任意の合成または天然由来物質を含む組成物には、任意の材料を添加することができる。材料は、（ａ）組成物の構造をより強固またはより柔軟にする、（ｂ）分子または細胞を３Ｄナノファイバーウェビング内に取り込む、（ｃ）３Ｄナノファイバーウェビング内に存在する１種または複数の剤を分解から保護する、もしくは分解を遅らせる、かつ／または（ｄ）１種または複数の剤を活性化させる、もしくは阻害するのに有用となることが企図されている。材料はゲル、気体、クリーム、軟膏または固体であってもよく、また有機材料でも無機材料でもよい。本明細書において企図されているが、材料としては、限定するものではないが、鉱物、セラミック、ナノダイヤモンド、結晶、非晶質鉱物およびヒドロキシアパタイト、フッ素リン灰石、リン酸三カルシウム、骨のためのリン酸カルシウムならびに硬（石灰化）組織が挙げられる。また、金
属、および金、銀、銅、亜鉛、スズ、白金、チタン、マグネシウム合金等の合金、Ｎａ、Ｃａ、Ｆ、Ｌｉ、Ｋ、Ｍｇ等のアルカリ金属、ならびにＣｌ、Ｂｒおよびヨウ素が本明細書において企図されている。具体的には、組成物は少なくとも１種の無機結晶性材料または非晶質鉱物様材料を含有してもよく、例としては限定するものではないが、フルオロアパタイト、（Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３（Ｆ、ＯＨ））、ヒドロキシアパタイト、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）および炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）がある。幹細胞を象牙質生成細胞にするためのＭＴＡ（ミネラルトリオキサイドアグリゲート）もまた、カルシトニンやビスホスホネートとともに本明細書において企図されている。
【０１２９】
組成物は、少なくとも１種の有機および無機ナノベシクル（ナノ粒子）を含有できる。これらのナノベシクルを用いて少なくとも１種の有機または無機の治療用物質を送達することができる。治療剤は、ナノベシクルおよび／またはナノ粒子の中に充填することもできるし、一時的または永久的化学結合（共有結合、極性共有結合、イオン結合、金属結合、水素結合）を形成することもできる。これらの有機および無機ナノベシクルの例としては、ミセル、高分子電解質カプセル、アルミノケイ酸塩、アルミノケイ酸塩ナノチューブ、シルクナノ粒子、クレイナノ粒子、自己組織化単層、シンターゼカプシド、またはペプチドを使用した積層技術により調製した自己組織化カプセル、タンパク質、ならびにポリマーおよび無機鉱物が可能である。積層カプセルの例としては、ナノウェビングに組み入れることができる、ドラッグデリバリーに使用するポリ（Ｌ−グルタミン酸）／キトサンマイクロカプセルがある。少なくとも１種の有機および無機ナノベシクル、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセルを含有する組成物は、ナノウェビング技術を用いた共エレクトロスピニングにより、または有針エレクトロスピニングと、ナノウェビング技術、エマルションエレクトロスピニング法、同軸エレクトロスピニング、またはこれらの技術の組合せとを組み合わせることにより調製することができる。
【０１３０】
使用
組成物に材料、物質およびバイオポリマーが存在するために、組成物は感染や熱損失から組織を適切に保護する能力を有する。また血液供給や真皮細胞の再生も可能になるが、提供者組織の成分がないので拒絶反応は起こさない。組成物は生分解性であるため、組成物によって送達されるいずれの細胞の増殖も天然皮膚の細胞と調和して進むことができ、これによって瘢痕や拘縮が防がれる。３Ｄナノファイバーウェビングを含むカスタマイズされた皮膚組織再生組成物の使用は、組織の再生または修復を必要とするいずれの身体部位にも適用できる。本明細書において企図されているが、組成物の使用は皮膚奇形や異常を治療するためであってもよい。異常には、糖尿病性足部潰瘍等の慢性創傷が含まれ得る。組成物を用いて、（例えば幹細胞を有する）パッチまたは膜として組成物を眼の後方（すなわち網膜、ＢＭ、視神経）に適用することにより黄斑変性を治療することができる。図１０を参照されたい。
【０１３１】
表面および形状
本発明は、三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングを含むカスタマイズされた組織再生組成物を提供する。組成物の表面は多孔性であっても不浸透性であってもよい。組成物の形状は、組織の再生または修復を必要とする身体部位に合わせられるいずれの形状でもよい。
【０１３２】
ポリマー
本発明で使用するための３Ｄナノファイバーウェビングを形成するために使用することができるポリマーとしては、合成および天然ポリマーが挙げられる。合成ポリマーの例としては、限定するものではないが、ナイロン４，６（ＰＡ−４，６）、ナイロン６（ＰＡ−６）、ナイロン６，６（ＰＡ−６，６）、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド−６（ＰＡ）、ポリ（ベンズイミダゾール）（ＰＢＩ）、ポリカーボネート、ポ
リカーボネートビスフェノール−Ａ、ポリ（エーテルイミド）（ＰＥＩ）、ポリ（エチルオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポリスルホンビスフェノールＡ、ポリ（トリメチレンテレフタレート）、ポリ（ウレタン）（ＰＵ）、ポリ（ウレタンウレア）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルカルバゾール）（ＰＶＫ）、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ）、ポリ（フッ化ビニリデン−コ−ヘキサフルオロプロピレン）（ＰＶＤＦ−ＨＦＰ）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）（ＰＥＶＡ）、ポリ（メタクリレート）（ＰＭＭＡ）およびポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）が挙げられる。合成または天然ポリマーは生分解性ポリマーでもよい。合成生分解性ポリマーとしては、限定するものではないが、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（グリコリド）（ＰＧＬ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（ラクチド−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ならびにグリコリド、ラクチド（Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ε−カプロラクトン、ポリ（グリセロールセバテート（sebatate））（ＰＧＳ）、酢酸セルロース、ポリホスファジン、ポリ無水物およびポリオルトエステルのいずれかのホモポリマーおよびコポリマーが挙げられる。天然ポリマーは本明細書において企図されており、タンパク質、脂質および／または多糖類を含む。天然生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（アミノ酸）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリアニリン、ラミニン、小麦グルテン、絹、フィブリン、フィブリノゲン、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンまたは当業者に公知のいずれかの型もしくは亜型のコラーゲン、カゼインおよびエラスチン、ならびに例えば、キトサン、ゼラチン、デンプン、酢酸セルロースや、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンより選択される多糖類より選択されるタンパク質が挙げられる。上記の天然および合成ポリマーの混合物またはブレンドは、本発明の組成物の形成において使用してもよい。組成物は絹等のポリマーを含んでいなくてもよい、ということもまた企図されている。
【０１３３】
生分解性ポリマーが、Ｉ型コラーゲンおよび／もしくはラミニンおよび／もしくはマトリゲルおよび／もしくはゲルトレックス等のタンパク質または他の治療剤であるかまたはそれらを含有する／でありかつそれらを含有する、種々の好ましい実施形態について以下に考察する。
【０１３４】
Ｉ型コラーゲンは天然細胞外マトリックスの主要構成成分である。その天然起源、非免疫原性、生体適合性および細胞接着や細胞移動におけるその役割ゆえに、Ｉ型コラーゲンは細胞外マトリックスの主成分として重要な役割を果たしている。Ｉ型コラーゲンは、ＢｉｏＧｉｄｅ等の生体膜の設計において幅広い用途がある。
【０１３５】
ある特定の実施形態においては、コラーゲンおよびＰＬＧＡ膜を、様々な組成（０％コラーゲン：１００％ＰＬＧＡ、２５％コラーゲン：７５％ＰＬＧＡ、５０％コラーゲン：５０％ＰＬＧＡ、７５％コラーゲン：２５％ＰＬＧＡ、１００％コラーゲン：０％ＰＬＧＡ、および他の濃度）で厚さ４０μｍ以上でエレクトロスピニングしたところ、架橋して最終組成物の少なくとも１つの層を形成した。
【０１３６】
ある特定の実施形態においては、本発明の生体内分解性ポリマー含有層内のＩ型コラーゲンを架橋させ、その結果層の分解速度および溶解度を低下させる。分解速度を制御することが、結果として組成物に組み込まれた治療剤の放出を制御することになる。
【０１３７】
ある特定の実施形態においては、コラーゲンとゼラチンとを含有する層を架橋させ、ゼ
ロ長架橋剤であるＮ，Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）により表面修飾する。ＥＤＣ：ＮＨＳの比が５：１であるＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）を架橋プロセスに加えて架橋の効率を上げる。架橋においては、ゲニピン、アルデヒド（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリセルアルデヒド）、ポリエポキシド、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびイソシアネート等の他の剤をさらに用いてもよい。
【０１３８】
またゼロ長架橋を用い、レチノイン酸、ラミニンおよびコラーゲン等の、反応性基（例えばカルボキシル基）を含有する治療剤を加えることにより、組成物の少なくとも１つの層を表面修飾した。架橋、カップリング、共役、環化付加反応等の「クリック」化学、例えばヒュスゲン１，３−双極環化付加反応、Ｃｕ（Ｉ）触媒アジド−アセチレン環化付加反応、ディールス・アルダー反応、歪みの小さい環（例えばエポキシ環やアジリジン環）への求核置換、尿素やアミドの形成、エポキシ化、ジヒドロキシル化等の二重結合への付加反応、ハロゲン化（例えば塩化または臭化）ベンジル基の求核置換および当該技術分野において公知でありかつ使用されている他のいずれかの活性化プロセスが本明細書において企図されている。再生または修復を必要とする組織への１種または複数の剤の送達を増進するあらゆる活性化プロセスが企図されている。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：顔型の調製
本発明の一態様においては、三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングを含むカスタマイズされた組織再生組成物の調製プロセスは、組織の修復または再生を必要とする身体部位の型の調製から始まる。
一例として、本発明者は、混凝紙を用いて顔の型を調製した。工程は以下の通りである。
・ワセリンの薄いコーティングで顔を覆った
・混凝紙をおよそ７×１５ｃｍの小片に切った
・メッシュ片を温水にサッと浸けてから顔の上に載せた
・メッシュ片を皮膚の上で優しくマッサージするようにして顔の形になるようにした
・混凝紙は３層重ねた
・２０分間型を乾燥させてから顔から型をゆっくりと引き離した
・２部の水と３部の石膏の混合物を調製することによりギプスを調製した
・石膏を撹拌器を用いて混合した
・次いで混合物をゆっくりと型に流し込んだ
・ギプスを２４時間乾燥させた
・一旦石膏を取り付け、型から離して１８０℃のオーブンに３０分間入れた
図１は顔型の調製工程を表した図である。
【０１４０】
実施例２：ナノファイバーのスピニングプロセス
次の工程では、３Ｄナノファイバーウェビングを顔のギプスに適用する。ナノファイバーをスピンしてウェブ状にする。スピニング（またはエレクトロスピニング）は、ＮＳ Ｌａｂ ２００ｓ（Ｎａｎｏ−ｓｐｉｄｅｒ（登録商標））等の無針装置により達成する。プロセスを開始するために、以下の工程を行った：
・ポリマー溶液は換気フードの中で調製しなければならない
・ポリマー用の適切な溶媒を選択してから、種々の濃度のポリマー溶液を調製することができる（溶液濃度のナノファイバーの形態への影響を調査するため）。溶媒は、いずれかの無機もしくは有機溶液、または溶媒の組合せであってもよい。
・ポリマーの溶解を促進するため、以下の装置の少なくとも１つを使用する：マグネチックスターラー、振盪機または超音波処理器。
・バイアルには、ポリマーの名前、使用した溶媒（１種または複数）中の濃度および日付
のラベルを貼っておくべきである。
・ポリマーが完全に溶解したならば、ポリマー溶液特性を調査して記録すべきである。
・蒸気をわずかでも吸入してしまうことを避けるため、溶液は密閉瓶内のスピニングチャンバに移しておくべきである
・集電極を取り付け、５．５〜８ｍｍ^２の銅線を用いてコレクターを接地する
・コレクターの高さを調整する
・スピン電極の軸端をギアホルダーに挿入することによりスピン電極（ワイヤスピン電極、シリンダースピン電極、スパイクスピン電極）をスピニングタブに挿入する
・スピニングタブをスピニングトレーに装填する
・スピニングトレーの内側に向けてロックスリットを回転させることによりスピニングタブをロックする
・スピニングタブ内にポリマー溶液を注ぐ（溶液をタブに注ぐ前にスプーンで溶液を混合する）
・ギアホルダーの上に高電圧シールドを載せる
・スピニングチャンバの正面扉を閉めてロックする
・電源につないでＮＳ Ｌａｂ２００Ｓを作動させる
・正面扉の下にある主スイッチを押す。「吸込ファン」というパイロット・ランプ（緑色光）が点灯し、換気ファンが運転中であることが示される。
・開始ボタンスイッチ（緑色）を押す。「供給電圧」というパイロット・ランプが点灯し、電気部品が接続されていることが示される。
・安全ロック（青色）ボタンを押す
・スイッチ（黒色の二位置選択器）をオンの位置にひねりライトを点灯する
・電極回転を開始させ、回転の設定を行う（エレクトロスピニングパラメータに従って回転の速度を設定しなければならない）
・電圧ダイヤル式電位差計（Voltage Dial Potentiometer）で出力電圧をゼロに設定する・電流ダイヤル式電位差計（Current Dial Potentiometer）で出力電流を最大値である「１０」に設定する
・全パラメータを設定したら、ブラックパワーロッカー（Black Power Rocker）を用いて電源装置のスイッチを入れる
・赤い高電圧スイッチを押して高電圧の発生を可能にする
【０１４１】
上記の工程が完了した後は、以下の工程により電圧を調整する必要がある。
・赤が押されたら高電圧が発生する
・電圧電位差計を用い、印加電圧を徐々に挙げてナノファイバーが現れ始める値にする
・ナノファイバーの形成を確認するもう１つの方法は電流の変化を確認することであり、電流が０．００１〜０．００２ｍＡを超えると２電極間の質量移動が始まる。
・ナノファイバー形成が不十分のようであれば印加電圧を上げてもよい
・最良のナノファイバーを得るためには、様々な電圧で溶液をエレクトロスピニングし、走査型電子顕微鏡でファイバーの形態と径にアクセスする必要がある。
【０１４２】
上記の工程が完了した後は、以下の工程により操作を停止する必要がある。
・赤い高電圧スイッチを押して高電圧の発生をできなくする
・ブラックパワーロッカーを用いて電源装置のスイッチを切る
・電圧ダイヤル式電位差計で出力電圧をゼロに設定する
・電極回転を停止する
・スイッチ（黒色の二位置選択器）をオフの位置にひねりライトを消す
・停止ボタンスイッチ（赤色）を押す
・スピニングチャンバにアクセスするために、正面扉のロックを解く
・接地棒を用いてチャンバ内の全ての残留電荷を除去する
・正面扉の下にある主スイッチを切る
・機械のプラグを抜く
【０１４３】
実施例３：顔ギプスによるナノウェビング加工
実施例１に記載の顔のインプレッションギプス（焼石膏）を実施例２に記載のようにナノファイバー加工にかけた。詳細は以下の通りである。
ギプスを、Ｎａｎｏ−Ｓｐｉｄｅｒの機械の中のワイヤーで接地したコレクターの上に置いた。両面テープでギプスをコレクターに固定した。次に、８％ゼラチンをナノウェビング機のタブに注いだ。この操作にはウェビング電極、特にパイク電極を用いたが、シリンダー電極、ワイヤー電極を用いてもよい。操作を開始し、最適化した。電極間距離を２１ｃｍに設定した時に最良の操作パラメータが８０ｋＶであることがわかった。スピン電極を１５Ｈｚに設定した。テイラーコーンの形成（図２、左パネルに見ることができる）は、３５ｋＶでのプロセスの開始を示している。
【０１４４】
十分な厚さを達成した後でナノウェビング加工を停止し、得られた組成物（図３Ａ参照）をギプスから剥がすように取り除いた。膜の形態の組成物も製造した（図３Ｂおよび３Ｃを参照のこと）。
【０１４５】
実施例４：膜の生体適合性試験
膜の形態の組成物を数個、別々のバイオポリマーをナノウェビング化することにより製造した。試験したバイオポリマーは、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ゼラチンおよびポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）である。製造工程は各ポリマーとも同じである。代表的な例としては、ＰＬＧＡのナノウェビング化により製造した膜のプロセスは下記の通りである。具体的には、
・ＰＬＧＡ（８５／１５：Ｌ−ラクチド／グリコリドコポリマー（モル比）（Ｐｕｒａｓｏｒｂ ＰＬＧ８５３１、ピューラック社（Purac）、オランダ））ポリマー溶液を換気
フード内で調製した
・ＰＬＧＡを１２グラム量り取り、２００ｍＬガラス瓶に注いだ
・２，２，２−トリフルオロエタノール（ＡＣＲ１３９７５５０００、サーモフィッシャー社（ThermoFisher）、米国）を１８８グラム量り取り、ＰＬＧＡを含む２００ｍＬガラス瓶に直接注いだ
・１５ｍｍの磁性ロッドを瓶の中に入れた
・瓶の蓋をしてパラフィンフィルムで密封した
・次いで瓶にラベルを貼って日付を記入した
・ＰＬＧＡと溶媒を含有する瓶マグネチックスターラーの上に置き、ポリマーが十分に溶解するまで溶液を５００ｒｐｍで４時間攪拌した
・４０ｍＬの７０％ｖ／ｖ酢酸（７０ｍＬの氷酢酸（Ａ９９６７、シグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich）、米国）と３０ｍＬの脱イオン水の混合により事前に調製）を溶液に
加えた。
・瓶を閉めて再度密封し、一晩攪拌した
・溶液をスピニングチャンバに移した
・集電極のねじを外してスピニングチャンバから引き離した。
■電極距離ボタンを用いて集電極を下げた
■電極の上部の４つのボルトを緩めた
■コレクター（例えば模型またはギプス）コレクターのプラットフォーム上に置いて銅線で固定した
・次いでコレクターを５．５〜８ｍｍ^２の銅線で接地した
・機械の後方に設置された電極距離ボタンを用いてコレクターの高さを調整した
・次いで、スピン電極の軸端をギアホルダーに挿入することによりワイヤスピン電極をスピニングタブに入れた
・次いでスピニングタブをスピニングトレーに装填した
・次いで、スピニングトレーの内側に向けてロックスリットを回転させることによりスピニングタブをトレーの中にロックした
・次いでポリマー溶液をスプーンで混合した後、スピニングタブに注いだ
・高電圧シールドをギアホルダーの上に載せた
・次いでスピニングチャンバの正面扉を閉め、２個のＤＩＲＡＫロックでロックした。
・ＮＳ Ｌａｂ２００Ｓの機械を電源につないだ
・正面扉の下にある主スイッチで機械を作動させた。「吸込ファン」というパイロット・ランプ（緑色光）が点灯し、換気ファンが運転中であることが示された。
・開始ボタンスイッチ（緑色）を押した。「供給電圧」というパイロット・ランプが点灯し、電気部品が接続されていることが示された。
・安全ロック（青色）ボタンを押した
・スイッチ（黒色の二位置選択器）をオンの位置にひねりチャンバのライトを点灯した
・電極回転を開始させ、回転を８ｒｐｍに設定した
・電圧ダイヤル式電位差計で出力電圧をゼロに設定した
・電流ダイヤル式電位差計で出力電流を最大値である「１０」に設定した
・全パラメータを設定したら、ブラックパワーロッカーを用いて電源装置をオンにした
・赤い高電圧スイッチを押して高電圧の発生を可能にした
・電圧をゆっくりと５０ｋＶに上げた
・ナノファイバーを５分間回収し、次いで１０分間空気乾燥させた。
・銅線を緩めてコレクターを裏返した
・銅線をきつく締めて接地を確認した
・スピニングを再開した
・十分な厚みのエレクトロスピニングしたナノファイバーの層がコレクター全体を覆うまで上記の工程を繰り返した
【０１４６】
カバーグラスおよびＢｉｏｇｉｄｅ（市販の臨床的に承認されたコラーゲン膜；ガイストリッヒ（Geistlich）社、ウォルフーゼン、スイス）をコントロールとした。
膜とコントロールとにヒト間葉系幹細胞を播種し、増殖および細胞生存を当業者に公知の標準的ＷＳＴアッセイで試験した。
８日間の培養後、ＰＬＧＡ膜はコントロールよりも有意に良好な細胞増殖および細胞生存を示した（図４Ａ（ヒストグラム）および図４Ｂ（顕微鏡写真）参照）。本発明者らのＰＣＬ膜はコントロールと同程度であった。ゼラチン膜の成績は、８日間の培養後も依然として細胞が活動的であったため、中程度ではあるが許容可能であった。
【０１４７】
実施例５：ナノ織ゼラチン膜の分解速度
代用顔の膜は長期間にわたって生分解性であるべきであるが、そうあることで天然組織が取って代わることができ、またファイバーが分解することによってできる空間内に増殖することができる。
サンプルを３７℃で２１日間ＰＢＳに浸漬した。質量損失率を計算することにより分解速度を７日置きに測定した。３０％、５０％、７０％、９０％および１００％エタノールを用いてサンプルを脱水し、次いで１時間空気乾燥させてから計量した（２１日間）。次式を用いて質量損失率を測定した［Kim et. al. (2009)］。
質量損失（％）＝［（Ｗ０−Ｗｔ）／Ｗ０］×１００
Ｗ０＝初期質量（ｇ）
Ｗｔ＝時間ｔにおけるサンプルの質量（ｇ）
【０１４８】
図５に示すように、ゼラチンの代用顔の膜は、数週間、具体的には２１日間の経過に伴って天然組織に取って代わることが可能になる分解パターンを有する。
【０１４９】
実施例６：表面修飾
以下に示す式を用い、反応性カルボキシル基を持つ選択したいくつかのバイオポリマーを、薬、サイトカインおよび増殖因子で表面修飾した。第１の工程として、作製後のポリマーを量り取り１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有するエタノールに浸漬した。
【０１５０】
以下の式を用いて、架橋および表面修飾に必要とされるＥＤＣおよび／またはＮＨＳの量を算出する。
ポリマーの質量＝膜の質量×ポリマーの組成
ポリマーのモル数＝ポリマーの質量／分子量
反応性側鎖のモル数（ｎ（Ｒｅ））＝ポリマーのモル数×各分子中のＲｅの数
必要とされるｎ（ＥＤＣ）＝ｎ（Ｒｅ）×１０
必要とされるｎ（ＮＨＳ）＝２（Ｒｅ）
必要とされるｎ（薬）＝ｎ（Ｒｅ）×治療レベル
質量（ＥＤＣ）＝ｎ（ＥＤＣ）×Ｍｗ（ＥＤＣ）
質量（ＮＨＳ）＝ｎ（ＮＨＳ）×Ｍｗ（ＮＨＳ）
質量（治療薬）＝ｎ（薬）×Ｍｗ（薬）
【０１５１】
必要とされる架橋度によっても異なるが、膜を２４時間架橋させる。上記の式は、ラミニン、コラーゲンおよびカルシトニン等の少なくとも１種の治療用物質を加えることが可能なナノファイバーの表面修飾にも当てはまる。
【０１５２】
実施例７：コラーゲンおよびＰＬＧＡの組成物を含有する層の調製
溶媒として１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）を用いて、６％ＰＬＧＡ溶液を調製した。同じ溶媒ＨＦＩＰを用いて６％コラーゲン溶液を調製した。両溶液を３０分間超音波処理した後で、一晩マグネチックスターラー上に放置した。コラーゲンとＰＬＧＡが完全に溶解したら、それらを様々な濃度（０％コラーゲン：１００％ＰＬＧＡ；２５％コラーゲン：７５％ＰＬＧＡ（１：３）；５０％コラーゲン：５０％ＰＬＧＡ（１：１）；７５％コラーゲン：２５％ＰＬＧＡ（３：１）；１００％コラーゲン：０％ＰＬＧＡ、および他の濃度）で混合した。ナノウェビング技術を用いて溶液をスピニングした。パイクスピン電極に５ｋＶを印加した。スピン電極から１５ｃｍ離れた場所にある集電極上に置かれたアルミホイル上でナノウェブを回収した。２５回繰り返した各回において、４０μｍＬの溶液をスピニングし、十分な厚さの層を得た。
【０１５３】
次いで膜を７０％エタノールおよび２倍強度のアンチマイシン−抗生物質溶液で殺菌し、ＰＢＳで洗浄してからヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を播種した。
膜およびコントロールにｈＭＳＣを播種し、増殖および細胞生存を当業者に公知の標準的ＷＳＴアッセイで試験した。
１日目、３日目、６日目および８日目に細胞増殖および細胞生存を試験した。８日間の培養後、コラーゲン：ＰＬＧＡ（３：１）膜はコントロールよりも良好な細胞増殖および細胞生存を示した（図６参照）。
【０１５４】
実施例８：臨床グレードのエレクトロスピニング法
これらの研究は、本発明の組成物を製造するための臨床グレードのエレクトロスピニング法の応用に関する。
新規な臨床グレードのエレクトロスピニング法では、合成または天然バイオポリマーナノファイバーからなる三次元（３Ｄ）ナノ構造生体材料を得ることができる。かかる先端材料は天然細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を正確に模倣できる可能性があり、また再生療法における最適な幹細胞接着および個々の細胞ホーミングのための、細胞内規模の優れたニッチ様空隙を形成し得る。これらの研究の目的は、再生医療用の先端ヘルスケア材料の
製造のための適正製造基準（ＧＭＰ）を満たすように厳しく管理して、独特の無針マルチジェットエレクトロスピニング法により天然のメッシュ様３Ｄ構造を有するいくつかの新規なナノファイバー細胞外マトリックス（ＮＦ−ＥＣＭ）を設計すること、およびこれらの上でのヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）の細胞挙動を試験することである。
【０１５５】
１．材料および方法
１．１．ポリマーおよびコポリマー溶液の調製
２種類の合成生分解性ポリマーをこれらの研究用に選んだ：１つ目は、Ｌ−ラクチド：グリコリドのモル比が８５：１５のポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）（ピューラック・バイオケム社（Purac Biochem）、オランダ、より購入）、２つ目は、
ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ；シグマ社（Sigma）製、米国ミズーリ州）。さらに、
２種類の天然バイオポリマー、ウシＩ型コラーゲン（シグマ社、米国ミズーリ州、ロット番号０７８ｋ７０１６Ｖ、Ｐコード１００１１１６８７０、BornsteinとTraubのプロトコルを用いてコウシ皮より抽出）およびウシゼラチン（シグマ社、米国ミズーリ州）を選択した。ポリマーを、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ；サーモフィッシャー社、オーストラリア、ヴィクトリア州）に１０％ｗｔ／ｖの濃度で溶解させた。コラーゲンの解離を促進するため、超音波処理を３０分間行った。合成および天然バイオポリマー（ＰＬＧＡ：コラーゲン、ＰＬＧＡ：ゼラチン、ＰＣＬ：コラーゲンまたはＰＣＬ：ゼラチン）のコポリマー溶液を調製するため、各ポリマーを別々にＨＦＩＰに溶解させた後、適切な比率で合わせた（３：１、１：１または１：３）。調製の直後に、ポリマー溶液をエレクトロスピニングして新規な３Ｄ構造ナノファイバーＥＣＭ（ＮＦ−ＥＣＭ）を作成するか、またはポリマー溶液をフィルム流延して同じ材料の２Ｄ表面（２Ｄコントロール）を誘導した。
【０１５６】
１．２．３ＤナノファイバーＥＣＭ（ＮＦ−ＥＣＭ）の無針マルチジェットエレクトロスピニング
バイオポリマーから本発明者らの３ＤＮＦ−ＥＣＭを作製するために、元々はナノスケールの織物メッシュの管理されたエレクトロスピニング用に設計された新規な産業用装置である、ＮａｎｏＳｐｉｄｅｒ ＮＳ２００（エルマルコ社（Elmarco）、チェコ共和国
リベレツ）を準備した。図１３ａは、１８℃に設定された、陽圧をかけた通風クリーンルームに設置したＮａｎｏＳｐｉｄｅｒ（商標）を示している。クリーンルーム条件とすることで臨床グレードかつＧＭＰ遵守の製造環境となる。図１３ｂは、ナノファイバーのマルチジェットスプレー（図１３ｃ）を可能にするこの自由表面無針エレクトロスピニング装置の構成を示している。最初に、ポリマー溶液をパイクスピン電極（ＳＥ）（図１３ｄ）を用いてエレクトロスピニングした。パイクＳＥを用いて、溶液がランダムな３Ｄ構造にエレクトロスピニング可能かをテストし、また処理パラメータを最適化した。パイク電極の先端は、４０μｌのポリマー溶液が置かれた円錐形の開口部からなる。次いでＮａｎｏＳｐｉｄｅｒ（商標）チャンバを閉めて施錠したが、陰圧チャンバであると、溶媒の迅速な蒸発および排気が可能である。印加電圧、電極間距離およびポリマー溶液濃度等の様々な処理パラメータを変更、かつ最適化し、ファイバー径の同じナノファイバーを作製した。スピン電極と集電極との距離は２１０ｍｍとした。印加電圧を２０ｋＶから３５ｋＶに変更し、全ポリマーについて径の同じナノファイバーを得た。エレクトロスピニングを十分長く行って、肉眼で見える厚さ２０±４μｍのメッシュ膜を形成するＮＦ−ＥＣＭを作製した。
【０１５７】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いてナノファイバーの特徴付けを行った。ＮＦ−ＥＣＭから撮ったＳＥＭ像をＩｍａｇｅＪ（米国国立精神保健研究所、米国メリーランド州ベセズダ）を用いて解析し、その形態、ナノファイバー径および充填密度を調べた。３０本のファイバーの径を測定して平均ファイバー径を算出した。均一性（ファイバー径の偏差）を計算するために、ランダムな１２０本のファイバーを測定して標準偏差を計算し、平
均で割って百分率で表した。充填密度は百分率で表したが、画像の端から端までのファイバーの数を数え、その平均ファイバー径を掛け、次に画像の長さ（１１７μｍ）で割って算出した。下記実施例１０を参照されたい。
【０１５８】
１．３．２Ｄコントロールのためのフィルム流延
３ＤＮＦ−ＥＣＭの誘導に使用した同じバイオポリマーをさらに、ナノファイバー構造を持たない平坦な２Ｄフィルム状に流延した。フィルムは全て、ポリマー溶液をガラス表面上に直接注ぐことによって調製し、溶液の延展をより一層確実にするために振盪機の上に置いた。クリーンルーム環境と同様の条件を設けた。フィルムを２４時間空気乾燥させてから室温にてデシケーター内で保存した。このポリマーフィルムは、ＨＭＳＣのコロニー形成用の２Ｄ表面を得る際にコントロールとなった。
【０１５９】
１．４．臨床的に承認されたコントロールとしてのコラーゲン膜（ＣＣＭ）
ＢｉｏＧｉｄｅ（登録商標）膜（ガイストリッヒバイオマテリアルズ社（Geistlich Biomaterials）、ウォルフーゼン、スイス）をさらなるコントロール（ＣＣＭ）とした。ＣＣＭは、ブタＥＣＭ由来の３ＤマイクロファイバーＩ型コラーゲン膜であり、臨床グレードの条件下で製造される。これらの膜は臨床的に承認され、かつ口腔インプラント術や歯周療法術での使用に市販されているため、またその３Ｄ構造やマイクロファイバー構造のため、ＣＣＭを本発明者らの３ＤＮＦ−ＥＣＭ用の基準コントロールとして選択した。ＣＣＭは、滅菌臨床パッケージ中の３０×４０ｍｍの膜として購入した。
【０１６０】
１．５．ナノファイバー架橋
純粋コラーゲン、純粋ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭおよびフィルム、ならびにコラーゲンまたはゼラチンを含有する全コポリマーのＮＦ−ＥＣＭを、作製直後に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）（サーモフィッシャー社、オーストラリア、ヴィクトリア州）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）（サーモフィッシャー社、オーストラリア、ヴィクトリア州）架橋試薬を用いて架橋させた。ゼラチンとコラーゲンとの架橋を確実に完了させるために、ＥＤＣおよびＮＨＳを０．２のＮＨＳ／ＥＤＣモル比にて加えた。膜を、２４時間振盪させながら室温で架橋させた。
【０１６１】
１．６．機械的試験
機械的試験を行ってＮＦ−ＥＣＭ、フィルムおよびＣＣＭの生物物理学的特性を評価した。５０Ｎの充填細胞を備えたシングルカラム卓上汎用試験システム（インストロン社（Instron）、オーストラリア、ヴィクトリア州）を用いてＮＦ−ＥＣＭ、フィルムおよび
ＣＣＭの、ヤング率、最大引張応力およびひずみを測定した。ＮＦ−ＥＣＭ、フィルムおよびＣＣＭを、１０×４０ｍｍのサンプルにカットした。ゲージ開口部は２０ｍｍに設定した。最大引張応力にもよるが、測定のスピードは、最大ひずみ１００％未満および最大ひずみ１０００％未満のサンプルに対して、それぞれ２ｍｍ／分または２０ｍｍ／分に設定した。サンプルの厚さをマイクロメータ（株式会社ミツトヨ、神奈川県、日本）で測定した。全体としては、測定を５回繰り返し、Ｂｌｕｅｈｉｌｌ（登録商標）ソフトウェア（インストロン社、オーストラリア、ヴィクトリア州）で解析した。
【０１６２】
１．７．水接触角
ゴニオメーター（フューチャー・デジタル・サイエンティフィック社（Future Digital
Scientific Corp）、米国ニューヨーク州）を用いて水接触角を求めてＮＦ−ＥＣＭ、２ＤフィルムおよびＣＣＭの疎水性を評価した。ＮＦ−ＥＣＭ、フィルムおよびＣＣＭを１５×１５ｍｍのサンプルにカットし、スライドガラス上に固定した。全体としては、各サンプルにつき３回繰り返した。
【０１６３】
１．８．フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）
架橋および非架橋の、コラーゲン、ゼラチンおよびＮＦ−ＥＣＭとそのポリマー粉末との組合せ、ならびにＣＣＭのＦＴＩＲスペクトルをＦＴＩＲ分光計（ブルカー・オプティクス社（Bruker Optic）、ドイツ、バーデン−ヴュルテンベルク州）で記録し、ＯＰＵＳ６．５ソフトウェア（ブルカー・オプティクス社、ドイツ、バーデン−ヴュルテンベルク州）で解析した。試験したポリマーの指紋領域を解析して、膜内のゼラチンおよびコラーゲンポリマーの具体的な特徴付けに使用した。
【０１６４】
１．９．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
以下のサンプルを用いた：純粋コラーゲン粉末、無針エレクトロスピニングおよび有針エレクトロスピニングで作製した架橋および非架橋のコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭ、ＨＦＩＰ溶解コラーゲン（６０分間ＨＦＩＰに溶解させたがエレクトロスピニングはせず）、純粋ゼラチン粉末、ＨＦＩＰ溶解させたゼラチン、ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭおよび架橋ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭ。サンプルを、最終濃度１ｍｇ／ｍＬになるまで０．５Ｍ酢酸に溶解させた。一連のサンプルを、０．５Ｍ酢酸中０．１ｍｇ／ｍＬペプシンで２０分間消化させた。溶液を４℃、１３３３０ｇにて１５分間遠心し、上清を３〜１５％の１０ウェルゲル（バイオラッド社（Bio-Rad）、米国カリフォルニア州）に充填した。パワーパック（PowerPac）（商標）ＨＣ電源装置（バイオラッド社、米国カリフォルニア州）でゲルに１
００Ｖを供給し、２時間運転させた。タンパク質バンドをシンプリーブルーセーフステイン（SimplyBlue safestain）（商標）（インビトロジェン社（Invitrogen）、米国ニューヨーク州）で可視化し、Ｄ５１００デジタルカメラ（ニコン、タイ）で画像を撮影した。ＣＣＭは０．５Ｍ酢酸に溶解せず、またペプシンで消化されなかったため、ＣＣＭのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を達成することは不可能であった。
【０１６５】
１．１０．骨髄由来のヒト間葉系幹細胞（ＨＭＳＣ）の単離、培養および特徴付け
試験したＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスおよびＣＣＭの生物学的特性を評価するために、２１歳男性のヒト骨髄からＨＭＳＣを採取した。本研究は、ボンド大学（オーストラリア、クイーンズランド州、倫理承認番号ＲＯ１３３３）およびクリスティアン・アルブレヒト大学キール医学部（キール、ドイツ、倫理承認番号ＡＺ４０２／０７）の倫理委員会によって承認された。ＨＭＳＣの単離および培養を行った。マルチパラメータフローサイトメトリーおよびインビトロでの分化アッセイを用いてこれらの細胞を特徴付けた。
【０１６６】
１．１１．膜の調製および滅菌
ＮＦ−ＥＣＭ、コントロールフィルムおよびＣＣＭを１５×１５ｍｍのサンプルにカットして、ＣｅｌｌＣｒｏｗｎ２４（スキャフデックス社（Scaffdex）、フィンランド、ピルカンマー県（Pirkanama））の上に載置した後、２４ウェルプレートに入れた。カバー
グラスコントロール（サーモフィッシャー社、オーストラリア、ヴィクトリア州）も２４ウェルプレートに入れた。載置したサンプルおよびカバーグラスコントロールを、２５ｋＧｙのガンマ線照射で滅菌した。
【０１６７】
簡単に述べると、ＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスおよびＣＣＭを１ｍＬのＰＢＳですすいだ後、３７℃で一晩αＭＥＭに浸漬した。５０μＬの完全培地（αＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％Ｐ／Ｓ、２．２ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム）中の合計で１×１０^４個（３代継代）のＨＭＳＣを、それぞれの膜／ＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスまたはＣＣＭの上にピペットで移した。細胞を３０分間放置して接着させた後１ｍＬの新しい完全培地を添加し、必要になるまでインキュベートした（加湿インキュベーター、５％ＣＯ_２、３７℃）。
【０１６８】
１．１２．膜の生体適合性（ＷＳＴ−１アッセイ）
ＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスおよびＣＣＭに播種したＨＭＳＣの増殖を細胞生体適合性の基準として用い、ＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Roche Diagnosis）、ドイツ、マンハイム）で評価した。ＷＳＴ−１とは、細胞増殖や細胞
生存率を評価するための定量測色技術である。生存細胞内にてミトコンドリアデヒドロゲナーゼによってテトラゾリウム塩が開裂するとホルマザンが産生するが、この吸光度が４６０ｎｍで検出できる。
【０１６９】
各６回ずつ繰り返したＮＦ−ＥＣＭを、播種後２日目、５日目および８日目に分析した。試験の日に、古い培地を１０％ＷＳＴ−１を含有する１ｍｌの新しいＨＭＳＣ培地と取り換え、９０分間インキュベートした。次いで１００μｌの培地を９６ウェルプレートに移し、４６０ｎｍの吸光度を分光光度計（ターナー・バイオシステムズ社（Turner Biosystem）、米国カリフォルニア州）で測定した。フィルムおよびカバーグラスをそれぞれコントロールとして用いたが、３Ｄマイクロファイバーの閉塞性な臨床的に承認されたコラーゲン膜Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）（ＣＣＭ）は臨床医学に関するコントロールとして用いた。
【０１７０】
１．１３．骨形成生体機能試験
マトリックスへの完全統合後にＨＭＳＣが分化できたかどうかを評価するために、骨形成生体機能分化試験を行った。ＨＭＳＣを、ＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスコントロールまたはＣＣＭ上にて、２×１０^４個の細胞で一晩培養した。これを６回繰り返した。細胞は、完全培地（コントロール）で１４日間維持するか、または骨形成培地（β−グリセロホスフェート１０ｍＭ、アスコルビン酸５０ｍｇ／Ｌおよびデキサメタゾン１００ｎＭ）を添加した。次いで細胞をアリザリンレッドまたはアルカリホスファターゼでで染色した。
【０１７１】
１．１４．アリザリンレッドおよびアルカリホスファターゼ染色
サンプルをＰＢＳで簡単にすすぎ、室温にて１０分間３．７％パラホルムアルデヒドで固定した後、蒸留水で洗浄した。アリザリンレッド（シグマ社、米国ミズーリ州）を用いて２０μｇ／ｍＬの濃度で５分間染色することによりカルシウム石灰化を評価した。余分なアリザリンレッドを複数回洗浄して除去した。ＡＬＰ活性を、ＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ錠剤（５−ブロモ−４−クロロ−４，３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）（シグマ社、米国ミズーリ州）を用いて測定した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ希釈標準溶液を、錠剤１個を１０ｍＬの蒸留水で希釈して調製した。１ｍＬの希釈標準溶液を各ウェルに加え、暗所で染色させた。サンプルが紫／青色を呈した直後に染色を停止した。背景染色を評価するため、無細胞膜もまた、非骨形成および骨形成条件にてアリザリン／ＡＬＰで染色した。次いでサンプルを蒸留水ですすぎ、Ｄ５１００デジタルカメラ（ニコン、タイ）で撮影した。ＩｍａｇｅＪ（米国国立精神保健研究所、米国メリーランド州ベセズダ）を用い、染色したウェルをウェルの最外径でカットし、図１８で使用した共用ファイルに並べて置いた状態でロードした。
【０１７２】
１．１５．ＳＥＭ検査
生体適合性アッセイに従って細胞に播種した。播種後２日目および８日目に、ＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスおよびＣＣＭ上のＨＭＳＣをＰＢＳ中３％グルタルアルデヒド溶液で３０分間固定し、続いてＰＢＳ中３０、５０、７０、９０および１００％エタノールで１０分間脱水し、次いでヘキサメチルジシラザンで２回すすぎ脱水を完了した。全サンプルをスパッタ金コーター（日本電子、東京、日本）でコーティングし、Ｎｅｏｓｃｏｐｅ走査型電子顕微鏡（日本電子、東京、日本）で検査した。
【０１７３】
１．１６．共焦点顕微鏡検査
生体適合性アッセイに従って細胞を調製した。播種後２日目に、ＮＦ−ＥＣＭ、フィル
ム、カバーグラスおよびＣＣＭに播種したＨＭＳＣをＰＢＳ中３．７％パラホルムアルデヒド溶液で１０分間固定した。サンプルを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ社、米国ミズーリ州）溶液で透過処理し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ溶液でブロックし、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（インビトロジェン社、米国ニューヨーク州）および１／４００ローダミンファロイジン（インビトロジェン社、米国ニューヨーク州）とともに６０分間インキュベートした。Ｎｉｋｏｎ Ｃ１共焦点顕微鏡（ニコン、東京、日本）で画像を撮影した。
【０１７４】
１．１７．統計
ＷＳＴ−１試験および機械的試験から収集したデータの有意差をスチューデントのｔ検定により評価し、ＬＳＤ事後解析（ＳＰＳＳ統計ヴァージョン１９、ＩＢＭ）により確認した。統計的有意性は次のように表した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
【０１７５】
２．結果
２．１．ナノファイバー膜の特徴付け
図１４は、ＮＦ−ＥＣＭ、フィルムおよびＣＣＭのＳＥＭ顕微鏡写真を示している。Ｎａｎｏｓｐｉｄｅｒ（登録商標）装置を用いた無針マルチジェットエレクトロスピニング法では、臨床グレードのＧＭＰと同等の構成においてナノファイバー網状膜を製造することが可能であった。ＮＦ−ＥＣＭは全てメッシュ様の外観であり、ニッチ様空隙を豊富に有する開放構造で接近し易いナノウェブを形成しているランダムな３Ｄ構造の数層のナノファイバーを有していた。いくつかのＮＦ−ＥＣＭでは、完全な細胞統合、すなわち「密閉」のための正確なサイズを有するニッチ様空隙が得られた（図１９と２０を比較されたい）。
【０１７６】
平均ファイバー径、ファイバー径の偏差および充填密度を、ＳＥＭ像を用いて測定した（実施例１０の表を参照のこと）。純粋ＮＦ−ＥＣＭの内、ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭのファイバーが最も厚く４４８±８１ｎｍであり、続いてコラーゲンが４２４±７８ｎｍ、ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭが３８８±９７、ＰＣＬのＮＦ−ＥＣＭのファイバーは平均径が３５４±５６ｎｍと最も薄かった。コポリマーのＮＦ−ＥＣＭは、特に傾向はなく種々の径を有していた。ＮＦ−ＥＣＭのファイバー径の偏差は、いずれの特定のＮＦ−ＥＣＭに関してもファイバー径の偏差３０％以下であった。純粋ＮＦ−ＥＣＭの内、ＰＣＬのＮＦ−ＥＣＭの充填密度が最も高く（５１．９±８．１％）、ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭ（３５．３±１５．８％）、ＰＬＧＡおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭ（それぞれ１７．３±３．１％および１４．０±１０．６％）と続く。コポリマーのＮＦ−ＥＣＭの充填密度は様々であった。
【０１７７】
フィルムでは、ＳＥＭ上は非多孔性かつ無ファイバーに見える２Ｄ表面が得られ、ＮＦ−ＥＣＭに見られるようなニッチ様空隙とは異なった（図１４）。ＣＣＭは、一様にナノスケールを超えた広範囲のファイバー径を有し、性質としてはマイクロファイバーのようであった。ファイバーは密着しており、より閉塞的なパターンを形成していた（図１４）。
【０１７８】
ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭおよびＰＬＧＡのフィルムのＡＦＭ画像（図１４）は、表面トポグラフィーの違いの例として示されている。ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭは深さ４μｍの３Ｄ構造であり、一方でＰＬＧＡのフィルムは特定の表面トポグラフィーを示しておらず、深さは５０ｎｍ未満である。
【０１７９】
図１５ａは、コラーゲン粉末およびＮＦ−ＥＣＭ中のゼラチンのＦＴＩＲスペクトルを示している。コラーゲンのＮＦ−ＥＣＭは、主ピークが１７１５ｃｍ^−１、１６２５ｃｍ
^−１、１４５０ｃｍ^−１、１２４０ｃｍ^−１および１１９５ｃｍ^−１と、純粋コラーゲン粉末と相似したＦＴＩＲ指紋スペクトルを示した。架橋したコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭは、非架橋コラーゲンのＮＦ−ＥＣＭやコラーゲン粉末に比べて１７１５ｃｍ^−１のピークが有意に低かった。ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭおよびＣＣＭは１７１５ｃｍ^−１のピークが無かった。架橋したゼラチンのＮＦ−ＥＣＭ、非架橋のゼラチンのＮＦ−ＥＣＭおよびゼラチン粉末は、互いに同一のスペクトルを有していた。純粋コラーゲン粉末およびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭのＦＴＩＲスペクトルは１２４０ｃｍ^−１のピークと１４５０ｃｍ^−１のピークとの比が大きいが、これはゼラチンやＣＣＭ、さらに架橋コラーゲンのＮＦ−ＥＣＭには見られなかった。この大きな比は、コラーゲン：ＰＬＧＡおよびコラーゲン：ＰＣＬコポリマーのＮＦ−ＥＣＭにも見られた。
【０１８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られた結果を図１５ｂに示す。コラーゲン粉末、ＨＦＩＰに溶解させたコラーゲン粉末、コラーゲンのＮＦ−ＥＣＭおよび０．５Ｍ酢酸に溶解させた架橋したコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭは、全てγ（Ｉ）−、β（Ｉ）−、α１（Ｉ）−およびα２（Ｉ）−バンドを示した。ペプシン消化の後、α１（Ｉ）−およびα２（Ｉ）−バンドは、架橋および非架橋のコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭにおいて完全に消化した。これらのバンドはＨＦＩＰ溶解コラーゲンでかすかに見ることができた。ゼラチンは、０．５Ｍ酢酸溶液中のγ（Ｉ）−およびβ（Ｉ）−バンドは全く示さず、またα１（Ｉ）−およびα２（Ｉ）−バンドはペプシンを加えると完全に消化した。
【０１８１】
ヤング率および最大引張応力は、フィルムの方がＮＦ−ＥＣＭよりも高かった（ｐ＜０．００１）（図１６）。ゼラチンのフィルムの引張応力およびヤング率が最も高く、それぞれ５０．１±４．１ＭＰａおよび２２１３±１４３ＭＰａであった（図１６（ａ）および（ｂ））。ゼラチンおよびＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭの引張応力（それぞれ６．３７±０．４６および４．７９±０．２８ＭＰａ）はＣＣＭ（５．４０±０．１６ＭＰａ）と同等であったが、コラーゲンおよびＰＣＬのＮＦ−ＥＣＭの引張応力は、それぞれ１０．８９±０．９１ＭＰａおよび９．４０±０．２７ＭＰａと有意に高かった（ｐ＜０．０１）。対照的に、エレクトロスピニングしたゼラチンのヤング率（２２１２±１４３ＭＰａ）はＣＣＭ（３４．８±２．３ＭＰａ）のほぼ５０倍以上（ｐ＜０．００１）であり、一方でコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭのヤング率はわずかに高かった（２１７．９２±１５．３０ＭＰａ）。ＰＬＧＡおよびＰＣＬのＮＦ−ＥＣＭのヤング率（５１．４±１．８０および３８．５±３．３０ＭＰａ）はＣＣＭと同等であった。最大引張ひずみは、ＰＬＧＡのフィルム（３．６５±０．４３％）に比べるとＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭ（５８．３±１．６０％）の方が有意に大きかったが、ＰＣＬとゼラチンに関しては同じ傾向は見られなかった（ｐ＜０．００１）。ＰＬＧＡ、ＰＣＬおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭの引張ひずみ（５８．３±１．６０％、５１．７±２．７０％および７０．０５±４．６４％）はＣＣＭ（４１．８±３．５８％）よりもわずかに大きかった。それぞれ、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１。しかしながらゼラチンの引張ひずみ（７．８３±１．０１％）はＣＣＭに比べると有意に小さかった（ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
ＮＦ−ＥＣＭの接触角はフィルムよりも有意に小さかった（疎水性が弱かった）（ｐ＜０．００１、図１６（ｄ））。ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭの接触角（１２１°）が最も大きく、ＰＣＬのＮＦ−ＥＣＭ（９２°）が続いている。ＰＬＧＡ、ＰＣＬおよびゼラチンのフィルムの水接触角がそれぞれ１００°、８５°および６０°であるフィルムについても、同様の傾向が見られた。ＣＣＭ、ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭについては接触角の測定は達成できなかった。これらのサンプルは極度に親水性であり、測定する前に水が瞬間的に中に分散した。
【０１８３】
２．２．ＨＭＳＣの特徴付け
ＨＭＳＣを播種前に特徴付けたところ、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ２９およびＣＤ９
０に対しては陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲおよび７−ＡＡＤに対しては陰性であった。
【０１８４】
２．３．生体適合性アッセイ
全てのＮＦ−ＥＣＭは８日間にわたってＨＭＳＣの増殖を支援した（図１７）。ＰＬＧＡおよびコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭ、ＰＬＧＡとコラーゲンの全コポリマー（コラーゲン：ＰＬＧＡ、３：１、１：１および１：３）および１：３のコラーゲン：ＰＣＬは、４６０ｎｍの吸光度で測定した通り（それぞれ０．８４±０．０２、０．８４±０．０８、０．７９±０．１０、０．７９±０．０３、０．７９±０．０７および０．８７±０．７０Ａｕ）、全てＣＣＭ（０．５８±０．０８Ａｕ）よりも高い増殖速度を支援した（ｐ＜０．０１）。対照的に、ゼラチンのフィルム（０．６２±０．２Ａｕ）、ゼラチンのＮＦ−ＥＣＭ（０．６７±０．４Ａｕ）、ＰＣＬのＮＦ−ＥＣＭ（０．５３±０．０８Ａｕ）および全てのゼラチン：ＰＣＬコポリマーのＮＦ−ＥＣＭは、ＣＣＭと同程度の増殖を示し（ｐ＞０．０５）、一方ＰＣＬのフィルム（０．４４±０．１０Ａｕ）およびカバーグラス（０．４５±０．４Ａｕ）はＣＣＭに比べると成績は劣っていた（ｐ＜０．０５）。純粋ポリマーの内、コラーゲンとＰＬＧＡの増殖速度が最も速く、ゼラチンとＰＣＬがそれぞれ続いた。コラーゲンまたはゼラチンのいずれかと共エレクトロスピニングしたＰＬＧＡは、純粋ＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭと同等の増殖を示した。対照的に、コラーゲンおよびゼラチンのＮＦ−ＥＣＭはＰＣＬと混合すると増殖速度が大きく上昇した。フィルムは、同じポリマーのＮＦ−ＥＣＭに比べると増殖は有意に劣っていた（図１７）。
【０１８５】
２．４．カルシウム石灰化およびＡＬＰ活性
図１８は、ＨＭＳＣによって誘導された石灰化の程度を示す。骨形成培地で培養したＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスおよびＣＣＭは、カルシウム沈着（赤染色）およびＡＬＰ活性（紫／青染色）について陽性に染色された。骨形成培地では全てのサンプルがアリザリンレッドおよびＡＬＰに対して陽性であった。アリザリンレッドに対して陽性（一方ＡＬＰに対しては陰性）に自動染色されたコラーゲンのＮＦ−ＥＣＭおよびＣＣＭを除き、コントロール培地では全てのサンプルがアリザリンレッドおよびＡＬＰに対して陰性であった。
【０１８６】
２．５．細胞の接着、形態および統合への膜の影響
図１９、２０および２１は、ＮＦ−ＥＣＭ、フィルム、カバーグラスおよびＣＣＭ上におけるＨＭＳＣの形態を示す。図１９に具体的に見られるように、カバーグラスコントロール上のＨＭＳＣには３Ｄの深さがなく（非常に平坦）、細胞質は大きく、かつ広範に延長していた（非常によく広がっていた）。画像では見ることができないが、カバーグラス上のこれらの平坦なＨＭＳＣは、ＮＦ−ＥＣＭで培養したＨＭＳＣがほとんど移動させることが不可能であるのとは対照的に、ＲＮＡ／タンパク質アッセイには必要なことではあるが、細胞培養培地をピペットで移すことによって機械的に攻撃を受けると接着が簡単に壊れてしまう。フィルムコントロールは、カバーグラスに蒔いたＨＭＳＣとほとんど同じ傾向をたどった（図２０）。対照的にＮＦ−ＥＣＭ上のＨＭＳＣは、明らかに見てとれるが、３Ｄ空隙を占有し、ＮＦ−ＥＣＭナノファイバーメッシュ内で堅固に接着して十分に統合されており、またそうすることにより広範囲に広がった細胞質を失くしていた。ＰＣＬのＮＦ−ＥＣＭに見られる高充填密度では細胞統合は最小限であるが、ナノファイバー充填密度が低めのＮＦ−ＥＣＭ（ＰＬＧＡ等）に関しては、ＨＭＳＣはＮＦ−ＥＣＭの３Ｄ閉じ込め内で十分に統合されており、ナノファイバーと細胞糸状仮足の伸長体とが一緒になって一つのものに変形、すなわち、ナノファイバーと細胞の接合部が識別不能になっていた（図１９、中央パネル）。このように細胞とＰＬＧＡのＮＦ−ＥＣＭとの間に不一致がないことから、ＮＦ−ＥＣＭはＨＭＳＣにとっての「内部細胞骨格」であると思われた。
【０１８７】
ＣＣＭで培養したＨＭＳＣも統合を示したが、マトリックスファイバーはナノファイバーＮＦ−ＥＣＭよりも明らかにはるかに大きかった。ＨＭＳＣ細胞骨格の３Ｄ共焦点顕微鏡検査は上記の結果と一致した（図２１）。
【０１８８】
３．結論
合成もしくは天然起源またはそれらの組合せの起源の３ＤＮＦ−ＥＣＭを、ＧＭＰ遵守環境のクリーンルーム内にて新規な無針マルチジェットナノファイバーエレクトロスピニングプロセスにより作製した。この技術により作製した３ＤＮＦ−ＥＣＭは、均一なファイバー径および天然ＥＣＭと同様の充填密度を示し、２Ｄフィルム、カバーグラスおよび臨床的に承認されたベンチマークＥＣＭの足場よりも優れた顕著な生体適合性を有していた。全体的に見て、このような増殖ポテンシャル、細胞密閉様統合特性、幹細胞送達ビヒクルとなる潜在能力および必要に応じて幹細胞の特殊分化を誘導する能力があることから、このような環境で無針エレクトロスピニングにより作製したＮＦ−ＥＣＭは再生医療において有用となり得ると思われる。
【０１８９】
実施例９：三次元ナノファイバー膜の形態である本発明の組成物と二次元フィルムとを比較した薬の放出の研究
この研究では、二次元フィルムに比べると、三次元ナノファイバー膜の形態の組成物による抗ＶＥＧＦの放出はより安定でより遅いことが示されている。抗ＶＥＧＦは黄斑変性治療に一般的に使用されており、一般に好まれている投与経路は注射である。
抗ＶＥＧＦ、すなわち血管新生抑制剤であるベバシズマブ（アバスチン（商標））を、直接分散によってＰＬＧＡのフィルムおよびＰＬＧＡのナノファイバー内に組み込んだ。最終濃度２５ｍｇ／ｍｌのベバシズマブの水溶液を、ジクロロメタン中６％ｗｔ／ｖＰＬＧＡ溶液に添加した。得られた溶液を混合した後、ポリマー溶液中で薬が確実に均一に分散するように３０秒間超音波処理した。次いで溶液の半分をフィルムの中に流延し、もう一方の半分を無針エレクトロスピニングでエレクトロスピニングした。
【０１９０】
ベバシズマブの放出の動態を調べるため、ベバシズマブを含有するＰＬＧＡのフィルム組成物およびＰＬＧＡのナノファイバー組成物をリン酸緩衝生理食塩水に浸漬し、３７℃の５％ＣＯ中でインキュベートした。ベバシズマブの放出をＵＶ分光法により波長２８５ｎｍで測定した。
図１２に示す結果は、７９日間（１８９６時間）にわたるベバシズマブの累積放出を示している。フィルムでは薬が初期バーストする結果となり、一方ナノファイバーでは７９日間にわたって直線的な制御された薬の持続放出が可能であった。
【０１９１】
実施例１０：ナノファイバーの径および充填密度
各ＮＦ−ＥＣＭのナノファイバーの平均径を、標準偏差も含めて測定した。ナノファイバーの均一性は、ファイバー径のパーセント偏差として以下の表に表した。充填密度は、個々のＮＦ−ＥＣＭのＳＥＭ像全体におけるファイバーのパーセント濃度を示している。
【０１９２】
【表１】

【０１９３】
実施例１１：ナノファイバーマトリックス内に定着した幹細胞の影響
この研究では、細胞刺激因子および分化因子がナノファイバーから放出されることができて放出後の幹細胞に活発に影響することが示されている。これは、ファイバー内ではなく培地内に分化因子を有することによって試験される。
小分子であるプルモルファミンをポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）溶液に直接組み込んだ後、溶液をファイバー状にエレクトロスピニングした。プルモルファミンは２，６，９−三置換プリンであるが、骨形成分化を促進することがわかっている。分子的研究から、プルモルファミンは７回膜貫通型スムーズンド受容体に結合することによってヘッジホッグシグナル経路を活性化するが、このことが骨ならびに他の組織および器官の発育の際に重要な役割を果たしているということがわかっている。
【０１９４】
プルモルファミン粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させることにより１０ｍＭのプルモルファミン原液を調製した。ＰＬＧＡを、７０％クロロホルム：３０％ジメチルフルロミドの溶媒混合液中でゆっくり攪拌することによって溶解させて、１０％ｗｔ／ｖ溶液を得た。適当なプルモルファミン原液と１０％ｗｔ／ｖのＰＬＧＡとを混合することによって様々な濃度で作成したプルモルファミン希釈標準溶液を用いて、ナノファイバー膜をエレクトロスピニングした。プレーンな１０％ｗｔ／ｖのＰＬＧＡと同量のＤＭＳＯとが入った希釈標準溶液中をコントロールとした。エレクトロスピニング手順を２７〜３５ｋＶの下で実施した。電極間距離は２１ｃｍとした。
【０１９５】
骨形成分化のために、膜の細胞を骨形成分化培地で３週間培養した。骨形成培地は、デキサメタゾン１００ｎＭ、β−グリセロホスフェート１０ｍＭおよびアスコルビン酸５２ｍｇ／Ｌを含有する補足α−ＭＥＭからなっていた。ｈＭＳＣ播種手順は増殖アッセイと同じであった。細胞接着させるための２４時間のインキュベーションの後に、増殖培地を完全に骨形成培地と入れ換え、その後は週に２回３０％の培地変更を行った。２週間後、マトリックス内に生じたカルシウム沈着を定量化した。
【０１９６】
石灰化は、骨形成の特異的マーカーの１つである。マトリックス内でのカルシウム沈着を測定してｈＭＳＣの骨形成分化を定量した。以下のグラフでは、２μＭのプルモルファミンをポリスチレン培養プレート（ＰＳ）上の分化培地に直接添加した際のカルシウム沈着の有意な増加を示した。同様の増加が純粋ＰＬＧＡ膜上でも見られた。ＰＬＧＡ８０とＰＬＧＡ１６０（８０μＭおよび１６０μＭのプルモルファミンが組み込まれたＰＬＧＡ膜）の複合体も、純粋ＰＬＧＡと比較してカルシウム沈着が改善を示した。これらの結果から、プルモルファミンは骨形成分化を増進することができ、またプルモルファミンをＰＬＧＡ膜と統合するとこの薬の放出がうまくいき、その結果骨形成分化が改善するということがわかった。
【０１９７】
加えて、図３１のグラフは、ＰＳに比べてナノファイバーへのカルシウム沈着が有意に増加していることを示しており、ナノファイバー単独でｈＭＳＣの細胞分化を増進することができることを示している。さらに、骨形成培地に添加されることなくＰＬＧＡのナノファイバーで培養したｈＭＳＣもマトリックス内でのカルシウム沈着の兆候を示しているが、このことはナノファイバーの表面トポグラフィーもまた骨形成分化を誘導し得るということを示すものであると言える。
【０１９８】
実施例１２：新規なナノテクノロジープロセスによる、ヒトブルッフ膜（ＢＭ）の天然三次元構造を模倣する超薄ナノファイバー膜の製造に関する研究
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、西欧諸国の５０歳以上の人間の失明の主な原因である［１、２］。ブルッフ膜（ＢＭ）の加齢変化の蓄積および網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の死滅がＡＭＤの主な特徴である。天然のヒトＢＭは、ＲＰＥと脈絡毛細管板とをつなぎ、内側から外側に向かってＲＰＥの基底膜層、内コラーゲン層、エラスチン層、外コラーゲン層および脈絡毛細管板の基底膜の５つの解剖学的な層からなる、２〜４μｍ厚の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）区画である［参考文献３、４参照］。ＢＭはＲＰＥ細胞の接着、移動および分化を物理的に支援している。ＲＰＥは六角形の細胞の単層であり、視覚機能において以下のような複数の役割を果たしている：迷光の吸収、視サイクルにおけるレチノールの異性化、光のダメージを受けた光受容器の外節の食作用、増殖因子の分泌、ならびにＢＭとともに血液網膜関門を形成して網膜と脈絡膜間における生体分子、栄養素、酸素および代謝老廃物の相互交換を調節すること［参考文献５参照］。したがって、ＲＰＥの喪失またはＲＰＥへのダメージは、光受容器の機能障害および不可逆的失明を引き起こす。
【０１９９】
現在、委縮性ＡＭＤの視力回復のための治療法は非常に限られている［参考文献６参照］。ダメージを受けたＲＰＥを取り替えればおそらく網膜機能を回復できるので、細胞療
法での回復は期待できる。動物モデルにおいて、ＲＰＥ交換によるＡＭＤの治癒可能性が実証されている［参考文献７〜１２参照］。さらに、網膜中央帯から採取した自己ＲＰＥおよび胎児シート移植は、ＡＭＤ患者において部分的な視力改善を示している［参考文献１３〜１８参照］。しかしながら自己移植はＡＭＤにかかりやすい遺伝的素因によって制限され、網膜の症状が繰り返し発現することになり得る。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞はインビトロでＲＰＥ細胞に分化しており、したがって、広がる未来に向けてＡＭＤ治療用の細胞源の代わりとなる可能性を提示している［１９〜２４］。解離ｈＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞を移植する第Ｉ相臨床試験は最近食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されている［２５、２６］。しかしながら、胎児提供者の組織は通常供給源が限られており、またそれを使用することによって倫理上の問題が起きる場合がある。
【０２００】
ＲＰＥ移植は光受容器の機能障害を遅らせることが可能であるが、加齢によってダメージを受けているＢＭでは移植片接着や移植片生存を支援するのに適当な微環境を形成せず、さらにはＲＰＥ機能を阻害することもある。移植片の生存が限られていること、および網膜や眼の後壁の他の部位で異常構造が形成されることは、ＡＭＤの細胞療法における大きな課題である［２７］。したがって多くの研究所が、長期間にわたって機能的に無傷であり同時に老化したＢＭの影響を受けないＲＰＥパッチの送達を可能にする人工ＢＭの研究に取り組んでいる［１３］。
【０２０１】
理想的には代用ＢＭは、ＲＰＥの表現型の維持を支援し、正常な網膜構造を回復させ、宿主免疫系および視覚系に耐容性であり、網膜下腔にとって適切な厚さを有し、外科的な操作が簡単であり、かつ時間が経過しても生分解性であるべきである［１３、２８］。現状では、適切かつ十分に機能的なＲＰＥの単層の増殖を可能にし、それによって後に行う植え込みをさらに可能にする、天然のＢＭを模倣するための理想的な人口足場はまだ見つかっていない。ほとんどの研究では、フィルム等の滑らかな表面が代用ＢＭの可能性を持つものとして調査されている［２７］。最近では、絹の膜がＲＰＥ送達膜として注目されている［３８］。しかしながら、多くのそのような材料の分解プロセスが、望ましくない網膜下血管新生、ＢＭの瘢痕、免疫拒絶反応、または移植組織の生体機能性および寿命の低下を増やし得る宿主の有害な免疫応答を後で誘発する可能性があるかどうかは、まだ十分明らかになっていない。
【０２０２】
対照的に自然のＢＭは、滑らかな絹のようなフィルムであるのではなく、ナノファイバー状トポグラフィーを有する天然タンパク質の微細な網目構造を含有している。したがって、本明細書に記載のナノファイバー状メッシュを製造する新規なナノテクノロジー法は、自然のヒトＢＭの正確な形態的擬態の製造を可能にすることにおいて顕著な進歩を示している。可能な限り正確に天然の構造を模倣する人工の膜であれば、適切なＲＰＥの単層を工学的に作り出してその後網膜下腔に送達することが容易になる。
【０２０３】
本研究において、本発明者は、新規なエレクトロスピニングプロセスを用いて、天然のＢＭに近い擬態の設計を可能にし得るナノファイバーで超薄ナノファイバー膜を作製することを目的とした。一般的に使用されている安全なバイオポリマーであるＩ型コラーゲンおよびＰＬＧＡをエレクトロスピニングして膜にした。一次ＲＰＥ細胞を培養するための代用ＢＭとしてかかるナノ膜を使用することの可能性を、ＡＭＤの新規な治療戦略のために天然のような人工ＢＭ基質を製造するという目的のために調査した。
【０２０４】
１．材料および方法
１．１．ナノファイバー膜の調製
Ｌ−ラクチド：グリコリドのモル比が８５：１５のＰＬＧＡ（ピューラック・バイオケム社、オランダ）および天然バイオポリマーウシＩ型コラーゲン（カタログ番号Ｃ３５１１、シグマ社、米国）を、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール
（ＨＦＩＰ）（サーモフィッシャー社、オーストラリア）に１０％ｗｔ／ｖの濃度で溶解させた。超音波処理を３０分間行ってコラーゲンの解離を推進した。織物エレクトロスピニング用の産業用装置であるＮａｎｏＳｐｉｄｅｒ ＮＳ２００（エルマルコ社、チェコ共和国）を用いて、実施例８に記載のように臨床グレードのクリーンルーム構成でＰＬＧＡおよびコラーゲンのナノファイバー膜を作製した。まず初めに、パイクスピン電極を用いてポリマー溶液をエレクトロスピニングしてランダムな三次元構造を生成させた。パイク電極と集電極との距離は２１０ｍｍとした。印加電圧は、ＰＬＧＡおよびコラーゲンについてそれぞれ３２ｋＶおよび３５ｋＶに設定し、作製した膜全てにおいて同径のナノファイバーを得た。
【０２０５】
純粋コラーゲンのナノファイバーを、Kuijpersらに従って作製した直後に化学的に架橋した［４６］。簡単に述べると、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）（サーモフィッシャー社、オーストラリア）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）（サーモフィッシャー社、オーストラリア）をモル比１：５で９５％エタノールに溶解させ、作製したコラーゲン膜に添加した。架橋の手順を、２４時間振盪させながら室温で実施した。実験に関しては、作製した膜を全て小片にカットし、ＣｅｌｌＣｒｏｗｎ２４（スキャフデックス社、フィンランド）に添付し、その後２５ｋＧのガンマ線照射で滅菌した。
【０２０６】
１．２．エレクトロスピニングした膜の特徴付け
膜を構成しているナノファイバーを金スパッタした後、Ｎｅｏｓｃｏｐｅ ＪＣＭ−５０００日本電子走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（日本電子、日本）を用いて特徴付けた。Marco Zarbinのグループ［４７］は、天然のコントロールである自然のヒトＢＭの内コラーゲン層のＳＥＭ像を親切にも提供した（図２５Ｄ）。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立精神保健研究所、米国）でＳＥＭ像を解析してナノファイバーの形態、径および充填密度を求めた。少なくとも５０本のファイバーを測定してそれぞれの膜のファイバー径の平均を算出した。充填密度は百分率で表すが、各画像の端から端までのファイバーの数をカウントし、ファイバー径の平均を掛けて、次いで画像の幅で割ることにより算出した（×１０００倍で１１７μｍ）。
【０２０７】
機械的試験を行って、作製した膜の生物物理学的特性を評価した。５０Ｎの充填細胞を備えたシングルカラム卓上汎用試験システム（インストロン社、オーストラリア）を用いて試料のヤング率、最大引張応力およびひずみを測定した。エレクトロスピニングした膜を１０×４０ｍｍのサンプルにカットした。ゲージ開口部は２０ｍｍに設定した。両測定スピードは２ｍｍ／分に設定した。サンプルの厚さをマイクロメータ（株式会社ミツトヨ、日本）で測定した。測定を５回繰り返し、Ｂｌｕｅｈｉｌｌ（登録商標）ソフトウェア（インストロン社、オーストラリア）で解析した。
【０２０８】
１．３．増殖アッセイ
ヒト一次ＲＰＥ細胞はロンザ社（Lonza）より購入した（カタログ番号００１９４９８
７）。細胞培養基本培地および全ての添加物はロンザ社より購入（カタログ番号００１９５４０９）。細胞を３代継代の膜に播種した。簡単に述べると、ＣｅｌｌＣｒｏｗｎ２４に添付した滅菌膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２時間洗浄した後、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．５％線維芽細胞増殖因子（塩基性）（ＦＧＦ−Ｂ）、２％Ｌ−グルタミンおよび０．２５％ＧＡ−１００が添加された網膜色素上皮基本培地からなる平板培地中の各試料に１０，０００個の細胞を加えた。カバーグラスの細胞を滑らかな表面のコントロールとした。翌日、ＦＢＳを除く全ての添加物を含有する増殖培地に培地を変えた。その後は１日おきに培地を変えた。
【０２０９】
増殖アッセイの標準プロトコルに従い、ＷＳＴ−１試薬（水溶性テトラゾリウム（４−
［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホン酸）（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）を用いた。テトラゾリウム塩のＷＳＴ−１を、生存細胞内のミトコンドリアデヒドロゲナーゼでホルマザンに変換する。続いてホルマザンは分光測定で定量化することができる。１日目、３日目および５日目にＷＳＴ試験を実施した。試験の日には、古い培地を９００μＬの新しい増殖培地に取り替えた。次いで１００μＬのＷＳＴ−１試薬を各サンプルに加え、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。４時間後、各サンプルから培地１００μＬを９６ウェルプレートに移し、分光光度計（プロメガ社（Promega）、米国）で
吸光度を４５０ｎｍで測定した。各試料につき６回繰り返して分析した。
【０２１０】
１．４．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）検査
ＳＥＭ検査を用いて膜における細胞形態を調査した。播種プロセスおよび培地の交換は上記の通りである。ＳＥＭのサンプルは、検査用に３日目および１１日目に調製した。ＳＥＭ検査の日には、ヒトＲＰＥ細胞を有する膜をＰＢＳ中３％グルタルアルデヒド溶液で２４時間固定した。次いで、ＰＢＳ中３０、５０、７０、９０および１００％エタノールで濃度を上げていきながら各１０分間ずつ脱水した後、ヘキサメチルジシラザンで２回すすいだ。全試料を金コータースパッタ（日本電子、日本）で金コーティングし、Ｎｅｏｓｃｏｐｅ ＪＣＭ−５０００日本電子卓上型ＳＥＭ（日本電子、日本）で画像を撮影した。
【０２１１】
１．５．免疫細胞化学
ＣｅｌｌＣｒｏｗｎ２４に添付したコラーゲンおよびＰＬＧＡの膜ならびに２４ウェルプレート内のカバーグラスに、１０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で細胞を播種した。１１日間の培養の後、サンプルを室温にて１０分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００で５分間透過処理し、ＰＢＳで洗浄した。次いでサンプルを、マウス抗ＲＰＥ６５抗体（カタログ番号ａｂ１３８２６、アブカム社（Abcam）、
米国）の１：１０００希釈物、またはブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（シグマ社））中のマウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−接合−抗ＺＯ−１抗体（カタログ番号３３９１８８、インビトロジェン社、オーストラリア）の１：１００希釈物とともに、室温にて９０分間暗所でインキュベートした。核を標識するために、ブロッキング緩衝液中のヘキスト３３３４２（インビトロジェン社、オーストラリア）の１：１０００希釈物とともに細胞を共染色した。ＲＰＥ６５抗体で染色したサンプルを洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−接合ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ１１００１、インビトロジェン社、オーストラリア）とともに室温にて３０分間暗所でインキュベートした。Ｎｉｋｏｎ Ｃ１共焦点顕微鏡（ニコン、日本）で画像処理を行った。
【０２１２】
１．６．統計解析
増殖のデータの統計的有意性をスチューデントのｔ検定で解析し、エレクトロスピニングした膜とカバーグラスとを各時点において比較するためにｐ＜０．０５に設定した。
【０２１３】
２．結果
２．１．膜の特徴付け
本発明者は、本発明者らのＮＡＮＯＳＰＩＤＥＲ（登録商標）装置により、ＰＬＧＡおよびコラーゲンバイオポリマーのナノファイバーをエレクトロスピニングすることができた。得られた超薄膜は、本物の天然のＢＭに類似している３Ｄ構造および３Ｄ形態内に定着したナノファイバーからなっていた。
【０２１４】
図２５のＳＥＭ像は、作製した膜、カバーグラス、および自然のヒトＢＭの内コラーゲン層のトポグラフィーを示しており、実施例１０の表は、ナノファイバー膜の物理的特徴のデータを表している。エレクトロスピニングした膜は、ランダムに構築されたファイバ
ーの網状組織からなっていた。平均ファイバー径はそれぞれ、ＰＬＧＡ膜が３３１±７８ｎｍ、コラーゲン膜が２９９±１８５ｎｍであった。ＰＬＧＡ膜のファイバー充填密度は３７．１±１．１％であったが、コラーゲン膜は３０．３±１．４％であった。ＳＥＭ像解析から、自然のヒトＢＭの内コラーゲン層のファイバー径が３６６±９８．８ｎｍであり、充填密度が３０．２±８．２％であることがわかった。作製した膜のファイバーの構造はヒトＢＭの内コラーゲン層と類似していた。それに比べて、カバーグラスの表面は比較的滑らかかつ均質であった。作製したコラーゲンおよびＰＬＧＡの膜は、ともに厚さ１４μｍであった。ＰＬＧＡのナノファイバー膜の最大引張強度は１．５±０．４ＭＰａ、極限ひずみは２８．８±４．９％、ヤング率は１３１．９±１３．３ＭＰａであった。コラーゲンのナノファイバー膜の引張強度、引張ひずみおよびヤング率の値は、それぞれ１０．８±０．７ＭＰａ、７０．０±４．６％および２１７．９±１５．３ＭＰａとより高かった。要約すると、ＰＬＧＡ膜はコラーゲン膜よりも強度は低いが弾性は高かった。
【０２１５】
２．２．増殖アッセイ
図２６に増殖アッセイの結果を示しているが、ＰＬＧＡ膜およびコラーゲン膜ともに播種後１日目の細胞の接着がカバーグラスよりも多いことがわかった（ｐ＜０．０１）。３日目では、ＰＬＧＡ膜およびカバーグラスと比べるとコラーゲン膜により多くの生存細胞が測定されたが、５日目にはＰＬＧＡ膜が最良のＲＰＥ細胞増殖支持を示した。全体的には、５日間の培養後、滑らかなカバーグラス表面に比べるとナノファイバー膜の方がＲＰＥ細胞の増殖を有意に大きく促進したことが増殖アッセイによって実証された。
【０２１６】
２．３．細胞形態のＳＥＭ
図２７および２８においては、代表的なＳＥＭ像にてコラーゲン膜およびＰＬＧＡ膜ならびにカバーグラス上のヒトＲＰＥ細胞を示している。３日後、培養した細胞は全ての基質において多角形を呈し、よく広がった形態を示した（図２７）。１１日後、広範囲に局所コンフルエンスが見られ、細胞が密に詰まっていた。より高い倍率においては（図２８）、全体的にカバーグラスよりもＰＬＧＡおよびコラーゲンの膜において、細胞はより自然な三次元単層を形成した。カバーグラスの細胞のいくつかは互いに重なっているように見えた。形が良く、長く、大量の、シート状の微絨毛を確認することができ、ナノファイバー膜で培養した細胞の表面を覆っていたが、カバーグラスで培養した細胞の表面では微絨毛の数はより少なく、かつそれほど形は良くなかった。細胞の径の大きさは、試験した全ての基質において１０〜１４μｍの範囲であった。
【０２１７】
２．４．免疫化学
図２９は、密着結合の特異的マーカーの１つであるＺＯ−１で染色した細胞の共焦点顕微鏡画像を示している。どの基質で培養した細胞も、密着結合の形成および六角形を示した。抗ＲＰＥ６５による免疫蛍光染色によって、ナノファイバー膜およびカバーグラスのどちらで増殖している細胞も、主要な機能性タンパク質であるＲＰＥ６５を維持していることがわかった（図３０）。
【０２１８】
３．考察
ＲＰＥの単層やＢＭへのダメージは、ＡＭＤの主な病理学的な特徴である［４８］。ＡＭＤは、生活要因および遺伝的素因がリスクの一因となっている複合疾患である。この疾患は、黄斑がダメージを受けることによって中心視が冒され、そのため良好な視力が冒され、最終的には不可逆的失明につながる。研究所および可能性のある治療法を探すために行われている臨床研究の数が多いにもかかわらず、委縮性ＡＭＤの治療法は現在非常に限られている［６］。細胞移植は動物モデルやＡＭＤ患者の視覚機能を部分的に改善しており、いくらか期待が持てる［７、１０〜１８、４９］。しかしながらこのタイプの細胞療法は、短い生存期間およびインビボにおける移植片の異常な細胞構造のため限界がある［２７、４９］。これまでの研究から、ＡＭＤ患者におけるヒトＢＭの解剖学的な層は無傷
ではなく、このことがＲＰＥ細胞の接着、生存および形態を変化させ、ＲＰＥの増殖および成熟を阻害し得ることがわかっている［５０〜５３］。加齢によるＢＭの変化としては、肥大、脂質の蓄積、コラーゲン架橋およびエラスチン層の石灰化が挙げられる。これらの変化による有害作用は累積性であり、かつ進行性である傾向にある［５４〜５６］。老化したＢＭのこのような欠点を克服するためには、人工膜上の細胞を送達することが、ＡＭＤ患者への植え込みを成功させるために必要になると考えられる。
【０２１９】
治療用の膜として可能性のあるものは、網膜下腔と適合性があり、かつＲＰＥ細胞の接着、増殖および成熟を支援したり、また網膜との栄養・老廃物交換を調節したりといったＢＭの特徴を再現するべきである［１３、２８］。ほとんどの研究において、二次元の膜である薄いフィルムは天然由来および合成ポリマーから作製されており、またインビトロおよびインビボの両方においてＲＰＥ細胞に対して生体適合性であることがわかっている［２７、３０、３３］。しかしながら天然のＢＭは、相互に連結したナノスケールのタンパク繊維の複雑な三次元のＥＣＭであり、また他の細胞型の挙動へのトポロジーの影響がこれまでに報告されている［３９〜４１、５９］。したがって二次元の細胞培養環境は、ＥＣＭのより複雑な三次元構造とのトポロジー的な近似が乏しく、強制的に細胞に不自然な特徴を呈示させることがある。
【０２２０】
ナノスケールのファイバーを含有する三次元細胞培養膜を工学的に作り出せば、ＲＰＥ細胞の増殖およびよりインビボ様の条件下での分化が可能になる。エレクトロスピニングしたナノファイバー膜は、自然のＥＣＭのナノトポグラフィーを正確に表す高い空孔率および表面積−体積比を有し、そのために細胞の接着、増殖および組織化を助長し得る、有力な候補である。この研究において、本発明者は、Ｉ型コラーゲンおよびＰＬＧＡからなる２種類のエレクトロスピニングした膜を作製した。ＳＥＭによって、ファイバー径が２００〜５００ｎｍの範囲でありファイバー充填密度がそれぞれ３０．３±１．４％および３７．１±１．１％であるランダムなファイバー状網状組織が明らかになった（図２５および実施例１０の表）。自然のヒトＢＭの内コラーゲン層のＳＥＭによって、ファイバー径が３６６±９８．８ｎｍであり充填密度が３０．２±８．２％のファイバー状網状組織が示された。要約すると、本発明のエレクトロスピニングした膜によって、自然のヒトＢＭの内コラーゲン層と同様のナノファイバー状構造が実証された。さらに、工学的に作り出された膜は移植に適当な厚さを有するべきである。エレクトロスピニングした膜は両方とも、網膜下腔に適合するのに十分な薄さであった（１４μｍ）。
【０２２１】
機械的試験では、試料の強度および剛性が、それぞれ最大引張応力およびヤング率を測定することにより示された。最大引張強度とは、サンプルが破損するまでに耐え得る負荷の量を示すものである。手術中の操作に耐えなければならず、また取り扱いが容易になるような物理的性質を有しなければならないため、ビヒクルの送達には十分な引張強度が必要とされる。ヤング率は試料の剛性を示す。ＰＬＧＡ膜は総じてコラーゲン膜よりも強度は低かったが弾性は高かった。
【０２２２】
ＲＰＥ細胞がナノファイバー膜に関連して調査されたことはめったになかった。本研究において本発明者は、ＲＰＥ細胞が総じて平面状のカバーグラスよりもナノファイバー膜上で増殖が多かったことを実証した（図２６）。播種後１日目のＲＰＥ細胞の接着は、カバーグラスよりも本発明のナノファイバー膜で有意に改善した（ｐ＜０．０１）。５日間の培養期間中、細胞は総じてカバーグラスよりもナノファイバー膜で高い増殖を示した。
【０２２３】
移植したＲＰＥナノファイバー膜がＡＭＤの治療において有効であるためには、ＲＰＥの成熟および生体機能を可能にしたり促進したりすることも必須である。局所コンフルエンスに達した後、ＲＰＥ細胞は成熟を開始し、緊密に集まって多角形細胞の特徴的な単層を形成する。３日間の培養後、細胞は各基質において自然な多角形を呈した（図２７）。
１１日間の培養後、ＲＰＥ細胞は全表面において局所コンフルエンスに達したが、カバーグラスよりもナノファイバー膜でより良好な細胞の組織化が確認された（図２７および２８）。重大な観察となるかもしれないが、形が良く、長く、シート状の微絨毛は、ナノファイバー膜で培養した細胞の表面でのみはっきりと見ることができた。インビボのＲＰＥ細胞は、頂端面が網膜下腔に隣接し側底面がＢＭに面している同じような分極構造を有している。網膜が成熟すると、非常に長いシート状の微絨毛が頂端面で成長して光受容器の外節の先端を包む。したがって、ＲＰＥの頂端の微絨毛は網膜接着および光受容器の興奮性の維持において極めて重要な役割を果たしている［６９、７０］。本発明者は、同じ天然のような配向で、微絨毛の発現が本発明のナノ膜では広範囲であるが平坦なカバーグラスでは同程度ではないＲＰＥの単層を工学的に作り出すことに成功したため、本発明のナノファイバー基質／ウェビングが、ＲＰＥの単層を工学的に作り出すことに関して非ナノファイバーの平坦な材料よりも優れているのは当然のことである。さらに、ナノファイバー膜のＲＰＥ細胞は、黄斑内の自然のＲＰＥ細胞と同じ正常な大きさ（１０〜１４μｍ）を示した［１３、７１、７２］。まとめると、本発明者は、ナノファイバー膜はＲＰＥの組織化を改善するため、平面状の基質よりも光受容細胞をよく維持することになり未来のＡＭＤ治療法となり得ると考える。
【０２２４】
成熟したＲＰＥの単層のその他の重要な生物学的特徴は、密着結合形成およびＲＰＥ６５タンパク質の発現である。細胞間の密着結合によって、単層が、ＢＭと一緒になって、水やイオンが自由に通過するのを阻止する血液網膜関門となることができる［１３、７３］。ＲＰＥ６５は視サイクルに関与しており、突然変異すると重篤な早発性の失明につながる［５０、７４、７５］。密着結合の形成は、密着結合の特異的マーカーであるＺＯ−１に対する蛍光免疫染色によって、１１日間の培養後の全ての基質で実証された（図２９）。同様に、全ての基質のＲＰＥ細胞が、主要な機能性タンパク質であるＲＰＥ６５の発現量を維持した（図３０）。
【０２２５】
まとめると、本発明者は、作製したナノファイバー膜が、ＲＰＥの増殖および成熟ならびに生体機能的特徴の発現を支援することに関して平面状のカバーグラスよりもよい働きをしたので、エレクトロスピニングした膜を黄斑再生用に用いることの有益な証拠となる、とういことを示した。ナノファイバー三次元マトリックスは、自然のＥＣＭのナノ地形構造を模倣することにより、平面状の表面のコントロールよりもインビボ様の組織化および形態を多く誘導する。
【０２２６】
本研究において、本発明者は、ナノファイバー膜を作製するための生体材料としてＩ型コラーゲンおよびＰＬＧＡのポリマーを選んだ。これらのポリマーを選択したのは、十分に研究されており、またその生体適合性が例えば黄斑変性に関して確認されているからである。ＰＬＧＡは、ＦＤＡに認可された医療用インプラント用の合成ポリマーであり、体内で分解して無毒性の分解生成物となる。Ｉ型コラーゲンはＢＭの主成分であり、細胞接着を強めることができる天然の接着シグナルを有する。増殖アッセイによって、Ｉ型コラーゲン膜では、カバーグラスと対照的にＲＰＥ細胞の接着がよりよいことが実証された（播種後１日目）（図２６）。しかしながら、１日目の接触に関してはＰＬＧＡ膜とコラーゲン膜との間に有意差は現れなかった。このケースでは、ナノファイバー状トポグラフィーが優勢な役割を果たしているのではないかと考えられる。２つの膜の細胞間の増殖量の差は３日目および５日目ではわずかであった。細胞の大きさ、組織化、密着結合の形成およびＲＰＥ６５の発現に関しては、細胞挙動はどちらのナノファイバー膜も同じであり、ＲＰＥ細胞の機能および成熟が両基質上で同程度であったことを示唆している。しかしながら非ヒト起源のポリマーＩ型コラーゲンでは、疾患の伝染およびいくつかの関連成分への患者のアレルギー等の懸念が起こり得る。比較してみると、化学合成ポリマーであるＰＬＧＡははるかに安価であり、調製や保存の際により安定している。インビトロにおける性能が比較的等しいことを考慮すると、本発明者は、膜ベースのＲＰＥ治療にはＰＬＧＡ
が好ましいポリマーであると提唱する。
【０２２７】
結論として、本発明者は、ナノファイバー膜が、ヒトＢＭの内コラーゲン層の構造を模倣する三次元環境をもたらし、インビトロで生体適合性であり、また一次ヒトＲＰＥ細胞の増殖および生体機能的な成熟を促進することを実証した。このことは、本発明の組成物が、植え込みおよびＡＭＤの治療用の機能的なＲＰＥ細胞の単層の適切な担体であることを示唆している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含む、組織を再生または修復するための組成物であって、前記ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、前記第１および第２の層が互いに別個のものであり、前記組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、前記ウェビングの第１および第２の層が前記組織の第１の層および第２の層に一致する組成物。
【請求項２】
前記組成物の第１の層および第２の層が、細胞外マトリックスまたは細胞の層を模倣することにより前記組織の第１の層および第２の層に一致する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組織中の細胞の層と一致する前記組成物の層に１つまたは複数の細胞が播種されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
播種されている前記細胞が、前記組織層中の細胞と同じ細胞型である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
播種されている前記細胞が、前記組織層中の細胞の細胞型と異なるが、培養を通じて同じ細胞型に分化することが可能である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
播種されている前記細胞が幹細胞である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が３層、４層またはそれ以上の層を含む、請求項１〜７のいずれか一項に組成物。
【請求項９】
前記組成物が改変可能であり、かつ前記組織の形状に合わせられている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウェビングの第１、第２、第３、第４またはそれ以上の層のそれぞれが、１種のポリマーまたは２種以上のポリマーの混合物からなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
２種以上のポリマーが異なる配向に配置される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリマーが天然または合成であり、かつ生分解性である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記剤が生理化学剤または治療剤である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記剤がカプセル化またはコーティングされている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
材料をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記材料が、合成または天然由来であり、ゲル、気体、クリーム、軟膏または固体の形態である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
再生または修復を必要とする前記組織が、顔、胸部、耳、首、腋窩、鼠径部、手、肘、腕、脚部、足、膝、生殖器、眼瞼、鼻、口唇、皮膚、角膜、網膜、ＢＭ、視神経および眼の後壁の他のいずれかの解剖学的部位を含む眼、肝臓、胆管および胆嚢、腎臓、腸、心臓、膵臓、脾臓、ＧＡＬＴ、ＭＡＬＴ、咽喉、食道、喉頭、肺、静脈、動脈、胃、小腸、十二指腸、回腸、空腸、結腸、大腸、脳、脊髄および脊髄神経、筋肉（平滑筋、骨格筋および混合筋）、血管、子宮、膀胱および尿道および尿管、卵巣、膣、直腸、甲状腺、舌、口腔粘膜、胃腸粘膜および鼻咽頭粘膜、歯周組織および歯組織、平滑筋および骨格筋、毛髪、乳頭、アポクリン腺、エクリン腺および内分泌腺、毛包、骨軟骨、腱、ならびに骨膜および軟骨膜を含む群より選択される身体部位または臓器に属する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
対象者の組織を再生または修復する方法であって、前記組織を含む対象者の身体の部位への組成物の投与を含み、前記組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、前記ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、前記第１および第２の層が互いに別個のものであり、前記組成物の厚さまたは構造が健康状態の組織の厚さまたは構造に一致し、前記ウェビングの第１および第２の層が前記組織の第１の層および第２の層に一致する方法。
【請求項１９】
前記剤が１つまたは複数の細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物の第１の層および第２の層が、前記細胞の層を模倣することにより前記組織の第１の層および第２の層に一致する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の細胞が幹細胞または前駆細胞である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記幹細胞がヒト幹細胞または他のいずれかの脊椎動物の幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象者の黄斑変性を治療する方法であって、対象者の網膜の黄斑組織への組成物の投与を含み、前記組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、前記ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、前記第１および第２の層が互いに別個のものであり、前記組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、前記ウェビングの第１および第２の層が前記組織の第１の層および第２の層に一致する方法。
【請求項２４】
前記剤が組織特異的な細胞、幹細胞または前駆細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が１種または複数のポリマーを含む超薄膜として使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
幹細胞および／または１種または複数の剤を含むポリマー含有膜が、眼の後壁につぎ当てられるかまたは外科的に統合される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記膜が時間とともに分解し、損傷黄斑内に細胞および／または１種または複数の剤を放出する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記幹細胞が光受容細胞、神経由来の細胞または網膜色素上皮細胞に分化する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象者の組織を修復または再生するための組成物の使用であって、前記組織を含む対象者の身体の部位への組成物の投与を含み、前記組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、前記ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、前記第１および第２の層が互いに別個のものであり、前記組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、前記ウェビングの第１および第２の層が前記組織の第１の層および第２の層に一致する使用。
【請求項３０】
請求項３１〜４６のプロセスの工程をさらに含む、請求項１８〜２８に記載の方法ならびに請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
組織を再生または修復するための組成物の製造プロセスであって、前記組成物が三次元（３Ｄ）ナノファイバーウェビングおよび少なくとも１種の剤を含み、前記ウェビングが少なくとも第１の層と第２の層とを含み、前記第１および第２の層が互いに別個のものであり、前記組成物の厚さが健康状態の組織の厚さに一致し、前記ウェビングの第１および第２の層が前記組織の第１の層および第２の層に一致し、以下の工程：
（ａ）再生または修復を必要とする組織の厚さおよび／もしくは構造を測定する工程；
（ｂ）前記組織の第１および第２の層の厚さおよび／または構造を測定する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の測定工程に基づき、組成物の望ましい厚さおよび／または構造を決定する工程；
（ｄ）ナノファイバーウェビング機の電場にコレクターを設置する工程；
（ｅ）１種または複数のポリマーを、電場を介して撒布して、組成物の第１の層を作製するのに十分な時間と条件下でコレクターに接触させる工程；
（ｆ）（ｅ）の１種または複数のポリマーの撒布の後に、１種または複数の剤を第１の層に添加する工程；
（ｇ）１種または複数のポリマーを、電場を介して撒布して、組成物の第２の層を作製するのに十分な時間と条件下でコレクターに接触させる工程；
（ｈ）所望により１種または複数のポリマーの撒布を繰り返してさらなる層を作製する工程；
（ｉ）コレクターから層を取り外す工程；および
（ｊ）前記組成物の層を組織の形状に合わせること
を含むプロセス。
【請求項３２】
前記１種または複数の剤をあらかじめ前記第１の層に添加することに加えまたはその代わりに、前記１種または複数の剤を前記第２の層に添加する、請求項３１に記載のプロセス。
【請求項３３】
前記１種または複数の剤が細胞である、請求項３２に記載のプロセス。
【請求項３４】
前記細胞が組織特異的であるか、または幹細胞もしくは前駆細胞である、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記プロセスにより作製される前記組成物が少なくとも３つの層を含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３６】
第１の層に光受容細胞を播種し、別の層に網膜色素上皮細胞を播種し、第３の層に１つまたは複数の神経由来の細胞を播種し、所望により第４の層に網膜色素上皮細胞と同類の細胞を播種する、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３７】
撒布が前記１種または複数のポリマーを噴霧またはスピニングすることにより行われる、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３８】
コレクターが、組織の再生または修復を必要とする身体部位のインプレッション型から調製するギプスである、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３９】
型からのギプスの調製の代わりに以下の工程が採用される、請求項３８に記載のプロセス：
（ａ）３Ｄ画像化技術により組織の再生または修復を必要とする身体部位の輪郭を測定する工程；
（ｂ）測定値をデザインアプリケーションに入力して身体の物理模型を調製する工程；および
（ｃ）模型をコレクターとして使用する工程。
【請求項４０】
３Ｄ画像化技術が、スキャンＸ線、ＣＴスキャン、コーンビームＸ線、ＭＲＩおよび３Ｄ写真を含む群より選択される、請求項３９に記載のプロセス。
【請求項４１】
デザインアプリケーションが、コンピューター支援設計（ＣＡＤ）およびラピッドプロトタイピングを含む群より選択される、請求項３９または４０に記載のプロセス。
【請求項４２】
ラピッドプロトタイピングが、３Ｄ印刷、３Ｄ選択的レーザー加工、３Ｄ選択的焼結、３Ｄ流延、３Ｄバーリング、３Ｄ研削またはこれらのいずれかの組合せを含む群より選択される、請求項４１に記載のプロセス。
【請求項４３】
電場がスピン電極に電圧を印加した際に発生する、請求項３１〜４２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４４】
３Ｄナノファイバーウェビングを硬化する工程をさらに含む、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記硬化する工程が化学的または物理的硬化を含む、請求項４４に記載のプロセス。
【請求項４６】
硬化がポリマーの光硬化により行われる、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】
請求項３１〜４６に記載のプロセスにより得ることができる組成物。
【請求項４８】
請求項３１〜４６に記載のプロセスにより得られる組成物。
【請求項４９】
黄斑変性の治療または皮膚の奇形や異常の矯正に使用する場合の、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記１種または複数の剤が、１種または複数の、抗生物質、抗菌ペプチド、抗菌デフェンシン、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、細胞に影響を与え相互に作用する物質、小分子、表面接着分子およびタンパク質等の細胞挙動に影響を与えるシグナル因子、ヒト細胞、天然組織ファイバーまたはこれらのいずれかの組合せを含む群より選択される、請求項１〜１７、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物が、ゲル、気体、クリーム、軟膏または固体の形態のさらなる材料を含む、請求項１〜１７、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記さらなる材料が無機材料である、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、前記組成物に構造安定性を付与するために少なくとも１種の硬化性ポリマー、少なくとも１種の硬化性樹脂、少なくとも１種の自硬性粘土またはそれらの組合せを含有する、請求項１〜１７、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
１種または複数のポリマーを、直接撒布エレクトロスピニング、共蒸着およびエマルションエレクトロスピニングを含む群より選択されるエレクトロスピニング技術により前記組成物の層に組み込む、請求項１〜１７、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記組成物の厚さまたは構造が、治療を必要とする身体部位の変形や異常によって異なる、請求項１〜１７、４７および４８のいずれか一項に記載の組成物。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図３Ｆ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【公開番号】特開２０１３−８１７８３（Ｐ２０１３−８１７８３Ａ）
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２２６３３４（Ｐ２０１２−２２６３３４）
【出願日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ
【出願人】（５１２２６３４２９）ボンド　ユニバーシティ　リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】