カスタムメイドメガヌクレアーゼおよびその使用

【課題】特異的なヌクレオチド配列を認識して切断するカスタムメイドメガヌクレアーゼともよばれるレアカットエンドヌクレアーゼを提供する。
【解決手段】認識・切断部位が、由来するメガヌクレアーゼとは異なる、メガヌクレアーゼ変異型、該メガヌクレアーゼ変異型をエンコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター細胞、動物または植物、およびこれらのインビボ又はインビトロでの遺伝子工学並びにゲノム工学のための使用。

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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メガヌクレアーゼ変異型が由来する当初メガヌクレアーゼの部位とは異なる認識・切断部位を示すことを特徴とするメガヌクレアーゼ変異型。
【請求項２】
ａ)当初メガヌクレアーゼからメガヌクレアーゼ変異型のライブラリを作製する工程；及び
ｂ)DNA標的配列を切断できる変異型を単離する工程
を含む方法により得ることができることを特徴とする請求項１に記載のメガヌクレアーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のカスタムメイドメガヌクレアーゼをエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項５】
ターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記ターゲティングDNA構築物が、請求項１又は２に記載のメガヌクレアーゼの切断部位の周囲の領域と相同性を共有する配列を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項７】
前記ターゲティングDNA構築物が：
ａ)請求項１又は２に記載のメガヌクレアーゼの切断部位の周囲の領域と相同性を共有する配列、及び
ｂ)ａ)の配列で挟まれる導入される配列
を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載のベクター。
【請求項８】
請求項３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４〜７のいずれか１項に記載のベクターにより改変されたことを特徴とする細胞。
【請求項９】
請求項３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４〜７のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項１０】
請求項３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４〜７のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とするヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載のメガヌクレアーゼ、請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４〜７のいずれか１項に記載のベクター、請求項８に記載の細胞、請求項９に記載のトランスジェニック植物、請求項１０に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の、分子生物学、インビボ又はインビトロ遺伝子工学及びインビボ又はインビトロゲノム工学のための使用。
【請求項１２】
DNA標的配列を含む対象の部位に二本鎖破壊を導入し、それによりDNA組換え事象、DNA損失又は細胞死を導くための請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記二本鎖破壊が、特定配列を修復するため、特定配列を改変するため、変異した遺伝子の代わりに機能的遺伝子を回復させるため、対象の内因性遺伝子を減弱させるか又は活性化するため、対象の部位に突然変異を導入するため、外因性遺伝子又はその一部分を導入するため、内因性遺伝子又はその一部分を不活性化するか又は欠失させるため、染色体腕を転座させるため、あるいはDNAを修復されないままにして分解させるためであることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記メガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、トランスジェニック植物又はヒト以外の哺乳動物が、請求項６又は７に規定されるターゲティングDNA構築物と関連することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載のメガヌクレアーゼを用いてベクターに位置しかつDNA標的配列を含む対象の部位において二本鎖破壊を導入し、それにより切断部位の周囲の配列と相同性を示す別のベクターとの相同的組換えを誘導する工程を含むことを特徴とする遺伝子工学の方法。
【請求項１６】
次の工程：
１)請求項１又は２に記載のメガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程；
２)標的された遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる導入される配列を含むターゲティングDNA構築物を提供する工程
を含むことを特徴とするゲノム工学の方法。
【請求項１７】
次の工程：
１)請求項１又は２に記載のメガヌクレアーゼの少なくとも１つの認識・切断部位を含むゲノム遺伝子座に二本鎖破壊を導入する工程；
２)切断部位の周囲の領域と相同性を共有する染色体DNAと、相同的組換えに適切な条件下で保持する工程
を含むことを特徴とするゲノム工学の方法
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１９】
標的遺伝子座と相同性を共有する配列で挟まれる対象の部位を修復する配列を含むターゲティングDNA構築物をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターの、遺伝子疾患の予防、改善又は治療を必要とする個体において該個体にいずれの手段により投与される該遺伝子疾患を予防、改善又は治療するための医薬品を製造するための使用。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターの、DNA媒介物を提示する感染性因子により引き起こされる疾患の予防、改善又は治療を必要とする個体において該個体にいずれの手段により投与される該疾患を予防、改善又は治療するための医薬品を製造するための方法。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのメガヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド又はベクターの、生物学的に得られた物質又は生物学的使用もしくは物体の消毒を意図する物質において、インビトロで、DNA媒介物を提示する感染性因子の増殖を阻害するかあるいは該感染性因子を不活性化又は除去するための使用。
【請求項２３】
前記感染性因子がウイルスである請求項２２に記載の使用。

【図１】