カダベリン・脂肪族ジカルボン酸塩
【課題】より簡単な製造プロセスにより高反応収率、高生産速度および高純度でカダベリン・ジカルボン酸塩を製造する。
【解決手段】本発明の課題は、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子を導入した大腸菌もしくはＬ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させた大腸菌を接触させることにより解決される。更には、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液を、ジカルボン酸によりｐＨを制御しながら行ったＬ−リジン発酵液を用い、更にＬ−リジン脱炭酸酵素を同発酵液を用いることにより調整する。こうして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液から、濃縮、有機溶媒添加、ろ過、晶析をすることによりカダベリン・ジカルボン酸塩を製造することによって解決される。
【解決手段】本発明の課題は、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子を導入した大腸菌もしくはＬ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させた大腸菌を接触させることにより解決される。更には、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液を、ジカルボン酸によりｐＨを制御しながら行ったＬ−リジン発酵液を用い、更にＬ−リジン脱炭酸酵素を同発酵液を用いることにより調整する。こうして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液から、濃縮、有機溶媒添加、ろ過、晶析をすることによりカダベリン・ジカルボン酸塩を製造することによって解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造法に関するものである。カダベリン・ジカルボン酸塩はポリアミドの原料として期待され、需要が高まりつつある。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカダベリンが得られることが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら高温反応であるために大量のエネルギーおよび有機溶媒が必要であるうえに、反応収率が非常に低い（３６％）。
【０００３】
また、２−シクロヘキセン−１−オンなどのビニルケトン類を触媒としてリジンから合成する方法が知られている（非特許文献２参照。）。
【０００４】
さらにＬ−リジンを、３−メチル−シクロヘキセノンを触媒にナトリウムメトキシド含むシクロヘキサノール中で１５５℃３時間加熱攪拌することによりカダベリンが得られることが知られている（特許文献１参照。）。
【０００５】
また、この方法によって得られるカダベリンには不純物として、トリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンといった塩基性化合物が含有されている。
【０００６】
また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつある（非特許文献３参照。）。また、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子が知られている（非特許文献４参照。）。
【０００７】
また、カダベリンの組み換え大腸菌での発酵による製造方法（特許文献２参照）および組み換え大腸菌での酵素法による製造方法（特許文献３参照）が知られている。
【０００８】
一方、細胞表面にタンパク質を局在化させる研究は、多くの細菌において行われている。大腸菌について細胞表面にタンパク質を局在化させる研究が活発に行われている（非特許文献５参照。）。
【０００９】
また、ポリアミドは、原料であるフリーのジアミンおよびフリーのジカルボン酸を、各々を精製した後、等モル混合し重合反応を行い製造していた。従来のジアミンおよびジカルボン酸は石油由来の原料を用いるため、溶媒を特に用いることなくフリーのジアミンおよびジカルボン酸が得られた（非特許文献６参照。）。そのため水溶液からのジアミン・ジカルボン酸の晶析を検討する必要はなかった。
【００１０】
しかし、化学合成法とは異なる発酵または酵素法によりポリアミド原料を製造するためには、溶媒として水を使うことが一般的であり、また発酵または酵素法を行うためには溶液のｐＨの調整が一般的に必要である。これら中和剤としてはアルカリ金属水酸化物または無機酸が一般的に用いられ、それらの塩としてジアミンまたはジカルボン酸が晶析されている。例えば、ジカルボン酸であるコハク酸の発酵による製法などでは、コハク酸カルシウムとして晶析し精製している（特許文献４参照。）。
【００１１】
しかしながら、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造について実際的な製造技術は確立されておらず、副生廃棄物の少ない、高純度のカダベリン・ジカルボン酸塩を製造する方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開昭６０−２３３２８号公報第１１〜１２頁
【特許文献２】特開２００２−２２３７７０号公報第５頁
【特許文献３】特開２００２−２２３７７１号公報第４〜５頁
【特許文献４】特開昭６２−２９４０９０号公報第６頁
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】須山正,金尾清造，「アミノ酸の脱炭酸（第４報）」，薬学雑誌，１９６５年，第８５巻，第６号，ｐ．５３１−５３３
【非特許文献２】ミツノリハシモト、外４名，「ケミストリーレターズ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ）」，１９８６年，ｐ．８９３−８９６
【非特許文献３】セリアホワイトテーバー、ハーバートテーバー（Ｃｅｌｉａ ｗｈｉｔｅ ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒｔ ｔａｂｏｒ），「マイクロバイオロジカルレビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．８１−９９
【非特許文献４】シユアンメング（Ｓｈｉ−ｙｕａｎｍｅｎｇ）、外１名，「ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１９９２年，第１７４巻，ｐ．２６５９−２６６９
【非特許文献５】ジョージジョージオウ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ））、外５名，「プロテインエンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，１９９６年，第９巻，第２号，ｐ．２３９−２４７
【非特許文献６】向山光昭著，「工業有機化学」，第４版，東京化学同人，ｐ．２７０−２７３，２７５−２８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンが多く含有されているカダベリン・ジカルボン酸塩をポリマーの原料とする場合、たとえば、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む原料からポリアミドを加熱重縮合で合成する際には、反応温度が高温であるため、カダベリン・ジカルボン酸塩に含まれるトリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの塩基性化合物がポリアミドの分解反応を起こし得られたポリアミドに耐熱性が不足するといった問題点がある。
【００１５】
さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンは、水性生物に有毒で、魚類に対する致死量は２０−４０ｍｇ／ｌであるといった問題点もある。
【００１６】
Ｌ−リジンを発酵法により製造する際に中和剤として塩酸を使用し、その発酵液から酵素法によりカダベリンを製造する際に中和剤として塩酸を使用すると、カダベリンを二塩酸塩として晶析することになる。そうするとカダベリン二塩酸塩をイオン交換法や抽出法などによりフリー化する必要があり、工程が複雑になり、溶媒が必要となったり副生成物などの廃棄処理が必要になったりする。
【００１７】
また、発酵装置および酵素調整装置は別々の反応器で行われることが一般的であり、装置のメンテナンスおよび管理が複雑になる。
【００１８】
また発酵液中にはアミノ酸が含まれているが、アミノ酸の水への溶解度は高く、また、カダベリン・ジカルボン酸塩の水への溶解度も高い。そのため水溶液から直接カダベリン・ジカルボン酸塩のみを晶析する事ができない。
【００１９】
またポリアミドに重合する際にカダベリン・ジカルボン酸塩中にアミノ酸が含まれていると、アミノ酸が重合されポリマーの分岐を起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下させたりする。
【００２０】
本発明の課題は、このような不純物の少ないカダベリン・ジカルボン酸塩を、より簡単な製造プロセスで、発酵および酵素反応の際にアルカリ金属水酸化物または無機酸を中和剤に使用することなく、水溶液からカダベリン・ジカルボン酸塩を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記問題点を解決するために、本発明者らは、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法について鋭意研究を行った結果、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりカダベリン・ジカルボン酸塩を効率的に得られることを見出した。
【００２２】
すなわち、本発明は、
「（１）Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリン・ジカルボン酸塩を単離することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
（２）２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
（３）トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
（４）上記（１）の方法で得られたカダベリン・ジカルボン酸塩または上記（２）あるいは（３）記載のカダベリン・ジカルボン酸塩を原料として含有するポリアミド。」である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、一つの発酵装置で高反応収率、高生産速度および高純度でのカダベリン・ジカルボン酸塩の工業的製造方法およびカダベリン・ジカルボン酸塩の単離方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞内発現ベクターｐＬＤＣ１のフィジカルマップを示す図である。
【図２】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞表面発現ベクターｐＴＭ１６のフィジカルマップを示す図である。
【図３】実施例４〜６における時間とカダベリン生産量の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
カダベリンとは１，５−ペンタンジアミンのことであり、ポリマー原料として有用な化合物である。
【００２６】
本発明において、Ｌ−リジン脱炭酸酵素とは、少なくともＬ−リジンをカダベリンに転換させる酵素でありさえすれば、何等限定されるものではなく、Ｌ−リジン脱炭酸能以外の酵素作用も併せ持っていても良い。但し、その場合、本発明において、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造に大きく支障をきたすような副反応等を引き起こすものは好ましくない。前記Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２）株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、多くの生物に存在することが知られている。
【００２７】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素に特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、またはピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）由来のものが好ましく用いられる。さらに好ましくは安全性の認められているエシェリシア・コリ由来のものである。
【００２８】
本発明における生成物は、アルカリ性の化合物であるカダベリンであるために、反応が進行するにつれ、反応液のｐＨはアルカリ側に変化していく。しかし、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させれば、反応液のｐＨを制御する必要がなく効率よくカダベリンを生産できる。
【００２９】
リジン発酵において培養ｐＨ調整にはアンモニアおよびジカルボン酸を使用することが好ましく、これら中和剤を用い培養ｐＨを５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。
【００３０】
本発明においては、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液は、好ましくは、Ｌ−リジン発酵微生物を培養した発酵液、より好ましくは、Ｌ−リジン発酵微生物を培養する際に、ジカルボン酸により培養液のｐＨを調整しながら行った発酵液である。その際に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞として使用する微生物も特に制限はなく、好ましくはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物であり、更に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【００３１】
使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマル酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、尿素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ１等のビタミン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応じて、無機イオンとして、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、前記に列記した、炭素源、窒素源、有機微量栄養素、無機イオンの例示は、以下、典型培地成分群という。
【００３２】
更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカムの場合硫酸マグネシウム、クエン酸、硫酸鉄、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、尿素、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、ビオチンおよびチアミンが含まれる培地である。
【００３３】
培養条件にも特に制限はなく、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムの場合、好気条件下で１６〜１５０時間程度実施するのが良く、培養温度は２５℃〜４２℃に、特に好ましくは３０℃である。
【００３４】
中和剤として用いるジカルボン酸に特に制限はなく、好ましくは、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸である。官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族または芳香族のジカルボン酸とは、前記２つのカルボキシル基以外には、実質上、官能基が存在しないものである。ここでいう官能基とは、ポリアミド重合反応（反応条件としては、例えば、反応温度２５０〜２７０℃、圧力１０〜２０ｋｇ／ｃｍ２で反応時間１から５時間）の際にアミノ基やカルボキシル基等と反応して、ポリマーの分岐を引き起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下（結晶化度８０％以下）させるような基を指す。例えばアミノ基やカルボキシル基がこれに該当するが、それ以外には、酸性基（スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等）や塩基性基（ヒドラジノ基等）やプロトニックな極性基（水酸基等）や開裂性を有する基（エポシキ基、過酸化基等）やその他反応性の高い基（イソシアナート基等）が該当することが多い。一方、ハロゲン置換基や芳香族性置換基は比較的安定であり、エーテル、エステル、アミド等も安定であり、官能性が低い場合が多い。
【００３５】
ジカルボン酸として、より好ましくは、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸である。
ＨＯＯＣ−(ＣＨ２)ｍ−ＣＯＯＨ （１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０〜１６）
【００３６】
【化１】
【００３７】
【化２】
【００３８】
（但し、一般式（２）、（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜５）
更に好ましくは一般式（１）において、ｍ＝０〜１０、および／または、該一般式（２）および／または（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜１である。
【００３９】
より更に好ましくは、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸、テレフタル酸である。
【００４０】
水溶液中のＬ−リジンおよびジカルボン酸のモル比に制限はない。Ｌ−リジンは塩酸との塩を形成する際１：１のモル比でＬ−リジン・塩酸塩を形成する。そのためＬ−リジン・ジカルボン酸塩の状態では水溶液中にはＬ−リジンとジカルボン酸のモル比は１：０．５であるはずである。しかし、用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の至適ｐＨ付近になるように調整するために、ジカルボン酸をさらに添加（Ｌ−リジン：ジカルボン酸＝１：０．５５〜０．７５［モル比］）することが好ましい。またはアルカリを添加する必要がある場合はアンモニアで調整することが好ましい。
【００４１】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素は本来ビタミンＢ６と結合し存在するが、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液にビタミンＢ６を添加することにより、生産速度および反応収率を向上させることができる。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はない。反応中に適宜添加しても良い。好ましくはＬ−リジン脱炭酸酵素が溶液状態であれば、酵素溶液中に添加することが好ましい。反応液中でのビタミンＢ６の濃度については特に制限はなく。好ましくは反応液に０．０５ｍＭのビタミンＢ６濃度となるように加えればよい。用いるビタミンＢ６に特に制限はない。好ましくは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種である。さらに好ましくはピリドキサルリン酸である。
【００４２】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素または、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞としては、特に制限はないが、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞内で高発現した組換え細胞（細胞内発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を遠心分離、または、更に酵素の分離などの通常の方法により回収したものなどが挙げられる。
【００４３】
また、これとは別に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞（細胞表面発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収したものでも良い。
【００４４】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞とは、少なくともＬ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している状態であり、細胞内に同時にＬ−リジン脱炭酸酵素が存在していても良い。
【００４５】
一方、細胞表面にＬ−リジン脱炭酸酵素を局在化させる具体的な方法としては、例えば、分泌シグナル配列の一部、細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡを大腸菌に導入すればよい。
【００４６】
分泌シグナル配列の一部に制限はない。宿主においてタンパク質を分泌するために必要な配列であればよい。大腸菌においては、例えばリポプロテインの配列の一部であり、具体的には、アミノ酸配列としてＭＫＡＴＫＬＶＬＧＡＶＩＬＧＳＴＬＬＡＧＣＳＳＮＡＫＩＤＱ（アミノ酸の一文字表記）と翻訳される遺伝子配列であることが好ましい。
【００４７】
細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列に特に制限はない。大腸菌においては、例えば外膜結合タンパク質の配列の一部であり、具体的にはＯｍｐＡ（外膜結合タンパク質）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列の一部であることが好ましい。
【００４８】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子、リポプロテイン遺伝子およびＯｍｐＡ遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。例えばエシェリシア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてＬ−リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子またはｌｄｃ遺伝子をクローニングする。この際使用する染色体ＤＮＡはエシェリシア・コリ由来であればどの菌株由来でもよい。なお、本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
【００４９】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化していることの確認は、例えばＬ−リジン脱炭酸酵素を抗原として作製した抗体により、細胞表面発現組み換え細胞を免疫反応後、包埋、薄切りし、電子顕微鏡（免疫電顕法）により観察することで確認できる。
【００５０】
本発明では、Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性が上昇した組換え細胞から調製されたものが好ましく使用できる。細胞内もしくは細胞表面でＬ−リジン脱炭酸酵素の活性を上昇させる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられる。
【００５１】
細胞内もしくは細胞表面の酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００５２】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００５３】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（バーグ，Ｄ．Ｅ．（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ）、外１名，「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９８３年，第１巻，ｐ．４１７）やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
【００５４】
蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはＳＤ配列、真核生物ではＫｏｚａｋのコンセンサス配列を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５号公報）などが挙げられる。
【００５５】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性を上昇させる手段としては、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、Ｌ−リジン脱炭酸酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。
【００５６】
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（クラマー，Ｗ．（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．）、外１名，「メゾットインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」，１９８７年，第１５４巻，ｐ．３５０）、リコンビナントＰＣＲ法、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００５７】
組換え細胞としては、微生物、動物、植物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例えば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。また、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞などが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、大腸菌などが用いられる。
【００５８】
また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を複数種組み合わせて使用しても良い。
【００５９】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を得るために、組換え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、大腸菌の場合しばしばLB培地が用いられる。好ましい成分として、前記典型培地成分群があげられる。
【００６０】
更に好ましい培地は、Ｌ−リジン発酵を行った後の発酵液である。この発酵液にＬ−リジン脱炭酸酵素を得るために必要な栄養素を更に添加しても良い。
【００６１】
培養条件にも特に制限はなく、例えば大腸菌の場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するのが良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは３７℃に、培養ｐＨは５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なおｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００６２】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を高発現させた宿主がＬ−リジンまたはカダベリンまたはジカルボン酸を資化してしまう場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を精製して用いる方が好ましい。
【００６３】
例えば、回収した細胞内発現組み換え細胞から細胞破砕液を調整するには、通常の方法が用いられる。すなわち、細胞内発現組み換え細胞を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去することにより細胞破砕液が得られる。
【００６４】
細胞破砕液からＬ−リジン脱炭酸酵素を精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱処理、ｐＨ処理など酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わされて用いられる。
【００６５】
工業的には精製方法は簡便な方がよく、部分的に精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることが好ましい。部分的な精製とは、工業的に容易な処理のみ行うことであり例えば熱処理、ｐＨ処理等が挙げられる。好ましくは熱処理である。さらに好ましくは単離精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることである。Ｌ−リジン脱炭酸酵素を部分的に精製、または単離精製することで、Ｌ−リジンの分解やカダベリンの分解またはジカルボン酸の分解を引き起こす酵素を取り除くことができる。
【００６６】
本発明で使用する精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素は、固定化することで繰り返しカダベリン合成反応に使用することができ、酵素の調製に必要なコストを低減させることができる。固定化方法としては、アクリルアミドなどの合成高分子に包括する方法、セファロースやスチレン樹脂を骨格とするイオン交換性担体や疎水性担体に吸着させる方法、または、ガラス担体に共有結合で結合させる方法などが挙げられる。
【００６７】
さらに、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している細胞を作用させれば、Ｌ−リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高生産速度でカダベリンが得られる。さらにはその細胞を回収することで繰り返し酵素反応に利用することができる。しかも酵素の調整が非常に簡便である。
【００６８】
これらＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞をゲル状担体により包括固定化すると、細胞および酵素が安定化し、酵素の繰り返し利用が簡便にできるようになる。
【００６９】
ゲル状担体としては、特に制限はない。高分子多糖類でも合成高分子でもよく、好ましくは高分子多糖類である。より好ましくは、アルギン酸、カッパーカラギーナンまたはポリアクリルアミドのいずれかであり、更に好ましくはカッパーカラギーナンである。
【００７０】
包括固定する方法に特に制限はない。Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性が低下しない程度の穏和な条件で行うことが好ましい。
【００７１】
包括固定するゲル状担体の量に特に制限はない。調整したＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞のすべてを包括固定できればよい。
【００７２】
一般的に酵素というものは本来あるべきアミノ酸配列で自然界に存在するため、人工的にアミノ酸配列を付与もしくは欠如させると酵素の活性を失うことが多い。しかし本発明において細胞内にＬ−リジン脱炭酸酵素を発現させる場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸配列を付与したＬ−リジン脱炭酸酵素が好ましく使用できる。ここで、Ｎ末端に付与するものは６から１０個のヒスチジン残基が好ましい。このように、Ｎ末端アミノ酸配列にアミノ酸を付与することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の精製を簡便にできるようにすることができる。Ｎ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸を付与する方法に特に制限はない。例えばＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子に付与したいアミノ酸配列に相当する塩基配列を遺伝子工学的手法を用い、組み換えればよい。用いる遺伝子工学的手法に特に制限はないが。好ましくはＰＣＲ法やＤＮＡ断片同士の連結による方法がある。
【００７３】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素によるＬ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液からカダベリンへの変換は、上記のようにして得られるＬ−リジン脱炭酸酵素を、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に接触させることによって行うことができる。
【００７４】
用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の量に特に制限はない。Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液をカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液に変換する反応を触媒するのに十分な量であればよい。好ましくは反応液中の酵素濃度が２５から７０ｍｇ／ｌである。好ましくは５０ｍｇ／ｌである。一方、休止細胞を使用する際は、反応液中の細胞濃度が５から１５ｇ／ｌである。好ましくは１０ｇ／ｌである。
【００７５】
なお、本発明においてＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞又はＬ−リジン脱炭酸酵素の活性は、後述の実施例６又は参考例１（２）の条件で，ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株又はその細胞破砕液の活性の、好ましくは１０（より好ましくは５０）倍以上である。
【００７６】
反応温度は、通常、２８〜５５℃、好ましくは３５〜４８℃である。
【００７７】
反応液の状態に特に制限はない。好ましくは静置または攪拌状態である。攪拌状態にする方法には特に制限はない。好ましくは攪拌翼により攪拌する方法である。
【００７８】
反応時間は、使用する酵素活性、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩濃度などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間である。また、反応は、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩を供給しながら連続的に行ってもよい。
【００７９】
このように生成したカダベリン・ジカルボン酸塩を反応終了後、反応液から採取する方法としては、通常の単離または晶析を用いれば良く、例えば、好ましくは反応液を濃縮し、有機溶媒を添加した晶析操作により採取できる。
【００８０】
晶析操作前に水溶液中のカダベリンとジカルボン酸を等モルに調整することが好ましい。更に好ましくはジカルボン酸を過剰に加える方がよい。
【００８１】
本発明で、反応液に添加する有機溶媒は、アルコール類、ケトン類またはニトリル類が好ましい。更に好ましくは、炭素数６以下の脂肪族アルコール類、炭素数６以下の脂肪族ケトン類または炭素数６以下の脂肪族ニトリル類である。
【００８２】
例えば有機溶媒の具体的例として、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロパノール、アセトニトリルまたはアセトン等が挙げられる。
【００８３】
その他、有機溶媒は単独である必要はなく、混合溶媒で有っても良い。例えば、エタノール・アセトン混合液等が挙げられる。
【００８４】
本発明で用いる有機溶媒量は特に限定されないが、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液の重量に対して通常０．１〜５倍、本発明を特に効果的に実施するためには０．３〜２倍が使用される。あるいは、カダベリン・ジカルボン酸塩重量に対して、好ましくは１〜１０（より好ましくは３〜７）倍である。
【００８５】
カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液と有機溶媒との接触方法は任意であり、バッチ法であっても連続法であってもよい。
【００８６】
晶析を効率的に行うために、および釜効率を良くするためにカダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液は濃縮するのが好ましい。濃縮の程度は、無機塩およびカダベリン・ジカルボン酸塩が結晶として析出しない程度が好ましい。水溶液中のカダベリン・ジカルボン酸塩濃度、その他の塩濃度によって濃縮の程度は変わるが、重量基準で１／４〜１／３０まで濃縮するのが好ましく、１／１０〜１／２０まで濃縮するのがより好ましい。
【００８７】
濃縮方法は常圧濃縮、減圧濃縮のいずれでもよいが、濃縮時の液温は通常、水の沸点以下で行われる。かかる液温とするとカダベリン・ジカルボン酸塩が分解する恐れがない。
【００８８】
このようにして、製造されたカダベリン・ジカルボン酸塩は、カダベリン１分子とジカルボン酸１分子よりなる塩であると考えて良いが、何等他の形態を排除するものでもなく、例えばカダベリン２分子とカルボン酸２分子より形成された塩等が含まれていても良い。
【００８９】
本発明の精製方法は、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液に、不純物としてアミノ酸が含まれている場合の精製に特に有効である。含まれているアミノ酸に特に制限はない。好ましくは、非電荷・極性アミノ酸（グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミン）、酸性アミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸）および塩基性アミノ酸（Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒスチジン）のいずれかが含まれている場合の精製に特に有効である。更に好ましくは、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リジンのいずれかが含まれている場合である。本発明において、水溶液中に含まれるアミノ酸濃度は、好適には０．０１〜１重量％である。前記数値範囲の下限とを下回るとカダベリンの生成が困難となる可能性があり、一方、上限値を上回ると単離・晶析が困難となる恐れがあり、いずれも好ましくない。
【００９０】
次いで、濃縮工程で濃縮されたカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液に有機溶媒を添加し、析出した結晶を遠心分離などの通常の固液分離の方法によって取り除き、この有機溶媒からカダベリン・ジカルボン酸塩を通常の晶析分離操作によりカダベリン・ジカルボン酸塩を単離する。例えば、有機溶媒を添加した濃縮液をそのまま冷却してカダベリン・ジカルボン酸塩を晶析した後、結晶を遠心分離などの通常の固液分離の方法によって単離すると高純度のカダベリン・ジカルボン酸塩を得ることができる。
【００９１】
晶析行程でカダベリン・ジカルボン酸塩から分離された有機溶媒は晶析操作にリサイクルすることが好ましい。
【００９２】
かくして単離したカダベリン・ジカルボン酸塩は再度既知の晶析精製方法で、つまり、有機溶媒で均一溶液とした後、その均一液を冷却したり、熱時ろ過したろ液を冷却したりしてカダベリン・ジカルボン酸塩を結晶化させ、高純度品にできる。
【００９３】
このようにして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩は、トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの不純物が少ない。本発明の方法で製造することで、以下の方法で分析した場合に、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下のカタベリン・ジカルボン酸塩が得られる。さらに、以下の方法で分析した場合に、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下であり、かつ、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。
【００９４】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの分析は、ＧＣ−ＭＳ法によって以下の条件で行う。
ＧＣ−ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
カラム：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
オーブン：１２０℃（一定）
インジェクト：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
流速：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ（一定）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０から４００）。
【００９５】
このようにして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩は、ポリアミドの原料として有用である。
【００９６】
ポリアミドの製造方法としては、こうして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩および水の混合物を、加熱して脱水反応を進行させる加熱重縮合法が用いられる。また、加熱重縮合後、固相重合することによって、分子量を上昇させることも可能である。固相重合は、１００℃から融点の温度範囲で、真空中、あるいは不活性ガス中で加熱することにより進行し、加熱重縮合では分子量が不十分なポリアミドを高分子量化することができる。
【００９７】
本発明で得られるカダベリン・ジカルボン酸塩をポリアミドの原料とすることで、耐熱性の高いポリアミドが得られる。
【実施例】
【００９８】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００９９】
[Ｌ−リジン濃度およびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【０１００】
[アジピン酸、コハク酸濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
使用カラム：ＳＣＲ−１０１Ｈ（島津製作所）
移動相：０．０２５％（ｖ／ｖ）硫酸水溶液
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプルを、検量線が直線性を有することができる範囲内の濃度となるように、水で希釈し、１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【０１０１】
参考例１（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の調整）
（１）Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子のクローニングおよび細胞内発現ベクターの作製
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用いてＬ−リジン・ジカルボン酸塩からカダベリン・ジカルボン酸塩に変換させるために、エシェリシア・コリのＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【０１０２】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：１）、５’−ｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：２）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位 ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた（ポリメラーゼ連鎖反応：以後、ＰＣＲ法と記す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡと命名した。
【０１０３】
このｐＴ７−ｃａｄＡを増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：３）、５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。ここで得られる産物は、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）由来の塩基配列と、オリゴヌクレオチド（配列番号：４）由来の塩基配列が、それぞれｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端、および３’末端に付加されている。この産物を１％アガロースにて電気泳動し、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡ１と命名した。
【０１０４】
このｐＴ７−ｃａｄＡ１をＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、得られた２．１ｋｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、予めＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＬＤＣ１と命名した（図１）。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に６個のヒスジチン残基が付加された分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を生産することができる。
【０１０５】
（２）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の産生
ｐＬＤＣ１でエシェリシア・コリＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株と命名した。
【０１０６】
次にＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌したＬＢ培地（ナカライテスク社製）（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行い、前培養液を得た。
【０１０７】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後にＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）（１ｍＭ）添加し、更に４時間培養した。対照実験として、ＪＭ１０９株をｐＴＶ１１８Ｎで形質転換した形質転換体（以後、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株とする）を用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。これらのL-リジン脱炭酸酵素活性の測定を単位時間当たりに生成するカダベリンの濃度を測定することにより行った。その結果、対照実験であるＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株由来の細胞破砕液に対して、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株においてはＬ−リジン脱炭酸酵素活性は約１００倍に上昇していた。また、この細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）でウエスタンブロッティングを行った結果、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株由来の細胞破砕液のみから、分子量約８０ｋＤａの組み換えL-リジン脱炭酸酵素を検出した。
【０１０８】
（３）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の精製
この組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基があることこから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。
まず１０ｍｌのキレーティング セファロース ファースト フロー（Ｃｈｉｌａｔｉｎｇ ＳｅｐＨａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）担体（アマシャム バイオサイエンス社製）を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに５０ｍｌの５０ｍＭ硫酸ニッケル水溶液、５０ｍｌのＴＢＳ緩衝液の順で流した後、（２）と同様の方法で得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株の５００ｍｌ培養液由来の５０ｍｌ細胞破砕液を流した。その後、１００ｍｌのイミダゾール（５ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液、１００ｍｌのイミダゾール（５０ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液をこの順序で流した。更に５０ｍｌのイミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液のＬ−リジン脱炭酸酵素活性を（２）と同様の方法で測定したところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液のみに活性があった。また、カラムに流した各々の緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クマシーブリリアントブルーで染色たところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液から、約８０ｋＤａの単一バンドを検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液を（２）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液のみに約８０ｋＤａタンパク質を検出し、この精製タンパク質はＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素であることを確認した。
【０１０９】
（４）Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞表面発現ベクターの作製
まず、リポプロテインの配列の一部および外膜結合タンパク質（ＯｍｐＡ）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列を一つのカセットとしてクローニングした。
【０１１０】
即ち、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている外膜結合タンパク質（ｏｍｐＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇ−３’（配列番号：５）５’−ａｔａｇｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃｃｇｇａｃｇａｇｔｇｃｃｇ−３’（配列番号：６）、５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔａａｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃｔａｃｔｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｇｔｔｇｃｔｃｃａｇｃａａｃｇｃｔａａａａｔｃｇａｔｃａｇａａｃｃｃｇｔａ−３’（配列番号：７）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：５）（配列番号：６）（配列番号：７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。このＰＣＲ法により得られた産物を２％アガロースにて電気泳動し、ｏｍｐＡ遺伝子を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ７と命名した。
【０１１１】
このｐＴＭ７をＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化し、得られた約０．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化しておいたｐＵＣ１９（宝酒造製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１４と命名した。
【０１１２】
次に、エシェリシア・コリＫ１２株のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【０１１３】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｔａｔｇｔｃｇａｃａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔ−３’（配列番号：８）、５’−ｇｇａｇａｇｃｔｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔ−３’（配列番号：９）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：８）（配列番号：９）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。
【０１１４】
このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１５と命名した。
【０１１５】
これら調整したｐＴＭ１５をＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化し、得られた約２．１ｋｂのＳａｌＩ、ＳａｃＩ断片を、予めＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化しておいたｐＴＭ１４のＳａｌＩ／ＳａｃＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１６（図２）と命名した。
【０１１６】
このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化され、その大腸菌を回収するだけでＬ−リジン脱炭酸酵素を調整することができるようになる。
【０１１７】
（５）Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化した細胞の調整
ｐＴＭ１６でエシェリシア・コリＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株と命名した。
【０１１８】
次にＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まずＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【０１１９】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０cmで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後にＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、更に４時間培養した。こうして得られた菌体を遠心回収し、１０ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）で３回洗浄後、遠心し菌体を回収した。
【０１２０】
実施例１，２、比較例１（Ｌ−リジン・ジカルボン酸水溶液を用いることの効果）
１，０００ｍｌのフラスコに、表１に示すようにＬ−リジンまたはＬ−リジンおよびジカルボン酸を水溶液５００ｍｌに加えた。その後、終濃度５０ｍｇ／ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素および終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
この結果、原料としてＬ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液を用いると、ｐＨの調整をしなくてもカダベリン・ジカルボン酸塩が得られた。
【０１２３】
実施例３、比較例２（Ｌ−リジン発酵をジカルボン酸で中和することの効果）
コリネバクテリウム・グルタミカ ＡＴＣＣ１３２８６株を滅菌ＬＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行って、前々培養液を得た。
【０１２４】
この前々培養液を滅菌ＬＢ培地５０ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行って、前培養液を得た。
【０１２５】
次に表２に示す発酵培地９５０ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を１ｖｖｍ（１分間に培養液体積と同等の体積の空気を通気する）で通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら７５時間培養を行った。中和剤として、滅菌したアジピン酸水溶液（１０ｇ／ｌ）およびアンモニア水（３Ｍ）（実施例３の場合）、もしくは、塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）（比較例２の場合）で行った。 培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中に、実施例３および比較例２共に総量として１０ｇのＬ−リジンを生成した。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
次にそれぞれの培養上清に終濃度５０ｍｇ／ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素および終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え、４５℃で４８時間作用させた。この反応液中に、実施例３および比較例２共に総量として６．６ｇのカダベリンを生成した。
【０１２８】
次にそれぞれの反応液を２Ｌ３つ口フラスコ内で減圧下で水を留去した。スラリーの粘度が上昇し攪拌操作性が悪化し始めたところで濃縮を終了した。素早く８０ｇのエタノールを加え、６５℃まで加熱し溶解させた。溶解せずに析出した結晶をろ過により固液分離した。その後均一に溶解したエタノールを徐々に冷却し、晶析、固液分離、乾燥した。実施例３では、カダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶１２．２ｇを得た。対して比較例２では、カダベリン二塩酸塩の結晶６．８ｇを得た。
【０１２９】
比較例２ではこの後さらに、得られたカダベリン二塩酸塩の結晶を水に溶解し、水酸化ナトリウムを添加し、この水溶液のｐＨを１３以上にした。次にクロロホルムを水溶液と等量加え、クロロホルム相にカダベリンを抽出した。最後にこのクロロホルム相を、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりフリーのカダベリン３．６ｇを単離した。
【０１３０】
この単離したカダベリンと等モルのアジピン酸５．１ｇを水に一旦溶解させ減圧下で水を留去し、乾燥することでカダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶８．７ｇを得た。
【０１３１】
この結果、Ｌ−リジン発酵を塩酸で中和せずに、アジピン酸で中和することでカダベリン・アジピン酸塩を得る工程が簡略化される。そのため当然ながら対原料収率が向上する。
【０１３２】
実施例４〜６（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の状態の効果）
実施例３の方法と同様にＬ−リジン発酵を行い、総量として１０ｇのＬ−リジンを含む培養上清を得た。
【０１３３】
この培養上清に終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え、最後に参考例１（２）および（５）に記載の方法により調整したＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ菌体（実施例６）、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１菌体（実施例４）およびＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体（実施例５）を加え、４５℃で２４時間作用させた。経時的にカダベリンの濃度を測定した結果を図３に示す。
【０１３４】
この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させることで高生産速度でカダベリンが得られた。
【０１３５】
実施例７（Ｌ−リジン発酵培地でＬ−リジン脱炭酸酵素を調整する効果）
実施例３の方法と同様にＬ−リジン発酵を行い、総量として１０ｇのＬ−リジンを含む培養上清を得た。
【０１３６】
この培養上清に終濃度１０ｇ／ｌになるように滅菌したグルコースを添加し、ＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体を１白金耳植菌し、滅菌した空気を１ｖｖｍで通気しながら、３７℃、攪拌翼回転数４００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら２４時間培養を行った。中和剤として滅菌したアジピン酸水溶液（１０ｇ／ｌ）およびアンモニア水（３Ｍ）を使用した。培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中に、全量として６．８ｇのカダベリンを生成した。
【０１３７】
この培養上清を実施例３に記載の方法でカダベリン・アジピン酸塩を精製し、カダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶１２．５ｇを得た。
【０１３８】
この結果一つの発酵装置を用いるだけでカダベリン・アジピン酸を得ることができた。
【０１３９】
比較例３（既存の化学合成法によるカダベリンの調製）
Ｌ−リジン一塩酸塩２０ｇ（フルカ社製）シクロヘキサノール１００ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）に懸濁し、次いで２８％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（シグマアルドリッチジャパン製）２１．２ｍｌ、３−メチル−シクロヘキセノン１ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、１５５℃で３時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に塩化水素４ｇ（シグマアルドリッチジャパン製）を含むイソプロパノール溶液２０ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、析出した生成物を回収し、乾燥することによりカダベリン二塩酸塩を得た（特開昭６０−２３３２８号公報の実施例３記載の方法）。
【０１４０】
得られたカダベリン二塩酸塩を水に溶解させ、この水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を添加することによってカダベリン二塩酸塩をカダベリンに変換し、クロロホルムで抽出して、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することにより、カダベリンを得た。この単離したカダベリンと等モルのアジピン酸を水に一旦溶解させ減圧下で乾燥することでカダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶を得た。
【０１４１】
実施例３，６、比較例３の不純物の同定
実施例３および６で得られたカダベリン・アジピン酸塩の不純物の分析を、下記に示す条件でＧＣ−ＭＳ法により行い、比較例３で調製したカダベリン・アジピン酸塩の不純物分析と比較した結果を表３に示す。
ＧＣ−ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
カラム：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
オーブン：１２０℃（一定）
インジェクト：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
流速：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ（一定）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０から４００）
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用い生成したカダベリンをカダベリン・アジピン酸塩に精製することにより、水性生物に有毒で、また酸と接触すると反応してしまうトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下かつ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下の高純度カダベリン・アジピン酸塩が得られた。
【０１４４】
実施例７（ポリアミドの合成）
実施例３の方法で得られたカダベリン・アジピン酸の等モル塩を水に溶解させの５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを調整した。この溶液を試験管に仕込み、オートクレーブに入れて、密閉し、窒素置換した。ジャケット温度を２６５℃に設定し、加熱を開始した。缶内圧力が１７．５ｋｇ／ｃｍ2に到達した後、缶内圧力を１７．５ｋｇ／ｃｍ2で３時間保持した。その後、ジャケット温度を２７５℃に設定し、２時間かけて缶内圧力を常圧に放圧した。その後、缶内温度が２４５℃に到達した時点で、加熱を停止した。室温に放冷後、試験管をオートクレーブから取り出し、ポリアミドを得た。
【０１４５】
比較例４
比較例３の方法で得られたカダベリン・アジピン酸の等モル塩を水に溶解させ５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを調整し用いる以外は、実施例７と全く同様の方法でポリアミドを得た。
【０１４６】
実施例７、比較例４のポリアミドの評価
実施例７で得られたポリアミドおよび比較例４で得られたポリアミドを下記に示す方法で比較評価した。その結果を表４に示す。
【０１４７】
［ポリアミド中の２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンの定量（ＧＣ−ＭＳ）］
ポリアミド約１５ｇを精秤して、メタノールでソックスレー抽出し、その抽出液を、下記条件でＧＣ−ＭＳ分析して、ポリアミド中に含まれる２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンを定量した。
装置：ヒューレットパッカード製 ＨＰ５８９０質量検出器
カラム：５％−ジフェニル−９５％−ジメチルポリシロキサン
カラム温度：Ｉｎｉｔｉａｌ １００℃
Ｆｉｎａｌ ２５０℃
昇温速度：１０℃／ｍｉｎ
注入口温度：２３０℃
検出器温度：２８０℃
キャリアガス：ヘリウム
注入口圧力：５０ｋｇ／ｃｍ２
試料注入量：１μｌ。
【０１４８】
［ＤＳＣ（示差走査熱量測定）］
セイコー電子工業製 ロボットＤＳＣ ＲＤＣ２２０を用い、窒素雰囲気下、ポリアミドを約５ｍｇを採取し、次の条件で測定した。融点＋２５℃に昇温して３分間保持し、ポリアミドを完全に融解させた後、２０℃／分の降温速度で、３０℃まで降温し、３分間保持した後、３０℃から融点＋２５℃まで２０℃／分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度、および熱量を求めた。
【０１４９】
［相対粘度（ηｒ）］
９８％硫酸中、０．０１ｇ／ｍｌ濃度、２５℃でオストワルド式粘度計を用いて測定を行った。
【０１５０】
［溶融滞留試験］
試験管にポリアミド約５ｇを仕込み、窒素雰囲気下、融点＋２０℃の温度のシリコンバスに浸漬し、ポリアミドが完全に溶融してから３０分間放置した後、ポリアミドを回収して相対粘度測定を行った。
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
その結果、本発明の方法によって得られた高純度カダベリン・ジカルボン酸塩を使用することにより、相対粘度（ηｒ）の保持率の高い（耐熱性の高い）ポリアミドが得られた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造法に関するものである。カダベリン・ジカルボン酸塩はポリアミドの原料として期待され、需要が高まりつつある。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカダベリンが得られることが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら高温反応であるために大量のエネルギーおよび有機溶媒が必要であるうえに、反応収率が非常に低い（３６％）。
【０００３】
また、２−シクロヘキセン−１−オンなどのビニルケトン類を触媒としてリジンから合成する方法が知られている（非特許文献２参照。）。
【０００４】
さらにＬ−リジンを、３−メチル−シクロヘキセノンを触媒にナトリウムメトキシド含むシクロヘキサノール中で１５５℃３時間加熱攪拌することによりカダベリンが得られることが知られている（特許文献１参照。）。
【０００５】
また、この方法によって得られるカダベリンには不純物として、トリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンといった塩基性化合物が含有されている。
【０００６】
また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつある（非特許文献３参照。）。また、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子が知られている（非特許文献４参照。）。
【０００７】
また、カダベリンの組み換え大腸菌での発酵による製造方法（特許文献２参照）および組み換え大腸菌での酵素法による製造方法（特許文献３参照）が知られている。
【０００８】
一方、細胞表面にタンパク質を局在化させる研究は、多くの細菌において行われている。大腸菌について細胞表面にタンパク質を局在化させる研究が活発に行われている（非特許文献５参照。）。
【０００９】
また、ポリアミドは、原料であるフリーのジアミンおよびフリーのジカルボン酸を、各々を精製した後、等モル混合し重合反応を行い製造していた。従来のジアミンおよびジカルボン酸は石油由来の原料を用いるため、溶媒を特に用いることなくフリーのジアミンおよびジカルボン酸が得られた（非特許文献６参照。）。そのため水溶液からのジアミン・ジカルボン酸の晶析を検討する必要はなかった。
【００１０】
しかし、化学合成法とは異なる発酵または酵素法によりポリアミド原料を製造するためには、溶媒として水を使うことが一般的であり、また発酵または酵素法を行うためには溶液のｐＨの調整が一般的に必要である。これら中和剤としてはアルカリ金属水酸化物または無機酸が一般的に用いられ、それらの塩としてジアミンまたはジカルボン酸が晶析されている。例えば、ジカルボン酸であるコハク酸の発酵による製法などでは、コハク酸カルシウムとして晶析し精製している（特許文献４参照。）。
【００１１】
しかしながら、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造について実際的な製造技術は確立されておらず、副生廃棄物の少ない、高純度のカダベリン・ジカルボン酸塩を製造する方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開昭６０−２３３２８号公報第１１〜１２頁
【特許文献２】特開２００２−２２３７７０号公報第５頁
【特許文献３】特開２００２−２２３７７１号公報第４〜５頁
【特許文献４】特開昭６２−２９４０９０号公報第６頁
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】須山正,金尾清造，「アミノ酸の脱炭酸（第４報）」，薬学雑誌，１９６５年，第８５巻，第６号，ｐ．５３１−５３３
【非特許文献２】ミツノリハシモト、外４名，「ケミストリーレターズ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ）」，１９８６年，ｐ．８９３−８９６
【非特許文献３】セリアホワイトテーバー、ハーバートテーバー（Ｃｅｌｉａ ｗｈｉｔｅ ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒｔ ｔａｂｏｒ），「マイクロバイオロジカルレビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」，１９８５年，第４９巻，ｐ．８１−９９
【非特許文献４】シユアンメング（Ｓｈｉ−ｙｕａｎｍｅｎｇ）、外１名，「ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１９９２年，第１７４巻，ｐ．２６５９−２６６９
【非特許文献５】ジョージジョージオウ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ））、外５名，「プロテインエンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，１９９６年，第９巻，第２号，ｐ．２３９−２４７
【非特許文献６】向山光昭著，「工業有機化学」，第４版，東京化学同人，ｐ．２７０−２７３，２７５−２８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンが多く含有されているカダベリン・ジカルボン酸塩をポリマーの原料とする場合、たとえば、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む原料からポリアミドを加熱重縮合で合成する際には、反応温度が高温であるため、カダベリン・ジカルボン酸塩に含まれるトリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの塩基性化合物がポリアミドの分解反応を起こし得られたポリアミドに耐熱性が不足するといった問題点がある。
【００１５】
さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンは、水性生物に有毒で、魚類に対する致死量は２０−４０ｍｇ／ｌであるといった問題点もある。
【００１６】
Ｌ−リジンを発酵法により製造する際に中和剤として塩酸を使用し、その発酵液から酵素法によりカダベリンを製造する際に中和剤として塩酸を使用すると、カダベリンを二塩酸塩として晶析することになる。そうするとカダベリン二塩酸塩をイオン交換法や抽出法などによりフリー化する必要があり、工程が複雑になり、溶媒が必要となったり副生成物などの廃棄処理が必要になったりする。
【００１７】
また、発酵装置および酵素調整装置は別々の反応器で行われることが一般的であり、装置のメンテナンスおよび管理が複雑になる。
【００１８】
また発酵液中にはアミノ酸が含まれているが、アミノ酸の水への溶解度は高く、また、カダベリン・ジカルボン酸塩の水への溶解度も高い。そのため水溶液から直接カダベリン・ジカルボン酸塩のみを晶析する事ができない。
【００１９】
またポリアミドに重合する際にカダベリン・ジカルボン酸塩中にアミノ酸が含まれていると、アミノ酸が重合されポリマーの分岐を起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下させたりする。
【００２０】
本発明の課題は、このような不純物の少ないカダベリン・ジカルボン酸塩を、より簡単な製造プロセスで、発酵および酵素反応の際にアルカリ金属水酸化物または無機酸を中和剤に使用することなく、水溶液からカダベリン・ジカルボン酸塩を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記問題点を解決するために、本発明者らは、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法について鋭意研究を行った結果、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりカダベリン・ジカルボン酸塩を効率的に得られることを見出した。
【００２２】
すなわち、本発明は、
「（１）Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリン・ジカルボン酸塩を単離することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
（２）２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
（３）トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
（４）上記（１）の方法で得られたカダベリン・ジカルボン酸塩または上記（２）あるいは（３）記載のカダベリン・ジカルボン酸塩を原料として含有するポリアミド。」である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、一つの発酵装置で高反応収率、高生産速度および高純度でのカダベリン・ジカルボン酸塩の工業的製造方法およびカダベリン・ジカルボン酸塩の単離方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞内発現ベクターｐＬＤＣ１のフィジカルマップを示す図である。
【図２】Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞表面発現ベクターｐＴＭ１６のフィジカルマップを示す図である。
【図３】実施例４〜６における時間とカダベリン生産量の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
カダベリンとは１，５−ペンタンジアミンのことであり、ポリマー原料として有用な化合物である。
【００２６】
本発明において、Ｌ−リジン脱炭酸酵素とは、少なくともＬ−リジンをカダベリンに転換させる酵素でありさえすれば、何等限定されるものではなく、Ｌ−リジン脱炭酸能以外の酵素作用も併せ持っていても良い。但し、その場合、本発明において、カダベリン・ジカルボン酸塩の製造に大きく支障をきたすような副反応等を引き起こすものは好ましくない。前記Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２）株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、多くの生物に存在することが知られている。
【００２７】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素に特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、またはピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）由来のものが好ましく用いられる。さらに好ましくは安全性の認められているエシェリシア・コリ由来のものである。
【００２８】
本発明における生成物は、アルカリ性の化合物であるカダベリンであるために、反応が進行するにつれ、反応液のｐＨはアルカリ側に変化していく。しかし、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させれば、反応液のｐＨを制御する必要がなく効率よくカダベリンを生産できる。
【００２９】
リジン発酵において培養ｐＨ調整にはアンモニアおよびジカルボン酸を使用することが好ましく、これら中和剤を用い培養ｐＨを５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用される。特に好ましくは水溶液である。
【００３０】
本発明においては、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液は、好ましくは、Ｌ−リジン発酵微生物を培養した発酵液、より好ましくは、Ｌ−リジン発酵微生物を培養する際に、ジカルボン酸により培養液のｐＨを調整しながら行った発酵液である。その際に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞として使用する微生物も特に制限はなく、好ましくはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物であり、更に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。
【００３１】
使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマル酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、尿素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ１等のビタミン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応じて、無機イオンとして、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、前記に列記した、炭素源、窒素源、有機微量栄養素、無機イオンの例示は、以下、典型培地成分群という。
【００３２】
更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカムの場合硫酸マグネシウム、クエン酸、硫酸鉄、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウム、尿素、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ロイシン、ビオチンおよびチアミンが含まれる培地である。
【００３３】
培養条件にも特に制限はなく、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムの場合、好気条件下で１６〜１５０時間程度実施するのが良く、培養温度は２５℃〜４２℃に、特に好ましくは３０℃である。
【００３４】
中和剤として用いるジカルボン酸に特に制限はなく、好ましくは、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸である。官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族または芳香族のジカルボン酸とは、前記２つのカルボキシル基以外には、実質上、官能基が存在しないものである。ここでいう官能基とは、ポリアミド重合反応（反応条件としては、例えば、反応温度２５０〜２７０℃、圧力１０〜２０ｋｇ／ｃｍ２で反応時間１から５時間）の際にアミノ基やカルボキシル基等と反応して、ポリマーの分岐を引き起こしたり、ポリマーの結晶化度を低下（結晶化度８０％以下）させるような基を指す。例えばアミノ基やカルボキシル基がこれに該当するが、それ以外には、酸性基（スルホン酸基、リン酸基、フェノール性水酸基等）や塩基性基（ヒドラジノ基等）やプロトニックな極性基（水酸基等）や開裂性を有する基（エポシキ基、過酸化基等）やその他反応性の高い基（イソシアナート基等）が該当することが多い。一方、ハロゲン置換基や芳香族性置換基は比較的安定であり、エーテル、エステル、アミド等も安定であり、官能性が低い場合が多い。
【００３５】
ジカルボン酸として、より好ましくは、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸である。
ＨＯＯＣ−(ＣＨ２)ｍ−ＣＯＯＨ （１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０〜１６）
【００３６】
【化１】
【００３７】
【化２】
【００３８】
（但し、一般式（２）、（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜５）
更に好ましくは一般式（１）において、ｍ＝０〜１０、および／または、該一般式（２）および／または（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜１である。
【００３９】
より更に好ましくは、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸、テレフタル酸である。
【００４０】
水溶液中のＬ−リジンおよびジカルボン酸のモル比に制限はない。Ｌ−リジンは塩酸との塩を形成する際１：１のモル比でＬ−リジン・塩酸塩を形成する。そのためＬ−リジン・ジカルボン酸塩の状態では水溶液中にはＬ−リジンとジカルボン酸のモル比は１：０．５であるはずである。しかし、用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の至適ｐＨ付近になるように調整するために、ジカルボン酸をさらに添加（Ｌ−リジン：ジカルボン酸＝１：０．５５〜０．７５［モル比］）することが好ましい。またはアルカリを添加する必要がある場合はアンモニアで調整することが好ましい。
【００４１】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素は本来ビタミンＢ６と結合し存在するが、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液にビタミンＢ６を添加することにより、生産速度および反応収率を向上させることができる。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はない。反応中に適宜添加しても良い。好ましくはＬ−リジン脱炭酸酵素が溶液状態であれば、酵素溶液中に添加することが好ましい。反応液中でのビタミンＢ６の濃度については特に制限はなく。好ましくは反応液に０．０５ｍＭのビタミンＢ６濃度となるように加えればよい。用いるビタミンＢ６に特に制限はない。好ましくは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種である。さらに好ましくはピリドキサルリン酸である。
【００４２】
本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素または、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞としては、特に制限はないが、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞内で高発現した組換え細胞（細胞内発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を遠心分離、または、更に酵素の分離などの通常の方法により回収したものなどが挙げられる。
【００４３】
また、これとは別に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞（細胞表面発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収したものでも良い。
【００４４】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞とは、少なくともＬ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している状態であり、細胞内に同時にＬ−リジン脱炭酸酵素が存在していても良い。
【００４５】
一方、細胞表面にＬ−リジン脱炭酸酵素を局在化させる具体的な方法としては、例えば、分泌シグナル配列の一部、細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡを大腸菌に導入すればよい。
【００４６】
分泌シグナル配列の一部に制限はない。宿主においてタンパク質を分泌するために必要な配列であればよい。大腸菌においては、例えばリポプロテインの配列の一部であり、具体的には、アミノ酸配列としてＭＫＡＴＫＬＶＬＧＡＶＩＬＧＳＴＬＬＡＧＣＳＳＮＡＫＩＤＱ（アミノ酸の一文字表記）と翻訳される遺伝子配列であることが好ましい。
【００４７】
細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列に特に制限はない。大腸菌においては、例えば外膜結合タンパク質の配列の一部であり、具体的にはＯｍｐＡ（外膜結合タンパク質）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列の一部であることが好ましい。
【００４８】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子、リポプロテイン遺伝子およびＯｍｐＡ遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。例えばエシェリシア・コリＫ１２株の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてＬ−リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子またはｌｄｃ遺伝子をクローニングする。この際使用する染色体ＤＮＡはエシェリシア・コリ由来であればどの菌株由来でもよい。なお、本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
【００４９】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化していることの確認は、例えばＬ−リジン脱炭酸酵素を抗原として作製した抗体により、細胞表面発現組み換え細胞を免疫反応後、包埋、薄切りし、電子顕微鏡（免疫電顕法）により観察することで確認できる。
【００５０】
本発明では、Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性が上昇した組換え細胞から調製されたものが好ましく使用できる。細胞内もしくは細胞表面でＬ−リジン脱炭酸酵素の活性を上昇させる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられる。
【００５１】
細胞内もしくは細胞表面の酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００５２】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００５３】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（バーグ，Ｄ．Ｅ．（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ）、外１名，「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９８３年，第１巻，ｐ．４１７）やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
【００５４】
蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはＳＤ配列、真核生物ではＫｏｚａｋのコンセンサス配列を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５号公報）などが挙げられる。
【００５５】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性を上昇させる手段としては、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、Ｌ−リジン脱炭酸酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。
【００５６】
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（クラマー，Ｗ．（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．）、外１名，「メゾットインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」，１９８７年，第１５４巻，ｐ．３５０）、リコンビナントＰＣＲ法、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００５７】
組換え細胞としては、微生物、動物、植物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例えば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。また、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞などが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、大腸菌などが用いられる。
【００５８】
また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を複数種組み合わせて使用しても良い。
【００５９】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を得るために、組換え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、大腸菌の場合しばしばLB培地が用いられる。好ましい成分として、前記典型培地成分群があげられる。
【００６０】
更に好ましい培地は、Ｌ−リジン発酵を行った後の発酵液である。この発酵液にＬ−リジン脱炭酸酵素を得るために必要な栄養素を更に添加しても良い。
【００６１】
培養条件にも特に制限はなく、例えば大腸菌の場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するのが良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは３７℃に、培養ｐＨは５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なおｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００６２】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を高発現させた宿主がＬ−リジンまたはカダベリンまたはジカルボン酸を資化してしまう場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を精製して用いる方が好ましい。
【００６３】
例えば、回収した細胞内発現組み換え細胞から細胞破砕液を調整するには、通常の方法が用いられる。すなわち、細胞内発現組み換え細胞を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去することにより細胞破砕液が得られる。
【００６４】
細胞破砕液からＬ−リジン脱炭酸酵素を精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱処理、ｐＨ処理など酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わされて用いられる。
【００６５】
工業的には精製方法は簡便な方がよく、部分的に精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることが好ましい。部分的な精製とは、工業的に容易な処理のみ行うことであり例えば熱処理、ｐＨ処理等が挙げられる。好ましくは熱処理である。さらに好ましくは単離精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることである。Ｌ−リジン脱炭酸酵素を部分的に精製、または単離精製することで、Ｌ−リジンの分解やカダベリンの分解またはジカルボン酸の分解を引き起こす酵素を取り除くことができる。
【００６６】
本発明で使用する精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素は、固定化することで繰り返しカダベリン合成反応に使用することができ、酵素の調製に必要なコストを低減させることができる。固定化方法としては、アクリルアミドなどの合成高分子に包括する方法、セファロースやスチレン樹脂を骨格とするイオン交換性担体や疎水性担体に吸着させる方法、または、ガラス担体に共有結合で結合させる方法などが挙げられる。
【００６７】
さらに、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している細胞を作用させれば、Ｌ−リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高生産速度でカダベリンが得られる。さらにはその細胞を回収することで繰り返し酵素反応に利用することができる。しかも酵素の調整が非常に簡便である。
【００６８】
これらＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞をゲル状担体により包括固定化すると、細胞および酵素が安定化し、酵素の繰り返し利用が簡便にできるようになる。
【００６９】
ゲル状担体としては、特に制限はない。高分子多糖類でも合成高分子でもよく、好ましくは高分子多糖類である。より好ましくは、アルギン酸、カッパーカラギーナンまたはポリアクリルアミドのいずれかであり、更に好ましくはカッパーカラギーナンである。
【００７０】
包括固定する方法に特に制限はない。Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性が低下しない程度の穏和な条件で行うことが好ましい。
【００７１】
包括固定するゲル状担体の量に特に制限はない。調整したＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞のすべてを包括固定できればよい。
【００７２】
一般的に酵素というものは本来あるべきアミノ酸配列で自然界に存在するため、人工的にアミノ酸配列を付与もしくは欠如させると酵素の活性を失うことが多い。しかし本発明において細胞内にＬ−リジン脱炭酸酵素を発現させる場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸配列を付与したＬ−リジン脱炭酸酵素が好ましく使用できる。ここで、Ｎ末端に付与するものは６から１０個のヒスチジン残基が好ましい。このように、Ｎ末端アミノ酸配列にアミノ酸を付与することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の精製を簡便にできるようにすることができる。Ｎ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸を付与する方法に特に制限はない。例えばＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子に付与したいアミノ酸配列に相当する塩基配列を遺伝子工学的手法を用い、組み換えればよい。用いる遺伝子工学的手法に特に制限はないが。好ましくはＰＣＲ法やＤＮＡ断片同士の連結による方法がある。
【００７３】
Ｌ−リジン脱炭酸酵素によるＬ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液からカダベリンへの変換は、上記のようにして得られるＬ−リジン脱炭酸酵素を、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に接触させることによって行うことができる。
【００７４】
用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の量に特に制限はない。Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液をカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液に変換する反応を触媒するのに十分な量であればよい。好ましくは反応液中の酵素濃度が２５から７０ｍｇ／ｌである。好ましくは５０ｍｇ／ｌである。一方、休止細胞を使用する際は、反応液中の細胞濃度が５から１５ｇ／ｌである。好ましくは１０ｇ／ｌである。
【００７５】
なお、本発明においてＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞又はＬ−リジン脱炭酸酵素の活性は、後述の実施例６又は参考例１（２）の条件で，ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株又はその細胞破砕液の活性の、好ましくは１０（より好ましくは５０）倍以上である。
【００７６】
反応温度は、通常、２８〜５５℃、好ましくは３５〜４８℃である。
【００７７】
反応液の状態に特に制限はない。好ましくは静置または攪拌状態である。攪拌状態にする方法には特に制限はない。好ましくは攪拌翼により攪拌する方法である。
【００７８】
反応時間は、使用する酵素活性、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩濃度などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間である。また、反応は、Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩を供給しながら連続的に行ってもよい。
【００７９】
このように生成したカダベリン・ジカルボン酸塩を反応終了後、反応液から採取する方法としては、通常の単離または晶析を用いれば良く、例えば、好ましくは反応液を濃縮し、有機溶媒を添加した晶析操作により採取できる。
【００８０】
晶析操作前に水溶液中のカダベリンとジカルボン酸を等モルに調整することが好ましい。更に好ましくはジカルボン酸を過剰に加える方がよい。
【００８１】
本発明で、反応液に添加する有機溶媒は、アルコール類、ケトン類またはニトリル類が好ましい。更に好ましくは、炭素数６以下の脂肪族アルコール類、炭素数６以下の脂肪族ケトン類または炭素数６以下の脂肪族ニトリル類である。
【００８２】
例えば有機溶媒の具体的例として、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロパノール、アセトニトリルまたはアセトン等が挙げられる。
【００８３】
その他、有機溶媒は単独である必要はなく、混合溶媒で有っても良い。例えば、エタノール・アセトン混合液等が挙げられる。
【００８４】
本発明で用いる有機溶媒量は特に限定されないが、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液の重量に対して通常０．１〜５倍、本発明を特に効果的に実施するためには０．３〜２倍が使用される。あるいは、カダベリン・ジカルボン酸塩重量に対して、好ましくは１〜１０（より好ましくは３〜７）倍である。
【００８５】
カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液と有機溶媒との接触方法は任意であり、バッチ法であっても連続法であってもよい。
【００８６】
晶析を効率的に行うために、および釜効率を良くするためにカダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液は濃縮するのが好ましい。濃縮の程度は、無機塩およびカダベリン・ジカルボン酸塩が結晶として析出しない程度が好ましい。水溶液中のカダベリン・ジカルボン酸塩濃度、その他の塩濃度によって濃縮の程度は変わるが、重量基準で１／４〜１／３０まで濃縮するのが好ましく、１／１０〜１／２０まで濃縮するのがより好ましい。
【００８７】
濃縮方法は常圧濃縮、減圧濃縮のいずれでもよいが、濃縮時の液温は通常、水の沸点以下で行われる。かかる液温とするとカダベリン・ジカルボン酸塩が分解する恐れがない。
【００８８】
このようにして、製造されたカダベリン・ジカルボン酸塩は、カダベリン１分子とジカルボン酸１分子よりなる塩であると考えて良いが、何等他の形態を排除するものでもなく、例えばカダベリン２分子とカルボン酸２分子より形成された塩等が含まれていても良い。
【００８９】
本発明の精製方法は、カダベリン・ジカルボン酸塩を含む水溶液に、不純物としてアミノ酸が含まれている場合の精製に特に有効である。含まれているアミノ酸に特に制限はない。好ましくは、非電荷・極性アミノ酸（グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−グルタミン）、酸性アミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−グルタミン酸）および塩基性アミノ酸（Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニンおよびＬ−ヒスチジン）のいずれかが含まれている場合の精製に特に有効である。更に好ましくは、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リジンのいずれかが含まれている場合である。本発明において、水溶液中に含まれるアミノ酸濃度は、好適には０．０１〜１重量％である。前記数値範囲の下限とを下回るとカダベリンの生成が困難となる可能性があり、一方、上限値を上回ると単離・晶析が困難となる恐れがあり、いずれも好ましくない。
【００９０】
次いで、濃縮工程で濃縮されたカダベリン・ジカルボン酸塩水溶液に有機溶媒を添加し、析出した結晶を遠心分離などの通常の固液分離の方法によって取り除き、この有機溶媒からカダベリン・ジカルボン酸塩を通常の晶析分離操作によりカダベリン・ジカルボン酸塩を単離する。例えば、有機溶媒を添加した濃縮液をそのまま冷却してカダベリン・ジカルボン酸塩を晶析した後、結晶を遠心分離などの通常の固液分離の方法によって単離すると高純度のカダベリン・ジカルボン酸塩を得ることができる。
【００９１】
晶析行程でカダベリン・ジカルボン酸塩から分離された有機溶媒は晶析操作にリサイクルすることが好ましい。
【００９２】
かくして単離したカダベリン・ジカルボン酸塩は再度既知の晶析精製方法で、つまり、有機溶媒で均一溶液とした後、その均一液を冷却したり、熱時ろ過したろ液を冷却したりしてカダベリン・ジカルボン酸塩を結晶化させ、高純度品にできる。
【００９３】
このようにして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩は、トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの不純物が少ない。本発明の方法で製造することで、以下の方法で分析した場合に、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下のカタベリン・ジカルボン酸塩が得られる。さらに、以下の方法で分析した場合に、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下であり、かつ、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。
【００９４】
トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの分析は、ＧＣ−ＭＳ法によって以下の条件で行う。
ＧＣ−ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
カラム：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
オーブン：１２０℃（一定）
インジェクト：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
流速：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ（一定）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０から４００）。
【００９５】
このようにして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩は、ポリアミドの原料として有用である。
【００９６】
ポリアミドの製造方法としては、こうして得られたカダベリン・ジカルボン酸塩および水の混合物を、加熱して脱水反応を進行させる加熱重縮合法が用いられる。また、加熱重縮合後、固相重合することによって、分子量を上昇させることも可能である。固相重合は、１００℃から融点の温度範囲で、真空中、あるいは不活性ガス中で加熱することにより進行し、加熱重縮合では分子量が不十分なポリアミドを高分子量化することができる。
【００９７】
本発明で得られるカダベリン・ジカルボン酸塩をポリアミドの原料とすることで、耐熱性の高いポリアミドが得られる。
【実施例】
【００９８】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００９９】
[Ｌ−リジン濃度およびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【０１００】
[アジピン酸、コハク酸濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
使用カラム：ＳＣＲ−１０１Ｈ（島津製作所）
移動相：０．０２５％（ｖ／ｖ）硫酸水溶液
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプルを、検量線が直線性を有することができる範囲内の濃度となるように、水で希釈し、１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【０１０１】
参考例１（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の調整）
（１）Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子のクローニングおよび細胞内発現ベクターの作製
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用いてＬ−リジン・ジカルボン酸塩からカダベリン・ジカルボン酸塩に変換させるために、エシェリシア・コリのＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【０１０２】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：１）、５’−ｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：２）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ塩化カリウム、１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位 ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた（ポリメラーゼ連鎖反応：以後、ＰＣＲ法と記す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡと命名した。
【０１０３】
このｐＴ７−ｃａｄＡを増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：３）、５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。ここで得られる産物は、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）由来の塩基配列と、オリゴヌクレオチド（配列番号：４）由来の塩基配列が、それぞれｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端、および３’末端に付加されている。この産物を１％アガロースにて電気泳動し、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡ１と命名した。
【０１０４】
このｐＴ７−ｃａｄＡ１をＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、得られた２．１ｋｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、予めＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＬＤＣ１と命名した（図１）。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に６個のヒスジチン残基が付加された分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を生産することができる。
【０１０５】
（２）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の産生
ｐＬＤＣ１でエシェリシア・コリＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株と命名した。
【０１０６】
次にＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌したＬＢ培地（ナカライテスク社製）（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行い、前培養液を得た。
【０１０７】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後にＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）（１ｍＭ）添加し、更に４時間培養した。対照実験として、ＪＭ１０９株をｐＴＶ１１８Ｎで形質転換した形質転換体（以後、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株とする）を用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。これらのL-リジン脱炭酸酵素活性の測定を単位時間当たりに生成するカダベリンの濃度を測定することにより行った。その結果、対照実験であるＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株由来の細胞破砕液に対して、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株においてはＬ−リジン脱炭酸酵素活性は約１００倍に上昇していた。また、この細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）でウエスタンブロッティングを行った結果、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株由来の細胞破砕液のみから、分子量約８０ｋＤａの組み換えL-リジン脱炭酸酵素を検出した。
【０１０８】
（３）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の精製
この組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基があることこから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。
まず１０ｍｌのキレーティング セファロース ファースト フロー（Ｃｈｉｌａｔｉｎｇ ＳｅｐＨａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）担体（アマシャム バイオサイエンス社製）を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに５０ｍｌの５０ｍＭ硫酸ニッケル水溶液、５０ｍｌのＴＢＳ緩衝液の順で流した後、（２）と同様の方法で得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株の５００ｍｌ培養液由来の５０ｍｌ細胞破砕液を流した。その後、１００ｍｌのイミダゾール（５ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液、１００ｍｌのイミダゾール（５０ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液をこの順序で流した。更に５０ｍｌのイミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液のＬ−リジン脱炭酸酵素活性を（２）と同様の方法で測定したところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液のみに活性があった。また、カラムに流した各々の緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クマシーブリリアントブルーで染色たところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液から、約８０ｋＤａの単一バンドを検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液を（２）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、イミダゾール（６００ｍＭ）を含むＴＢＳ緩衝液のみに約８０ｋＤａタンパク質を検出し、この精製タンパク質はＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素であることを確認した。
【０１０９】
（４）Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞表面発現ベクターの作製
まず、リポプロテインの配列の一部および外膜結合タンパク質（ＯｍｐＡ）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列を一つのカセットとしてクローニングした。
【０１１０】
即ち、データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている外膜結合タンパク質（ｏｍｐＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇ−３’（配列番号：５）５’−ａｔａｇｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃｃｇｇａｃｇａｇｔｇｃｃｇ−３’（配列番号：６）、５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔａａｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃｔａｃｔｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｇｔｔｇｃｔｃｃａｇｃａａｃｇｃｔａａａａｔｃｇａｔｃａｇａａｃｃｃｇｔａ−３’（配列番号：７）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：５）（配列番号：６）（配列番号：７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。このＰＣＲ法により得られた産物を２％アガロースにて電気泳動し、ｏｍｐＡ遺伝子を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ７と命名した。
【０１１１】
このｐＴＭ７をＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化し、得られた約０．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化しておいたｐＵＣ１９（宝酒造製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１４と命名した。
【０１１２】
次に、エシェリシア・コリＫ１２株のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。
【０１１３】
データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５’−ｔａｔｇｔｃｇａｃａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔ−３’（配列番号：８）、５’−ｇｇａｇａｇｃｔｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔ−３’（配列番号：９）を合成した。エシェリシア・コリＫ１２株から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：８）（配列番号：９）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。
【０１１４】
このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１５と命名した。
【０１１５】
これら調整したｐＴＭ１５をＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化し、得られた約２．１ｋｂのＳａｌＩ、ＳａｃＩ断片を、予めＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化しておいたｐＴＭ１４のＳａｌＩ／ＳａｃＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１６（図２）と命名した。
【０１１６】
このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化され、その大腸菌を回収するだけでＬ−リジン脱炭酸酵素を調整することができるようになる。
【０１１７】
（５）Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化した細胞の調整
ｐＴＭ１６でエシェリシア・コリＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株と命名した。
【０１１８】
次にＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まずＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【０１１９】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０cmで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後にＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、更に４時間培養した。こうして得られた菌体を遠心回収し、１０ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）で３回洗浄後、遠心し菌体を回収した。
【０１２０】
実施例１，２、比較例１（Ｌ−リジン・ジカルボン酸水溶液を用いることの効果）
１，０００ｍｌのフラスコに、表１に示すようにＬ−リジンまたはＬ−リジンおよびジカルボン酸を水溶液５００ｍｌに加えた。その後、終濃度５０ｍｇ／ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素および終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表１に示す。
【０１２１】
【表１】
【０１２２】
この結果、原料としてＬ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液を用いると、ｐＨの調整をしなくてもカダベリン・ジカルボン酸塩が得られた。
【０１２３】
実施例３、比較例２（Ｌ−リジン発酵をジカルボン酸で中和することの効果）
コリネバクテリウム・グルタミカ ＡＴＣＣ１３２８６株を滅菌ＬＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行って、前々培養液を得た。
【０１２４】
この前々培養液を滅菌ＬＢ培地５０ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行って、前培養液を得た。
【０１２５】
次に表２に示す発酵培地９５０ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を１ｖｖｍ（１分間に培養液体積と同等の体積の空気を通気する）で通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら７５時間培養を行った。中和剤として、滅菌したアジピン酸水溶液（１０ｇ／ｌ）およびアンモニア水（３Ｍ）（実施例３の場合）、もしくは、塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）（比較例２の場合）で行った。 培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中に、実施例３および比較例２共に総量として１０ｇのＬ−リジンを生成した。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
次にそれぞれの培養上清に終濃度５０ｍｇ／ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素および終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え、４５℃で４８時間作用させた。この反応液中に、実施例３および比較例２共に総量として６．６ｇのカダベリンを生成した。
【０１２８】
次にそれぞれの反応液を２Ｌ３つ口フラスコ内で減圧下で水を留去した。スラリーの粘度が上昇し攪拌操作性が悪化し始めたところで濃縮を終了した。素早く８０ｇのエタノールを加え、６５℃まで加熱し溶解させた。溶解せずに析出した結晶をろ過により固液分離した。その後均一に溶解したエタノールを徐々に冷却し、晶析、固液分離、乾燥した。実施例３では、カダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶１２．２ｇを得た。対して比較例２では、カダベリン二塩酸塩の結晶６．８ｇを得た。
【０１２９】
比較例２ではこの後さらに、得られたカダベリン二塩酸塩の結晶を水に溶解し、水酸化ナトリウムを添加し、この水溶液のｐＨを１３以上にした。次にクロロホルムを水溶液と等量加え、クロロホルム相にカダベリンを抽出した。最後にこのクロロホルム相を、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりフリーのカダベリン３．６ｇを単離した。
【０１３０】
この単離したカダベリンと等モルのアジピン酸５．１ｇを水に一旦溶解させ減圧下で水を留去し、乾燥することでカダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶８．７ｇを得た。
【０１３１】
この結果、Ｌ−リジン発酵を塩酸で中和せずに、アジピン酸で中和することでカダベリン・アジピン酸塩を得る工程が簡略化される。そのため当然ながら対原料収率が向上する。
【０１３２】
実施例４〜６（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の状態の効果）
実施例３の方法と同様にＬ−リジン発酵を行い、総量として１０ｇのＬ−リジンを含む培養上清を得た。
【０１３３】
この培養上清に終濃度０．０５ｍＭになるようにピリドキサルリン酸を加え、最後に参考例１（２）および（５）に記載の方法により調整したＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ菌体（実施例６）、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１菌体（実施例４）およびＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体（実施例５）を加え、４５℃で２４時間作用させた。経時的にカダベリンの濃度を測定した結果を図３に示す。
【０１３４】
この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させることで高生産速度でカダベリンが得られた。
【０１３５】
実施例７（Ｌ−リジン発酵培地でＬ−リジン脱炭酸酵素を調整する効果）
実施例３の方法と同様にＬ−リジン発酵を行い、総量として１０ｇのＬ−リジンを含む培養上清を得た。
【０１３６】
この培養上清に終濃度１０ｇ／ｌになるように滅菌したグルコースを添加し、ＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体を１白金耳植菌し、滅菌した空気を１ｖｖｍで通気しながら、３７℃、攪拌翼回転数４００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら２４時間培養を行った。中和剤として滅菌したアジピン酸水溶液（１０ｇ／ｌ）およびアンモニア水（３Ｍ）を使用した。培養終了後、４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中に、全量として６．８ｇのカダベリンを生成した。
【０１３７】
この培養上清を実施例３に記載の方法でカダベリン・アジピン酸塩を精製し、カダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶１２．５ｇを得た。
【０１３８】
この結果一つの発酵装置を用いるだけでカダベリン・アジピン酸を得ることができた。
【０１３９】
比較例３（既存の化学合成法によるカダベリンの調製）
Ｌ−リジン一塩酸塩２０ｇ（フルカ社製）シクロヘキサノール１００ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）に懸濁し、次いで２８％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（シグマアルドリッチジャパン製）２１．２ｍｌ、３−メチル−シクロヘキセノン１ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、１５５℃で３時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に塩化水素４ｇ（シグマアルドリッチジャパン製）を含むイソプロパノール溶液２０ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、析出した生成物を回収し、乾燥することによりカダベリン二塩酸塩を得た（特開昭６０−２３３２８号公報の実施例３記載の方法）。
【０１４０】
得られたカダベリン二塩酸塩を水に溶解させ、この水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を添加することによってカダベリン二塩酸塩をカダベリンに変換し、クロロホルムで抽出して、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することにより、カダベリンを得た。この単離したカダベリンと等モルのアジピン酸を水に一旦溶解させ減圧下で乾燥することでカダベリン・アジピン酸の等モル塩である結晶を得た。
【０１４１】
実施例３，６、比較例３の不純物の同定
実施例３および６で得られたカダベリン・アジピン酸塩の不純物の分析を、下記に示す条件でＧＣ−ＭＳ法により行い、比較例３で調製したカダベリン・アジピン酸塩の不純物分析と比較した結果を表３に示す。
ＧＣ−ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
カラム：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
オーブン：１２０℃（一定）
インジェクト：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
流速：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ（一定）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０から４００）
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用い生成したカダベリンをカダベリン・アジピン酸塩に精製することにより、水性生物に有毒で、また酸と接触すると反応してしまうトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下かつ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下の高純度カダベリン・アジピン酸塩が得られた。
【０１４４】
実施例７（ポリアミドの合成）
実施例３の方法で得られたカダベリン・アジピン酸の等モル塩を水に溶解させの５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを調整した。この溶液を試験管に仕込み、オートクレーブに入れて、密閉し、窒素置換した。ジャケット温度を２６５℃に設定し、加熱を開始した。缶内圧力が１７．５ｋｇ／ｃｍ2に到達した後、缶内圧力を１７．５ｋｇ／ｃｍ2で３時間保持した。その後、ジャケット温度を２７５℃に設定し、２時間かけて缶内圧力を常圧に放圧した。その後、缶内温度が２４５℃に到達した時点で、加熱を停止した。室温に放冷後、試験管をオートクレーブから取り出し、ポリアミドを得た。
【０１４５】
比較例４
比較例３の方法で得られたカダベリン・アジピン酸の等モル塩を水に溶解させ５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを調整し用いる以外は、実施例７と全く同様の方法でポリアミドを得た。
【０１４６】
実施例７、比較例４のポリアミドの評価
実施例７で得られたポリアミドおよび比較例４で得られたポリアミドを下記に示す方法で比較評価した。その結果を表４に示す。
【０１４７】
［ポリアミド中の２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンの定量（ＧＣ−ＭＳ）］
ポリアミド約１５ｇを精秤して、メタノールでソックスレー抽出し、その抽出液を、下記条件でＧＣ−ＭＳ分析して、ポリアミド中に含まれる２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンを定量した。
装置：ヒューレットパッカード製 ＨＰ５８９０質量検出器
カラム：５％−ジフェニル−９５％−ジメチルポリシロキサン
カラム温度：Ｉｎｉｔｉａｌ １００℃
Ｆｉｎａｌ ２５０℃
昇温速度：１０℃／ｍｉｎ
注入口温度：２３０℃
検出器温度：２８０℃
キャリアガス：ヘリウム
注入口圧力：５０ｋｇ／ｃｍ２
試料注入量：１μｌ。
【０１４８】
［ＤＳＣ（示差走査熱量測定）］
セイコー電子工業製 ロボットＤＳＣ ＲＤＣ２２０を用い、窒素雰囲気下、ポリアミドを約５ｍｇを採取し、次の条件で測定した。融点＋２５℃に昇温して３分間保持し、ポリアミドを完全に融解させた後、２０℃／分の降温速度で、３０℃まで降温し、３分間保持した後、３０℃から融点＋２５℃まで２０℃／分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度、および熱量を求めた。
【０１４９】
［相対粘度（ηｒ）］
９８％硫酸中、０．０１ｇ／ｍｌ濃度、２５℃でオストワルド式粘度計を用いて測定を行った。
【０１５０】
［溶融滞留試験］
試験管にポリアミド約５ｇを仕込み、窒素雰囲気下、融点＋２０℃の温度のシリコンバスに浸漬し、ポリアミドが完全に溶融してから３０分間放置した後、ポリアミドを回収して相対粘度測定を行った。
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
その結果、本発明の方法によって得られた高純度カダベリン・ジカルボン酸塩を使用することにより、相対粘度（ηｒ）の保持率の高い（耐熱性の高い）ポリアミドが得られた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリン・ジカルボン酸塩を単離することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項２】
Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液から晶析工程によりカダベリン・ジカルボン酸塩を回収することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項３】
該Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液が、Ｌ−リジン発酵微生物を培養する際に、ジカルボン酸により培養液のｐＨを調整しながら行った発酵液であることを特徴とする請求項１または２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項４】
該Ｌ−リジン発酵微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属および／またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であることを特徴とする請求項３記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項５】
該ジカルボン酸が、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項６】
ジカルボン酸が、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
ＨＯＯＣ−(ＣＨ２)ｍ−ＣＯＯＨ （１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０〜１６）
【化１】
【化２】
（但し、一般式（２）、（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜５）
【請求項７】
該一般式（１）において、ｍ＝０〜１０、および／または、該一般式（２）および／または（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜１のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項８】
該ジカルボン酸が、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項９】
請求項３から８のいずれかに記載の発酵液を用い、L-リジン脱炭酸酵素を調製することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１０】
該Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞のＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１１】
該Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、細胞表面に局在化しているＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１２】
反応後の該反応液から、カダベリン・ジカルボン酸塩を単離または晶析する際に、有機溶媒を添加することを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１３】
該有機溶媒が、アルコール類、ケトン類またはニトリル類のいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１４】
該有機溶媒が、炭素数６以下の脂肪族アルコール類、炭素数６以下の脂肪族ケトン類または炭素数６以下の脂肪族ニトリル類のいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１５】
該有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロパノール、アセトニトリルまたはアセトンのいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１６】
２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
【請求項１７】
トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
【請求項１８】
２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下かつトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
【請求項１９】
請求項１から１５のいずれか１項記載の方法で得られるカダベリン・ジカルボン酸塩もしくは請求項１６から１８のいずれか１項記載のカダベリン・ジカルボン酸塩を原料として得られたポリアミド。
【請求項１】
Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリン・ジカルボン酸塩を単離することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項２】
Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液から晶析工程によりカダベリン・ジカルボン酸塩を回収することを特徴とするカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項３】
該Ｌ−リジン・ジカルボン酸塩水溶液が、Ｌ−リジン発酵微生物を培養する際に、ジカルボン酸により培養液のｐＨを調整しながら行った発酵液であることを特徴とする請求項１または２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項４】
該Ｌ−リジン発酵微生物が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属および／またはブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属であることを特徴とする請求項３記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項５】
該ジカルボン酸が、官能基としては２つのカルボキシル基のみを有する脂肪族および／または芳香族のジカルボン酸であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項６】
ジカルボン酸が、以下の一般式（１）、（２）または（３）で示されるジカルボン酸のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
ＨＯＯＣ−(ＣＨ２)ｍ−ＣＯＯＨ （１）
（但し、一般式（１）において、ｍ＝０〜１６）
【化１】
【化２】
（但し、一般式（２）、（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜５）
【請求項７】
該一般式（１）において、ｍ＝０〜１０、および／または、該一般式（２）および／または（３）において、ｎ，ｏ，ｐ，ｑ＝０〜１のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項８】
該ジカルボン酸が、アジピン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、コハク酸、イソフタル酸またはテレフタル酸のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項９】
請求項３から８のいずれかに記載の発酵液を用い、L-リジン脱炭酸酵素を調製することを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１０】
該Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞のＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１１】
該Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、細胞表面に局在化しているＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１２】
反応後の該反応液から、カダベリン・ジカルボン酸塩を単離または晶析する際に、有機溶媒を添加することを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１３】
該有機溶媒が、アルコール類、ケトン類またはニトリル類のいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１４】
該有機溶媒が、炭素数６以下の脂肪族アルコール類、炭素数６以下の脂肪族ケトン類または炭素数６以下の脂肪族ニトリル類のいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１５】
該有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、イソプロパノール、アセトニトリルまたはアセトンのいずれかであることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリン・ジカルボン酸塩の製造方法。
【請求項１６】
２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
【請求項１７】
トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
【請求項１８】
２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下かつトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６％以下のカダベリン・ジカルボン酸塩。
【請求項１９】
請求項１から１５のいずれか１項記載の方法で得られるカダベリン・ジカルボン酸塩もしくは請求項１６から１８のいずれか１項記載のカダベリン・ジカルボン酸塩を原料として得られたポリアミド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２０７４９５（Ｐ２００９−２０７４９５Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４２３５０（Ｐ２００９−１４２３５０）
【出願日】平成２１年６月１５日（２００９．６．１５）
【分割の表示】特願２００３−１８７１（Ｐ２００３−１８７１）の分割
【原出願日】平成１５年１月８日（２００３．１．８）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１５日（２００９．６．１５）
【分割の表示】特願２００３−１８７１（Ｐ２００３−１８７１）の分割
【原出願日】平成１５年１月８日（２００３．１．８）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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