カバノアナタケの細胞壁の破壊方法、破壊装置及びカバノアナタケの有効成分の抽出方法。
【課題】操作が簡便でまた短時間で細胞破壊が可能なカバノアナタケの細胞壁の破壊方法、有効成分の回収率が高いカバノアナタケの有効成分の回収方法、及びカバノアナタケの細胞壁の破壊装置を提供する。
【解決手段】カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性を持つ媒体で置換するステップと、該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、を含む。
【解決手段】カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性を持つ媒体で置換するステップと、該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カバノアナタケの細胞壁の破壊方法、カバノアナタケの細胞壁の破壊装置及びカバノアナタケの有効成分の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物の抽出物を用いた健康機能食品は従来から多く知られている。例えば白樺などのカバノ類の幹に寄生するキノコであるカバノアナタケ（学名：Ｆｕｓｃｏｐｉｒｉａ Ｏｂｌｉｑｕａ）の菌核であるチャーガには、抗腫瘍作用や血糖降下作用があることが知られており、有効成分を抽出する方法も種々の検討がなされている。
【０００３】
カバノアナタケからの有効成分の抽出方法は、熱湯で煎じる方法が一般的であるが、有効成分は細胞壁の内側に存在するため、有効成分の抽出率が極めて低い。そのため細胞壁を破壊し、有効成分の回収率を高める方法が多く用いられている。細胞壁を破壊する方法としては、（１）界面活性剤を用いる方法、（２）酵素を用いる方法、（３）超音波破砕法、（４）磨砕法フレンチプレス法、（５）凍結破砕法などが知られている。このうち酵素を利用した例として、菌核を超音波で破砕し、プロテアーゼまたはセルラーゼで酵素処理し、その後熱水抽出する方法が提案されている（例えば特許文献１参照）。同様の方法としてカバノアナタケにアミラーゼ等の糖質分解酵素を加え酵素処理を行なった後、アルコールで抽出する方法も提案されている（例えば特許文献２参照）。
【０００４】
上記の方法の他にも細胞膜または細胞壁を破壊する方法としては、超臨界流体を利用した技術も開示されている。（例えば特許文献３及び特許文献４参照）。特許文献３に記載の技術は、菌体の培養液と超臨界状態の溶解溶媒を混合した後、圧力を瞬時に低下させることで、細胞膜内に拡散した混合溶媒を急激に膨張させ、細胞膜を破壊させるとするものである。特許文献４に記載の技術は、動植物細胞の懸濁液に高圧ガス状態の二酸化炭素を微小泡状に導入することで、懸濁液に溶解した二酸化炭素が、細胞膜や細胞壁を構成する脂質二重膜に浸透し細胞膜や細胞壁を破壊する技術である。
【特許文献１】特開２００２−２６２８２０号公報
【特許文献２】特開２００４−１６１７４８号公報
【特許文献３】特公平６−９５０２号公報
【特許文献４】特開２００２−７８４７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞壁の破砕方法として従来から用いられている磨砕法などは、破壊に際して熱履歴を伴うので、本来有効な成分が熱的破壊を受けたり、変性を伴う場合があった。また特許文献１に記載の技術は、超音波で処理することにより供試体を１０μｍ以下の微粒子とし、さらに酵素作用によりたんぱく質等を加水分解することにより溶媒に対する溶解性を高め、有効成分を効率的に回収する方法であり有効な方法と思われるが、抽出に多くの工程、操作を必要とし、また抽出に多くの時間を必要とする。特許文献２に記載の技術も、供試体を粉砕し、アミラーゼなどの糖質分解酵素を加え加水分解させた後、アルコール抽出を行なうので、有効成分の抽出には多くの時間を必要とする。また、特許文献１及び特許文献２の技術も酵素を使用するので、これらが不所望の影響を与えるおそれがある。
【０００６】
特許文献３及び特許文献４に記載の超臨界技術を利用する方法は、処理工程が少なくまた処理時間も比較的短いが、これら技術をカバノアナタケのような植物細胞体の破壊に利用しようとしても、細胞内の水への二酸化炭素の溶解度は超臨界加圧状態においても僅かであり、期待するほどの細胞破壊は認められない。
【０００７】
本発明の目的は、操作が簡便でまた短時間で細胞破壊が可能なカバノアナタケの細胞壁の破壊方法、有効成分の回収率が高いカバノアナタケの有効成分の回収方法、及びカバノアナタケの細胞壁の破壊装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者は、二酸化炭素液体が水とは殆んど相溶性がないが、エチルアルコールや酢酸とは相溶性を示すことと、同時にエチルアルコールや酢酸は水とも相溶性であることを利用し、細胞内の水の一部又は大部分を一旦エチルアルコールや酢酸等の水と相溶性のある媒体で置換し、その後に超臨界状態の二酸化炭素流体で加圧処理して、細胞内媒体の一部又は大部分を二酸化炭素流体で置換することにより、細胞内の二酸化炭素濃度を遥かに高め、次いで、急激に圧力を減ずることにより二酸化炭素をガス状と成すことで急激な体積膨張を起こさせ、よって細胞壁を破壊する方法を見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊方法である。
【００１０】
また本発明で、前記超臨界流体は、二酸化炭素であり、また前記媒体は、エチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法である。
【００１１】
また本発明は、請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法により、カバノアナタケの細胞壁の破壊し、該細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出することを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法である。
【００１２】
また本発明は、カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
該細胞壁を破壊した該カバノアナタケから有効成分を抽出するステップと、を含み、
細胞壁を破壊するステップと、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出するステップとを、同一の容器内で略同一に行なうことを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法である。
【００１３】
本発明は、超臨界流体を形成可能な超臨界流体形成手段と、
該カバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体、及び該超臨界流体を受入れ可能なカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽と、
該処理槽内の圧力を一挙に低減可能な圧力減圧手段と、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊装置である。
【発明の効果】
【００１４】
本カバノアナタケの細胞壁の破壊方法は、カバノアナタケの細胞内の水を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換し、細胞内の水を媒体で置換したカバノアナタケを超臨界流体と接触させることにより細胞内の媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換した後、圧力を一挙に減じることで細胞壁を破壊するので、簡単な操作でまた短時間でカバノアナタケの細胞壁を破壊することができる。
【００１５】
またカバノアナタケの細胞内の水を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換し、細胞内の水を媒体で置換したカバノアナタケを超臨界流体と接触させることにより細胞内の媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換しているので、従来の超臨界流体を用いた細胞壁の破壊の方法と異なり、媒体への超臨界流体の溶解度が非常に大きい。この結果、圧力を一挙に減じることで確実に細胞壁を破壊することができる。また界面活性剤や酵素を用いる方法のように異物が取り込まれるおそれがない。
【００１６】
また本発明によれば、超臨界流体は二酸化炭素であるので、臨界温度及び臨界圧力が比較的低く、超臨界状態の形成が容易である。また超臨界流体は二酸化炭素であるので、臨界温度が低く、カバノアナタケに含まれる有効成分が熱的変性を受けることがない。また超臨界流体は二酸化炭素であるので、室温、大気圧下では気体であり、カバノアナタケから容易に除去することができる。
【００１７】
また本発明によれば、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体は、エチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つであるので安価である。また、媒体はエチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つであるので、水または超臨界状態の二酸化炭素とも相溶性が高い。また酵素などを用いないので抽出物に影響を与えることもなく、エチルアルコールの場合は、カバノアナタケ内に仮に残留したとしても安全である。
【００１８】
また本カバノアナタケの有効成分の抽出方法は、上記のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法により、カバノアナタケの細胞壁の破壊し、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出する抽出方法であるので、有効性成分の回収率が高い。また抽出操作前にカバノアナタケの細胞壁がすでに破壊されているので、水による抽出、アルコールによる抽出など種々の抽出方法を採用することが可能で、有効成分の抽出方法の選択肢が広がる。
【００１９】
また本カバノアナタケの有効成分の抽出方法は、カバノアナタケの細胞壁を破壊するステップと、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出するステップとを含み、これらステップを同一の容器内で略同一に行なうので、短時間に効率的にカバノアナタケから有効成分を抽出することができる。
【００２０】
また本発明によれば本細胞壁破壊装置は、超臨界流体を形成可能な超臨界流体形成手段と、カバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性を持つ媒体、及び該超臨界流体を受入れ可能なカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽と、処理槽内の圧力を一挙に低減可能な圧力減圧手段とを含むので、本装置を用いてカバノアナタケの細胞壁を破壊することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１は、本発明の実施の一形態としてのカバノアナタケの細胞壁破壊装置１の概略的な構成を示す図である。超臨界流体として二酸化酸素を用いて本実施形態を説明する。なお後述のように超臨界流体が二酸化酸素に限定されないのは言うまでもない。細胞壁破壊装置１は、原材料であるカバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体、及び超臨界流体を受入れ、後述の操作によりカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽１０、この処理槽１０に超臨界流体を形成し供給する超臨界流体供給手段２０、処理槽１０の圧力を保持または減圧する圧力調節手段３０、処理槽１０の圧力低下操作に伴う留出物を回収する回収手段４０を主な構成要素とする。
【００２２】
処理槽１０は、原材料であるカバノアナタケを受入れる金属製の圧力容器であり、原材料を受入れ可能なように上部が開閉可能な構造となっている。上部には超臨界流体を受入れる管路１１が接続され、この管路１１を通じて超臨界流体供給手段２０から供給される超臨界流体を受入れる。またこの管路１１は、処理槽内の超臨界流体を排出する管路としても使用する。
【００２３】
処理槽１０は、恒温槽１２内に設置され一定の温度に保持される。恒温槽１２は内部に電気ヒータ１３を備え、槽内の温度を測定する熱電対１４及び温度制御装置１５とで恒温槽内の温度を一定に保つ。例えば超臨界流体として二酸化炭素を使用する場合は、二酸化炭素の臨界温度が３０４．２Ｋであるので、恒温槽１２はこの温度以上に加熱する能力が求められる。また恒温槽１２には、恒温槽１２の温度分布をなくするためにファン１６が装着される。これにより処理槽１０に供給した超臨界流体を超臨界状態で安定的に保持することができる。本実施形態では恒温槽１２を用いる例を示しているけれども、処理槽の温度を一定に保持することができる機能を備えるものであれば特に形式は問わない。例えば温度制御機構を備えるウオターバス、オイルバス、又は処理槽に装着して使用可能なリボン形状の電気ヒータ、マントルヒータであってもよい。
【００２４】
超臨界流体供給手段２０は、処理槽１０に超臨界流体を供給するもので、超臨界流体を形成する二酸化炭素の供給源である液体二酸化炭素ボンベ２１、液体二酸化炭素を昇圧し処理槽に供給する供給ポンプ２２、供給ポンプ２２から送液される液体二酸化炭素を加温する熱交換器２４を主な構成要素とする。
【００２５】
液体二酸化炭素の供給源である液体二酸化炭素ボンベ２１出口には、管路２３が接続され、管路２３を通じて供給ポンプ２２に液体二酸化炭素を供給する。なお、供給ポンプ２２が可動すると熱を発生するので、管路２３の途中には冷却器を装着し、供給ポンプ２２に送液する液体二酸化炭素を冷却し送液することが望ましい。供給ポンプ２２は、送液された液体二酸化炭素を所定の圧力まで昇圧する。供給ポンプ２２の出口には管路２５が接続され、管路２５の途中には管路内の圧力を検知する圧力検知器２６が設けられている。この圧力検知器２６と図示を省略した圧力制御装置とで、供給ポンプ２２の作動を制御する。
【００２６】
昇圧された液体二酸化炭素は、管路２５を介して恒温槽内に設置された熱交換器２４に送られ、ここで所定の温度まで加温され超臨界状態となる。超臨界状態の二酸化炭素は、熱交換器２４に接続する管路２７、管路２７に接続する仕切弁２８、仕切弁２８に接続する管路２９、管路２９と接続する管路１１を通じて、処理槽１０に送られる。本実施形態では、圧力検出器２６、及び図示を省略した圧力制御装置を供給ポンプに連動させ、圧力を一定に制御する例を示したけれども、供給ポンプ２２の出口圧力を一定に制御する方法はこれに限定されない。例えば供給ポンプ２２出口に逃がし弁を設けて、圧力が上昇した場合はこの逃がし弁を通じて二酸化炭素を管路２３に戻す方法であってもよい。
【００２７】
また超臨界二酸化炭素の形成は、上記の方法以外にも次の方法を用いることもできる。処理槽１０の容積と超臨界状態の二酸化炭素の密度とから、処理槽１０に充填する液体二酸化炭素の量を算出する。この量に相当する臨界温度以下の液体二酸化炭素を処理槽１０に送液後、処理槽１０で液体二酸化炭素を加熱し、超臨界流体を形成する。この方法を採用する場合にあっては、熱交換器２４は必ずしも必要ではない。
【００２８】
圧力調整手段３０は、仕切弁３１を主な構成要素として、処理槽１０内の圧力を一定に保持、又は必要に応じて減圧する。処理槽１０に供給された超臨界流体を排出する場合は、処理槽１０の上部に連結した管路１１、管路３２を通じて仕切弁３１を開とすることで行なう。仕切弁３１は、後述のように処理槽１０内の圧力を一挙に低減可能な機能を備える圧力減圧手段でもある。仕切弁３１と接続する管路３２には分岐管３３を通じて圧力検出器３４が設けられ、これにより処理槽１０内の圧力を検知することができる。仕切弁３１を通じて超臨界流体を排出させると、断熱膨張に伴い仕切弁３１が冷却されるので、流体が固化し閉塞する場合もある。よって仕切弁３１は恒温槽１２内に設置することが望ましい。
【００２９】
仕切弁３１の出口には管路３５が接続され、管路３５は、留出物を回収する回収手段４０である回収槽に接続する。回収槽４０の上部にはベント配管４１が接続され、処理槽１０から排出される二酸化炭素は最終的にベント配管４１を通じて排出される。また回収槽４０は底部に、排出される二酸化炭素に同伴し留出する留出物を排出する管路４２及び弁４３を備える。
【００３０】
次に本細胞壁破壊装置１を用いてカバノアナタケの細胞壁を破砕する手順、及びカバノアナタケの有効成分を抽出する方法について説明する。図２は、本細胞壁破壊装置１を用いてカバノアナタケの細胞壁を破砕する手順、及び細胞壁を破壊したカバノアナタケを用いて有効成分を抽出する手順を示すフローチャートである。本フローチャートは手順の一例を示しただけで、ステップＳ１からステップＳ６までの操作は変更して使用してよいことはもちろんである。
【００３１】
まずステップＳ１で、試料であるカバノアナタケを乾燥し、試料に含まれる水分量を低下させる。本発明は、後述のようにカバノアナタケの細胞内に含まれる水分を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体と置換するので、試料に含まれる水分は少ないことが好ましいことによる。乾燥は水と媒体との置換を容易にするために行なうものであるから、試料の水分量が少ないような場合は、乾燥工程を省略してもよい。また試料に含まれる水分が比較的多い場合であっても、媒体の量を増加させたり、試料の媒体への浸漬時間を長くすることで乾燥工程を省略することは可能である。
【００３２】
本発明のカバノアナタケの有効成分の抽出には、菌核であるチャーガが有効成分を多く含有する点で好適であるけれども、カバノアナタケの子実体や菌糸体を用いることもできる。これらは単独で使用できることはもちろんであるが、子実体や菌糸体や菌核を混合してもよい。またカバノアナタケは天然物以外にも栽培物または培養物を使用できることは言うまでもない。
【００３３】
次にステップＳ２で、試料を粉砕し処理槽１０に充填する。試料を粉砕しておくことで、試料中の水分を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体に置換することが容易となる。粉砕の程度は特に限定されないけれども、粉粒体の大きさが小さいほど水と媒体との置換が容易である。また粉砕に用いる粉砕装置の種類も特に限定されるものではない。
【００３４】
次にステップＳ３で処理槽１０にエチルアルコールを加え、試料をエチルアルコールに浸漬させる。エチルアルコールは水と超臨界流体である二酸化炭素との双方に相溶性のある媒体であり、試料をエチルアルコールに浸漬することで、細胞内の水分をエチルアルコールに置換することができる。本実施の形態では、エチルアルコールを使用しているけれども、細胞内の水と置換する媒体は、エチルアルコールに限定されない。この媒体は、水と超臨界流体との双方に相溶性を持つ媒体であればよいので、超臨界流体に二酸化炭素を使用するのであれば、メチルアルコール、メチルアルコールとエチルアルコールとの混合物、酢酸を使用することができる。さらにメチルアルコール、エチルアルコール、メチルアルコールとエチルアルコールとの混合物、酢酸と、水との混合物を用いることも可能である。ただし、媒体は細胞内の水分と置換するためのものであるので、媒体に含まれる水分濃度は低いことが望ましいのは当然である。また超臨界流体も二酸化炭素に限定されるものではない。例えばプロパンなどの炭化水素を使用することも可能である。
【００３５】
また、細胞内の水をエチルアルコール等の媒体で置換する際に、その置換を促進させる為、引き続き使用する二酸化炭素等を用いて常圧乃至超臨界圧の範囲で適宜加圧することも好適な方法である。
【００３６】
ステップＳ３におけるエチルアルコール浸漬は、細胞壁内の水をエチルアルコールで置換することにある。この際、十分なる浸漬後に、余剰のエチルアルコールを系外に排除することで、後に続く超臨界流体による細胞破壊で乾燥状態の細胞破壊物を取得することも可能となる。すなわち、超臨界状態の二酸化炭素を急速圧力開放した場合、二酸化炭素に溶解したエチルアルコールは同伴して系外に排出されるので、残留する細胞破壊物を乾燥状態として得ることも可能となる。
【００３７】
次にステップＳ４において、処理槽１０に超臨界流体を供給する。超臨界流体は、液体二酸化炭素を充填した二酸化炭素のボンベ２１から管路２３を経由し供給ポンプ２２に送り、供給ポンプ２２で所定の圧力まで昇圧し、熱交換器２４で所定の温度まで加温することで形成することができる。なお処理槽１０へ超臨界流体を送るに先立ち、処理槽１０を所定の温度まで加温しておく。
【００３８】
処理槽１０へ超臨界二酸化炭素を供給することで、超臨界二酸化炭素は細胞内のエチルアルコールに溶解し、エチルアルコールの少なくとも一部は超臨界二酸化炭素に置換する。超臨界二酸化炭素を細胞内のエチルアルコールへより確実に溶解させるには、処理槽１０に供給した超臨界二酸化炭素を排出し、再度処理槽１０へ超臨界二酸化炭素を供給する方法を用いてもよい。本発明における超臨界流体とは、臨界温度及び臨界圧力を超えた状態を言い、二酸化炭素にあっては、圧力７．３７ＭＰａ、温度３０４．２Ｋを超えた状態を言う。二酸化炭素を使用すれば、比較的低い温度及び圧力で超臨界状態を形成可能なので、装置の仕様が緩やかであり、装置コストを抑えることができる。
【００３９】
処理槽１０に超臨界二酸化炭素を供給した後、ステップＳ５において仕切弁３１を開とし、処理槽内の圧力を急激に開放する。これによりカバノアナタケの細胞内のエチルアルコールに溶解していた超臨界状態の二酸化炭素が、一挙にガス化し体積膨張を起こす。この体積膨張によりカバノアナタケの細胞壁が破壊される。このように本発明ではカバノアナタケの細胞内の水を、超臨界二酸化炭素と相溶性のあるエチルアルコールで置換した後、細胞内のエチルアルコールに超臨界二酸化炭素を溶解させるので、超臨界二酸化炭素の溶解量が非常に大きく、圧力を開放することで確実に細胞壁を破壊させることができる。
【００４０】
従来の超臨界流体を用いた菌体の細胞壁の破壊は、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体を介在させていない。このため超臨界二酸化炭素は細胞内の水に溶解することとなるが、超臨界状態の二酸化炭素であっても水に溶解する量は水に対して数％である。これに対して、エチルアルコールに対する超臨界二酸化炭素の溶解量は、水の場合の数十倍以上の溶解量を示す。一方大気圧状態においては、超臨界二酸化炭素は、ガス状態となりエチルアルコールに対する溶解量は非常小さい。これにより超臨界状態の二酸化炭素の圧力を開放することで、カバノアナタケの細胞内のエタノールに溶解していた超臨界状態の二酸化炭素が、一挙にガス化し体積膨張を起こす。
【００４１】
超臨界状態の二酸化炭素は、液体二酸化炭素に近似する密度を有するとともに、二酸化炭素ガスの有する拡散速度を示すことから、細胞内への二酸化炭素の拡散が良好に行われることからその使用が好ましいが、亜臨界状態の二酸化炭素であっても、エチルアルコールに対する溶解量は、超臨界状態の二酸化炭素の水に対する溶解量よりも大きい。このため必要に応じて亜臨界状態の流体を細胞壁の破壊に用いることができる。ここで亜臨界状態とは、温度、圧力が臨界点近傍にあるもの、または温度、圧力のうち少なくとも一方は、臨界点を超え、他方は臨界点近傍にあるものを言う。
【００４２】
以上ステップＳ１からステップＳ５の操作において、カバノアナタケの細胞壁を確実に破壊することができる。このように簡単な操作でまた短時間のうちにカバノアナタケの細胞壁を破壊することができる。さらにこの細胞壁を破壊したカバノアナタケを用いて、カバノアナタケから有効成分の抽出を行なってもよい（ステップＳ６）。細胞壁を破壊していないカバノアナタケに比較して有効成分をより多く抽出することが可能なことは、後述の実施例の実証データが示すところである。抽出には溶媒抽出を用いることが可能である。この有効成分の抽出に用いる溶媒は、特に限定されるものではなく水、アルコールなどを用いることができる。アルコール抽出を行う場合は、エチルアルコールを用いることが安全性の点から好ましい。
【００４３】
有効成分の溶媒による抽出は、ステップＳ５の細胞壁破壊が終了した後、処理槽に抽出溶媒を投入し行うこともできる。またステップＳ５の細胞壁破壊が終了したカバノアナタケを処理槽から回収し、他の抽出装置を用いて有効成分を抽出することも可能である。このようにカバノアナタケの有効成分の抽出は、細胞壁破壊操作に引き続き、細胞壁破壊を行なった処理槽１０で行なうこともできるので、有効成分を抽出するために特別の装置を必要としない。
【００４４】
本発明の他の実施形態として、カバノアナタケの細胞壁破壊とカバノアナタケの有効成分の抽出を略同一に行なうことも可能である。図２に示す操作手順において、ステップＳ３で処理槽１０に加えるエチルアルコールの量を多くし、以下図２に示すステップＳ４及びステップＳ５の操作を行なう。ステップＳ５の減圧操作で処理槽内のエチルアルコールの多くは、二酸化炭素に同伴して留出するが、ステップＳ３で処理槽に充填するエチルアルコールの量を多くすることで、処理槽内にはエチルアルコールの一部が残留する。この残留したエチルアルコールは、細胞壁が破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出する役目を果たす。
【００４５】
ステップＳ５で、二酸化炭素に同伴し留出するエチルアルコールにもカバノアナタケの有効成分が含まれる場合もあるので、処理槽１０に残留したエチルアルコール及び回収槽４０に留出した留出物からカバノアナタケの有効成分を回収することができる。本実施形態を採用することで、カバノアナタケの細胞破壊と細胞破壊をさせたカバアノアナタケからの有効成分の抽出を略同一に行なうことができる。
【００４６】
抽出されたカバノアナタケの有効成分は、従来から用いられている所定の方法で加工することで、キャラメルなどの菓子、ジュースなどの飲料（ドリンク）、粉末形態や錠剤形態などの機能性食品とすることができる。機能性食品に配合するにあたっては、抽出物をそのまま、あるいは濃縮した抽出液を配合することもできる。また機能性食品を製造するにあたり、所定の食品添加物を添加可能なことは言うまでもない。このように食品に、本発明のカバノアナタケの有効成分を含む抽出物を添加することで、異味異臭などを生じることはなく、経口摂取が容易と機能性食品とすることができる。
【００４７】
以下本発明の実施例を示す。
（実施例１）試料にはチャーガを用いた。まず始めに次ぎの要領でチャーガの細胞内の水を、液体二酸化炭素と水の双方に相溶性のあるエチルアルコールで置換した。乾燥したチャーガを機械的に粉砕し、粉末としたもの１０．５ｇを、内容積６０ｍｌの金属製小型圧力容器に入れ、エチルアルコール３０ｍｌを加えて容器を密閉した。この容器を４０℃に加温した湯浴に漬け、液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して圧力容器に供給し、１５ＭＰａまで加圧して超臨界状態とし、そのまま２０分間保持した。その後圧力をゆっくり減じ常圧に戻した。次いで、再び液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して圧力容器に供給し、１５ＭＰａまで加圧して超臨界状態としそのまま２０分間保持した後、圧力をゆっくり減じ、常圧に戻した。この２回の脱圧操作の際に、排出される二酸化炭素には一部エチルアルコールが含まれており、４．０１ｇが回収槽に捕集された。
【００４８】
次にチャーガ処理物を含む圧力容器に、液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して供給し、１５Ｍｐａまで加圧して超臨界状態とし、そのまま２０分間保持した後、今度は圧力を一挙に開放し、速やかに常圧に戻した。更にもう一度、液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して供給し、１５Ｍｐａまで加圧して超臨界状態とし、そのまま２０分間保持した後、圧力を一挙に開放し、速やかに常圧に戻した。こうして細胞内の水分をエチルアルコールで置換したチャーガの超臨界二酸化炭素流体による急速脱圧処理物を得た。固形分として２３．２ｇを得た。
【００４９】
乾燥チャーガの重量は、上記処理によりその重量が１０．５ｇから２３．２ｇに増大した。これは、細胞内に多くのエチルアルコールが取り込まれたことを示しており、この細胞内に含まれるエチルアルコールに相溶性を有する二酸化炭素流体が、超臨界流体からガス状へ変換することに伴う急激な体積膨張により、細胞壁が破壊されることを支持している。
【００５０】
次に上記処理で得たチャーガ処理物（細胞壁を破壊したチャーガ）２．０７ｇを、ソックスレー抽出円筒ろ紙に入れ、エチルアルコール５０ｍｌを抽出媒体として一夜ソックスレー抽出した。抽出操作終了後、抽出円筒ろ紙に残留する成分を乾燥後、秤量したところ０．８０ｇであった。ここで用いたチャーガ処理物２．０７ｇは、原料のチャーガ０．９４ｇに相当するので、この一連の処理により、乾燥したチャーガの１５％に相当する有効成分が抽出されたこととなる。この値は、後述の比較例１及び比較例２の値に比較して非常に大きな値であった。
【００５１】
（比較例１）乾燥したチャーガを機械的に粉砕した粉末試料１．１３ｇをソックスレー抽出円筒ろ紙に入れ、エチルアルコール５０ｍｌを抽出媒体として一夜ソックスレー抽出した。抽出操作終了後、抽出円筒ろ紙に残留する成分を乾燥後、秤量したところ１．０３ｇであった。即ち、本処理により、乾燥したチャーガの９％に相当する有効成分が抽出されたことが分かった。
【００５２】
（比較例２）乾燥したチャーガを機械的に粉砕し粉末としたものを、液体窒素を用いる凍結粉砕法でさらに粉砕し細胞壁破壊を行った。この粉末試料１．０７ｇをソックスレー抽出円筒ろ紙に入れ、エチルアルコール５０ｍｌを抽出媒体として一夜ソックスレー抽出した。抽出操作終了後、抽出円筒ろ紙に残留する成分を乾燥後、秤量したところ０．９３ｇであった。即ち、本処理により、乾燥したチャーガの１３％に相当する有効成分が抽出されたことが分かった。
【００５３】
以上のように、チャーガ内の内包水を一旦、超臨界流体である液体二酸化炭素と相溶性を有する媒体と置換した後、液体又は超臨界状態の二酸化炭素を加圧下で共存させることにより細胞壁内の二酸化炭素流体濃度を高め、次いで急激な圧力開放により二酸化炭素がガス状態に変換することに伴う急激な体積膨張で強固な細胞壁を破壊することで、有効成分の抽出率を向上させることが可能なことが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施の一形態としてのカバノアナタケの細胞壁破壊装置１の概略的な構成を示す図である。
【図２】本発明の細胞壁破壊装置１を用いてカバノアナタケの細胞壁を破砕後、有効成分を抽出する手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００５５】
１ 細胞壁破壊装置
１０ 処理槽
２０ 超臨界流体供給手段
２１ 液体二酸化炭素ボンベ
２２ 供給ポンプ
２４ 熱交換器
３１ 仕切弁
４０ 回収槽
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カバノアナタケの細胞壁の破壊方法、カバノアナタケの細胞壁の破壊装置及びカバノアナタケの有効成分の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物の抽出物を用いた健康機能食品は従来から多く知られている。例えば白樺などのカバノ類の幹に寄生するキノコであるカバノアナタケ（学名：Ｆｕｓｃｏｐｉｒｉａ Ｏｂｌｉｑｕａ）の菌核であるチャーガには、抗腫瘍作用や血糖降下作用があることが知られており、有効成分を抽出する方法も種々の検討がなされている。
【０００３】
カバノアナタケからの有効成分の抽出方法は、熱湯で煎じる方法が一般的であるが、有効成分は細胞壁の内側に存在するため、有効成分の抽出率が極めて低い。そのため細胞壁を破壊し、有効成分の回収率を高める方法が多く用いられている。細胞壁を破壊する方法としては、（１）界面活性剤を用いる方法、（２）酵素を用いる方法、（３）超音波破砕法、（４）磨砕法フレンチプレス法、（５）凍結破砕法などが知られている。このうち酵素を利用した例として、菌核を超音波で破砕し、プロテアーゼまたはセルラーゼで酵素処理し、その後熱水抽出する方法が提案されている（例えば特許文献１参照）。同様の方法としてカバノアナタケにアミラーゼ等の糖質分解酵素を加え酵素処理を行なった後、アルコールで抽出する方法も提案されている（例えば特許文献２参照）。
【０００４】
上記の方法の他にも細胞膜または細胞壁を破壊する方法としては、超臨界流体を利用した技術も開示されている。（例えば特許文献３及び特許文献４参照）。特許文献３に記載の技術は、菌体の培養液と超臨界状態の溶解溶媒を混合した後、圧力を瞬時に低下させることで、細胞膜内に拡散した混合溶媒を急激に膨張させ、細胞膜を破壊させるとするものである。特許文献４に記載の技術は、動植物細胞の懸濁液に高圧ガス状態の二酸化炭素を微小泡状に導入することで、懸濁液に溶解した二酸化炭素が、細胞膜や細胞壁を構成する脂質二重膜に浸透し細胞膜や細胞壁を破壊する技術である。
【特許文献１】特開２００２−２６２８２０号公報
【特許文献２】特開２００４−１６１７４８号公報
【特許文献３】特公平６−９５０２号公報
【特許文献４】特開２００２−７８４７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞壁の破砕方法として従来から用いられている磨砕法などは、破壊に際して熱履歴を伴うので、本来有効な成分が熱的破壊を受けたり、変性を伴う場合があった。また特許文献１に記載の技術は、超音波で処理することにより供試体を１０μｍ以下の微粒子とし、さらに酵素作用によりたんぱく質等を加水分解することにより溶媒に対する溶解性を高め、有効成分を効率的に回収する方法であり有効な方法と思われるが、抽出に多くの工程、操作を必要とし、また抽出に多くの時間を必要とする。特許文献２に記載の技術も、供試体を粉砕し、アミラーゼなどの糖質分解酵素を加え加水分解させた後、アルコール抽出を行なうので、有効成分の抽出には多くの時間を必要とする。また、特許文献１及び特許文献２の技術も酵素を使用するので、これらが不所望の影響を与えるおそれがある。
【０００６】
特許文献３及び特許文献４に記載の超臨界技術を利用する方法は、処理工程が少なくまた処理時間も比較的短いが、これら技術をカバノアナタケのような植物細胞体の破壊に利用しようとしても、細胞内の水への二酸化炭素の溶解度は超臨界加圧状態においても僅かであり、期待するほどの細胞破壊は認められない。
【０００７】
本発明の目的は、操作が簡便でまた短時間で細胞破壊が可能なカバノアナタケの細胞壁の破壊方法、有効成分の回収率が高いカバノアナタケの有効成分の回収方法、及びカバノアナタケの細胞壁の破壊装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者は、二酸化炭素液体が水とは殆んど相溶性がないが、エチルアルコールや酢酸とは相溶性を示すことと、同時にエチルアルコールや酢酸は水とも相溶性であることを利用し、細胞内の水の一部又は大部分を一旦エチルアルコールや酢酸等の水と相溶性のある媒体で置換し、その後に超臨界状態の二酸化炭素流体で加圧処理して、細胞内媒体の一部又は大部分を二酸化炭素流体で置換することにより、細胞内の二酸化炭素濃度を遥かに高め、次いで、急激に圧力を減ずることにより二酸化炭素をガス状と成すことで急激な体積膨張を起こさせ、よって細胞壁を破壊する方法を見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊方法である。
【００１０】
また本発明で、前記超臨界流体は、二酸化炭素であり、また前記媒体は、エチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法である。
【００１１】
また本発明は、請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法により、カバノアナタケの細胞壁の破壊し、該細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出することを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法である。
【００１２】
また本発明は、カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
該細胞壁を破壊した該カバノアナタケから有効成分を抽出するステップと、を含み、
細胞壁を破壊するステップと、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出するステップとを、同一の容器内で略同一に行なうことを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法である。
【００１３】
本発明は、超臨界流体を形成可能な超臨界流体形成手段と、
該カバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体、及び該超臨界流体を受入れ可能なカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽と、
該処理槽内の圧力を一挙に低減可能な圧力減圧手段と、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊装置である。
【発明の効果】
【００１４】
本カバノアナタケの細胞壁の破壊方法は、カバノアナタケの細胞内の水を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換し、細胞内の水を媒体で置換したカバノアナタケを超臨界流体と接触させることにより細胞内の媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換した後、圧力を一挙に減じることで細胞壁を破壊するので、簡単な操作でまた短時間でカバノアナタケの細胞壁を破壊することができる。
【００１５】
またカバノアナタケの細胞内の水を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換し、細胞内の水を媒体で置換したカバノアナタケを超臨界流体と接触させることにより細胞内の媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換しているので、従来の超臨界流体を用いた細胞壁の破壊の方法と異なり、媒体への超臨界流体の溶解度が非常に大きい。この結果、圧力を一挙に減じることで確実に細胞壁を破壊することができる。また界面活性剤や酵素を用いる方法のように異物が取り込まれるおそれがない。
【００１６】
また本発明によれば、超臨界流体は二酸化炭素であるので、臨界温度及び臨界圧力が比較的低く、超臨界状態の形成が容易である。また超臨界流体は二酸化炭素であるので、臨界温度が低く、カバノアナタケに含まれる有効成分が熱的変性を受けることがない。また超臨界流体は二酸化炭素であるので、室温、大気圧下では気体であり、カバノアナタケから容易に除去することができる。
【００１７】
また本発明によれば、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体は、エチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つであるので安価である。また、媒体はエチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つであるので、水または超臨界状態の二酸化炭素とも相溶性が高い。また酵素などを用いないので抽出物に影響を与えることもなく、エチルアルコールの場合は、カバノアナタケ内に仮に残留したとしても安全である。
【００１８】
また本カバノアナタケの有効成分の抽出方法は、上記のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法により、カバノアナタケの細胞壁の破壊し、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出する抽出方法であるので、有効性成分の回収率が高い。また抽出操作前にカバノアナタケの細胞壁がすでに破壊されているので、水による抽出、アルコールによる抽出など種々の抽出方法を採用することが可能で、有効成分の抽出方法の選択肢が広がる。
【００１９】
また本カバノアナタケの有効成分の抽出方法は、カバノアナタケの細胞壁を破壊するステップと、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出するステップとを含み、これらステップを同一の容器内で略同一に行なうので、短時間に効率的にカバノアナタケから有効成分を抽出することができる。
【００２０】
また本発明によれば本細胞壁破壊装置は、超臨界流体を形成可能な超臨界流体形成手段と、カバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性を持つ媒体、及び該超臨界流体を受入れ可能なカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽と、処理槽内の圧力を一挙に低減可能な圧力減圧手段とを含むので、本装置を用いてカバノアナタケの細胞壁を破壊することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１は、本発明の実施の一形態としてのカバノアナタケの細胞壁破壊装置１の概略的な構成を示す図である。超臨界流体として二酸化酸素を用いて本実施形態を説明する。なお後述のように超臨界流体が二酸化酸素に限定されないのは言うまでもない。細胞壁破壊装置１は、原材料であるカバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体、及び超臨界流体を受入れ、後述の操作によりカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽１０、この処理槽１０に超臨界流体を形成し供給する超臨界流体供給手段２０、処理槽１０の圧力を保持または減圧する圧力調節手段３０、処理槽１０の圧力低下操作に伴う留出物を回収する回収手段４０を主な構成要素とする。
【００２２】
処理槽１０は、原材料であるカバノアナタケを受入れる金属製の圧力容器であり、原材料を受入れ可能なように上部が開閉可能な構造となっている。上部には超臨界流体を受入れる管路１１が接続され、この管路１１を通じて超臨界流体供給手段２０から供給される超臨界流体を受入れる。またこの管路１１は、処理槽内の超臨界流体を排出する管路としても使用する。
【００２３】
処理槽１０は、恒温槽１２内に設置され一定の温度に保持される。恒温槽１２は内部に電気ヒータ１３を備え、槽内の温度を測定する熱電対１４及び温度制御装置１５とで恒温槽内の温度を一定に保つ。例えば超臨界流体として二酸化炭素を使用する場合は、二酸化炭素の臨界温度が３０４．２Ｋであるので、恒温槽１２はこの温度以上に加熱する能力が求められる。また恒温槽１２には、恒温槽１２の温度分布をなくするためにファン１６が装着される。これにより処理槽１０に供給した超臨界流体を超臨界状態で安定的に保持することができる。本実施形態では恒温槽１２を用いる例を示しているけれども、処理槽の温度を一定に保持することができる機能を備えるものであれば特に形式は問わない。例えば温度制御機構を備えるウオターバス、オイルバス、又は処理槽に装着して使用可能なリボン形状の電気ヒータ、マントルヒータであってもよい。
【００２４】
超臨界流体供給手段２０は、処理槽１０に超臨界流体を供給するもので、超臨界流体を形成する二酸化炭素の供給源である液体二酸化炭素ボンベ２１、液体二酸化炭素を昇圧し処理槽に供給する供給ポンプ２２、供給ポンプ２２から送液される液体二酸化炭素を加温する熱交換器２４を主な構成要素とする。
【００２５】
液体二酸化炭素の供給源である液体二酸化炭素ボンベ２１出口には、管路２３が接続され、管路２３を通じて供給ポンプ２２に液体二酸化炭素を供給する。なお、供給ポンプ２２が可動すると熱を発生するので、管路２３の途中には冷却器を装着し、供給ポンプ２２に送液する液体二酸化炭素を冷却し送液することが望ましい。供給ポンプ２２は、送液された液体二酸化炭素を所定の圧力まで昇圧する。供給ポンプ２２の出口には管路２５が接続され、管路２５の途中には管路内の圧力を検知する圧力検知器２６が設けられている。この圧力検知器２６と図示を省略した圧力制御装置とで、供給ポンプ２２の作動を制御する。
【００２６】
昇圧された液体二酸化炭素は、管路２５を介して恒温槽内に設置された熱交換器２４に送られ、ここで所定の温度まで加温され超臨界状態となる。超臨界状態の二酸化炭素は、熱交換器２４に接続する管路２７、管路２７に接続する仕切弁２８、仕切弁２８に接続する管路２９、管路２９と接続する管路１１を通じて、処理槽１０に送られる。本実施形態では、圧力検出器２６、及び図示を省略した圧力制御装置を供給ポンプに連動させ、圧力を一定に制御する例を示したけれども、供給ポンプ２２の出口圧力を一定に制御する方法はこれに限定されない。例えば供給ポンプ２２出口に逃がし弁を設けて、圧力が上昇した場合はこの逃がし弁を通じて二酸化炭素を管路２３に戻す方法であってもよい。
【００２７】
また超臨界二酸化炭素の形成は、上記の方法以外にも次の方法を用いることもできる。処理槽１０の容積と超臨界状態の二酸化炭素の密度とから、処理槽１０に充填する液体二酸化炭素の量を算出する。この量に相当する臨界温度以下の液体二酸化炭素を処理槽１０に送液後、処理槽１０で液体二酸化炭素を加熱し、超臨界流体を形成する。この方法を採用する場合にあっては、熱交換器２４は必ずしも必要ではない。
【００２８】
圧力調整手段３０は、仕切弁３１を主な構成要素として、処理槽１０内の圧力を一定に保持、又は必要に応じて減圧する。処理槽１０に供給された超臨界流体を排出する場合は、処理槽１０の上部に連結した管路１１、管路３２を通じて仕切弁３１を開とすることで行なう。仕切弁３１は、後述のように処理槽１０内の圧力を一挙に低減可能な機能を備える圧力減圧手段でもある。仕切弁３１と接続する管路３２には分岐管３３を通じて圧力検出器３４が設けられ、これにより処理槽１０内の圧力を検知することができる。仕切弁３１を通じて超臨界流体を排出させると、断熱膨張に伴い仕切弁３１が冷却されるので、流体が固化し閉塞する場合もある。よって仕切弁３１は恒温槽１２内に設置することが望ましい。
【００２９】
仕切弁３１の出口には管路３５が接続され、管路３５は、留出物を回収する回収手段４０である回収槽に接続する。回収槽４０の上部にはベント配管４１が接続され、処理槽１０から排出される二酸化炭素は最終的にベント配管４１を通じて排出される。また回収槽４０は底部に、排出される二酸化炭素に同伴し留出する留出物を排出する管路４２及び弁４３を備える。
【００３０】
次に本細胞壁破壊装置１を用いてカバノアナタケの細胞壁を破砕する手順、及びカバノアナタケの有効成分を抽出する方法について説明する。図２は、本細胞壁破壊装置１を用いてカバノアナタケの細胞壁を破砕する手順、及び細胞壁を破壊したカバノアナタケを用いて有効成分を抽出する手順を示すフローチャートである。本フローチャートは手順の一例を示しただけで、ステップＳ１からステップＳ６までの操作は変更して使用してよいことはもちろんである。
【００３１】
まずステップＳ１で、試料であるカバノアナタケを乾燥し、試料に含まれる水分量を低下させる。本発明は、後述のようにカバノアナタケの細胞内に含まれる水分を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体と置換するので、試料に含まれる水分は少ないことが好ましいことによる。乾燥は水と媒体との置換を容易にするために行なうものであるから、試料の水分量が少ないような場合は、乾燥工程を省略してもよい。また試料に含まれる水分が比較的多い場合であっても、媒体の量を増加させたり、試料の媒体への浸漬時間を長くすることで乾燥工程を省略することは可能である。
【００３２】
本発明のカバノアナタケの有効成分の抽出には、菌核であるチャーガが有効成分を多く含有する点で好適であるけれども、カバノアナタケの子実体や菌糸体を用いることもできる。これらは単独で使用できることはもちろんであるが、子実体や菌糸体や菌核を混合してもよい。またカバノアナタケは天然物以外にも栽培物または培養物を使用できることは言うまでもない。
【００３３】
次にステップＳ２で、試料を粉砕し処理槽１０に充填する。試料を粉砕しておくことで、試料中の水分を、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体に置換することが容易となる。粉砕の程度は特に限定されないけれども、粉粒体の大きさが小さいほど水と媒体との置換が容易である。また粉砕に用いる粉砕装置の種類も特に限定されるものではない。
【００３４】
次にステップＳ３で処理槽１０にエチルアルコールを加え、試料をエチルアルコールに浸漬させる。エチルアルコールは水と超臨界流体である二酸化炭素との双方に相溶性のある媒体であり、試料をエチルアルコールに浸漬することで、細胞内の水分をエチルアルコールに置換することができる。本実施の形態では、エチルアルコールを使用しているけれども、細胞内の水と置換する媒体は、エチルアルコールに限定されない。この媒体は、水と超臨界流体との双方に相溶性を持つ媒体であればよいので、超臨界流体に二酸化炭素を使用するのであれば、メチルアルコール、メチルアルコールとエチルアルコールとの混合物、酢酸を使用することができる。さらにメチルアルコール、エチルアルコール、メチルアルコールとエチルアルコールとの混合物、酢酸と、水との混合物を用いることも可能である。ただし、媒体は細胞内の水分と置換するためのものであるので、媒体に含まれる水分濃度は低いことが望ましいのは当然である。また超臨界流体も二酸化炭素に限定されるものではない。例えばプロパンなどの炭化水素を使用することも可能である。
【００３５】
また、細胞内の水をエチルアルコール等の媒体で置換する際に、その置換を促進させる為、引き続き使用する二酸化炭素等を用いて常圧乃至超臨界圧の範囲で適宜加圧することも好適な方法である。
【００３６】
ステップＳ３におけるエチルアルコール浸漬は、細胞壁内の水をエチルアルコールで置換することにある。この際、十分なる浸漬後に、余剰のエチルアルコールを系外に排除することで、後に続く超臨界流体による細胞破壊で乾燥状態の細胞破壊物を取得することも可能となる。すなわち、超臨界状態の二酸化炭素を急速圧力開放した場合、二酸化炭素に溶解したエチルアルコールは同伴して系外に排出されるので、残留する細胞破壊物を乾燥状態として得ることも可能となる。
【００３７】
次にステップＳ４において、処理槽１０に超臨界流体を供給する。超臨界流体は、液体二酸化炭素を充填した二酸化炭素のボンベ２１から管路２３を経由し供給ポンプ２２に送り、供給ポンプ２２で所定の圧力まで昇圧し、熱交換器２４で所定の温度まで加温することで形成することができる。なお処理槽１０へ超臨界流体を送るに先立ち、処理槽１０を所定の温度まで加温しておく。
【００３８】
処理槽１０へ超臨界二酸化炭素を供給することで、超臨界二酸化炭素は細胞内のエチルアルコールに溶解し、エチルアルコールの少なくとも一部は超臨界二酸化炭素に置換する。超臨界二酸化炭素を細胞内のエチルアルコールへより確実に溶解させるには、処理槽１０に供給した超臨界二酸化炭素を排出し、再度処理槽１０へ超臨界二酸化炭素を供給する方法を用いてもよい。本発明における超臨界流体とは、臨界温度及び臨界圧力を超えた状態を言い、二酸化炭素にあっては、圧力７．３７ＭＰａ、温度３０４．２Ｋを超えた状態を言う。二酸化炭素を使用すれば、比較的低い温度及び圧力で超臨界状態を形成可能なので、装置の仕様が緩やかであり、装置コストを抑えることができる。
【００３９】
処理槽１０に超臨界二酸化炭素を供給した後、ステップＳ５において仕切弁３１を開とし、処理槽内の圧力を急激に開放する。これによりカバノアナタケの細胞内のエチルアルコールに溶解していた超臨界状態の二酸化炭素が、一挙にガス化し体積膨張を起こす。この体積膨張によりカバノアナタケの細胞壁が破壊される。このように本発明ではカバノアナタケの細胞内の水を、超臨界二酸化炭素と相溶性のあるエチルアルコールで置換した後、細胞内のエチルアルコールに超臨界二酸化炭素を溶解させるので、超臨界二酸化炭素の溶解量が非常に大きく、圧力を開放することで確実に細胞壁を破壊させることができる。
【００４０】
従来の超臨界流体を用いた菌体の細胞壁の破壊は、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体を介在させていない。このため超臨界二酸化炭素は細胞内の水に溶解することとなるが、超臨界状態の二酸化炭素であっても水に溶解する量は水に対して数％である。これに対して、エチルアルコールに対する超臨界二酸化炭素の溶解量は、水の場合の数十倍以上の溶解量を示す。一方大気圧状態においては、超臨界二酸化炭素は、ガス状態となりエチルアルコールに対する溶解量は非常小さい。これにより超臨界状態の二酸化炭素の圧力を開放することで、カバノアナタケの細胞内のエタノールに溶解していた超臨界状態の二酸化炭素が、一挙にガス化し体積膨張を起こす。
【００４１】
超臨界状態の二酸化炭素は、液体二酸化炭素に近似する密度を有するとともに、二酸化炭素ガスの有する拡散速度を示すことから、細胞内への二酸化炭素の拡散が良好に行われることからその使用が好ましいが、亜臨界状態の二酸化炭素であっても、エチルアルコールに対する溶解量は、超臨界状態の二酸化炭素の水に対する溶解量よりも大きい。このため必要に応じて亜臨界状態の流体を細胞壁の破壊に用いることができる。ここで亜臨界状態とは、温度、圧力が臨界点近傍にあるもの、または温度、圧力のうち少なくとも一方は、臨界点を超え、他方は臨界点近傍にあるものを言う。
【００４２】
以上ステップＳ１からステップＳ５の操作において、カバノアナタケの細胞壁を確実に破壊することができる。このように簡単な操作でまた短時間のうちにカバノアナタケの細胞壁を破壊することができる。さらにこの細胞壁を破壊したカバノアナタケを用いて、カバノアナタケから有効成分の抽出を行なってもよい（ステップＳ６）。細胞壁を破壊していないカバノアナタケに比較して有効成分をより多く抽出することが可能なことは、後述の実施例の実証データが示すところである。抽出には溶媒抽出を用いることが可能である。この有効成分の抽出に用いる溶媒は、特に限定されるものではなく水、アルコールなどを用いることができる。アルコール抽出を行う場合は、エチルアルコールを用いることが安全性の点から好ましい。
【００４３】
有効成分の溶媒による抽出は、ステップＳ５の細胞壁破壊が終了した後、処理槽に抽出溶媒を投入し行うこともできる。またステップＳ５の細胞壁破壊が終了したカバノアナタケを処理槽から回収し、他の抽出装置を用いて有効成分を抽出することも可能である。このようにカバノアナタケの有効成分の抽出は、細胞壁破壊操作に引き続き、細胞壁破壊を行なった処理槽１０で行なうこともできるので、有効成分を抽出するために特別の装置を必要としない。
【００４４】
本発明の他の実施形態として、カバノアナタケの細胞壁破壊とカバノアナタケの有効成分の抽出を略同一に行なうことも可能である。図２に示す操作手順において、ステップＳ３で処理槽１０に加えるエチルアルコールの量を多くし、以下図２に示すステップＳ４及びステップＳ５の操作を行なう。ステップＳ５の減圧操作で処理槽内のエチルアルコールの多くは、二酸化炭素に同伴して留出するが、ステップＳ３で処理槽に充填するエチルアルコールの量を多くすることで、処理槽内にはエチルアルコールの一部が残留する。この残留したエチルアルコールは、細胞壁が破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出する役目を果たす。
【００４５】
ステップＳ５で、二酸化炭素に同伴し留出するエチルアルコールにもカバノアナタケの有効成分が含まれる場合もあるので、処理槽１０に残留したエチルアルコール及び回収槽４０に留出した留出物からカバノアナタケの有効成分を回収することができる。本実施形態を採用することで、カバノアナタケの細胞破壊と細胞破壊をさせたカバアノアナタケからの有効成分の抽出を略同一に行なうことができる。
【００４６】
抽出されたカバノアナタケの有効成分は、従来から用いられている所定の方法で加工することで、キャラメルなどの菓子、ジュースなどの飲料（ドリンク）、粉末形態や錠剤形態などの機能性食品とすることができる。機能性食品に配合するにあたっては、抽出物をそのまま、あるいは濃縮した抽出液を配合することもできる。また機能性食品を製造するにあたり、所定の食品添加物を添加可能なことは言うまでもない。このように食品に、本発明のカバノアナタケの有効成分を含む抽出物を添加することで、異味異臭などを生じることはなく、経口摂取が容易と機能性食品とすることができる。
【００４７】
以下本発明の実施例を示す。
（実施例１）試料にはチャーガを用いた。まず始めに次ぎの要領でチャーガの細胞内の水を、液体二酸化炭素と水の双方に相溶性のあるエチルアルコールで置換した。乾燥したチャーガを機械的に粉砕し、粉末としたもの１０．５ｇを、内容積６０ｍｌの金属製小型圧力容器に入れ、エチルアルコール３０ｍｌを加えて容器を密閉した。この容器を４０℃に加温した湯浴に漬け、液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して圧力容器に供給し、１５ＭＰａまで加圧して超臨界状態とし、そのまま２０分間保持した。その後圧力をゆっくり減じ常圧に戻した。次いで、再び液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して圧力容器に供給し、１５ＭＰａまで加圧して超臨界状態としそのまま２０分間保持した後、圧力をゆっくり減じ、常圧に戻した。この２回の脱圧操作の際に、排出される二酸化炭素には一部エチルアルコールが含まれており、４．０１ｇが回収槽に捕集された。
【００４８】
次にチャーガ処理物を含む圧力容器に、液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して供給し、１５Ｍｐａまで加圧して超臨界状態とし、そのまま２０分間保持した後、今度は圧力を一挙に開放し、速やかに常圧に戻した。更にもう一度、液体二酸化炭素を昇圧装置を経由して供給し、１５Ｍｐａまで加圧して超臨界状態とし、そのまま２０分間保持した後、圧力を一挙に開放し、速やかに常圧に戻した。こうして細胞内の水分をエチルアルコールで置換したチャーガの超臨界二酸化炭素流体による急速脱圧処理物を得た。固形分として２３．２ｇを得た。
【００４９】
乾燥チャーガの重量は、上記処理によりその重量が１０．５ｇから２３．２ｇに増大した。これは、細胞内に多くのエチルアルコールが取り込まれたことを示しており、この細胞内に含まれるエチルアルコールに相溶性を有する二酸化炭素流体が、超臨界流体からガス状へ変換することに伴う急激な体積膨張により、細胞壁が破壊されることを支持している。
【００５０】
次に上記処理で得たチャーガ処理物（細胞壁を破壊したチャーガ）２．０７ｇを、ソックスレー抽出円筒ろ紙に入れ、エチルアルコール５０ｍｌを抽出媒体として一夜ソックスレー抽出した。抽出操作終了後、抽出円筒ろ紙に残留する成分を乾燥後、秤量したところ０．８０ｇであった。ここで用いたチャーガ処理物２．０７ｇは、原料のチャーガ０．９４ｇに相当するので、この一連の処理により、乾燥したチャーガの１５％に相当する有効成分が抽出されたこととなる。この値は、後述の比較例１及び比較例２の値に比較して非常に大きな値であった。
【００５１】
（比較例１）乾燥したチャーガを機械的に粉砕した粉末試料１．１３ｇをソックスレー抽出円筒ろ紙に入れ、エチルアルコール５０ｍｌを抽出媒体として一夜ソックスレー抽出した。抽出操作終了後、抽出円筒ろ紙に残留する成分を乾燥後、秤量したところ１．０３ｇであった。即ち、本処理により、乾燥したチャーガの９％に相当する有効成分が抽出されたことが分かった。
【００５２】
（比較例２）乾燥したチャーガを機械的に粉砕し粉末としたものを、液体窒素を用いる凍結粉砕法でさらに粉砕し細胞壁破壊を行った。この粉末試料１．０７ｇをソックスレー抽出円筒ろ紙に入れ、エチルアルコール５０ｍｌを抽出媒体として一夜ソックスレー抽出した。抽出操作終了後、抽出円筒ろ紙に残留する成分を乾燥後、秤量したところ０．９３ｇであった。即ち、本処理により、乾燥したチャーガの１３％に相当する有効成分が抽出されたことが分かった。
【００５３】
以上のように、チャーガ内の内包水を一旦、超臨界流体である液体二酸化炭素と相溶性を有する媒体と置換した後、液体又は超臨界状態の二酸化炭素を加圧下で共存させることにより細胞壁内の二酸化炭素流体濃度を高め、次いで急激な圧力開放により二酸化炭素がガス状態に変換することに伴う急激な体積膨張で強固な細胞壁を破壊することで、有効成分の抽出率を向上させることが可能なことが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施の一形態としてのカバノアナタケの細胞壁破壊装置１の概略的な構成を示す図である。
【図２】本発明の細胞壁破壊装置１を用いてカバノアナタケの細胞壁を破砕後、有効成分を抽出する手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００５５】
１ 細胞壁破壊装置
１０ 処理槽
２０ 超臨界流体供給手段
２１ 液体二酸化炭素ボンベ
２２ 供給ポンプ
２４ 熱交換器
３１ 仕切弁
４０ 回収槽
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊方法。
【請求項２】
前記超臨界流体は、二酸化炭素であり、また前記媒体は、エチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法。
【請求項３】
請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法により、カバノアナタケの細胞壁の破壊し、該細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出することを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法。
【請求項４】
カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
該細胞壁を破壊した該カバノアナタケから有効成分を抽出するステップと、を含み、
細胞壁を破壊するステップと、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出するステップとを、同一の容器内で略同一に行なうことを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法。
【請求項５】
超臨界流体を形成可能な超臨界流体形成手段と、
該カバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体、及び該超臨界流体を受入れ可能なカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽と、
該処理槽内の圧力を一挙に低減可能な圧力減圧手段と、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊装置。
【請求項１】
カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊方法。
【請求項２】
前記超臨界流体は、二酸化炭素であり、また前記媒体は、エチルアルコールまたは酢酸のうち少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法。
【請求項３】
請求項１に記載のカバノアナタケの細胞壁の破壊方法により、カバノアナタケの細胞壁の破壊し、該細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出することを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法。
【請求項４】
カバノアナタケの細胞内の水を、該水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体で置換するステップと、
該細胞内の水を該媒体で置換した該カバノアナタケを、超臨界流体と接触させることにより該細胞内の該媒体の少なくとも一部を超臨界流体で置換するステップと、
圧力を一挙に減じ、該細胞壁内の超臨界流体を急激に体積膨張させ細胞壁を破壊するステップと、
該細胞壁を破壊した該カバノアナタケから有効成分を抽出するステップと、を含み、
細胞壁を破壊するステップと、細胞壁を破壊したカバノアナタケから有効成分を抽出するステップとを、同一の容器内で略同一に行なうことを特徴とするカバノアナタケの有効成分の抽出方法。
【請求項５】
超臨界流体を形成可能な超臨界流体形成手段と、
該カバノアナタケ、水と超臨界流体との双方に相溶性のある媒体、及び該超臨界流体を受入れ可能なカバノアナタケの細胞壁を破壊する処理槽と、
該処理槽内の圧力を一挙に低減可能な圧力減圧手段と、
を含むことを特徴とするカバノアナタケの細胞壁の破壊装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１２９７１４（Ｐ２００６−１２９７１４Ａ）
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１９１９８（Ｐ２００４−３１９１９８）
【出願日】平成１６年１１月２日（２００４．１１．２）
【出願人】（５０３１６１０８４）株式会社コーケン (1)
【出願人】（５９２１４８８７８）株式会社東洋高圧 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２日（２００４．１１．２）
【出願人】（５０３１６１０８４）株式会社コーケン (1)
【出願人】（５９２１４８８７８）株式会社東洋高圧 (49)
【Ｆターム（参考）】
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