カビの検査方法
【課題】 複数種類のカビを同じ培地で同時に培養し、各カビを特異的に検出することを可能とする。
【解決手段】 複数種類のカビを培養し、この培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する。
【解決手段】 複数種類のカビを培養し、この培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カビの検査方法に関し、特に複数種類のカビを同時に特異的に検出するためのカビの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、食品製造現場や臨床現場、また文化財などの保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このようなカビの存在確認として、以下に示す３通りの方法を挙げることができる。
まず、第一の方法として、環境中から試料をサンプリングして前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定し、その存否の確認を行う方法を挙げることができる（特許文献１参照）。
【０００３】
また、第二の方法として、環境中から試料をサンプリングして前培養した後に各菌を個別に培養し、培養細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりターゲット領域を増幅して、その領域の塩基配列を解析することで、カビの同定及び存在確認を行う方法を挙げることができる。
さらに、近年では、カビの新たな検出方法として、ターゲット領域と相補的に結合する塩基配列からなるプローブを作成してＤＮＡチップの基板上に固定化し、ＰＣＲの増幅産物をＤＮＡチップに滴下することで、対応するターゲット領域とプローブとをハイブリダイズさせ、試料に含まれるカビの同定及び存在確認を行う方法が開発されている（特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１９５４５４号公報
【特許文献２】特開２００８−３５７７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、形態同定を行う第一の方法では、形態的特徴を発現させるため、菌種ごとに最適な培地と長期間の培養が必要となり、さらに同定には熟練が必要となることから、迅速な検査や検査の簡易化に適するものではないという問題があった。
また、ＰＣＲ及び配列解析による第二の方法でも、菌種ごとに個別に培養するため、１４日程度の比較的長い検査期間が必要となり、また菌種ごとに個別に解析することが必要であることから、多検体処理が要求される場合に適するものではないという問題があった。
【０００６】
これに対して、ＤＮＡチップによる新たな検出方法によれば、理論上、複数種類のカビを一括して検出することが可能であり、迅速かつ簡易な検査方法として期待されている。
【０００７】
一方、カビは生育に適する湿度にもとづいて、好乾性カビ（乾燥状態を好む）、耐乾性カビ（乾燥に耐えうる）、及び好湿性カビ（湿潤状態を好む）に分けられ、これらはそれぞれに適した異なる培地によって培養する必要があった。また、上述した従来一般的に行われている第一及び第二の方法では、菌種ごとに培養することが必要であったことから、複数のカビを混合して培養し、さらにその上で、それぞれのカビを個別に検出するという概念は存在していなかった。このため、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを同時に培養して、それぞれのカビを特異的に検出可能にする技術は、従来は存在していなかった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、複数種類のカビを分離培養することなく、同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出可能にするカビの検査方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、この培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法としてある。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、カビを菌種ごとに個別に分けることなく、混在したまま培養しても、培養された菌種を特異的に検出することができる。すなわち、培養された複数種類のカビが混合された状態で、それぞれのカビのゲノムＤＮＡの抽出をまとめて行っても、ＤＮＡチップにより、各カビを検出することができる。
【００１０】
なお、抽出されたゲノムＤＮＡを、ＤＮＡチップを用いて検出する方法としては、一般的な手法を用いることが可能である。
具体的には、例えば検出対象カビの特定領域を増幅するためのプライマーセットを含むＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲ法によりゲノムＤＮＡの特定領域を増幅する。このプライマーセットによる増幅領域から予め選択されたプローブをＤＮＡチップに固定化しておく。このとき、プライマーセット及びプローブは、検出対象カビの特定領域ごとに予め作成しておく必要がある。そして、ＰＣＲ法により得られた増幅産物を当該ＤＮＡチップに滴下し、プローブに結合した増幅産物を検出することで、混合物に含まれる各種カビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。
【００１１】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、少なくとも好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビからなる群から選択される２種類以上のカビを所定の一の培地で同時に培養し、この培養したカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法とすることも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、通常は個別に培養される、異なる湿度環境を要求するカビを所定の一の培地で同時に培養することができる。そして、これらの混合物からそれぞれのカビを特異的に検出することができる。このため、カビの性質等を考慮することなく、一括して同時に培養して検出を行うことができ、カビの検査の簡易化を図ることが可能となる。
【００１２】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度は、５〜５０％、さらには、１０％〜４０％とすることが好ましい。糖の種類として、具体的には、グルコース、シュークロースが好適に使用される。
このような水分活性値、糖濃度の固形培地によれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも好適に培養することができ、あらゆるカビを一括して同時に培養し、その検出を行うことが可能となる。
【００１３】
さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、２５℃±２℃の温度で培養する方法とすることも好ましい。
このような温度範囲であれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも十分に繁殖させることが可能となる。
【００１４】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、培養した複数種類のカビを、カビの細胞壁を物理的に破砕するためのビーズを収容した容器に入れて混合し、一括してゲノムＤＮＡを抽出することも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、同時に培養された複数種類のカビからまとめてゲノムＤＮＡを抽出することが可能となる。
【００１５】
さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビが、大気中に浮遊もしくは付着したカビ胞子及び菌糸であることも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、環境中におけるカビを採取して培養し、これらを簡易に同時に検出することが可能となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】各種培地組成による培養試験の培養評価を示す図である。
【図２】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種培地で培養したときのコロニーの直径を示す図である。
【図３】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの直径を示す図である。
【図４】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの写真を示す図である。
【図５】検体１−２０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【図６】検体２１−４０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【図７】検体４５−６０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明のカビの検査方法の一実施形態について詳細に説明する。なお、本実施形態のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出するものであれば良く、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１９】
本実施形態のカビの検査方法は、以下の工程を含むものとすることができる。
（１）カビの採取
まず、エアーサンプラーを用いて、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等における空気を採取する。次いで、採取した空気をエアーサンプラー用にストリップ形状にした専用培地などに吹き付けて培養する。
【００２０】
その培地としては、実施例において後述するように、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができるＭ４０Ｙ、ＭＹ１０Ｇ培地、ＭＹ３０Ｇ培地等を用いることが好ましい。このうち、Ｍ４０Ｙ培地を用いると、上記のいずれの性質のカビでも高効率に培養することが可能であるため、特に好ましい。
また、培養条件としては、２３℃〜２７℃の温度の暗所に、２日〜７日程度静置させることが好ましい。
なお、一般的にＭ４０Ｙ培地、ＭＹ１０Ｇ培地、及びＭＹ３０Ｇ培地は、好乾性カビ用のものと考えられており、好湿性カビ培養には適さないと考えられてきた。
【００２１】
次に、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、個別に分離することなく、一括して採取する。そして、採取された試料を、例えば、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶などに入れ、バイアル瓶ごと液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置等を用いて、カビの細胞を破砕する。なお、細胞の破壊は、ＤＮＡが抽出できるように行われれば良く、その他の方法により行ってもかまわない。
【００２２】
（２）ＤＮＡの抽出
カビの細胞を破壊した試料から、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法を用いることができる。
【００２３】
（３）ＰＣＲ法によるＩＴＳ領域の増幅
次に、各種カビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅することができるプライマーセットをＰＣＲ反応液に加えて、ＰＣＲ法により、上記試料中のカビのゲノムＤＮＡにおける特定領域を増幅する。具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ配列番号１，２に示される塩基配列のものを用いることができる。また、ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
【００２４】
本実施形態のＰＣＲ反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、標識成分（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの容量分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することが可能である。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所）を用いることができる。
【００２５】
本実施形態のカビの検査方法におけるＰＣＲ反応条件としては、例えば以下のようにすることが好ましい。
（ａ）９５℃ １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
【００２６】
（４）ＤＮＡチップによる検出
本実施形態のＤＮＡチップは、検出対象のカビのＤＮＡから選択されたプローブを固定化したものであれば良く、その他の点では特に限定されない。例えばスポット型ＤＮＡチップ、合成型ＤＮＡチップなどを用いることが可能である。
具体的には、本実施形態のカビの検査方法のＰＣＲ反応液に含まれるプライマーセットにより増幅される増幅領域と結合するプローブを予め合成し、ＤＮＡチップの基板上に固定化しておく。例えば、アスペルギルス ヴィトリコラ（Aspergillus vitricola）検出用のプローブとしては、配列番号３に示される塩基配列からなるものを用いることができる。また、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides）検出用のプローブとしては、配列番号４に示される塩基配列からなるものを用いることができる。さらに、ユーロチウム属菌（Eurotium sp.）検出用のプローブとしては、配列番号５に示される塩基配列からなるものを用いることができる。
【００２７】
次に、ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡチップ上に滴下して、上記カビ検出用プローブにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の標識を検出する。具体的には、例えば次のように行うことができる。
まず、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合して、ＤＮＡチップに滴下する。
次に、ＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流す。
そして、ＤＮＡチップを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、検出対象カビが存在するか否かを判定する。なお、標識検出装置としては、例えば、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。なお、標識及びその検出方法は蛍光に限定されず、その他の方法を用いても良い。
【００２８】
以上説明したように、本実施形態のカビの検査方法によれば、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができる培地を用いて、複数のカビを同時に培養することができる。そして、培養されたカビを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出することができる。
このため、採取されたカビを分離培養する必要がなく、複数種類のカビを迅速に一括して簡易に検出することが可能である。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明のカビの検査方法によるカビ検出の試験結果について、具体的に説明する。
【００３０】
（試験１：各種培地組成の水分活性値による培養試験）
ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）培地とＭＹ（Ｍａｌｔ＋Ｙｅａｓｔ）培地に糖などを添加して種々の水分活性値を示す培地組成からなる各種培地を作製し、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを培養して、それぞれの培養結果を評価した。
【００３１】
１．培地の作製方法
（１）ＰＤＡ培地
ＰＤＡ（ＤＩＦＣＯ社製）に、グルコース（和光純薬工業株式会社）、及び／又は、シュークロース（和光純薬工業株式会社）を各種割合で添加し、１Ｌのイオン交換水に懸濁してオートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。なお、シャーレ分注前に、細菌増殖を防止する目的で、クロラムフェニコール（和光純薬工業株式会社）を最終濃度５０ｐｐｍとなるように加えた。ＭＹ培地についても同様である。
【００３２】
（２）ＭＹ培地
以下のＭＹに、シュークロース（和光純薬工業株式会社）、グルコース、寒天（和光純薬工業株式会社）、及びグリセリンの少なくともいずれかを各種割合で添加し、１００ｍｌのイオン交換水に懸濁し、オートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。
ＭＹ：麦芽（Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）＋酵母（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）
【００３３】
２．培地の水分活性値の測定
実際に培養に使用した培地の所定量について、ロトロニック水分活性測定装置（ＧＳＩクレオス社製）を使用して、その水分活性値を専用密閉容器内で測定した。
【００３４】
３．培養評価
上記作製方法に従って作成した各種培地（図１の実施例１−１０，参考例１−６）を用いて、好乾性カビ（Eurotium herbariorum）、耐乾性カビ（A.niger）、好湿性カビ（Fusarium sp.）を２５℃で暗所にて７２時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。培養後のコロニーの直径が１０ｍｍ以上を○、１０ｍｍ未満を×とした。その結果を図１に示す。
同図に示されている通り、実施例１−１０の各種培地を用いた場合は、好乾性カビ、耐乾性カビ及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例１−６の各種培地を用いた場合は、十分に繁殖していない菌種が存在していることがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の範囲とすることが好適であることがわかる。
【００３５】
（試験２：各種培地による培養試験）
図１に示す参考例１，２，４−６、及び実施例７の６種類の培地を用いて、各種のカビを２５℃で暗所にて１６８時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。
【００３６】
供試菌種としては、以下の１４種類のものを使用した。結果を図２に示す。このうち、１−４の供試菌種は好乾性のカビであり、５−１０の供試菌種は耐乾性のカビであり、１１−１４の供試菌種は好湿性のカビである。なお、これらの供試菌種は環境中から独自に採取し、同定して得たものであり、その番号は便宜上付したものである。
【００３７】
１．アスペルギルス ペニシリオイデス（A.penicillioides，K-7-4）
２．アスペルギルス リストリクタス（A.restrictus，I-2-1）
３．ユーロチウム ヘルバリオルム（Eurotium herbariorum，イ2-1）
４．ワレミア セビ（Wallemia sebi，KSS-1127）
５．アスペルギルス フラバス（A.flavus，B-3-3）
６．アスペルギルス フミガタス（A.fumigatus，KSS-1126）
７．アスペルギルス ニガー（A.niger，A-1-1）
８．アスペルギルス バーシカラー（A.versicolor，イ3-1）
９．ペニシリウム グラブラム（Penicillium glabrum，B-4-3）
１０．ペニシリウム ルグロサム（P.rugulosum，E-2-3）
１１．クラドスポリウム サファエロスペルマ（Cladosporium.sphaerospermum，I-4-2）
１２．クラドスポリウム クラドスポリオイデス（C.cladosporioides，A-2-1）
１３．フザリウム属菌（Fusarium sp.，Ｂ５−３−Ｃ）
１４．スタキボトリス属菌（Stachybotrys sp.，KSS-1125）
【００３８】
図２に示される通り、実施例７の培地（Ｍ４０Ｙ）によれば、生育に適する湿度が異なる複数の種類のカビのコロニーができ、上記１−１４の全ての菌種が、十分に繁殖していることがわかる。
このように、実施例７の培地を用いれば、最適湿度についての性質が異なる複数のカビを、同じ培地で同時に培養可能であることが明らかとなった。
【００３９】
（試験３：各種温度による培養試験）
実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて、各種温度で培養を行い、得られたコロニーの直径を測定した。供試菌種は、試験１と同様に好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを含む１４種類を用い、暗所にて１６８時間培養を行った。その結果を図３に示す。また、３，８，１３の菌種について、図４にコロニーの写真を示す。
【００４０】
図３の実施例１１−１３に示される通り、培養温度が２３℃〜２７℃の範囲では、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例７−９に示される通り、培養温度が３０℃〜３５℃の範囲では、生育できない菌種が存在することがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、培養温度を２５℃±２℃の範囲とすることが好適であることがわかる。
【００４１】
（試験４：ＤＮＡチップ解析試験）
実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて各種カビを培養し、得られたコロニーを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＩＴＳ１領域をＰＣＲ法により増幅して検出対象カビが増幅産物に含まれているか否かをＤＮＡチップにより検査した。また、ＤＮＡチップによる検査結果を検証するために、ＤＮＡ配列解析を行った。具体的には、以下のようにして行った。
【００４２】
まず、実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いた検体として、Ｎｏ．１からＮｏ．６０までの６０個の検体を準備した。次に、エアーサンプラーを用いて、一般環境中から空気を採取し、上記各検体に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
【００４３】
次に、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、ＤＮＡ配列解析に供するために、各コロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７−１０日間分離培養を行った。
さらに、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取して、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
【００４４】
次いで、検体ごとに、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域を増幅した。
具体的には、ＰＣＲ反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ（Ｇ／Ｃｒｉｃｈ） ４．０μｌ
２．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（ａｄｄｉｔｉｏｎ−４） ４．０μｌ
３．ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ １．０μｌ
４．Ｃｙ５−ｄＣＴＰ ０．２μｌ
５．ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー（１０μＭ，配列番号１，シグマアルドリッチ社により合成） １．０μｌ
６．ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマー（１０μＭ，配列番号２，シグマアルドリッチ社により合成） １．０μｌ
７．試料のゲノムＤＮＡ １．０μｌ
８．ＮｏｖａＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２μｌ
９．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００４５】
このＰＣＲ反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
１．９５℃ １０分
２．９５℃ ３０秒
３．５６℃ ３０秒
４．７２℃ ６０秒（２〜４を４０サイクル）
５．７２℃ １０分
【００４６】
ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、これに配列番号３、配列番号４、配列番号５に示される塩基配列からなるプローブを固定化したものを使用した。これらは、それぞれアスペルギルス ヴィトリコラ（Aspergillus vitricola）検出用のプローブ、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides）検出用のプローブ、及びユーロチウム属菌（Eurotium sp.）検出用のプローブである。
【００４７】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、上記ＤＮＡチップに滴下した。
このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（ジーンシリコン専用スキャナー BIOSHOT東洋鋼鈑株式会社製）にかけて、各プローブの蛍光強度を測定した。その結果を図５−７に示す。
【００４８】
また、検体ごとに含まれる菌種のＤＮＡ配列解析を行うため、上記のようにコロニーごとに分離培養して得られた菌種からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により増幅産物を得た。
このとき、プライマーセットは、配列番号１及び２に示される塩基配列からなるものを用いるとともに、核酸合成酵素には、TAKARA ExTaq ポリメラーゼを使用した。また、核酸増幅装置には、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、その他は上記と同様にしてＰＣＲ反応を行った。
このＰＣＲ反応により得られた増幅産物と、配列番号６及び７に示される塩基配列からなるプライマーセットをシーケンス用プライマーとして、タカラバイオ株式会社に委託し、ＤＮＡシーケンサーによりＩＴＳ１領域の配列解析を行った。その結果、図５−７に示すように、各検体から最大で４菌種が確認された。
【００４９】
図５−７の「ＤＮＡチップ解析（プローブ蛍光強度）」において、陽性と考えられる部分を太枠で囲っている。これらは、それぞれ「ＩＴＳ配列解析により確認された検体中に含まれる菌種」において、同じ菌種が示されている。
なお、ＩＴＳ配列解析により耐乾性カビ（Penicillium sp.）、及び好湿性カビ（Cladosporium sp.）が含まれていることが判明した検体Ｎｏ．３につき、Penicillium sp検出用プローブ及びCladosporium sp検出用プローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、上記と同様にして、標識検出装置により蛍光強度を測定したところ、これらの菌種（Penicillium sp.，Cladosporium sp.）の検出が確認された。
したがって、本発明のカビの検査方法により、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養した場合に、各カビを特異的に検出できることが分かった。
【００５０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施例では、培地としてＭ４０Ｙなどを用いているがこれらに限定されるものではなく、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の固形培地のその他の固形培地を用いるなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等におけるカビの検査に好適に利用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カビの検査方法に関し、特に複数種類のカビを同時に特異的に検出するためのカビの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、食品製造現場や臨床現場、また文化財などの保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
このようなカビの存在確認として、以下に示す３通りの方法を挙げることができる。
まず、第一の方法として、環境中から試料をサンプリングして前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定し、その存否の確認を行う方法を挙げることができる（特許文献１参照）。
【０００３】
また、第二の方法として、環境中から試料をサンプリングして前培養した後に各菌を個別に培養し、培養細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりターゲット領域を増幅して、その領域の塩基配列を解析することで、カビの同定及び存在確認を行う方法を挙げることができる。
さらに、近年では、カビの新たな検出方法として、ターゲット領域と相補的に結合する塩基配列からなるプローブを作成してＤＮＡチップの基板上に固定化し、ＰＣＲの増幅産物をＤＮＡチップに滴下することで、対応するターゲット領域とプローブとをハイブリダイズさせ、試料に含まれるカビの同定及び存在確認を行う方法が開発されている（特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１９５４５４号公報
【特許文献２】特開２００８−３５７７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、形態同定を行う第一の方法では、形態的特徴を発現させるため、菌種ごとに最適な培地と長期間の培養が必要となり、さらに同定には熟練が必要となることから、迅速な検査や検査の簡易化に適するものではないという問題があった。
また、ＰＣＲ及び配列解析による第二の方法でも、菌種ごとに個別に培養するため、１４日程度の比較的長い検査期間が必要となり、また菌種ごとに個別に解析することが必要であることから、多検体処理が要求される場合に適するものではないという問題があった。
【０００６】
これに対して、ＤＮＡチップによる新たな検出方法によれば、理論上、複数種類のカビを一括して検出することが可能であり、迅速かつ簡易な検査方法として期待されている。
【０００７】
一方、カビは生育に適する湿度にもとづいて、好乾性カビ（乾燥状態を好む）、耐乾性カビ（乾燥に耐えうる）、及び好湿性カビ（湿潤状態を好む）に分けられ、これらはそれぞれに適した異なる培地によって培養する必要があった。また、上述した従来一般的に行われている第一及び第二の方法では、菌種ごとに培養することが必要であったことから、複数のカビを混合して培養し、さらにその上で、それぞれのカビを個別に検出するという概念は存在していなかった。このため、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを同時に培養して、それぞれのカビを特異的に検出可能にする技術は、従来は存在していなかった。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、複数種類のカビを分離培養することなく、同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出可能にするカビの検査方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、この培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法としてある。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、カビを菌種ごとに個別に分けることなく、混在したまま培養しても、培養された菌種を特異的に検出することができる。すなわち、培養された複数種類のカビが混合された状態で、それぞれのカビのゲノムＤＮＡの抽出をまとめて行っても、ＤＮＡチップにより、各カビを検出することができる。
【００１０】
なお、抽出されたゲノムＤＮＡを、ＤＮＡチップを用いて検出する方法としては、一般的な手法を用いることが可能である。
具体的には、例えば検出対象カビの特定領域を増幅するためのプライマーセットを含むＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲ法によりゲノムＤＮＡの特定領域を増幅する。このプライマーセットによる増幅領域から予め選択されたプローブをＤＮＡチップに固定化しておく。このとき、プライマーセット及びプローブは、検出対象カビの特定領域ごとに予め作成しておく必要がある。そして、ＰＣＲ法により得られた増幅産物を当該ＤＮＡチップに滴下し、プローブに結合した増幅産物を検出することで、混合物に含まれる各種カビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。
【００１１】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、少なくとも好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビからなる群から選択される２種類以上のカビを所定の一の培地で同時に培養し、この培養したカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する方法とすることも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、通常は個別に培養される、異なる湿度環境を要求するカビを所定の一の培地で同時に培養することができる。そして、これらの混合物からそれぞれのカビを特異的に検出することができる。このため、カビの性質等を考慮することなく、一括して同時に培養して検出を行うことができ、カビの検査の簡易化を図ることが可能となる。
【００１２】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度は、５〜５０％、さらには、１０％〜４０％とすることが好ましい。糖の種類として、具体的には、グルコース、シュークロースが好適に使用される。
このような水分活性値、糖濃度の固形培地によれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも好適に培養することができ、あらゆるカビを一括して同時に培養し、その検出を行うことが可能となる。
【００１３】
さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビを、２５℃±２℃の温度で培養する方法とすることも好ましい。
このような温度範囲であれば、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれをも十分に繁殖させることが可能となる。
【００１４】
また、上記の本発明のカビの検査方法において、培養した複数種類のカビを、カビの細胞壁を物理的に破砕するためのビーズを収容した容器に入れて混合し、一括してゲノムＤＮＡを抽出することも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、同時に培養された複数種類のカビからまとめてゲノムＤＮＡを抽出することが可能となる。
【００１５】
さらに、上記の本発明のカビの検査方法において、複数種類のカビが、大気中に浮遊もしくは付着したカビ胞子及び菌糸であることも好ましい。
本発明のカビの検査方法をこのような方法にすれば、環境中におけるカビを採取して培養し、これらを簡易に同時に検出することが可能となる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養すると共に、これらを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップにより各カビを特異的に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】各種培地組成による培養試験の培養評価を示す図である。
【図２】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種培地で培養したときのコロニーの直径を示す図である。
【図３】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの直径を示す図である。
【図４】好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを、各種温度で培養したときのコロニーの写真を示す図である。
【図５】検体１−２０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【図６】検体２１−４０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【図７】検体４５−６０における菌種のＤＮＡチップ解析及び配列解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明のカビの検査方法の一実施形態について詳細に説明する。なお、本実施形態のカビの検査方法は、複数種類のカビを培養し、培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出するものであれば良く、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【００１９】
本実施形態のカビの検査方法は、以下の工程を含むものとすることができる。
（１）カビの採取
まず、エアーサンプラーを用いて、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等における空気を採取する。次いで、採取した空気をエアーサンプラー用にストリップ形状にした専用培地などに吹き付けて培養する。
【００２０】
その培地としては、実施例において後述するように、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができるＭ４０Ｙ、ＭＹ１０Ｇ培地、ＭＹ３０Ｇ培地等を用いることが好ましい。このうち、Ｍ４０Ｙ培地を用いると、上記のいずれの性質のカビでも高効率に培養することが可能であるため、特に好ましい。
また、培養条件としては、２３℃〜２７℃の温度の暗所に、２日〜７日程度静置させることが好ましい。
なお、一般的にＭ４０Ｙ培地、ＭＹ１０Ｇ培地、及びＭＹ３０Ｇ培地は、好乾性カビ用のものと考えられており、好湿性カビ培養には適さないと考えられてきた。
【００２１】
次に、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、個別に分離することなく、一括して採取する。そして、採取された試料を、例えば、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶などに入れ、バイアル瓶ごと液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置等を用いて、カビの細胞を破砕する。なお、細胞の破壊は、ＤＮＡが抽出できるように行われれば良く、その他の方法により行ってもかまわない。
【００２２】
（２）ＤＮＡの抽出
カビの細胞を破壊した試料から、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法を用いることができる。
【００２３】
（３）ＰＣＲ法によるＩＴＳ領域の増幅
次に、各種カビのｒＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅することができるプライマーセットをＰＣＲ反応液に加えて、ＰＣＲ法により、上記試料中のカビのゲノムＤＮＡにおける特定領域を増幅する。具体的には、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ配列番号１，２に示される塩基配列のものを用いることができる。また、ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
【００２４】
本実施形態のＰＣＲ反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、標識成分（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの容量分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することが可能である。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所）を用いることができる。
【００２５】
本実施形態のカビの検査方法におけるＰＣＲ反応条件としては、例えば以下のようにすることが好ましい。
（ａ）９５℃ １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
【００２６】
（４）ＤＮＡチップによる検出
本実施形態のＤＮＡチップは、検出対象のカビのＤＮＡから選択されたプローブを固定化したものであれば良く、その他の点では特に限定されない。例えばスポット型ＤＮＡチップ、合成型ＤＮＡチップなどを用いることが可能である。
具体的には、本実施形態のカビの検査方法のＰＣＲ反応液に含まれるプライマーセットにより増幅される増幅領域と結合するプローブを予め合成し、ＤＮＡチップの基板上に固定化しておく。例えば、アスペルギルス ヴィトリコラ（Aspergillus vitricola）検出用のプローブとしては、配列番号３に示される塩基配列からなるものを用いることができる。また、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides）検出用のプローブとしては、配列番号４に示される塩基配列からなるものを用いることができる。さらに、ユーロチウム属菌（Eurotium sp.）検出用のプローブとしては、配列番号５に示される塩基配列からなるものを用いることができる。
【００２７】
次に、ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡチップ上に滴下して、上記カビ検出用プローブにハイブリダイズしたＰＣＲ増幅産物の標識を検出する。具体的には、例えば次のように行うことができる。
まず、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合して、ＤＮＡチップに滴下する。
次に、ＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流す。
そして、ＤＮＡチップを標識検出装置にかけて標識の検出を行い、検出対象カビが存在するか否かを判定する。なお、標識検出装置としては、例えば、蛍光スキャニング装置など一般的なものを用いることができる。なお、標識及びその検出方法は蛍光に限定されず、その他の方法を用いても良い。
【００２８】
以上説明したように、本実施形態のカビの検査方法によれば、好乾性、耐乾性、及び好湿性のいずれのカビでも培養することができる培地を用いて、複数のカビを同時に培養することができる。そして、培養されたカビを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出することができる。
このため、採取されたカビを分離培養する必要がなく、複数種類のカビを迅速に一括して簡易に検出することが可能である。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明のカビの検査方法によるカビ検出の試験結果について、具体的に説明する。
【００３０】
（試験１：各種培地組成の水分活性値による培養試験）
ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）培地とＭＹ（Ｍａｌｔ＋Ｙｅａｓｔ）培地に糖などを添加して種々の水分活性値を示す培地組成からなる各種培地を作製し、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを培養して、それぞれの培養結果を評価した。
【００３１】
１．培地の作製方法
（１）ＰＤＡ培地
ＰＤＡ（ＤＩＦＣＯ社製）に、グルコース（和光純薬工業株式会社）、及び／又は、シュークロース（和光純薬工業株式会社）を各種割合で添加し、１Ｌのイオン交換水に懸濁してオートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。なお、シャーレ分注前に、細菌増殖を防止する目的で、クロラムフェニコール（和光純薬工業株式会社）を最終濃度５０ｐｐｍとなるように加えた。ＭＹ培地についても同様である。
【００３２】
（２）ＭＹ培地
以下のＭＹに、シュークロース（和光純薬工業株式会社）、グルコース、寒天（和光純薬工業株式会社）、及びグリセリンの少なくともいずれかを各種割合で添加し、１００ｍｌのイオン交換水に懸濁し、オートクレーブで融解後、シャーレに分注して作製した。
ＭＹ：麦芽（Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）＋酵母（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，ＤＩＦＣＯ社製）
【００３３】
２．培地の水分活性値の測定
実際に培養に使用した培地の所定量について、ロトロニック水分活性測定装置（ＧＳＩクレオス社製）を使用して、その水分活性値を専用密閉容器内で測定した。
【００３４】
３．培養評価
上記作製方法に従って作成した各種培地（図１の実施例１−１０，参考例１−６）を用いて、好乾性カビ（Eurotium herbariorum）、耐乾性カビ（A.niger）、好湿性カビ（Fusarium sp.）を２５℃で暗所にて７２時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。培養後のコロニーの直径が１０ｍｍ以上を○、１０ｍｍ未満を×とした。その結果を図１に示す。
同図に示されている通り、実施例１−１０の各種培地を用いた場合は、好乾性カビ、耐乾性カビ及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例１−６の各種培地を用いた場合は、十分に繁殖していない菌種が存在していることがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の範囲とすることが好適であることがわかる。
【００３５】
（試験２：各種培地による培養試験）
図１に示す参考例１，２，４−６、及び実施例７の６種類の培地を用いて、各種のカビを２５℃で暗所にて１６８時間培養し、得られたコロニーの直径を測定した。
【００３６】
供試菌種としては、以下の１４種類のものを使用した。結果を図２に示す。このうち、１−４の供試菌種は好乾性のカビであり、５−１０の供試菌種は耐乾性のカビであり、１１−１４の供試菌種は好湿性のカビである。なお、これらの供試菌種は環境中から独自に採取し、同定して得たものであり、その番号は便宜上付したものである。
【００３７】
１．アスペルギルス ペニシリオイデス（A.penicillioides，K-7-4）
２．アスペルギルス リストリクタス（A.restrictus，I-2-1）
３．ユーロチウム ヘルバリオルム（Eurotium herbariorum，イ2-1）
４．ワレミア セビ（Wallemia sebi，KSS-1127）
５．アスペルギルス フラバス（A.flavus，B-3-3）
６．アスペルギルス フミガタス（A.fumigatus，KSS-1126）
７．アスペルギルス ニガー（A.niger，A-1-1）
８．アスペルギルス バーシカラー（A.versicolor，イ3-1）
９．ペニシリウム グラブラム（Penicillium glabrum，B-4-3）
１０．ペニシリウム ルグロサム（P.rugulosum，E-2-3）
１１．クラドスポリウム サファエロスペルマ（Cladosporium.sphaerospermum，I-4-2）
１２．クラドスポリウム クラドスポリオイデス（C.cladosporioides，A-2-1）
１３．フザリウム属菌（Fusarium sp.，Ｂ５−３−Ｃ）
１４．スタキボトリス属菌（Stachybotrys sp.，KSS-1125）
【００３８】
図２に示される通り、実施例７の培地（Ｍ４０Ｙ）によれば、生育に適する湿度が異なる複数の種類のカビのコロニーができ、上記１−１４の全ての菌種が、十分に繁殖していることがわかる。
このように、実施例７の培地を用いれば、最適湿度についての性質が異なる複数のカビを、同じ培地で同時に培養可能であることが明らかとなった。
【００３９】
（試験３：各種温度による培養試験）
実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて、各種温度で培養を行い、得られたコロニーの直径を測定した。供試菌種は、試験１と同様に好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビを含む１４種類を用い、暗所にて１６８時間培養を行った。その結果を図３に示す。また、３，８，１３の菌種について、図４にコロニーの写真を示す。
【００４０】
図３の実施例１１−１３に示される通り、培養温度が２３℃〜２７℃の範囲では、好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビのいずれもが十分に繁殖していることがわかる。一方、参考例７−９に示される通り、培養温度が３０℃〜３５℃の範囲では、生育できない菌種が存在することがわかる。このため、複数の菌種を同時に培養するためには、培養温度を２５℃±２℃の範囲とすることが好適であることがわかる。
【００４１】
（試験４：ＤＮＡチップ解析試験）
実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いて各種カビを培養し、得られたコロニーを混合して一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＩＴＳ１領域をＰＣＲ法により増幅して検出対象カビが増幅産物に含まれているか否かをＤＮＡチップにより検査した。また、ＤＮＡチップによる検査結果を検証するために、ＤＮＡ配列解析を行った。具体的には、以下のようにして行った。
【００４２】
まず、実施例７で使用したＭ４０Ｙ培地を用いた検体として、Ｎｏ．１からＮｏ．６０までの６０個の検体を準備した。次に、エアーサンプラーを用いて、一般環境中から空気を採取し、上記各検体に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
【００４３】
次に、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを、ＤＮＡ配列解析に供するために、各コロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７−１０日間分離培養を行った。
さらに、検体ごとに、培地に生じた様々な種類のカビのコロニーを一括して採取して、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
【００４４】
次いで、検体ごとに、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域を増幅した。
具体的には、ＰＣＲ反応液として、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ（Ｇ／Ｃｒｉｃｈ） ４．０μｌ
２．Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（ａｄｄｉｔｉｏｎ−４） ４．０μｌ
３．ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ １．０μｌ
４．Ｃｙ５−ｄＣＴＰ ０．２μｌ
５．ＩＴＳ１領域増幅用フォワードプライマー（１０μＭ，配列番号１，シグマアルドリッチ社により合成） １．０μｌ
６．ＩＴＳ１領域増幅用リバースプライマー（１０μＭ，配列番号２，シグマアルドリッチ社により合成） １．０μｌ
７．試料のゲノムＤＮＡ １．０μｌ
８．ＮｏｖａＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２μｌ
９．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００４５】
このＰＣＲ反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
１．９５℃ １０分
２．９５℃ ３０秒
３．５６℃ ３０秒
４．７２℃ ６０秒（２〜４を４０サイクル）
５．７２℃ １０分
【００４６】
ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、これに配列番号３、配列番号４、配列番号５に示される塩基配列からなるプローブを固定化したものを使用した。これらは、それぞれアスペルギルス ヴィトリコラ（Aspergillus vitricola）検出用のプローブ、アスペルギルス ペニシリオイデス（Aspergillus penicillioides）検出用のプローブ、及びユーロチウム属菌（Eurotium sp.）検出用のプローブである。
【００４７】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、上記ＤＮＡチップに滴下した。
このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（ジーンシリコン専用スキャナー BIOSHOT東洋鋼鈑株式会社製）にかけて、各プローブの蛍光強度を測定した。その結果を図５−７に示す。
【００４８】
また、検体ごとに含まれる菌種のＤＮＡ配列解析を行うため、上記のようにコロニーごとに分離培養して得られた菌種からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により増幅産物を得た。
このとき、プライマーセットは、配列番号１及び２に示される塩基配列からなるものを用いるとともに、核酸合成酵素には、TAKARA ExTaq ポリメラーゼを使用した。また、核酸増幅装置には、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、その他は上記と同様にしてＰＣＲ反応を行った。
このＰＣＲ反応により得られた増幅産物と、配列番号６及び７に示される塩基配列からなるプライマーセットをシーケンス用プライマーとして、タカラバイオ株式会社に委託し、ＤＮＡシーケンサーによりＩＴＳ１領域の配列解析を行った。その結果、図５−７に示すように、各検体から最大で４菌種が確認された。
【００４９】
図５−７の「ＤＮＡチップ解析（プローブ蛍光強度）」において、陽性と考えられる部分を太枠で囲っている。これらは、それぞれ「ＩＴＳ配列解析により確認された検体中に含まれる菌種」において、同じ菌種が示されている。
なお、ＩＴＳ配列解析により耐乾性カビ（Penicillium sp.）、及び好湿性カビ（Cladosporium sp.）が含まれていることが判明した検体Ｎｏ．３につき、Penicillium sp検出用プローブ及びCladosporium sp検出用プローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、上記と同様にして、標識検出装置により蛍光強度を測定したところ、これらの菌種（Penicillium sp.，Cladosporium sp.）の検出が確認された。
したがって、本発明のカビの検査方法により、複数種類のカビを同じ培地で同時に培養した場合に、各カビを特異的に検出できることが分かった。
【００５０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施例では、培地としてＭ４０Ｙなどを用いているがこれらに限定されるものではなく、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の固形培地のその他の固形培地を用いるなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、食品製造現場や臨床現場、文化財の保護環境等におけるカビの検査に好適に利用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類のカビを培養し、
培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて前記複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する
ことを特徴とするカビの検査方法。
【請求項２】
少なくとも好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビからなる群から選択される２種類以上のカビを一の培地で同時に培養し、この培養したカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する
ことを特徴とする請求項１記載のカビの検査方法。
【請求項３】
前記複数種類のカビを、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の固形培地で培養することを特徴とする請求項１又は２記載のカビの検査方法。
【請求項４】
前記複数種類のカビを、２５℃±２℃の温度で培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のカビの検査方法。
【請求項５】
前記培養した複数種類のカビを、カビの細胞壁を物理的に破砕するためのビーズを収容した容器に入れて混合し、一括してゲノムＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のカビの検査方法。
【請求項６】
前記複数種類のカビが、大気中に浮遊もしくは付着したカビ胞子及び菌糸であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のカビの検査方法。
【請求項１】
複数種類のカビを培養し、
培養された複数種類のカビを混合して、一括してゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡチップを用いて前記複数種類のカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する
ことを特徴とするカビの検査方法。
【請求項２】
少なくとも好乾性カビ、耐乾性カビ、及び好湿性カビからなる群から選択される２種類以上のカビを一の培地で同時に培養し、この培養したカビのそれぞれを同時かつ特異的に検出する
ことを特徴とする請求項１記載のカビの検査方法。
【請求項３】
前記複数種類のカビを、水分活性値が１．０未満、０．９０以上で、且つ、糖濃度５％〜５０％の固形培地で培養することを特徴とする請求項１又は２記載のカビの検査方法。
【請求項４】
前記複数種類のカビを、２５℃±２℃の温度で培養することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のカビの検査方法。
【請求項５】
前記培養した複数種類のカビを、カビの細胞壁を物理的に破砕するためのビーズを収容した容器に入れて混合し、一括してゲノムＤＮＡを抽出することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のカビの検査方法。
【請求項６】
前記複数種類のカビが、大気中に浮遊もしくは付着したカビ胞子及び菌糸であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のカビの検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−２００２１３（Ｐ２０１２−２００２１３Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６８３３２（Ｐ２０１１−６８３３２）
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物名 日本防菌防黴学会第３７回年次大会要旨集 発行所 日本防菌防黴学会 発行日 平成２２年９月２７日
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物名 日本防菌防黴学会第３７回年次大会要旨集 発行所 日本防菌防黴学会 発行日 平成２２年９月２７日
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【Ｆターム（参考）】
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