カラム内濃縮が可能な毛細管電気泳動を誘導結合プラズマに接続するためのインターフェース
【課題】 毛細管電気泳動（ＣＥ）と誘導結合プラズマを接続するための新しいインターフェースを提供する。
【解決手段】 インターフェースは、３つの濾斗状チューブで構成されており、それぞれのチューブの尖った方の端が集まってＹ字状を形成し、他方の端が電気泳動毛細管、補助毛細管、およびネブライザーのサンプリングチューブにそれぞれ接続されている。また、電気泳動による分離されたイオンをネブライザーに直接導入する方法は、電気泳動回路を形成する三又分岐を構成する電気泳動毛細管と補助毛細管とを有し、ネブライザーによる吸引またはペリスタチューブによる送液により電解液の流れを実現し、印可電圧により分離されたイオンを含む電解液の一部を直接導入することを特徴とする。
【解決手段】 インターフェースは、３つの濾斗状チューブで構成されており、それぞれのチューブの尖った方の端が集まってＹ字状を形成し、他方の端が電気泳動毛細管、補助毛細管、およびネブライザーのサンプリングチューブにそれぞれ接続されている。また、電気泳動による分離されたイオンをネブライザーに直接導入する方法は、電気泳動回路を形成する三又分岐を構成する電気泳動毛細管と補助毛細管とを有し、ネブライザーによる吸引またはペリスタチューブによる送液により電解液の流れを実現し、印可電圧により分離されたイオンを含む電解液の一部を直接導入することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】毛細管電気泳動（ＣＥ）と誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を接続するための新しいインターフェースに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】金属元素の毒性は、化学種に依存することが多い。従って、金属元素の総量ならびにその化学種の分離および定量が生物および環境試料の分析で益々重要に成りつつある。クロマトグラフィ、原子分光測定法および質量分析法のような各種分析技術がこれらの分野で用いられるが、より良い結果を得るために、更に効率的で感度の良い方法が絶えず探し求められていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】毛細管電気泳動（ＣＥ）は、高価で複雑な装置を必要としない、強力で簡単な方法である。この方法は環境、生物学、臨床を含む広い研究分野のサンプルの分析に用いられている。一般に、極く小量のサンプルしかＣＥに導入できないので、殆どの化学種に対して濃度の点で満足のいく検出限界を得るのは難しい。従って、高感度で高選択性の検出器の開発は、ＣＥが実用になった後の、非常に重要かつ、やり甲斐のある仕事である。現在までのところ、オンカラムでＵＶおよび蛍光検出器が広く用いられている。しかしながら、これらの検出器の感度は、普通１０−５から１０−６Ｍの間である。質量分析、レーザー誘導蛍光分析、電流分析、伝導度分析、化学発光およびレーザーラマン法といった、他の幾つかの検出技術が、ＣＥで分離された検体の高感度、高選択性の検出方法を提供するために研究されてきた。
【０００４】誘導結合プラズマ発光測定法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＩＣＰ−ＡＥＳ）および質量分析法（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＳ）は、非常に感度が良く元素選択的検出技術である。これらの技術は、生物試料、環境試料および金属結合蛋白中の微量元素種を定量するために、高速液体クロマトグラフィおよび容積排除クロマトグラフィに接続されている。最近、これらの技術はＣＥと接続され、非常に有用な検出器であることが分かった。ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳ／ＭＳを使って仕事をする時の課題は、ＣＥとＩＣＰを結合する効率的なインターフェースを設計することである。従来型の同軸型ニューマティックネブライザー（ＣＰＣＮ）および直接注入ネブライザー（ＤＩＮ）に結合できるインターフェースが開発されたが、これらインターフェースは、どれも余りにも複雑で、他種のネブライザーに必ずしも接続して使用出来るわけではない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、非常に簡単で殆どあらゆる種類のネブライザーに接続して使えるインターフェースを提供するものであり、３つの濾斗状チューブで構成されており、それぞれのチューブの尖った方の端が集まってＹ字状を形成し、他方の端が電気泳動毛細管、補助毛細管、およびネブライザーのサンプリングチューブにそれぞれ接続されていることを特徴とする。このインターフェースは、ネブライザーの外部に独立しており、ネブライザーのサンプリングチューブに直接結合させることができるものであり、サンプルはＣＥで分離され、次いでネブライザー中の高速アルゴンガス気流による自己吸引によりネブライザーに吸入される。このインターフェースは、ＣＰＣＮおよびマイクロコンセントリックネブライザー（ＭＣＮ）にうまく接続でき、満足できる感度および効率的分離が得られる。かくして、本発明はまた、電気泳動回路を形成する三又分岐を構成する電気泳動毛細管と補助毛細管とを有し、ネブライザーによる吸引またはペリスタチューブによる送液により電解液の流れを実現し、印可電圧により分離されたイオンを含む電解液の一部を直接導入することを特徴とする、電気泳動による分離されたイオンをネブライザーに直接導入する方法を提供するものである。
【０００６】ＣＥでは、検出感度を改善するために各種のオンカラム濃縮技術が用いられる。そうした技術の１つは、大量の低濃度のサンプルプラグを電気泳動毛細管に導入し、高電圧を印加してサンプルプラグの端に検体サンプルを濃縮することである。本発明では、この技術も利用され、感度の改善がもたらされた。大量のサンプルが毛細管に導入され、長いサンプルプラグが形成され、そこでは低濃度のために低伝導度となるので、良好な感度および効率的な分離度を得るために内径の大きな毛細管を用いることができる。また、大きなサンプルプラグでは０．０５ＭのＨＮＯ３溶液を電気泳動電解質として用いることができる。
【０００７】
【実施例】試薬および物質． 酢酸ナトリウム３水和物（純度９９．０％、和光純薬工業）および硝酸（ＥＬ、比重１．３８、関東化学）を電解質として用いた。Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７（純度９９．５％、和光純薬工業）、ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（純度９９．５％、和光純薬工業）、ＦｅＣｌ２（純度９７．０％、和光純薬工業）、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（純度９９．９％、和光純薬工業）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（純度９９．５％、純正化学）およびエチレンジアミン四酢酸２水素２ナトリウム（純度９９．５％、純正化学）を分析種として用いた。全ての溶液は、物質の適量を脱イオン水に溶解して製した。
【０００８】毛細管電気泳動． 外径が３７５μｍで、内径がそれぞれ１００μｍ（長さ１２０ｃｍ）と内径１５０μｍ（長さ１６０ｃｍ）の２種類の溶融シリカ毛細管（ＧＬサイエンスジャパン）を電気泳動毛細管として、また、長さが４０ｃｍ、内径が１５０μｍの毛細管を補助毛細管として用いた。高圧直流電源は、松定プレシジョン（株）製で、３０ｋＶまでの電圧及び２００μＡ電流を供給できる。外径０．１ｍｍの白金線を電極として用いた。
【０００９】ネブライザー． ２種の市販ネブライザーをテストした。ＣＰＣＮ（グラスエクスパンジョンプロプリエータリリミテッド、オーストラリア）およびＭＣＮ（ＣＥＴＡＣテクノロジー、オマハ、ネブラスカ、ＵＳＡ）である。インターフェースは、ネブライザーのサンプリングチューブに直接接続した。ネブライザー毎にキャリヤーガスの流速を種々変えて最適の感度および分解能を得るようにした。
【００１０】誘導結合プラズマ発光分光器． アナリティカルリサーチラボラトリーズ（ＡＲＬ）のＭＡＸＩＭＩＩＩ光学発光分光測定器（ＦＩＳＳＯＮ製）を用いた。標準トーチＭＡＸＩＭ ＩＣＰを、製造業者の推奨通りに、中間のガス流速０．８ｌ／分、外側ガス流速１３ｌ／分で使用した。電力は１．１ｋＷであった。
【００１１】スプレイチャンバー． ２種類のスプレイチャンバーをＭＣＮおよびＣＰＣＮに接続してテストした。ＭＣＮの場合には、内部にインパクトビーズのない、円錐形で自作したスプレイチャンバーを用いた。ＣＰＣＮの場合には、インパクトビーズのある正規のＭＡＸＩＭタイプのスプレイチャンバー及び、ＭＣＮで使用したのと同じスプレイチャンバーを試験した。
【００１２】インターフェース． 図１は、ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳ用インターフェースであり、このインターフェース１は、石英製であり、その第１の腕９は、電気泳動毛細管２の出口に接続し、第２の腕１０は、補給電解質溶液を吸い上げる補助毛細管３に接続されている。この補助毛細管のもう一方の端は、補給電解質として用いられている０．０５ＭのＨＮＯ３溶液中に浸されている。インターフェースの第３の腕１１は、適当なチューブ例えばペリスタルチックポンプ用チューブによってネブライザー８のサンプリングチューブ６に直結している。図中１２は、左右のチューブを結合するコネクターである。毛細管は直接インターフェースの各腕に挿入出来るので何ら前処理を必要としない。キャリヤーガスのバルブを開くと、ネブライザー内の高速アルゴンガス気流によって生じる圧力差によって、補給電解質溶液と電解質溶液またはサンプル溶液が、電気泳動毛細管および補助毛細管に吸い上げられる。２種類の溶液は、２つの腕の接合部で混合し、次いで、ネブライザーの中に吸引される。補給電解質溶液は、直流電源のアース側に接続しており、緩衝電解質溶液は、直流電源の陰極に接続している。負の高電圧によって電解質に自己吸引の流れに反対方向の電気浸透圧による流れを起こさせ、かくしてサンプルは、正の分極電圧を印加した時に比べて長時間毛細管の中に留まることになる。
【００１３】サンプル注入． サンプルは、キャリヤーガスの流れによって生じる自己吸引によって直接毛細管に導入される。サンプリングの前および後には、空気を電気泳動毛細管の中に自己吸引して導入することのないように、補助毛細管は、インターフェースから外しておくか、またはキャリヤーガスのバルブを閉じて自己吸引作用がなくなるようにしておかなければならない。サンプルの容積は、２つの方法で測定できる。１つは、サンプリング時間の測定によるものであり、もう１つは、サンプリングの前後に蒸留水の重量を測定するものである。これら２つの方法を用いて測定したサンプリング容積は、それぞれ０．００３１４ｍｌ／分および０．００３２８ｍｌ／分と計算された。これらの測定は、内径１５０μｍ（長さ１６０ｃｍ）の毛細管を電気泳動毛細管として用い、ＭＣＮを０．２５ｌ／分のキャリヤーガス流量で操作して行なった。こうした条件下では、補給溶液の流速は、０．０１３６ｍｌ／分と計算され、この値は、サンプル流速の４倍以上である。このことは、サンプルが補給溶液で４倍以上に希釈されることを意味する。
【００１４】ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳのインターフェースの特徴． ここに記載されているＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳのインターフェースの場合、支持電解質溶液は、２つの目的を果たしている。第１に、支持電解質溶液は、完全な電気泳動回路が出来上がるように電気泳動毛細管の出口（アース側）のところでの連続的かつ安定な電気的接触を保つために用いられる。第２に、支持電解質溶液は、ネブライザーに吸引される混合溶液のｐＨ値の調整に使うことができる。一般に、高ｐＨ緩衝溶液が電解質溶液として用いられることは、しばしばある。しかし、アルカリ性のｐＨ環境では、殆どの金属イオンは、水酸化物として存在し、それらは、ネブライザーの毛細管壁に容易に吸着されるか、濃度が高過ぎれば沈殿する。このことは、特にＭＣＮを用いた場合には、ネブライザーを詰まらせることになりかねない。もし、０．０４Ｍの酢酸ナトリウムを支持液および電解質溶液とし、そして、Ｃｒ２Ｏ７２−およびＣｒ３＋（Ｃｒ３＋の一部はＣｒ（ＯＨ）３の形で存在しているであろう。）をこのシステムで分析すれば、サンプリング２回ないし３回毎にＭＣＮを０．０５ＭのＨＮＯ３で３分間ほど洗浄しなければならない。もし、０．０４Ｍの酢酸ナトリウムの替わりに０．０５ＭのＨＮＯ３を支持溶液として用いれば、詰まりが起きることは殆どない。補助毛細管の内径は、支持溶液の吸い上げ容積、電気泳動電流、および、電気泳動毛細管と補助毛細管との間の電圧分布に影響する。補助毛細管の内径が大きければ、支持液の吸い上げ容積が増し、目的化学種の希釈度が大きくなる。反対に、補助毛細管の内径が小さければ、希釈度を下げられる。しかし、このことは、インターフェースとネブライザーとの間の液体流速を下げ、それによってピークの幅を広げることになる。従って、この実験では、妥協が必要であり、内径１５０μｍの毛細管が補助毛細管として用いられた。電気泳動電流は、支持液の濃度を変更することによって調整することもでき、従って、電気泳動毛細管と補助毛細管との間の電圧分布も同様に調整することができる。
【００１５】ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳのインターフェースの評価． このインターフェースおよびこのシステムを評価するために若干の予備テストが行なわれた。図２および図３は、それぞれＣｒ２Ｏ７２−およびＣｒ３＋を含むテスト溶液についてＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法およびＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法によって得られた電気泳動図である。このうち図２は、全濃度：１００μｇ／ｍｌ、化学種：Ｃｒ３＋およびＣｒ２Ｏ７２−（１：１）、緩衝電解質溶液：０．０４Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ ７．２）、高電圧：１５ｋＶ、毛細管の内径：１００μｍ、サンプルプラグの長さ：電気泳動毛細管の２５％の場合、図３は、全濃度：１μｇ／ｍｌ、化学種：Ｃｒ３＋とＣｒ２Ｏ７２−（１：１）、緩衝電解質溶液：０．０５ＭのＨＮＯ３、高電圧：８ｋＶ、毛細管の内径：１５０μｍ、サンプルプラグの長さ：電気泳動毛細管の３０％の場合である。どちらの実験においても自作したスプレーチャンバーが用いられた。どちらの場合でも、Ｃｒ２Ｏ７２−およびＣｒ３＋の完全分離が観測された。これらの結果は、このインターフェースがＣＰＣＮにもＭＣＮにも適しており、ＣＥとＩＣＰ−ＡＥＳを接続するのに間違いなく利用できることを明確に示すものである。
【００１６】ＭＣＮはＣＰＣＮよりもずっと高いネブライザー効率を持っているので、ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法の感度は、ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳの感度よりも遥かに大きい。キャリヤーガス気流によって起きる電気泳動毛細管中の流速が、この２つのシステム間に分解能の差を生じるのである。この流速がＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法におけるよりも遥かに遅いＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法では、８ｋＶで約１２分で完全な分離が得られる。しかし、ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法では、約４分間１５ｋＶでやっとベースライン分離が得られるに過ぎない。２つのピークの高さもこの流速に関連している。流速が低下すると、分離が良くなり、Ｃｒ３＋のピーク高は減少するがＣｒ２Ｏ７２−のピーク高は殆ど変化しない。これは、高電荷カチオン（Ｃｒ３＋）が毛細管壁に捕捉され易く、流速が遅いと、速い時に比べてサンプルが電気泳動毛細管中に長い時間留まることになるからである。このことが、高電荷カチオンの毛細管壁への吸着を増強することになる。電気泳動電圧として陽電圧を用いると、Ｃｒ３＋がＣｒ２Ｏ７２−よりも早く毛細管から溶出する。陰電圧の時よりも陽電圧の時の方がＣｒ３＋が毛細管中に留まる時間が短いので、Ｃｒ３＋のシグナル強度は、陰電圧で得られるシグナル強度よりも強い。ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法については、正規のＭＡＸＩＭタイプのインパクトビーズ付のスプレーチャンバーもテストした。その感度は、現場合わせのインパクトビーズなしのスプレーチャンバーでの感度の少なくとも１／１０以下であった。この装置を日常業務の目的で使う場合は、サンプルを２ｍｌ／分の割合でネブライザーに導入する。正規のＭＡＸＩＭタイプのスプレーチャンバーは、大きな液滴がプラズマ中に入るのを防止し、ＩＣＰのエアロゾル溶媒による過負荷を防止できる。しかし、このシステムでは、極小量のサンプルしかネブライザーに導入されず、したがって、プラズマの溶媒過負荷を心配する必要はない。
【００１７】カラム上濃縮と分離． ＣＥ法では、サンプリング容積は、分離および感度に影響する非常に重要な因子である。一般に、サンプリング容積は、電気泳動毛細管の全長の１０％以下である。本発明は、カラム上濃縮技術を用いており、普通よりも多量のサンプルが毛細管に導入された。図４および図５は、サンプリング容量を変化した時の銅の電気泳動図である。このうち、図４R>４は、全濃度：１０μｇ／７ｍｌ、化学種：Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−（１：１）、緩衝電解質溶液：０．０５ＭのＨＮＯ３、高電圧：８ｋＶ、毛細管の内径：１５０μｍ、 サンプルプラグの長さ：電気泳動毛細管の５％の場合、図５は、サンプルプラグの長さが電気泳動毛細管の全長の３０％で、その他の条件は図４での条件と同じの場合のものである。Ｃｕ２＋およびＣｕ（ＥＤＴＡ）２−についての図４と図５を比較すると、注入容積の増加が、ピーク幅に顕著な悪影響を及ぼすことなく、ピーク高および分解能をいずれも増加することが明らかである。
【００１８】カラム上濃縮操作を以下に説明する。緩衝電解質溶液中よりもサンプルプラグ中にずっと高い電場勾配が生じる。その理由は、サンプルプラグ中の荷電粒子の濃度が、緩衝電解質溶液中よりもずっと低いからである。この（高い電場勾配）ため、サンプルプラグ中の荷電粒子は緩衝電解質溶液中の荷電粒子よりもずっと高速で動く。しかしながら、荷電粒子が緩衝電解質溶液に到達すれば、その領域にはより低い電場勾配しか存在しないので、移動速度は低下する。このことが、サンプル溶液と緩衝電解質溶液との境界に大量の荷電粒子の集積を齎らす。Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−の運動方向は反対であるから、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−とは、サンプルプラグの別々の端に集積する。かくして、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−の分離が達成される。相対的に長いサンプルプラグが、ずっと良い分離度及びより多くの荷電粒子のサンプル溶液・緩衝電解質溶液境界での集積を引き起こすことになる。Ｃｒ３＋およびＣｒ２Ｏ７２−の分離についも全く同じ事が言える。
【００１９】図６、図７および図８は、それぞれ、注入容積とピーク高、注入容積とピーク幅および注入容積と分解能の関係を示している。Ｃｕ２＋は、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−よりも長時間毛細管の中に留まるので、Ｃｕ２＋は、より長い時間電気泳動作用を受けて毛細管中に濃縮される。従って、Ｃｕ２＋のピーク幅は殆ど変化しないが、ピーク高は、注入容積が毛細管の全長の５％から４０％まで増加する時、連続的に増加する。それとは対照的に、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク幅は、注入容積が毛細管の全長の３０％を超えると劇的に増加する。しかしながら、３０％および４０％注入容積でのピーク面積は、２０％注入容積でのピーク面積よりも大きいけれども、３０％および４０％注入容積でのピーク高は、２０％注入容積でのピーク高よりも低い。検体の毛細管内滞留時間の延長を齎らすキャリヤーガスの流速低下及び／または電気泳動電圧の増加は、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク幅を幾分縮小すると期待される。しかしながら、キャリヤーガスの低流速はまた、ピーク幅を拡張させることもあり、また、高電圧は、陽イオンの毛細管壁への吸着を誘発し、シグナル強度を減少させる。
【００２０】カラム上濃縮法では、比較的長いサンプルプラグが、低濃度用の反対極性を持った２種の荷電粒子を分離するのに適していると考えられた。何故ならば、これらの荷電粒子は、高電圧が印加されるとサンプルプラグの両端へと移動するからである。高電圧を印加した時に同じ方向に移動するＦｅ３＋およびＦｅ２＋の分離に対する注入容積の影響も研究した。若干の興味ある現象が観測された。比較的短いサンプルプラグ（電気泳動毛細管の全長の５％から２５％）が毛細管に挿入された場合には、２つのピークが得られる。図９は、２５％のサンプルプラグの場合の電気泳動図であり、図１０は、３８％のサンプルプラグの場合の電気泳動図である。後者の場合には、図１０に示されているとおり、３つのピークが現われた。第２おび第３のピークはＦｅ２＋とＦｅ３＋であると推定されている。これらのピークを同定し、この現象を説明するために更に研究が続けられている。
【００２１】電気泳動毛細管の内径と電解質． 電気泳動毛細管の内径もまた、分離効率および感度に影響する。一方では、内径の大きな毛細管は、大量のサンプルを導入出来る利点があり、したがって、より低い検出限界が期待できるが、他方、このことは、電気泳動電流の増加を招き、低分解能をきたす恐れがある。２種類の毛細管をテストした。１つは内径１００μｍの毛細管、もう１つは内径１５０μｍの毛細管である。サンプル溶液の濃度が低く、比較的長いサンプルプラグが毛細管に挿入された時は、電気泳動電流は、低伝導度のサンプルプラグによって決まる。従って、効率的な分離は、このシステムでは内径１５０μｍの毛細管で得られた。全濃度が１０μｇ／ｍｌの銅またはクロムを含む溶液の場合、Ｃｒ２Ｏ７２−からのＣｒ３＋の分離またはＣｕ（ＥＤＴＡ）２−からのＣｕ２＋の分離は、電気泳動電解質として０．０５ＭＣのＨＮＯ３または０．０４Ｍの酢酸ナトリウムの何れを使用しても、サンプルプラグの長さが毛細管の全長の１％よりも短い時は、内径１５０μｍの毛細管では不可能であった。サンプル溶液の全濃度が１００μｇ／ｍｌに増大し、サンプルプラグの長さが毛細管の全長の５％になった場合でもなお、内径１５０μｍの毛細管で分離することは難しかった。内径１００μｍの毛細管では、同一条件で同じような結果を得るには、ずっと短いサンプルプラグ及びずっと高い濃度が必要であった。
【００２２】２種類の電気泳動電解質、すなわち０．０４Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．０５ＭのＨＮＯ３をテストした。０．０４Ｍの酢酸ナトリウム溶液の伝導度は０．０５ＭのＨＮＯ３の伝導度よりも遥かに低いので、０．０４Ｍの酢酸ナトリウムに対する電気泳動電流は、０．０５ＭのＨＮＯ３に対する電気泳動電流よりも低い。クロムまたは銅の全濃度が１０μｇ／ｍｌで、サンプルプラグの長さが毛細管の全長の５％というような、低濃度サンプルで比較的長いサンプルプラグの場合には、内径１５０μｍまたは内径１００μｍのいずれの毛細管を用いても、Ｃｒ２Ｏ７２−からＣｒ３＋を、またＣｕ（ＥＤＴＡ）２−からＣｕ２＋を分離する電気泳動電解質として０．０５ＭのＨＮＯ３を使用することができる。しかし、サンプル溶液の全濃度が１００μｇ／ｍｌの時は、同一条件のもとで効率的な分離を得ることは不可能であった。この場合には、内径１００μｍの毛細管と０．０４Ｍの酢酸ナトリウムが効率的な分離を達成するのに有効であることが分かった。従って、電気泳動毛細管の内径および電気泳動電解質の選択は、サンプル溶液の濃度およびサンプルプラグの長さを考慮に入れなければならないということが結論できる。インターフェースをＭＣＮと接続した場合には、高電解質濃度の緩衝溶液によって惹起されるＭＣＮの機能停止（目詰まり）を回避することができるので、０．０５ＭのＨＮＯ３を電気泳動電解質として用いることが望ましい。
【００２３】ピーク高およびピーク幅に及ぼす電気泳動電圧の影響． 電気泳動電圧が陽イオンのピーク高およびピーク幅に与える影響は、陰イオンに与える影響とは異なっており、図１１および図１２に示す通りである。２０％サンプルプラグが毛細管に挿入された時には、陽イオンのピーク高はカラム上濃度（濃縮）および陽イオンの毛細管壁への吸着の両方の影響を受ける。Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−のシグナル強度は、電圧を印加しない時は等しい。しかし、高電圧を印加した場合には、Ｃｕ２＋のピーク高は４ｋＶまでは電気泳動電圧に比例して増加し、ついで、電気泳動電圧が大きくなると共に減少する。Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク高は、６ｋＶまで増加し続け、それ以後は、ピークの高さおよび幅は、電気泳動電圧が増大しても殆ど変化を示さない。図１２に示されているように、Ｃｕ２＋は，Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−よりも長時間毛細管の中に留まることができるので、濃縮しかつ良好なピーク形を得るためには、４ｋＶで充分であるが、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−に対しては６ｋＶが必要である。高電圧は、陽イオンと陰イオンに異なった影響を持っているので、異なる化学種のピーク高またはピーク面積の比は、化学種の比（量比）と同じではない。従って、正確な結果を得るには、較正を行なわねばならない。図１３は、０．５μｇ／ｍｌのＣｕ２＋およびＣｕ（ＥＤＴＡ）２−の電気泳動図を示している。Ｃｕ２＋のピーク高はＣｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク高よりもずっと低いことが分かる。
【００２４】検出限界． 或る元素の検出限界は、ここでは、検体波長におけるバックグラウンド強度の標準偏差の３倍（３σ）に等しい実質シグナルを生じる濃度として定義された。１８種の元素の検出限界が、電圧無印加、サンプルはプラズマに連続導入で、ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳシステムおよび従来型の自己吸引ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳを用いて得られている。それらの値が表１に纏められている。
【００２５】
【表１】
【００２６】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰでは、内径１５０μｍの毛細管が、電気泳動毛細管および補助毛細管のどちらにも使用された。ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳシステムでは、従来型のＩＣＰ−ＡＥＳにおけるよりも、ずっと小容積のサンプルがプラズマに導入されるので、ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳで得られる検出限界は、ＩＣＰ−ＡＥＳでの検出限界の１−４倍高い（大きい）。ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳ分析では、シグナル強度は、カラム上濃縮技術を利用することによって数倍改善でき、従って高電圧無印加で得られる値よりも低い検出限界が、この技術によって期待できる。
【００２７】上記の結果は、本発明のインターフェースが、毛細管電気泳動をＩＣＰ−ＡＥＳに接続するのに有効であることを示している。このインターフェースは、容易且つ直接に、従来型の同軸型ニューマティックネブライザーおよびマイクロコンセントリックネブライザーに接続することができる。このＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳシステムによって、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｃｒ３＋とＣｒ２Ｏ７２−およびＦｅ３＋とＦｅ２＋をそれぞれ含むサンプルについて、効率的な分離ならびに十分な感度が得られた。カラム上濃縮技術によって、ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳの感度および分離効率を改善することができる。この実験では、内径１５０μｍの毛細管しか使用しなかったけれども、もっとサイズの大きな毛細管を利用すれば効率的な分離とより高い感度を得ることが可能と思われる。さらに、カラム上濃縮技術を利用すれば、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｃｒ３＋とＣｒ２Ｏ７２−、およびＦｅ３＋とＦｅ２＋を分離する電解質として０．０５ＭのＨＮＯ３（ｐＨ約１．３）が利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】毛細管電気泳動を誘導結合プラズマ分光測定法に接続するためのインターフェースの略図。
【図２】ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られたクロムの電気泳動図。
【図３】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られたクロムの電気泳動図。
【図４】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた銅の電気泳動図。
【図５】サンプルプラグの長さが電気泳動毛細管の全長の３０％の時の、ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた銅の電気泳動図。
【図６】注入容積がピーク高に及ぼす影響を示す。
【図７】注入容積がＣｕ２＋およびＣｕ（ＥＤＴＡ）２−のピークの半値幅（ｆｕｌｌｗｉｄｔｈ ａｔ ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｈｅｉｇｈｔ（ＦＷＨＭ））に及ぼす影響を示す。
【図８】注入容積が分解能に及ぼす影響を示す。
【図９】ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた鉄の電気泳動図。
【図１０】サンプルプラグの長さが電気泳動毛細管の全長の３８％の時のＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた鉄の電気泳動図。
【図１１】電圧がピーク高に及ぼす影響。
【図１２】電圧が半値幅（ＦＷＨＭ）に及ぼす影響。
【図１３】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた銅の電気泳動図。
【符号の説明】
１ インターフェース
２ 電気泳動毛細管
３ 補助毛細管
４ 補給電解質
５ 緩衝電解質
６ ネブライザーのサンプリングチューブ
７ 直流電源
８ ネブライザー
９ 第１の腕
１０ 第２の腕
１１ 第３の腕
１２ コネクター
【０００１】
【産業上の利用分野】毛細管電気泳動（ＣＥ）と誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を接続するための新しいインターフェースに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】金属元素の毒性は、化学種に依存することが多い。従って、金属元素の総量ならびにその化学種の分離および定量が生物および環境試料の分析で益々重要に成りつつある。クロマトグラフィ、原子分光測定法および質量分析法のような各種分析技術がこれらの分野で用いられるが、より良い結果を得るために、更に効率的で感度の良い方法が絶えず探し求められていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】毛細管電気泳動（ＣＥ）は、高価で複雑な装置を必要としない、強力で簡単な方法である。この方法は環境、生物学、臨床を含む広い研究分野のサンプルの分析に用いられている。一般に、極く小量のサンプルしかＣＥに導入できないので、殆どの化学種に対して濃度の点で満足のいく検出限界を得るのは難しい。従って、高感度で高選択性の検出器の開発は、ＣＥが実用になった後の、非常に重要かつ、やり甲斐のある仕事である。現在までのところ、オンカラムでＵＶおよび蛍光検出器が広く用いられている。しかしながら、これらの検出器の感度は、普通１０−５から１０−６Ｍの間である。質量分析、レーザー誘導蛍光分析、電流分析、伝導度分析、化学発光およびレーザーラマン法といった、他の幾つかの検出技術が、ＣＥで分離された検体の高感度、高選択性の検出方法を提供するために研究されてきた。
【０００４】誘導結合プラズマ発光測定法（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ａｔｏｍｉｃ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＩＣＰ−ＡＥＳ）および質量分析法（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＳ）は、非常に感度が良く元素選択的検出技術である。これらの技術は、生物試料、環境試料および金属結合蛋白中の微量元素種を定量するために、高速液体クロマトグラフィおよび容積排除クロマトグラフィに接続されている。最近、これらの技術はＣＥと接続され、非常に有用な検出器であることが分かった。ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳ／ＭＳを使って仕事をする時の課題は、ＣＥとＩＣＰを結合する効率的なインターフェースを設計することである。従来型の同軸型ニューマティックネブライザー（ＣＰＣＮ）および直接注入ネブライザー（ＤＩＮ）に結合できるインターフェースが開発されたが、これらインターフェースは、どれも余りにも複雑で、他種のネブライザーに必ずしも接続して使用出来るわけではない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、非常に簡単で殆どあらゆる種類のネブライザーに接続して使えるインターフェースを提供するものであり、３つの濾斗状チューブで構成されており、それぞれのチューブの尖った方の端が集まってＹ字状を形成し、他方の端が電気泳動毛細管、補助毛細管、およびネブライザーのサンプリングチューブにそれぞれ接続されていることを特徴とする。このインターフェースは、ネブライザーの外部に独立しており、ネブライザーのサンプリングチューブに直接結合させることができるものであり、サンプルはＣＥで分離され、次いでネブライザー中の高速アルゴンガス気流による自己吸引によりネブライザーに吸入される。このインターフェースは、ＣＰＣＮおよびマイクロコンセントリックネブライザー（ＭＣＮ）にうまく接続でき、満足できる感度および効率的分離が得られる。かくして、本発明はまた、電気泳動回路を形成する三又分岐を構成する電気泳動毛細管と補助毛細管とを有し、ネブライザーによる吸引またはペリスタチューブによる送液により電解液の流れを実現し、印可電圧により分離されたイオンを含む電解液の一部を直接導入することを特徴とする、電気泳動による分離されたイオンをネブライザーに直接導入する方法を提供するものである。
【０００６】ＣＥでは、検出感度を改善するために各種のオンカラム濃縮技術が用いられる。そうした技術の１つは、大量の低濃度のサンプルプラグを電気泳動毛細管に導入し、高電圧を印加してサンプルプラグの端に検体サンプルを濃縮することである。本発明では、この技術も利用され、感度の改善がもたらされた。大量のサンプルが毛細管に導入され、長いサンプルプラグが形成され、そこでは低濃度のために低伝導度となるので、良好な感度および効率的な分離度を得るために内径の大きな毛細管を用いることができる。また、大きなサンプルプラグでは０．０５ＭのＨＮＯ３溶液を電気泳動電解質として用いることができる。
【０００７】
【実施例】試薬および物質． 酢酸ナトリウム３水和物（純度９９．０％、和光純薬工業）および硝酸（ＥＬ、比重１．３８、関東化学）を電解質として用いた。Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７（純度９９．５％、和光純薬工業）、ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（純度９９．５％、和光純薬工業）、ＦｅＣｌ２（純度９７．０％、和光純薬工業）、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（純度９９．９％、和光純薬工業）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（純度９９．５％、純正化学）およびエチレンジアミン四酢酸２水素２ナトリウム（純度９９．５％、純正化学）を分析種として用いた。全ての溶液は、物質の適量を脱イオン水に溶解して製した。
【０００８】毛細管電気泳動． 外径が３７５μｍで、内径がそれぞれ１００μｍ（長さ１２０ｃｍ）と内径１５０μｍ（長さ１６０ｃｍ）の２種類の溶融シリカ毛細管（ＧＬサイエンスジャパン）を電気泳動毛細管として、また、長さが４０ｃｍ、内径が１５０μｍの毛細管を補助毛細管として用いた。高圧直流電源は、松定プレシジョン（株）製で、３０ｋＶまでの電圧及び２００μＡ電流を供給できる。外径０．１ｍｍの白金線を電極として用いた。
【０００９】ネブライザー． ２種の市販ネブライザーをテストした。ＣＰＣＮ（グラスエクスパンジョンプロプリエータリリミテッド、オーストラリア）およびＭＣＮ（ＣＥＴＡＣテクノロジー、オマハ、ネブラスカ、ＵＳＡ）である。インターフェースは、ネブライザーのサンプリングチューブに直接接続した。ネブライザー毎にキャリヤーガスの流速を種々変えて最適の感度および分解能を得るようにした。
【００１０】誘導結合プラズマ発光分光器． アナリティカルリサーチラボラトリーズ（ＡＲＬ）のＭＡＸＩＭＩＩＩ光学発光分光測定器（ＦＩＳＳＯＮ製）を用いた。標準トーチＭＡＸＩＭ ＩＣＰを、製造業者の推奨通りに、中間のガス流速０．８ｌ／分、外側ガス流速１３ｌ／分で使用した。電力は１．１ｋＷであった。
【００１１】スプレイチャンバー． ２種類のスプレイチャンバーをＭＣＮおよびＣＰＣＮに接続してテストした。ＭＣＮの場合には、内部にインパクトビーズのない、円錐形で自作したスプレイチャンバーを用いた。ＣＰＣＮの場合には、インパクトビーズのある正規のＭＡＸＩＭタイプのスプレイチャンバー及び、ＭＣＮで使用したのと同じスプレイチャンバーを試験した。
【００１２】インターフェース． 図１は、ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳ用インターフェースであり、このインターフェース１は、石英製であり、その第１の腕９は、電気泳動毛細管２の出口に接続し、第２の腕１０は、補給電解質溶液を吸い上げる補助毛細管３に接続されている。この補助毛細管のもう一方の端は、補給電解質として用いられている０．０５ＭのＨＮＯ３溶液中に浸されている。インターフェースの第３の腕１１は、適当なチューブ例えばペリスタルチックポンプ用チューブによってネブライザー８のサンプリングチューブ６に直結している。図中１２は、左右のチューブを結合するコネクターである。毛細管は直接インターフェースの各腕に挿入出来るので何ら前処理を必要としない。キャリヤーガスのバルブを開くと、ネブライザー内の高速アルゴンガス気流によって生じる圧力差によって、補給電解質溶液と電解質溶液またはサンプル溶液が、電気泳動毛細管および補助毛細管に吸い上げられる。２種類の溶液は、２つの腕の接合部で混合し、次いで、ネブライザーの中に吸引される。補給電解質溶液は、直流電源のアース側に接続しており、緩衝電解質溶液は、直流電源の陰極に接続している。負の高電圧によって電解質に自己吸引の流れに反対方向の電気浸透圧による流れを起こさせ、かくしてサンプルは、正の分極電圧を印加した時に比べて長時間毛細管の中に留まることになる。
【００１３】サンプル注入． サンプルは、キャリヤーガスの流れによって生じる自己吸引によって直接毛細管に導入される。サンプリングの前および後には、空気を電気泳動毛細管の中に自己吸引して導入することのないように、補助毛細管は、インターフェースから外しておくか、またはキャリヤーガスのバルブを閉じて自己吸引作用がなくなるようにしておかなければならない。サンプルの容積は、２つの方法で測定できる。１つは、サンプリング時間の測定によるものであり、もう１つは、サンプリングの前後に蒸留水の重量を測定するものである。これら２つの方法を用いて測定したサンプリング容積は、それぞれ０．００３１４ｍｌ／分および０．００３２８ｍｌ／分と計算された。これらの測定は、内径１５０μｍ（長さ１６０ｃｍ）の毛細管を電気泳動毛細管として用い、ＭＣＮを０．２５ｌ／分のキャリヤーガス流量で操作して行なった。こうした条件下では、補給溶液の流速は、０．０１３６ｍｌ／分と計算され、この値は、サンプル流速の４倍以上である。このことは、サンプルが補給溶液で４倍以上に希釈されることを意味する。
【００１４】ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳのインターフェースの特徴． ここに記載されているＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳのインターフェースの場合、支持電解質溶液は、２つの目的を果たしている。第１に、支持電解質溶液は、完全な電気泳動回路が出来上がるように電気泳動毛細管の出口（アース側）のところでの連続的かつ安定な電気的接触を保つために用いられる。第２に、支持電解質溶液は、ネブライザーに吸引される混合溶液のｐＨ値の調整に使うことができる。一般に、高ｐＨ緩衝溶液が電解質溶液として用いられることは、しばしばある。しかし、アルカリ性のｐＨ環境では、殆どの金属イオンは、水酸化物として存在し、それらは、ネブライザーの毛細管壁に容易に吸着されるか、濃度が高過ぎれば沈殿する。このことは、特にＭＣＮを用いた場合には、ネブライザーを詰まらせることになりかねない。もし、０．０４Ｍの酢酸ナトリウムを支持液および電解質溶液とし、そして、Ｃｒ２Ｏ７２−およびＣｒ３＋（Ｃｒ３＋の一部はＣｒ（ＯＨ）３の形で存在しているであろう。）をこのシステムで分析すれば、サンプリング２回ないし３回毎にＭＣＮを０．０５ＭのＨＮＯ３で３分間ほど洗浄しなければならない。もし、０．０４Ｍの酢酸ナトリウムの替わりに０．０５ＭのＨＮＯ３を支持溶液として用いれば、詰まりが起きることは殆どない。補助毛細管の内径は、支持溶液の吸い上げ容積、電気泳動電流、および、電気泳動毛細管と補助毛細管との間の電圧分布に影響する。補助毛細管の内径が大きければ、支持液の吸い上げ容積が増し、目的化学種の希釈度が大きくなる。反対に、補助毛細管の内径が小さければ、希釈度を下げられる。しかし、このことは、インターフェースとネブライザーとの間の液体流速を下げ、それによってピークの幅を広げることになる。従って、この実験では、妥協が必要であり、内径１５０μｍの毛細管が補助毛細管として用いられた。電気泳動電流は、支持液の濃度を変更することによって調整することもでき、従って、電気泳動毛細管と補助毛細管との間の電圧分布も同様に調整することができる。
【００１５】ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳのインターフェースの評価． このインターフェースおよびこのシステムを評価するために若干の予備テストが行なわれた。図２および図３は、それぞれＣｒ２Ｏ７２−およびＣｒ３＋を含むテスト溶液についてＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法およびＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法によって得られた電気泳動図である。このうち図２は、全濃度：１００μｇ／ｍｌ、化学種：Ｃｒ３＋およびＣｒ２Ｏ７２−（１：１）、緩衝電解質溶液：０．０４Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ ７．２）、高電圧：１５ｋＶ、毛細管の内径：１００μｍ、サンプルプラグの長さ：電気泳動毛細管の２５％の場合、図３は、全濃度：１μｇ／ｍｌ、化学種：Ｃｒ３＋とＣｒ２Ｏ７２−（１：１）、緩衝電解質溶液：０．０５ＭのＨＮＯ３、高電圧：８ｋＶ、毛細管の内径：１５０μｍ、サンプルプラグの長さ：電気泳動毛細管の３０％の場合である。どちらの実験においても自作したスプレーチャンバーが用いられた。どちらの場合でも、Ｃｒ２Ｏ７２−およびＣｒ３＋の完全分離が観測された。これらの結果は、このインターフェースがＣＰＣＮにもＭＣＮにも適しており、ＣＥとＩＣＰ−ＡＥＳを接続するのに間違いなく利用できることを明確に示すものである。
【００１６】ＭＣＮはＣＰＣＮよりもずっと高いネブライザー効率を持っているので、ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法の感度は、ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳの感度よりも遥かに大きい。キャリヤーガス気流によって起きる電気泳動毛細管中の流速が、この２つのシステム間に分解能の差を生じるのである。この流速がＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法におけるよりも遥かに遅いＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法では、８ｋＶで約１２分で完全な分離が得られる。しかし、ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法では、約４分間１５ｋＶでやっとベースライン分離が得られるに過ぎない。２つのピークの高さもこの流速に関連している。流速が低下すると、分離が良くなり、Ｃｒ３＋のピーク高は減少するがＣｒ２Ｏ７２−のピーク高は殆ど変化しない。これは、高電荷カチオン（Ｃｒ３＋）が毛細管壁に捕捉され易く、流速が遅いと、速い時に比べてサンプルが電気泳動毛細管中に長い時間留まることになるからである。このことが、高電荷カチオンの毛細管壁への吸着を増強することになる。電気泳動電圧として陽電圧を用いると、Ｃｒ３＋がＣｒ２Ｏ７２−よりも早く毛細管から溶出する。陰電圧の時よりも陽電圧の時の方がＣｒ３＋が毛細管中に留まる時間が短いので、Ｃｒ３＋のシグナル強度は、陰電圧で得られるシグナル強度よりも強い。ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法については、正規のＭＡＸＩＭタイプのインパクトビーズ付のスプレーチャンバーもテストした。その感度は、現場合わせのインパクトビーズなしのスプレーチャンバーでの感度の少なくとも１／１０以下であった。この装置を日常業務の目的で使う場合は、サンプルを２ｍｌ／分の割合でネブライザーに導入する。正規のＭＡＸＩＭタイプのスプレーチャンバーは、大きな液滴がプラズマ中に入るのを防止し、ＩＣＰのエアロゾル溶媒による過負荷を防止できる。しかし、このシステムでは、極小量のサンプルしかネブライザーに導入されず、したがって、プラズマの溶媒過負荷を心配する必要はない。
【００１７】カラム上濃縮と分離． ＣＥ法では、サンプリング容積は、分離および感度に影響する非常に重要な因子である。一般に、サンプリング容積は、電気泳動毛細管の全長の１０％以下である。本発明は、カラム上濃縮技術を用いており、普通よりも多量のサンプルが毛細管に導入された。図４および図５は、サンプリング容量を変化した時の銅の電気泳動図である。このうち、図４R>４は、全濃度：１０μｇ／７ｍｌ、化学種：Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−（１：１）、緩衝電解質溶液：０．０５ＭのＨＮＯ３、高電圧：８ｋＶ、毛細管の内径：１５０μｍ、 サンプルプラグの長さ：電気泳動毛細管の５％の場合、図５は、サンプルプラグの長さが電気泳動毛細管の全長の３０％で、その他の条件は図４での条件と同じの場合のものである。Ｃｕ２＋およびＣｕ（ＥＤＴＡ）２−についての図４と図５を比較すると、注入容積の増加が、ピーク幅に顕著な悪影響を及ぼすことなく、ピーク高および分解能をいずれも増加することが明らかである。
【００１８】カラム上濃縮操作を以下に説明する。緩衝電解質溶液中よりもサンプルプラグ中にずっと高い電場勾配が生じる。その理由は、サンプルプラグ中の荷電粒子の濃度が、緩衝電解質溶液中よりもずっと低いからである。この（高い電場勾配）ため、サンプルプラグ中の荷電粒子は緩衝電解質溶液中の荷電粒子よりもずっと高速で動く。しかしながら、荷電粒子が緩衝電解質溶液に到達すれば、その領域にはより低い電場勾配しか存在しないので、移動速度は低下する。このことが、サンプル溶液と緩衝電解質溶液との境界に大量の荷電粒子の集積を齎らす。Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−の運動方向は反対であるから、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−とは、サンプルプラグの別々の端に集積する。かくして、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−の分離が達成される。相対的に長いサンプルプラグが、ずっと良い分離度及びより多くの荷電粒子のサンプル溶液・緩衝電解質溶液境界での集積を引き起こすことになる。Ｃｒ３＋およびＣｒ２Ｏ７２−の分離についも全く同じ事が言える。
【００１９】図６、図７および図８は、それぞれ、注入容積とピーク高、注入容積とピーク幅および注入容積と分解能の関係を示している。Ｃｕ２＋は、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−よりも長時間毛細管の中に留まるので、Ｃｕ２＋は、より長い時間電気泳動作用を受けて毛細管中に濃縮される。従って、Ｃｕ２＋のピーク幅は殆ど変化しないが、ピーク高は、注入容積が毛細管の全長の５％から４０％まで増加する時、連続的に増加する。それとは対照的に、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク幅は、注入容積が毛細管の全長の３０％を超えると劇的に増加する。しかしながら、３０％および４０％注入容積でのピーク面積は、２０％注入容積でのピーク面積よりも大きいけれども、３０％および４０％注入容積でのピーク高は、２０％注入容積でのピーク高よりも低い。検体の毛細管内滞留時間の延長を齎らすキャリヤーガスの流速低下及び／または電気泳動電圧の増加は、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク幅を幾分縮小すると期待される。しかしながら、キャリヤーガスの低流速はまた、ピーク幅を拡張させることもあり、また、高電圧は、陽イオンの毛細管壁への吸着を誘発し、シグナル強度を減少させる。
【００２０】カラム上濃縮法では、比較的長いサンプルプラグが、低濃度用の反対極性を持った２種の荷電粒子を分離するのに適していると考えられた。何故ならば、これらの荷電粒子は、高電圧が印加されるとサンプルプラグの両端へと移動するからである。高電圧を印加した時に同じ方向に移動するＦｅ３＋およびＦｅ２＋の分離に対する注入容積の影響も研究した。若干の興味ある現象が観測された。比較的短いサンプルプラグ（電気泳動毛細管の全長の５％から２５％）が毛細管に挿入された場合には、２つのピークが得られる。図９は、２５％のサンプルプラグの場合の電気泳動図であり、図１０は、３８％のサンプルプラグの場合の電気泳動図である。後者の場合には、図１０に示されているとおり、３つのピークが現われた。第２おび第３のピークはＦｅ２＋とＦｅ３＋であると推定されている。これらのピークを同定し、この現象を説明するために更に研究が続けられている。
【００２１】電気泳動毛細管の内径と電解質． 電気泳動毛細管の内径もまた、分離効率および感度に影響する。一方では、内径の大きな毛細管は、大量のサンプルを導入出来る利点があり、したがって、より低い検出限界が期待できるが、他方、このことは、電気泳動電流の増加を招き、低分解能をきたす恐れがある。２種類の毛細管をテストした。１つは内径１００μｍの毛細管、もう１つは内径１５０μｍの毛細管である。サンプル溶液の濃度が低く、比較的長いサンプルプラグが毛細管に挿入された時は、電気泳動電流は、低伝導度のサンプルプラグによって決まる。従って、効率的な分離は、このシステムでは内径１５０μｍの毛細管で得られた。全濃度が１０μｇ／ｍｌの銅またはクロムを含む溶液の場合、Ｃｒ２Ｏ７２−からのＣｒ３＋の分離またはＣｕ（ＥＤＴＡ）２−からのＣｕ２＋の分離は、電気泳動電解質として０．０５ＭＣのＨＮＯ３または０．０４Ｍの酢酸ナトリウムの何れを使用しても、サンプルプラグの長さが毛細管の全長の１％よりも短い時は、内径１５０μｍの毛細管では不可能であった。サンプル溶液の全濃度が１００μｇ／ｍｌに増大し、サンプルプラグの長さが毛細管の全長の５％になった場合でもなお、内径１５０μｍの毛細管で分離することは難しかった。内径１００μｍの毛細管では、同一条件で同じような結果を得るには、ずっと短いサンプルプラグ及びずっと高い濃度が必要であった。
【００２２】２種類の電気泳動電解質、すなわち０．０４Ｍの酢酸ナトリウムおよび０．０５ＭのＨＮＯ３をテストした。０．０４Ｍの酢酸ナトリウム溶液の伝導度は０．０５ＭのＨＮＯ３の伝導度よりも遥かに低いので、０．０４Ｍの酢酸ナトリウムに対する電気泳動電流は、０．０５ＭのＨＮＯ３に対する電気泳動電流よりも低い。クロムまたは銅の全濃度が１０μｇ／ｍｌで、サンプルプラグの長さが毛細管の全長の５％というような、低濃度サンプルで比較的長いサンプルプラグの場合には、内径１５０μｍまたは内径１００μｍのいずれの毛細管を用いても、Ｃｒ２Ｏ７２−からＣｒ３＋を、またＣｕ（ＥＤＴＡ）２−からＣｕ２＋を分離する電気泳動電解質として０．０５ＭのＨＮＯ３を使用することができる。しかし、サンプル溶液の全濃度が１００μｇ／ｍｌの時は、同一条件のもとで効率的な分離を得ることは不可能であった。この場合には、内径１００μｍの毛細管と０．０４Ｍの酢酸ナトリウムが効率的な分離を達成するのに有効であることが分かった。従って、電気泳動毛細管の内径および電気泳動電解質の選択は、サンプル溶液の濃度およびサンプルプラグの長さを考慮に入れなければならないということが結論できる。インターフェースをＭＣＮと接続した場合には、高電解質濃度の緩衝溶液によって惹起されるＭＣＮの機能停止（目詰まり）を回避することができるので、０．０５ＭのＨＮＯ３を電気泳動電解質として用いることが望ましい。
【００２３】ピーク高およびピーク幅に及ぼす電気泳動電圧の影響． 電気泳動電圧が陽イオンのピーク高およびピーク幅に与える影響は、陰イオンに与える影響とは異なっており、図１１および図１２に示す通りである。２０％サンプルプラグが毛細管に挿入された時には、陽イオンのピーク高はカラム上濃度（濃縮）および陽イオンの毛細管壁への吸着の両方の影響を受ける。Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−のシグナル強度は、電圧を印加しない時は等しい。しかし、高電圧を印加した場合には、Ｃｕ２＋のピーク高は４ｋＶまでは電気泳動電圧に比例して増加し、ついで、電気泳動電圧が大きくなると共に減少する。Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク高は、６ｋＶまで増加し続け、それ以後は、ピークの高さおよび幅は、電気泳動電圧が増大しても殆ど変化を示さない。図１２に示されているように、Ｃｕ２＋は，Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−よりも長時間毛細管の中に留まることができるので、濃縮しかつ良好なピーク形を得るためには、４ｋＶで充分であるが、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−に対しては６ｋＶが必要である。高電圧は、陽イオンと陰イオンに異なった影響を持っているので、異なる化学種のピーク高またはピーク面積の比は、化学種の比（量比）と同じではない。従って、正確な結果を得るには、較正を行なわねばならない。図１３は、０．５μｇ／ｍｌのＣｕ２＋およびＣｕ（ＥＤＴＡ）２−の電気泳動図を示している。Ｃｕ２＋のピーク高はＣｕ（ＥＤＴＡ）２−のピーク高よりもずっと低いことが分かる。
【００２４】検出限界． 或る元素の検出限界は、ここでは、検体波長におけるバックグラウンド強度の標準偏差の３倍（３σ）に等しい実質シグナルを生じる濃度として定義された。１８種の元素の検出限界が、電圧無印加、サンプルはプラズマに連続導入で、ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳシステムおよび従来型の自己吸引ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳを用いて得られている。それらの値が表１に纏められている。
【００２５】
【表１】
【００２６】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰでは、内径１５０μｍの毛細管が、電気泳動毛細管および補助毛細管のどちらにも使用された。ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳシステムでは、従来型のＩＣＰ−ＡＥＳにおけるよりも、ずっと小容積のサンプルがプラズマに導入されるので、ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳで得られる検出限界は、ＩＣＰ−ＡＥＳでの検出限界の１−４倍高い（大きい）。ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳ分析では、シグナル強度は、カラム上濃縮技術を利用することによって数倍改善でき、従って高電圧無印加で得られる値よりも低い検出限界が、この技術によって期待できる。
【００２７】上記の結果は、本発明のインターフェースが、毛細管電気泳動をＩＣＰ−ＡＥＳに接続するのに有効であることを示している。このインターフェースは、容易且つ直接に、従来型の同軸型ニューマティックネブライザーおよびマイクロコンセントリックネブライザーに接続することができる。このＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳシステムによって、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｃｒ３＋とＣｒ２Ｏ７２−およびＦｅ３＋とＦｅ２＋をそれぞれ含むサンプルについて、効率的な分離ならびに十分な感度が得られた。カラム上濃縮技術によって、ＣＥ−ＩＣＰ−ＡＥＳの感度および分離効率を改善することができる。この実験では、内径１５０μｍの毛細管しか使用しなかったけれども、もっとサイズの大きな毛細管を利用すれば効率的な分離とより高い感度を得ることが可能と思われる。さらに、カラム上濃縮技術を利用すれば、Ｃｕ２＋とＣｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｃｒ３＋とＣｒ２Ｏ７２−、およびＦｅ３＋とＦｅ２＋を分離する電解質として０．０５ＭのＨＮＯ３（ｐＨ約１．３）が利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】毛細管電気泳動を誘導結合プラズマ分光測定法に接続するためのインターフェースの略図。
【図２】ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られたクロムの電気泳動図。
【図３】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られたクロムの電気泳動図。
【図４】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた銅の電気泳動図。
【図５】サンプルプラグの長さが電気泳動毛細管の全長の３０％の時の、ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた銅の電気泳動図。
【図６】注入容積がピーク高に及ぼす影響を示す。
【図７】注入容積がＣｕ２＋およびＣｕ（ＥＤＴＡ）２−のピークの半値幅（ｆｕｌｌｗｉｄｔｈ ａｔ ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｈｅｉｇｈｔ（ＦＷＨＭ））に及ぼす影響を示す。
【図８】注入容積が分解能に及ぼす影響を示す。
【図９】ＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた鉄の電気泳動図。
【図１０】サンプルプラグの長さが電気泳動毛細管の全長の３８％の時のＣＥ−ＣＰＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた鉄の電気泳動図。
【図１１】電圧がピーク高に及ぼす影響。
【図１２】電圧が半値幅（ＦＷＨＭ）に及ぼす影響。
【図１３】ＣＥ−ＭＣＮ−ＩＣＰ−ＡＥＳ法で得られた銅の電気泳動図。
【符号の説明】
１ インターフェース
２ 電気泳動毛細管
３ 補助毛細管
４ 補給電解質
５ 緩衝電解質
６ ネブライザーのサンプリングチューブ
７ 直流電源
８ ネブライザー
９ 第１の腕
１０ 第２の腕
１１ 第３の腕
１２ コネクター
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ３つの濾斗状チューブで構成されており、それぞれのチューブの尖った方の端が集まってＹ字状を形成し、他方の端が電気泳動毛細管、補助毛細管、およびネブライザーのサンプリングチューブにそれぞれ接続されていることを特徴とする、毛細管電気泳動を誘導結合プラズマ測定に接続するためのインターフェイス。
【請求項２】 電気泳動回路を形成する三又分岐を構成する電気泳動毛細管と補助毛細管とを有し、ネブライザーによる吸引またはペリスタチューブによる送液により電解液の流れを実現し、印可電圧により分離されたイオンを含む電解液の一部を直接導入することを特徴とする、電気泳動による分離されたイオンをネブライザーに直接導入する方法。
【請求項１】 ３つの濾斗状チューブで構成されており、それぞれのチューブの尖った方の端が集まってＹ字状を形成し、他方の端が電気泳動毛細管、補助毛細管、およびネブライザーのサンプリングチューブにそれぞれ接続されていることを特徴とする、毛細管電気泳動を誘導結合プラズマ測定に接続するためのインターフェイス。
【請求項２】 電気泳動回路を形成する三又分岐を構成する電気泳動毛細管と補助毛細管とを有し、ネブライザーによる吸引またはペリスタチューブによる送液により電解液の流れを実現し、印可電圧により分離されたイオンを含む電解液の一部を直接導入することを特徴とする、電気泳動による分離されたイオンをネブライザーに直接導入する方法。
【図 １】
【図 ２】
【図 ３】
【図 ４】
【図 ５】
【図 ６】
【図 ７】
【図 ８】
【図 ９】
【図 １０】
【図 １１】
【図 １２】
【図 １３】
【図 ２】
【図 ３】
【図 ４】
【図 ５】
【図 ６】
【図 ７】
【図 ８】
【図 ９】
【図 １０】
【図 １１】
【図 １２】
【図 １３】
【公開番号】特開平１０−１６０７０６
【公開日】平成１０年（１９９８）６月１９日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平８−３５３８２５
【出願日】平成８年（１９９６）１１月２９日
【出願人】（５９１０１４７０９）農林水産省農業環境技術研究所長 (4)
【公開日】平成１０年（１９９８）６月１９日
【国際特許分類】
【出願日】平成８年（１９９６）１１月２９日
【出願人】（５９１０１４７０９）農林水産省農業環境技術研究所長 (4)
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