カリウムチャネル変異サッカロミセスセレビシエ酵母および真核細胞カリウムチャネルスクリーニングのためのその使用
【課題】 真核細胞カリウムチャネルのインヒビターおよび活性化物質を特定する新規の方法の提供。
【解決手段】 真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定する方法であって、（ａ）３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い、（ｂ）真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ、（ｃ）前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして（ｄ）前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する方法、ならびにそのような変異サッカロミセスセレビシエ細胞、そのような変異サッカロミセスセレビシエ細胞の製造および使用。
【解決手段】 真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定する方法であって、（ａ）３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い、（ｂ）真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ、（ｃ）前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして（ｄ）前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する方法、ならびにそのような変異サッカロミセスセレビシエ細胞、そのような変異サッカロミセスセレビシエ細胞の製造および使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞を用いる真核細胞カリウムチャネルの阻害物質および活性化物質を特定する方法に関する。前記変異細胞の内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１の機能は発現されないが、前記細胞は研究対象の真核細胞カリウムチャネルを異種発現させる。本発明はまた、ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞、並びにこれら変異サッカロミセスセレビシエ細胞の作製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は各々、約６〜８nmの厚さを有する形質膜に包まれている。この膜は細胞の容積を決定し、細胞の内容物をその外界から分離させる。全ての生物膜は連結された脂質分子の二重層で構成され、前記二重層は多様な膜蛋白質を含んでいる。前記脂質二重層が生物膜の基本的構造を決定し、一方、前記蛋白質は生物膜の機能の大半に必要である。その疎水性内層のために、脂質二重層はほとんどの極性分子にとって非浸透性障壁として作用する。レセプター、イオンチャネルおよびおよびトランスポーターのような膜蛋白質のみがイオン流入および極性分子通過の制御を可能にする（Alberts et al.,1995）。したがって蛋白質は細胞内部および細胞周囲の多様なイオン濃度に寄与し、栄養物の進入および分解産物の排出を支配する。膜蛋白質のほとんどは、イオンチャネルのように形質膜の隙間を繰り返し埋め、したがってこれらは内在性膜蛋白質群に属する。これらの蛋白質は、疎水性領域（これは脂質二重層に広がる）および親水性部分（これらは膜のいずれかの面側の水性媒体に露出している）の両方を有する。イオンチャネルは全ての細胞に見出され、さらに神経細胞では活動電位の発生に必要である（Alberts et al.,1995）。イオンチャネルは、それらのイオン選択性の違いを基準に、さらにそれらの開閉メカニズムの相違を参考に区別することができる。
【０００３】
カリウムチャネルは、興奮性および非興奮性細胞の両方で見出される不変的な膜蛋白質である（概略については以下を参照されたい：L.Y. Jan et al.,1997）。開放カリウムチャネルは膜電位をカリウム平衡電位に近づけ、その結果、閾電位から外れて活動電位を惹起させる。したがってカリウムチャネルは休止膜電位を強化し細胞を再分極させ、このようにして活動電位の頻度の長さを決定する（M.C. Sanguinetti et al.,1997; A.A. Wilde
et al.,1997; Q. Wang et al.,1998）。これらの機能のために、カリウムチャネルはまた多くの病態の発生の分子的原因を構成し、したがって治療薬剤の開発の重要な標的である。
【０００４】
サッカロミセスセレビシエは３つのカリウムチャネル、すなわちＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を有する。カリウムチャネルＴＲＫ１（YJL129c）は、“主要促進因子”カリウム透過酵素族に属し、高親和性カリウムトランスポーターであり媒体から細胞内へのカリウムイオン流入に必要である（R.F. Gaber et al.,1998; C.H. Ko et al.,1990; C.H. Ko et al.,1991）。欠失変異体Δtrk1は生存可能であり、少なくとも１０mMＫ+で強く分極している（R.F. Gaber et al.,1988; R. Madrid et al.,1998）。Δtrk1株は１mMＫ+では生存できない（R.F. Gaber et.al.,1988）。
【０００５】
カリウムチャネルＴＲＫ２（YKR050w）はまた“主要促進因子”カリウム透過酵素族に属し、低親和性カリウムトランスポーターで媒体から細胞内へのカリウムの流入に必要である（C.H. Ko et al.,1990; C.H. Ko et al.,1991; R. Madrid et al.,1998）。Δtrk2欠失変異体の表現型はΔtrk1変異体の場合ほど顕著ではない。Δtrk2株はまた１mMＫ+で
生存できる（C.H. Ko et al.,1990; R. Madrid et al.,1998）。
【０００６】
カリウムチャネルＴＯＫ１（ＤＶＫ１またはＹＯＲＫとしても知られている）は、媒体から細胞内へのカリウムイオンの流入に必要である（K.A. Ketchum et al.,1995; C. Fairman et al.,1999）。しかしながら、イオン流入の方向は逆転可能で、したがって培養条件に応じて反対方向を取ることができる（C. Fairman et al.,1999）。
【０００７】
その欠失変異体Δtrk1Δtrk2は既に繰り返して報告されている（C.H. Ko et al.,1990;
C.H. Ko et al.,1991; R. Madrid et al.,1998; C. Fairman et al.,1999）。
【０００８】
これまで前記変異体は、表現型の相補性による高等真核細胞のＫ+チャネルの特定および記述のために用いられてきた。これまでに報告されれたものは、内方向整流チャネルＫＡＴ１ｃＤＮＡ（Arabidopsis thaliana）、ＨＫＴ１ｃＤＮＡ（Triticum aestivum）、ＩＲＫ１（Mus musculus）およびＨＫＴ１Ｋ+／Ｎａ+トランスポーター（Triticum aestivum）による相補性である（W. Tang et al.,1995; F.W. Smith et al.,1995; S.A. Goldstein et al.,1996; R.L. Nakamura et al.,1997）。さらに、ＴＯＫ１およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来のその同族体ＯＲＫ１の酵母細胞での過剰発現は、Δtrk1Δtrk2変異体の発育不全を相補できることが報告された（C. Fairman et al.,1999）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、例えばヒトのチャネルＨＥＲＧ１またはＫｖ１.５は５mMのＫＣｌでΔtrk1Δtrk2の致死的表現型を相補できず、したがってスクリーニングできないので、多数の真核細胞のカリウムチャネルおよびカリウムチャネルの作用を改変できる物質の特定に関する研究が困難になっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は真核細胞のカリウムチャネルの阻害物質を特定する方法に関し、本方法では、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い；
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ；
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし；さらに
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の影響を決定する。
【００１１】
本方法で用いる変異サッカロミセスセレビシエ細胞では、遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１（配列番号１、配列番号２および配列番号３）は、好ましくはノックアウトによってスイッチが切られており（Δtrk1、Δtrk2、 Δtok1）、好ましくは遺伝子の大部分が欠失している。
【００１２】
本方法で用いる真核細胞カリウムチャネルは、調べようとしているカリウムチャネル、その阻害物質または活性化物質を特定しようとしているチャネルである。
例えば、真核細胞カリウムチャネルは、ヒトＨＥＲＧ１、ヒトＫｖ１.５、ヒトＲＯＭＫ２またはｇｐＩＲＫ１（モルモット）チャネルである。真核細胞カリウムチャネルは、好ましくは問題のカリウムチャネルの天然の配列、例えば配列番号４、配列番号５、配列番号７（ＲＯＭＫ２）または配列番号６の配列の１つによってコードされるものを有する。しかしながら、カリウムチャネルの天然の配列はまた改変、例えば変異させたものでもよい。
【００１３】
好ましくは、真核細胞カリウムチャネルをコードするヌクレオチド配列は、酵母の発現プラスミド、例えばｐ４２３ＧＰＤ３、またはベクター（例えばｐＲＳ４２ｘまたはｐＲＳ３２ｘシリーズ）に組み込まれ、前記組換え発現プラスミドは変異サッカロミセスセレビシエ細胞に導入される。
【００１４】
前記方法は、真核細胞カリウムチャネルに対して作用を及ぼす物質を特定することを目的とする。これらの物質は変異サッカロミセスセレビシエ細胞の増殖を抑制する。異種発現された真核細胞カリウムチャネルを抑制する被検物質は、前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞は内在性カリウムチャネルを発現しないので、その分裂および成長を非常に困難にさせるか、または遅らせるか、または本発明の実施態様では致死させる。
【００１５】
被検物質の作用は、例えば光学密度を６００nmで測定するか、または変異サッカロミセスセレビシエ細胞で構成的に発現される増殖レポーターを用いて直接測定することができる。前記構成的に発現される増殖レポーターは、好ましくは、それ自体蛍光もしくは化学発光を示す蛋白質、または蛍光もしくは化学発光シグナルを生じる反応に加わる蛋白質をコードする。前記増殖レポーターをコードする配列は、好ましくはベクター由来である。適当な増殖レポーターは、例えばβ−ガラクトシダーゼのＬａｃＺ遺伝子または酸性ホスファターゼＰＨ０３（両方とも構成的酵母プロモーターの制御下で発現される）である。測定可能な蛍光または化学発光によって変異サッカロミセスセレビシエ細胞数に関する結果が得られる。蛍光もしくは化学発光が全くないかまたは少ない場合は、問題のサンプルに含まれる変異サッカロミセスセレビシエ細胞の数が少ないことになる。変異サッカロミセスセレビシエ細胞の数が少ない場合は、被検物質は真核細胞のカリウムチャネルに対して抑制作用を有することになる。
【００１６】
前述の方法は特に容易な自動化を可能にし、平行的に多数の物質の検査を実施することができる。本発明の特定の実施態様では、２つまたは３つ以上の方法が比較的態様で実施され、その場合２つまたは３つ以上のサッカロミセスセレビシエ細胞が比較的態様で分析される。これらの変異サッカロミセスセレビシエ細胞は好ましくは同じ量の被検物質と一緒にインキュベートされるが、前記細胞は問題の真核細胞カリウムチャネルを種々の程度に発現する。本発明のまた別の実施態様では、問題の真核細胞カリウムチャネルの発現は同程度であるが、異なる量の被検物質と一緒にインキュベートされた変異サッカロミセスセレビシエ細胞が比較的態様で分析される。
【００１７】
本発明の特徴はまた、内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１が発現されない変異サッカロミセスセレビシエ細胞である。さらに別の特徴は、遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のスイッチが切られた変異サッカロミセスセレビシエ細胞に関する。前記遺伝子は、好ましくはそれら全体または一部分がノックアウトによって除去されている。さらにまた別の特徴は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従いドイツ微生物および培養細胞コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig）に寄託された変異サッカロミセスセレビシエに関する（寄託番号DSM13197）。
【００１８】
本発明の特徴は真核細胞カリウムチャネルを異種発現する変異サッカロミセスセレビシエ細胞に関する。前記真核細胞カリウムチャネルは、好ましくはヒトカリウムチャネル（例えばＨＥＲＧ１、Ｋｖ１.５）、またはｇｐＩＲＫ１またはヒトＫｖ４．３［Genbank Accession Number AF187963］、ＴＡＳＫ［Genbank Accession Number AF006823］またはＲＯＭＫ２［Genbank Accession Number U12542］で、前記カリウムチャネルは天然の配列を有していてもよいし、また変異していてもよい。
【００１９】
本発明はまた変異サッカロミセスセレビシエ細胞の製造方法に関する。前記細胞はカリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現せず、遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１はノックアウトにより破壊されているかまたは欠失している。
本変異サッカロミセスセレビシエ細胞は、例えば、真核細胞カリウムチャネルの活性を抑制または活性化させる物質を特定する方法で用いることができる。また前記細胞は、例えば毒性物質の決定に用いることができる検査キットの部分でもよい。
【００２０】
本発明はまた真核細胞のカリウムチャネルの活性化物質を特定する方法に関し、本方法では、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い；
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ；
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュヘ゛ートし；さらに
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の作用を決定する。
【００２１】
本発明はさらにまた真核細胞のカリウムチャネルの活性化物質を特定する方法に関し、本方法では、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い；
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ；
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を前記真核細胞カリウムチャネルの阻害物質の存在下で被検物質と一緒にインキュベートし；さらに
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の作用を決定する。
【００２２】
本発明はまた医薬の製造方法に関し、本方法では、
(ａ) 真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定し；
(ｂ) 前記阻害物質を公知の化学的方法によって製造または単離し；さらに
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記阻害物質に添加する。
【００２３】
本発明はまた医薬の製造方法に関し、本方法では、
(ａ) 真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定し；
(ｂ) 前記活性化物質を公知の化学的方法によって製造または単離し;さらに
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記活性化物質に添加する。
【００２４】
添付図面において：
図１は、三重ノックアウトを証明するための診断ＰＣＲを示す。ゲルの段／レーンの説明については実施例２の三重ノックアウトを参照されたい。
図２は、規定のＫＣｌ濃度を含むｐＨ６.５のＤＰＭ培地でのＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
図３は、５mMのＫＣｌ＋２mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９０株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【００２５】
図４は、５mMのＫＣｌ＋２mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９１株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
図５は、５mMのＫＣｌ＋１mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９
４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。（“ＫＯＮ”＝コントロール）
図６は、５mMのＫＣｌ＋１mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。（“ＫＯＮ”＝コントロール）
【００２６】
図７は、活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５mMＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度の測定のために、市販のＬａｃＺレポーター系ｐＹＸ２３２（Ingenius, Cat.No.MBV-032-10）で分析酵母株を形質転換した。ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子のための構成的サッカロミセスセレビシエプロモーターＴＰＩの制御下にあった。ＬａｃＺ酵素活性は、市販のアッセイ系（TROPIX）を用いて２４時間後の化学発光を検出することによって測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。２つの別個のアッセイを別の日に互いに別々に実施した。
【００２７】
図８は、活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度は、６２０nmの波長で光学密度を測定することによって３８時間増殖後に測定した（出発培養密度：０.０３OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。
【００２８】
図９は、０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５mM ＫＣｌ培地におけるサッカロミセスセレビシエの増殖を示す。
それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度の測定のために、市販のＬａｃＺレポーター系ｐＹＸ２３２（Ingenius, Cat.No.MBV-032-10）で分析酵母株を形質転換した。ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子のための構成的サッカロミセスセレビシエプロモーターＴＰＩの制御下にあった。ＬａｃＺ酵素活性は、市販のアッセイ系（TROPIX）を用いて２４時間後の化学発光を検出することによって測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。２つの別個のアッセイを別の日に互いに別々に実施した。
【００２９】
図１０は、０.５mMのＫＣｌまたは８０mMのＫＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ培地におけるサッカロミセスセレビシエ野生型株の増殖を示す。
それぞれの事例で阻害物質、ジプラシドンおよびピモジドを最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度は、６２０nmの波長で光学密度を測定することによって２４時間増殖後に測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。
【００３０】
図１１は、５mMのＫＣｌおよび活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
１：陰性コントロールとしてブランクベクターｐ４２３ＧＰＤが発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。２：陽性コントロールとしてｐ４２３ＧＰＤ−ＴＲＫ１が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。３：ｐ４２３ＧＰＤ−ＨＥＲＧ１が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。４：ｐ４２３ＧＰＤ−ＨＥＲＧ１が
発現している二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖。使用したベクターおよび構築物は本明細書で説明されている（段落0039以下および段落0043以下の配列を参照されたい）。
【００３１】
図１２は、５ｍＭのＫＣｌおよび活性化物質として２mMのＲｂＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＫｖ１.５の発現を示す。
１：陰性コントロールとしてブランクベクターｐ４２３ＧＰＤが発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。２：陽性コントロールとしてｐ４２３ＧＰＤ−ＴＲＫ１が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。３：ｐ４２３ＧＰＤ−Ｋｖ１.５が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。４：ｐ４２３ＧＰＤ−Ｋｖ１.５が発現している二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖。使用したベクターおよび構築物は本願明細書で説明されている（段落0039以下および段落0043以下の配列を参照されたい）。
【００３２】
図１３は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＲＯＭＫ２の発現および陰性コントロールとしての酵母ベクターｐ４２３ＧＰＤの発現を示す。
細胞密度は、６２０nmの波長で光学密度を測定することによって２４時間増殖後に測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。
図１４は、ｐ４２３ＧＰＤ−ＲＯＭＫ２のプラスミドマップを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】三重ノックアウトを証明するための診断ＰＣＲを示す。
【図２】規定のＫＣｌ濃度を含むｐＨ６.５のＤＰＭ培地でのＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図３】５mMのＫＣｌ＋２mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９０株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図４】５mMのＫＣｌ＋２mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９１株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図５】５mMのＫＣｌ＋１mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図６】５mMのＫＣｌ＋１mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図７】活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
【図８】活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
【図９】０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５ｍＭＫＣｌ培地におけるサッカロミセスセレビシエの増殖を示す。
【図１０】０.５mMのＫＣｌまたは８０mMのＫＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ培地におけるサッカロミセスセレビシエ野生型株の増殖を示す。
【図１１】５mMのＫＣｌおよび活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
【図１２】５mMのＫＣｌおよび活性化物質として２mMのＲｂＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＫｖ１.５の発現を示す。
【図１３】９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＲＯＭＫ２の発現および陰性コントロールとしての酵母ベクターｐ４２３ＧＰＤの発現を示す。
【図１４】ｐ４２３ＧＰＤ−ＲＯＭＫ２のプラスミドマップを示す。
【実施例】
【００３４】
材料および株
培地：
ＹＰＤ（完全酵母培地）：１％バクト（Bacto）酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％バクト寒天、２％グルコース。
ＳＣ（合成完全）培地：０.６７％バクト酵母窒素ベース、アミノ酸、２％グルコース。
胞子形成培地：１％酢酸カリウム、アミノ酸。
５−ＦＯＡ培地：０.６７％バクト酵母窒素ベース、アミノ酸、ウラシル（５０μｇ／mL）、２％糖（ガラクトースまたはグルコース）、０.１％５−ＦＯＡ。
全ての培地は次の文献に記載されている：（G.R. Fink et al.,1991）。
【００３５】
アミノ酸ドロップアウトミックス：
Ｌ−アラニン２ｇ；Ｌ−アルギニン２ｇ；Ｌ−アスパラギン*Ｈ2Ｏ ２.２７ｇ；Ｌ−アスパラギン酸２ｇ；Ｌ−システイン*ＨＣｌ ２.６ｇ；Ｌ−グルタミン２ｇ；Ｌ−グルタミン酸２ｇ；グリシン２ｇ；ミオイノシトール２ｇ；Ｌ−イソロイシン２ｇ；Ｌ−メチオニン２ｇ；ＰＡＢＡ０．２ｇ；Ｌ−フェニルアラニン２ｇ；Ｌ−セリン２ｇ；Ｌ−スレオニン２ｇ；Ｌ−チロシン２ｇ；Ｌ−バリン２ｇ。
【００３６】
マーカーアミノ酸用ストック溶液：
mM ｇ／Ｌ
アデニン(100x) 30 5.53 加熱（60℃未満）
ロイシン(60x) 100 13.12 加熱
リジン(100x) 100 18.26 −
ヒスチジン(200x) 60 12.57 −
トリプトファン(100x) 40 8.17 −
ウラシル(100x) 20 2.24 0.5％ＮａＨＣＯ3溶液中で加熱
【００３７】
ビタミン原液（５０mL）：
ビオチン２０μｇ／Ｌ；パントテン酸カルシウム４０μｇ／Ｌ；チアミン４０μｇ／Ｌ
。
【００３８】
限定カリウム培地（ＤＰＭ）：１.５Ｌ用（２×原液）：
(ＮＨ4)2ＨＰＯ4 8mM 3.2ｇ
(ＮＨ4)2ＳＯ4 29mM 11.5ｇ
ＭｇＳＯ4 2mM 0.8ｇ（または１Ｍ原液6mL)
ＣａＣｌ2 0.2mM 90μｇ（または0.5Ｍ原液１.２mL）
ビタミン原液 120μＬ
アミノ酸ドロップアウトミックス 6ｇ
リジン 100倍原液330mL
アデニン 0.9mM 100倍原液30mL
→上記をＨＣｌでpH6.5（または他のpH）としオートクレーブする。
グルコース 2％ 40％原液より
ＫＣｌ １Ｍ原液より
必須アミノ酸（Ｌｙｓ／Ａｄｅは除外）は原液から
寒天
【００３９】
緩衝液および溶液：
ＴＥ緩衝液：トリス／ＨＣｌ(pH７.５)１０mM；ＥＤＴＡ(pH８.０)１mM；
ＴＡＥ緩衝液：トリス４０mM；ＥＤＴＡ１mM；酢酸０.２mM；
ＳＳＣ緩衝液(20x)：ＮａＣｌ ３Ｍ；クエン酸ナトリウム*２Ｈ2Ｏ ０.３Ｍ;
ゲルローディング緩衝液：ブロムフェノールブルー０.０５％(w/v)；スクロース４０％(w/v)；ＥＤＴＡ(pH８.０)０.１Ｍ；ＳＤＳ ０.５％(w/v)
ハイブリダイゼーション緩衝液：ＳＳＣ ５ｘ；ＳＤＳ ０.１％(w/v)；硫酸デキストラン５％(w/v)；停止試薬１：20；
緩衝液Ａ(無菌)：トリス−ＨＣｌ １００mM；ＮａＣｌ(pH９.５) ３００mM；
脱プリン溶液：ＨＣｌ ０.２５Ｍ；
変性溶液：ＮａＣｌ １.５Ｍ；ＮａＯＨ ０.５Ｍ；
中和溶液：ＮａＣｌ １.５Ｍ；トリス（pH８.０）０.５Ｍ。
【００４０】
オリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）：
【００４１】
【００４２】
ベクター：
細菌ベクター
【００４３】
酵母ベクター
【００４４】
株：
細菌株：ＤＨ５α；ワンショット（One ShotTM) TOP10(Invitrogen)
酵母株：
この実験のために作製した全ての酵母株は以下の二倍体野生型株をベースにしている：Ｗ３０３ＭＡＴａ／α ａｄｅ２．ｈｉｓ３−１１−１５，ｌｅｕ２−３−１１２，ｔｒｐ１−１，ｕｒａ３−１，ｃａｎ１−１００；ＡＴＣＣ＃２０８３５２
【００４５】
【００４６】
以下の酵母株を作製した：
【００４７】
【００４８】
カリウムチャネルクローン：
Ａ）
系統名 ＫＣＮＡ５
別称 Ｋｖ１．５，（ＨＫ２，ＨＰＣＮ１）
種類 電圧開閉カリウムチャネル、shaker関連サブファミリー
(メンバー番号５)、遅延整流チャネル
染色体上の位置 １２ｐ１３.３２−ｐ１３.３１
登録番号 ＮＩＤ ｇ４５０４８１８
蛋白質 ６１３アミノ酸、６７ｋＤ
組織内分布 心臓、膵臓ランゲルハンス島およびインスリノーマ
同族体 ｍＫｃｎａ５(Mus musculus)、70％がｈＨＣＮ４と相同
参考文献 (S.L. Roberds et al.,1991; M.E. Curran et al.,1992;
D.J. Snyders et al.,1993）
【００４９】
Ｂ）
系統名 ＨＣＮ２
別称 ＢＣＮＧ２(脳環状ヌクレオチド開閉チャネル)、ＨＡＣ１
種類 過分極−活性化および環状ヌクレオチド開閉カリウムチャネ
ル、電圧開閉カリウムチャネルのサブファミリーに属する
染色体上の位置 １９ｐ１３.３
登録番号 ＮＩＤ ｇ４９９６８９３
蛋白質 ８８９アミノ酸
機能 ペースメーカー
組織内分布 脳、心臓
同族体 ｍＨｃｎ２（Mus musculus）
参考文献 （A. Ludwig et al.,1999）
【００５０】
Ｃ）
系統名 ＫＣＮＨ２
別称 ＨＥＲＧ１（より長いスプライス変種）
種類 電圧開閉カリウムチャネル、eag関連サブファミリー
（メンバー番号２）
染色体上の位置 ７ｑ３５−ｑ３６
登録番号 ＮＩＤ ｇ４５５７７２８
特性 Ｋ+チャネル調節因子１によってチャネル活性化が促進
参考文献 （M. Taglialatela et al.,1998; T. Itoh et al.,1998）
【００５１】
Ｄ）
系統名 ＫＣＮＪ２（モルモット）
別称 Ｋｉｒ２．１，ＩＲＫ１
種類 内向き整流カリウムチャネル
組織内分布 脳、心臓、肺臓、腎臓、胎盤、骨格筋
参考文献 （W. Tang et al.,1995）
【００５２】
方法：
ＲＯＭＫ２（後記の“ＲＯＭＫ２の配列”を参照されたい）
【００５３】
ＰＣＲ：
パワースクリプト(Powerscript)ポリメラーゼ(PAN Biotech)用プロトコル：
ローワー(lower）試薬用ミックス(ホットスタートプロトコル)(２５μＬ)：
３μＬのＨ2Ｏ；２.５μＬの１０×オプチパフォーム（OptiPerform(登録商標)）III緩衝液（pH９.２）；１０μＬの１.２５mM ｄＮＴＰ(＝２００μＭ)；
１.５μＬの前進プライマー（２０pmol／μＬ）；１.５μＬの逆方向プライマー（２０pmol／μＬ）；１.５μＬの５０mg ＭｇＣｌ2（＝１.２５mM）；５μＬの５×オプチザイム（OptiZyme(登録商標))エンハンサー
【００５４】
アッパー試薬用混合物（３５μＬ）：
２３μＬのＨ2Ｏ；３.５μＬの１０×オプチパフォーム（OptiPerform(登録商標)）III緩衝液；１.５μＬの５０mM ＭｇＣｌ2；０.５μＬのパワースクリプトＤＮＡポリメラーゼ；７μＬの５×オプチザイム（OptiZyme(登録商標)）エンハンサー。
【００５５】
ＰＣＲプログラム（ホットスタート）：
１．９４℃で１分
２．９４℃で１分
３．５０〜５５℃（プライマーによる）で１.５分
４．６９〜７２℃（ポリメラーゼによる）で４分
５．２番から２７回繰り返す
６．４℃∞
７．終了
【００５６】
アンプリタック（AmpliTaq）ポリメラーゼ（Perkin Elmer）用プロトコル：
アッパー試薬用ミックス（ホットスタートプロトコル）(５０μＬ)：
１８.１μＬのＨ2Ｏ；４.２μＬの１０×緩衝液II；１６.７μＬのｄＮＴＰ；２.５μＬの前進プライマー；２.５μＬの逆方向プライマー；６μＬの２５mM ＭｇＣｌ2(＝１.５mM）。
ローワー試薬用ミックス(５０μＬ)：
４２μＬのＨ2Ｏ；５μＬの１０×緩衝液II；１μＬのアンプリタック（AmpliTaq）ポリメラーゼ；２μＬの鋳型。
【００５７】
ＤＮＡの精製
ＰＣＲ反応物の精製：ＰＣＲ増幅生成物の精製はキット（High Pure PCR Product Purification Kit(Roche))を用いて実施した。
フェノール抽出：サンプル容積をＴＥ緩衝液で２００μＬにする。２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、混合し、最大速度で１分間遠心する。上部相を新しいエッペンドルフ試験管に移し、２００μＬのクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、混合し１分間遠心する。上部相を取り出しエタノールで沈殿させる。
【００５８】
エタノール沈殿：約２００μＬのサンプル容積に５μＬの５Ｍ ＮａＣｌおよび２０μＬの３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５.７）をピペットで加える。２.５容の１００％エタノールを添加して混合し、少なくとも３０またはそれ以上−２０℃で静置する。４℃で１０分間遠心し、ペレットを１７０μＬの７０％冷エタノールで洗浄する。３分間遠心し、ペレットを３７℃で乾燥させ、さらに３０μＬのＨ2Ｏに再懸濁させる。
【００５９】
大腸菌（E. coli）のプラスミドＤＮＡの単離：大腸菌オーバーナイト培養のプラスミドＤＮＡの単離はキアゲン(Qiagen）のプロトコル（QIApre Spin Miniprep Kit Orotocl)を用いて実施した。
【００６０】
サッカロミセスセレビシエのＤＮＡの調製：
前記酵母細胞を１０mLのＹＰＤで一晩３０℃でインキュベートし、次の朝、３０００rpmで１０分間遠心し、ペレットを１Ｍソルビトール、０.１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７.５）の５００μＬに再懸濁し、エッペンドルフ試験管に移す。５０μＬのザイモラーゼ（zymolase）（ソルビトール／ＥＤＴＡ中に５mg／mL）を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、さらに１分間遠心する。５０mMトリス、２０mMのＥＤＴＡ（ｐＨ７.４）５００μＬにペレットを再懸濁する。５０μＬの１０％ＳＤＳを添加し、完全に混合し、さらに６５℃で３０分間インキュベートする。５ＭのＫＡｃ２００μＬを加え、氷上に１時間置き、１
０分間遠心する。上清（約６５０μＬ）を新しいエッペンドルフ試験管に移し、１容量のイソプロパノールを加え、穏やかに混合し、さらに５分間静置する。簡単に遠心するか、または沈殿したＤＮＡをガラスのかぎ棒で抜き取り、空気中で前記ペレットを乾燥させる。ペレットまたはＤＮＡを１５０μＬのＴＥ緩衝液に再懸濁し、６５℃で１０分間溶解させる。
ＤＮＡクローニング：全てのＤＮＡクローニングは標準的なプロトコルにしたがって実施した。
【００６１】
酵母の形質転換（酢酸リチウム法）：
形質転換しようとする酵母株を５ｍＬの適当な培養液中で一晩３０℃でシェーカー上でインキュベートする。次の朝前記オーバーナイト培養を適当な培養液で希釈し（ＯＤ600＝０.４０.５）、さらに２時間シェーカー上で３０℃でインキュベートする（ＯＤ600＝０.４０.８）。２５００rpmで３分間遠心し、２５mLの滅菌Ｈ2Ｏでペレットを洗浄する。２５００rpmで３分間遠心し、１mLのＬＩＴＥ（１００mMのＬｉＡｃ，ＴＥ（ｐＨ７.５))に再懸濁し、懸濁液をエッペンドルフ試験管に移す。ＲＴで５分間インキュベートし、１５秒間遠心する（Quickspin）。１００mMのＬｉＡｃ １mLでペレットを洗浄し（quick-spin）、細胞濃度に応じてペレットを２００４００μＬの１００mM ＬｉＡｃに再懸濁して５０μＬの部分標本に分ける。
【００６２】
表示の順番どおりに以下を加える：
２４０μＬのＰＥＧ（５０％）、ピペットで穏やかに懸濁物を混合する；
３６μＬの１Ｍ ＬｉＡｃ、ピペットで穏やかに懸濁物を混合する；
１０μＬの一本鎖精子ＤＮＡ（−２０℃で保存；使用前に８０−９０℃で１０分間加熱してから氷に移す）；
２〜３μｇのプラスミドＤＮＡ（またはノックアウトトランスフォーメーションの場合には８〜１０μＬのミニプレップ（Miniprep))、ピペットで穏やかに懸濁物を混合し；
形質転換反応物をオーバーヘッド回転装置で低速で３０℃３０分間インキュベートする；
４２℃１５分間形質転換反応；
クィックスピンで遠心、ペレットを２００μＬのＴＥ緩衝液に再懸濁（ノックアウトの場合は３００μＬのＹＰＤにペレットを再懸濁）し、オーバーヘッド回転装置で３０℃で４時間インキュベートする；
寒天平板当たり１００μＬ（ノックアウトのばあいは全反応物）を平板培養し、３０℃で３〜４日間インキュベート。
【００６３】
配列決定：ＡＢＩＰＲＩＳＭ(登録商標) ｒｅｄ．プロトコルII／AmpliTaq(登録商標) ＦＳ1/4ＢｉｇＤｙｅターミネーター
【００６４】
反応物：
プレミックス ２μＬ
ＤＮＡ鋳型
ｓｓＤＮＡ ５０ｎｇ
ｄｓＤＮＡ ２５０ｎｇ
ＰＣＲ生成物（０．２−５ｋＢ） １０−５０ｎｇ
プライマー ３〜１０ｐｍｏｌ
Ｈ2Ｏで最終容積 １０μＬ
【００６５】
サーモサイクラープロトコル（２５サイクル）：
１．９６℃で１５秒間
２．９６℃で１５秒間
３．５５℃で１０秒間
４．６０℃で４分間
５．２．に戻って２４サイクル
６．４℃∞
７．終了
【００６６】
精製反応（セントリセップスピンカラム（Centri Sep Spin Colum）(Princeton Separations))：
カラムを７５０μＬのＨ2Ｏで３０分間予め膨潤させ、液体を排出させて２分間３０００rpmで遠心する。反応物をＨ2Ｏで２０μＬにしてカラムに適用し、２分間３０００rpmで遠心する。
サンプル適用：配列決定試験管に、４μＬのセントリセップ（Centri Sep)溶出液＋２０μＬのＴＳＲ（鋳型抑制試薬）、９０℃で２分間。
【００６７】
サザンブロット：
ＤＮＡプローブを適当な制限酵素で消化、ゲル電気泳動で分離し、ゲルから抽出する。ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で一晩消化し、ゲル電気泳動で分離する（１％アガロースゲル）。
【００６８】
ゲルの前処理：アガロースゲルからローディングウェルを取り出す。アガロースゲルを０.２５ＭのＨＣｌで１５分間脱プリン処理し、続いて蒸留水で２回洗浄する。アガロースゲルを０,５ＭのＮａＯＨで３０分間変性させ、ヴァキュームブロッターモデル785（Vaccum Blotter Model 785, BioRad）を用いてビニールシートの中央に移し、ウィンドー（ウィンドーシール）を切り取り、ナイロン膜と濾紙の端を切り揃え（各々の事例でゲルより０.５cm小さい）、ナイロン膜の端を蒸留水で湿らし（各々の事例でビニールシートの小窓より０.５cm広い）、続いてナイロン膜および濾紙をトランスファー溶液で湿らす。
【００６９】
装置の構築（下から上へ）：
ベースユニット、真空土台部、多孔性真空スラブ、濾紙、ナイロン膜、ビニールウィンドー、アガロースゲル、最終フレーム、蓋。
バイオラッド（BioRad）真空ポンプを１０分間予熱し、真空を適用する（１６９３２Ｐａ（５インチＨｇ))。
端に沿ってゲルを穏やかに圧迫する。
トランスファー溶液（約１Ｌ、１０×ＳＳＣ）を上部液だめに入れる；移動時間：９０分；真空のスイッチを切り、ナイロン膜を取り出し、５分間２×ＳＳＣで洗浄し、続いて濾紙の間で風乾させる。ＤＮＡ固定：ナイロン膜をＵＶ透過性の密着フィルム上に置き、陽性コントロールとして端にプローブを適用する；ＵＶストラタリンカーに入れ架橋を開始させる（１２０００００Ｊ→０）；膜は粘着フィルム内またはワットマン濾紙の間で室温または４℃で保存することができる。
【００７０】
ジーンイメージ・ランダムプライムラベリングモジュール（Amersham)：
ＤＮＡプローブの標識：ＤＮＡプローブを９６℃で５分間変性させ（ヒートショック）、その後氷上に置く。１０μＬの反応ミックス（ヌクレオチドミックス（５×）、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）中のフルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２−メルカトエタノールおよびＭｇＣｌ2）；５μＬのプライマー（Random Nonamers）、１μＬの酵素溶液（クレノーフラグメント、５単位／mL）；２２μＬの変性ＤＮＡプローブ；１２μＬのＨ2Ｏ。２時間３７℃でインキュベートし、２μＬのＯ.５Ｍ ＥＤＴＡ（＝２０mM）を添加し、部分標本を−２０℃で保存する。標識効率の確認：５×ヌクレオチドミックスをＴＥ緩衝液で１／５、１／１０、１／２５、１／５０、１／１００、１／２５０および１／５００に希釈し；ナイロン膜の細片に５μＬの
ＤＮＡプローブを５μＬの１／５希釈と一緒に適用してさっと吸収させ、予め温めておいた２×ＳＳＣで６０℃で１５分間洗浄し；１／５希釈を除いた残りの溶液を参照用膜細片に適用し、両方の膜細片をＵＶ光の下で観察し、サンプルの濃さを決定する。
【００７１】
ハイブリダイゼーション：ナイロン膜（ブロット）を温かいハイブリダイゼーション緩衝液（０.３mL／cm2）で、回転オーブンで６０℃２時間予備ハイブリダイズさせ；緩衝液を除きその１０mLを残す。ＤＮＡプローブを変性させ（９６℃で５分間、続いて氷上で冷却）；プローブを前記１０ｍＬの緩衝液とともにブロット上に加え、回転オーブンで６０℃で一晩ハイブリダイズさせる。
【００７２】
洗浄工程：
温かい１×ＳＳＣ，０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中でプラットフォームシェーカー上で１５分；温かい０.５×ＳＳＣ，０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中でプラットフォームシェーカー上で１５分。
【００７３】
ジーンイメージ・ＣＤＰ−スターディテクションモジュール（Amersham）：
停止および抗体反応：シェーカーの上で、緩衝液Ａ中の停止試薬１／１０希釈中で１時間室温でブロットをインキュベートする。抗体溶液（アルカリ性ホスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体、５０００×）を０.５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／緩衝液Ａでブロットシールと一緒に金属薄片中で希釈し、さらにシェーカー上で１時間室温でインキュベートする。１０分間緩衝液Ａ中の０.３％トゥイーン（Tween）２０で３回洗浄して未結合抗体溶液を除去する。
【００７４】
シグナル発生および検出：洗浄緩衝液を排出し、ブロットを密着フィルム上に置き、５mLの検出試薬を適用し、２〜５分反応させ、再度排液し（アルカリ性ホスファターゼは発光を引き起こす）；密着フィルムで包み、暗室の赤色光の中でフィルム（ハイパーフィルム(Hyperfilm(登録商標)MP, Amersham）を用い、フィルムカセット（BioMax, Kodak）中で０.５〜２時間露光させ、現像してスキャンする。ブロットは４℃で密着フィルム中で保存できる。
【００７５】
実施例１：特異的欠失カセットの構築
欠失は全て標準的な方法によって実施した（G.R. Fink et al.,1991; A. Wach et al.,1994; U. Guldener et al.,1996; A.L. Goldstein et al.,1999）。
各々約５００ｂｐのフラグメント（それぞれは遺伝子の初めと終わりの領域をもつ）を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた：ＴＲＫ１の場合はTRK1-FL-BamHI-Fo、 TRK1-FL-PstI-Re、 TRK1-FL-PstI-FoおよびTRK1-FL-XhoI-Re、 ＴＲＫ２の場合はTRK2-DEL-5-Fo-B、 TRK2-DEL-5-Re、 TRK2-DEL-3-FoおよびTRK2-DEL-3-Re、 並びにＴＯＫ１の場合はTOK1-DEL-5-Fo、 TOK1-DEL-5-Re、 TOK1-DEL-3-FoおよびTOK1-DEL-3-Re（２.３章参照）。増幅させた末端は後の酵母ゲノムへの正確な組み込みを可能にする。酵母株ｗ３０３ａ／αまたはｗ３０３ａ／αΔｔｒｋ１はＤＮＡ鋳型として機能する。
【００７６】
実施例２：単一、二重、三重変異体の構築
実施例２ａ：単一ノックアウト
ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のための構築欠失カセットでそれぞれ二倍体酵母株ＹＭ９６（ＭＡＴａ／ＭＡＴα）を形質転換した。ゲノムへの欠失カセットの組み込みは、（−）ＵＲＡ／Ｇｌｃでｔｒｋ１変異体（ＹＭ１２３／１２４）を、さらにＹＰＤ／ジェニチシンでｔｒｋ２変異体（ＹＭ１５８−１６１）およびｔｏｋ１変異体（ＹＭ１５４−１５７）を増殖させることによって確認した。なぜならば、ＴＲＫ１欠失カセットのＵＲＡ３マーカーは（−）ＵＲＡ培地での増殖を可能にし、ＴＲＫ２またはＴＯＫ１のＫＡＮマーカーはゲネチシン（geneticin）での増殖を可能にするからである（G.R. Fink et
al.,1991）。陽性コロニーを胞子形成平板にレプリカ平板培養により移し、ここで栄養成長を行わずに１８−２４時間後にＭＡＴａ／ＭＡＴα二倍体細胞は胞子を形成する。それらをザイモラーゼで処理し、再びＹＰＤ上で増殖させた後、解剖顕微鏡を用いていくつかのコロニーの四分子を個々の４つの胞子に分割する。
【００７７】
胞子コロニーの交配型を交配テスター株との交配によって決定した（G.R. Fink et al.,1991）。欠失カセットの有無についての選別は、ｔｒｋ１については−ＵＲＡ培地、ｔｒｋ２およびｔｏｋ１についてはゲネチシン含有培地でのレプリカ平板培養によって実施した。酵母のＤＮＡ調製によって形質転換体のゲノムＤＮＡを得た後で、結果を診断用ＰＣＲおよびサザンブロットによって確認した。
【００７８】
実施例２ｂ：二重ノックアウト
ＴＯＫ１欠失カセットで一倍体Δtrk1酵母株ＹＭ１２３およびＹＭ１２４を形質転換し、ＹＰＤ／ゲネチシンでの増殖によりＴＯＫ１欠失カセットの組み込みについて選別した。結果は診断用ＰＣＲおよびサザンブロットにより確認した。グリセロール培養は以下の株を用いて実施した：（＋）ＵＲＡ３、（＋）ＫＡＮ）（Δtrk1Δtok1)株（ＹＭ１４０、ＹＭ１４１、ＹＭ１４３およびＹＭ１４４）。単一コロニーをパッチとして画線培養し、５−ＦＯＡ上にレプリカ培養し、ＴＲＫ１欠失カセットからＵＲＡ３マーカーおよびｈｉｓＧリピートを排除したコロニーを選別した（G.R. Fink et al.,1991）。したがって、ウラシル合成のためのＵＲＡ３遺伝子（ＴＲＫ１で）を欠いたコロニーはいずれも（−）ＵＲＡ／Ｇｌｃでは増殖せず、一方、ＴＯＫ１欠失カセット中の耐性遺伝子により全てのコロニーがＹＰＤ／ｇｅｎ上で生存する。ゲノムからＫａｎマーカーを除去するために、（−）ＵＲＡ３変異体をプラスミドｐＳＨ４７で形質転換した。前記ｐＳＨ４７にはＣｒｅリコンビナーゼおよびウラシル合成（ＵＲＡ３）のための遺伝子が存在する。陽性形質転換体は（−）ＵＲＡ／Ｇｌｃで増殖し、したがって（−）ＵＲＡ／Ｇａｌ液体培地でのインキュベーションによってＣｒｅリコンビナーゼを誘発することが可能であった。この方法で、Ｋａｎマーカーは１つのｌｏｘＰリピートとともに排除され、１つのｌｏｘＰは保持される。
【００７９】
オーバーナイト培養でＯＤ600＝５となった後で、１：１００００および１：５００００の希釈を（−）ＵＲＡ／Ｇａｌで平板培養した。ＹＰＤ／ｇｅｎでレプリカ培養した単一コロニーパッチは増殖を示さなかった（これはＫａｎマーカーの排除は成功であったことを示している）。プラスミドｐＳＨ４７を除去するために、その後、細胞を５−ＦＯＡで２回選別を繰り返した。グリセロール培養は（−）ｕｒａ（−）ｋａｎ（Δtrk1Δtok1)株（ＹＭ１６２、ＹＭ１６３およびＹＭ１６４）を用いて実施した。
【００８０】
実施例２ｃ：三重ノックアウト
ＹＰＤでのオーバーナイト培養を単一Δtrk1Δtok1コロニー（ＹＭ１６２およびＹＭ１６４）を用いて開始し、次の日、BsiWI/SpeI消化ＴＲＫ２欠失カセットで形質転換し、ＹＰＤ／ＫＣｌ／ジェネチシンで平板培養した。酵母ＤＮＡを調製した後、この三重ノックアウトを診断用ＰＣＲおよびサザンブロットで確認した。
【００８１】
【００８２】
実施例３：ヒトカリウムチャネルのサブクローニング並びに二重および三重変異体の形質転換
ヒト遺伝子ＨＥＲＧ、ＨＣＮ２、Ｋｖ１．５および陽性コントロールとしてＴＲＫ１、ＩＲＫ１（モルモット）をそれらを含むプラスミド（HERGはpcDNAのBamHI間に、 HCN2はpTLNのNcoI/XhoI間に、 Kv1.5はpcDNA3.1(-)のNheI/EcoRI間に、 IRK1はpSGEMのBamHI/EcoRI間に存在）から制限酵素を用いて切断して切り出し、ゲル電気泳動によって分離し、さらにゲルから抽出した。個々のヒトカリウムチャネルを酵母ベクターｐ４２３−ＧＰＤ３（D. Mumberg et al.,1995; V. Ronicke et al.,1997）に連結し、大腸菌を形質転換した。プラスミド調製物のコントロール消化および配列決定によって前記のヒト遺伝子が組み込まれたクローンを特定することができた。続いてこれらのプラスミドでΔtrk1Δtrk2二重ノックアウト(YM168)およびΔtrk1Δtrk2Δtok1三重ノックアウト(YM182)を形質転換し、 （−）ＨＩＳ／８０ｍＭＫＣｌ上で平板培養した。
【００８３】
実施例４：ノックアウト株の性状決定
実施例４ａ：種々のＫ+濃度およびｐＨ値の培養平板上での二重および三重変異体の増殖
種々のノックアウトのカリウム要求の相違を比較するために、酵母株ＹＭ１８２、ＹＭ１６８およびＹＭ９７（ＷＴ）を、種々のＫ+濃度およびｐＨ値をもつＤＰＭ平板でインキュベートした。この目的のために、グリセロール培養のパッチを先ず最初に１００mM ＫＣｌ／ｐＨ６.５に画線培養した。２日間増殖させた後、５０mM、３０mMおよび５mM ＫＣｌでレプリカ平板培養を実施した。
この実験によって、ＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の両株は５０mMおよび３０mMのＫＣｌで生存可能であることが示された。さらに、ＹＭ１８２株はＹＭ１６８株よりも３０ｍＭのＫＣｌの存在下でより良好に増殖することが判明した。この２つの株のいずれも、野生型株ＹＭ９７とは対照的に５ｍＭのＫＣｌの存在下で生存できなかった。
【００８４】
ｐＨ依存性を調べるために、前記３株をさらに１００mMおよび５mM ＫＣｌ／ｐＨ５.０並びに１００mMおよび５mM ＫＣｌ／ｐＨ４.０上でレプリカ平板培養した。この実験は、
ＹＭ１６８およびＹＭ１８２はいずれもｐＨ４.０では１００mM ＫＣｌでも５mM ＫＣｌでも生存できないことを示した。ｐＨ５.０で１００mM ＫＣｌでは、ＹＭ１６８の増殖欠損はＹＭ１８２の場合よりも激しい。ベクターpRS416GALのＴＲＫ１の発現は、ＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖欠損を完全に補完する。
【００８５】
実施例４ｂ：種々のＫ+濃度の液体培地での二重および三重変異体の増殖
ＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）（以後の全ての実験はこれらを基準にしている）の性状を調べるために、これら酵母株の液体培養中の増殖態様を調べた。最初に、オーバーナイト培養をＤＰＭ／８０mM ＫＣｌ中で開始させ、次の朝、ＤＰＭ／５mM ＫＣｌおよびＤＰＭ／１５mM ＫＣｌで前記培養をＯＤ＝０.０５にした。それぞれ規定の間隔後に６００nmでの光学密度を光度計により決定した。
これらの実験によって、ＹＭ１８２株の増殖欠損は、５mM ＫＣｌおよび１５mM ＫＣｌではＹＭ１６８よりも強くないことが判明した。
【００８６】
実施例５：二重および三重ノックアウトのヒトカリウムチャネルの性状決定
実施例５ａ：培養平板のＫ+欠乏の補完能力
ＹＭ１６８（Δtrk1Δtrk2)およびＹＭ１８２（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の各株を、酵母発現ベクターとしてｐ４２３−ＧＰＤ３中のヒトカリウムチャネルＫｖ１.５（(D. Fedida et al.,1998)；YM190およびYM195）およびＨＥＲＧ１（(D. Fedida et al.,1998)；YM191およびYM196）でそれぞれ形質転換した。ｇｐＩＲＫ１（W. Tang et al.,1995)；YM193およびYM198）は酵母発現ベクターｐ４２３−ＧＰＤ３中の陽性コントロールとして機能した（D. Mumberg et al.,1995; V. Ronicke et al.,1997）。ブランクベクターｐ４２３−ＧＰＤ３（YM189およびYM194）は陰性コントロールとして機能した。形質転換酵母株を（−）ＨＩＳ／８０mM ＫＣｌ上で平板培養した。この後、単一コロニーのパッチをＤＰＭ／５mM ＫＣｌ（ｐＨ６.５）上でレプリカ平板培養し、カリウム欠乏を補完する能力を調べた。
【００８７】
これらの実験によって、ｐ４２３−ＧＰＤ３の陽性コントロールｇｐＩＲＫ（YM193およびYM198）は完全に二重および三重ノックアウトの増殖欠損を補完することが示された。陰性コントロールとしてのブランクベクターｐ４２３−ＧＤＰ３（YM189およびYM194）はこの増殖欠損を補完することができない。ヒトカリウムチャネルＫｖ１.５は三重ノックアウトの増殖欠損を補完するが、陽性コントロールｇｐＩＲＫよりはるかに効率が悪い。さらにまた、ヒトカリウムチャネルＫｖ１．５は二重ノックアウトΔtrk1Δtrk2を補完しない。与えられた実験条件下では、ＨＥＲＧチャネルは二重および三重ノックアウトの増殖欠損を補完しない。
【００８８】
実施例５ｂ：活性化物質が存在する培養平板での増殖
種々のカリウムチャネルに対する活性化物質の作用を示すために、上記の株を以下の特定の活性化物質を含む培地中でインキュベートした。
Ｋｖ１.５：Ｒｂ+は過分極相を延長させる。これは、内向きのＫ+の流れはより長く続き、増殖欠損を補完する可能性を高めることを意味している。
ＨＥＲＧ：Ｃｓ+は過分極相を延長させる。これは、内向きのＫ+の流れはより長く続き、増殖欠損を補完する可能性を高めることを意味している。このチャネルはＣｓ+によって抑制される。
ＩＲＫ１：Ｃｓ+はこのチャネルを阻害する。
ｐ４２３−ＧＰＤ３−Ｋｖ１.５を用いた実験によって、ヒトＫｖ１.５チャネルは、２mM ＲｂＣｌの存在下でΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体の増殖欠損を完全に補完できることが示された（図３）。Δtrk1Δtrk2変異体の増殖欠損の補完は極めて効率が低い（図３）。これは実施例６ａで示される結果と一致する。
ｐ４２３−ＧＰＤ３−ＨＥＲＧを用いた実験によって、ヒトＨＥＲＧ１チャネルは、２ｍＭＣｓＣｌの存在下でΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体の増殖欠損を完全に補完できることが示された（図４）。Δtrk1Δtrk2変異体の増殖欠損の補完は極めて効率が低い（図４）。これは実施例６ａで示される結果と一致する。
【００８９】
実施例５ｃ：液体培養液中のＲｂＣｌの存在下におけるΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体のＫｖ１．５による補完
酵母株ＹＭ１９４およびＹＭ１９５を１ｍＭのＲｂＣｌを含むＤＰＭ／−ＨＩＳ／５ｍＭＫＣｌ中で液体培地における増殖態様の相違について調べた。この目的のために、１０mLのオーバーナイト培養をＤＰＭ／−ＨＩＳ／８０mM ＫＣｌ中で開始し、次の朝対応する培養液を用いてＯＤ600を０.０５にした（最終容積：２０mL）。６００nmでの光学密度は規定の間隔で光度計により測定した。
これらの実験は、ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を欠く酵母株におけるベクターｐ４２３−ＧＰＤ３のＫｖ１.５の発現は前記によってもたらされた増殖欠損を補完することができることを明瞭に示した。
さらに別の実験で、Ｋｖ１.５およびｇｐＩＲＫによる増殖欠損の補完は２mMのＣｓＣｌの存在下で抑制されることが示された。
【００９０】
実施例５ｄ：液体培地中のＣｓＣｌ存在下でのΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体におけるＨＥＲＧ1チャネルによる補完
酵母株ＹＭ１９4およびＹＭ１９６を１mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ／−ＨＩＳ／５mM ＫＣｌ中で液体培地における増殖態様の相違について調べた。この目的のために、１０mLのオーバーナイト培養をＤＰＭ／−ＨＩＳ／８０mM ＫＣｌ中で開始し、次の朝対応する培養液を用いてＯＤ600を０．０５にした（最終容積：２０mL）。６００nmでの光学密度は規定の間隔で光度計により測定した。
これらの実験は、ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を欠く酵母株におけるベクターｐ４２３−ＧＰＤ３のＨＥＲＧ１の発現は前記によってもたらされた増殖欠損を補完できることを明瞭に示した。
【００９１】
実施例６：
三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1における全ての増殖アッセイは、各事例で表示したｐＨおよびカリウム濃度で増殖培地ＤＰＭ（規定カリウム培地）で実施した。
ヒトＨＥＲＧ１Ｋ+チャネルの阻害物質として用いられた物質は、テルフェナジン（α−（４−tert−ブチルフェニル）−４−（α−ヒドロキシ−αフェニルベンジル）−１−ピペリジンブタノール；ＨＭＲ)、 ピモジド（１−（４,４−bis（Ｐ−フルオロフェニル）ブチル）−４−（２−オキソ−１−ベンゾイミダゾリニル）−ピペリジン；Sigma, Cat.No.P100）、ジプラシドン（５−（２−［４−（１,２−ベンゾイソチアゾール−３−イル）ピペラジノ］−エチル）−６−クロロ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン；ＨＭＲ）、ロラタジン（エチル４−（８−クロロ−５,６−ジヒドロ−１１Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２−ｂ−］ピペリジン−１１−イリデン）−１−ピペリジンカルボキシレート；ＨＭＲ）およびセルティンドール（１−（２−［４−［５−クロロ−１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−１−ピペリジニル］エチル）−２−イミダゾリジノン；ＨＭＲ）であった（E. Richelson, 1996; E. Richelson, 1999; E. Delpon et. al.,1999; T. Kobayashi et al.,2000; M.D. Drich et al.,2000）。カリウムチャネルに対して抑制作用をもたないはずの物質、ジフェニルヒドラミン（Sigma, Cat.No.D3630）およびフェキソフェナジン（４−［ヒドロキシ−４−［４−(ヒドロキシジフェニルメチル)−１−ピペリジニル］ブチル］−α，α−ジメチルベンゼン酢酸ヒドロクロリド；ＨＭＲ）（M. Taglialatela et al.,1999; L.M. DuBuske, 1999）もまた用いた。全ての物質はＤＭＳＯに溶解し、最終濃度３０μＭで使用した。コントロールとして、前記物質を含まない０．５％の同じ最終濃度のＤＭＳＯを有する細胞、
ＤＭＳＯが添加されていない細胞、物質が添加されていない細胞を測定した。
【００９２】
図１および２に示したように、ヒトＨＥＲＧ１チャネルは、５mM ＫＣｌのみを含む培地で三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができる。テルフェナジン、ピモジド、ジプラシドン、セルティンドールおよびロラタジンの存在下では、ヒトＨＥＲＧ１チャネルは、もはや５mM ＫＣｌのみを含む培地では三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができない。
【００９３】
実施例７：
酵母の３つの内在性カリウムチャネル蛋白質を全て発現する野生型株をテルフェナジン、ピモジド、ジフェニルヒドラミン、ジプラシドン、ロラタジン、フェキソフェナジンおよびセルティンドールとともにインキュベートしたとき、テルフェナジン、ロラタジンおよびセルティンドールはヒトＨＥＲＧ１チャネルの特異的阻害物質であることが示された（図９）。
【００９４】
この結果によれば、ピモジドおよびジプラシドンはむしろ非特異的阻害物質であると考えるべきである。このことは、これらの物質はおそらくヒトＨＥＲＧ１チャネルだけでなくサッカロミセスセレビシエの内在性カリウムチャネルもまた抑制することを意味している。しかしながら、この結果は、これら物質について認められた抑制作用は、酵母細胞の増殖に必須の他の物質の抑制に起因する可能性を排除することができなかった。この可能性を調べるために、８０mMのＫＣｌを含む増殖培地でこれらの物質の作用も調べた。
【００９５】
これらの結果（図１０）によって、ピモジドは、非特異的態様で内在性カリウムチャネルＴＲＫ１およびＴＲＫ２の活性を抑制することが明らかになった。より高いカリウム濃度で抑制作用が認められないことによって、ピモジドは酵母細胞で不変的な毒性作用をもたないと結論することができる。対照的に、ジプラシドンはより高いカリウム濃度でさえ酵母細胞の増殖を抑制し、したがってサッカロミセスセレビシエに対する毒性作用をもつことが明らかになった。この作用に必須である酵母の標的蛋白質はまだ特定されていない。
結論として、上記の実験は、前述の系によって、ヒトカリウムチャネルを特異的に抑制する物質を実際にサッカロミセスセレビシエで特定することができることを示した。
前記の結果は図１０に示されている。
【００９６】
実施例８：
ヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１およびＫｖ１.５は二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完しない（図１１および図１２）。
結果：図１１および図１２
図１１および１２は、ヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１およびＫｖ１.５は二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完しないことを示している（各事例について図１１および１２の第４の部分）。陰性コントロール、すなわち三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるブランクベクターｐ４２３ＧＰＤ（各事例について図１１および１２の第１の部分）と比較したとき、増殖が改善されていないことが示されている。二重変異体Δtrk1Δtrk2の陰性コントロールｐ４２３ＧＰＤは表示されていないが、三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の陰性コントロールｐ４２３ＧＰＤと異ならない。対照的に、ヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１およびＫｖ１.５は三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完する（各事例について、図１１および１２の第三の部分）。
【００９７】
実施例９：
ヒトカリウムチャネルＲＯＭＫ２((M.E. Shuck et al.,1994; J.H. Bock et al.,1997)；配列番号３１、ｈＲＯＭＫ２）を酵母ベクターｐ４２３ＧＰＤでサブクローニングし、
三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1を形質転換した。この実験によって、前記ヒトカリウムチャネルもまた三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができることが示された。
このヒトカリウムチャネルが二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完できるか否かはまだ調べられていない。ＲＯＭＫ２チャネルを特異的に抑制する物質はまだ判明していない。
前記の結果は図１３に示されている。
【００９８】
【表１】
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
【表１０】
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】
【表１２】
【０１１０】
【表１３】
【０１１１】
【表１４】
【０１１２】
【表１５】
【０１１３】
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【０１１４】
【０１１５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞を用いる真核細胞カリウムチャネルの阻害物質および活性化物質を特定する方法に関する。前記変異細胞の内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１の機能は発現されないが、前記細胞は研究対象の真核細胞カリウムチャネルを異種発現させる。本発明はまた、ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞、並びにこれら変異サッカロミセスセレビシエ細胞の作製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は各々、約６〜８nmの厚さを有する形質膜に包まれている。この膜は細胞の容積を決定し、細胞の内容物をその外界から分離させる。全ての生物膜は連結された脂質分子の二重層で構成され、前記二重層は多様な膜蛋白質を含んでいる。前記脂質二重層が生物膜の基本的構造を決定し、一方、前記蛋白質は生物膜の機能の大半に必要である。その疎水性内層のために、脂質二重層はほとんどの極性分子にとって非浸透性障壁として作用する。レセプター、イオンチャネルおよびおよびトランスポーターのような膜蛋白質のみがイオン流入および極性分子通過の制御を可能にする（Alberts et al.,1995）。したがって蛋白質は細胞内部および細胞周囲の多様なイオン濃度に寄与し、栄養物の進入および分解産物の排出を支配する。膜蛋白質のほとんどは、イオンチャネルのように形質膜の隙間を繰り返し埋め、したがってこれらは内在性膜蛋白質群に属する。これらの蛋白質は、疎水性領域（これは脂質二重層に広がる）および親水性部分（これらは膜のいずれかの面側の水性媒体に露出している）の両方を有する。イオンチャネルは全ての細胞に見出され、さらに神経細胞では活動電位の発生に必要である（Alberts et al.,1995）。イオンチャネルは、それらのイオン選択性の違いを基準に、さらにそれらの開閉メカニズムの相違を参考に区別することができる。
【０００３】
カリウムチャネルは、興奮性および非興奮性細胞の両方で見出される不変的な膜蛋白質である（概略については以下を参照されたい：L.Y. Jan et al.,1997）。開放カリウムチャネルは膜電位をカリウム平衡電位に近づけ、その結果、閾電位から外れて活動電位を惹起させる。したがってカリウムチャネルは休止膜電位を強化し細胞を再分極させ、このようにして活動電位の頻度の長さを決定する（M.C. Sanguinetti et al.,1997; A.A. Wilde
et al.,1997; Q. Wang et al.,1998）。これらの機能のために、カリウムチャネルはまた多くの病態の発生の分子的原因を構成し、したがって治療薬剤の開発の重要な標的である。
【０００４】
サッカロミセスセレビシエは３つのカリウムチャネル、すなわちＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を有する。カリウムチャネルＴＲＫ１（YJL129c）は、“主要促進因子”カリウム透過酵素族に属し、高親和性カリウムトランスポーターであり媒体から細胞内へのカリウムイオン流入に必要である（R.F. Gaber et al.,1998; C.H. Ko et al.,1990; C.H. Ko et al.,1991）。欠失変異体Δtrk1は生存可能であり、少なくとも１０mMＫ+で強く分極している（R.F. Gaber et al.,1988; R. Madrid et al.,1998）。Δtrk1株は１mMＫ+では生存できない（R.F. Gaber et.al.,1988）。
【０００５】
カリウムチャネルＴＲＫ２（YKR050w）はまた“主要促進因子”カリウム透過酵素族に属し、低親和性カリウムトランスポーターで媒体から細胞内へのカリウムの流入に必要である（C.H. Ko et al.,1990; C.H. Ko et al.,1991; R. Madrid et al.,1998）。Δtrk2欠失変異体の表現型はΔtrk1変異体の場合ほど顕著ではない。Δtrk2株はまた１mMＫ+で
生存できる（C.H. Ko et al.,1990; R. Madrid et al.,1998）。
【０００６】
カリウムチャネルＴＯＫ１（ＤＶＫ１またはＹＯＲＫとしても知られている）は、媒体から細胞内へのカリウムイオンの流入に必要である（K.A. Ketchum et al.,1995; C. Fairman et al.,1999）。しかしながら、イオン流入の方向は逆転可能で、したがって培養条件に応じて反対方向を取ることができる（C. Fairman et al.,1999）。
【０００７】
その欠失変異体Δtrk1Δtrk2は既に繰り返して報告されている（C.H. Ko et al.,1990;
C.H. Ko et al.,1991; R. Madrid et al.,1998; C. Fairman et al.,1999）。
【０００８】
これまで前記変異体は、表現型の相補性による高等真核細胞のＫ+チャネルの特定および記述のために用いられてきた。これまでに報告されれたものは、内方向整流チャネルＫＡＴ１ｃＤＮＡ（Arabidopsis thaliana）、ＨＫＴ１ｃＤＮＡ（Triticum aestivum）、ＩＲＫ１（Mus musculus）およびＨＫＴ１Ｋ+／Ｎａ+トランスポーター（Triticum aestivum）による相補性である（W. Tang et al.,1995; F.W. Smith et al.,1995; S.A. Goldstein et al.,1996; R.L. Nakamura et al.,1997）。さらに、ＴＯＫ１およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来のその同族体ＯＲＫ１の酵母細胞での過剰発現は、Δtrk1Δtrk2変異体の発育不全を相補できることが報告された（C. Fairman et al.,1999）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、例えばヒトのチャネルＨＥＲＧ１またはＫｖ１.５は５mMのＫＣｌでΔtrk1Δtrk2の致死的表現型を相補できず、したがってスクリーニングできないので、多数の真核細胞のカリウムチャネルおよびカリウムチャネルの作用を改変できる物質の特定に関する研究が困難になっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は真核細胞のカリウムチャネルの阻害物質を特定する方法に関し、本方法では、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い；
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ；
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし；さらに
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の影響を決定する。
【００１１】
本方法で用いる変異サッカロミセスセレビシエ細胞では、遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１（配列番号１、配列番号２および配列番号３）は、好ましくはノックアウトによってスイッチが切られており（Δtrk1、Δtrk2、 Δtok1）、好ましくは遺伝子の大部分が欠失している。
【００１２】
本方法で用いる真核細胞カリウムチャネルは、調べようとしているカリウムチャネル、その阻害物質または活性化物質を特定しようとしているチャネルである。
例えば、真核細胞カリウムチャネルは、ヒトＨＥＲＧ１、ヒトＫｖ１.５、ヒトＲＯＭＫ２またはｇｐＩＲＫ１（モルモット）チャネルである。真核細胞カリウムチャネルは、好ましくは問題のカリウムチャネルの天然の配列、例えば配列番号４、配列番号５、配列番号７（ＲＯＭＫ２）または配列番号６の配列の１つによってコードされるものを有する。しかしながら、カリウムチャネルの天然の配列はまた改変、例えば変異させたものでもよい。
【００１３】
好ましくは、真核細胞カリウムチャネルをコードするヌクレオチド配列は、酵母の発現プラスミド、例えばｐ４２３ＧＰＤ３、またはベクター（例えばｐＲＳ４２ｘまたはｐＲＳ３２ｘシリーズ）に組み込まれ、前記組換え発現プラスミドは変異サッカロミセスセレビシエ細胞に導入される。
【００１４】
前記方法は、真核細胞カリウムチャネルに対して作用を及ぼす物質を特定することを目的とする。これらの物質は変異サッカロミセスセレビシエ細胞の増殖を抑制する。異種発現された真核細胞カリウムチャネルを抑制する被検物質は、前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞は内在性カリウムチャネルを発現しないので、その分裂および成長を非常に困難にさせるか、または遅らせるか、または本発明の実施態様では致死させる。
【００１５】
被検物質の作用は、例えば光学密度を６００nmで測定するか、または変異サッカロミセスセレビシエ細胞で構成的に発現される増殖レポーターを用いて直接測定することができる。前記構成的に発現される増殖レポーターは、好ましくは、それ自体蛍光もしくは化学発光を示す蛋白質、または蛍光もしくは化学発光シグナルを生じる反応に加わる蛋白質をコードする。前記増殖レポーターをコードする配列は、好ましくはベクター由来である。適当な増殖レポーターは、例えばβ−ガラクトシダーゼのＬａｃＺ遺伝子または酸性ホスファターゼＰＨ０３（両方とも構成的酵母プロモーターの制御下で発現される）である。測定可能な蛍光または化学発光によって変異サッカロミセスセレビシエ細胞数に関する結果が得られる。蛍光もしくは化学発光が全くないかまたは少ない場合は、問題のサンプルに含まれる変異サッカロミセスセレビシエ細胞の数が少ないことになる。変異サッカロミセスセレビシエ細胞の数が少ない場合は、被検物質は真核細胞のカリウムチャネルに対して抑制作用を有することになる。
【００１６】
前述の方法は特に容易な自動化を可能にし、平行的に多数の物質の検査を実施することができる。本発明の特定の実施態様では、２つまたは３つ以上の方法が比較的態様で実施され、その場合２つまたは３つ以上のサッカロミセスセレビシエ細胞が比較的態様で分析される。これらの変異サッカロミセスセレビシエ細胞は好ましくは同じ量の被検物質と一緒にインキュベートされるが、前記細胞は問題の真核細胞カリウムチャネルを種々の程度に発現する。本発明のまた別の実施態様では、問題の真核細胞カリウムチャネルの発現は同程度であるが、異なる量の被検物質と一緒にインキュベートされた変異サッカロミセスセレビシエ細胞が比較的態様で分析される。
【００１７】
本発明の特徴はまた、内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１が発現されない変異サッカロミセスセレビシエ細胞である。さらに別の特徴は、遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のスイッチが切られた変異サッカロミセスセレビシエ細胞に関する。前記遺伝子は、好ましくはそれら全体または一部分がノックアウトによって除去されている。さらにまた別の特徴は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従いドイツ微生物および培養細胞コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig）に寄託された変異サッカロミセスセレビシエに関する（寄託番号DSM13197）。
【００１８】
本発明の特徴は真核細胞カリウムチャネルを異種発現する変異サッカロミセスセレビシエ細胞に関する。前記真核細胞カリウムチャネルは、好ましくはヒトカリウムチャネル（例えばＨＥＲＧ１、Ｋｖ１.５）、またはｇｐＩＲＫ１またはヒトＫｖ４．３［Genbank Accession Number AF187963］、ＴＡＳＫ［Genbank Accession Number AF006823］またはＲＯＭＫ２［Genbank Accession Number U12542］で、前記カリウムチャネルは天然の配列を有していてもよいし、また変異していてもよい。
【００１９】
本発明はまた変異サッカロミセスセレビシエ細胞の製造方法に関する。前記細胞はカリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現せず、遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１はノックアウトにより破壊されているかまたは欠失している。
本変異サッカロミセスセレビシエ細胞は、例えば、真核細胞カリウムチャネルの活性を抑制または活性化させる物質を特定する方法で用いることができる。また前記細胞は、例えば毒性物質の決定に用いることができる検査キットの部分でもよい。
【００２０】
本発明はまた真核細胞のカリウムチャネルの活性化物質を特定する方法に関し、本方法では、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い；
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ；
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュヘ゛ートし；さらに
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の作用を決定する。
【００２１】
本発明はさらにまた真核細胞のカリウムチャネルの活性化物質を特定する方法に関し、本方法では、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い；
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ；
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を前記真核細胞カリウムチャネルの阻害物質の存在下で被検物質と一緒にインキュベートし；さらに
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する前記被検物質の作用を決定する。
【００２２】
本発明はまた医薬の製造方法に関し、本方法では、
(ａ) 真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定し；
(ｂ) 前記阻害物質を公知の化学的方法によって製造または単離し；さらに
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記阻害物質に添加する。
【００２３】
本発明はまた医薬の製造方法に関し、本方法では、
(ａ) 真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定し；
(ｂ) 前記活性化物質を公知の化学的方法によって製造または単離し;さらに
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記活性化物質に添加する。
【００２４】
添付図面において：
図１は、三重ノックアウトを証明するための診断ＰＣＲを示す。ゲルの段／レーンの説明については実施例２の三重ノックアウトを参照されたい。
図２は、規定のＫＣｌ濃度を含むｐＨ６.５のＤＰＭ培地でのＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
図３は、５mMのＫＣｌ＋２mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９０株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【００２５】
図４は、５mMのＫＣｌ＋２mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９１株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
図５は、５mMのＫＣｌ＋１mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９
４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。（“ＫＯＮ”＝コントロール）
図６は、５mMのＫＣｌ＋１mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。（“ＫＯＮ”＝コントロール）
【００２６】
図７は、活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５mMＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度の測定のために、市販のＬａｃＺレポーター系ｐＹＸ２３２（Ingenius, Cat.No.MBV-032-10）で分析酵母株を形質転換した。ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子のための構成的サッカロミセスセレビシエプロモーターＴＰＩの制御下にあった。ＬａｃＺ酵素活性は、市販のアッセイ系（TROPIX）を用いて２４時間後の化学発光を検出することによって測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。２つの別個のアッセイを別の日に互いに別々に実施した。
【００２７】
図８は、活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度は、６２０nmの波長で光学密度を測定することによって３８時間増殖後に測定した（出発培養密度：０.０３OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。
【００２８】
図９は、０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５mM ＫＣｌ培地におけるサッカロミセスセレビシエの増殖を示す。
それぞれの事例で種々の阻害物質を最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度の測定のために、市販のＬａｃＺレポーター系ｐＹＸ２３２（Ingenius, Cat.No.MBV-032-10）で分析酵母株を形質転換した。ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、トリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子のための構成的サッカロミセスセレビシエプロモーターＴＰＩの制御下にあった。ＬａｃＺ酵素活性は、市販のアッセイ系（TROPIX）を用いて２４時間後の化学発光を検出することによって測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。２つの別個のアッセイを別の日に互いに別々に実施した。
【００２９】
図１０は、０.５mMのＫＣｌまたは８０mMのＫＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ培地におけるサッカロミセスセレビシエ野生型株の増殖を示す。
それぞれの事例で阻害物質、ジプラシドンおよびピモジドを最終濃度３０μＭで用いた。細胞密度は、６２０nmの波長で光学密度を測定することによって２４時間増殖後に測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。
【００３０】
図１１は、５mMのＫＣｌおよび活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
１：陰性コントロールとしてブランクベクターｐ４２３ＧＰＤが発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。２：陽性コントロールとしてｐ４２３ＧＰＤ−ＴＲＫ１が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。３：ｐ４２３ＧＰＤ−ＨＥＲＧ１が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。４：ｐ４２３ＧＰＤ−ＨＥＲＧ１が
発現している二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖。使用したベクターおよび構築物は本明細書で説明されている（段落0039以下および段落0043以下の配列を参照されたい）。
【００３１】
図１２は、５ｍＭのＫＣｌおよび活性化物質として２mMのＲｂＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＫｖ１.５の発現を示す。
１：陰性コントロールとしてブランクベクターｐ４２３ＧＰＤが発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。２：陽性コントロールとしてｐ４２３ＧＰＤ−ＴＲＫ１が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。３：ｐ４２３ＧＰＤ−Ｋｖ１.５が発現している三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖。４：ｐ４２３ＧＰＤ−Ｋｖ１.５が発現している二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖。使用したベクターおよび構築物は本願明細書で説明されている（段落0039以下および段落0043以下の配列を参照されたい）。
【００３２】
図１３は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＲＯＭＫ２の発現および陰性コントロールとしての酵母ベクターｐ４２３ＧＰＤの発現を示す。
細胞密度は、６２０nmの波長で光学密度を測定することによって２４時間増殖後に測定した（出発培養密度：０.０１OD620）。値は各事例で４つの測定値の平均±ＳＤに一致する。
図１４は、ｐ４２３ＧＰＤ−ＲＯＭＫ２のプラスミドマップを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】三重ノックアウトを証明するための診断ＰＣＲを示す。
【図２】規定のＫＣｌ濃度を含むｐＨ６.５のＤＰＭ培地でのＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図３】５mMのＫＣｌ＋２mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９０株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図４】５mMのＫＣｌ＋２mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１８９株およびＹＭ１９１株（Δtrk1Δtrk2）並びにＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図５】５mMのＫＣｌ＋１mMのＲｂＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９４株およびＹＭ１９５株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図６】５mMのＫＣｌ＋１mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ培地（ｐＨ６.５）でのＹＭ１９４株およびＹＭ１９６株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖を示す。
【図７】活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
【図８】活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
【図９】０.５mMのＣｓＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ／−ＴＲＰ５ｍＭＫＣｌ培地におけるサッカロミセスセレビシエの増殖を示す。
【図１０】０.５mMのＫＣｌまたは８０mMのＫＣｌが存在する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ培地におけるサッカロミセスセレビシエ野生型株の増殖を示す。
【図１１】５mMのＫＣｌおよび活性化物質として０.５mMのＣｓＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１の発現を示す。
【図１２】５mMのＫＣｌおよび活性化物質として２mMのＲｂＣｌが存在するＤＰＭ−ＨＩＳ培地における三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1および二重変異体Δtrk1Δtrk2におけるヒトカリウムチャネルＫｖ１.５の発現を示す。
【図１３】９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのＤＰＭ−ＨＩＳ５mM ＫＣｌ培地の三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるヒトカリウムチャネルＲＯＭＫ２の発現および陰性コントロールとしての酵母ベクターｐ４２３ＧＰＤの発現を示す。
【図１４】ｐ４２３ＧＰＤ−ＲＯＭＫ２のプラスミドマップを示す。
【実施例】
【００３４】
材料および株
培地：
ＹＰＤ（完全酵母培地）：１％バクト（Bacto）酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％バクト寒天、２％グルコース。
ＳＣ（合成完全）培地：０.６７％バクト酵母窒素ベース、アミノ酸、２％グルコース。
胞子形成培地：１％酢酸カリウム、アミノ酸。
５−ＦＯＡ培地：０.６７％バクト酵母窒素ベース、アミノ酸、ウラシル（５０μｇ／mL）、２％糖（ガラクトースまたはグルコース）、０.１％５−ＦＯＡ。
全ての培地は次の文献に記載されている：（G.R. Fink et al.,1991）。
【００３５】
アミノ酸ドロップアウトミックス：
Ｌ−アラニン２ｇ；Ｌ−アルギニン２ｇ；Ｌ−アスパラギン*Ｈ2Ｏ ２.２７ｇ；Ｌ−アスパラギン酸２ｇ；Ｌ−システイン*ＨＣｌ ２.６ｇ；Ｌ−グルタミン２ｇ；Ｌ−グルタミン酸２ｇ；グリシン２ｇ；ミオイノシトール２ｇ；Ｌ−イソロイシン２ｇ；Ｌ−メチオニン２ｇ；ＰＡＢＡ０．２ｇ；Ｌ−フェニルアラニン２ｇ；Ｌ−セリン２ｇ；Ｌ−スレオニン２ｇ；Ｌ−チロシン２ｇ；Ｌ−バリン２ｇ。
【００３６】
マーカーアミノ酸用ストック溶液：
mM ｇ／Ｌ
アデニン(100x) 30 5.53 加熱（60℃未満）
ロイシン(60x) 100 13.12 加熱
リジン(100x) 100 18.26 −
ヒスチジン(200x) 60 12.57 −
トリプトファン(100x) 40 8.17 −
ウラシル(100x) 20 2.24 0.5％ＮａＨＣＯ3溶液中で加熱
【００３７】
ビタミン原液（５０mL）：
ビオチン２０μｇ／Ｌ；パントテン酸カルシウム４０μｇ／Ｌ；チアミン４０μｇ／Ｌ
。
【００３８】
限定カリウム培地（ＤＰＭ）：１.５Ｌ用（２×原液）：
(ＮＨ4)2ＨＰＯ4 8mM 3.2ｇ
(ＮＨ4)2ＳＯ4 29mM 11.5ｇ
ＭｇＳＯ4 2mM 0.8ｇ（または１Ｍ原液6mL)
ＣａＣｌ2 0.2mM 90μｇ（または0.5Ｍ原液１.２mL）
ビタミン原液 120μＬ
アミノ酸ドロップアウトミックス 6ｇ
リジン 100倍原液330mL
アデニン 0.9mM 100倍原液30mL
→上記をＨＣｌでpH6.5（または他のpH）としオートクレーブする。
グルコース 2％ 40％原液より
ＫＣｌ １Ｍ原液より
必須アミノ酸（Ｌｙｓ／Ａｄｅは除外）は原液から
寒天
【００３９】
緩衝液および溶液：
ＴＥ緩衝液：トリス／ＨＣｌ(pH７.５)１０mM；ＥＤＴＡ(pH８.０)１mM；
ＴＡＥ緩衝液：トリス４０mM；ＥＤＴＡ１mM；酢酸０.２mM；
ＳＳＣ緩衝液(20x)：ＮａＣｌ ３Ｍ；クエン酸ナトリウム*２Ｈ2Ｏ ０.３Ｍ;
ゲルローディング緩衝液：ブロムフェノールブルー０.０５％(w/v)；スクロース４０％(w/v)；ＥＤＴＡ(pH８.０)０.１Ｍ；ＳＤＳ ０.５％(w/v)
ハイブリダイゼーション緩衝液：ＳＳＣ ５ｘ；ＳＤＳ ０.１％(w/v)；硫酸デキストラン５％(w/v)；停止試薬１：20；
緩衝液Ａ(無菌)：トリス−ＨＣｌ １００mM；ＮａＣｌ(pH９.５) ３００mM；
脱プリン溶液：ＨＣｌ ０.２５Ｍ；
変性溶液：ＮａＣｌ １.５Ｍ；ＮａＯＨ ０.５Ｍ；
中和溶液：ＮａＣｌ １.５Ｍ；トリス（pH８.０）０.５Ｍ。
【００４０】
オリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）：
【００４１】
【００４２】
ベクター：
細菌ベクター
【００４３】
酵母ベクター
【００４４】
株：
細菌株：ＤＨ５α；ワンショット（One ShotTM) TOP10(Invitrogen)
酵母株：
この実験のために作製した全ての酵母株は以下の二倍体野生型株をベースにしている：Ｗ３０３ＭＡＴａ／α ａｄｅ２．ｈｉｓ３−１１−１５，ｌｅｕ２−３−１１２，ｔｒｐ１−１，ｕｒａ３−１，ｃａｎ１−１００；ＡＴＣＣ＃２０８３５２
【００４５】
【００４６】
以下の酵母株を作製した：
【００４７】
【００４８】
カリウムチャネルクローン：
Ａ）
系統名 ＫＣＮＡ５
別称 Ｋｖ１．５，（ＨＫ２，ＨＰＣＮ１）
種類 電圧開閉カリウムチャネル、shaker関連サブファミリー
(メンバー番号５)、遅延整流チャネル
染色体上の位置 １２ｐ１３.３２−ｐ１３.３１
登録番号 ＮＩＤ ｇ４５０４８１８
蛋白質 ６１３アミノ酸、６７ｋＤ
組織内分布 心臓、膵臓ランゲルハンス島およびインスリノーマ
同族体 ｍＫｃｎａ５(Mus musculus)、70％がｈＨＣＮ４と相同
参考文献 (S.L. Roberds et al.,1991; M.E. Curran et al.,1992;
D.J. Snyders et al.,1993）
【００４９】
Ｂ）
系統名 ＨＣＮ２
別称 ＢＣＮＧ２(脳環状ヌクレオチド開閉チャネル)、ＨＡＣ１
種類 過分極−活性化および環状ヌクレオチド開閉カリウムチャネ
ル、電圧開閉カリウムチャネルのサブファミリーに属する
染色体上の位置 １９ｐ１３.３
登録番号 ＮＩＤ ｇ４９９６８９３
蛋白質 ８８９アミノ酸
機能 ペースメーカー
組織内分布 脳、心臓
同族体 ｍＨｃｎ２（Mus musculus）
参考文献 （A. Ludwig et al.,1999）
【００５０】
Ｃ）
系統名 ＫＣＮＨ２
別称 ＨＥＲＧ１（より長いスプライス変種）
種類 電圧開閉カリウムチャネル、eag関連サブファミリー
（メンバー番号２）
染色体上の位置 ７ｑ３５−ｑ３６
登録番号 ＮＩＤ ｇ４５５７７２８
特性 Ｋ+チャネル調節因子１によってチャネル活性化が促進
参考文献 （M. Taglialatela et al.,1998; T. Itoh et al.,1998）
【００５１】
Ｄ）
系統名 ＫＣＮＪ２（モルモット）
別称 Ｋｉｒ２．１，ＩＲＫ１
種類 内向き整流カリウムチャネル
組織内分布 脳、心臓、肺臓、腎臓、胎盤、骨格筋
参考文献 （W. Tang et al.,1995）
【００５２】
方法：
ＲＯＭＫ２（後記の“ＲＯＭＫ２の配列”を参照されたい）
【００５３】
ＰＣＲ：
パワースクリプト(Powerscript)ポリメラーゼ(PAN Biotech)用プロトコル：
ローワー(lower）試薬用ミックス(ホットスタートプロトコル)(２５μＬ)：
３μＬのＨ2Ｏ；２.５μＬの１０×オプチパフォーム（OptiPerform(登録商標)）III緩衝液（pH９.２）；１０μＬの１.２５mM ｄＮＴＰ(＝２００μＭ)；
１.５μＬの前進プライマー（２０pmol／μＬ）；１.５μＬの逆方向プライマー（２０pmol／μＬ）；１.５μＬの５０mg ＭｇＣｌ2（＝１.２５mM）；５μＬの５×オプチザイム（OptiZyme(登録商標))エンハンサー
【００５４】
アッパー試薬用混合物（３５μＬ）：
２３μＬのＨ2Ｏ；３.５μＬの１０×オプチパフォーム（OptiPerform(登録商標)）III緩衝液；１.５μＬの５０mM ＭｇＣｌ2；０.５μＬのパワースクリプトＤＮＡポリメラーゼ；７μＬの５×オプチザイム（OptiZyme(登録商標)）エンハンサー。
【００５５】
ＰＣＲプログラム（ホットスタート）：
１．９４℃で１分
２．９４℃で１分
３．５０〜５５℃（プライマーによる）で１.５分
４．６９〜７２℃（ポリメラーゼによる）で４分
５．２番から２７回繰り返す
６．４℃∞
７．終了
【００５６】
アンプリタック（AmpliTaq）ポリメラーゼ（Perkin Elmer）用プロトコル：
アッパー試薬用ミックス（ホットスタートプロトコル）(５０μＬ)：
１８.１μＬのＨ2Ｏ；４.２μＬの１０×緩衝液II；１６.７μＬのｄＮＴＰ；２.５μＬの前進プライマー；２.５μＬの逆方向プライマー；６μＬの２５mM ＭｇＣｌ2(＝１.５mM）。
ローワー試薬用ミックス(５０μＬ)：
４２μＬのＨ2Ｏ；５μＬの１０×緩衝液II；１μＬのアンプリタック（AmpliTaq）ポリメラーゼ；２μＬの鋳型。
【００５７】
ＤＮＡの精製
ＰＣＲ反応物の精製：ＰＣＲ増幅生成物の精製はキット（High Pure PCR Product Purification Kit(Roche))を用いて実施した。
フェノール抽出：サンプル容積をＴＥ緩衝液で２００μＬにする。２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、混合し、最大速度で１分間遠心する。上部相を新しいエッペンドルフ試験管に移し、２００μＬのクロロホルム／イソアミルアルコールを加え、混合し１分間遠心する。上部相を取り出しエタノールで沈殿させる。
【００５８】
エタノール沈殿：約２００μＬのサンプル容積に５μＬの５Ｍ ＮａＣｌおよび２０μＬの３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５.７）をピペットで加える。２.５容の１００％エタノールを添加して混合し、少なくとも３０またはそれ以上−２０℃で静置する。４℃で１０分間遠心し、ペレットを１７０μＬの７０％冷エタノールで洗浄する。３分間遠心し、ペレットを３７℃で乾燥させ、さらに３０μＬのＨ2Ｏに再懸濁させる。
【００５９】
大腸菌（E. coli）のプラスミドＤＮＡの単離：大腸菌オーバーナイト培養のプラスミドＤＮＡの単離はキアゲン(Qiagen）のプロトコル（QIApre Spin Miniprep Kit Orotocl)を用いて実施した。
【００６０】
サッカロミセスセレビシエのＤＮＡの調製：
前記酵母細胞を１０mLのＹＰＤで一晩３０℃でインキュベートし、次の朝、３０００rpmで１０分間遠心し、ペレットを１Ｍソルビトール、０.１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７.５）の５００μＬに再懸濁し、エッペンドルフ試験管に移す。５０μＬのザイモラーゼ（zymolase）（ソルビトール／ＥＤＴＡ中に５mg／mL）を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、さらに１分間遠心する。５０mMトリス、２０mMのＥＤＴＡ（ｐＨ７.４）５００μＬにペレットを再懸濁する。５０μＬの１０％ＳＤＳを添加し、完全に混合し、さらに６５℃で３０分間インキュベートする。５ＭのＫＡｃ２００μＬを加え、氷上に１時間置き、１
０分間遠心する。上清（約６５０μＬ）を新しいエッペンドルフ試験管に移し、１容量のイソプロパノールを加え、穏やかに混合し、さらに５分間静置する。簡単に遠心するか、または沈殿したＤＮＡをガラスのかぎ棒で抜き取り、空気中で前記ペレットを乾燥させる。ペレットまたはＤＮＡを１５０μＬのＴＥ緩衝液に再懸濁し、６５℃で１０分間溶解させる。
ＤＮＡクローニング：全てのＤＮＡクローニングは標準的なプロトコルにしたがって実施した。
【００６１】
酵母の形質転換（酢酸リチウム法）：
形質転換しようとする酵母株を５ｍＬの適当な培養液中で一晩３０℃でシェーカー上でインキュベートする。次の朝前記オーバーナイト培養を適当な培養液で希釈し（ＯＤ600＝０.４０.５）、さらに２時間シェーカー上で３０℃でインキュベートする（ＯＤ600＝０.４０.８）。２５００rpmで３分間遠心し、２５mLの滅菌Ｈ2Ｏでペレットを洗浄する。２５００rpmで３分間遠心し、１mLのＬＩＴＥ（１００mMのＬｉＡｃ，ＴＥ（ｐＨ７.５))に再懸濁し、懸濁液をエッペンドルフ試験管に移す。ＲＴで５分間インキュベートし、１５秒間遠心する（Quickspin）。１００mMのＬｉＡｃ １mLでペレットを洗浄し（quick-spin）、細胞濃度に応じてペレットを２００４００μＬの１００mM ＬｉＡｃに再懸濁して５０μＬの部分標本に分ける。
【００６２】
表示の順番どおりに以下を加える：
２４０μＬのＰＥＧ（５０％）、ピペットで穏やかに懸濁物を混合する；
３６μＬの１Ｍ ＬｉＡｃ、ピペットで穏やかに懸濁物を混合する；
１０μＬの一本鎖精子ＤＮＡ（−２０℃で保存；使用前に８０−９０℃で１０分間加熱してから氷に移す）；
２〜３μｇのプラスミドＤＮＡ（またはノックアウトトランスフォーメーションの場合には８〜１０μＬのミニプレップ（Miniprep))、ピペットで穏やかに懸濁物を混合し；
形質転換反応物をオーバーヘッド回転装置で低速で３０℃３０分間インキュベートする；
４２℃１５分間形質転換反応；
クィックスピンで遠心、ペレットを２００μＬのＴＥ緩衝液に再懸濁（ノックアウトの場合は３００μＬのＹＰＤにペレットを再懸濁）し、オーバーヘッド回転装置で３０℃で４時間インキュベートする；
寒天平板当たり１００μＬ（ノックアウトのばあいは全反応物）を平板培養し、３０℃で３〜４日間インキュベート。
【００６３】
配列決定：ＡＢＩＰＲＩＳＭ(登録商標) ｒｅｄ．プロトコルII／AmpliTaq(登録商標) ＦＳ1/4ＢｉｇＤｙｅターミネーター
【００６４】
反応物：
プレミックス ２μＬ
ＤＮＡ鋳型
ｓｓＤＮＡ ５０ｎｇ
ｄｓＤＮＡ ２５０ｎｇ
ＰＣＲ生成物（０．２−５ｋＢ） １０−５０ｎｇ
プライマー ３〜１０ｐｍｏｌ
Ｈ2Ｏで最終容積 １０μＬ
【００６５】
サーモサイクラープロトコル（２５サイクル）：
１．９６℃で１５秒間
２．９６℃で１５秒間
３．５５℃で１０秒間
４．６０℃で４分間
５．２．に戻って２４サイクル
６．４℃∞
７．終了
【００６６】
精製反応（セントリセップスピンカラム（Centri Sep Spin Colum）(Princeton Separations))：
カラムを７５０μＬのＨ2Ｏで３０分間予め膨潤させ、液体を排出させて２分間３０００rpmで遠心する。反応物をＨ2Ｏで２０μＬにしてカラムに適用し、２分間３０００rpmで遠心する。
サンプル適用：配列決定試験管に、４μＬのセントリセップ（Centri Sep)溶出液＋２０μＬのＴＳＲ（鋳型抑制試薬）、９０℃で２分間。
【００６７】
サザンブロット：
ＤＮＡプローブを適当な制限酵素で消化、ゲル電気泳動で分離し、ゲルから抽出する。ゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で一晩消化し、ゲル電気泳動で分離する（１％アガロースゲル）。
【００６８】
ゲルの前処理：アガロースゲルからローディングウェルを取り出す。アガロースゲルを０.２５ＭのＨＣｌで１５分間脱プリン処理し、続いて蒸留水で２回洗浄する。アガロースゲルを０,５ＭのＮａＯＨで３０分間変性させ、ヴァキュームブロッターモデル785（Vaccum Blotter Model 785, BioRad）を用いてビニールシートの中央に移し、ウィンドー（ウィンドーシール）を切り取り、ナイロン膜と濾紙の端を切り揃え（各々の事例でゲルより０.５cm小さい）、ナイロン膜の端を蒸留水で湿らし（各々の事例でビニールシートの小窓より０.５cm広い）、続いてナイロン膜および濾紙をトランスファー溶液で湿らす。
【００６９】
装置の構築（下から上へ）：
ベースユニット、真空土台部、多孔性真空スラブ、濾紙、ナイロン膜、ビニールウィンドー、アガロースゲル、最終フレーム、蓋。
バイオラッド（BioRad）真空ポンプを１０分間予熱し、真空を適用する（１６９３２Ｐａ（５インチＨｇ))。
端に沿ってゲルを穏やかに圧迫する。
トランスファー溶液（約１Ｌ、１０×ＳＳＣ）を上部液だめに入れる；移動時間：９０分；真空のスイッチを切り、ナイロン膜を取り出し、５分間２×ＳＳＣで洗浄し、続いて濾紙の間で風乾させる。ＤＮＡ固定：ナイロン膜をＵＶ透過性の密着フィルム上に置き、陽性コントロールとして端にプローブを適用する；ＵＶストラタリンカーに入れ架橋を開始させる（１２０００００Ｊ→０）；膜は粘着フィルム内またはワットマン濾紙の間で室温または４℃で保存することができる。
【００７０】
ジーンイメージ・ランダムプライムラベリングモジュール（Amersham)：
ＤＮＡプローブの標識：ＤＮＡプローブを９６℃で５分間変性させ（ヒートショック）、その後氷上に置く。１０μＬの反応ミックス（ヌクレオチドミックス（５×）、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）中のフルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２−メルカトエタノールおよびＭｇＣｌ2）；５μＬのプライマー（Random Nonamers）、１μＬの酵素溶液（クレノーフラグメント、５単位／mL）；２２μＬの変性ＤＮＡプローブ；１２μＬのＨ2Ｏ。２時間３７℃でインキュベートし、２μＬのＯ.５Ｍ ＥＤＴＡ（＝２０mM）を添加し、部分標本を−２０℃で保存する。標識効率の確認：５×ヌクレオチドミックスをＴＥ緩衝液で１／５、１／１０、１／２５、１／５０、１／１００、１／２５０および１／５００に希釈し；ナイロン膜の細片に５μＬの
ＤＮＡプローブを５μＬの１／５希釈と一緒に適用してさっと吸収させ、予め温めておいた２×ＳＳＣで６０℃で１５分間洗浄し；１／５希釈を除いた残りの溶液を参照用膜細片に適用し、両方の膜細片をＵＶ光の下で観察し、サンプルの濃さを決定する。
【００７１】
ハイブリダイゼーション：ナイロン膜（ブロット）を温かいハイブリダイゼーション緩衝液（０.３mL／cm2）で、回転オーブンで６０℃２時間予備ハイブリダイズさせ；緩衝液を除きその１０mLを残す。ＤＮＡプローブを変性させ（９６℃で５分間、続いて氷上で冷却）；プローブを前記１０ｍＬの緩衝液とともにブロット上に加え、回転オーブンで６０℃で一晩ハイブリダイズさせる。
【００７２】
洗浄工程：
温かい１×ＳＳＣ，０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中でプラットフォームシェーカー上で１５分；温かい０.５×ＳＳＣ，０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中でプラットフォームシェーカー上で１５分。
【００７３】
ジーンイメージ・ＣＤＰ−スターディテクションモジュール（Amersham）：
停止および抗体反応：シェーカーの上で、緩衝液Ａ中の停止試薬１／１０希釈中で１時間室温でブロットをインキュベートする。抗体溶液（アルカリ性ホスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体、５０００×）を０.５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／緩衝液Ａでブロットシールと一緒に金属薄片中で希釈し、さらにシェーカー上で１時間室温でインキュベートする。１０分間緩衝液Ａ中の０.３％トゥイーン（Tween）２０で３回洗浄して未結合抗体溶液を除去する。
【００７４】
シグナル発生および検出：洗浄緩衝液を排出し、ブロットを密着フィルム上に置き、５mLの検出試薬を適用し、２〜５分反応させ、再度排液し（アルカリ性ホスファターゼは発光を引き起こす）；密着フィルムで包み、暗室の赤色光の中でフィルム（ハイパーフィルム(Hyperfilm(登録商標)MP, Amersham）を用い、フィルムカセット（BioMax, Kodak）中で０.５〜２時間露光させ、現像してスキャンする。ブロットは４℃で密着フィルム中で保存できる。
【００７５】
実施例１：特異的欠失カセットの構築
欠失は全て標準的な方法によって実施した（G.R. Fink et al.,1991; A. Wach et al.,1994; U. Guldener et al.,1996; A.L. Goldstein et al.,1999）。
各々約５００ｂｐのフラグメント（それぞれは遺伝子の初めと終わりの領域をもつ）を以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた：ＴＲＫ１の場合はTRK1-FL-BamHI-Fo、 TRK1-FL-PstI-Re、 TRK1-FL-PstI-FoおよびTRK1-FL-XhoI-Re、 ＴＲＫ２の場合はTRK2-DEL-5-Fo-B、 TRK2-DEL-5-Re、 TRK2-DEL-3-FoおよびTRK2-DEL-3-Re、 並びにＴＯＫ１の場合はTOK1-DEL-5-Fo、 TOK1-DEL-5-Re、 TOK1-DEL-3-FoおよびTOK1-DEL-3-Re（２.３章参照）。増幅させた末端は後の酵母ゲノムへの正確な組み込みを可能にする。酵母株ｗ３０３ａ／αまたはｗ３０３ａ／αΔｔｒｋ１はＤＮＡ鋳型として機能する。
【００７６】
実施例２：単一、二重、三重変異体の構築
実施例２ａ：単一ノックアウト
ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のための構築欠失カセットでそれぞれ二倍体酵母株ＹＭ９６（ＭＡＴａ／ＭＡＴα）を形質転換した。ゲノムへの欠失カセットの組み込みは、（−）ＵＲＡ／Ｇｌｃでｔｒｋ１変異体（ＹＭ１２３／１２４）を、さらにＹＰＤ／ジェニチシンでｔｒｋ２変異体（ＹＭ１５８−１６１）およびｔｏｋ１変異体（ＹＭ１５４−１５７）を増殖させることによって確認した。なぜならば、ＴＲＫ１欠失カセットのＵＲＡ３マーカーは（−）ＵＲＡ培地での増殖を可能にし、ＴＲＫ２またはＴＯＫ１のＫＡＮマーカーはゲネチシン（geneticin）での増殖を可能にするからである（G.R. Fink et
al.,1991）。陽性コロニーを胞子形成平板にレプリカ平板培養により移し、ここで栄養成長を行わずに１８−２４時間後にＭＡＴａ／ＭＡＴα二倍体細胞は胞子を形成する。それらをザイモラーゼで処理し、再びＹＰＤ上で増殖させた後、解剖顕微鏡を用いていくつかのコロニーの四分子を個々の４つの胞子に分割する。
【００７７】
胞子コロニーの交配型を交配テスター株との交配によって決定した（G.R. Fink et al.,1991）。欠失カセットの有無についての選別は、ｔｒｋ１については−ＵＲＡ培地、ｔｒｋ２およびｔｏｋ１についてはゲネチシン含有培地でのレプリカ平板培養によって実施した。酵母のＤＮＡ調製によって形質転換体のゲノムＤＮＡを得た後で、結果を診断用ＰＣＲおよびサザンブロットによって確認した。
【００７８】
実施例２ｂ：二重ノックアウト
ＴＯＫ１欠失カセットで一倍体Δtrk1酵母株ＹＭ１２３およびＹＭ１２４を形質転換し、ＹＰＤ／ゲネチシンでの増殖によりＴＯＫ１欠失カセットの組み込みについて選別した。結果は診断用ＰＣＲおよびサザンブロットにより確認した。グリセロール培養は以下の株を用いて実施した：（＋）ＵＲＡ３、（＋）ＫＡＮ）（Δtrk1Δtok1)株（ＹＭ１４０、ＹＭ１４１、ＹＭ１４３およびＹＭ１４４）。単一コロニーをパッチとして画線培養し、５−ＦＯＡ上にレプリカ培養し、ＴＲＫ１欠失カセットからＵＲＡ３マーカーおよびｈｉｓＧリピートを排除したコロニーを選別した（G.R. Fink et al.,1991）。したがって、ウラシル合成のためのＵＲＡ３遺伝子（ＴＲＫ１で）を欠いたコロニーはいずれも（−）ＵＲＡ／Ｇｌｃでは増殖せず、一方、ＴＯＫ１欠失カセット中の耐性遺伝子により全てのコロニーがＹＰＤ／ｇｅｎ上で生存する。ゲノムからＫａｎマーカーを除去するために、（−）ＵＲＡ３変異体をプラスミドｐＳＨ４７で形質転換した。前記ｐＳＨ４７にはＣｒｅリコンビナーゼおよびウラシル合成（ＵＲＡ３）のための遺伝子が存在する。陽性形質転換体は（−）ＵＲＡ／Ｇｌｃで増殖し、したがって（−）ＵＲＡ／Ｇａｌ液体培地でのインキュベーションによってＣｒｅリコンビナーゼを誘発することが可能であった。この方法で、Ｋａｎマーカーは１つのｌｏｘＰリピートとともに排除され、１つのｌｏｘＰは保持される。
【００７９】
オーバーナイト培養でＯＤ600＝５となった後で、１：１００００および１：５００００の希釈を（−）ＵＲＡ／Ｇａｌで平板培養した。ＹＰＤ／ｇｅｎでレプリカ培養した単一コロニーパッチは増殖を示さなかった（これはＫａｎマーカーの排除は成功であったことを示している）。プラスミドｐＳＨ４７を除去するために、その後、細胞を５−ＦＯＡで２回選別を繰り返した。グリセロール培養は（−）ｕｒａ（−）ｋａｎ（Δtrk1Δtok1)株（ＹＭ１６２、ＹＭ１６３およびＹＭ１６４）を用いて実施した。
【００８０】
実施例２ｃ：三重ノックアウト
ＹＰＤでのオーバーナイト培養を単一Δtrk1Δtok1コロニー（ＹＭ１６２およびＹＭ１６４）を用いて開始し、次の日、BsiWI/SpeI消化ＴＲＫ２欠失カセットで形質転換し、ＹＰＤ／ＫＣｌ／ジェネチシンで平板培養した。酵母ＤＮＡを調製した後、この三重ノックアウトを診断用ＰＣＲおよびサザンブロットで確認した。
【００８１】
【００８２】
実施例３：ヒトカリウムチャネルのサブクローニング並びに二重および三重変異体の形質転換
ヒト遺伝子ＨＥＲＧ、ＨＣＮ２、Ｋｖ１．５および陽性コントロールとしてＴＲＫ１、ＩＲＫ１（モルモット）をそれらを含むプラスミド（HERGはpcDNAのBamHI間に、 HCN2はpTLNのNcoI/XhoI間に、 Kv1.5はpcDNA3.1(-)のNheI/EcoRI間に、 IRK1はpSGEMのBamHI/EcoRI間に存在）から制限酵素を用いて切断して切り出し、ゲル電気泳動によって分離し、さらにゲルから抽出した。個々のヒトカリウムチャネルを酵母ベクターｐ４２３−ＧＰＤ３（D. Mumberg et al.,1995; V. Ronicke et al.,1997）に連結し、大腸菌を形質転換した。プラスミド調製物のコントロール消化および配列決定によって前記のヒト遺伝子が組み込まれたクローンを特定することができた。続いてこれらのプラスミドでΔtrk1Δtrk2二重ノックアウト(YM168)およびΔtrk1Δtrk2Δtok1三重ノックアウト(YM182)を形質転換し、 （−）ＨＩＳ／８０ｍＭＫＣｌ上で平板培養した。
【００８３】
実施例４：ノックアウト株の性状決定
実施例４ａ：種々のＫ+濃度およびｐＨ値の培養平板上での二重および三重変異体の増殖
種々のノックアウトのカリウム要求の相違を比較するために、酵母株ＹＭ１８２、ＹＭ１６８およびＹＭ９７（ＷＴ）を、種々のＫ+濃度およびｐＨ値をもつＤＰＭ平板でインキュベートした。この目的のために、グリセロール培養のパッチを先ず最初に１００mM ＫＣｌ／ｐＨ６.５に画線培養した。２日間増殖させた後、５０mM、３０mMおよび５mM ＫＣｌでレプリカ平板培養を実施した。
この実験によって、ＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の両株は５０mMおよび３０mMのＫＣｌで生存可能であることが示された。さらに、ＹＭ１８２株はＹＭ１６８株よりも３０ｍＭのＫＣｌの存在下でより良好に増殖することが判明した。この２つの株のいずれも、野生型株ＹＭ９７とは対照的に５ｍＭのＫＣｌの存在下で生存できなかった。
【００８４】
ｐＨ依存性を調べるために、前記３株をさらに１００mMおよび５mM ＫＣｌ／ｐＨ５.０並びに１００mMおよび５mM ＫＣｌ／ｐＨ４.０上でレプリカ平板培養した。この実験は、
ＹＭ１６８およびＹＭ１８２はいずれもｐＨ４.０では１００mM ＫＣｌでも５mM ＫＣｌでも生存できないことを示した。ｐＨ５.０で１００mM ＫＣｌでは、ＹＭ１６８の増殖欠損はＹＭ１８２の場合よりも激しい。ベクターpRS416GALのＴＲＫ１の発現は、ＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の増殖欠損を完全に補完する。
【００８５】
実施例４ｂ：種々のＫ+濃度の液体培地での二重および三重変異体の増殖
ＹＭ１６８株（Δtrk1Δtrk2）およびＹＭ１８２株（Δtrk1Δtrk2Δtok1）（以後の全ての実験はこれらを基準にしている）の性状を調べるために、これら酵母株の液体培養中の増殖態様を調べた。最初に、オーバーナイト培養をＤＰＭ／８０mM ＫＣｌ中で開始させ、次の朝、ＤＰＭ／５mM ＫＣｌおよびＤＰＭ／１５mM ＫＣｌで前記培養をＯＤ＝０.０５にした。それぞれ規定の間隔後に６００nmでの光学密度を光度計により決定した。
これらの実験によって、ＹＭ１８２株の増殖欠損は、５mM ＫＣｌおよび１５mM ＫＣｌではＹＭ１６８よりも強くないことが判明した。
【００８６】
実施例５：二重および三重ノックアウトのヒトカリウムチャネルの性状決定
実施例５ａ：培養平板のＫ+欠乏の補完能力
ＹＭ１６８（Δtrk1Δtrk2)およびＹＭ１８２（Δtrk1Δtrk2Δtok1）の各株を、酵母発現ベクターとしてｐ４２３−ＧＰＤ３中のヒトカリウムチャネルＫｖ１.５（(D. Fedida et al.,1998)；YM190およびYM195）およびＨＥＲＧ１（(D. Fedida et al.,1998)；YM191およびYM196）でそれぞれ形質転換した。ｇｐＩＲＫ１（W. Tang et al.,1995)；YM193およびYM198）は酵母発現ベクターｐ４２３−ＧＰＤ３中の陽性コントロールとして機能した（D. Mumberg et al.,1995; V. Ronicke et al.,1997）。ブランクベクターｐ４２３−ＧＰＤ３（YM189およびYM194）は陰性コントロールとして機能した。形質転換酵母株を（−）ＨＩＳ／８０mM ＫＣｌ上で平板培養した。この後、単一コロニーのパッチをＤＰＭ／５mM ＫＣｌ（ｐＨ６.５）上でレプリカ平板培養し、カリウム欠乏を補完する能力を調べた。
【００８７】
これらの実験によって、ｐ４２３−ＧＰＤ３の陽性コントロールｇｐＩＲＫ（YM193およびYM198）は完全に二重および三重ノックアウトの増殖欠損を補完することが示された。陰性コントロールとしてのブランクベクターｐ４２３−ＧＤＰ３（YM189およびYM194）はこの増殖欠損を補完することができない。ヒトカリウムチャネルＫｖ１.５は三重ノックアウトの増殖欠損を補完するが、陽性コントロールｇｐＩＲＫよりはるかに効率が悪い。さらにまた、ヒトカリウムチャネルＫｖ１．５は二重ノックアウトΔtrk1Δtrk2を補完しない。与えられた実験条件下では、ＨＥＲＧチャネルは二重および三重ノックアウトの増殖欠損を補完しない。
【００８８】
実施例５ｂ：活性化物質が存在する培養平板での増殖
種々のカリウムチャネルに対する活性化物質の作用を示すために、上記の株を以下の特定の活性化物質を含む培地中でインキュベートした。
Ｋｖ１.５：Ｒｂ+は過分極相を延長させる。これは、内向きのＫ+の流れはより長く続き、増殖欠損を補完する可能性を高めることを意味している。
ＨＥＲＧ：Ｃｓ+は過分極相を延長させる。これは、内向きのＫ+の流れはより長く続き、増殖欠損を補完する可能性を高めることを意味している。このチャネルはＣｓ+によって抑制される。
ＩＲＫ１：Ｃｓ+はこのチャネルを阻害する。
ｐ４２３−ＧＰＤ３−Ｋｖ１.５を用いた実験によって、ヒトＫｖ１.５チャネルは、２mM ＲｂＣｌの存在下でΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体の増殖欠損を完全に補完できることが示された（図３）。Δtrk1Δtrk2変異体の増殖欠損の補完は極めて効率が低い（図３）。これは実施例６ａで示される結果と一致する。
ｐ４２３−ＧＰＤ３−ＨＥＲＧを用いた実験によって、ヒトＨＥＲＧ１チャネルは、２ｍＭＣｓＣｌの存在下でΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体の増殖欠損を完全に補完できることが示された（図４）。Δtrk1Δtrk2変異体の増殖欠損の補完は極めて効率が低い（図４）。これは実施例６ａで示される結果と一致する。
【００８９】
実施例５ｃ：液体培養液中のＲｂＣｌの存在下におけるΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体のＫｖ１．５による補完
酵母株ＹＭ１９４およびＹＭ１９５を１ｍＭのＲｂＣｌを含むＤＰＭ／−ＨＩＳ／５ｍＭＫＣｌ中で液体培地における増殖態様の相違について調べた。この目的のために、１０mLのオーバーナイト培養をＤＰＭ／−ＨＩＳ／８０mM ＫＣｌ中で開始し、次の朝対応する培養液を用いてＯＤ600を０.０５にした（最終容積：２０mL）。６００nmでの光学密度は規定の間隔で光度計により測定した。
これらの実験は、ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を欠く酵母株におけるベクターｐ４２３−ＧＰＤ３のＫｖ１.５の発現は前記によってもたらされた増殖欠損を補完することができることを明瞭に示した。
さらに別の実験で、Ｋｖ１.５およびｇｐＩＲＫによる増殖欠損の補完は２mMのＣｓＣｌの存在下で抑制されることが示された。
【００９０】
実施例５ｄ：液体培地中のＣｓＣｌ存在下でのΔtrk1Δtrk2Δtok1変異体におけるＨＥＲＧ1チャネルによる補完
酵母株ＹＭ１９4およびＹＭ１９６を１mMのＣｓＣｌを含むＤＰＭ／−ＨＩＳ／５mM ＫＣｌ中で液体培地における増殖態様の相違について調べた。この目的のために、１０mLのオーバーナイト培養をＤＰＭ／−ＨＩＳ／８０mM ＫＣｌ中で開始し、次の朝対応する培養液を用いてＯＤ600を０．０５にした（最終容積：２０mL）。６００nmでの光学密度は規定の間隔で光度計により測定した。
これらの実験は、ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を欠く酵母株におけるベクターｐ４２３−ＧＰＤ３のＨＥＲＧ１の発現は前記によってもたらされた増殖欠損を補完できることを明瞭に示した。
【００９１】
実施例６：
三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1における全ての増殖アッセイは、各事例で表示したｐＨおよびカリウム濃度で増殖培地ＤＰＭ（規定カリウム培地）で実施した。
ヒトＨＥＲＧ１Ｋ+チャネルの阻害物質として用いられた物質は、テルフェナジン（α−（４−tert−ブチルフェニル）−４−（α−ヒドロキシ−αフェニルベンジル）−１−ピペリジンブタノール；ＨＭＲ)、 ピモジド（１−（４,４−bis（Ｐ−フルオロフェニル）ブチル）−４−（２−オキソ−１−ベンゾイミダゾリニル）−ピペリジン；Sigma, Cat.No.P100）、ジプラシドン（５−（２−［４−（１,２−ベンゾイソチアゾール−３−イル）ピペラジノ］−エチル）−６−クロロ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン；ＨＭＲ）、ロラタジン（エチル４−（８−クロロ−５,６−ジヒドロ−１１Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２−ｂ−］ピペリジン−１１−イリデン）−１−ピペリジンカルボキシレート；ＨＭＲ）およびセルティンドール（１−（２−［４−［５−クロロ−１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−１−ピペリジニル］エチル）−２−イミダゾリジノン；ＨＭＲ）であった（E. Richelson, 1996; E. Richelson, 1999; E. Delpon et. al.,1999; T. Kobayashi et al.,2000; M.D. Drich et al.,2000）。カリウムチャネルに対して抑制作用をもたないはずの物質、ジフェニルヒドラミン（Sigma, Cat.No.D3630）およびフェキソフェナジン（４−［ヒドロキシ−４−［４−(ヒドロキシジフェニルメチル)−１−ピペリジニル］ブチル］−α，α−ジメチルベンゼン酢酸ヒドロクロリド；ＨＭＲ）（M. Taglialatela et al.,1999; L.M. DuBuske, 1999）もまた用いた。全ての物質はＤＭＳＯに溶解し、最終濃度３０μＭで使用した。コントロールとして、前記物質を含まない０．５％の同じ最終濃度のＤＭＳＯを有する細胞、
ＤＭＳＯが添加されていない細胞、物質が添加されていない細胞を測定した。
【００９２】
図１および２に示したように、ヒトＨＥＲＧ１チャネルは、５mM ＫＣｌのみを含む培地で三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができる。テルフェナジン、ピモジド、ジプラシドン、セルティンドールおよびロラタジンの存在下では、ヒトＨＥＲＧ１チャネルは、もはや５mM ＫＣｌのみを含む培地では三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができない。
【００９３】
実施例７：
酵母の３つの内在性カリウムチャネル蛋白質を全て発現する野生型株をテルフェナジン、ピモジド、ジフェニルヒドラミン、ジプラシドン、ロラタジン、フェキソフェナジンおよびセルティンドールとともにインキュベートしたとき、テルフェナジン、ロラタジンおよびセルティンドールはヒトＨＥＲＧ１チャネルの特異的阻害物質であることが示された（図９）。
【００９４】
この結果によれば、ピモジドおよびジプラシドンはむしろ非特異的阻害物質であると考えるべきである。このことは、これらの物質はおそらくヒトＨＥＲＧ１チャネルだけでなくサッカロミセスセレビシエの内在性カリウムチャネルもまた抑制することを意味している。しかしながら、この結果は、これら物質について認められた抑制作用は、酵母細胞の増殖に必須の他の物質の抑制に起因する可能性を排除することができなかった。この可能性を調べるために、８０mMのＫＣｌを含む増殖培地でこれらの物質の作用も調べた。
【００９５】
これらの結果（図１０）によって、ピモジドは、非特異的態様で内在性カリウムチャネルＴＲＫ１およびＴＲＫ２の活性を抑制することが明らかになった。より高いカリウム濃度で抑制作用が認められないことによって、ピモジドは酵母細胞で不変的な毒性作用をもたないと結論することができる。対照的に、ジプラシドンはより高いカリウム濃度でさえ酵母細胞の増殖を抑制し、したがってサッカロミセスセレビシエに対する毒性作用をもつことが明らかになった。この作用に必須である酵母の標的蛋白質はまだ特定されていない。
結論として、上記の実験は、前述の系によって、ヒトカリウムチャネルを特異的に抑制する物質を実際にサッカロミセスセレビシエで特定することができることを示した。
前記の結果は図１０に示されている。
【００９６】
実施例８：
ヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１およびＫｖ１.５は二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完しない（図１１および図１２）。
結果：図１１および図１２
図１１および１２は、ヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１およびＫｖ１.５は二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完しないことを示している（各事例について図１１および１２の第４の部分）。陰性コントロール、すなわち三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1におけるブランクベクターｐ４２３ＧＰＤ（各事例について図１１および１２の第１の部分）と比較したとき、増殖が改善されていないことが示されている。二重変異体Δtrk1Δtrk2の陰性コントロールｐ４２３ＧＰＤは表示されていないが、三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の陰性コントロールｐ４２３ＧＰＤと異ならない。対照的に、ヒトカリウムチャネルＨＥＲＧ１およびＫｖ１.５は三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完する（各事例について、図１１および１２の第三の部分）。
【００９７】
実施例９：
ヒトカリウムチャネルＲＯＭＫ２((M.E. Shuck et al.,1994; J.H. Bock et al.,1997)；配列番号３１、ｈＲＯＭＫ２）を酵母ベクターｐ４２３ＧＰＤでサブクローニングし、
三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1を形質転換した。この実験によって、前記ヒトカリウムチャネルもまた三重変異体Δtrk1Δtrk2Δtok1の増殖欠損を補完することができることが示された。
このヒトカリウムチャネルが二重変異体Δtrk1Δtrk2の増殖欠損を補完できるか否かはまだ調べられていない。ＲＯＭＫ２チャネルを特異的に抑制する物質はまだ判明していない。
前記の結果は図１３に示されている。
【００９８】
【表１】
【００９９】
【表２】
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
【表８】
【０１０６】
【表９】
【０１０７】
【表１０】
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】
【表１２】
【０１１０】
【表１３】
【０１１１】
【表１４】
【０１１２】
【表１５】
【０１１３】
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【０１１４】
【０１１５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定する方法であって、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。
【請求項２】
変異サッカロミセスセレビシエ細胞（Δtrk1、Δtrk2、 Δtok1）で遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のスイッチが切られている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
真核細胞カリウムチャネルがヒトカリウムチャネルである請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
真核細胞カリウムチャネルがＨＥＲＧ１、Ｋｖ１.５またはｇｐＩＲＫ１である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
真核細胞カリウムチャネルが変異している請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
真核細胞カリウムチャネルが酵母の発現プラスミドに存在する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
変異サッカロミセスセレビシエ細胞が増殖レポーターを構成的に発現する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
真核細胞カリウムチャネルに対して作用を及ぼす被検物質が変異サッカロミセスセレビシエ細胞の増殖を抑制する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用が、変異サッカロミセスセレビシエ細胞の細胞数を測定することによって決定される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞数が、構成的に発現された増殖レポーターの蛍光または化学発光により決定される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１が発現されない変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１２】
遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のスイッチが切られている変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１３】
DSM13197として寄託された変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１４】
サッカロミセスセレビシエ細胞が真核細胞カリウムチャネルを異種発現する請求項１１〜１３のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１５】
真核細胞カリウムチャネルがヒトカリウムチャネルである請求項１１〜１４のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１６】
真核細胞カリウムチャネルがＨＥＲＧ１、Ｋｖ１.５またはｇｐＩＲＫ１である請求項１１〜１５のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１７】
真核細胞カリウムチャネルが変異している請求項１１〜１６のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１８】
カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現せず、前記遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１がノックアウトによって破壊されている変異サッカロミセスセレビシエ細胞の作製方法。
【請求項１９】
真核細胞カリウムチャネルの活性を抑制する物質を特定するための、請求項１１〜１７のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞の使用。
【請求項２０】
真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定する方法であって、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。
【請求項２１】
真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定する方法であって、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を前記真核細胞カリウムチャネルの阻害物質の存在下で被検物質と一緒にインキュベートし、そして
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。
【請求項２２】
請求項１１〜１７のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞を含む検査キット。
【請求項２３】
(ａ) 真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を利用して特定し
(ｂ) 前記阻害物質を知られている化学的方法によって製造または単離し、そして
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記阻害物質に添加することからなる医薬の製造方法。
【請求項２４】
(ａ) 請求項２０または２１に記載の方法を利用して真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定し
(ｂ) 前記活性化物質を知られている化学的方法によって製造または単離し、そして
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記活性化物質に添加することからなる医薬の製造方法。
【請求項１】
真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を特定する方法であって、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。
【請求項２】
変異サッカロミセスセレビシエ細胞（Δtrk1、Δtrk2、 Δtok1）で遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のスイッチが切られている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
真核細胞カリウムチャネルがヒトカリウムチャネルである請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
真核細胞カリウムチャネルがＨＥＲＧ１、Ｋｖ１.５またはｇｐＩＲＫ１である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
真核細胞カリウムチャネルが変異している請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
真核細胞カリウムチャネルが酵母の発現プラスミドに存在する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
変異サッカロミセスセレビシエ細胞が増殖レポーターを構成的に発現する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
真核細胞カリウムチャネルに対して作用を及ぼす被検物質が変異サッカロミセスセレビシエ細胞の増殖を抑制する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用が、変異サッカロミセスセレビシエ細胞の細胞数を測定することによって決定される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
細胞数が、構成的に発現された増殖レポーターの蛍光または化学発光により決定される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１が発現されない変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１２】
遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１のスイッチが切られている変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１３】
DSM13197として寄託された変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１４】
サッカロミセスセレビシエ細胞が真核細胞カリウムチャネルを異種発現する請求項１１〜１３のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１５】
真核細胞カリウムチャネルがヒトカリウムチャネルである請求項１１〜１４のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１６】
真核細胞カリウムチャネルがＨＥＲＧ１、Ｋｖ１.５またはｇｐＩＲＫ１である請求項１１〜１５のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１７】
真核細胞カリウムチャネルが変異している請求項１１〜１６のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞。
【請求項１８】
カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現せず、前記遺伝子ＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１がノックアウトによって破壊されている変異サッカロミセスセレビシエ細胞の作製方法。
【請求項１９】
真核細胞カリウムチャネルの活性を抑制する物質を特定するための、請求項１１〜１７のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞の使用。
【請求項２０】
真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定する方法であって、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を被検物質と一緒にインキュベートし、そして
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。
【請求項２１】
真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定する方法であって、
(ａ) ３つの内在性カリウムチャネルＴＲＫ１、ＴＲＫ２およびＴＯＫ１を発現しない変異サッカロミセスセレビシエ細胞を用い
(ｂ) 真核細胞カリウムチャネルを前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞で異種発現させ
(ｃ) 前記変異サッカロミセスセレビシエ細胞を前記真核細胞カリウムチャネルの阻害物質の存在下で被検物質と一緒にインキュベートし、そして
(ｄ) 前記真核細胞カリウムチャネルに対する被検物質の作用を決定する、上記方法。
【請求項２２】
請求項１１〜１７のいずれかに記載の変異サッカロミセスセレビシエ細胞を含む検査キット。
【請求項２３】
(ａ) 真核細胞カリウムチャネルの阻害物質を請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を利用して特定し
(ｂ) 前記阻害物質を知られている化学的方法によって製造または単離し、そして
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記阻害物質に添加することからなる医薬の製造方法。
【請求項２４】
(ａ) 請求項２０または２１に記載の方法を利用して真核細胞カリウムチャネルの活性化物質を特定し
(ｂ) 前記活性化物質を知られている化学的方法によって製造または単離し、そして
(ｃ) 生理学的に許容できる添加物を前記活性化物質に添加することからなる医薬の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−１０７０９（Ｐ２０１２−１０７０９Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９１２２９（Ｐ２０１１−１９１２２９）
【出願日】平成２３年９月２日（２０１１．９．２）
【分割の表示】特願２００１−５５１１０３（Ｐ２００１−５５１１０３）の分割
【原出願日】平成１３年１月５日（２００１．１．５）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２日（２０１１．９．２）
【分割の表示】特願２００１−５５１１０３（Ｐ２００１−５５１１０３）の分割
【原出願日】平成１３年１月５日（２００１．１．５）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
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