カルボキシペプチダーゼ遺伝子
【課題】醤油及び酵素分解調味料中に存在するペプチドを分解することができる新規なカルボキシペプチダーゼを提供する。
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼ。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質。新規カルボキシペプチダーゼは、タンパク質原料を効率良く分解し、アミノ化率を向上させることができる。
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼ。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質。新規カルボキシペプチダーゼは、タンパク質原料を効率良く分解し、アミノ化率を向上させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びカルボキシペプチダーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボキシペプチダーゼは、タンパク質のカルボキシ末端からアミノ酸を順次遊離させる酵素である。
これまでに哺乳類から微生物にいたるまで多くのカルボキシペプチダーゼの酵素学的性質が決定され、また、遺伝子についても解析されている。例えば、ヒトの膵臓由来（例えば、非特許文献１参照）、サッカロマイセス・セレビシエ由来（例えば、非特許文献２参照）、アスペルギルス・オリゼー由来（例えば、特許文献１〜２、非特許文献３参照）のものが知られている。
【０００３】
麹カビ（黄麹菌）であるアスペルギルス・オリゼーおよびアスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒などの、日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。
【０００４】
醤油製造の際に、原料の分解は、麹菌により生産されるプロテアーゼによってポリペプチドに分解され、更にポリペプチドからロイシンアミノペプチダーゼによりアミノ末端から、酸性カルボキシペプチダーゼによりカルボキシル末端から分解され、主にアミノ酸及びジペプチドから成る低分子ペプチドに分解される。これらの酵素が互いに補足しあって、多種類のペプチドを分解できるようになっており、高分子のタンパク質を完全に可溶化・分解・アミノ酸化するためは、カルボキシペプチダーゼが不可欠である。これは、大豆タンパク質にプロテアーゼだけで分解すると、窒素分の可溶化は著しいが、グルタミン酸およびその他のアミノ酸の生成がほとんどないのに対して、プロテアーゼにカルボキシペプチダーゼを添加し、分解することにより、窒素の可溶化が増加するとともに、グルタミン酸およびその他のアミノ酸の溶出が著しいことからも分かる（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
醤油及び酵素分解調味料中には未分解のペプチドが残存していることが知られている。カルボキシペプチダーゼがあれば、それらの醤油及び酵素分解調味料に残存するペプチドを速やかに分解することで、アミノ化率の向上、アミノ酸組成の変化による呈味性の改善に寄与することが期待される。そのため、麹菌からカルボキシペプチダーゼを得ることが強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２５０５８４号公報
【特許文献２】特許第４０７３９６２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ），１９８９年，第１７９巻，第３号，ｐ６０９−６１６，１９８９年
【非特許文献２】バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９７４年，第１３巻，第１９号，ｐ３８７１−３８７７
【非特許文献３】アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），１９９９年８月，第６５巻，第８号，ｐ．３２９８−３３０３
【非特許文献４】栃倉辰六郎，他，「醤油の科学と技術」，日本醸造協会，昭和６３年３月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、醤油及び酵素分解調味料中に存在するペプチドを分解することができる新規カルボキシペプチダーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び該形質転換体又は形質導入体を用いたカルボキシペプチダーゼの製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）由来のカルボキシペプチダーゼ遺伝子を単離し、構造決定し、カルボキシペプチダーゼ活性を確認し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、
１）以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
３）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
４）上記２）又は３）記載のカルボキシペプチダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
５）上記４）記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
６）上記５）記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からカルボキシペプチダーゼを採取することを特徴とするカルボキシペプチダーゼの製造法。
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のアスペルギルス・ソーヤ特有の新規なカルボキシペプチダーゼは、タンパク質原料を効率良く分解し、アミノ化率を向上させることができるので、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．カルボキシペプチダーゼ及びそれをコードする遺伝子。
本発明のカルボキシペプチダーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼである。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
（ａ）に示すタンパク質は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター−宿主系に導入して発現させることにより得られる。
なお、該タンパク質は、（ｂ）に示す通り、カルボキシペプチダーゼ活性を有する限り、（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。本発明において「複数」とは、アミノ酸残基のカルボキシペプチダーゼタンパク質の立体構造における位置又は種類によっても異なり、通常２〜３００個、好ましくは、２〜２００個、更に好ましくは、２〜５０個、最も好ましくは、２〜１０個を意味する。
【００１３】
そのような変異型カルボキシペプチダーゼ、すなわち上記（ｂ）のタンパク質は、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子の塩基配列に対して置換、欠損、挿入、付加又は逆位等の変異を導入して変異型カルボキシペプチダーゼ遺伝子を作製し、これを適当なベクター−宿主系に導入して発現させることにより得られる。
【００１４】
遺伝子への変異導入法としては、例えば、部位特異的変異誘導法、ＰＣＲによるランダム変異導入法、更には、遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去又は付加した後、遺伝子を連結する方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明のカルボキシペプチダーゼ遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子である。なお、本発明のカルボキシペプチダーゼ遺伝子は、（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＮａＣｌ濃度が５０〜３００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭであり、温度が４２〜６８℃、好ましくは６５℃以上での条件をいう。
上記（ａ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子の一例としては、配列番号１記載の塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。このＤＮＡは、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子である。
【００１６】
天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子は、アスペルギルス属に属する糸状菌の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型遺伝子をクローニングすることにより得られる。遺伝子のクローニング方法としては、例えば、糸状菌より染色体ＤＮＡを抽出し、アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列を参考として設計したプライマーを用いて染色体ＤＮＡよりＰＣＲにより目的のＤＮＡ断片を得る方法が挙げられる。
【００１７】
増幅されたＤＮＡを適当なプロモーター及びターミネーターに連結し、それを糸状菌のゲノム中に相同組み換えにて挿入する。使用するプロモーターには麹菌の場合、例えば翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子のプロモーター又はα−アミラーゼのプロモーター、アルカリプロテアーゼのプロモーターが利用出来る。
もしくは、増幅されたＤＮＡを適当なベクターに挿入して組み換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)等の市販のキットあるいは、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の市販のプラスミドベクターＤＮＡ、λＥＭＢＬ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。
【００１８】
得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を形質転換又は形質導入して、それぞれ形質転換体又は形質導入体を得る。形質転換は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９７９年，第６８巻，ｐ３２６−３３１）により行なうことができる。また、形質導入は、例えば、Ｂ．Ｈｏｈｎの方法（メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９７９年，第６８巻，ｐ２９９−３０９）により行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌の他、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌等の微生物や動物細胞、植物細胞等が利用できる。
【００１９】
上記で増幅されたＤＮＡの全塩基配列（配列番号１参照）は、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ ＭＯＤＥＬ ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社より購入）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）を用いて解析できる。塩基配列を、部分アミノ酸配列の情報と比較することにより、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子が取得できたか否かを確認することができる。
そして、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子の解析により、翻訳されるポリペプチド、すなわち、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列が確定される。
【００２０】
２．カルボキシペプチダーゼの製造法
本発明のカルボキシペプチダーゼを製造する場合は、先ず、カルボキシペプチダーゼ遺伝子をクローニングし、それをセルフクローニングによって自身の高発現プロモーター制御下で強制発現させればよい。高発現プロモーターは例えばアスペルギルス・ソーヤの場合、α−アミラーゼのプロモーター領域、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１プロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝しプロモーター領域等が利用出来る。
または、クローニングしたカルボキシペプチダーゼ遺伝子を用いて組み換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を作製し、これらを培養し、培養物からカルボキシペプチダーゼを採取すればよい。
【００２１】
本発明のカルボキシペプチダーゼ遺伝子を用いて、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質を生産するためには、好適なベクター−宿主系を選択する必要がある。そのような系としては、ｐＳＴ１４（モレキュラー アンド ジェネラル ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．），１９８９年，第２１８巻，ｐ９９−１０４）及び糸状菌〔アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）, アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）,アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）,アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）, ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）等〕の系、酵母発現ベクターＹＥｐＦＬＡＧ−１（ＳＩＧＭＡ社製）及び酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の系、大腸菌発現ベクターｐＴＥ（Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ社製）及び大腸菌エッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の系等が挙げられる。タンパク質への糖鎖付加がおこるという点で糸状菌又は酵母の系を使用することが好ましい。
【００２２】
組み換え体ＤＮＡは、カルボキシペプチダーゼ遺伝子を適当なベクターに挿入することにより得られる。ベクターとしては、市販品、例えば、酵母発現ベクターＹＥｐ−ＦＬＡＧ−１（ＳＩＧＭＡ社製）、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＵＲ１２３（宝酒造社製）、ｐＹＥＸ−ＢＸ、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＹＥＸ−４Ｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、大腸菌発現ベクターｐＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴＥ（Ｓｔｒａｇａｔｅｎｅ社製）等が使用できる。
【００２３】
次いで、該組み換え体ＤＮＡを宿主細胞に形質転換又は形質導入する。宿主細胞としては、大腸菌又は酵母の他、他の細菌、糸状菌、放線菌等の微生物あるいは動物細胞が使用可能である。
【００２４】
以上によりカルボキシペプチダーゼ生産能を有する形質転換体又は形質導入体が得られる。形質転換体又は形質導入体を培養するには、通常の固体培養法もしくは液体培養法を採用することができる。
【００２５】
宿主として麹菌を用いた場合、培地としては、例えば、醤油麹あるいはふすま麹等の固体培地もしくはＰＤ培地等の一般的な富栄養液体培地が使用できる。
麹菌を培養する場合は、固体培養においては２５〜３５℃、好ましくは３０℃前後で、２４〜４８時間静置培養する。液体培養においては２５〜３５℃、好ましくは３０℃前後で、２４〜４８時間通気攪拌条件により、振盪培養することが好ましい。
【００２６】
発現したカルボキシペプチダーゼを、Ｊ．Ｐ．Ｔ．Ｗ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｅｖｅｒｇｈらの方法（ジーン（Ｇｅｎｅ），１９９４年，第１５１巻，ｐ７３−７９）を一部改変した方法により精製できる。
麹菌の場合では、該形質転換麹菌を上記の適当な方法で培養後、固体培養の場合は麹を水又は適当な緩衝液にて、時折攪拌しながら１〜５時間抽出し、麹抽出液を得る。
【００２７】
液体培養では培養液を濾過もしくは遠心分離して培養上澄を得る。もしくは菌体を回収し、該菌体に細胞壁溶解酵素を加え充分に細胞壁を溶解させた後、遠心分離して上澄み液を得る。この上澄み液に硫酸アンモニウムを添加し塩析させ、更に、遠心分離して不溶性タンパク質を除きカルボキシペプチダーゼを含む粗酵素液を得る。
【００２８】
麹抽出液もしくは培養上澄、粗酵素液からフェニルセファロースカラム、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、ゲル濾過カラム、ＨＰＬＣを用いて、カルボキシペプチダーゼ活性画分を精製することにより精製されたカルボキシペプチダーゼを得ることができる。
【００２９】
なお、本発明における遺伝子工学的方法は、例えば、「モレキュラー クローニング：実験室マニュアル 第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），１９８９年，コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ＩＳＢＮ ０８７６９−３０９−６」等の記載に準じて実施可能である。
【００３０】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
形質転換宿主には、アスペルギルス・ソーヤ ＡＳＫＵＰＴＲ８株（ΔｐｙｒＧ、ｋｕ７０：：ｐｒｔＡ）（高橋理、他２名，モレキュラー ジェネティクス アンド ゲノミクス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），２００６年，第２７５巻，第５号，ｐ４６０−４７０、特開２００７−２２２０５５号公報参照）をもとにｐｙｒＧマーカーを用いてＡｄｅＡ遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤ ＫＵＡＤＥ＿１株（ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ、ａｄｅＡ：：ｐｙｒＧ）を用いた。
【００３２】
＜アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌におけるカルボキシペプチダーゼ相同遺伝子の検索＞
アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列から、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて相同性検索を行ったところ、１９１９塩基からなる推定オープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦという）を得た。該ＯＲＦをアスペルギルス・ソーヤ特有の新規カルボキシペプチダーゼ遺伝子の断片であると推定し、該遺伝子のクローニングを行った。
【００３３】
＜アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）からのゲノムＤＮＡ抽出＞
アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４６２５０株をバッフル付き三角フラスコにて、ＰＤ培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＮａＮＯ３、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％ カザミノ酸）で３０℃、２０時間振とう培養を行なった。
培養終了後、培養液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）で濾過して菌体を集めた。集めた菌体を滅菌水で洗浄した後、液体窒素中で凍結させ乳鉢を用いて物理的に磨砕し、細かい粉末状の菌体片とした。菌体片からＮｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（共にＰｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。全ての操作は添付のプロトコールに従った。
【００３４】
上記で得られたゲノムＤＮＡを鋳型に、表１のＣｐｄ９＿Ｆ１＿ｐＭＤＬＭ及びＣｐｄ９＿Ｒ１＿ｐＭＤＬＭで示すプライマーを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲによりアスペルギルス・ソーヤ特異的なカルボキシペプチダーゼ遺伝子（Ｃｐｄ９とする）をクローニングした。全ての操作は添付のプロトコールに従った。ＰＣＲの装置としてｉＣｙｃｌｅｒ １７０−８７２０ＪＡ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用した。同様に表１のＣｐｄ＿Ｒ１＿ｐＭＤＬＭ及びＡｌｐ＿３Ｒで示すプライマーを用いてアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域を、Ａｍｙ＿Ｔ１Ｆ及びＡｍｙ＿Ｔ１６０５Ｒで示すプライマーを用いてアミラーゼ遺伝子のターミネーター領域をクローニングした。
【００３５】
増幅されたＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。操作は添付のプロトコールに従った。抽出されたＤＮＡ断片を鋳型にＤｏｕｂｌｅ ｊｏｉｎｔ ＰＣＲを行ない、各ＤＮＡ断片を連結した。Ｄｏｕｂｌｅ ｊｏｉｎｔ ＰＣＲの反応条件はＹｕ，Ｊ．−Ｈらの方法（ファンガル ジェネティクス アンド バイオロジー（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を参考に行なった。最後に、得られたＰＣＲ産物を鋳型に表１のＡｌｐ＿−１９９０Ｆ及びＡｍｙ＿Ｔ１２３１Ｒで示すプライマーを用いてＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行い、目的のカセットを構築した。
【００３６】
上記と同様の方法を用いて表２で示すプライマーの組み合わせによりアミラーゼ５’−ＵＴＲ領域、ホスホリボシルアミドイミダゾール−スクシノカルボキシアミドシンターゼ遺伝子（ＡｄｅＡとする）、及びアルカリプロテアーゼプロモーター領域をＰＣＲによりクローニング後、Ｊｏｉｎｔ ＰＣＲにより３断片を連結した。この際、最終的なカセットは表１のＡｍｙ＿−２３６４Ｆ及びＡｌｐ＿３Ｒで示すプライマーを使用して取得した。
【００３７】
これらの方法により得られた二つのＤＮＡ断片を用いてアスペルギルス・ソーヤＫＵＡＤＥ＿１株（ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ、ａｄｅＡ：：ｐｙｒＧ）を宿主にプロトプラスト−ＰＥＧ法により形質転換を行い、アミラーゼの遺伝子座にａｄｅＡ遺伝子、アルカリプロテアーゼプロモーター、カルボキシペプチダーゼ遺伝子が挿入された強制発現株を取得した。同様の操作を既知のカルボキシペプチダーゼ遺伝子（Ｃｐｄ１）に対しても行い、強制発現株を取得した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
*alp, アルカリプロテアーゼ遺伝子； amy, アミラーゼ遺伝子。
開始コドン直前を−１とし、アミラーゼ遺伝子終止コドン直後をT1とする。
**アスペルギルス・ソーヤATCC46250の染色体ＤＮＡを鋳型に使用。
【００４０】
＜強制発現株のふすま麹水抽出液におけるカルボキシペプチダーゼ活性＞
得られた強制発現株を用いてふすま麹を作成した。ふすま麹は１０ｇの小麦ふすまに８ｍＬの散水を行い、５ｇずつ１５０ｍＬ三角フラスコに分注した。これを１２１℃、５０分オートクレーブした後、麹菌分生子懸濁液を１０６個／ｇ麹となるように加え、３０℃、４０時間培養した。培養後の麹に水を５０ｍＬ加え、定期的に攪拌しながら３時間抽出を行った。これをＮｏ．２の定性濾紙（アドバンテック社製）にてろ過後、ろ液をふすま麹１０倍水抽出液としてカルボキシペプチダーゼ活性の測定を行った。測定には酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット（キッコーマン社製）を使用し、添付のプロトコールに従った。
対照株であるｋｕ７０のみを破壊した株と比較して、新規なカルボキシペプチダーゼ遺伝子を強制発現させた株においては、その活性が約１．５倍上昇し、カルボキシペプチダーゼ活性を有することが確認された（表３参照）。
【００４１】
【表３】
【００４２】
＜カルボキシペプチダーゼ遺伝子強制発現株を用いた醤油麹の作製、及びグルテン分解＞
上記の操作により得られた強制発現株およびコントロール株を用いて醤油麹を作製した。加熱水蒸気型連続膨化処理装置によるパフ化を行なった脱脂大豆１５．３５ｇ、焙煎割砕小麦１６．５ｇ、水２４ｍＬを混合し、よく混合した後、１５０ｍＬ三角フラスコに１０ｇずつ分注した。これらの原料を１２１℃、２０分の条件でオートクレーブを行った後、各菌株の分生子懸濁液を１０6個植菌し、３０℃で三日間培養した。
得られた醤油麹全量に対してグルテン粉１８．５ｇ、０．５ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１３％食塩水 ３３ｍＬ、及びＣＫ懸濁液 ０．３３ｍＬを添加し、４０℃で８日間分解を行なった。
ＣＫ懸濁液はクリプトコッカス・ノダシエンスＧ２０をＹＰＤ（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ペプトン、２％グルコース）液体培地で２５℃、４日間培養後、遠心分離で菌体を１０倍濃縮したものを使用した。
分解終了後、Ｎｏ．２の定性ろ紙（アドバンテック社製）を用いて濾過を行い、ろ液を回収した。
【００４３】
＜グルテン分解液のアミノ化率の算出＞
グルテン分解液の一部を遠心分離し、上澄５０μＬを６．７Ｎ ＨＣｌが０．４５ｍＬ入ったバイアルに添加して密栓した。このバイアルを１１０℃、２４時間インキュベートし、その後得られた液を遠心分離にて上澄を回収し、塩酸分解液とした。
塩酸分解液およびグルテン分解液をＨＰＬＣによるアミノ酸分析に供した。その結果、表４に示す通りコントロールに比べアミノ化率が向上し、既知のカルボキシペプチダーゼ遺伝子（Ｃｐｄ）を強制発現させたものとアミノ化率を比較しても、同程度であった。
【００４４】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及びカルボキシペプチダーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボキシペプチダーゼは、タンパク質のカルボキシ末端からアミノ酸を順次遊離させる酵素である。
これまでに哺乳類から微生物にいたるまで多くのカルボキシペプチダーゼの酵素学的性質が決定され、また、遺伝子についても解析されている。例えば、ヒトの膵臓由来（例えば、非特許文献１参照）、サッカロマイセス・セレビシエ由来（例えば、非特許文献２参照）、アスペルギルス・オリゼー由来（例えば、特許文献１〜２、非特許文献３参照）のものが知られている。
【０００３】
麹カビ（黄麹菌）であるアスペルギルス・オリゼーおよびアスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒などの、日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。
【０００４】
醤油製造の際に、原料の分解は、麹菌により生産されるプロテアーゼによってポリペプチドに分解され、更にポリペプチドからロイシンアミノペプチダーゼによりアミノ末端から、酸性カルボキシペプチダーゼによりカルボキシル末端から分解され、主にアミノ酸及びジペプチドから成る低分子ペプチドに分解される。これらの酵素が互いに補足しあって、多種類のペプチドを分解できるようになっており、高分子のタンパク質を完全に可溶化・分解・アミノ酸化するためは、カルボキシペプチダーゼが不可欠である。これは、大豆タンパク質にプロテアーゼだけで分解すると、窒素分の可溶化は著しいが、グルタミン酸およびその他のアミノ酸の生成がほとんどないのに対して、プロテアーゼにカルボキシペプチダーゼを添加し、分解することにより、窒素の可溶化が増加するとともに、グルタミン酸およびその他のアミノ酸の溶出が著しいことからも分かる（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
醤油及び酵素分解調味料中には未分解のペプチドが残存していることが知られている。カルボキシペプチダーゼがあれば、それらの醤油及び酵素分解調味料に残存するペプチドを速やかに分解することで、アミノ化率の向上、アミノ酸組成の変化による呈味性の改善に寄与することが期待される。そのため、麹菌からカルボキシペプチダーゼを得ることが強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２５０５８４号公報
【特許文献２】特許第４０７３９６２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ），１９８９年，第１７９巻，第３号，ｐ６０９−６１６，１９８９年
【非特許文献２】バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９７４年，第１３巻，第１９号，ｐ３８７１−３８７７
【非特許文献３】アプライド アンド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ），１９９９年８月，第６５巻，第８号，ｐ．３２９８−３３０３
【非特許文献４】栃倉辰六郎，他，「醤油の科学と技術」，日本醸造協会，昭和６３年３月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、醤油及び酵素分解調味料中に存在するペプチドを分解することができる新規カルボキシペプチダーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体及び該形質転換体又は形質導入体を用いたカルボキシペプチダーゼの製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）由来のカルボキシペプチダーゼ遺伝子を単離し、構造決定し、カルボキシペプチダーゼ活性を確認し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、
１）以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
３）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
４）上記２）又は３）記載のカルボキシペプチダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
５）上記４）記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
６）上記５）記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からカルボキシペプチダーゼを採取することを特徴とするカルボキシペプチダーゼの製造法。
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のアスペルギルス・ソーヤ特有の新規なカルボキシペプチダーゼは、タンパク質原料を効率良く分解し、アミノ化率を向上させることができるので、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．カルボキシペプチダーゼ及びそれをコードする遺伝子。
本発明のカルボキシペプチダーゼは、以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼである。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
（ａ）に示すタンパク質は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター−宿主系に導入して発現させることにより得られる。
なお、該タンパク質は、（ｂ）に示す通り、カルボキシペプチダーゼ活性を有する限り、（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。本発明において「複数」とは、アミノ酸残基のカルボキシペプチダーゼタンパク質の立体構造における位置又は種類によっても異なり、通常２〜３００個、好ましくは、２〜２００個、更に好ましくは、２〜５０個、最も好ましくは、２〜１０個を意味する。
【００１３】
そのような変異型カルボキシペプチダーゼ、すなわち上記（ｂ）のタンパク質は、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子の塩基配列に対して置換、欠損、挿入、付加又は逆位等の変異を導入して変異型カルボキシペプチダーゼ遺伝子を作製し、これを適当なベクター−宿主系に導入して発現させることにより得られる。
【００１４】
遺伝子への変異導入法としては、例えば、部位特異的変異誘導法、ＰＣＲによるランダム変異導入法、更には、遺伝子を選択的に開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去又は付加した後、遺伝子を連結する方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明のカルボキシペプチダーゼ遺伝子は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子である。なお、本発明のカルボキシペプチダーゼ遺伝子は、（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＮａＣｌ濃度が５０〜３００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭであり、温度が４２〜６８℃、好ましくは６５℃以上での条件をいう。
上記（ａ）のタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子の一例としては、配列番号１記載の塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。このＤＮＡは、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子である。
【００１６】
天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子は、アスペルギルス属に属する糸状菌の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型遺伝子をクローニングすることにより得られる。遺伝子のクローニング方法としては、例えば、糸状菌より染色体ＤＮＡを抽出し、アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列を参考として設計したプライマーを用いて染色体ＤＮＡよりＰＣＲにより目的のＤＮＡ断片を得る方法が挙げられる。
【００１７】
増幅されたＤＮＡを適当なプロモーター及びターミネーターに連結し、それを糸状菌のゲノム中に相同組み換えにて挿入する。使用するプロモーターには麹菌の場合、例えば翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子のプロモーター又はα−アミラーゼのプロモーター、アルカリプロテアーゼのプロモーターが利用出来る。
もしくは、増幅されたＤＮＡを適当なベクターに挿入して組み換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)等の市販のキットあるいは、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の市販のプラスミドベクターＤＮＡ、λＥＭＢＬ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等の市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。
【００１８】
得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を形質転換又は形質導入して、それぞれ形質転換体又は形質導入体を得る。形質転換は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９７９年，第６８巻，ｐ３２６−３３１）により行なうことができる。また、形質導入は、例えば、Ｂ．Ｈｏｈｎの方法（メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９７９年，第６８巻，ｐ２９９−３０９）により行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌の他、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌等の微生物や動物細胞、植物細胞等が利用できる。
【００１９】
上記で増幅されたＤＮＡの全塩基配列（配列番号１参照）は、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ ＭＯＤＥＬ ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社より購入）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）を用いて解析できる。塩基配列を、部分アミノ酸配列の情報と比較することにより、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子が取得できたか否かを確認することができる。
そして、天然型カルボキシペプチダーゼ遺伝子の解析により、翻訳されるポリペプチド、すなわち、（ａ）のタンパク質のアミノ酸配列が確定される。
【００２０】
２．カルボキシペプチダーゼの製造法
本発明のカルボキシペプチダーゼを製造する場合は、先ず、カルボキシペプチダーゼ遺伝子をクローニングし、それをセルフクローニングによって自身の高発現プロモーター制御下で強制発現させればよい。高発現プロモーターは例えばアスペルギルス・ソーヤの場合、α−アミラーゼのプロモーター領域、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１プロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝しプロモーター領域等が利用出来る。
または、クローニングしたカルボキシペプチダーゼ遺伝子を用いて組み換え体ＤＮＡを作製し、該組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を作製し、これらを培養し、培養物からカルボキシペプチダーゼを採取すればよい。
【００２１】
本発明のカルボキシペプチダーゼ遺伝子を用いて、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質を生産するためには、好適なベクター−宿主系を選択する必要がある。そのような系としては、ｐＳＴ１４（モレキュラー アンド ジェネラル ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．），１９８９年，第２１８巻，ｐ９９−１０４）及び糸状菌〔アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）, アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）,アスペルギルス・ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）,アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）, ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）等〕の系、酵母発現ベクターＹＥｐＦＬＡＧ−１（ＳＩＧＭＡ社製）及び酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の系、大腸菌発現ベクターｐＴＥ（Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ社製）及び大腸菌エッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の系等が挙げられる。タンパク質への糖鎖付加がおこるという点で糸状菌又は酵母の系を使用することが好ましい。
【００２２】
組み換え体ＤＮＡは、カルボキシペプチダーゼ遺伝子を適当なベクターに挿入することにより得られる。ベクターとしては、市販品、例えば、酵母発現ベクターＹＥｐ−ＦＬＡＧ−１（ＳＩＧＭＡ社製）、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＵＲ１２３（宝酒造社製）、ｐＹＥＸ−ＢＸ、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＹＥＸ−４Ｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、大腸菌発現ベクターｐＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴＥ（Ｓｔｒａｇａｔｅｎｅ社製）等が使用できる。
【００２３】
次いで、該組み換え体ＤＮＡを宿主細胞に形質転換又は形質導入する。宿主細胞としては、大腸菌又は酵母の他、他の細菌、糸状菌、放線菌等の微生物あるいは動物細胞が使用可能である。
【００２４】
以上によりカルボキシペプチダーゼ生産能を有する形質転換体又は形質導入体が得られる。形質転換体又は形質導入体を培養するには、通常の固体培養法もしくは液体培養法を採用することができる。
【００２５】
宿主として麹菌を用いた場合、培地としては、例えば、醤油麹あるいはふすま麹等の固体培地もしくはＰＤ培地等の一般的な富栄養液体培地が使用できる。
麹菌を培養する場合は、固体培養においては２５〜３５℃、好ましくは３０℃前後で、２４〜４８時間静置培養する。液体培養においては２５〜３５℃、好ましくは３０℃前後で、２４〜４８時間通気攪拌条件により、振盪培養することが好ましい。
【００２６】
発現したカルボキシペプチダーゼを、Ｊ．Ｐ．Ｔ．Ｗ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｅｖｅｒｇｈらの方法（ジーン（Ｇｅｎｅ），１９９４年，第１５１巻，ｐ７３−７９）を一部改変した方法により精製できる。
麹菌の場合では、該形質転換麹菌を上記の適当な方法で培養後、固体培養の場合は麹を水又は適当な緩衝液にて、時折攪拌しながら１〜５時間抽出し、麹抽出液を得る。
【００２７】
液体培養では培養液を濾過もしくは遠心分離して培養上澄を得る。もしくは菌体を回収し、該菌体に細胞壁溶解酵素を加え充分に細胞壁を溶解させた後、遠心分離して上澄み液を得る。この上澄み液に硫酸アンモニウムを添加し塩析させ、更に、遠心分離して不溶性タンパク質を除きカルボキシペプチダーゼを含む粗酵素液を得る。
【００２８】
麹抽出液もしくは培養上澄、粗酵素液からフェニルセファロースカラム、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、ゲル濾過カラム、ＨＰＬＣを用いて、カルボキシペプチダーゼ活性画分を精製することにより精製されたカルボキシペプチダーゼを得ることができる。
【００２９】
なお、本発明における遺伝子工学的方法は、例えば、「モレキュラー クローニング：実験室マニュアル 第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），１９８９年，コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），ＩＳＢＮ ０８７６９−３０９−６」等の記載に準じて実施可能である。
【００３０】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
形質転換宿主には、アスペルギルス・ソーヤ ＡＳＫＵＰＴＲ８株（ΔｐｙｒＧ、ｋｕ７０：：ｐｒｔＡ）（高橋理、他２名，モレキュラー ジェネティクス アンド ゲノミクス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），２００６年，第２７５巻，第５号，ｐ４６０−４７０、特開２００７−２２２０５５号公報参照）をもとにｐｙｒＧマーカーを用いてＡｄｅＡ遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤ ＫＵＡＤＥ＿１株（ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ、ａｄｅＡ：：ｐｙｒＧ）を用いた。
【００３２】
＜アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌におけるカルボキシペプチダーゼ相同遺伝子の検索＞
アスペルギルス・ソーヤのゲノム配列から、Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて相同性検索を行ったところ、１９１９塩基からなる推定オープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦという）を得た。該ＯＲＦをアスペルギルス・ソーヤ特有の新規カルボキシペプチダーゼ遺伝子の断片であると推定し、該遺伝子のクローニングを行った。
【００３３】
＜アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）からのゲノムＤＮＡ抽出＞
アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４６２５０株をバッフル付き三角フラスコにて、ＰＤ培地（２％ デキストリン、１％ ポリペプトン、０．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＮａＮＯ３、０．０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％ カザミノ酸）で３０℃、２０時間振とう培養を行なった。
培養終了後、培養液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）で濾過して菌体を集めた。集めた菌体を滅菌水で洗浄した後、液体窒素中で凍結させ乳鉢を用いて物理的に磨砕し、細かい粉末状の菌体片とした。菌体片からＮｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ ＳｏｌｕｔｉｏｎおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（共にＰｒｏｍｅｇａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。全ての操作は添付のプロトコールに従った。
【００３４】
上記で得られたゲノムＤＮＡを鋳型に、表１のＣｐｄ９＿Ｆ１＿ｐＭＤＬＭ及びＣｐｄ９＿Ｒ１＿ｐＭＤＬＭで示すプライマーを用いて、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲによりアスペルギルス・ソーヤ特異的なカルボキシペプチダーゼ遺伝子（Ｃｐｄ９とする）をクローニングした。全ての操作は添付のプロトコールに従った。ＰＣＲの装置としてｉＣｙｃｌｅｒ １７０−８７２０ＪＡ（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用した。同様に表１のＣｐｄ＿Ｒ１＿ｐＭＤＬＭ及びＡｌｐ＿３Ｒで示すプライマーを用いてアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域を、Ａｍｙ＿Ｔ１Ｆ及びＡｍｙ＿Ｔ１６０５Ｒで示すプライマーを用いてアミラーゼ遺伝子のターミネーター領域をクローニングした。
【００３５】
増幅されたＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲル中で分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。操作は添付のプロトコールに従った。抽出されたＤＮＡ断片を鋳型にＤｏｕｂｌｅ ｊｏｉｎｔ ＰＣＲを行ない、各ＤＮＡ断片を連結した。Ｄｏｕｂｌｅ ｊｏｉｎｔ ＰＣＲの反応条件はＹｕ，Ｊ．−Ｈらの方法（ファンガル ジェネティクス アンド バイオロジー（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を参考に行なった。最後に、得られたＰＣＲ産物を鋳型に表１のＡｌｐ＿−１９９０Ｆ及びＡｍｙ＿Ｔ１２３１Ｒで示すプライマーを用いてＮｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行い、目的のカセットを構築した。
【００３６】
上記と同様の方法を用いて表２で示すプライマーの組み合わせによりアミラーゼ５’−ＵＴＲ領域、ホスホリボシルアミドイミダゾール−スクシノカルボキシアミドシンターゼ遺伝子（ＡｄｅＡとする）、及びアルカリプロテアーゼプロモーター領域をＰＣＲによりクローニング後、Ｊｏｉｎｔ ＰＣＲにより３断片を連結した。この際、最終的なカセットは表１のＡｍｙ＿−２３６４Ｆ及びＡｌｐ＿３Ｒで示すプライマーを使用して取得した。
【００３７】
これらの方法により得られた二つのＤＮＡ断片を用いてアスペルギルス・ソーヤＫＵＡＤＥ＿１株（ｋｕ７０：：ｐｔｒＡ、ａｄｅＡ：：ｐｙｒＧ）を宿主にプロトプラスト−ＰＥＧ法により形質転換を行い、アミラーゼの遺伝子座にａｄｅＡ遺伝子、アルカリプロテアーゼプロモーター、カルボキシペプチダーゼ遺伝子が挿入された強制発現株を取得した。同様の操作を既知のカルボキシペプチダーゼ遺伝子（Ｃｐｄ１）に対しても行い、強制発現株を取得した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
*alp, アルカリプロテアーゼ遺伝子； amy, アミラーゼ遺伝子。
開始コドン直前を−１とし、アミラーゼ遺伝子終止コドン直後をT1とする。
**アスペルギルス・ソーヤATCC46250の染色体ＤＮＡを鋳型に使用。
【００４０】
＜強制発現株のふすま麹水抽出液におけるカルボキシペプチダーゼ活性＞
得られた強制発現株を用いてふすま麹を作成した。ふすま麹は１０ｇの小麦ふすまに８ｍＬの散水を行い、５ｇずつ１５０ｍＬ三角フラスコに分注した。これを１２１℃、５０分オートクレーブした後、麹菌分生子懸濁液を１０６個／ｇ麹となるように加え、３０℃、４０時間培養した。培養後の麹に水を５０ｍＬ加え、定期的に攪拌しながら３時間抽出を行った。これをＮｏ．２の定性濾紙（アドバンテック社製）にてろ過後、ろ液をふすま麹１０倍水抽出液としてカルボキシペプチダーゼ活性の測定を行った。測定には酸性カルボキシペプチダーゼ測定キット（キッコーマン社製）を使用し、添付のプロトコールに従った。
対照株であるｋｕ７０のみを破壊した株と比較して、新規なカルボキシペプチダーゼ遺伝子を強制発現させた株においては、その活性が約１．５倍上昇し、カルボキシペプチダーゼ活性を有することが確認された（表３参照）。
【００４１】
【表３】
【００４２】
＜カルボキシペプチダーゼ遺伝子強制発現株を用いた醤油麹の作製、及びグルテン分解＞
上記の操作により得られた強制発現株およびコントロール株を用いて醤油麹を作製した。加熱水蒸気型連続膨化処理装置によるパフ化を行なった脱脂大豆１５．３５ｇ、焙煎割砕小麦１６．５ｇ、水２４ｍＬを混合し、よく混合した後、１５０ｍＬ三角フラスコに１０ｇずつ分注した。これらの原料を１２１℃、２０分の条件でオートクレーブを行った後、各菌株の分生子懸濁液を１０6個植菌し、３０℃で三日間培養した。
得られた醤油麹全量に対してグルテン粉１８．５ｇ、０．５ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１３％食塩水 ３３ｍＬ、及びＣＫ懸濁液 ０．３３ｍＬを添加し、４０℃で８日間分解を行なった。
ＣＫ懸濁液はクリプトコッカス・ノダシエンスＧ２０をＹＰＤ（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ペプトン、２％グルコース）液体培地で２５℃、４日間培養後、遠心分離で菌体を１０倍濃縮したものを使用した。
分解終了後、Ｎｏ．２の定性ろ紙（アドバンテック社製）を用いて濾過を行い、ろ液を回収した。
【００４３】
＜グルテン分解液のアミノ化率の算出＞
グルテン分解液の一部を遠心分離し、上澄５０μＬを６．７Ｎ ＨＣｌが０．４５ｍＬ入ったバイアルに添加して密栓した。このバイアルを１１０℃、２４時間インキュベートし、その後得られた液を遠心分離にて上澄を回収し、塩酸分解液とした。
塩酸分解液およびグルテン分解液をＨＰＬＣによるアミノ酸分析に供した。その結果、表４に示す通りコントロールに比べアミノ化率が向上し、既知のカルボキシペプチダーゼ遺伝子（Ｃｐｄ）を強制発現させたものとアミノ化率を比較しても、同程度であった。
【００４４】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３記載のカルボキシペプチダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からカルボキシペプチダーゼを採取することを特徴とするカルボキシペプチダーゼの製造法。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のカルボキシペプチダーゼ。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるカルボキシペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、カルボキシペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３記載のカルボキシペプチダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からカルボキシペプチダーゼを採取することを特徴とするカルボキシペプチダーゼの製造法。
【公開番号】特開２０１１−１４７３４８（Ｐ２０１１−１４７３４８Ａ）
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８６１９（Ｐ２０１０−８６１９）
【出願日】平成２２年１月１９日（２０１０．１．１９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１９日（２０１０．１．１９）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
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