カルボキシメチルアルギニンの免疫測定方法
【課題】ＣＭＡを簡便に精度よく測定可能なＣＭＡの新たな測定方法の提供。
【解決手段】
試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び前処理した試料中のカルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法によって測定することを含む、試料中のカルボキシメチルアルギニンを測定する方法。
【解決手段】
試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び前処理した試料中のカルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法によって測定することを含む、試料中のカルボキシメチルアルギニンを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシメチルアルギニンの免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、メイラード反応の後期反応において生成される物質であって、老化や種々の疾患の発症・進展に関与することが明らかになりつつある。例えば、皮膚においてＡＧＥｓが生成し蓄積すると、皮膚の弾力性の低下や、シワ、たるみ及びシミ等の一因となることが知られている。
【０００３】
ＡＧＥｓの一種としてＮω−カルボキシメチルアルギニン（以下、「ＣＭＡ」ともいう）が知られている。ＣＭＡはコラーゲン中に特異的に生成するＡＧＥｓであることが確認されている（例えば、特許文献１）。このため、生体におけるＣＭＡの生成を抑制することによりＣＭＡの生成及びコラーゲンへの蓄積に起因する老化・疾病を防止することを目的としたＣＭＡ生成抑制剤が提案されている（特許文献２）。また、糖尿病患者の血清タンパク質におけるＣＭＡレベルは、同年代の健常者の血清タンパク質のＣＭＡレベルと比較して顕著に高いことから、ＣＭＡは糖尿病における糖化の新たな診断マーカーとしての可能性が期待されている（非特許文献１）。ＣＭＡはその他には骨粗しょう症のマーカーとしての利用可能性も期待されている。
【０００４】
ＡＧＥｓとしては、ＣＭＡが見出される以前からペントシジン、カルボキシメチルリジン（以下、「ＣＭＬ」という）、ピラリン等といった数１００種類の物質が同定されており、抗糖化マーカーとしての利用が試みられている。しかしながら、ペントシジンやＣＭＬは組織特異的ではないため、これらの血中濃度を測定しても糖化が生じている組織を特定することはできない。一方、ＣＭＡは上記のとおりコラーゲン等の結合組織タンパク質に特異的であることから、ＣＭＡを測定して得られた値は結合組織タンパク質（特に、コラーゲン）における糖化の指標となりうる。このため、ＣＭＡを特異的に認識する抗体及びそれを含むＣＭＡ検出用の免疫試薬が提案されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許３８８９１９０号
【特許文献２】ＷＯ２０１１／００４７３４
【特許文献３】特開２００２−２４３７３２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Odani et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 285, 1232-1236 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献３に開示されている抗体等の測定試薬を用い、ＣＭＡ標品を含むサンプルに対して免疫学的方法によるＣＭＡの測定を行うと十分な感度が得られる。しかしながら、本発明者らは、生体試料（特に、血液由来試料）の場合には前記測定試薬を用いてもＣＭＡがほとんど検出されないという新たな課題を見出した。一方、生体試料中のＣＭＡを測定するその他の方法としては例えばＬＣ／ＭＳ法等があるが、この方法では特殊な装置が必要となり測定がきわめて煩雑であるという問題がある。そこで、本発明はＣＭＡを簡便に精度よく測定可能なＣＭＡの新たな測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び前記処理した試料中のカルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法によって測定することを含む、試料中のカルボキシメチルアルギニンの測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、例えば、生体試料等のような試料中のＣＭＡを簡単かつ精度よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１の結果の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、比較例１の結果の一例を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１及び比較例１の結果から得られた検量線の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、生体試料を尿素（ＣＯ（ＮＨ2）2）によって前処理した後、免疫学的方法によるＣＭＡの測定を行えば、生体試料中のＣＭＡを簡単かつ精度よく測定できるという知見に基づく。
【００１２】
すなわち、本発明は、一態様として、試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び前記処理した試料中のＣＭＡを免疫学的方法によって測定することを含む、試料中のＣＭＡの測定方法（以下、「本発明の測定方法」ともいう）に関する。
【００１３】
尿素による生体試料の前処理を行うことによって、生体試料中のＣＭＡを免疫学的方法を用いて測定できるメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように推定される。すなわち、生体試料、特に血液試料中においてＣＭＡはアルブミン等のタンパク質に結合した状態で存在しているものと考えられる。このため、ＣＭＡを特異的に認識する抗体を添加してもＣＭＡが抗体に結合することができなかったためほとんど検出されなかったが、尿素による前処理を行うことによって、ＣＭＡと結合するタンパク質に構造の変化が生じたり、ＣＭＡとタンパク質との結合が保持されなくなること等により、ＣＭＡと抗体との反応性が向上されるものと考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１４】
本発明の測定方法によれば、生体内に生成及び又は蓄積するＣＭＡ量を簡単かつ精度よく把握することができる。ＣＭＡは、例えば、抗糖化マーカー、皮膚老化マーカー及び又は骨粗しょう症マーカーとしての利用が試みられている。このため、本発明の測定方法によれば、糖化ストレス、皮膚の老化及び又は骨粗しょう症の症状の程度や発症の可能性を把握することができ、これらの予防やアンチエイジングの分野において有用である。さらに、ＣＭＡはコラーゲン中に特異的に生成及び又は蓄積することが知られている。このため、本発明のＣＭＡ測定方法により得られたＣＭＡ測定値に基づき、例えば、コラーゲンの老化度や皮膚の老化度をモニタリングすることができ、その結果からヒトの老化度の評価を行うことができるという効果を奏しうる。
【００１５】
本発明の測定方法において、試料は、前処理剤による測定感度の向上効果が得られやすいことから、生体試料が好ましい。生体試料としては、例えば、尿由来、血液由来、又は組織由来の試料が挙げられる。血液由来の試料としては、例えば、全血試料、血清試料、血漿試料、及び溶血試料等が挙げられる。組織由来の試料としては、生体から採取された組織から調製された試料が挙げられる。組織としては、例えば、コラーゲンを含む組織が挙げられる。コラーゲンを含む組織としては、例えば、骨、皮膚、及び腱等が挙げられる。試料としては、中でも、血液由来試料であれば、前処理剤を用いた処理による測定感度向上効果がさらに得られやすいため好ましい。なお、前記血液由来の試料の中でも血清試料及び血漿試料であればさらに好ましい。試料は、生体から採取したものをそのまま使用してもよいし、希釈して使用してもよい。また、本発明の測定方法によれば、試料に含まれるＣＭＡが単離及び又は精製されたＣＭＡ（ＣＭＡ標品）でなくても、簡単かつ精度よく測定することができる。
【００１６】
本発明の測定方法において、前処理剤は、有効成分として有効な量の尿素を含んでいればよく、例えば、実質的に尿素からなる前処理剤であってもよい。本明細書において「実質的に尿素からなる」とは、前処理剤の原料に含まれる不可避的不純物及び又は前処理剤の製造過程で混入する不可避的不純物を除いては尿素からなることをいう。
【００１７】
尿素を含む前処理剤による試料の処理は、例えば、尿素を含む前処理剤と試料とを溶液中で共存させることにより行うことができる。尿素と試料とを共存させることにより、試料中のＣＭＡと抗体との反応性が向上し、測定感度が向上される。溶液中で前処理剤と試料とを共存させる方法及びその順序は特に制限されず、例えば、試料に前処理剤を添加してもよいし、前処理剤を含む溶液に試料を添加してもよい。
【００１８】
前処理剤による試料の処理工程において、試料を処理するときの尿素の濃度（前処理剤と試料とを含む前処理溶液中の濃度）は特に限定されるものではなく、例えば、０．０１Ｍ〜１０Ｍであり、好ましくは０．０１Ｍ〜８Ｍである。前処理溶液のｐＨは特に限定されるものではなく、例えば、４．０〜９．０であり、好ましくは５．０〜８．０、より好ましくは６．０〜７．５である。
【００１９】
前処理剤による処理温度は特に限定されるものではなく、例えば、０〜６０℃であり、処理直後に免疫学的測定を実施する場合においては、４〜４５℃が好ましく、より好ましくは２５〜３７℃である。前処理剤による処理時間は特に限定されるものではなく、例えば、０．１分〜１２時間であり、測定上の簡便性の点から、０．１〜３０分が好ましく、より好ましくは０．１〜１０分である。
【００２０】
本明細書において「免疫学的方法」とは、ＣＭＡに特異的な抗体、その断片又はその類似体を用いてＣＭＡを検出又は測定する方法をいい、例えば、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）法、イムノクロマト法、及び凝集法等が挙げられるが、これらに制限されない。免疫学的方法は、試料の種類に応じて適宜決定してもよく、試料が血液由来試料である場合、測定精度向上の点から、凝集法が好ましい。また、免疫学的方法は、試料中のＣＭＡの状態に応じて適宜決定してもよい。巨大分子中にＣＭＡが複数存在する場合は非競合法が好ましく、ＣＭＡが１分子単独で存在する場合は競合法が好ましい。
【００２１】
免疫学的方法による測定は、例えば、試料中のＣＭＡと、ＣＭＡに特異的に反応する抗体（以下、「抗ＣＭＡ抗体」ともいう）との抗原抗体反応を利用して行うことができる。以下に、免疫学的方法による測定について凝集法を例にとり説明する。凝集法としては、非競合的な方法と、競合的な方法とをとりうる。非競合的な方法により測定を行う場合、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＭＡ抗体を感作させた粒子（以下、「抗体感作粒子」という）と上記の前処理を行った試料とを混合すること、及び抗体感作粒子の凝集を測定することにより、試料中のＣＭＡを測定することができる。
【００２２】
抗ＣＭＡ抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。抗ＣＭＡ抗体としては、例えば、特開２００２−２４３７３２号公報等に開示のものが挙げられる。抗ＣＭＡ抗体は、市販のものを使用してもよいし、自家調製したものを使用してもよい。抗体を感作させる粒子としては特に制限されるものではないが、免疫学的方法に通常用いられている公知の粒子が使用でき、例えば、不溶性担体粒子、及び磁性粒子等が挙げられる。不溶性担体粒子は特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレンラテックス粒子等のラテックス粒子、ポリプロピレン粒子、ポリエチレン粒子、ゼラチン粒子、金コロイド粒子等が挙げられ、中でもラテックス粒子が好ましい。粒子の粒径は特に限定されるものではないが、ラテックス粒子の場合、例えば、０．０５〜１．０μｍであり、分散性の維持や凝集度の測定のしやすさの点から、０．１０〜０．５０μｍが好ましい。抗ＣＭＡ抗体による粒子の感作の方法は特に制限されることなく、当該分野で公知の方法によって行うことができ、例えば、物理的吸着法及び化学結合法等が挙げられる。抗体感作粒子は、例えば、水又は緩衝液に懸濁させて懸濁液として使用してもよい。懸濁液における粒子の割合は特に限定されるものではなく、例えば、０．０１〜１重量％である。緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えば、グッドの緩衝剤、リン酸緩衝剤、及びトリス緩衝剤等が挙げられる。
【００２３】
前処理後の試料と抗体感作粒子との反応温度は特に限定されるものではなく、例えば、４〜４５℃が好ましく、より好ましくは２５〜３７℃である。反応時間は特に限定されるものではなく、例えば、０．１〜６０分であり、測定の迅速性と測定感度向上の点からは１〜３０分が好ましく、より好ましくは３〜１５分である。抗体感作粒子と試料との混合液中における抗体感作粒子の濃度は特に制限されるものではなく、例えば、０．００１〜０．２ｗ／ｖ％であり、０．０２〜０．０７ｗ／ｖ％が好ましい。凝集の測定は特に制限されるものではなく、例えば、分光光度計や光学測定装置等を用いて、吸光度及び又は濁度を測定することにより行うことができる。
【００２４】
競合的な方法により測定を行う場合、特に限定されるものではないが、例えば、上記の前処理を行った試料とＣＭＡ担持物質と混合すること、ＣＭＡ担持物質と混合した試料を抗体感作粒子と混合すること、及び抗体感作粒子の凝集を測定することにより、試料中のＣＭＡを測定することができる。ＣＭＡ担持物質としては、例えば、ＣＭＡ（抗原）を感作させた粒子、ＣＭＡをヘモシアニン及びアルブミンの担体物質に結合させたもの、グリケーションコラーゲン等が挙げられる。グリケーションコラーゲンとは糖化したコラーゲンのことをいい、例えば、中性リン酸緩衝液中においてコラーゲンをグルコースと共存させて３７度でインキュベーションすることによって調製することができる。グリケーションコラーゲンの調製方法は、例えば、特開２００２−２４３７３２号公報に開示されている。
【００２５】
前処理後の試料とＣＭＡ担持物質との反応温度は特に限定されるものではなく、例えば、４〜４５℃が好ましく、より好ましくは２５〜３７℃である。反応時間は特に限定されるものではなく、例えば、０〜６０分であり、測定の迅速性及び溶液の均一性確保の点からは、０．５〜１０分が好ましく、より好ましくは０．５〜５分である。試料とＣＭＡ担持物質との混合液中におけるＣＭＡ担持物質の濃度は特に制限されるものではなく、例えば、０．００１〜０．２ｗ／ｖ％であり、０．００１〜０．０５ｗ／ｖ％が好ましい。抗体感作粒子との反応温度及び反応時間、並びに抗体感作粒子の混合液中における濃度は、上記の非競合法と同様である。
【００２６】
本発明の測定方法は、免疫学的方法による測定によって得られた結果に基づき、試料中のＣＭＡを定量することを含んでいてもよい。試料中のＣＭＡを定量することにより、糖化ストレス、皮膚の老化及び又は骨粗しょう症の症状の程度や発症の可能性を把握することができ、またコラーゲンの老化度及び又は皮膚の老化度を判定及び又はモニタリングすることができる。
【００２７】
このため、本発明は、その他の態様として、試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、前処理した試料中のＣＭＡを免疫学的方法によって測定すること、及び免疫学的方法により得られた測定結果から試料中のＣＭＡを定量することを含む、糖化ストレス、骨粗しょう症、コラーゲンの老化度又は皮膚の老化度の判定方法に関しうる。
【００２８】
（試料の前処理方法）
本発明は、さらにその他の態様として、試料を尿素を含む前処理剤で処理することを含む、試料中のＣＭＡを免疫学的方法により測定するための試料の前処理方法に関する。本発明の前処理方法によって試料の前処理を行うことにより、例えば、精度の高い免疫学的方法を用いた試料中のＣＭＡの測定が可能になる。前処理剤での処理条件は、上記のＣＭＡの測定方法と同様に行うことができる。
【００２９】
（前処理剤）
本発明は、さらにその他の態様として、尿素を含む、ＣＭＡを免疫学的方法により測定するための試料の前処理剤に関する。本発明の前処理剤によれば、免疫学的方法により試料中のＣＭＡを測定するための試料の前処理を簡便に行うことができる。
【００３０】
前処理剤は、有効成分として有効な量の尿素を含んでいればよく、例えば、実質的に尿素からなる前処理剤であってもよい。
【００３１】
前処理剤の形態は特に制限されることなく、液系（液状試薬）であってもよく、ドライ系であってもよいが、利便性の点からは、水又は緩衝液に溶解させた液状試薬が好ましい。液系である場合、前処理剤における尿素の濃度は特に限定されるものではなく、例えば、０．０１Ｍ〜１０Ｍであり、好ましくは０．０１Ｍ〜８Ｍである。
【００３２】
（免疫学的方法によるＣＭＡの測定用キット）
本発明は、さらにその他の態様として、尿素を含む前処理剤と、免疫学的方法によりＣＭＡを測定するための測定用試薬とを含む、ＣＭＡを免疫学的方法により測定するための測定用キットに関する。本発明の測定キットによれば、免疫学的方法によるＣＭＡの測定を簡便に行うことができる。前処理剤としては、上記の前処理剤が挙げられる。
【００３３】
測定用試薬は特に制限されず、ＣＭＡに特異的な抗体、その断片又はその類似体を用いてＣＭＡを検出又は測定する可能な試薬を含んでいればよく、試薬の構成は測定を行う免疫学的方法により応じて適宜決定することができる。中でも、測定用試薬は、例えば、抗ＣＭＡ抗体感作粒子を含むことが好ましい。抗ＣＭＡ抗体感作粒子は、上述するＣＭＡの測定方法に開示されたものが使用できる。
【００３４】
本発明の測定用キットは、その他に、例えば、試料を希釈するための試料調製液を含んでいてもよい。試料調製液としては特に制限されるものではないが、例えば、水及び緩衝液等が挙げられる。
【００３５】
本発明の測定用キットは、上記試薬を用いて試料中のＣＭＡを免疫学的方法により測定する方法等が記載された取扱い説明書を含むことが好ましい。本発明の測定用キットは、取扱い説明書が本発明の測定キットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
【００３６】
本発明の測定用キットとしては、例えば、前処理剤、及び測定用試薬が試薬パックに収納されていてもよい。試薬パックは、例えば、使い捨て可能なカートリッジ形状であることが好ましく、上記試薬を配置可能な槽を２種類以上備えることがより好ましい。本発明の測定用キットとしては、前処理剤、及び測定用試薬のそれぞれが個別の槽に配置された試薬パックが好ましい。試薬パックは特に制限されるものではないが、例えば、反応槽、検体槽、分注チップ、反応用光学セル、及び廃棄槽等をさらに含んでいてもよい。このような試薬パックを用いることにより、例えば、本発明の測定方法をより一層簡便に実施することができ、また、自動化装置への適用も極めて容易することができる。
【００３７】
（前処理用キット）
本発明は、さらにその他の態様として、尿素を含む前処理剤を含む、試料中のＣＭＡを免疫学的方法により測定するための試料の前処理用キットに関する。本発明の前処理用キットによれば、本発明の前処理方法を簡便に行うことができる。本発明の前処理用キットは、その他に、例えば、試料を希釈するための試料調製液、及び又は上記前処理剤を用いて試料の前処理方法等が記載された取扱い説明書を含むことが好ましい。
【００３８】
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００３９】
［抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子の調製］
抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子は、下記の方法で調製した。まず、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７)にラテックス粒子を添加して０．５ｗ／Ｖ％とし、このラテックス粒子分散液１ｍLに、１ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ水溶液０．３ｍＬを添加して２５℃で１５分間転倒混和した。１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＭＡ抗体を含むＰＢＳ ０．５ｍＬを添加し、２５℃で６０分間転倒混和した。さらに１０ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７）４５４μＬを添加し、ラテックス粒子を懸濁させた後に、２５℃で６０分間転倒混和した。次いで、１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，１０℃にて遠心分離し、上清を除去した。得られた残渣に、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７）３ｍＬを添加し、ラテックス粒子を懸濁させた後に、再び１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，１０℃にて遠心分離し、上清を除去した。得られた残渣に、５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０５％ ＢＳＡ，０．０５％ アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を２．５ｍＬ添加し、ラテックス粒子を懸濁させ、抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子を調製した。
【００４０】
（実施例１）
［前処理工程］
血清と、等量の７Ｍ尿素水溶液とを混合して２５℃で３０分間インキュベートすることによって試料の前処理を行った。なお、前処理溶液のｐＨは７とした。
［免疫測定工程］
前処理した試料２０μＬを下記第１試薬１１５μＬと混合し、３７℃で５分間インキュベートした。ついで、第２試薬１１５μＬを添加し、６６０ｎｍの吸光度を測定して初期値を得た。さらに、３７℃で５分間インキュベートした後、６６０ｎｍの吸光度を測定し、得られた測定値と初期値との差（Δ吸光度）を得た。また、前処理した試料を蒸留水で２、４又は８倍希釈し、それを用いて上記と同様の測定を行った。その結果を図１に示す。図１において、縦軸はΔ吸光度、横軸は測定時間を示し、１ポイントは１９．９２秒を意味する。なお、測定は日立製の自動分析装置７０７０で行った。
＜第１試薬＞
１％ ＰＥＧ２００００
１％ ＢＳＡ
０．９％ ＮａＣｌ
０．１％ ＥＤＴＡ2Ｎａ
０．０９％ ＮａＮ3
０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ
ｐＨ８．４
＜第２試薬＞
０．０５％ 抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子（直径：３７０ｎｍ、白色）
５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
０．０５％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ3
２０ｍＭ ＭＯＰＳ
ｐＨ７．５
【００４１】
（比較例１）
比較例１として、血清を等量の蒸留水と混合し、前処理を行わない以外は実施例１と同様の測定を行った。その結果を図２に示す。
【００４２】
図１及び２の結果に基づき、実施例１及び比較例１について検量線を作成した。その結果を図３に示す。図３において、縦軸はΔ吸光度、横軸は試料（血清）の希釈倍率を示す。図１〜３に示すように、尿素による前処理を行った試料は、前処理を行わなかった試料と比較して、反応性が大幅に向上した。また、尿素により試料の前処理を行うことにより、濃度依存的にΔ吸光度が上昇した。このため、本発明の測定方法によれば、生体試料中のＣＭＡ濃度を免疫学的方法により測定できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の試料分析方法は、例えば、医療分野、臨床検査の分野等の様々な分野に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシメチルアルギニンの免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、メイラード反応の後期反応において生成される物質であって、老化や種々の疾患の発症・進展に関与することが明らかになりつつある。例えば、皮膚においてＡＧＥｓが生成し蓄積すると、皮膚の弾力性の低下や、シワ、たるみ及びシミ等の一因となることが知られている。
【０００３】
ＡＧＥｓの一種としてＮω−カルボキシメチルアルギニン（以下、「ＣＭＡ」ともいう）が知られている。ＣＭＡはコラーゲン中に特異的に生成するＡＧＥｓであることが確認されている（例えば、特許文献１）。このため、生体におけるＣＭＡの生成を抑制することによりＣＭＡの生成及びコラーゲンへの蓄積に起因する老化・疾病を防止することを目的としたＣＭＡ生成抑制剤が提案されている（特許文献２）。また、糖尿病患者の血清タンパク質におけるＣＭＡレベルは、同年代の健常者の血清タンパク質のＣＭＡレベルと比較して顕著に高いことから、ＣＭＡは糖尿病における糖化の新たな診断マーカーとしての可能性が期待されている（非特許文献１）。ＣＭＡはその他には骨粗しょう症のマーカーとしての利用可能性も期待されている。
【０００４】
ＡＧＥｓとしては、ＣＭＡが見出される以前からペントシジン、カルボキシメチルリジン（以下、「ＣＭＬ」という）、ピラリン等といった数１００種類の物質が同定されており、抗糖化マーカーとしての利用が試みられている。しかしながら、ペントシジンやＣＭＬは組織特異的ではないため、これらの血中濃度を測定しても糖化が生じている組織を特定することはできない。一方、ＣＭＡは上記のとおりコラーゲン等の結合組織タンパク質に特異的であることから、ＣＭＡを測定して得られた値は結合組織タンパク質（特に、コラーゲン）における糖化の指標となりうる。このため、ＣＭＡを特異的に認識する抗体及びそれを含むＣＭＡ検出用の免疫試薬が提案されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許３８８９１９０号
【特許文献２】ＷＯ２０１１／００４７３４
【特許文献３】特開２００２−２４３７３２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Odani et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 285, 1232-1236 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献３に開示されている抗体等の測定試薬を用い、ＣＭＡ標品を含むサンプルに対して免疫学的方法によるＣＭＡの測定を行うと十分な感度が得られる。しかしながら、本発明者らは、生体試料（特に、血液由来試料）の場合には前記測定試薬を用いてもＣＭＡがほとんど検出されないという新たな課題を見出した。一方、生体試料中のＣＭＡを測定するその他の方法としては例えばＬＣ／ＭＳ法等があるが、この方法では特殊な装置が必要となり測定がきわめて煩雑であるという問題がある。そこで、本発明はＣＭＡを簡便に精度よく測定可能なＣＭＡの新たな測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び前記処理した試料中のカルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法によって測定することを含む、試料中のカルボキシメチルアルギニンの測定方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、例えば、生体試料等のような試料中のＣＭＡを簡単かつ精度よく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１の結果の一例を示すグラフである。
【図２】図２は、比較例１の結果の一例を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１及び比較例１の結果から得られた検量線の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、生体試料を尿素（ＣＯ（ＮＨ2）2）によって前処理した後、免疫学的方法によるＣＭＡの測定を行えば、生体試料中のＣＭＡを簡単かつ精度よく測定できるという知見に基づく。
【００１２】
すなわち、本発明は、一態様として、試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び前記処理した試料中のＣＭＡを免疫学的方法によって測定することを含む、試料中のＣＭＡの測定方法（以下、「本発明の測定方法」ともいう）に関する。
【００１３】
尿素による生体試料の前処理を行うことによって、生体試料中のＣＭＡを免疫学的方法を用いて測定できるメカニズムの詳細は明らかではないが、以下のように推定される。すなわち、生体試料、特に血液試料中においてＣＭＡはアルブミン等のタンパク質に結合した状態で存在しているものと考えられる。このため、ＣＭＡを特異的に認識する抗体を添加してもＣＭＡが抗体に結合することができなかったためほとんど検出されなかったが、尿素による前処理を行うことによって、ＣＭＡと結合するタンパク質に構造の変化が生じたり、ＣＭＡとタンパク質との結合が保持されなくなること等により、ＣＭＡと抗体との反応性が向上されるものと考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１４】
本発明の測定方法によれば、生体内に生成及び又は蓄積するＣＭＡ量を簡単かつ精度よく把握することができる。ＣＭＡは、例えば、抗糖化マーカー、皮膚老化マーカー及び又は骨粗しょう症マーカーとしての利用が試みられている。このため、本発明の測定方法によれば、糖化ストレス、皮膚の老化及び又は骨粗しょう症の症状の程度や発症の可能性を把握することができ、これらの予防やアンチエイジングの分野において有用である。さらに、ＣＭＡはコラーゲン中に特異的に生成及び又は蓄積することが知られている。このため、本発明のＣＭＡ測定方法により得られたＣＭＡ測定値に基づき、例えば、コラーゲンの老化度や皮膚の老化度をモニタリングすることができ、その結果からヒトの老化度の評価を行うことができるという効果を奏しうる。
【００１５】
本発明の測定方法において、試料は、前処理剤による測定感度の向上効果が得られやすいことから、生体試料が好ましい。生体試料としては、例えば、尿由来、血液由来、又は組織由来の試料が挙げられる。血液由来の試料としては、例えば、全血試料、血清試料、血漿試料、及び溶血試料等が挙げられる。組織由来の試料としては、生体から採取された組織から調製された試料が挙げられる。組織としては、例えば、コラーゲンを含む組織が挙げられる。コラーゲンを含む組織としては、例えば、骨、皮膚、及び腱等が挙げられる。試料としては、中でも、血液由来試料であれば、前処理剤を用いた処理による測定感度向上効果がさらに得られやすいため好ましい。なお、前記血液由来の試料の中でも血清試料及び血漿試料であればさらに好ましい。試料は、生体から採取したものをそのまま使用してもよいし、希釈して使用してもよい。また、本発明の測定方法によれば、試料に含まれるＣＭＡが単離及び又は精製されたＣＭＡ（ＣＭＡ標品）でなくても、簡単かつ精度よく測定することができる。
【００１６】
本発明の測定方法において、前処理剤は、有効成分として有効な量の尿素を含んでいればよく、例えば、実質的に尿素からなる前処理剤であってもよい。本明細書において「実質的に尿素からなる」とは、前処理剤の原料に含まれる不可避的不純物及び又は前処理剤の製造過程で混入する不可避的不純物を除いては尿素からなることをいう。
【００１７】
尿素を含む前処理剤による試料の処理は、例えば、尿素を含む前処理剤と試料とを溶液中で共存させることにより行うことができる。尿素と試料とを共存させることにより、試料中のＣＭＡと抗体との反応性が向上し、測定感度が向上される。溶液中で前処理剤と試料とを共存させる方法及びその順序は特に制限されず、例えば、試料に前処理剤を添加してもよいし、前処理剤を含む溶液に試料を添加してもよい。
【００１８】
前処理剤による試料の処理工程において、試料を処理するときの尿素の濃度（前処理剤と試料とを含む前処理溶液中の濃度）は特に限定されるものではなく、例えば、０．０１Ｍ〜１０Ｍであり、好ましくは０．０１Ｍ〜８Ｍである。前処理溶液のｐＨは特に限定されるものではなく、例えば、４．０〜９．０であり、好ましくは５．０〜８．０、より好ましくは６．０〜７．５である。
【００１９】
前処理剤による処理温度は特に限定されるものではなく、例えば、０〜６０℃であり、処理直後に免疫学的測定を実施する場合においては、４〜４５℃が好ましく、より好ましくは２５〜３７℃である。前処理剤による処理時間は特に限定されるものではなく、例えば、０．１分〜１２時間であり、測定上の簡便性の点から、０．１〜３０分が好ましく、より好ましくは０．１〜１０分である。
【００２０】
本明細書において「免疫学的方法」とは、ＣＭＡに特異的な抗体、その断片又はその類似体を用いてＣＭＡを検出又は測定する方法をいい、例えば、ＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）法、イムノクロマト法、及び凝集法等が挙げられるが、これらに制限されない。免疫学的方法は、試料の種類に応じて適宜決定してもよく、試料が血液由来試料である場合、測定精度向上の点から、凝集法が好ましい。また、免疫学的方法は、試料中のＣＭＡの状態に応じて適宜決定してもよい。巨大分子中にＣＭＡが複数存在する場合は非競合法が好ましく、ＣＭＡが１分子単独で存在する場合は競合法が好ましい。
【００２１】
免疫学的方法による測定は、例えば、試料中のＣＭＡと、ＣＭＡに特異的に反応する抗体（以下、「抗ＣＭＡ抗体」ともいう）との抗原抗体反応を利用して行うことができる。以下に、免疫学的方法による測定について凝集法を例にとり説明する。凝集法としては、非競合的な方法と、競合的な方法とをとりうる。非競合的な方法により測定を行う場合、特に限定されるものではないが、例えば、抗ＣＭＡ抗体を感作させた粒子（以下、「抗体感作粒子」という）と上記の前処理を行った試料とを混合すること、及び抗体感作粒子の凝集を測定することにより、試料中のＣＭＡを測定することができる。
【００２２】
抗ＣＭＡ抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。抗ＣＭＡ抗体としては、例えば、特開２００２−２４３７３２号公報等に開示のものが挙げられる。抗ＣＭＡ抗体は、市販のものを使用してもよいし、自家調製したものを使用してもよい。抗体を感作させる粒子としては特に制限されるものではないが、免疫学的方法に通常用いられている公知の粒子が使用でき、例えば、不溶性担体粒子、及び磁性粒子等が挙げられる。不溶性担体粒子は特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレンラテックス粒子等のラテックス粒子、ポリプロピレン粒子、ポリエチレン粒子、ゼラチン粒子、金コロイド粒子等が挙げられ、中でもラテックス粒子が好ましい。粒子の粒径は特に限定されるものではないが、ラテックス粒子の場合、例えば、０．０５〜１．０μｍであり、分散性の維持や凝集度の測定のしやすさの点から、０．１０〜０．５０μｍが好ましい。抗ＣＭＡ抗体による粒子の感作の方法は特に制限されることなく、当該分野で公知の方法によって行うことができ、例えば、物理的吸着法及び化学結合法等が挙げられる。抗体感作粒子は、例えば、水又は緩衝液に懸濁させて懸濁液として使用してもよい。懸濁液における粒子の割合は特に限定されるものではなく、例えば、０．０１〜１重量％である。緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えば、グッドの緩衝剤、リン酸緩衝剤、及びトリス緩衝剤等が挙げられる。
【００２３】
前処理後の試料と抗体感作粒子との反応温度は特に限定されるものではなく、例えば、４〜４５℃が好ましく、より好ましくは２５〜３７℃である。反応時間は特に限定されるものではなく、例えば、０．１〜６０分であり、測定の迅速性と測定感度向上の点からは１〜３０分が好ましく、より好ましくは３〜１５分である。抗体感作粒子と試料との混合液中における抗体感作粒子の濃度は特に制限されるものではなく、例えば、０．００１〜０．２ｗ／ｖ％であり、０．０２〜０．０７ｗ／ｖ％が好ましい。凝集の測定は特に制限されるものではなく、例えば、分光光度計や光学測定装置等を用いて、吸光度及び又は濁度を測定することにより行うことができる。
【００２４】
競合的な方法により測定を行う場合、特に限定されるものではないが、例えば、上記の前処理を行った試料とＣＭＡ担持物質と混合すること、ＣＭＡ担持物質と混合した試料を抗体感作粒子と混合すること、及び抗体感作粒子の凝集を測定することにより、試料中のＣＭＡを測定することができる。ＣＭＡ担持物質としては、例えば、ＣＭＡ（抗原）を感作させた粒子、ＣＭＡをヘモシアニン及びアルブミンの担体物質に結合させたもの、グリケーションコラーゲン等が挙げられる。グリケーションコラーゲンとは糖化したコラーゲンのことをいい、例えば、中性リン酸緩衝液中においてコラーゲンをグルコースと共存させて３７度でインキュベーションすることによって調製することができる。グリケーションコラーゲンの調製方法は、例えば、特開２００２−２４３７３２号公報に開示されている。
【００２５】
前処理後の試料とＣＭＡ担持物質との反応温度は特に限定されるものではなく、例えば、４〜４５℃が好ましく、より好ましくは２５〜３７℃である。反応時間は特に限定されるものではなく、例えば、０〜６０分であり、測定の迅速性及び溶液の均一性確保の点からは、０．５〜１０分が好ましく、より好ましくは０．５〜５分である。試料とＣＭＡ担持物質との混合液中におけるＣＭＡ担持物質の濃度は特に制限されるものではなく、例えば、０．００１〜０．２ｗ／ｖ％であり、０．００１〜０．０５ｗ／ｖ％が好ましい。抗体感作粒子との反応温度及び反応時間、並びに抗体感作粒子の混合液中における濃度は、上記の非競合法と同様である。
【００２６】
本発明の測定方法は、免疫学的方法による測定によって得られた結果に基づき、試料中のＣＭＡを定量することを含んでいてもよい。試料中のＣＭＡを定量することにより、糖化ストレス、皮膚の老化及び又は骨粗しょう症の症状の程度や発症の可能性を把握することができ、またコラーゲンの老化度及び又は皮膚の老化度を判定及び又はモニタリングすることができる。
【００２７】
このため、本発明は、その他の態様として、試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、前処理した試料中のＣＭＡを免疫学的方法によって測定すること、及び免疫学的方法により得られた測定結果から試料中のＣＭＡを定量することを含む、糖化ストレス、骨粗しょう症、コラーゲンの老化度又は皮膚の老化度の判定方法に関しうる。
【００２８】
（試料の前処理方法）
本発明は、さらにその他の態様として、試料を尿素を含む前処理剤で処理することを含む、試料中のＣＭＡを免疫学的方法により測定するための試料の前処理方法に関する。本発明の前処理方法によって試料の前処理を行うことにより、例えば、精度の高い免疫学的方法を用いた試料中のＣＭＡの測定が可能になる。前処理剤での処理条件は、上記のＣＭＡの測定方法と同様に行うことができる。
【００２９】
（前処理剤）
本発明は、さらにその他の態様として、尿素を含む、ＣＭＡを免疫学的方法により測定するための試料の前処理剤に関する。本発明の前処理剤によれば、免疫学的方法により試料中のＣＭＡを測定するための試料の前処理を簡便に行うことができる。
【００３０】
前処理剤は、有効成分として有効な量の尿素を含んでいればよく、例えば、実質的に尿素からなる前処理剤であってもよい。
【００３１】
前処理剤の形態は特に制限されることなく、液系（液状試薬）であってもよく、ドライ系であってもよいが、利便性の点からは、水又は緩衝液に溶解させた液状試薬が好ましい。液系である場合、前処理剤における尿素の濃度は特に限定されるものではなく、例えば、０．０１Ｍ〜１０Ｍであり、好ましくは０．０１Ｍ〜８Ｍである。
【００３２】
（免疫学的方法によるＣＭＡの測定用キット）
本発明は、さらにその他の態様として、尿素を含む前処理剤と、免疫学的方法によりＣＭＡを測定するための測定用試薬とを含む、ＣＭＡを免疫学的方法により測定するための測定用キットに関する。本発明の測定キットによれば、免疫学的方法によるＣＭＡの測定を簡便に行うことができる。前処理剤としては、上記の前処理剤が挙げられる。
【００３３】
測定用試薬は特に制限されず、ＣＭＡに特異的な抗体、その断片又はその類似体を用いてＣＭＡを検出又は測定する可能な試薬を含んでいればよく、試薬の構成は測定を行う免疫学的方法により応じて適宜決定することができる。中でも、測定用試薬は、例えば、抗ＣＭＡ抗体感作粒子を含むことが好ましい。抗ＣＭＡ抗体感作粒子は、上述するＣＭＡの測定方法に開示されたものが使用できる。
【００３４】
本発明の測定用キットは、その他に、例えば、試料を希釈するための試料調製液を含んでいてもよい。試料調製液としては特に制限されるものではないが、例えば、水及び緩衝液等が挙げられる。
【００３５】
本発明の測定用キットは、上記試薬を用いて試料中のＣＭＡを免疫学的方法により測定する方法等が記載された取扱い説明書を含むことが好ましい。本発明の測定用キットは、取扱い説明書が本発明の測定キットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
【００３６】
本発明の測定用キットとしては、例えば、前処理剤、及び測定用試薬が試薬パックに収納されていてもよい。試薬パックは、例えば、使い捨て可能なカートリッジ形状であることが好ましく、上記試薬を配置可能な槽を２種類以上備えることがより好ましい。本発明の測定用キットとしては、前処理剤、及び測定用試薬のそれぞれが個別の槽に配置された試薬パックが好ましい。試薬パックは特に制限されるものではないが、例えば、反応槽、検体槽、分注チップ、反応用光学セル、及び廃棄槽等をさらに含んでいてもよい。このような試薬パックを用いることにより、例えば、本発明の測定方法をより一層簡便に実施することができ、また、自動化装置への適用も極めて容易することができる。
【００３７】
（前処理用キット）
本発明は、さらにその他の態様として、尿素を含む前処理剤を含む、試料中のＣＭＡを免疫学的方法により測定するための試料の前処理用キットに関する。本発明の前処理用キットによれば、本発明の前処理方法を簡便に行うことができる。本発明の前処理用キットは、その他に、例えば、試料を希釈するための試料調製液、及び又は上記前処理剤を用いて試料の前処理方法等が記載された取扱い説明書を含むことが好ましい。
【００３８】
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００３９】
［抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子の調製］
抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子は、下記の方法で調製した。まず、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７)にラテックス粒子を添加して０．５ｗ／Ｖ％とし、このラテックス粒子分散液１ｍLに、１ｍｇ／ｍＬ ＷＳＣ水溶液０．３ｍＬを添加して２５℃で１５分間転倒混和した。１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＭＡ抗体を含むＰＢＳ ０．５ｍＬを添加し、２５℃で６０分間転倒混和した。さらに１０ｗ／Ｖ％ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７）４５４μＬを添加し、ラテックス粒子を懸濁させた後に、２５℃で６０分間転倒混和した。次いで、１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，１０℃にて遠心分離し、上清を除去した。得られた残渣に、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ ＢＳＡを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．７）３ｍＬを添加し、ラテックス粒子を懸濁させた後に、再び１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，１０℃にて遠心分離し、上清を除去した。得られた残渣に、５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０５％ ＢＳＡ，０．０５％ アジ化ナトリウムを含む２０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）を２．５ｍＬ添加し、ラテックス粒子を懸濁させ、抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子を調製した。
【００４０】
（実施例１）
［前処理工程］
血清と、等量の７Ｍ尿素水溶液とを混合して２５℃で３０分間インキュベートすることによって試料の前処理を行った。なお、前処理溶液のｐＨは７とした。
［免疫測定工程］
前処理した試料２０μＬを下記第１試薬１１５μＬと混合し、３７℃で５分間インキュベートした。ついで、第２試薬１１５μＬを添加し、６６０ｎｍの吸光度を測定して初期値を得た。さらに、３７℃で５分間インキュベートした後、６６０ｎｍの吸光度を測定し、得られた測定値と初期値との差（Δ吸光度）を得た。また、前処理した試料を蒸留水で２、４又は８倍希釈し、それを用いて上記と同様の測定を行った。その結果を図１に示す。図１において、縦軸はΔ吸光度、横軸は測定時間を示し、１ポイントは１９．９２秒を意味する。なお、測定は日立製の自動分析装置７０７０で行った。
＜第１試薬＞
１％ ＰＥＧ２００００
１％ ＢＳＡ
０．９％ ＮａＣｌ
０．１％ ＥＤＴＡ2Ｎａ
０．０９％ ＮａＮ3
０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ
ｐＨ８．４
＜第２試薬＞
０．０５％ 抗ＣＭＡポリクローナル抗体感作ラテックス粒子（直径：３７０ｎｍ、白色）
５％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
０．０５％ ＢＳＡ
０．０５％ ＮａＮ3
２０ｍＭ ＭＯＰＳ
ｐＨ７．５
【００４１】
（比較例１）
比較例１として、血清を等量の蒸留水と混合し、前処理を行わない以外は実施例１と同様の測定を行った。その結果を図２に示す。
【００４２】
図１及び２の結果に基づき、実施例１及び比較例１について検量線を作成した。その結果を図３に示す。図３において、縦軸はΔ吸光度、横軸は試料（血清）の希釈倍率を示す。図１〜３に示すように、尿素による前処理を行った試料は、前処理を行わなかった試料と比較して、反応性が大幅に向上した。また、尿素により試料の前処理を行うことにより、濃度依存的にΔ吸光度が上昇した。このため、本発明の測定方法によれば、生体試料中のＣＭＡ濃度を免疫学的方法により測定できることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の試料分析方法は、例えば、医療分野、臨床検査の分野等の様々な分野に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のカルボキシメチルアルギニンを測定する方法であって、
前記試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び
前記処理した試料中のカルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法によって測定することを含む、カルボキシメチルアルギニンの測定方法。
【請求項２】
前記前処理剤は、有効成分として尿素を含む、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記試料は、生体試料である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記生体試料が、尿由来、血液由来、もしくは組織由来である、請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
前記免疫学的方法は、エンザイムイムノアッセイ法、イムノクロマト法、及び凝集法からなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
前記免疫学的方法による測定が、前記処理した試料を、カルボキシメチルアルギニンと反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と混合すること、及び前記抗体感作粒子の凝集を測定することを含む、請求項１から５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である、請求項６記載の測定方法。
【請求項８】
前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子、及び金コロイド粒子からなる群から選択される、請求項７記載の測定方法。
【請求項９】
尿素を含む、カルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法により測定するための試料の前処理剤。
【請求項１０】
有効成分として有効な量の尿素を含む、請求項９記載の前処理剤。
【請求項１１】
尿素を含む前処理剤と、
免疫学的方法によりカルボキシメチルアルギニンを測定するための測定用試薬とを含む、カルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法により測定するための測定用キット。
【請求項１２】
前記測定用試薬は、抗体感作粒子を含む、請求項１１記載の測定用キット。
【請求項１３】
前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である、請求項１２記載の測定用キット。
【請求項１４】
前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子、及び金コロイド粒子からなる群から選択される、請求項１３記載の測定キット。
【請求項１】
試料中のカルボキシメチルアルギニンを測定する方法であって、
前記試料を、尿素を含む前処理剤で処理すること、及び
前記処理した試料中のカルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法によって測定することを含む、カルボキシメチルアルギニンの測定方法。
【請求項２】
前記前処理剤は、有効成分として尿素を含む、請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記試料は、生体試料である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記生体試料が、尿由来、血液由来、もしくは組織由来である、請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
前記免疫学的方法は、エンザイムイムノアッセイ法、イムノクロマト法、及び凝集法からなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
前記免疫学的方法による測定が、前記処理した試料を、カルボキシメチルアルギニンと反応する抗体を感作させた抗体感作粒子と混合すること、及び前記抗体感作粒子の凝集を測定することを含む、請求項１から５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である、請求項６記載の測定方法。
【請求項８】
前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子、及び金コロイド粒子からなる群から選択される、請求項７記載の測定方法。
【請求項９】
尿素を含む、カルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法により測定するための試料の前処理剤。
【請求項１０】
有効成分として有効な量の尿素を含む、請求項９記載の前処理剤。
【請求項１１】
尿素を含む前処理剤と、
免疫学的方法によりカルボキシメチルアルギニンを測定するための測定用試薬とを含む、カルボキシメチルアルギニンを免疫学的方法により測定するための測定用キット。
【請求項１２】
前記測定用試薬は、抗体感作粒子を含む、請求項１１記載の測定用キット。
【請求項１３】
前記抗体感作粒子が、不溶性担体粒子に抗体を感作させた抗体感作粒子である、請求項１２記載の測定用キット。
【請求項１４】
前記不溶性担体粒子が、ラテックス粒子、及び金コロイド粒子からなる群から選択される、請求項１３記載の測定キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−５４０２９（Ｐ２０１３−５４０２９Ａ）
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１７０２９９（Ｐ２０１２−１７０２９９）
【出願日】平成２４年７月３１日（２０１２．７．３１）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年７月３１日（２０１２．７．３１）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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