カルモジュリン様皮膚タンパク質を有効成分として含む医薬組成物
【課題】
神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性がヒューマニンよりも強い、内因性ヒューマニン受容体アゴニストを提供すること。
【解決手段】
式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するペプチド、又は、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列を含み、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド等を有効成分として含む、医薬組成物。
神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性がヒューマニンよりも強い、内因性ヒューマニン受容体アゴニストを提供すること。
【解決手段】
式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するペプチド、又は、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列を含み、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチド等を有効成分として含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルモジュリン様皮膚タンパク質を有効成分として含む医薬組成物、特に、アルツハイマー病治療用の医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化はアルツハイマー病（ＡＤ）の発症にとって極めて重要である。ＡＤの発症にとって老化が極めて重要であるということの根底にある仮説の１つは、内因性の防御システムが高齢者ではその有効性がより低くなるというものである（Ｍａｔｓｕｏｋａ，２００９）。ヒューマニンは、抗ＡＤ防御因子候補として機能し得ると推定される内因性の神経栄養因子である（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら，２００４；Ｍａｔｓｕｏｋａら，２００６；Ｍａｔｓｕｏｋａ，２００９、特許文献１）。
【０００３】
ヒューマニンは培養神経細胞の死を抑制し、ロンドン型家族性ＡＤ変異遺伝子のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）であるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現によって誘導される、２４個のアミノ酸からなるペプチド（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ）として、発現クローニング法により同定された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００ａ）。アミロイドベータ（Ａβ）により誘導される死、及び、家族性ＡＤ関連遺伝子の発現により誘導される死を含む、ＡＤ関連神経細胞死モデルをヒューマニンがインビトロで抑制することが、一連の研究により立証されている（概説として、Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら，２００４；Ｍａｔｓｕｏｋａら，２００６参照）。
【０００４】
強力なヒューマニンペプチド誘導体はＦＡＤ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを含むＡＤ関連マウスモデルの記憶障害を改善する（ＭａｍｉｙａとＵｋａｉ，２００１；Ｋｒｅｊｃｏｖａら，２００４：Ｔａｊｉｍａら，２００５；Ｃｈｉｂａら，２００５；Ｋｕｎｅｓｏｖら，２００８；Ｍｉａｏら，２００８；Ｙａｍａｄａら，２００８；Ｃｈｉｂａら，２００９）。Ｃｈｉｂａら（２００９）は、ヒューマニンが、ＳＴＡＴ３の活性化を介して、海馬のコリン作動性神経伝達を向上させることにより、ＡＤマウスモデルの記憶障害を改善することを示した。
【０００５】
ヒューマニンによってもたらされるＡＤ関連の神経細胞死及び神経機能障害の抑制は、細胞表面上の特異的受容体へのヒューマニンの結合とＳＴＡＴ３の活性化とが介在する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００；Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，２００３；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００５）。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（２００９）は、細胞表面上のヒューマニン受容体が、ＩＬ−６受容体ファミリーに属する新規受容体であり、毛様体神経栄養因子受容体a（ＣＮＴＦＲ）、ＷＳＸ−１、及びｇｐ１３０から構成されることを見出した（特許文献２）。この受容体の機能の喪失は、ヒューマニンの活性を無効にする。その特異的受容体の発見は、ヒューマニンの活性がＡＤ関連損傷から神経細胞をインビボで保護する上で重要な役割を果たすという考えを支持するものである。
【０００６】
細胞表面上の受容体に加えて、Ｇｕｏら（２００４）は、細胞質性のヒューマニンがＢａｘと結合しＢａｘが介在するプロアポトーシス経路を中和することにより、スタウロスポリンによって誘発される細胞死を部分的に抑制することを見出した。この知見は、細胞外から細胞表面上のヒューマニン受容体と結合するばかりでなく細胞質中のＢａｘとも結合することにより、その神経保護活性を示すことを示唆する（但し、後者の受容体が、ＡＤ関連神経保護に寄与することを示す証拠は存在しない）（Ｍａｔｓｕｏｋａら，２０１０）。
【０００７】
ヒューマニンに対する特異的抗体を用いた複数の研究により、ヒューマニンは成人精巣において高度に発現され（Ｔａｊｉｍａら，２００３；Ｌｕｅら，２０１０；Ｍｏｒｅｔｔｉら，２０１０）、神経細胞及びグリア細胞を含むその他の組織では弱く発現されることが示されている（Ｔａｊｉｍａら，２００３；Ｍｕｄｚｕｍａｒら，２００９）。この知見は、野生型のヒューマニンは非常に弱い神経保護活性を有することから、脳におけるＡＤ関連神経毒性を抑制するためには、ヒューマニンが精巣から循環系を経由して中枢神経系に送達される必要があり得ることを示すものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開WO2001/021787号パンフレット
【特許文献２】国際公開WO2006/1150267号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒューマニンは、１〜１０μＭのＥＣ５０でＡＤ関連神経細胞死を抑制する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００）。ヒューマニンの有効濃度は、それらの生物学的活性を内分泌的に示すその他のサイトカイン及び生物活性因子の濃度と比べてはるかに高い。従って、ヒューマニンよりも強い活性を有する別の内因性ヒューマニン受容体アゴニストが、ヒューマニン受容体が介在する生存促進性経路（ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙ）を活性化する上で主要な役割を果たし得るという可能性があり、当該技術分野において基礎研究及び臨床的観点からもそのような物質を探索・同定することが強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、ヒト由来の分泌型のカルモジュリン様皮膚タンパク質（ＣＬＳＰ）及びそのカウンターパートであるマウス由来のタンパク質がヒューマニン又はヒューマニンペプチド誘導体と同様な神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有しており、１０〜１００ｐＭのＥＣ５０を有するヒューマニン受容体アゴニストとして機能することを初めて見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は以下の態様にかかるものである。
［態様１］式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するペプチド。
［態様２］態様１記載のペプチド、又は、式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を含み、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
［態様３］以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列における式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（５）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；又は
（６）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
［態様４］神経細胞の機能障害又は細胞死がアルツハイマー病に関連する、態様２又は３記載の医薬組成物。
［態様５］記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、態様２〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［態様６］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
［態様７］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドによる細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を検出する方法であって、（ａ）被検化合物および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
［態様８］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検試料および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞死を検出する工程、（ｃ）神経細胞の機能障害又は細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
［態様９］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）該ペプチド又はポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該ペプチド又はポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
［態様１０］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドを神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法。
［態様１１］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドを、神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのある個体に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法。
［態様１２］
疾患又は疾病がアルツハイマー病である、態様１１記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、従来知られているヒューマニン又はヒューマニンペプチド誘導体に較べて極めて顕著な神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する物質を提供することが出来る。即ち、本発明のポリペプチドの一種であるＣＬＳＰの有するＥＣ５０は１０〜１００ｐＭであると推定され、これは、ＣＬＳＰがヒューマニン（ＥＣ５０＝１〜１０μＭ）よりも１０５−６倍強力な上記活性を有していることを意味する。
【００１３】
更に、本発明のポリペプチドの一種であるマウス由来のＣＬＳＰがインビボにおいてマウスの記憶傷害を抑制（改善）する効果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）マウス精巣及び示された培養細胞（ＭＬＴＣ−１細胞、マウスライディッヒ細胞；ＴＭ３細胞、マウスライディッヒ細胞；ＮＴ２細胞、ヒトテラトカルシノーマ細胞）から調製した溶解物を、ヒューマニン抗体ＰＯ４をコンジュゲートさせたタンパク質Ｇを用いて免疫沈降させた。次に、インプット溶解物及び免疫沈降物を、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続く、銀染色法により分析した。（Ｂ）２０ｋＤの分子量を有し、ＮＴ２細胞から免疫沈降させたタンパク質を含むゲル片を切り出し、質量分析のために使用した。このタンパク質は、ＣＬＳＰと同定された。下線を付したヒトＣＬＳＰのドメインは、ヒューマニンのコアドメインにわずかに類似している。
【図２】（Ａ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞は、ｐＦＬＡＧ−ｈＣＬＳＰ、ｐＦＬＡＧ−ＨＮ又はｐＦＬＡＧベクターを用いてトランスフェクトした。ｐＦＬＡＧ−ｈＣＬＳＰは、ＦＬＡＧエピトープがＣ末端にタグ付加されているｈＣＬＳＰをコードする。トランスフェクションの２４時間後、それらを、Ｂｒｅｆｅｎｄｉｎ−Ａと共に、又は、伴わずに６時間処理した。調整培地及び細胞溶解物を、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体を用いるイムノブロット分析に供した。（Ｂ、Ｃ、及びＤ）ヒトＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、Ｍｙｃ／６ｘＨｉｓ（ＭｙｃＨｉｓ）がＣ末端にタグ付加されているＣＬＳＰをコードするｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、それらを、ＷＳＴ−８細胞生存性アッセイ（Ｂ）、顕微鏡分析（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ｈＣＬＳＰ）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。（Ｅ、Ｆ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞をｈＣＬＳＰに対する抗体（ＣＬＳＰ−Ｎ）と一緒にインキュベートした。トランスフェクションの４８時間後に、それらをＷＳＴ−８細胞生存性アッセイ（Ｅ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ｈＣＬＳＰ）を用いたイムノブロット分析（Ｆ）のために回収した。
【図３】（Ａ）ｈＣＬＳＰ欠失変異体の概略図。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＣＬＳＰ欠失変異をコードするｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰ、又はｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトしたヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞。トランスフェクションを開始して４８時間後に、それらを、顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ＣＬＳＰタンパク質）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。調整培地も、６ｘＨｉｓをタグ付加したタンパク質を吸着するＴＡＬＯＮ金属樹脂を用いてプルダウンするために回収した。次に、沈降物をＭｙｃに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析した。
【図４】ｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮ、又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｓｓｈＣＬＳＰDＮと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトしたＳＨＳＹ−５Ｙ細胞。ｓｓｈＣＬＳＰDＮは、Ｍｅｔ−マウスインスリン様増殖因子−１シグナル配列（Ｓｅｒ１２−Ｇｌｙ３３）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるシグナル配列がＮ末端に結合しているｈＣＬＳＰDＮである。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ａ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ＣＬＳＰタンパク質）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。調整培地も、６ｘＨｉｓをタグ付加したタンパク質を吸着するＴＡＬＯＮ金属樹脂を用いてプルダウンするために回収した。次に、沈降物を、Ｍｙｃに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析した。ロット分析により分析した。
【図５】ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。次に、細胞を、示された濃度の合成ＥＨＤ又はＥＨＤ−Ｇと一緒にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ａ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｂ）、並びに、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロット分析（Ｃ）のために回収した。
【図６】（Ａ）ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰ又はベクターを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、調整培地を回収する前に４８時間、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で培養した。精製したｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓのタンパク質濃度は、基準物質としてＢＳＡを用いたＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色によって測定した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。並行して、同様に精製したベクター形質転換体の調整培地を、陰性対照（ＮＣ）として電気泳動に供した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。次に、細胞を、示された濃度のｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ又は陰性対照（ＮＣ）と一緒にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。ロット分析により分析した。
【図７】（Ａ）ＦＢＳ不含でＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ培地中で４８時間インキュベートされたＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、１０μＭ ＨＮ、１０μＭ ＨＮＡ、又は１００ｐＭ 組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを用いて、３７℃にて１５分間処理し、次に、ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）及び全ＳＴＡＴ３抗体を用いたイムノブロット分析のために回収した。ＨＮＡ（ヒューマニンＡ；Ｃ８Ａ−ヒューマニン）は、ヒューマニン活性を有しないヒューマニン誘導体である（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ）。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰを用いてトランスフェクトした。次に、細胞を、ｇｐ１３０に対する１μｇ／ｍｌの中和マウスモノクローナル中和抗体と一緒にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。ロット分析により分析した。
【図８】ヒトＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（ＣＮＴＦＲ−ＥＤ）（１μｇ）及びヒトｇｐ１３０−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（ｇｐ１３０−ＥＤ）（１μｇ）を、１％のＢｒｉｊ９６を含有する１００μｌのＰＢＳ中に含まれる、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体をコンジュゲートさせたアガロース上に固定化する前に、ヒトＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧ（ＷＳＸ−１−ＥＤ）（推定５μｇ）と一緒に、１００ｎＭのｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ又はヒューマニンの存在下又は非存在下で、６時間、３７℃にてインキュベートした。次に、洗浄した沈降物及びインプット組み換えタンパク質を、抗６ｘＨｉｓ抗体（ＣＮＴＦＲ−ＥＤ及びｇｐ１３０−ＥＤのため）及び抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体（ＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧの検出のため）を用いたイムノブロット分析に供した。ロット分析により分析した。
【図９】Ｆ１１ニューロハイブリッド細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｍＣＬＳＰ−１、又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｍＣＬＳＰ−２と共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションを開始してから７２時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びｍＭｙcに対する抗体（ｍＣＬＳＰ）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。ロット分析により分析した。
【図１０Ａ】（Ａ）ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｍＣＬＳＰ−１又はベクターを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞を、調整培地を回収する前に、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で４８時間培養した。精製したｍＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓのタンパク質濃度は、基準物質としてＢＳＡを用いたＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色によって測定した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。並行して、同様に精製したベクター形質転換体の調整培地を、陰性対照（ＮＣ）として電気泳動に供した。
【図１０Ｂ】（Ｂ）ＰＢＳ、１０ｐｍｏｌの精製ｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、又は陰性対照（ＮＣ）を脳室内注入すると共に、生理食塩水又はスコポラミンを腹腔内注入したＩＣＲマウスのＳＡ％（生理食塩水＋ＰＢＳ及びスコポラミン＋ＰＢＳ群については、Ｎ＝１０；スコポラミン＋ＣＬＳＰ群については、Ｎ＝１２；スコポラミン＋ＮＣ群については、Ｎ＝９）。
【図１０Ｃ】（Ｃ）７ｎｍｏｌのコリベリン、１００ｐｍｏｌの精製ｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、又はＮＣの腹腔内注入を行った又は行なわずに、スコポラミン処置を行ったＩＣＲマウスのＳＡ％（生理食塩水＋ＰＢＳ、スコポラミン＋ＰＢＳ群、及びスコポラミン＋コリベリン群については、Ｎ＝１０；スコポラミン＋ＣＬＳＰ群については、Ｎ＝１１）。データは、平均±ＳＥＭで示す。統計分析は、一元配置分散分析、続いて、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤにより行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ロット分析により分析した。
【図１１】８週齢及び２7月齢のマウスの皮膚断面と海馬断面（ＣＡ１−３領域のピラミッド状の層）を、ｍＣＬＳＰ−１又はｍＣＬＳＰ−２に対する抗体を用いて免疫染色した。目盛りバーは、１０μｍ長である。
【図１２Ａ】（Ａ）健常提供者からの１００μＬの血漿を、抗ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗血清−又は免疫前血清−をコンジュゲートさせたタンパク質Ｇを用いて免疫沈降させた。次に、免疫沈降物を、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗体を用いてイムノブロットした。ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＬＳＰ又はベクターを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞からの粗調整培地（ＣＭ）を、陽性及び陰性対照として使用した。
【図１２Ｂ】（Ｂ）ヒト血漿中のＥＨを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ。示された濃度の精製組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ及びヒト血漿をＥＬＩＳＡアッセイのために使用した。対照ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ濃度（ｘ軸）とＥＬＩＳＡ値（ｙ軸）との間の関係を下のパネルにプロットした。血漿サンプルは３１〜５３歳の４名の健常提供者から取得した。
【図１３】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ＣＬＳＰを用いてトランスフェクトした。次に、この細胞をヒトＣＮＴＦＲ又はヒトＷＳＸ−１に対する中和抗体と共にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を顕微鏡分析のため（Ａ、Ｄ）、ＷＳＴ−８アッセイのため（Ｂ、Ｅ）、及び、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロットアッセイのため（Ｃ、Ｆ）に回収した。ヒトＣＮＴＦＲ又はヒト若しくは対照マウスＩｇＧに対する１μｇ／ｍｌの中和マウスモノクローナル抗体１μＬを、１ｍｌの培地を含む６ウェルディッシュの１つのウェルに添加した（Ａ、Ｂ、Ｃ）。ヒトＷＳＸ−１のＮ末端１６ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体又は免疫前血清１μＬを１ｍｌの培地を含む６ウェルディッシュの１つのウェルに添加した（Ｄ、Ｅ、Ｆ）。
【図１４】５μＬの粗ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗血清及び免疫前血清をタンパク質Ｇビーズと一緒に混合し、ビーズ上に予め吸着させた。次に、１０ｎＭ ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを含む３５０μＬの溶液を、これらのタンパク質Ｇビーズを用いて免疫除去した。免疫除去後、１０μＬの免疫除去物及び投入物をＭｙｃに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書の実施例で示されるように、式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する本発明のペプチド、及び、該ペプチドを含むポリペプチド（タンパク質）、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチドは、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する。更に、配列番号３及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるマウス由来のポリペプチドも神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する。
【００１６】
尚、本発明において「神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性」とは、その原因又は因果関係に依らず、神経細胞における機能障害又は細胞死の少なくとも１つを抑制又は拮抗することを指す。神経細胞死の抑制は、完全な抑制ではなくても、有意に抑制されればよい。神経細胞死の抑制活性は、以下の実施例に記載された方法または他に記載の方法（例えば国際公開番号 ＷＯ００／１４２０４参照）に従って検定することができる。
【００１７】
従って、以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個（例えば、３個〜５個）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列における式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分において、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（５）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個（例えば、３個〜５個）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；又は
（６）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドは医薬組成物の有効成分として有用である。
【００１８】
２つのアミノ酸配列における配列の同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００１９】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列における同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができる。例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定することが出来る。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｈｕｌらによって開発された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。
【００２０】
さらに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴはＢＬＡＳＴより感度良く同一性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２１】
或いは、配列間の同一性として、Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａらによって開発されたＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いることも可能である。このソフトウェアは米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いパラメーターとしては、Ｏｐｅｎ ｇａｐ：１１ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：１ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。更に、高感度なＦＡＳＴＡソフトウェア（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８，１９８８）を用いて同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【００２２】
上記の本発明のペプチド又はポリペプチド（以下、「ポリペプチド等」ともいう）は、これらの官能基を既知の方法により修飾、付加、変異、置換、または削除などにより改変された形態を持つことも可能である。このような官能基の改変は、当業者に公知の任意の方法を用いて、例えば、ポリペプチドに存在する官能基の保護、ポリペプチドの安定性または組織移行性の制御、あるいはポリペプチドの活性の制御等を目的として行なうことが出来る。
【００２３】
即ち、本発明のポリペプチド等は翻訳後修飾などにより天然に修飾されていてもよい。また人工的に修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ末端、またはカルボキシル末端などの修飾が含まれる。また、ポリペプチドは分岐していてもよく、環状でもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、［フラビン（ｆｌａｖｉｎ）、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体、またはホスファチジルイノシトール］等の共有結合、クロスリンク形成、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ピログルタミン酸化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、ユビキチン化などが含まれるが、これらに制限されない。更に、上記ペプチド又はポリペプチドは当業者に公知の任意の塩及びエステル体とすることも可能である。
【００２４】
更に、本発明のポリペプチド等は公知の任意の神経向性ペプチドと融合ポリペプチドを形成することも出来、このような融合ポリペプチドは当業者に公知の任意の方法で容易に合成することができる。
【００２５】
既に述べたように、これまでの研究からアルツハイマー病において神経細胞の細胞死が起こることが明らかにされている。このため、本発明の医薬組成物（薬剤）は、アルツハイマー病における神経細胞の機能障害又は神経変性を保護する薬剤としても用いることが可能である。更に、本発明の薬剤を用いて、アルツハイマー病以外にも、記憶傷害又は神経変性を伴う疾病、例えば脳虚血による神経細胞の細胞死に起因する疾患を予防・治療することも可能である（Ｔ．Ｋｉｒｉｎｏ，１９８２，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２３９：５７−６９）。その他、痴呆を伴うパーキンソン病（Ｍ．Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：２０４５−２０４７）、びまん性レービー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）病（Ｍ．Ｇ．Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６４６９−６４７３）、ダウン症に伴う痴呆なども、治療や予防の対象となる。また、ＡＰＰの類縁分子であるＡＰＬＰ１が、先天性ネフローゼ症候群の原因遺伝子といわれている（Ｌｅｎｋｋｅｒｉ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０２：１９２−１９６）ことから、ネフローゼ症候群などの腎疾患も治療や予防の対象となる。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、有効成分自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。有効成分であるペプチド又はポリペプチドの含有率は使用目的及び製剤形態等に応じて適宜決定すればよい。
【００２７】
患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。脳神経変性疾患の治療に用いる場合においては、本発明の医薬組成物は、静脈内、脊髄腔内、脳室内または硬膜内注射を含む任意の適当な経路で中枢神経系に導入するのが望ましい。投与量、投与方法は、本発明の医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。例えば、１日1回〜数回、１回の処置当り数十μl程度の薬剤を適当な期間に亘り投与することができる。有効成分は、例えば、10 pmol〜100 nmol程度の範囲の濃度とすることができる。
【００２８】
このように、本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病等の神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病の予防または治療に広く用いることが出来る。
【００２９】
従って、本発明は、本発明のポリペプチド等を神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法、及び、本発明の医薬組成物を、アルツハイマー病等の神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのあるヒト等の動物である対象（個体）に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法神経変性障害を伴う疾患を治療する方法に係る。
【００３０】
本発明の医薬組成物の有効成分であるポリペプチド等はヒト及びマウス等の適当な種由来の細胞株等から調製することができ、更に、公知のペプチド合成技術により製造することが可能であり、また、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いて、これらをコードするＤＮＡを含むベクター等を適当な宿主細胞等に導入して発現させることによって製造することも可能である。
【００３１】
このようなベクターはプラスミド又はウイルス性ベクター等の当業者に公知の任意の形態であり、当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。こうして得られたベクターには、本発明の部位特異的組換え酵素のコード領域以外に、５’および３’に非コード配列（核移行シグナル、タグ配列、非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリＡ付加配列、ＩＲＥＳ、ｍＲＮＡ安定化・不安定化配列等を含む）が適宜含まれており、発現ベクターとして機能する。
【００３２】
このようなベクターを用いた当業者に公知の任意の方法、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、並びに、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の各種物理的方法によって、適当な宿主細胞を容易に形質転換させることが出来る。
【００３３】
宿主細胞に特に制限はなく、例えば、ヒト、サル及びマウス等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び、大腸菌等の細菌類を用いることができる。こうして作製された形質転換細胞は当業者に公知の任意の条件で培養し、培養した菌体又はその培養上清等の適当な画分から目的とする本発明のポリペプチド等を容易に調製することが出来る。
【００３４】
更に本発明は、本発明のポリペプチド等による神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）該ポリペプチド等の存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の細胞機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法に係る。
【００３５】
具体的な操作は、本明細書に記載された方法に従って行うことができる。この方法は、本発明のポリペプチド等が様々な細胞における細胞死に対して抑制効果を有するかどうかを決定したり、その抑制効果を定量するために用いられ得る。細胞としては特に制限はなく、細胞死を起し得るさまざまな細胞が用いられる。また、細胞死の誘導は、それぞれの細胞に応じて公知の細胞死誘導系を使用することができる。また、神経細胞を用いて、神経細胞死を誘導するさまざまな刺激、環境変化、または遺伝子発現などの諸条件に対する本発明のポリペプチド等の効果を検出するためにも用いられ得る。また、このような検出は、生物種や亜種、または個体間に存在し得る、神経細胞死における本発明のポリペプチド等に対する感受性の違いを検出するために用いられ得る。これにより、例えば民族、人種、または個人間で、本発明のポリペプチド等の有効性を検討することができる。このような方法により、例えば臨床適用に向けた詳細な条件検討を行うことができる
【００３６】
又、本発明は、本発明のポリペプチド等による神経細胞の細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を検出する方法であって、（ａ）被検化合物および該ポリペプチド等の存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、 （ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法に係る。
【００３７】
この方法は、本発明のポリペプチド等による神経細胞死を促進したり抑制したりする化合物をアッセイするために用いられ得る。本発明のポリペプチド等は、神経細胞表面に作用して細胞死抑制効果を発揮すると考えられる。この方法を用いれば、本発明のポリペプチド等の細胞表面への接触を阻害し得る候補化合物や、逆に促進し得る候補化合物の作用を検証することができる。
【００３８】
また、この検出方法を用いて、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングすることも可能である。この方法は、（ａ）被検試料および本発明のポリペプチド等の存在下で神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞死を検出する工程、および（ｃ）神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む。工程（ｃ）においては、任意の対照における場合と比較することができる。例えば、工程（ｃ）において、被検試料非存在下において検出した場合に比べ、被検試料存在下において神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択することができる。神経細胞死を促進する化合物は、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制を阻害する化合物の候補となり、神経細胞死を抑制する化合物は、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制をさらに促進する化合物の候補となる。また、上記のスクリーニングにおいて、被検試料とは別の化合物における場合を対照とすることもできる。例えば本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制を調節し得る別の化合物を用いて細胞死を検出し、工程（ｃ）において、該化合物の存在下における場合に比べ、工程（ａ）で用いた被検試料存在下において神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択することもできる。このようなスクリーニングにおいては、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制の調節能に関して、既存の化合物よりもさらに高い効果を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００３９】
上記のスクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。神経細胞死の誘導や本発明のポリペプチドの投与は、当業者に公知の任意の方法に従って行うことができる。
【００４０】
被検試料を細胞に適用する時期に特に制限はなく、本発明のポリペプチド等を適用する前、後、または同時に適用することができる。被検試料の適用方法に制限はなく、培養細胞系であれば、例えば培地に添加される。また核酸であれば、細胞内に導入されてもよい。その他の任意の投与方法により被検試料を適用することができる。
【００４１】
上記の化合物の作用の検査により評価された化合物、あるいはスクリーニングにより得られた化合物は、本発明のポリペプチド等の活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。
【００４２】
更に本発明は、本発明のポリペプチド等に結合する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該ポリペプチド等に被検試料を接触させる工程、（ｂ）該ポリペプチド等と被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法に係る。
【００４３】
本発明のポリペプチド等は、スクリーニングの手法に応じて、可溶性ポリペプチドとして、また担体に結合させた形態としてスクリーニングに用いることができる。本発明のポリペプチド等は標識されていてもよい。標識としては、放射性同位元素による標識、蛍光物質による標識、ビオチンやジゴキシゲニンによる標識、タグ配列の付加などが挙げられる。
【００４４】
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。被検試料は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４５】
例えば、本発明のポリペプチド等と結合するタンパク質をスクリーニングする場合は、本発明のポリペプチド等を固定したアフィニティーカラムに本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現していることが予想される組織または細胞の細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより、本発明のポリペプチド等に結合するタンパク質のスクリーニングを実施することが可能である。
【００４６】
さらに、本発明のポリペプチド等と結合するタンパク質を発現していることが予想される組織若しくは細胞（例えば脳皮質組織、またはＦ１１などの神経細胞）よりファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、アガロース上にプラークを形成させ、標識した本発明のポリペプチド等を用いてウエストウエスタンブロッティング法によりスクリーニングしたり、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域などのＤＮＡ結合ペプチドおよびＧＡＬ４転写活性化領域などの転写活性化ペプチドを、それぞれ本発明のポリペプチド等と被検タンパク質との融合タンパク質として発現させ、ＤＮＡ結合ペプチドの結合配列を有するプロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子の発現を通して本発明のポリペプチド等と被検タンパク質との結合を検出する「ｔｗｏハイブリッドシステム」等に従い実施することも可能である。
【００４７】
本発明のスクリーニングにより、本発明のポリペプチド等に対する受容体をクローニングすることも考えられる。この場合、被検試料は受容体を発現していることが予想される組織または細胞、例えば脳皮質組織、神経細胞株、または神経芽細胞腫や奇形腫細胞などから調製することが好ましい。神経細胞株としては、例えばＦ１１細胞、ＰＣ１２細胞（Ｌ．Ａ．ＧｒｅｅｎｅおよびＡ．Ｓ．Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，１９７６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３：２４２４−２４２８）、ＮＴＥＲＡ２細胞（Ｊ．ＳｋｏｗｒｏｎｓｋｉおよびＭ．Ｆ．Ｓｉｎｇｅｒ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６０５０−６０５４）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ．Ｏｄｅｌｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２２４：６９−８２）等が挙げられる。
【００４８】
また、固定化した本発明のポリペプチド等に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、結合する分子をスクリーニングすることも考えられる。また、表面プラズモン共鳴現象を利用した結合の検出によるスクリーニングも可能である（例えばビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）など）。これらのスクリーニングは、コンビナトリアルケミストリー技術を用いたハイスループットスクリーニングにより行うことも可能である。
【００４９】
本発明のスクリーニングにより得られた本発明のポリペプチド等に結合する化合物は、本発明のポリペプチド等の活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。
【００５０】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
［ＣＬＳＰはヒューマニン抗体によって免疫沈降する］
ヒューマニンに対する抗体ＰＯ４（Ｔａｊｉｍａら，２００３）を用いることにより、ヒトＮＴ２神経芽細胞腫細胞溶解物から２０ｋＤのタンパク質を免疫沈降させた（図１Ａ）。質量分析によって、このタンパク質はＣＬＳＰ（カルモジュリン様皮膚タンパク質；ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｋｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と同定された。ヒトＣＬＳＰ（ｈＣＬＳＰ）は１４６個のアミノ酸から成るタンパク質であって、主として皮膚ケラチノサイトで発現されＣａ２＋結合モチーフであるＥＦハンドを有するカルモジュリン関連タンパク質である（Ｍｅｈｕｌら，２０００；Ｈｗａｎｇら，２００３）。細胞内のシグナル伝達におけるその関与は、未だ特徴が明らかにされていない。かかるヒトＣＬＳＰのアミノ酸配列を配列番号１として示す。
【００５２】
ｈＣＬＳＰは４３番目から５９番目のアミノ酸から成る配列：ＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳＤを含む。一方、２４個のアミノ酸からなるヒューマニンには、１７個のアミノ酸から成るコア領域（ＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰ）が含まれている。これらアミノ酸配列を比較すると、互いの同一性は低いことがわかる（下線を付したアミノ酸は同一である）（図１Ｂ）。特に、ヒューマニンの活性にとって必須である上記コア領域のＰｒｏ３、Ｓｅｒ７、Ｃｙｓ８、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１２、Ｔｈｒ１３、Ｓｅｒ１４、及びＰｒｏ１９（特許文献１、Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，２００３）の中で、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１２、及びＳｅｒ１４がｈＣＬＳＰ中で保存されているにすぎない。従って、ｈＣＬＳＰのこの領域は構造的にはヒューマニンのコア領域との相同性又は類似性は極めて低いが、便宜的に、ヒューマニン様ドメイン（Ｈｕｍａｎｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ；ＨＬＤ）と命名した。
【実施例２】
【００５３】
［ＣＬＳＰはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される神経細胞死を抑制する］
ｈＣＬＳＰ（Ｃ末端にＭｙｃＨｉｓタグを付している）及びヒューマニン（Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付している）を、ヒトＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞中で発現させた。Ｈｉｓタグに吸着するＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ｒｅｓｉｎビーズを用いたｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓの精製、並びに、ＦＬＡＧ抗体をコンジュゲートさせたビーズを用いたヒューマニン−ＦＬＡＧの精製の結果、回収した調整培地及び細胞溶解物中にｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ及びヒューマニン−ＦＬＡＧの存在が認められた（図２Ａ）。小胞体−ゴルジ体輸送の阻害物質であるブレフェンディンＡによる処理によって、調整培地中に分泌されるＧｈＣＬＳＰ及びヒューマニンの量が少なくなった（図２Ａ）。これらの結果は、ＣＬＳＰ（典型的な分泌リーダー配列は欠けている）が、通常の細胞内分泌メカニズムを介して分泌されることを示唆している。ヒューマニンの分泌については、初期の研究においてすでに示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ）。
【００５４】
Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰの強制的発現は、初期の研究から予想されるように、ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞の死を誘発した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９）。結果として、このことは、ディッシュに付着している生存細胞数（図２Ｂ）とＷＳＴ−８アッセイによる細胞生存率（図２Ｃ）の両方の減少をもたらした。ｈＣＬＳＰの同時発現は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＳＨＳＹ−５Ｙ細胞の細胞死を抑制した（図２Ｂ及び２Ｃ）。イムノブロット分析によって、Ｖ６４２Ｉ−ＰＰの発現をダウンレギュレートすることによりｈＣＬＳＰが細胞死を抑制するという可能性は除外された（図２Ｄ）。
【００５５】
免疫前血清の添加でなく、１６個のアミノ酸から成るｈＣＬＳＰのＮ末端領域（「ｈＣＬＳＰ−Ｎ」と命名）に対する抗体をアッセイ系に添加することによって、ｈＣＬＳＰ発現をダウンレギュレートすることなく、ｈＣＬＳＰによって介在される細胞死を抑制する活性が無効になった（図２Ｅ及び２Ｆ）。この結果は、分泌されたｈＣＬＳＰは細胞の外側からその活性を示し、ｈＣＬＳＰ抗体が培地中のｈＣＬＳＰと結合することによりｈＣＬＳＰ活性を中和し得ることを示唆する。
【実施例３】
【００５６】
［ＣＬＳＰの培地中への分泌はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死に対するＣＬＳＰが介在する抑制にとって必須である］
ｈＣＬＳＰの欠失変異体ｈＣＬＳＰ−DＣ１及びｈＣＬＳＰ−DＣ２（これらは、それぞれ、Ｃ末端領域（アミノ酸７９〜１４６）及び（アミノ酸６２〜１４６）を欠失している）をコードする発現ベクターを、細胞死アッセイのために構築した（図３Ａ）。各変異体の同時発現は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死を抑制した（図３Ｂ及び３Ｃ）。イムノブロット分析によって、これらの変異体が調整培地中に分泌されることが示された（図３Ｄ）。これらの結果から、Ｎ末端の１〜６１領域はｈＣＬＳＰによって誘導される細胞死の抑制にとって十分であることが示された。
【００５７】
一方で、欠失変異体ｈＣＬＳＰ−DＮ（Ｎ末側領域（アミノ酸２−３９）を欠失している）をコードする発現ベクターを、別の細胞死アッセイのために構築した（図３Ａ）。同時に、Ｍｅｔ−ＩＧＦ−１シグナル配列（Ｓｅｒ１２−Ｇｌｙ３３）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなる２５個のアミノ酸配列が分泌を促進させるためにｈＣＬＳＰ−DＮのＮ末端に付いている、ｓｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮをコードするベクターを構築した。その結果、ｈＣＬＳＰ−DＮの発現はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死を抑制しなかった。一方で、ｓｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮの発現はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死を抑制した（図４Ａ及び４Ｂ）。ｈＣＬＳＰ−DＮは分泌されなかったのに対して、ｓｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮは培地中に分泌された（図４Ｃ）。この結果から、Ｎ末端の３８アミノ酸領域の欠失は、ＣＬＳＰの作用にとって必須であるｈＣＬＳＰの培地中への分泌を阻害することが示された。
【００５８】
以上のｈＣＬＳＰの欠失に関する分析結果から、ｈＣＬＳＰに含まれる２２個のアミノ酸（アミノ酸４０〜６１）から成る領域：ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳＤＧＤ（又は、「ＴＧＬ−ＨＬＤ−ＧＤ」）は、神経細胞死のｈＣＬＳＰが介在する抑制において中心的役割を果たすという結論がもたらされた。この領域を、内因性ヒューマニン様ドメイン（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｈｕｍａｎｉｎ−ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎ；ＥＨＤ）と命名した。尚、かかるＥＨＤのアミノ酸配列を配列番号２で示す。
【実施例４】
【００５９】
［合成ＥＨＤ（培地中に添加）はヒューマニン活性を示す］
ＥＨＤがｈＣＬＳＰによって誘導される抑制のためのｈＣＬＳＰのコア領域であることを確かめるために、ＥＨＤペプチドを化学的に合成し、それがｈＣＬＳＰを模倣するか否かを調べた。ヒューマニン変異体Ｓ１４Ｇ−ヒューマニンは野生型ヒューマニンと比べて１０００倍以上強力であることから（Ｔｅｒａｓｈｉｔａら，２００３）、比較のためにＥＨＤ−Ｇも合成した（この場合、５４番目のセリン（ヒューマニンにおける１４番目のセリンと類似）がグリシンに置換されている）。１０μＭの濃度のヒューマニン又はＥＨＤと一緒にインキュベートするとＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死は抑制されたのに対して、１０ｎＭの濃度のヒューマニン又はＥＨＤでは細胞死は抑制しなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。Ｓ５４Ｇ置換は、ヒューマニン活性を増強しなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。これらの結果は、ＥＨＤが神経細胞の死を抑制する活性を有することを裏付けるばかりでなく、分泌されたｈＣＬＳＰが細胞の外側から該活性を示すという考えをも支持するものである。これらのペプチドと一緒にインキュベートすることは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現に影響を与えなかった（図５Ｃ）。
【実施例５】
【００６０】
［ＣＬＳＰはヒューマニンよりもはるかに強力である］
Ｔａｌｏｎ Ｍｅｔａｌビーズを用いて、ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを過剰発現するＦ１１細胞の調整培地から、ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓをアフィニティー精製した。模擬精製は骨格ベクターを用いてトランスフェクトしたＦ１１細胞の調整培地を用いて行った。ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓの濃度は、クーマシーブルー染色によって推定した（図６Ａ）。ＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを過剰発現するＣＯＳ７細胞の調整培地から部分精製した各種濃度の組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを用いることにより、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死の抑制のためのｈＣＬＳＰの有効濃度を推定した。図６Ｂ及び６Ｃに示されるように、ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓは、用量に依存して神経細胞死を抑制した。推定されるＥＣ５０は１０〜１００ｐＭである。この結果は、ＣＬＳＰがヒューマニン（ＥＣ５０＝１〜１０μＭ）よりも１０５−６倍強力であることを示した。一方で、ＥＨＤペプチドのＥＣ５０は、１０ｎＭよりも高いことから（図５）、ｈＣＬＳＰのＥＨＤ及び／又は調整培地中でＣＬＳＰと複合体を形成するその他のタンパク質と比較して、その他の領域が、未だ特徴が明らかにされていない方法を介してＥＨＤのヒューマニン活性を増強する可能性が高い。
【実施例６】
【００６１】
［ＣＬＳＰはヒューマニン受容体を介して神経細胞の死を抑制する］
図７Ａに示されるように、組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ（概算濃度１００ｎＭ）又は合成ヒューマニン（１００μＭ）との同時インキュベーションは、７０５番目のチロシンにおけるＳＴＡＴ３のリン酸化を増大させた。この結果は、ＣＬＳＰがヒューマニン受容体と結合し、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３生存促進経路を活性化することにより、神経細胞死を抑制することを示唆する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９）。裏付けとして、ｇｐ１３０に対する中和抗体は、ヒューマニンが介在する神経保護活性についての初期の研究において示されるように（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９）、ＣＬＳＰによって誘発される神経細胞死の抑制を弱めた（図７Ｃ〜Ｄ）。ＣＮＴＦＲ及びＷＳＸ−１に対する中和抗体もまた、ＣＬＳＰによって誘発される神経細胞死の抑制を弱めた（図１３Ａ〜Ｆ参照）。
【００６２】
精製組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ又はヒューマニンの存在下で、ＣＮＴＦＲの組み換え細胞外ドメイン及びｇｐ１３０及び可溶性ＷＳＸ−１の混合物を一緒にインキュベートすることにより行うインビトロ再構成アッセイ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９ａ；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９ｂ）において、ＷＳＸ−１とＣＮＴＦＲとの間、及び、ＷＳＸ−１とｇｐ１３０との間のヘテロダイマー化をもたらした（図８）。全てのこれらの結果は、ＣＬＳＰがヒューマニン受容体アゴニストであるということを示した。
【実施例７】
【００６３】
［ＣＬＳＰはスコポラミンによって誘発されるマウスの記憶障害を抑制する］
ヒトＣＬＳＰ遺伝子に関しては、元々Ｓｃａｒｆ１及びＳｃａｒｆ２と名付けられた２つのマウスのカウンターパート遺伝子が存在する（Ｈｗａｎｇら，２００３）。マウスＳｃａｒｆ１はアミノ酸レベルでヒトＣＬＳＰと５０．０％の同一性を示す。マウスのＳｃａｒｆ１及びＳｃａｒｆ２は、高度に類似しており、それらの遺伝子はマウス染色体１５．３に１５．３ｋＢの間隔で並んで配置されている（Ｈｗａｎｇら，２００３）。これら遺伝子をマウスＣＬＳＰ−１（ｍＣＬＳＰ−１）及びマウスＣＬＳＰ−２（ｍＣＬＳＰ−２）と命名する。これらのいずれかとの同時発現によってＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＦ１１細胞の細胞死が完全に抑制されたのに対して（図９）、それらは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死は部分的にのみ抑制した（データは示さず）。一方で、ヒトＣＬＳＰは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の死を完全に抑制することができるのに対して、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＦ１１細胞の死は部分的にのみ抑制した（データ示さず）。これらの結果は、ＣＬＳＰが部分的に種特異的なヒューマニン活性を示すことを示している。尚、マウスＳｃａｒｆ１及びマウスＳｃａｒｆ２のアミノ酸配列を夫々、配列番号３及び配列番号４で示す。
【００６４】
ヒューマニンペプチド誘導体は、家族性ＡＤ関連遺伝子を過剰発現するトランスジェニックＡＤマウスを含むＡＤマウスモデルの記憶障害を改善することが知られている（ＭａｍｉｙａとＵｋａｉ，２００１；Ｋｒｅｊｃｏｖａら，２００４：Ｔａｊｉｍａら，２００５；Ｃｈｉｂａら，２００５；Ｋｕｎｅｓｏｖら，２００８；Ｍｉａｏら，２００８；Ｙａｍａｄａら，２００８；Ｃｈｉｂａら，２００９）。
【００６５】
そこで、次に、ＣＬＳＰがインビボにおいてヒューマニンを模倣するか否かについて検討した。ｍＣＬＳＰ１−ＭｙｃＨｉｓを過剰発現するＣＯＳ７細胞の調整培地から部分精製した組み換えｍＣＬＳＰ１−ＭｙｃＨｉｓを使用し、陰性対照としてＦ１１細胞の調整培地を用いて模擬精製し（図１０Ａ）、ＣＬＳＰ−１がスコポラミンによって誘発される記憶障害を改善するか否かをＹｍａｚｅ試験によって調べた（Ｃｈｉｂａら，２００５）。予め脳室内に投与された組み換えｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓは、スコポラミンによって誘発される記憶障害を減少させたのに対して、陰性対照の投与は減少させなかった（図１０Ｂ）。部分精製した組み換えｍＣＬＳＰ−１及び強力なヒューマニン誘導体ペプチドである合成コリベリン（Ｃｈｉｂａら，２００５）の腹腔内注入によってもスコポラミンによって誘発される記憶障害を改善した（図１０Ｃ）。後の結果は、末梢的に注入されたＣＬＳＰが、血液脳関門を通過し、脳内でその活性を示すことを示唆する。
【実施例８】
【００６６】
［皮膚におけるマウスＣＬＳＰ−１及びＣＬＳＰ−２の発現］
以前の研究によって、ヒトＣＬＳＰは皮膚及びその他の表皮組織において高度に発現することが示されている（Ｍｅｈｕｌら，２０００；Ｈｗａｎｇら，２００３）。マウスＣＬＳＰ−１及びＣＬＳＰ−２は筋肉でも発現した（Ｈｗａｎｇら，２００３）。本発明者は、ｍＣＬＳＰ−１及びｍＣＬＳＰ−２が８週齢及び２０月齢のマウスの皮膚組織及び筋肉で高度に発現されていることを免疫組織化学により見出した（図１１）。一方中枢神経の海馬における発現レベルは皮膚におけるレベルよりもはるかに低いことが示された（図１１）。
【実施例９】
【００６７】
［ＣＬＳＰはヒト血漿中で検出される］
更に、健常人の血漿中のＣＬＳＰを検出した。１００μＬのヒト血漿をヒトＣＬＳＰに対する抗体を用いて免疫沈降させ、得られた沈降物を同じ抗体を用いてイムノブロットした。免疫沈降効率はほぼ１００％であった。図１２Ａに示されるように、２０ｋＤの分子量を有するタンパク質はＣＬＳＰ抗体によって得られた沈降物中にのみ検出された。このタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で組み換え野生型ＣＬＳＰと完全に同じように移動した。この結果は、ヒト血液中におけるＣＬＳＰの存在を示した。血漿中のＣＬＳＰの概算濃度は５００ｐＭ〜１ｎＭであった。
【００６８】
別の検出方法として、同じ抗体を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）システムも開発した。このＥＬＩＳＡは１０〜５０ｐＭの濃度を有する組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを検出することが可能である（図１２Ｂ）。これを利用することにより、ヒト血漿中のＣＬＳＰ濃度が約５０〜５００ｐＭであることを示した（図１２Ｂ）。このＥＬＩＳＡによって推定された濃度は、イムノブロット分析によって推定された濃度よりも低い。このＥＬＩＳＡシステムは、全ＣＬＳＰの画分のみを検出し得る可能性が高い。
【００６９】
以上の実施例で使用された材料及び方法は以下の通りである。尚、特に記載がない場合には、当業者に公知の適当な方法・手段で実施した。
【００７０】
［タンパク質の精製、ヒューマニン抗体ＰＯ４による免疫沈降］
免疫沈降物はＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、ＰＶＤＦ膜上へ転写し、銀染色ＭＳキット（Ｗａｋｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）を用いて染色した。タンパク質のバンドを切り出して、リシルエンドペプチダーゼを用いて消化し、質量分析法（Applied Biosystems社のPerSeptive Biosystem Voyager-DE/RP）により分析した。
【００７１】
［遺伝子、ポリペプチド、及び材料］
ヒトおよびマウス皮膚組織よりmRNAを調製し、それぞれの遺伝子に対応したプライマーを作成して、RT-PCR方法で、hCLSPならびにmCLSP-1 及びmCLSP-1cDNAをクローニングした。RT-PCR方法でｐｃＤＮＡベクター中でＶ６４２Ｉ−ＡＰＰをコードするｃＤＮＡが、これまでに記述されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ，ｂ）。細菌中でＧＳＴタグ付ＣＬＳＰを作製するために、ヒトＣＬＳＰ ｃＤＮＡをｐＧＥＸベクター中に導入した。Ｃ末端にＭｙｃＨｉｓタグの付いたタンパク質を作製するために、ヒトＣＬＳＰ（ｈＣＬＳＰ）、ｈＣＬＳＰ欠失変異体、マウスＣＬＳＰ−１（ｍＣＬＳＰ−１）、及び、マウスＣＬＳＰ−２（ｍＣＬＳＰ−２）をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ中に導入した。Ｃ末端にＦＬＡＧタグの付いたＣＬＳＰ（ＣＬＳＰ−ＦＬＡＧ）を作製するために、ヒトＣＬＳＰｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧベクター中に導入した。
【００７２】
ヒトＣＮＴＦＲ（アミノ酸１〜３９０）の細胞外ドメイン（ＥＤ）は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域をコードし、Ｃ末端に６ｘＨｉｓタグを付加したｃＤＮＡとインフレームで融合し（ＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−Ｈｉｓ）、ヒトＷＳＸ−１（アミノ酸１〜３９０）のＥＤは、ヒトＷＳＸ−１の完全な細胞外ドメインを含む。組み換えヒトｇｐ１３０−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。
【００７３】
ヒューマニン、コリベリン（Ｃｈｉｂａら，２００５）、ＥＨＤ（ＴＧＬＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳＤＧＤ）及びＳ５４Ｇ−ＥＨＤ／ＥＨＤ−Ｇ（ＴＧＬＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＧＥＶＤＳＤＧ）は、エール大学（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）のＫｅｃｋ基金バイオテクノロジー資源研究所によって合成された。
【００７４】
［抗体］
抗体は以下の企業から購入した：Ｍｙｃ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ)；ＦＬＡＧ（Ｍ２），Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；ＡＰＰ（２２Ｃ１１)，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ｐｈｏｓｈｏＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５），Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；ＳＴＡＴ３（Ｃ−２０），Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。ＧＳＴ−ｈＣＬＳＰに対するウサギポリクローナル抗体（ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗体と命名）は、Ｎ末端にＧＳＴタグが付けられた組み換えヒトＣＬＳＰを用いて免疫することにより作製し、細菌中で産生させた。ヒトＣＬＳＰに対する別のウサギポリクローナル抗体（ＣＬＳＰ−Ｎ抗体と命名）は、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をコンジュゲートさせたｈＣＬＳＰのＮ末端１６アミノ酸ペプチドに相当する合成ペプチドを用いて免疫することにより作製した。ＣＬＳＰ−Ｎ抗体は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰにより誘発される死のＣＬＳＰが介在する抑制を阻害する。
【００７５】
「細胞、細胞死、及び生存性試験」
マウスＭＬＴＬ−１マウスライディッヒ細胞（ATCC番号CRL-2065）、ＴＭ３ライディッヒ細胞（ATCC番号CRL-1714）は、ＡＴＣＣから取得した。ヒトテラトカルシノーマ細胞株ＮＴＥＲＡ−２（ＮＴ２）はSTRATAGENE社から購入した。Ｆ１１細胞（胚齢１３日目のラット初期培養神経細胞及びマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２のハイブリッド））は上記のＨａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００；２０００ａ及び２００３に記載の方法で調製した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ATCC番号CRL-2266）は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２混合液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で増殖させた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、６ウェルプレート中、２ｘ１０５細胞／ウェルの濃度で、１２〜１６時間播種し、血清非存在下で、示されたベクターを用いて３時間トランスフェクトして、次に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−１０％中で培養した。トランスフェクションを開始して２４時間後に、続いて、培地を、レスキュー因子を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２補助物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換した。トランスフェクションを開始して４８時間の時点で、細胞の死亡率及び生存率のアッセイのために細胞を回収した。細胞生存性は、ＷＳＴ−８アッセイ及びカルセイン染色アッセイによって測定した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ，ｂ，２００５ａ，ｂ）。
【００７６】
ＷＳＴ−８アッセイ（細胞計数キット−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施）は、細胞が、水溶性の２−（２−メトキシ−４−ニトロフェリル）−３−（４−ニトロフェリル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩を、水溶性のフォルマザンに変換する能力に基づく。細胞は、３７℃にて２時間、ＷＳＴ−８試薬を用いて処理し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。カルセイン染色は記載されるようにして行った（Ｂｏｚｙｃｚｋｏ−Ｃｏｙｎｅら，１９９３）。手短に述べると、６ＭのカルセインＡＭ（３，６−ジ−（Ｏ−アセチル）−２，７−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオロセイン、テトラアセトキシメチルエステル；Ｄｏｊｉｎｄｏ）を細胞に添加し、カルセインＡＭ処理後３０分以上してから、カルセイン特異的蛍光（励起４８５ｎｍ；放射５３５ｎｍ）を、蛍光顕微鏡で観察するか、又は、蛍光分光光度計（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）で測定した。
【００７７】
Ｆ１１細胞を、これまでに記載されるようにして（Ｐｌａｔｉｋａら，１９８５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００）、１８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び抗生物質を含有する、ＨａｍのＦ−１２培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で増殖させた。ＨａｍのＦ−１２＋１８％ＦＢＳ（ＨＦ−１８％）中で１２〜１６時間培養したＦ１１細胞（６ウェルプレートの１ウェル当たり７ｘ１０４細胞）を、リポフェクション法［特に明記されない限り、ｃＤＮＡ，１．０μｇ；ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），２ｌ；ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），４μｌ］によりＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ遺伝子を用いて、血清の非存在下で３時間トランスフェクトし、ＨＦ−１８％で２時間インキュベートした。トランスフェクションを開始して５時間後に、培地を、ＨＦ−１０％に交換した。トランスフェクションを開始して２４時間後に、次に、それらを、レスキュー因子を含有するＨａｍのＦ１２＋Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。トランスフェクションを開始して７２時間後に、細胞の死亡率及び生存率についてのアッセイを行った。
【００７８】
［イムノブロット分析］
イムノブロット分析は、従来文献に記載されるようにして行った（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ，ｂ）。Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞からの溶解物（１レーン当たり２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（又は、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、次に、ポリ二フッ化ビニリデンシートに電気的にブロッティングした。シートを、２２Ｃ１１抗体に、次に、１：５０００の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗マウス又は抗ラットＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に浸した。抗原のバンドは、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により可視化した。
【００７９】
［ＣＬＳＰにより誘導されるＨＮ受容体サブユニットのオリゴマー化］
組み換えヒトＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ及びマウスＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧを作製するために、ＣＯＳ７細胞を、各タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、Ｎｉ ＮＴＡアガロース（１：１スラリー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２をコンジュゲートさせたアガロース（１：１スラリー；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた沈降のために調整培地を回収した。結合しているＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓを、１０ｍＭのイミダゾール溶液を用いて洗浄し、製造業者の説明書にしたがって、２５０ｍＭのイミダゾール溶液を用いて溶出した。溶出されたＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓを、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により脱塩し、次に、１／１０容量の１０ｘＰＢＳを、脱塩したタンパク質溶液に添加した。オリゴマー化を誘導するために、ｇｐ１３０−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（１mｇ）及び／又はＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（１μｇ）を、１％Ｂｒｉｊ９６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１００μｌのＰＢＳ中に含まれる抗ＦＬＡＧｍＡｂ Ｍ２をコンジュゲートしたアガロースビーズ上に固定化されたＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧ（推定５μｇ）と一緒に、ペプチドの存在下、３７℃にて６時間インキュベートした。オリゴマー化されたタンパク質は、同じバッファーで十分に洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画及びイムノブロット分析により可視化した。
【００８０】
［組み換えＣＬＳＰタンパク質の精製］
ＧＳＴ−融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＬＳＰ）を、１ｍＭ イソプロピル−チオ−b−Ｄ−ガラクトピラノシドの存在下、大腸菌ＢＬ−２１中で、３７℃にて４時間発現させ、従来文献に記載されるようにして精製した（Ｍａｔｓｕｏｋａら，２０００）。
【００８１】
ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ及びｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓの精製のために、ＣＯＳ７細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰプラスミドを用いてトランスフェクトし、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの４８時間後に、調整培地を回収した。分泌されたＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓタンパク質を、製造業者の説明書にしたがって、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてアフィニティー精製した。溶出液は、Ｚｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩した。１／１０容量の１０ｘＰＢＳ及び適当量のプロテアーゼカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）溶液を、脱塩した溶出物に添加した。精製されたＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓのタンパク質濃度は、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色により推定した。ＢＳＡを、濃度標準として使用した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。模擬（ｍｏｃｋ）精製のために、ＣＯＳ７細胞を、骨格ベクターを用いてトランスフェクトした。続いて、上記と同じ精製手順を用いた。
【００８２】
［Ｔｙｒ７０５リン酸化ＳＴＡＴ３の検出］
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ＦＢＳを含まない条件下、２４時間、Ｎ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ培地中で培養した。次に、示されたサイトカイン類を用いて、１５分間、３７℃にて細胞を処理した。ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＳＴＡＴ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたイムノブロット分析のために、１％ＮＰ−４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を含有するバッファーを用いて、細胞を回収した。
【００８３】
［動物及びＣＬＳＰ処理（インビボＡＤモデル）］
本研究は、神経科学会の神経科学研究における動物及びヒトの利用に関する方針、並びに、東京医科大学の実験動物のケア及び利用のためのガイドラインにしたがって行われた。全ての実験手順は、東京医科大学の施設内動物実験委員会によって承認された。９週齢のＩＣＲマウスを、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。動物は、１２時間の明／暗サイクル（７：００Ａ．Ｍ．〜７：００Ｐ．Ｍ．まで明るい）の下、通常の動物用施設において飼育した（２３℃、５０％湿度）（Ｔａｊｉｍａら，２００５；Ｙａｍａｄａら，２００５；Ｃｈｉｂａら，２００５）。Ｃ５７マウス（８週齢）を、Ｙ−ｍａｚｅ試験（ＹＭ）を行う前に一週間、馴化させた。ＹＭ当日、マウスに、ＹＭの３０分前に、５μＬの生理食塩水、部分精製されたｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、又は、５μＬの生理食塩水中の精製された陰性対照を脳室内に注入した。腹腔内注入のためには、０．２１ｍｌの滅菌生理食塩水、又は示された量の部分精製されたｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、精製された陰性対照、０．２１ｍｌの滅菌生理食塩水中のコリベリンを使用した。次に、スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ）を溶解した滅菌生理食塩水（０．２ｍｌ）をＹＭの３０分前にマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に注入した。
【００８４】
［行動試験］
ＹＭは、従来文献に記載されるようにして行った（Ｋａｗａｓｕｍｉら，２００４；Ｙａｍａｄａら，２００５）。ＹＭのための装置は、それぞれが１２０°の角度で連結されている３つの灰色のプラスチック製アーム（４０ｃｍの長さ、１２ｃｍの高さ、底部で３ｃｍの幅、及び頂部で１０ｃｍの幅）から作られている。マウスは、アームの端部に個別に置かれ、８分間アームを自由に探索させた。調べられたパラメーターは、（１）全アームエントリー数及び（２）自発的交代パーセンテージ（ＳＡ％）であった。ＳＡ％は、試験実施時における全選択（初めの２つのエントリーは評価することができなかったので「全エントリー引く２」）に対する、以前の２つの選択と異なるアームの選択（「成功の選択」）の比として定義された。例えば、あるマウスが１０エントリーした場合（例えば、１−２−３−２−３−１−２−３−２−１）、８つの全選択（１０エントリー引く２）のうち５つの成功の選択であった。その結果、本ケースにおけるＳＡ％は、６２．５％であった。
【００８５】
［ｈＣＬＳＰ抗体をコンジュゲートさせたタンパク質Ｇセファロースの調製及びヒト血漿の免疫沈降］
２００μｌの免疫前血清（Ｐｒｅ）又は抗ｈＣＬＳＰ抗血清を、８００μｌのタンパク質Ｇセファロース４Ｂ（１：１スラリー、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）と混合し、４℃にて一晩回転させた。０．２Ｍの四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）で二度洗浄した後、それらを２ｍｌの同じバッファー中に懸濁させた。次に、それらを、２００μｌの０．２Ｍ ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合し、緩やかに振盪させながら室温にて３０分間インキュベートした。０．２Ｍのエタノールアミンを用いて一度洗浄し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間、室温）により回収した後、ビーズを、１０μｌの０．２Ｍ エタノールアミンと混合し、緩やかに振盪させながら室温にて２時間インキュベートした。次に、ビーズをＰＢＳ中に懸濁させた。抗体のコンジュゲーション効率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色により確認した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００８６】
ヒト血漿を健常提供者から吸引し、氷上でＥＤＴＡ−Ｎａを含有するチューブ中に入れた。精製された血漿は、−８０℃にて保存された。１００μＬの精製ヒト血漿を、各免疫沈降において、ＣＬＳＰ抗体−又は免疫前−セファロースの２０μｌの１：１スラリーと一緒に、４℃にて一晩インキュベートした。
【００８７】
［酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）］
細胞培養及びヒト血漿からの調整培地（ＣＭ）中のヒトＣＬＳＰレベルを定量するために、ＥＬＩＳＡシステムを構築した。０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で（２５００倍に）希釈した抗ヒトＣＬＳＰ抗体を含有するウサギ血清を用いて、９６ウェルマイクロプレートを１ウェル当たり５０μＬの量でコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。各ウェルを吸引し、各洗浄工程時に、２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて３回洗浄した。捕捉抗体に対する非特異的結合は、３％のろ過済みスキムミルク含有ＰＢＳ（１５０μＬ）を添加後３７℃において１時間インキュベートし、５回の洗浄により最小にした。組み換えヒトＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを、７点標準曲線を提供するように希釈した（１０ｐＭ〜１ｎＭ）。１００μＬのヒト血漿及び基準物質をウェルに添加し（３連）、３７℃にて２時間インキュベートした。５回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたアフィニティー精製したウサギ抗ヒトＣＬＳＰ抗体を含むＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）溶液（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｊａｐａｎ）（０．１４４μｇ／ｍｌ）を１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。７回洗浄した後、４ｍｇ／ｍＬのｏ−フェヌレンジアミンを含む０．０５Ｍクエン酸ペルオキシドバッファー（１００μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃にて２時間インキュベートした。次に、反応を停止させるために５０μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加した。ＣＬＳＰ濃度を測定するために、吸光度（４５０ｎｍ）を、蛍光分光光度計（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）によって測定した。全てのサンプルは３連でアッセイし、値は、標準曲線に対してプロットした。このＥＬＩＳＡの感度は１ｎＭ迄の直線範囲で１０〜５０ｐＭであった。
【００８８】
各サンプルは、２つの部分に分けた。そのうちの一方は、予めタンパク質Ｇセファロース（Ｇ３サンプル）に結合させた抗ＧＳＴ−ｈＣＬＳＰ血清により、４℃にて一晩、免疫除去した。５μＬの粗ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗血清を混合し、タンパク質Ｇビーズ上に、４℃にて一晩予め吸着させた。模擬手順を、免疫前血清（Ｇ０サンプル）を用いて同様にして行った。Ｇ０サンプルのＥＬＩＳＡの値マイナスＧ３サンプルのＥＬＩＳＡの値を、実際のｈＣＬＳＰ濃度を表すと考えた。この免疫除去手順は、５ｎＭのｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを含有する１００μＬの溶液からｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓをほぼ完全に免疫除去することができた（図１４参照）。
【００８９】
［免疫組織化学］
８週齢、２０月齢のオスＣ５７−ＢＬ６マウスを、ジエチルエーテルによって麻酔した。４％パラホルムアルデヒドを含有するリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて固定化した後、脳及び皮膚を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中に包埋し、１０μｍの厚さに切断した。海馬の矢状断面を、ＭＡＳコーティングしたスライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）上に調製した。この断面を、ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄し、内因性のペルオキシダーゼ活性を消失させるために３０分間、０．３％ Ｈ２Ｏ２を用いて処理し、ＴＢＳ−Ｔですすいだ。ブロッキング及び免疫染色は、Ｍ．Ｏ．Ｍ．ベーシックキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて処理した。この断面を、一次抗体として、アフィニティー精製したｍＣＬＳＰ−１及びｍＣＬＳＰ−２抗体を用いて、４℃にて一晩インキュベートした。次に、それらを、ＴＢＳ−Ｔ中ですすぎ、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、室温にて３０分間インキュベートし、ＡＢＣエリートキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法で処理した。免疫反応性は、チラミド−ＦＩＴＣ（ＴＳＡキット；ＮＥＮ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて可視化した。蛍光は、レーザー走査共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
【００９０】
［統計分析］
全ての細胞死試験、細胞生存試験、結合試験、及び定量リアルタイムＰＣＲ試験を行った（ｎ＝３）。インビトロ研究における図中の全ての値は、平均±ＳＤである。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。インビボ試験に対する統計分析は、一元配置分散分析、続いて、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤを用いて行い、この場合、有意差として、ｐ＜０．０５が算定された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によって初めて見出されたＥＨＤペプチド又はＣＬＳＰの強力な神経保護活性（神経細胞の細胞機能障害又は神経細胞死を抑制する活性）は、ＣＬＳＰが、ヒューマニンよりもむしろヒューマニン受容体が介在する生存促進性シグナル（ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌ）の活性化において主要な役割を果たすことを示す。
【００９２】
本明細書中で引用された文献のリストを以下に示す。
［引用文献リスト］
Babini E, Bertini I, Capozzi F, Chirivino E, Luchinat C. A structural and dynamic characterization of the EF-hand protein CLSP. Structure. 2006 14:1029-38.
Bozyczko-Coyne D, McKenna B W, Connors T J, Neff N T (1993) A rapid fluorometric assay to measure neuronal survival in vitro. J Neurosci Methods 50:205-216
Chiba T, Hashimoto Y, Tajima H, Yamada M, Kato R, Niikura T, Terashita K, Schulman H, Aiso S, Kita Y, Matsuoka M, Nishimoto I (2004) Neuro- protective effect of activity-dependent neurotrophic factor against toxicity from familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1 in vitro and in vivo. J Neurosci Res 78:542-552.
Chiba T, Yamada M, Sasabe J, Terashita K, Shimoda M, Matsuoka M, Aiso S. Amyloid-beta causes memory impairment by disturbing the JAK2/STAT3 axis in hippocampal neurons. Mol Psychiatry. 2009, 14;206-22
Durussel I, Mehul B, Bernard D, Schmidt R, Cox JA. Cation- and peptide-binding properties of human calmodulin-like skin protein. Biochemistry. 2002 41:5439-48.
Guo B, Zhai D, Cabezas E, Welsh K, Nouraini S, Satterthwait AC, Reed JC (2003) Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation. Nature 423:456 - 461.
Hashimoto Y, Niikura T, Ito Y, Nishimoto I (2000) Multiple mechanisms underlie neurotoxicity by different types of Alzheimer’s disease mutations of amyloid precursor protein. J Biol Chem 275:34541-4551.
Hashimoto Y, Niikura T, Tajima H, Yasukawa T, Sudo H, Ito Y, Kita Y, Kawasumi M, Kouyama K, Doyu M, Sobue G, Koide T, Tsuji S, Lang J, Kurokawa K, Nishimoto I (2001a) A rescue factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheimer’s disease genes and Ab. Proc Natl Acad Sci USA 98:6336 - 6341.
Hashimoto Y, Niikura T, Ito Y, Sudo H, Hata M, Arakawa E, Abe Y, Kita Y,
Nishimoto I (2001b) Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant in- sults. J Neurosci 21:9235-9245.
Hashimoto Y, Tsuji O, Niikura T, Yamagishi Y, Ishizaka M, Kawasumi M, Chiba T, Kanekura K, Yamada M, Tsukamoto E, Kouyama K, Terashita K, Aiso S, Lin A, Nishimoto I (2003) Involvement of c-Jun N-terminal kinase in amyloid precursor protein-mediated neuronal cell death. J Neurochem 84:864- 877.
Hashimoto Y, Suzuki H, Aiso S, Niikura T, Nishimoto I, Matsuoka M (2005) Involvement of tyrosine kinases and STAT3 in Humanin-mediated neu- roprotection. Life Sci 77:3092-3104.
Hashimoto Y, Kurita M, Aiso S, Nishimoto I, Matsuoka M Humanin inhibits neuronal cell death by interacting with a cytokine receptor complex or complexes involving CNTF receptor alfa/WSX-1/gp130 Mol. Biol. Cell 2009, 20:2864-73.
Hwang M, Morasso MI. The novel murine Ca2+-binding protein, Scarf, is differentially expressed during epidermal differentiation. J Biol Chem. 2003 278:47827-33.
Hwang M, Kalinin A, Morasso MI. The temporal and spatial expression of the novel Ca++-binding proteins, Scarf and Scarf2, during development and epidermal differentiation. Gene Expr Patterns. 2005 5:801-8.
Hwang J, Kalinin A, Hwang M, Anderson DE, Kim MJ, Stojadinovic O, Tomic-Canic M, Lee SH, Morasso MI. Role of Scarf and its binding target proteins in epidermal calcium homeostasis.J Biol Chem. 2007 282:18645-53.
Kawasumi, M., Hashimoto, Y., Chiba, T., Kanekura, K., Yamagishi, Y., Ishizaka, M., Tajima, H., Niikura, T., and Nishimoto, I. (2002) Molecular mechanisms for neuronal cell death by Alzheimer's amyloid precursor protein relevant insults. Neurosignals 11, 236-250. Review
Kunesova G, Hlavacek J, Patocka J, Evangelou A, Zikos C, Benaki D, Paravatou-Petsotas M, Pelecanou M, Livaniou E, Slaninova J.
The multiple T-maze in vivo testing of the neuroprotective effect of humanin analogues.Peptides. 2008 29:1982-7
Krejcova G, Patocka J, Slaninova J (2004) Effect of humanin analogues on experimentally induced impairment of spatial memory in rats. J Pept Sci 10:636 - 639.
Lue Y, Swerdloff R, Liu Q, Mehta H, Hikim AS, Lee KW, Jia Y, Hwang D, Cobb LJ, Cohen P, Wang C. (2010) Opposing roles of insulin-like growth factor binding protein 3 and humanin in the regulation of testicular germ cell apoptosis. Endocrinology 151, 350-357.
Mamiya T, Ukai M (2001) [Gly(14)]-Humanin improved the learning and memory impairment induced by scopolamine in vivo. Br J Pharmacol
134:1597-1599.
Matsuoka M, Matsuura Y, Semba K, Nishimoto I. (2000)
Molecular cloning of a cyclin-like protein associated with cyclin-dependent kinase 3 (cdk 3) in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 273:442-7
Matsuoka M, Hashimoto Y, Aiso S, Nishimoto I. (2006) Humanin and colivelin: neuronal-death-suppressing peptides for Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. CNS Drug Rev. 12:113-22.
Matsuoka M.(2009) Humanin; a defender against Alzheimer's disease? Recent Pat CNS Drug Discov. 2009 4:37-4
Matsuoka M, Hashimoto Y. Humanin and the receptors for humanin.
Mol Neurobiol. 2010, 41, 22-8
Mehul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA, Schmidt R. Identification and cloning of a new calmodulin-like protein from human epidermis. J Biol Chem. 2000 275:12841-7.
Mehul B, Bernard D, Brouard M, Delattre C, Schmidt R.Influence of calcium on the proteolytic degradation of the calmodulin-like skin protein (calmodulin-like protein 5) in psoriatic epidermis.Exp Dermatol. 2006 15:469-77.
Miao J, Zhang W, Yin R, Liu R, Su C, Lei G, Li Z. (2008) S14G-Humanin ameliorates Abeta25-35-induced behavioral deficits by reducing neuroinflammatory responses and apoptosis in mice. Neuropeptides. 42:557-67
Moretti E, Giannerini V, Rossini L, Matsuoka M, Trabalzini L, Collodel (2010) G.Immunolocalization of humanin in human sperm and testis. Fertil Steril 94, 2888-2890.
Muzumdar RH, Huffman DM, Atzmon G, Buettner C, Cobb LJ, Fishman S, Budagov T, Cui L, Einstein FH, Poduval A, Hwang D, Barzilai N, Cohen P.
Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.
PLoS One. 2009 Jul 22;4(7):e6334.
Niikura, T., Hashimoto, Y., Tajima, H., and Nishimoto, I. (2002) Death and survival of neuronal cells exposed to Alzheimer's insults. J. Neurosci. Res. 70, 380-391. review
Nishimoto I, Matsuoka M, Niikura T. (2004) Unravelling the role of Humanin. Trends Mol Med 10: 102-105.
Tjima H, Niikura T, Hashimoto Y, Ito Y, Kita Y, Terashita K, Yamazaki K, Koto A, Aiso S, Nishimoto I (2002) Evidence for in vivo production of Humanin peptide, a neuroprotective factor against Alzheimer’s Disease-related insults. Neurosci Lett 324, 227-231.
Tajima H, Kawasumi M, Chiba T, Yamada M, Yamashita K, Nawa M, Kita Y, Kouyama K, Aiso S, Matsuoka M, Niikura T, Nishimoto I (2005) A Humanin derivative, S14G-HN, prevents amyloid-b-induced memory impairment in mice. J Neurosci Res 79:714 -723.
Terashita K, Hashimoto Y, Niikura T, Tajima H, Yamagishi Y, Ishizaka M, Kawasumi M, Chiba T, Kanekura K, Yamada M, Nawa M, Kita Y, Aiso S, Nishimoto I (2003) Two serine residues distinctly regulate the rescue function of Humanin, an inhibiting factor of Alzheimer’s disease-related neurotoxicity: functional potentiation by isomerization and dimeriza-tion. J Neurochem 85:1521-1538.
Yamada M, Chiba T, Sasabe J, Nawa M, Tajima H, Niikura T, Terashita K, Aiso S, Kita Y, Matsuoka M, Nishimoto I (2005) Implanted cannula- mediated repetitive administration of A 25-35 into the mouse cerebral ventricle effectively impairs spatial working memory. Behav Brain Res 164:139-146.
Yamagishi Y,HashimotoY,NiikuraT,NishimotoI (2003) Identificationof essential amino acids in Humanin, a neuroprotective factor against Alz- heimer’s disease-relevant insults. Peptides 24:585-595.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルモジュリン様皮膚タンパク質を有効成分として含む医薬組成物、特に、アルツハイマー病治療用の医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化はアルツハイマー病（ＡＤ）の発症にとって極めて重要である。ＡＤの発症にとって老化が極めて重要であるということの根底にある仮説の１つは、内因性の防御システムが高齢者ではその有効性がより低くなるというものである（Ｍａｔｓｕｏｋａ，２００９）。ヒューマニンは、抗ＡＤ防御因子候補として機能し得ると推定される内因性の神経栄養因子である（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら，２００４；Ｍａｔｓｕｏｋａら，２００６；Ｍａｔｓｕｏｋａ，２００９、特許文献１）。
【０００３】
ヒューマニンは培養神経細胞の死を抑制し、ロンドン型家族性ＡＤ変異遺伝子のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）であるＶ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現によって誘導される、２４個のアミノ酸からなるペプチド（ＭＡＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰＶＫＲＲＡ）として、発現クローニング法により同定された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００ａ）。アミロイドベータ（Ａβ）により誘導される死、及び、家族性ＡＤ関連遺伝子の発現により誘導される死を含む、ＡＤ関連神経細胞死モデルをヒューマニンがインビトロで抑制することが、一連の研究により立証されている（概説として、Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら，２００４；Ｍａｔｓｕｏｋａら，２００６参照）。
【０００４】
強力なヒューマニンペプチド誘導体はＦＡＤ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを含むＡＤ関連マウスモデルの記憶障害を改善する（ＭａｍｉｙａとＵｋａｉ，２００１；Ｋｒｅｊｃｏｖａら，２００４：Ｔａｊｉｍａら，２００５；Ｃｈｉｂａら，２００５；Ｋｕｎｅｓｏｖら，２００８；Ｍｉａｏら，２００８；Ｙａｍａｄａら，２００８；Ｃｈｉｂａら，２００９）。Ｃｈｉｂａら（２００９）は、ヒューマニンが、ＳＴＡＴ３の活性化を介して、海馬のコリン作動性神経伝達を向上させることにより、ＡＤマウスモデルの記憶障害を改善することを示した。
【０００５】
ヒューマニンによってもたらされるＡＤ関連の神経細胞死及び神経機能障害の抑制は、細胞表面上の特異的受容体へのヒューマニンの結合とＳＴＡＴ３の活性化とが介在する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００；Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，２００３；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００５）。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（２００９）は、細胞表面上のヒューマニン受容体が、ＩＬ−６受容体ファミリーに属する新規受容体であり、毛様体神経栄養因子受容体a（ＣＮＴＦＲ）、ＷＳＸ−１、及びｇｐ１３０から構成されることを見出した（特許文献２）。この受容体の機能の喪失は、ヒューマニンの活性を無効にする。その特異的受容体の発見は、ヒューマニンの活性がＡＤ関連損傷から神経細胞をインビボで保護する上で重要な役割を果たすという考えを支持するものである。
【０００６】
細胞表面上の受容体に加えて、Ｇｕｏら（２００４）は、細胞質性のヒューマニンがＢａｘと結合しＢａｘが介在するプロアポトーシス経路を中和することにより、スタウロスポリンによって誘発される細胞死を部分的に抑制することを見出した。この知見は、細胞外から細胞表面上のヒューマニン受容体と結合するばかりでなく細胞質中のＢａｘとも結合することにより、その神経保護活性を示すことを示唆する（但し、後者の受容体が、ＡＤ関連神経保護に寄与することを示す証拠は存在しない）（Ｍａｔｓｕｏｋａら，２０１０）。
【０００７】
ヒューマニンに対する特異的抗体を用いた複数の研究により、ヒューマニンは成人精巣において高度に発現され（Ｔａｊｉｍａら，２００３；Ｌｕｅら，２０１０；Ｍｏｒｅｔｔｉら，２０１０）、神経細胞及びグリア細胞を含むその他の組織では弱く発現されることが示されている（Ｔａｊｉｍａら，２００３；Ｍｕｄｚｕｍａｒら，２００９）。この知見は、野生型のヒューマニンは非常に弱い神経保護活性を有することから、脳におけるＡＤ関連神経毒性を抑制するためには、ヒューマニンが精巣から循環系を経由して中枢神経系に送達される必要があり得ることを示すものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開WO2001/021787号パンフレット
【特許文献２】国際公開WO2006/1150267号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒューマニンは、１〜１０μＭのＥＣ５０でＡＤ関連神経細胞死を抑制する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００）。ヒューマニンの有効濃度は、それらの生物学的活性を内分泌的に示すその他のサイトカイン及び生物活性因子の濃度と比べてはるかに高い。従って、ヒューマニンよりも強い活性を有する別の内因性ヒューマニン受容体アゴニストが、ヒューマニン受容体が介在する生存促進性経路（ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｔｈｗａｙ）を活性化する上で主要な役割を果たし得るという可能性があり、当該技術分野において基礎研究及び臨床的観点からもそのような物質を探索・同定することが強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、ヒト由来の分泌型のカルモジュリン様皮膚タンパク質（ＣＬＳＰ）及びそのカウンターパートであるマウス由来のタンパク質がヒューマニン又はヒューマニンペプチド誘導体と同様な神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有しており、１０〜１００ｐＭのＥＣ５０を有するヒューマニン受容体アゴニストとして機能することを初めて見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は以下の態様にかかるものである。
［態様１］式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するペプチド。
［態様２］態様１記載のペプチド、又は、式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を含み、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
［態様３］以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列における式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（５）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；又は
（６）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
［態様４］神経細胞の機能障害又は細胞死がアルツハイマー病に関連する、態様２又は３記載の医薬組成物。
［態様５］記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、態様２〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［態様６］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
［態様７］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドによる細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を検出する方法であって、（ａ）被検化合物および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
［態様８］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検試料および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞死を検出する工程、（ｃ）神経細胞の機能障害又は細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
［態様９］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）該ペプチド又はポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該ペプチド又はポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
［態様１０］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドを神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法。
［態様１１］態様１記載のペプチド、又は、態様２若しくは３に記載のポリペプチドを、神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのある個体に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法。
［態様１２］
疾患又は疾病がアルツハイマー病である、態様１１記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、従来知られているヒューマニン又はヒューマニンペプチド誘導体に較べて極めて顕著な神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する物質を提供することが出来る。即ち、本発明のポリペプチドの一種であるＣＬＳＰの有するＥＣ５０は１０〜１００ｐＭであると推定され、これは、ＣＬＳＰがヒューマニン（ＥＣ５０＝１〜１０μＭ）よりも１０５−６倍強力な上記活性を有していることを意味する。
【００１３】
更に、本発明のポリペプチドの一種であるマウス由来のＣＬＳＰがインビボにおいてマウスの記憶傷害を抑制（改善）する効果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）マウス精巣及び示された培養細胞（ＭＬＴＣ−１細胞、マウスライディッヒ細胞；ＴＭ３細胞、マウスライディッヒ細胞；ＮＴ２細胞、ヒトテラトカルシノーマ細胞）から調製した溶解物を、ヒューマニン抗体ＰＯ４をコンジュゲートさせたタンパク質Ｇを用いて免疫沈降させた。次に、インプット溶解物及び免疫沈降物を、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続く、銀染色法により分析した。（Ｂ）２０ｋＤの分子量を有し、ＮＴ２細胞から免疫沈降させたタンパク質を含むゲル片を切り出し、質量分析のために使用した。このタンパク質は、ＣＬＳＰと同定された。下線を付したヒトＣＬＳＰのドメインは、ヒューマニンのコアドメインにわずかに類似している。
【図２】（Ａ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞は、ｐＦＬＡＧ−ｈＣＬＳＰ、ｐＦＬＡＧ−ＨＮ又はｐＦＬＡＧベクターを用いてトランスフェクトした。ｐＦＬＡＧ−ｈＣＬＳＰは、ＦＬＡＧエピトープがＣ末端にタグ付加されているｈＣＬＳＰをコードする。トランスフェクションの２４時間後、それらを、Ｂｒｅｆｅｎｄｉｎ−Ａと共に、又は、伴わずに６時間処理した。調整培地及び細胞溶解物を、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体を用いるイムノブロット分析に供した。（Ｂ、Ｃ、及びＤ）ヒトＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、Ｍｙｃ／６ｘＨｉｓ（ＭｙｃＨｉｓ）がＣ末端にタグ付加されているＣＬＳＰをコードするｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、それらを、ＷＳＴ−８細胞生存性アッセイ（Ｂ）、顕微鏡分析（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ｈＣＬＳＰ）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。（Ｅ、Ｆ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後に、細胞をｈＣＬＳＰに対する抗体（ＣＬＳＰ−Ｎ）と一緒にインキュベートした。トランスフェクションの４８時間後に、それらをＷＳＴ−８細胞生存性アッセイ（Ｅ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ｈＣＬＳＰ）を用いたイムノブロット分析（Ｆ）のために回収した。
【図３】（Ａ）ｈＣＬＳＰ欠失変異体の概略図。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＣＬＳＰ欠失変異をコードするｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰ、又はｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトしたヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞。トランスフェクションを開始して４８時間後に、それらを、顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ＣＬＳＰタンパク質）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。調整培地も、６ｘＨｉｓをタグ付加したタンパク質を吸着するＴＡＬＯＮ金属樹脂を用いてプルダウンするために回収した。次に、沈降物をＭｙｃに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析した。
【図４】ｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮ、又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｓｓｈＣＬＳＰDＮと共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトしたＳＨＳＹ−５Ｙ細胞。ｓｓｈＣＬＳＰDＮは、Ｍｅｔ−マウスインスリン様増殖因子−１シグナル配列（Ｓｅｒ１２−Ｇｌｙ３３）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなるシグナル配列がＮ末端に結合しているｈＣＬＳＰDＮである。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ａ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びＭｙｃに対する抗体（ＣＬＳＰタンパク質）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。調整培地も、６ｘＨｉｓをタグ付加したタンパク質を吸着するＴＡＬＯＮ金属樹脂を用いてプルダウンするために回収した。次に、沈降物を、Ｍｙｃに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析した。ロット分析により分析した。
【図５】ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。次に、細胞を、示された濃度の合成ＥＨＤ又はＥＨＤ−Ｇと一緒にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ａ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｂ）、並びに、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロット分析（Ｃ）のために回収した。
【図６】（Ａ）ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰ又はベクターを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、調整培地を回収する前に４８時間、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で培養した。精製したｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓのタンパク質濃度は、基準物質としてＢＳＡを用いたＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色によって測定した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。並行して、同様に精製したベクター形質転換体の調整培地を、陰性対照（ＮＣ）として電気泳動に供した。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。次に、細胞を、示された濃度のｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ又は陰性対照（ＮＣ）と一緒にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。ロット分析により分析した。
【図７】（Ａ）ＦＢＳ不含でＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ培地中で４８時間インキュベートされたＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、１０μＭ ＨＮ、１０μＭ ＨＮＡ、又は１００ｐＭ 組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを用いて、３７℃にて１５分間処理し、次に、ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）及び全ＳＴＡＴ３抗体を用いたイムノブロット分析のために回収した。ＨＮＡ（ヒューマニンＡ；Ｃ８Ａ−ヒューマニン）は、ヒューマニン活性を有しないヒューマニン誘導体である（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ）。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰを用いてトランスフェクトした。次に、細胞を、ｇｐ１３０に対する１μｇ／ｍｌの中和マウスモノクローナル中和抗体と一緒にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。ロット分析により分析した。
【図８】ヒトＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（ＣＮＴＦＲ−ＥＤ）（１μｇ）及びヒトｇｐ１３０−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（ｇｐ１３０−ＥＤ）（１μｇ）を、１％のＢｒｉｊ９６を含有する１００μｌのＰＢＳ中に含まれる、Ｍ２抗ＦＬＡＧ抗体をコンジュゲートさせたアガロース上に固定化する前に、ヒトＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧ（ＷＳＸ−１−ＥＤ）（推定５μｇ）と一緒に、１００ｎＭのｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ又はヒューマニンの存在下又は非存在下で、６時間、３７℃にてインキュベートした。次に、洗浄した沈降物及びインプット組み換えタンパク質を、抗６ｘＨｉｓ抗体（ＣＮＴＦＲ−ＥＤ及びｇｐ１３０−ＥＤのため）及び抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）抗体（ＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧの検出のため）を用いたイムノブロット分析に供した。ロット分析により分析した。
【図９】Ｆ１１ニューロハイブリッド細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｍＣＬＳＰ−１、又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｍＣＬＳＰ−２と共に、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションを開始してから７２時間後に、細胞を、顕微鏡分析（Ｂ）、ＷＳＴ−８アッセイ（Ｃ）、並びに、ＡＰＰ及びｍＭｙcに対する抗体（ｍＣＬＳＰ）を用いたイムノブロット分析（Ｄ）のために回収した。ロット分析により分析した。
【図１０Ａ】（Ａ）ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｍＣＬＳＰ−１又はベクターを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞を、調整培地を回収する前に、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で４８時間培養した。精製したｍＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓのタンパク質濃度は、基準物質としてＢＳＡを用いたＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色によって測定した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。並行して、同様に精製したベクター形質転換体の調整培地を、陰性対照（ＮＣ）として電気泳動に供した。
【図１０Ｂ】（Ｂ）ＰＢＳ、１０ｐｍｏｌの精製ｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、又は陰性対照（ＮＣ）を脳室内注入すると共に、生理食塩水又はスコポラミンを腹腔内注入したＩＣＲマウスのＳＡ％（生理食塩水＋ＰＢＳ及びスコポラミン＋ＰＢＳ群については、Ｎ＝１０；スコポラミン＋ＣＬＳＰ群については、Ｎ＝１２；スコポラミン＋ＮＣ群については、Ｎ＝９）。
【図１０Ｃ】（Ｃ）７ｎｍｏｌのコリベリン、１００ｐｍｏｌの精製ｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、又はＮＣの腹腔内注入を行った又は行なわずに、スコポラミン処置を行ったＩＣＲマウスのＳＡ％（生理食塩水＋ＰＢＳ、スコポラミン＋ＰＢＳ群、及びスコポラミン＋コリベリン群については、Ｎ＝１０；スコポラミン＋ＣＬＳＰ群については、Ｎ＝１１）。データは、平均±ＳＥＭで示す。統計分析は、一元配置分散分析、続いて、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤにより行った（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ロット分析により分析した。
【図１１】８週齢及び２7月齢のマウスの皮膚断面と海馬断面（ＣＡ１−３領域のピラミッド状の層）を、ｍＣＬＳＰ−１又はｍＣＬＳＰ−２に対する抗体を用いて免疫染色した。目盛りバーは、１０μｍ長である。
【図１２Ａ】（Ａ）健常提供者からの１００μＬの血漿を、抗ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗血清−又は免疫前血清−をコンジュゲートさせたタンパク質Ｇを用いて免疫沈降させた。次に、免疫沈降物を、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗体を用いてイムノブロットした。ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＬＳＰ又はベクターを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞からの粗調整培地（ＣＭ）を、陽性及び陰性対照として使用した。
【図１２Ｂ】（Ｂ）ヒト血漿中のＥＨを検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ。示された濃度の精製組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ及びヒト血漿をＥＬＩＳＡアッセイのために使用した。対照ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ濃度（ｘ軸）とＥＬＩＳＡ値（ｙ軸）との間の関係を下のパネルにプロットした。血漿サンプルは３１〜５３歳の４名の健常提供者から取得した。
【図１３】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰと共に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨｉｓ（Ｖｅｃ）又はｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ＣＬＳＰを用いてトランスフェクトした。次に、この細胞をヒトＣＮＴＦＲ又はヒトＷＳＸ−１に対する中和抗体と共にインキュベートした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を顕微鏡分析のため（Ａ、Ｄ）、ＷＳＴ−８アッセイのため（Ｂ、Ｅ）、及び、ＡＰＰに対する抗体を用いたイムノブロットアッセイのため（Ｃ、Ｆ）に回収した。ヒトＣＮＴＦＲ又はヒト若しくは対照マウスＩｇＧに対する１μｇ／ｍｌの中和マウスモノクローナル抗体１μＬを、１ｍｌの培地を含む６ウェルディッシュの１つのウェルに添加した（Ａ、Ｂ、Ｃ）。ヒトＷＳＸ−１のＮ末端１６ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体又は免疫前血清１μＬを１ｍｌの培地を含む６ウェルディッシュの１つのウェルに添加した（Ｄ、Ｅ、Ｆ）。
【図１４】５μＬの粗ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗血清及び免疫前血清をタンパク質Ｇビーズと一緒に混合し、ビーズ上に予め吸着させた。次に、１０ｎＭ ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを含む３５０μＬの溶液を、これらのタンパク質Ｇビーズを用いて免疫除去した。免疫除去後、１０μＬの免疫除去物及び投入物をＭｙｃに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書の実施例で示されるように、式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する本発明のペプチド、及び、該ペプチドを含むポリペプチド（タンパク質）、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチドは、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する。更に、配列番号３及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるマウス由来のポリペプチドも神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する。
【００１６】
尚、本発明において「神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性」とは、その原因又は因果関係に依らず、神経細胞における機能障害又は細胞死の少なくとも１つを抑制又は拮抗することを指す。神経細胞死の抑制は、完全な抑制ではなくても、有意に抑制されればよい。神経細胞死の抑制活性は、以下の実施例に記載された方法または他に記載の方法（例えば国際公開番号 ＷＯ００／１４２０４参照）に従って検定することができる。
【００１７】
従って、以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個（例えば、３個〜５個）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列における式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分において、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（５）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個（例えば、３個〜５個）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；又は
（６）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドは医薬組成物の有効成分として有用である。
【００１８】
２つのアミノ酸配列における配列の同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００１９】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列における同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができる。例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定することが出来る。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｈｕｌらによって開発された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。
【００２０】
さらに、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴはＢＬＡＳＴより感度良く同一性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２１】
或いは、配列間の同一性として、Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｕｓｏｖａらによって開発されたＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いることも可能である。このソフトウェアは米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いパラメーターとしては、Ｏｐｅｎ ｇａｐ：１１ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：１ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。更に、高感度なＦＡＳＴＡソフトウェア（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８，１９８８）を用いて同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【００２２】
上記の本発明のペプチド又はポリペプチド（以下、「ポリペプチド等」ともいう）は、これらの官能基を既知の方法により修飾、付加、変異、置換、または削除などにより改変された形態を持つことも可能である。このような官能基の改変は、当業者に公知の任意の方法を用いて、例えば、ポリペプチドに存在する官能基の保護、ポリペプチドの安定性または組織移行性の制御、あるいはポリペプチドの活性の制御等を目的として行なうことが出来る。
【００２３】
即ち、本発明のポリペプチド等は翻訳後修飾などにより天然に修飾されていてもよい。また人工的に修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ末端、またはカルボキシル末端などの修飾が含まれる。また、ポリペプチドは分岐していてもよく、環状でもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、［フラビン（ｆｌａｖｉｎ）、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体、またはホスファチジルイノシトール］等の共有結合、クロスリンク形成、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ピログルタミン酸化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、ユビキチン化などが含まれるが、これらに制限されない。更に、上記ペプチド又はポリペプチドは当業者に公知の任意の塩及びエステル体とすることも可能である。
【００２４】
更に、本発明のポリペプチド等は公知の任意の神経向性ペプチドと融合ポリペプチドを形成することも出来、このような融合ポリペプチドは当業者に公知の任意の方法で容易に合成することができる。
【００２５】
既に述べたように、これまでの研究からアルツハイマー病において神経細胞の細胞死が起こることが明らかにされている。このため、本発明の医薬組成物（薬剤）は、アルツハイマー病における神経細胞の機能障害又は神経変性を保護する薬剤としても用いることが可能である。更に、本発明の薬剤を用いて、アルツハイマー病以外にも、記憶傷害又は神経変性を伴う疾病、例えば脳虚血による神経細胞の細胞死に起因する疾患を予防・治療することも可能である（Ｔ．Ｋｉｒｉｎｏ，１９８２，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２３９：５７−６９）。その他、痴呆を伴うパーキンソン病（Ｍ．Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：２０４５−２０４７）、びまん性レービー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）病（Ｍ．Ｇ．Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６４６９−６４７３）、ダウン症に伴う痴呆なども、治療や予防の対象となる。また、ＡＰＰの類縁分子であるＡＰＬＰ１が、先天性ネフローゼ症候群の原因遺伝子といわれている（Ｌｅｎｋｋｅｒｉ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０２：１９２−１９６）ことから、ネフローゼ症候群などの腎疾患も治療や予防の対象となる。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、有効成分自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。有効成分であるペプチド又はポリペプチドの含有率は使用目的及び製剤形態等に応じて適宜決定すればよい。
【００２７】
患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。脳神経変性疾患の治療に用いる場合においては、本発明の医薬組成物は、静脈内、脊髄腔内、脳室内または硬膜内注射を含む任意の適当な経路で中枢神経系に導入するのが望ましい。投与量、投与方法は、本発明の医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。例えば、１日1回〜数回、１回の処置当り数十μl程度の薬剤を適当な期間に亘り投与することができる。有効成分は、例えば、10 pmol〜100 nmol程度の範囲の濃度とすることができる。
【００２８】
このように、本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病等の神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病の予防または治療に広く用いることが出来る。
【００２９】
従って、本発明は、本発明のポリペプチド等を神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法、及び、本発明の医薬組成物を、アルツハイマー病等の神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのあるヒト等の動物である対象（個体）に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法神経変性障害を伴う疾患を治療する方法に係る。
【００３０】
本発明の医薬組成物の有効成分であるポリペプチド等はヒト及びマウス等の適当な種由来の細胞株等から調製することができ、更に、公知のペプチド合成技術により製造することが可能であり、また、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いて、これらをコードするＤＮＡを含むベクター等を適当な宿主細胞等に導入して発現させることによって製造することも可能である。
【００３１】
このようなベクターはプラスミド又はウイルス性ベクター等の当業者に公知の任意の形態であり、当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。こうして得られたベクターには、本発明の部位特異的組換え酵素のコード領域以外に、５’および３’に非コード配列（核移行シグナル、タグ配列、非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリＡ付加配列、ＩＲＥＳ、ｍＲＮＡ安定化・不安定化配列等を含む）が適宜含まれており、発現ベクターとして機能する。
【００３２】
このようなベクターを用いた当業者に公知の任意の方法、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、並びに、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の各種物理的方法によって、適当な宿主細胞を容易に形質転換させることが出来る。
【００３３】
宿主細胞に特に制限はなく、例えば、ヒト、サル及びマウス等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び、大腸菌等の細菌類を用いることができる。こうして作製された形質転換細胞は当業者に公知の任意の条件で培養し、培養した菌体又はその培養上清等の適当な画分から目的とする本発明のポリペプチド等を容易に調製することが出来る。
【００３４】
更に本発明は、本発明のポリペプチド等による神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）該ポリペプチド等の存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の細胞機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法に係る。
【００３５】
具体的な操作は、本明細書に記載された方法に従って行うことができる。この方法は、本発明のポリペプチド等が様々な細胞における細胞死に対して抑制効果を有するかどうかを決定したり、その抑制効果を定量するために用いられ得る。細胞としては特に制限はなく、細胞死を起し得るさまざまな細胞が用いられる。また、細胞死の誘導は、それぞれの細胞に応じて公知の細胞死誘導系を使用することができる。また、神経細胞を用いて、神経細胞死を誘導するさまざまな刺激、環境変化、または遺伝子発現などの諸条件に対する本発明のポリペプチド等の効果を検出するためにも用いられ得る。また、このような検出は、生物種や亜種、または個体間に存在し得る、神経細胞死における本発明のポリペプチド等に対する感受性の違いを検出するために用いられ得る。これにより、例えば民族、人種、または個人間で、本発明のポリペプチド等の有効性を検討することができる。このような方法により、例えば臨床適用に向けた詳細な条件検討を行うことができる
【００３６】
又、本発明は、本発明のポリペプチド等による神経細胞の細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を検出する方法であって、（ａ）被検化合物および該ポリペプチド等の存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、 （ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法に係る。
【００３７】
この方法は、本発明のポリペプチド等による神経細胞死を促進したり抑制したりする化合物をアッセイするために用いられ得る。本発明のポリペプチド等は、神経細胞表面に作用して細胞死抑制効果を発揮すると考えられる。この方法を用いれば、本発明のポリペプチド等の細胞表面への接触を阻害し得る候補化合物や、逆に促進し得る候補化合物の作用を検証することができる。
【００３８】
また、この検出方法を用いて、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングすることも可能である。この方法は、（ａ）被検試料および本発明のポリペプチド等の存在下で神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞死を検出する工程、および（ｃ）神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む。工程（ｃ）においては、任意の対照における場合と比較することができる。例えば、工程（ｃ）において、被検試料非存在下において検出した場合に比べ、被検試料存在下において神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択することができる。神経細胞死を促進する化合物は、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制を阻害する化合物の候補となり、神経細胞死を抑制する化合物は、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制をさらに促進する化合物の候補となる。また、上記のスクリーニングにおいて、被検試料とは別の化合物における場合を対照とすることもできる。例えば本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制を調節し得る別の化合物を用いて細胞死を検出し、工程（ｃ）において、該化合物の存在下における場合に比べ、工程（ａ）で用いた被検試料存在下において神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択することもできる。このようなスクリーニングにおいては、本発明のポリペプチド等による神経細胞死の抑制の調節能に関して、既存の化合物よりもさらに高い効果を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００３９】
上記のスクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。神経細胞死の誘導や本発明のポリペプチドの投与は、当業者に公知の任意の方法に従って行うことができる。
【００４０】
被検試料を細胞に適用する時期に特に制限はなく、本発明のポリペプチド等を適用する前、後、または同時に適用することができる。被検試料の適用方法に制限はなく、培養細胞系であれば、例えば培地に添加される。また核酸であれば、細胞内に導入されてもよい。その他の任意の投与方法により被検試料を適用することができる。
【００４１】
上記の化合物の作用の検査により評価された化合物、あるいはスクリーニングにより得られた化合物は、本発明のポリペプチド等の活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。
【００４２】
更に本発明は、本発明のポリペプチド等に結合する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該ポリペプチド等に被検試料を接触させる工程、（ｂ）該ポリペプチド等と被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法に係る。
【００４３】
本発明のポリペプチド等は、スクリーニングの手法に応じて、可溶性ポリペプチドとして、また担体に結合させた形態としてスクリーニングに用いることができる。本発明のポリペプチド等は標識されていてもよい。標識としては、放射性同位元素による標識、蛍光物質による標識、ビオチンやジゴキシゲニンによる標識、タグ配列の付加などが挙げられる。
【００４４】
スクリーニングに用いる被検試料としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。被検試料は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４５】
例えば、本発明のポリペプチド等と結合するタンパク質をスクリーニングする場合は、本発明のポリペプチド等を固定したアフィニティーカラムに本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現していることが予想される組織または細胞の細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより、本発明のポリペプチド等に結合するタンパク質のスクリーニングを実施することが可能である。
【００４６】
さらに、本発明のポリペプチド等と結合するタンパク質を発現していることが予想される組織若しくは細胞（例えば脳皮質組織、またはＦ１１などの神経細胞）よりファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、アガロース上にプラークを形成させ、標識した本発明のポリペプチド等を用いてウエストウエスタンブロッティング法によりスクリーニングしたり、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域などのＤＮＡ結合ペプチドおよびＧＡＬ４転写活性化領域などの転写活性化ペプチドを、それぞれ本発明のポリペプチド等と被検タンパク質との融合タンパク質として発現させ、ＤＮＡ結合ペプチドの結合配列を有するプロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子の発現を通して本発明のポリペプチド等と被検タンパク質との結合を検出する「ｔｗｏハイブリッドシステム」等に従い実施することも可能である。
【００４７】
本発明のスクリーニングにより、本発明のポリペプチド等に対する受容体をクローニングすることも考えられる。この場合、被検試料は受容体を発現していることが予想される組織または細胞、例えば脳皮質組織、神経細胞株、または神経芽細胞腫や奇形腫細胞などから調製することが好ましい。神経細胞株としては、例えばＦ１１細胞、ＰＣ１２細胞（Ｌ．Ａ．ＧｒｅｅｎｅおよびＡ．Ｓ．Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，１９７６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３：２４２４−２４２８）、ＮＴＥＲＡ２細胞（Ｊ．ＳｋｏｗｒｏｎｓｋｉおよびＭ．Ｆ．Ｓｉｎｇｅｒ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６０５０−６０５４）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ．Ｏｄｅｌｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２２４：６９−８２）等が挙げられる。
【００４８】
また、固定化した本発明のポリペプチド等に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、結合する分子をスクリーニングすることも考えられる。また、表面プラズモン共鳴現象を利用した結合の検出によるスクリーニングも可能である（例えばビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）など）。これらのスクリーニングは、コンビナトリアルケミストリー技術を用いたハイスループットスクリーニングにより行うことも可能である。
【００４９】
本発明のスクリーニングにより得られた本発明のポリペプチド等に結合する化合物は、本発明のポリペプチド等の活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。
【００５０】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
［ＣＬＳＰはヒューマニン抗体によって免疫沈降する］
ヒューマニンに対する抗体ＰＯ４（Ｔａｊｉｍａら，２００３）を用いることにより、ヒトＮＴ２神経芽細胞腫細胞溶解物から２０ｋＤのタンパク質を免疫沈降させた（図１Ａ）。質量分析によって、このタンパク質はＣＬＳＰ（カルモジュリン様皮膚タンパク質；ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｋｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と同定された。ヒトＣＬＳＰ（ｈＣＬＳＰ）は１４６個のアミノ酸から成るタンパク質であって、主として皮膚ケラチノサイトで発現されＣａ２＋結合モチーフであるＥＦハンドを有するカルモジュリン関連タンパク質である（Ｍｅｈｕｌら，２０００；Ｈｗａｎｇら，２００３）。細胞内のシグナル伝達におけるその関与は、未だ特徴が明らかにされていない。かかるヒトＣＬＳＰのアミノ酸配列を配列番号１として示す。
【００５２】
ｈＣＬＳＰは４３番目から５９番目のアミノ酸から成る配列：ＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳＤを含む。一方、２４個のアミノ酸からなるヒューマニンには、１７個のアミノ酸から成るコア領域（ＰＲＧＦＳＣＬＬＬＬＴＳＥＩＤＬＰ）が含まれている。これらアミノ酸配列を比較すると、互いの同一性は低いことがわかる（下線を付したアミノ酸は同一である）（図１Ｂ）。特に、ヒューマニンの活性にとって必須である上記コア領域のＰｒｏ３、Ｓｅｒ７、Ｃｙｓ８、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１２、Ｔｈｒ１３、Ｓｅｒ１４、及びＰｒｏ１９（特許文献１、Ｙａｍａｇｉｓｈｉら，２００３）の中で、Ｌｅｕ９、Ｌｅｕ１２、及びＳｅｒ１４がｈＣＬＳＰ中で保存されているにすぎない。従って、ｈＣＬＳＰのこの領域は構造的にはヒューマニンのコア領域との相同性又は類似性は極めて低いが、便宜的に、ヒューマニン様ドメイン（Ｈｕｍａｎｉｎ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎ；ＨＬＤ）と命名した。
【実施例２】
【００５３】
［ＣＬＳＰはＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される神経細胞死を抑制する］
ｈＣＬＳＰ（Ｃ末端にＭｙｃＨｉｓタグを付している）及びヒューマニン（Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付している）を、ヒトＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞中で発現させた。Ｈｉｓタグに吸着するＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ｒｅｓｉｎビーズを用いたｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓの精製、並びに、ＦＬＡＧ抗体をコンジュゲートさせたビーズを用いたヒューマニン−ＦＬＡＧの精製の結果、回収した調整培地及び細胞溶解物中にｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ及びヒューマニン−ＦＬＡＧの存在が認められた（図２Ａ）。小胞体−ゴルジ体輸送の阻害物質であるブレフェンディンＡによる処理によって、調整培地中に分泌されるＧｈＣＬＳＰ及びヒューマニンの量が少なくなった（図２Ａ）。これらの結果は、ＣＬＳＰ（典型的な分泌リーダー配列は欠けている）が、通常の細胞内分泌メカニズムを介して分泌されることを示唆している。ヒューマニンの分泌については、初期の研究においてすでに示されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ）。
【００５４】
Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰの強制的発現は、初期の研究から予想されるように、ＳＨＳＹ−５Ｙ神経芽細胞腫細胞の死を誘発した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９）。結果として、このことは、ディッシュに付着している生存細胞数（図２Ｂ）とＷＳＴ−８アッセイによる細胞生存率（図２Ｃ）の両方の減少をもたらした。ｈＣＬＳＰの同時発現は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＳＨＳＹ−５Ｙ細胞の細胞死を抑制した（図２Ｂ及び２Ｃ）。イムノブロット分析によって、Ｖ６４２Ｉ−ＰＰの発現をダウンレギュレートすることによりｈＣＬＳＰが細胞死を抑制するという可能性は除外された（図２Ｄ）。
【００５５】
免疫前血清の添加でなく、１６個のアミノ酸から成るｈＣＬＳＰのＮ末端領域（「ｈＣＬＳＰ−Ｎ」と命名）に対する抗体をアッセイ系に添加することによって、ｈＣＬＳＰ発現をダウンレギュレートすることなく、ｈＣＬＳＰによって介在される細胞死を抑制する活性が無効になった（図２Ｅ及び２Ｆ）。この結果は、分泌されたｈＣＬＳＰは細胞の外側からその活性を示し、ｈＣＬＳＰ抗体が培地中のｈＣＬＳＰと結合することによりｈＣＬＳＰ活性を中和し得ることを示唆する。
【実施例３】
【００５６】
［ＣＬＳＰの培地中への分泌はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死に対するＣＬＳＰが介在する抑制にとって必須である］
ｈＣＬＳＰの欠失変異体ｈＣＬＳＰ−DＣ１及びｈＣＬＳＰ−DＣ２（これらは、それぞれ、Ｃ末端領域（アミノ酸７９〜１４６）及び（アミノ酸６２〜１４６）を欠失している）をコードする発現ベクターを、細胞死アッセイのために構築した（図３Ａ）。各変異体の同時発現は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死を抑制した（図３Ｂ及び３Ｃ）。イムノブロット分析によって、これらの変異体が調整培地中に分泌されることが示された（図３Ｄ）。これらの結果から、Ｎ末端の１〜６１領域はｈＣＬＳＰによって誘導される細胞死の抑制にとって十分であることが示された。
【００５７】
一方で、欠失変異体ｈＣＬＳＰ−DＮ（Ｎ末側領域（アミノ酸２−３９）を欠失している）をコードする発現ベクターを、別の細胞死アッセイのために構築した（図３Ａ）。同時に、Ｍｅｔ−ＩＧＦ−１シグナル配列（Ｓｅｒ１２−Ｇｌｙ３３）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏからなる２５個のアミノ酸配列が分泌を促進させるためにｈＣＬＳＰ−DＮのＮ末端に付いている、ｓｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮをコードするベクターを構築した。その結果、ｈＣＬＳＰ−DＮの発現はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死を抑制しなかった。一方で、ｓｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮの発現はＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死を抑制した（図４Ａ及び４Ｂ）。ｈＣＬＳＰ−DＮは分泌されなかったのに対して、ｓｓ−ｈＣＬＳＰ−DＮは培地中に分泌された（図４Ｃ）。この結果から、Ｎ末端の３８アミノ酸領域の欠失は、ＣＬＳＰの作用にとって必須であるｈＣＬＳＰの培地中への分泌を阻害することが示された。
【００５８】
以上のｈＣＬＳＰの欠失に関する分析結果から、ｈＣＬＳＰに含まれる２２個のアミノ酸（アミノ酸４０〜６１）から成る領域：ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳＤＧＤ（又は、「ＴＧＬ−ＨＬＤ−ＧＤ」）は、神経細胞死のｈＣＬＳＰが介在する抑制において中心的役割を果たすという結論がもたらされた。この領域を、内因性ヒューマニン様ドメイン（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｈｕｍａｎｉｎ−ｌｉｋｅ Ｄｏｍａｉｎ；ＥＨＤ）と命名した。尚、かかるＥＨＤのアミノ酸配列を配列番号２で示す。
【実施例４】
【００５９】
［合成ＥＨＤ（培地中に添加）はヒューマニン活性を示す］
ＥＨＤがｈＣＬＳＰによって誘導される抑制のためのｈＣＬＳＰのコア領域であることを確かめるために、ＥＨＤペプチドを化学的に合成し、それがｈＣＬＳＰを模倣するか否かを調べた。ヒューマニン変異体Ｓ１４Ｇ−ヒューマニンは野生型ヒューマニンと比べて１０００倍以上強力であることから（Ｔｅｒａｓｈｉｔａら，２００３）、比較のためにＥＨＤ−Ｇも合成した（この場合、５４番目のセリン（ヒューマニンにおける１４番目のセリンと類似）がグリシンに置換されている）。１０μＭの濃度のヒューマニン又はＥＨＤと一緒にインキュベートするとＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死は抑制されたのに対して、１０ｎＭの濃度のヒューマニン又はＥＨＤでは細胞死は抑制しなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。Ｓ５４Ｇ置換は、ヒューマニン活性を増強しなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。これらの結果は、ＥＨＤが神経細胞の死を抑制する活性を有することを裏付けるばかりでなく、分泌されたｈＣＬＳＰが細胞の外側から該活性を示すという考えをも支持するものである。これらのペプチドと一緒にインキュベートすることは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰの発現に影響を与えなかった（図５Ｃ）。
【実施例５】
【００６０】
［ＣＬＳＰはヒューマニンよりもはるかに強力である］
Ｔａｌｏｎ Ｍｅｔａｌビーズを用いて、ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを過剰発現するＦ１１細胞の調整培地から、ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓをアフィニティー精製した。模擬精製は骨格ベクターを用いてトランスフェクトしたＦ１１細胞の調整培地を用いて行った。ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓの濃度は、クーマシーブルー染色によって推定した（図６Ａ）。ＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを過剰発現するＣＯＳ７細胞の調整培地から部分精製した各種濃度の組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを用いることにより、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発される細胞死の抑制のためのｈＣＬＳＰの有効濃度を推定した。図６Ｂ及び６Ｃに示されるように、ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓは、用量に依存して神経細胞死を抑制した。推定されるＥＣ５０は１０〜１００ｐＭである。この結果は、ＣＬＳＰがヒューマニン（ＥＣ５０＝１〜１０μＭ）よりも１０５−６倍強力であることを示した。一方で、ＥＨＤペプチドのＥＣ５０は、１０ｎＭよりも高いことから（図５）、ｈＣＬＳＰのＥＨＤ及び／又は調整培地中でＣＬＳＰと複合体を形成するその他のタンパク質と比較して、その他の領域が、未だ特徴が明らかにされていない方法を介してＥＨＤのヒューマニン活性を増強する可能性が高い。
【実施例６】
【００６１】
［ＣＬＳＰはヒューマニン受容体を介して神経細胞の死を抑制する］
図７Ａに示されるように、組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ（概算濃度１００ｎＭ）又は合成ヒューマニン（１００μＭ）との同時インキュベーションは、７０５番目のチロシンにおけるＳＴＡＴ３のリン酸化を増大させた。この結果は、ＣＬＳＰがヒューマニン受容体と結合し、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３生存促進経路を活性化することにより、神経細胞死を抑制することを示唆する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９）。裏付けとして、ｇｐ１３０に対する中和抗体は、ヒューマニンが介在する神経保護活性についての初期の研究において示されるように（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９）、ＣＬＳＰによって誘発される神経細胞死の抑制を弱めた（図７Ｃ〜Ｄ）。ＣＮＴＦＲ及びＷＳＸ−１に対する中和抗体もまた、ＣＬＳＰによって誘発される神経細胞死の抑制を弱めた（図１３Ａ〜Ｆ参照）。
【００６２】
精製組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ又はヒューマニンの存在下で、ＣＮＴＦＲの組み換え細胞外ドメイン及びｇｐ１３０及び可溶性ＷＳＸ−１の混合物を一緒にインキュベートすることにより行うインビトロ再構成アッセイ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９ａ；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００９ｂ）において、ＷＳＸ−１とＣＮＴＦＲとの間、及び、ＷＳＸ−１とｇｐ１３０との間のヘテロダイマー化をもたらした（図８）。全てのこれらの結果は、ＣＬＳＰがヒューマニン受容体アゴニストであるということを示した。
【実施例７】
【００６３】
［ＣＬＳＰはスコポラミンによって誘発されるマウスの記憶障害を抑制する］
ヒトＣＬＳＰ遺伝子に関しては、元々Ｓｃａｒｆ１及びＳｃａｒｆ２と名付けられた２つのマウスのカウンターパート遺伝子が存在する（Ｈｗａｎｇら，２００３）。マウスＳｃａｒｆ１はアミノ酸レベルでヒトＣＬＳＰと５０．０％の同一性を示す。マウスのＳｃａｒｆ１及びＳｃａｒｆ２は、高度に類似しており、それらの遺伝子はマウス染色体１５．３に１５．３ｋＢの間隔で並んで配置されている（Ｈｗａｎｇら，２００３）。これら遺伝子をマウスＣＬＳＰ−１（ｍＣＬＳＰ−１）及びマウスＣＬＳＰ−２（ｍＣＬＳＰ−２）と命名する。これらのいずれかとの同時発現によってＶ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＦ１１細胞の細胞死が完全に抑制されたのに対して（図９）、それらは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞死は部分的にのみ抑制した（データは示さず）。一方で、ヒトＣＬＳＰは、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の死を完全に抑制することができるのに対して、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰによって誘発されるＦ１１細胞の死は部分的にのみ抑制した（データ示さず）。これらの結果は、ＣＬＳＰが部分的に種特異的なヒューマニン活性を示すことを示している。尚、マウスＳｃａｒｆ１及びマウスＳｃａｒｆ２のアミノ酸配列を夫々、配列番号３及び配列番号４で示す。
【００６４】
ヒューマニンペプチド誘導体は、家族性ＡＤ関連遺伝子を過剰発現するトランスジェニックＡＤマウスを含むＡＤマウスモデルの記憶障害を改善することが知られている（ＭａｍｉｙａとＵｋａｉ，２００１；Ｋｒｅｊｃｏｖａら，２００４：Ｔａｊｉｍａら，２００５；Ｃｈｉｂａら，２００５；Ｋｕｎｅｓｏｖら，２００８；Ｍｉａｏら，２００８；Ｙａｍａｄａら，２００８；Ｃｈｉｂａら，２００９）。
【００６５】
そこで、次に、ＣＬＳＰがインビボにおいてヒューマニンを模倣するか否かについて検討した。ｍＣＬＳＰ１−ＭｙｃＨｉｓを過剰発現するＣＯＳ７細胞の調整培地から部分精製した組み換えｍＣＬＳＰ１−ＭｙｃＨｉｓを使用し、陰性対照としてＦ１１細胞の調整培地を用いて模擬精製し（図１０Ａ）、ＣＬＳＰ−１がスコポラミンによって誘発される記憶障害を改善するか否かをＹｍａｚｅ試験によって調べた（Ｃｈｉｂａら，２００５）。予め脳室内に投与された組み換えｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓは、スコポラミンによって誘発される記憶障害を減少させたのに対して、陰性対照の投与は減少させなかった（図１０Ｂ）。部分精製した組み換えｍＣＬＳＰ−１及び強力なヒューマニン誘導体ペプチドである合成コリベリン（Ｃｈｉｂａら，２００５）の腹腔内注入によってもスコポラミンによって誘発される記憶障害を改善した（図１０Ｃ）。後の結果は、末梢的に注入されたＣＬＳＰが、血液脳関門を通過し、脳内でその活性を示すことを示唆する。
【実施例８】
【００６６】
［皮膚におけるマウスＣＬＳＰ−１及びＣＬＳＰ−２の発現］
以前の研究によって、ヒトＣＬＳＰは皮膚及びその他の表皮組織において高度に発現することが示されている（Ｍｅｈｕｌら，２０００；Ｈｗａｎｇら，２００３）。マウスＣＬＳＰ−１及びＣＬＳＰ−２は筋肉でも発現した（Ｈｗａｎｇら，２００３）。本発明者は、ｍＣＬＳＰ−１及びｍＣＬＳＰ−２が８週齢及び２０月齢のマウスの皮膚組織及び筋肉で高度に発現されていることを免疫組織化学により見出した（図１１）。一方中枢神経の海馬における発現レベルは皮膚におけるレベルよりもはるかに低いことが示された（図１１）。
【実施例９】
【００６７】
［ＣＬＳＰはヒト血漿中で検出される］
更に、健常人の血漿中のＣＬＳＰを検出した。１００μＬのヒト血漿をヒトＣＬＳＰに対する抗体を用いて免疫沈降させ、得られた沈降物を同じ抗体を用いてイムノブロットした。免疫沈降効率はほぼ１００％であった。図１２Ａに示されるように、２０ｋＤの分子量を有するタンパク質はＣＬＳＰ抗体によって得られた沈降物中にのみ検出された。このタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で組み換え野生型ＣＬＳＰと完全に同じように移動した。この結果は、ヒト血液中におけるＣＬＳＰの存在を示した。血漿中のＣＬＳＰの概算濃度は５００ｐＭ〜１ｎＭであった。
【００６８】
別の検出方法として、同じ抗体を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）システムも開発した。このＥＬＩＳＡは１０〜５０ｐＭの濃度を有する組み換えｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを検出することが可能である（図１２Ｂ）。これを利用することにより、ヒト血漿中のＣＬＳＰ濃度が約５０〜５００ｐＭであることを示した（図１２Ｂ）。このＥＬＩＳＡによって推定された濃度は、イムノブロット分析によって推定された濃度よりも低い。このＥＬＩＳＡシステムは、全ＣＬＳＰの画分のみを検出し得る可能性が高い。
【００６９】
以上の実施例で使用された材料及び方法は以下の通りである。尚、特に記載がない場合には、当業者に公知の適当な方法・手段で実施した。
【００７０】
［タンパク質の精製、ヒューマニン抗体ＰＯ４による免疫沈降］
免疫沈降物はＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、ＰＶＤＦ膜上へ転写し、銀染色ＭＳキット（Ｗａｋｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）を用いて染色した。タンパク質のバンドを切り出して、リシルエンドペプチダーゼを用いて消化し、質量分析法（Applied Biosystems社のPerSeptive Biosystem Voyager-DE/RP）により分析した。
【００７１】
［遺伝子、ポリペプチド、及び材料］
ヒトおよびマウス皮膚組織よりmRNAを調製し、それぞれの遺伝子に対応したプライマーを作成して、RT-PCR方法で、hCLSPならびにmCLSP-1 及びmCLSP-1cDNAをクローニングした。RT-PCR方法でｐｃＤＮＡベクター中でＶ６４２Ｉ−ＡＰＰをコードするｃＤＮＡが、これまでに記述されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ，ｂ）。細菌中でＧＳＴタグ付ＣＬＳＰを作製するために、ヒトＣＬＳＰ ｃＤＮＡをｐＧＥＸベクター中に導入した。Ｃ末端にＭｙｃＨｉｓタグの付いたタンパク質を作製するために、ヒトＣＬＳＰ（ｈＣＬＳＰ）、ｈＣＬＳＰ欠失変異体、マウスＣＬＳＰ−１（ｍＣＬＳＰ−１）、及び、マウスＣＬＳＰ−２（ｍＣＬＳＰ−２）をコードするｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ中に導入した。Ｃ末端にＦＬＡＧタグの付いたＣＬＳＰ（ＣＬＳＰ−ＦＬＡＧ）を作製するために、ヒトＣＬＳＰｃＤＮＡを、ｐＦＬＡＧベクター中に導入した。
【００７２】
ヒトＣＮＴＦＲ（アミノ酸１〜３９０）の細胞外ドメイン（ＥＤ）は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域をコードし、Ｃ末端に６ｘＨｉｓタグを付加したｃＤＮＡとインフレームで融合し（ＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−Ｈｉｓ）、ヒトＷＳＸ−１（アミノ酸１〜３９０）のＥＤは、ヒトＷＳＸ−１の完全な細胞外ドメインを含む。組み換えヒトｇｐ１３０−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。
【００７３】
ヒューマニン、コリベリン（Ｃｈｉｂａら，２００５）、ＥＨＤ（ＴＧＬＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳＤＧＤ）及びＳ５４Ｇ−ＥＨＤ／ＥＨＤ−Ｇ（ＴＧＬＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩＧＥＶＤＳＤＧ）は、エール大学（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）のＫｅｃｋ基金バイオテクノロジー資源研究所によって合成された。
【００７４】
［抗体］
抗体は以下の企業から購入した：Ｍｙｃ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ)；ＦＬＡＧ（Ｍ２），Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）；ＡＰＰ（２２Ｃ１１)，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ｐｈｏｓｈｏＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５），Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；ＳＴＡＴ３（Ｃ−２０），Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。ＧＳＴ−ｈＣＬＳＰに対するウサギポリクローナル抗体（ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗体と命名）は、Ｎ末端にＧＳＴタグが付けられた組み換えヒトＣＬＳＰを用いて免疫することにより作製し、細菌中で産生させた。ヒトＣＬＳＰに対する別のウサギポリクローナル抗体（ＣＬＳＰ−Ｎ抗体と命名）は、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をコンジュゲートさせたｈＣＬＳＰのＮ末端１６アミノ酸ペプチドに相当する合成ペプチドを用いて免疫することにより作製した。ＣＬＳＰ−Ｎ抗体は、Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰにより誘発される死のＣＬＳＰが介在する抑制を阻害する。
【００７５】
「細胞、細胞死、及び生存性試験」
マウスＭＬＴＬ−１マウスライディッヒ細胞（ATCC番号CRL-2065）、ＴＭ３ライディッヒ細胞（ATCC番号CRL-1714）は、ＡＴＣＣから取得した。ヒトテラトカルシノーマ細胞株ＮＴＥＲＡ−２（ＮＴ２）はSTRATAGENE社から購入した。Ｆ１１細胞（胚齢１３日目のラット初期培養神経細胞及びマウス神経芽細胞腫Ｎ１８ＴＧ２のハイブリッド））は上記のＨａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００；２０００ａ及び２００３に記載の方法で調製した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ATCC番号CRL-2266）は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２混合液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で増殖させた。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、６ウェルプレート中、２ｘ１０５細胞／ウェルの濃度で、１２〜１６時間播種し、血清非存在下で、示されたベクターを用いて３時間トランスフェクトして、次に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−１０％中で培養した。トランスフェクションを開始して２４時間後に、続いて、培地を、レスキュー因子を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２補助物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換した。トランスフェクションを開始して４８時間の時点で、細胞の死亡率及び生存率のアッセイのために細胞を回収した。細胞生存性は、ＷＳＴ−８アッセイ及びカルセイン染色アッセイによって測定した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ，ｂ，２００５ａ，ｂ）。
【００７６】
ＷＳＴ−８アッセイ（細胞計数キット−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施）は、細胞が、水溶性の２−（２−メトキシ−４−ニトロフェリル）−３−（４−ニトロフェリル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩を、水溶性のフォルマザンに変換する能力に基づく。細胞は、３７℃にて２時間、ＷＳＴ−８試薬を用いて処理し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。カルセイン染色は記載されるようにして行った（Ｂｏｚｙｃｚｋｏ−Ｃｏｙｎｅら，１９９３）。手短に述べると、６ＭのカルセインＡＭ（３，６−ジ−（Ｏ−アセチル）−２，７−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオロセイン、テトラアセトキシメチルエステル；Ｄｏｊｉｎｄｏ）を細胞に添加し、カルセインＡＭ処理後３０分以上してから、カルセイン特異的蛍光（励起４８５ｎｍ；放射５３５ｎｍ）を、蛍光顕微鏡で観察するか、又は、蛍光分光光度計（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）で測定した。
【００７７】
Ｆ１１細胞を、これまでに記載されるようにして（Ｐｌａｔｉｋａら，１９８５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２０００）、１８％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び抗生物質を含有する、ＨａｍのＦ−１２培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で増殖させた。ＨａｍのＦ−１２＋１８％ＦＢＳ（ＨＦ−１８％）中で１２〜１６時間培養したＦ１１細胞（６ウェルプレートの１ウェル当たり７ｘ１０４細胞）を、リポフェクション法［特に明記されない限り、ｃＤＮＡ，１．０μｇ；ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），２ｌ；ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），４μｌ］によりＶ６４２Ｉ−ＡＰＰ遺伝子を用いて、血清の非存在下で３時間トランスフェクトし、ＨＦ−１８％で２時間インキュベートした。トランスフェクションを開始して５時間後に、培地を、ＨＦ−１０％に交換した。トランスフェクションを開始して２４時間後に、次に、それらを、レスキュー因子を含有するＨａｍのＦ１２＋Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に交換した。トランスフェクションを開始して７２時間後に、細胞の死亡率及び生存率についてのアッセイを行った。
【００７８】
［イムノブロット分析］
イムノブロット分析は、従来文献に記載されるようにして行った（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら，２００１ａ，ｂ）。Ｖ６４２Ｉ−ＡＰＰ発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞からの溶解物（１レーン当たり２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（又は、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、次に、ポリ二フッ化ビニリデンシートに電気的にブロッティングした。シートを、２２Ｃ１１抗体に、次に、１：５０００の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗マウス又は抗ラットＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に浸した。抗原のバンドは、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により可視化した。
【００７９】
［ＣＬＳＰにより誘導されるＨＮ受容体サブユニットのオリゴマー化］
組み換えヒトＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ及びマウスＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧを作製するために、ＣＯＳ７細胞を、各タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、Ｎｉ ＮＴＡアガロース（１：１スラリー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２をコンジュゲートさせたアガロース（１：１スラリー；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた沈降のために調整培地を回収した。結合しているＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓを、１０ｍＭのイミダゾール溶液を用いて洗浄し、製造業者の説明書にしたがって、２５０ｍＭのイミダゾール溶液を用いて溶出した。溶出されたＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓを、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により脱塩し、次に、１／１０容量の１０ｘＰＢＳを、脱塩したタンパク質溶液に添加した。オリゴマー化を誘導するために、ｇｐ１３０−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（１mｇ）及び／又はＣＮＴＦＲ−ＥＤ−Ｆｃ−６ｘＨｉｓ（１μｇ）を、１％Ｂｒｉｊ９６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１００μｌのＰＢＳ中に含まれる抗ＦＬＡＧｍＡｂ Ｍ２をコンジュゲートしたアガロースビーズ上に固定化されたＷＳＸ−１−ＥＤ−ＦＬＡＧ（推定５μｇ）と一緒に、ペプチドの存在下、３７℃にて６時間インキュベートした。オリゴマー化されたタンパク質は、同じバッファーで十分に洗浄した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分画及びイムノブロット分析により可視化した。
【００８０】
［組み換えＣＬＳＰタンパク質の精製］
ＧＳＴ−融合タンパク質（ＧＳＴ−ＣＬＳＰ）を、１ｍＭ イソプロピル−チオ−b−Ｄ−ガラクトピラノシドの存在下、大腸菌ＢＬ−２１中で、３７℃にて４時間発現させ、従来文献に記載されるようにして精製した（Ｍａｔｓｕｏｋａら，２０００）。
【００８１】
ｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓ及びｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓの精製のために、ＣＯＳ７細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ−ｈＣＬＳＰプラスミドを用いてトランスフェクトし、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの４８時間後に、調整培地を回収した。分泌されたＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓタンパク質を、製造業者の説明書にしたがって、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてアフィニティー精製した。溶出液は、Ｚｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩した。１／１０容量の１０ｘＰＢＳ及び適当量のプロテアーゼカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）溶液を、脱塩した溶出物に添加した。精製されたＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓのタンパク質濃度は、Ｔｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色により推定した。ＢＳＡを、濃度標準として使用した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。模擬（ｍｏｃｋ）精製のために、ＣＯＳ７細胞を、骨格ベクターを用いてトランスフェクトした。続いて、上記と同じ精製手順を用いた。
【００８２】
［Ｔｙｒ７０５リン酸化ＳＴＡＴ３の検出］
ＳＨＳＹ−５Ｙ細胞を、ＦＢＳを含まない条件下、２４時間、Ｎ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ培地中で培養した。次に、示されたサイトカイン類を用いて、１５分間、３７℃にて細胞を処理した。ホスホＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＳＴＡＴ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたイムノブロット分析のために、１％ＮＰ−４０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を含有するバッファーを用いて、細胞を回収した。
【００８３】
［動物及びＣＬＳＰ処理（インビボＡＤモデル）］
本研究は、神経科学会の神経科学研究における動物及びヒトの利用に関する方針、並びに、東京医科大学の実験動物のケア及び利用のためのガイドラインにしたがって行われた。全ての実験手順は、東京医科大学の施設内動物実験委員会によって承認された。９週齢のＩＣＲマウスを、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。動物は、１２時間の明／暗サイクル（７：００Ａ．Ｍ．〜７：００Ｐ．Ｍ．まで明るい）の下、通常の動物用施設において飼育した（２３℃、５０％湿度）（Ｔａｊｉｍａら，２００５；Ｙａｍａｄａら，２００５；Ｃｈｉｂａら，２００５）。Ｃ５７マウス（８週齢）を、Ｙ−ｍａｚｅ試験（ＹＭ）を行う前に一週間、馴化させた。ＹＭ当日、マウスに、ＹＭの３０分前に、５μＬの生理食塩水、部分精製されたｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、又は、５μＬの生理食塩水中の精製された陰性対照を脳室内に注入した。腹腔内注入のためには、０．２１ｍｌの滅菌生理食塩水、又は示された量の部分精製されたｍＣＬＳＰ−１−ＭｙｃＨｉｓ、精製された陰性対照、０．２１ｍｌの滅菌生理食塩水中のコリベリンを使用した。次に、スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ）を溶解した滅菌生理食塩水（０．２ｍｌ）をＹＭの３０分前にマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に注入した。
【００８４】
［行動試験］
ＹＭは、従来文献に記載されるようにして行った（Ｋａｗａｓｕｍｉら，２００４；Ｙａｍａｄａら，２００５）。ＹＭのための装置は、それぞれが１２０°の角度で連結されている３つの灰色のプラスチック製アーム（４０ｃｍの長さ、１２ｃｍの高さ、底部で３ｃｍの幅、及び頂部で１０ｃｍの幅）から作られている。マウスは、アームの端部に個別に置かれ、８分間アームを自由に探索させた。調べられたパラメーターは、（１）全アームエントリー数及び（２）自発的交代パーセンテージ（ＳＡ％）であった。ＳＡ％は、試験実施時における全選択（初めの２つのエントリーは評価することができなかったので「全エントリー引く２」）に対する、以前の２つの選択と異なるアームの選択（「成功の選択」）の比として定義された。例えば、あるマウスが１０エントリーした場合（例えば、１−２−３−２−３−１−２−３−２−１）、８つの全選択（１０エントリー引く２）のうち５つの成功の選択であった。その結果、本ケースにおけるＳＡ％は、６２．５％であった。
【００８５】
［ｈＣＬＳＰ抗体をコンジュゲートさせたタンパク質Ｇセファロースの調製及びヒト血漿の免疫沈降］
２００μｌの免疫前血清（Ｐｒｅ）又は抗ｈＣＬＳＰ抗血清を、８００μｌのタンパク質Ｇセファロース４Ｂ（１：１スラリー、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）と混合し、４℃にて一晩回転させた。０．２Ｍの四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）で二度洗浄した後、それらを２ｍｌの同じバッファー中に懸濁させた。次に、それらを、２００μｌの０．２Ｍ ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合し、緩やかに振盪させながら室温にて３０分間インキュベートした。０．２Ｍのエタノールアミンを用いて一度洗浄し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間、室温）により回収した後、ビーズを、１０μｌの０．２Ｍ エタノールアミンと混合し、緩やかに振盪させながら室温にて２時間インキュベートした。次に、ビーズをＰＢＳ中に懸濁させた。抗体のコンジュゲーション効率は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの銀染色により確認した（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００８６】
ヒト血漿を健常提供者から吸引し、氷上でＥＤＴＡ−Ｎａを含有するチューブ中に入れた。精製された血漿は、−８０℃にて保存された。１００μＬの精製ヒト血漿を、各免疫沈降において、ＣＬＳＰ抗体−又は免疫前−セファロースの２０μｌの１：１スラリーと一緒に、４℃にて一晩インキュベートした。
【００８７】
［酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）］
細胞培養及びヒト血漿からの調整培地（ＣＭ）中のヒトＣＬＳＰレベルを定量するために、ＥＬＩＳＡシステムを構築した。０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で（２５００倍に）希釈した抗ヒトＣＬＳＰ抗体を含有するウサギ血清を用いて、９６ウェルマイクロプレートを１ウェル当たり５０μＬの量でコーティングし、４℃にて一晩インキュベートした。各ウェルを吸引し、各洗浄工程時に、２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を用いて３回洗浄した。捕捉抗体に対する非特異的結合は、３％のろ過済みスキムミルク含有ＰＢＳ（１５０μＬ）を添加後３７℃において１時間インキュベートし、５回の洗浄により最小にした。組み換えヒトＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを、７点標準曲線を提供するように希釈した（１０ｐＭ〜１ｎＭ）。１００μＬのヒト血漿及び基準物質をウェルに添加し（３連）、３７℃にて２時間インキュベートした。５回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたアフィニティー精製したウサギ抗ヒトＣＬＳＰ抗体を含むＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）溶液（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｊａｐａｎ）（０．１４４μｇ／ｍｌ）を１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。７回洗浄した後、４ｍｇ／ｍＬのｏ−フェヌレンジアミンを含む０．０５Ｍクエン酸ペルオキシドバッファー（１００μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃にて２時間インキュベートした。次に、反応を停止させるために５０μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加した。ＣＬＳＰ濃度を測定するために、吸光度（４５０ｎｍ）を、蛍光分光光度計（Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯｓｘ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）によって測定した。全てのサンプルは３連でアッセイし、値は、標準曲線に対してプロットした。このＥＬＩＳＡの感度は１ｎＭ迄の直線範囲で１０〜５０ｐＭであった。
【００８８】
各サンプルは、２つの部分に分けた。そのうちの一方は、予めタンパク質Ｇセファロース（Ｇ３サンプル）に結合させた抗ＧＳＴ−ｈＣＬＳＰ血清により、４℃にて一晩、免疫除去した。５μＬの粗ＧＳＴ−ＣＬＳＰ抗血清を混合し、タンパク質Ｇビーズ上に、４℃にて一晩予め吸着させた。模擬手順を、免疫前血清（Ｇ０サンプル）を用いて同様にして行った。Ｇ０サンプルのＥＬＩＳＡの値マイナスＧ３サンプルのＥＬＩＳＡの値を、実際のｈＣＬＳＰ濃度を表すと考えた。この免疫除去手順は、５ｎＭのｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓを含有する１００μＬの溶液からｈＣＬＳＰ−ＭｙｃＨｉｓをほぼ完全に免疫除去することができた（図１４参照）。
【００８９】
［免疫組織化学］
８週齢、２０月齢のオスＣ５７−ＢＬ６マウスを、ジエチルエーテルによって麻酔した。４％パラホルムアルデヒドを含有するリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて固定化した後、脳及び皮膚を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中に包埋し、１０μｍの厚さに切断した。海馬の矢状断面を、ＭＡＳコーティングしたスライドグラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）上に調製した。この断面を、ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄し、内因性のペルオキシダーゼ活性を消失させるために３０分間、０．３％ Ｈ２Ｏ２を用いて処理し、ＴＢＳ−Ｔですすいだ。ブロッキング及び免疫染色は、Ｍ．Ｏ．Ｍ．ベーシックキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて処理した。この断面を、一次抗体として、アフィニティー精製したｍＣＬＳＰ−１及びｍＣＬＳＰ−２抗体を用いて、４℃にて一晩インキュベートした。次に、それらを、ＴＢＳ−Ｔ中ですすぎ、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、室温にて３０分間インキュベートし、ＡＢＣエリートキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法で処理した。免疫反応性は、チラミド−ＦＩＴＣ（ＴＳＡキット；ＮＥＮ−Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて可視化した。蛍光は、レーザー走査共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
【００９０】
［統計分析］
全ての細胞死試験、細胞生存試験、結合試験、及び定量リアルタイムＰＣＲ試験を行った（ｎ＝３）。インビトロ研究における図中の全ての値は、平均±ＳＤである。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。インビボ試験に対する統計分析は、一元配置分散分析、続いて、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤを用いて行い、この場合、有意差として、ｐ＜０．０５が算定された。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によって初めて見出されたＥＨＤペプチド又はＣＬＳＰの強力な神経保護活性（神経細胞の細胞機能障害又は神経細胞死を抑制する活性）は、ＣＬＳＰが、ヒューマニンよりもむしろヒューマニン受容体が介在する生存促進性シグナル（ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌ）の活性化において主要な役割を果たすことを示す。
【００９２】
本明細書中で引用された文献のリストを以下に示す。
［引用文献リスト］
Babini E, Bertini I, Capozzi F, Chirivino E, Luchinat C. A structural and dynamic characterization of the EF-hand protein CLSP. Structure. 2006 14:1029-38.
Bozyczko-Coyne D, McKenna B W, Connors T J, Neff N T (1993) A rapid fluorometric assay to measure neuronal survival in vitro. J Neurosci Methods 50:205-216
Chiba T, Hashimoto Y, Tajima H, Yamada M, Kato R, Niikura T, Terashita K, Schulman H, Aiso S, Kita Y, Matsuoka M, Nishimoto I (2004) Neuro- protective effect of activity-dependent neurotrophic factor against toxicity from familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1 in vitro and in vivo. J Neurosci Res 78:542-552.
Chiba T, Yamada M, Sasabe J, Terashita K, Shimoda M, Matsuoka M, Aiso S. Amyloid-beta causes memory impairment by disturbing the JAK2/STAT3 axis in hippocampal neurons. Mol Psychiatry. 2009, 14;206-22
Durussel I, Mehul B, Bernard D, Schmidt R, Cox JA. Cation- and peptide-binding properties of human calmodulin-like skin protein. Biochemistry. 2002 41:5439-48.
Guo B, Zhai D, Cabezas E, Welsh K, Nouraini S, Satterthwait AC, Reed JC (2003) Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation. Nature 423:456 - 461.
Hashimoto Y, Niikura T, Ito Y, Nishimoto I (2000) Multiple mechanisms underlie neurotoxicity by different types of Alzheimer’s disease mutations of amyloid precursor protein. J Biol Chem 275:34541-4551.
Hashimoto Y, Niikura T, Tajima H, Yasukawa T, Sudo H, Ito Y, Kita Y, Kawasumi M, Kouyama K, Doyu M, Sobue G, Koide T, Tsuji S, Lang J, Kurokawa K, Nishimoto I (2001a) A rescue factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheimer’s disease genes and Ab. Proc Natl Acad Sci USA 98:6336 - 6341.
Hashimoto Y, Niikura T, Ito Y, Sudo H, Hata M, Arakawa E, Abe Y, Kita Y,
Nishimoto I (2001b) Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer’s disease-relevant in- sults. J Neurosci 21:9235-9245.
Hashimoto Y, Tsuji O, Niikura T, Yamagishi Y, Ishizaka M, Kawasumi M, Chiba T, Kanekura K, Yamada M, Tsukamoto E, Kouyama K, Terashita K, Aiso S, Lin A, Nishimoto I (2003) Involvement of c-Jun N-terminal kinase in amyloid precursor protein-mediated neuronal cell death. J Neurochem 84:864- 877.
Hashimoto Y, Suzuki H, Aiso S, Niikura T, Nishimoto I, Matsuoka M (2005) Involvement of tyrosine kinases and STAT3 in Humanin-mediated neu- roprotection. Life Sci 77:3092-3104.
Hashimoto Y, Kurita M, Aiso S, Nishimoto I, Matsuoka M Humanin inhibits neuronal cell death by interacting with a cytokine receptor complex or complexes involving CNTF receptor alfa/WSX-1/gp130 Mol. Biol. Cell 2009, 20:2864-73.
Hwang M, Morasso MI. The novel murine Ca2+-binding protein, Scarf, is differentially expressed during epidermal differentiation. J Biol Chem. 2003 278:47827-33.
Hwang M, Kalinin A, Morasso MI. The temporal and spatial expression of the novel Ca++-binding proteins, Scarf and Scarf2, during development and epidermal differentiation. Gene Expr Patterns. 2005 5:801-8.
Hwang J, Kalinin A, Hwang M, Anderson DE, Kim MJ, Stojadinovic O, Tomic-Canic M, Lee SH, Morasso MI. Role of Scarf and its binding target proteins in epidermal calcium homeostasis.J Biol Chem. 2007 282:18645-53.
Kawasumi, M., Hashimoto, Y., Chiba, T., Kanekura, K., Yamagishi, Y., Ishizaka, M., Tajima, H., Niikura, T., and Nishimoto, I. (2002) Molecular mechanisms for neuronal cell death by Alzheimer's amyloid precursor protein relevant insults. Neurosignals 11, 236-250. Review
Kunesova G, Hlavacek J, Patocka J, Evangelou A, Zikos C, Benaki D, Paravatou-Petsotas M, Pelecanou M, Livaniou E, Slaninova J.
The multiple T-maze in vivo testing of the neuroprotective effect of humanin analogues.Peptides. 2008 29:1982-7
Krejcova G, Patocka J, Slaninova J (2004) Effect of humanin analogues on experimentally induced impairment of spatial memory in rats. J Pept Sci 10:636 - 639.
Lue Y, Swerdloff R, Liu Q, Mehta H, Hikim AS, Lee KW, Jia Y, Hwang D, Cobb LJ, Cohen P, Wang C. (2010) Opposing roles of insulin-like growth factor binding protein 3 and humanin in the regulation of testicular germ cell apoptosis. Endocrinology 151, 350-357.
Mamiya T, Ukai M (2001) [Gly(14)]-Humanin improved the learning and memory impairment induced by scopolamine in vivo. Br J Pharmacol
134:1597-1599.
Matsuoka M, Matsuura Y, Semba K, Nishimoto I. (2000)
Molecular cloning of a cyclin-like protein associated with cyclin-dependent kinase 3 (cdk 3) in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 273:442-7
Matsuoka M, Hashimoto Y, Aiso S, Nishimoto I. (2006) Humanin and colivelin: neuronal-death-suppressing peptides for Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis. CNS Drug Rev. 12:113-22.
Matsuoka M.(2009) Humanin; a defender against Alzheimer's disease? Recent Pat CNS Drug Discov. 2009 4:37-4
Matsuoka M, Hashimoto Y. Humanin and the receptors for humanin.
Mol Neurobiol. 2010, 41, 22-8
Mehul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA, Schmidt R. Identification and cloning of a new calmodulin-like protein from human epidermis. J Biol Chem. 2000 275:12841-7.
Mehul B, Bernard D, Brouard M, Delattre C, Schmidt R.Influence of calcium on the proteolytic degradation of the calmodulin-like skin protein (calmodulin-like protein 5) in psoriatic epidermis.Exp Dermatol. 2006 15:469-77.
Miao J, Zhang W, Yin R, Liu R, Su C, Lei G, Li Z. (2008) S14G-Humanin ameliorates Abeta25-35-induced behavioral deficits by reducing neuroinflammatory responses and apoptosis in mice. Neuropeptides. 42:557-67
Moretti E, Giannerini V, Rossini L, Matsuoka M, Trabalzini L, Collodel (2010) G.Immunolocalization of humanin in human sperm and testis. Fertil Steril 94, 2888-2890.
Muzumdar RH, Huffman DM, Atzmon G, Buettner C, Cobb LJ, Fishman S, Budagov T, Cui L, Einstein FH, Poduval A, Hwang D, Barzilai N, Cohen P.
Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.
PLoS One. 2009 Jul 22;4(7):e6334.
Niikura, T., Hashimoto, Y., Tajima, H., and Nishimoto, I. (2002) Death and survival of neuronal cells exposed to Alzheimer's insults. J. Neurosci. Res. 70, 380-391. review
Nishimoto I, Matsuoka M, Niikura T. (2004) Unravelling the role of Humanin. Trends Mol Med 10: 102-105.
Tjima H, Niikura T, Hashimoto Y, Ito Y, Kita Y, Terashita K, Yamazaki K, Koto A, Aiso S, Nishimoto I (2002) Evidence for in vivo production of Humanin peptide, a neuroprotective factor against Alzheimer’s Disease-related insults. Neurosci Lett 324, 227-231.
Tajima H, Kawasumi M, Chiba T, Yamada M, Yamashita K, Nawa M, Kita Y, Kouyama K, Aiso S, Matsuoka M, Niikura T, Nishimoto I (2005) A Humanin derivative, S14G-HN, prevents amyloid-b-induced memory impairment in mice. J Neurosci Res 79:714 -723.
Terashita K, Hashimoto Y, Niikura T, Tajima H, Yamagishi Y, Ishizaka M, Kawasumi M, Chiba T, Kanekura K, Yamada M, Nawa M, Kita Y, Aiso S, Nishimoto I (2003) Two serine residues distinctly regulate the rescue function of Humanin, an inhibiting factor of Alzheimer’s disease-related neurotoxicity: functional potentiation by isomerization and dimeriza-tion. J Neurochem 85:1521-1538.
Yamada M, Chiba T, Sasabe J, Nawa M, Tajima H, Niikura T, Terashita K, Aiso S, Kita Y, Matsuoka M, Nishimoto I (2005) Implanted cannula- mediated repetitive administration of A 25-35 into the mouse cerebral ventricle effectively impairs spatial working memory. Behav Brain Res 164:139-146.
Yamagishi Y,HashimotoY,NiikuraT,NishimotoI (2003) Identificationof essential amino acids in Humanin, a neuroprotective factor against Alz- heimer’s disease-relevant insults. Peptides 24:585-595.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチド、又は、式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を含み、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項３】
以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列における式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（５）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；又は
（６）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項４】
神経細胞の機能障害又は細胞死がアルツハイマー病に関連する、請求項２又は３記載の医薬組成物。
【請求項５】
記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
【請求項７】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドによる細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を検出する方法であって、（ａ）被検化合物および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
【請求項８】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検試料および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞死を検出する工程、（ｃ）神経細胞の機能障害又は細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項９】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）該ペプチド又はポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該ペプチド又はポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１０】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドを神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法。
【請求項１１】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドを、神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのある個体に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法。
【請求項１２】
疾患又は疾病がアルツハイマー病である、請求項１１記載の方法。
【請求項１】
式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を有する、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のペプチド、又は、式（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＧＬＲＫＬＩ（Ｓ又はＧ）ＥＶＤＳＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
からなるアミノ酸配列を含み、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項３】
以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列における式（Ｉ）からなるアミノ酸配列以外の部分において、６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列；
（５）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列；又は
（６）配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項４】
神経細胞の機能障害又は細胞死がアルツハイマー病に関連する、請求項２又は３記載の医薬組成物。
【請求項５】
記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
【請求項７】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドによる細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を検出する方法であって、（ａ）被検化合物および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
【請求項８】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）被検試料および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞死を検出する工程、（ｃ）神経細胞の機能障害又は細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項９】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）該ペプチド又はポリペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）該ペプチド又はポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該ペプチド又はポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１０】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドを神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法。
【請求項１１】
請求項１記載のペプチド、又は、請求項２若しくは３に記載のポリペプチドを、神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのある個体に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法。
【請求項１２】
疾患又は疾病がアルツハイマー病である、請求項１１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１２−１３１７１１（Ｐ２０１２−１３１７１１Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８２５０９（Ｐ２０１０−２８２５０９）
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度〜平成２１年度独立行政法人医薬基盤研究所基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（５０５４５７９９４）学校法人東京医科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２０日（２０１０．１２．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度〜平成２１年度独立行政法人医薬基盤研究所基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（５０５４５７９９４）学校法人東京医科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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