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カルモデュリンの構造変化を検出する方法、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法
説明

カルモデュリンの構造変化を検出する方法、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法

【課題】定量的かつリアルタイムに、カルモデュリンの構造変化を簡便に短時間で検出することができる方法、および、多数の物質の中からカルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を効率良く探索できる方法を提供することが本発明の課題である。
【解決手段】カルモデュリンよりなる試料膜に、活性を検出するべき被験物質を作用させ、上記被験物質を作用させる前と比べた試料膜の張力及び/または弾性の変化をメカノケミカル式センサーで検出することにより、上記被験物質が有するカルモデュリンの構造変化を誘導または阻害する活性をリアルタイムに短時間で測定できる方法が提供された。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はカルモデュリンの構造変化を検出する方法、およびカルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
カルシウムをセカンドメッセンジャーとする細胞内情報伝達系の多くにおいて、最初にカルシウムと結合するのはカルモデュリンである。カルモデュリンは148個のアミノ酸からなる分子量16700の蛋白質であり、情報伝達機能に関与するカルシウム結合蛋白質である。カルモデュリン1分子は4個のカルシウムを結合することができる。カルモデュリンは種々のカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質の調節に関与しており、まず蛋白質のコンフォメーション変化を伴うカルシウムのカルモデュリンへの結合が起こり、それに続いてカルモデュリン−カルシウム複合体がカルモデュリン依存性酵素または結合物質に結合してその酵素または結合物質が活性化する。
【0003】
従来のカルモデュリン阻害剤のスクリーニングは、カルモデュリン依存性酵素の活性を計測することによって行われていた。この方法はカルモデュリンに対する物質の作用を直接的に測定するものではなく、カルモデュリン依存性酵素の活性をカルシウム・カルモデュリンの存在下および非存在下で測定して間接的に測定するため、煩雑で時間がかかる。また、間接的に測定しているためにカルモデュリンに対する作用を正確に測定しているとはいえない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
よって本発明の課題は、張力及び/又は弾性の変化として、カルモデュリンの構造変化の過程を力センサーを用いてリアルタイムに検出測定することにより、カルモデュリンの構造変化を簡便かつ短時間で評価する方法を開発することである。更にその方法を用いて、多数の物質の中からカルモデュリンの構造変化に影響する活性をもつリガンドの効率良いスクリーニングを可能とする事も、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、カルモデュリンのリガンドとして作用する物質を添加したときのカルモデュリンよりなる試料膜の張力及び/又は弾性変化に着目し、種々の検討を重ねた結果、カルモデュリンの試料膜の張力及び/又は弾性変化を力センサーで測定することにより、カルモデュリンリガンドにより引き起こされたカルモデュリンの構造変化を測定できることを見出した。すなわち本発明は、カルモデュリンよりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルモデュリンの構造変化を検出する方法を提供するものである。
【0006】
更に本発明は、カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法を提供するものである。
【0007】
更に本発明は、カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルシウム/カルモデュリンが関与する細胞内情報伝達経路に変化が生じる疾患の診断薬または治療薬を探索する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【0008】
本発明は、カルモデュリンを固定化した試料膜に活性を判定すべき物質を添加し、その物質を添加する前と比べた試料膜の張力及び/又は弾性変化を検出することからなる、カルモデュリンの構造変化を検出する方法を与えるものであり、本発明の方法によれば、上記物質のカルモデュリンの構造変化を引き起こす活性をリアルタイムに短時間で効率良く検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
上記において述べたように本発明は、カルモデュリンの試料膜に披験物質を作用させ、その試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を力センサーで検出することにより、カルモデュリンの構造変化を検出する方法である。本発明の方法は、カルモデュリンの構造変化を張力及び/又は弾性の変化としてリアルタイムで直接的に観察および測定するものであるので、その点において本発明の方法は、カルモデュリン依存性酵素の活性を測定するという従来の間接的な手段とは異なっている。更には本発明の方法を用いて、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索することもできる。本発明の方法でカルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を直接的に探索することができると共に、スクリーニングに費やす時間を大幅に短縮することができ、多数の物質の中から効率良くスクリーニングを行うことができる。
【0010】
そしてかかるカルモデュリンの構造変化を、カルモデュリンからなる試料膜の機械的特性の変化により検出する点に本発明の最も顕著な特徴がある。本発明において試料膜の機械的特性の変化を、張力のみ、弾力のみあるいは張力と弾力の両者を指標として測定する態様が可能であるが、本発明は上記の特定の態様に限定されるものではない。
【0011】
本発明においてはまず、カルモデュリンからなる試料膜を基板上に形成する。形成される試料膜の大きさは、好ましくは、縦は50μmから1000μm、横は200μmから2000μm、厚さは0.3μmから10μmの範囲内であるが、その範囲内に特に限定されるものではない。また本発明における基板とは、その上に試料膜が作製されることによって試料膜を測定装置に移動することを可能とする適切な膜の支持体であり、該基板の材料や大きさは特に限定されるものではない。
【0012】
カルモデュリンは必ずしも完全な蛋白質として使用する必要がある訳ではなく、カルモデュリンとしての機能を保持する限り、その断片、変異体またはタグ化したカルモデュリンであってもよい。即ち本願明細書において「カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン」とは、カルモデュリンのアミノ酸配列の一部分からなる断片である蛋白質、カルモデュリンのアミノ酸配列の一部分が変異した蛋白質、またはカルモデュリンにタグを付した蛋白質であって、且つ、カルシウムと結合してカルシウム依存性酵素を活性化するというカルモデュリンとしての機能を保持しているものを意味するものである。また本発明はカルモデュリン自身の試料膜を形成する事に限定されるものではなく、カルモデュリンに対する抗体蛋白質あるいはカルモデュリンにより活性化される蛋白質よりなる膜を形成し、その抗体あるいはカルモデュリン活性化蛋白質がカルモデュリンと結合した際の構造変化を測定することによって同様の効果を得ることができるので、かかる態様も本発明の範囲内である。
【0013】
なおカルシウム−カルモデュリンを介する情報伝達系の下流に位置し、カルモデュリンにより制御を受ける主なカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質としては、アデニルシクラーゼ、ブラッシュボーダーミオシンI重鎖、カルシニューリン、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIV、カルデスモン、カルモデュリン依存性サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ、赤血球カルシウム-ATPアーゼ、ニューロナル一酸化窒素シンターゼ、ニコチナミドジヌクレオチドキナーゼ、ファオスファチヂルイノシトール3キナーゼ、フォスフォリレースキナーゼ、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ、IQGAP1などが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【0014】
なお本発明の方法によれば、カルモデュリン単独の状態でカルモデュリンの構造変化を引き起こすリガンドをスクリーニングできるのみならず、カルモデュリンと上記で述べたカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質を結合させることにより、カルモデュリン−カルモデュリン依存性酵素の複合体に作用するリガンドをスクリーニングすることも可能である。即ち、カルモデュリンよりなる試料膜をカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質で処理して複合体を形成し、あるいはカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質よりなる試料膜をカルモデュリンで処理して複合体を形成し、その複合体においてスクリーニングを行うことも本発明の一態様である。カルモデュリンと結合したカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質が下流の情報伝達系を制御している点を考えると、複合体を形成してスクリーニングを行うことは、本発明において好ましい態様である。
【0015】
このカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質は、必ずしも完全な蛋白質である必要がある訳ではなく、カルモデュリン依存性酵素/結合物質としての機能を保持する限り、その断片、変異体またはタグ化蛋白質であってもよい。即ち本願明細書において「カルモデュリン依存性酵素/結合物質の断片、前記蛋白質の変異体、タグ化した前記蛋白質」とは、上記で述べたカルモデュリン依存性酵素/結合物質のアミノ酸配列の一部分からなる断片である蛋白質、カルモデュリン依存性酵素/結合物質のアミノ酸配列の一部分が変異した蛋白質、またはカルモデュリン依存性酵素/結合物質にタグを付した蛋白質であって、且つカルモデュリンと結合して活性化されるというカルモデュリン依存性酵素/結合物質の機能を保持しているものを意味するものである。また本発明はカルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質そのものを固定化する事に限定されるものではなく、カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質に対する抗体を固定化する事によっても同様の効果を得ることができるので、かかる態様も本発明の範囲内である。
【0016】
上記で述べたカルモデュリンの試料膜を作製する方法としては、エレクトロスプレー(静電噴霧)により試料を堆積させて薄膜を形成させるESD法(静電噴霧法)が好適である。かかる技術は当業者にとって周知のものであり、適宜改変して本発明の目的に使用することができる。そのような技術を開示した文献の一例として、特表2002−511792号公報に記載されている、巨大生体分子を含む不揮発性物質の堆積物を、静電噴霧によって製造する方法を挙げることができる。
【0017】
また特開2003−136005号公報には、生体高分子などの活性を保持したまま固定して薄膜やスポットを作製するための装置が記載されている。更に特表2002−503332号公報には、プロテインやDNAと結合するリガンドを測定するための方法及び装置が記載されている。特表2002−503332号公報に記載されている装置によると、生体高分子などから構成された試料膜に対する化学物質の作用を機械化学的(メカノケミカル的)に測定することが可能である。よって、特表2002−503332号公報に記載されている装置により、試料膜の張力及び/又は弾性の変化を検出することは、本発明において好ましい態様である。
【0018】
なお、蛋白質とリガンドの相互作用を測定するために、蛋白質膜の弾力特性を測定するメカノケミカル的な方法は、V.N,Morozov and T Ya Morozova (1992) Anal.Biochem., 201:68-79及びV.N,Morozov and T Ya Morozova (1984) FEBS Letters, 175:299-302に記載されており、当業者はこれらの文献の記載を参考にして適宜改変を行い、本発明を実施することができる。
【0019】
また上記基板と試料膜との間に水溶性ポリマーからなる中間層を設けることは本発明において好ましい態様である。下記の実施例においては1.2%ポリビニルピロリドン(PVP)をこのような中間層として用いている。かかる中間層を設けることにより、基板から試料膜を取り外すことが容易となる。中間層としてPVPを用いる場合には、PVPの濃度は0.1%から5%、好ましくは0.3%から2%の範囲内であるが、PVPの濃度は特に限定されるものではない。また、他の水溶性ポリマーを使用することも可能である。
【0020】
なおこの中間層として使用することができる材料の例として、特表2002−503332号公報に記載されているように、(1)ポリアクリルアミド又はポリエチレングリコールのような水溶性のポリマーの層、(2)メルカプトエタノールにより還元される二硫化物のボンドを有するポリマーから成る層、(3)堆積される生物学的分子に対する接着性が低く、炭素を相当に分散させた層、および(4)低融点のカーボンポリマーの導電性の組成の層、を挙げることができる。
【0021】
必要ならば、ESD法により固定化した後に、上記試料膜を構成するカルモデュリンを更に架橋することもできる。かかる架橋を行うことは必須ではないが、試料膜の膜としての形態や強度を保つ目的において有効である。生物学的分子を重合するために利用できる架橋試薬は当業者に良く知られており、例えば、Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques Academic Press, New York, 1991を参照することができる。
【0022】
カルモデュリンを架橋するために使用する試薬としてグルタルアルデヒドは最も好適であるが、その他に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノ)ピロピルカルボジイミド(EDC)などのゼロ長架橋試薬、ジメチルアジピンイミデート(DMA)などのホモ二価性架橋試薬、スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)などのヘテロ二価性架橋試薬、4-アジド−2−ニトロフェニルビオシチン-4-ニトロフェニルエステルなどの三価性架橋試薬を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。また架橋反応を行う時間も特に限定されるものではなく、0から3時間程度の範囲内で最適の条件を適宜選択することができる。
【0023】
その様にして作製した試料膜を、例えば特表2002−503332号公報記載の検出装置に配置し、適切な緩衝液中に浸すことにより、試料膜に披験サンプルを作用させる準備を行う。ここで使用する緩衝液としては、本技術分野で一般的に使用されているHepes緩衝液やTris緩衝液などを使用することができるが、それらに限定されるものではない。緩衝液のpHも特に限定されるものではなく、pH3からpH9程度の範囲内で適切なpHを適宜選択することができる。
【0024】
また上記緩衝液は適切な塩強度を有することも可能であり、下記の実施例のように0.1M程度の塩化ナトリウムを緩衝液に添加することは本発明において好ましい態様である。しかし塩強度を与えるための電解質を添加しないで測定を行うことも可能であると考えられ、かかる態様も本発明の範囲内である。また添加する電解質も塩化ナトリウムに限定されるものではない。
【0025】
上記の緩衝液を一定流速で流して試料膜の張力を安定化させた後に、試験を行う対象である披験サンプルを含む緩衝液に置換して試料膜に作用させる。披験サンプル添加前と後における試料膜の張力及び/又は弾性変化を力センサーにより測定し、カルモデュリンの構造変化への影響を評価する。張力及び/又は弾性の変化は力センサーにより、好ましくはメカノケミカル式センサーにより測定することが可能である。なおメカノケミカル式センサーによる測定を、特表2002−503332号公報に記載されている装置を用いて行うことは、本発明において特に好ましい態様である。
【0026】
なおカルモデュリンの構造変化に対する影響を検討するための披験サンプルとして、種々の物質を採用することができる。その様な披験サンプルとなる物質の例として、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、糖、脂質、核酸、金属及び有機化合物などを挙げることができるが、それらに特に限定されるものではない。
【0027】
本発明の方法により、カルモデュリンの張力及び/又は弾性変化を、速やかに且つリアルタイムで検出することができる。よって、多くのサンプルにおけるカルモデュリンの構造変化を効率的に評価できるために、カルモデュリンの構造変化を阻害する物質の探索に費やす時間を大幅に短縮することができ、容易に多数の物質の中からかかる活性を有する物質を選別することができる。
【0028】
なお、カルシウム−カルモデュリンの情報伝達系の下流に異常が起きている事が疑われる疾患としては、統合失調症、心肥大、記憶障害、高血圧、炎症、アレルギー、糖尿病および癌などがある。また、シクロスポリンAやタクロムリスなどの免疫抑制剤の標的がカルシニューリンであることが知られている。よってカルモデュリンの阻害剤を新たに探索し、更に上記阻害剤の安全性などを検討することにより、これらの疾患の診断薬および治療薬を開発できる可能性がある。よって本発明は、かかる有用な診断薬および治療薬を得るための新たな途を提供するものである。
【実施例】
【0029】
下記の実施例や図面を用いて本発明を更に詳しく説明するが、その記載は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【0030】
(実施例1)
ウシ脳由来カルモデュリン(Sigma)を2 mg/mLの濃度で純水に溶解し、その溶液を特表2002-511792号公報に記載された静電噴霧を行う装置、あるいは特開2003-136005号公報に記載された固定化装置を用いて乾燥空気中で噴霧し、縦400μm横800μmの孔をもつマスクを透過させ、静電噴霧法(ESD法)により1.2%ポリビニルピロリドン上に膜を作成した。この膜を、メカノケミカル式センサーを有する特表2002-503332号公報あるいは米国特許US6033913号公報に記載されている装置上に配置し、0.1 M NaClを含む10 mM Hepes pH7.4緩衝液(以下、緩衝液と略す)中に浸した。緩衝液を、検出装置上に存在する膜上に0.1から0.2 mL/minの流速で流し、張力を安定させた。その後、同じ流速で、上記緩衝液中に溶解したCaCl2溶液を流し、張力および弾性の変化を検出した(図1)。
【0031】
このグラフは、CaCl2によりカルモデュリン膜の等方性張力が著しく増加することを示している。一方、この作用は、緩衝液によりCaCl2溶液添加前の状態に戻ることから、可逆的に回復することを示している。さらにキレーターであるEDTA添加によって張力がより減少することは、緩衝液に混入しているごくわずかなCaイオンをも検出できることを示している。最初の状態を示す水平線が立ち上がるところは、試料膜に張力が加わった時点を示し、振動しているところはコンプライアンスの測定を示したものである。この実施例は、カルモデュリンとCaCl2との相互作用により、Ca2+が引き起こすカルモデュリンの構造変化であり、それが本発明を使用してリアルタイムに数分で検出することができることを示したものである。なおカルモデュリンの構造変化については例えば次の総説を参照することができる(Vetter S. W. and Leclerc, E. (2003). Novel aspects of calmodulin target recognition and activation. Eur. J. Biochem. 270, 404-414)。
【0032】
(実施例2)
実施例1と同一の材料および方法で作成したカルモデュリン膜を、0.1M KCl、10mM EGTA を含む10mM MOPS 緩衝液 pH7.2中に浸した。遊離カルシウムイオン濃度が151nM、352nM、1360nMのカルシウムバッファー溶液を作成し、それら単独あるいは50μMのカルモデュリン阻害剤W-7を加えた溶液を流し、張力および弾性の変化を検出した(図2)。
【0033】
W-7は単独でもカルモデュリン膜に張力を生じるが、カルシウム存在下ではより張力を増大させ、W-7の除去によりもとにもどった。W-7はカルシウムによって構造変化をおこしたカルモデュリンに結合して、その構造をコンパクトにすることが知られているので(Osawa, M. et al., (1999). Evidense for calmodulin inter-domain compaction in solution induced by W-7 binding. FEBS Letters 442, 173-177)、この実施例はカルモデュリン阻害剤によるカルモデュリン膜の張力変化がカルモデュリンの構造変化に対応し、本系がカルモデュリン阻害剤の検出に有効であることを示している。
【0034】
(実施例3)
実施例1と同一の材料および方法で作成したカルモデュリン膜を、0.1M KCl、10mM EGTA を含む10mM HEPES 緩衝液 pH7.2中に浸した。そしてカルシウム依存性プロテインキナーゼIIのカルモデュリン結合部位断片を含む溶液を作成し、これをカルモデュリン膜と接触させて張力および弾性の変化を検出した(図3)。
【産業上の利用可能性】
【0035】
本発明により、メカノケミカル式センサーを用いてカルモデュリンの構造変化を検出する方法が提供された。更に上記検出方法を用いて、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法が提供された。本発明の方法は、カルシウム−カルモデュリンを介した情報伝達系が関与している疾患の治療薬や診断薬を得る目的に資するものであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】図1は、カルモデュリンの張力および弾性変化に対するCaCl2およびEDTAの効果を示す図である(実施例1)。
【図2】図2は、カルモデュリンの張力および弾性変化に対するCaイオンおよびカルモデュリン阻害剤W-7の効果を示す図である(実施例2)。
【図3】図3は、カルモデュリンの張力および弾性変化に対するカルシウム依存性プロテインキナーゼIIのカルモデュリン結合部位断片およびCaイオンの効果を示す図である(実施例3)。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルモデュリンの構造変化を検出する方法。
【請求項2】
前記力センサーがメカノケミカル式センサーである、請求項1記載の方法。
【請求項3】
基板上に形成した前記試料膜に、カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質、前記蛋白質の断片、前記蛋白質の変異体、タグ化した前記蛋白質、又は前記蛋白質に対する抗体蛋白質を結合させる工程を更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項4】
前記カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質は、アデニルシクラーゼ、ブラッシュボーダーミオシンI重鎖、カルシニューリン、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIV、カルデスモン、カルモデュリン依存性サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ、赤血球カルシウム-ATPアーゼ、ニューロナル一酸化窒素シンターゼ、ニコチナミドジヌクレオチドキナーゼ、ファオスファチヂルイノシトール3キナーゼ、フォスフォリレースキナーゼ、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼおよびIQGAP1からなる群から選択された蛋白質である、請求項3記載の方法。
【請求項5】
カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルモデュリンの構造変化に影響を与える活性を有する物質を探索する方法。
【請求項6】
前記力センサーがメカノケミカル式センサーである、請求項5記載の方法。
【請求項7】
基板上に形成した前記試料膜に、カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質、前記蛋白質の断片、前記蛋白質の変異体、タグ化した前記蛋白質、又は前記蛋白質に対する抗体蛋白質を結合させる工程を更に含む、請求項5記載の方法。
【請求項8】
前記カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質は、アデニルシクラーゼ、ブラッシュボーダーミオシンI重鎖、カルシニューリン、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIV、カルデスモン、カルモデュリン依存性サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ、赤血球カルシウム-ATPアーゼ、ニューロナル一酸化窒素シンターゼ、ニコチナミドジヌクレオチドキナーゼ、ファオスファチヂルイノシトール3キナーゼ、フォスフォリレースキナーゼ、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼおよびIQGAP1からなる群から選択された蛋白質である、請求項7記載の方法。
【請求項9】
カルモデュリン、カルモデュリンの断片、カルモデュリンの変異体、タグ化したカルモデュリン、又はカルモデュリンに対する抗体蛋白質よりなる試料膜を基板上に形成し、当該試料膜を有する当該基板を力センサーに配置し、披験サンプルを当該試料膜に作用させた際の当該試料膜の構造変化に由来する張力及び/又は弾性の変化を当該力センサーで検出することからなる、カルシウム/カルモデュリンが関与する細胞内情報伝達経路に変化が生じる疾患の診断薬または治療薬を探索する方法。
【請求項10】
前記力センサーがメカノケミカル式センサーである、請求項9記載の方法。
【請求項11】
基板上に形成した前記試料膜に、カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質、前記蛋白質の断片、前記蛋白質の変異体、タグ化した前記蛋白質、又は前記蛋白質に対する抗体蛋白質を結合させる工程を更に含む、請求項9記載の方法。
【請求項12】
前記カルモデュリン依存性酵素/カルモデュリン結合物質は、アデニルシクラーゼ、ブラッシュボーダーミオシンI重鎖、カルシニューリン、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII、カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIV、カルデスモン、カルモデュリン依存性サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ、赤血球カルシウム-ATPアーゼ、ニューロナル一酸化窒素シンターゼ、ニコチナミドジヌクレオチドキナーゼ、ファオスファチヂルイノシトール3キナーゼ、フォスフォリレースキナーゼ、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼおよびIQGAP1からなる群から選択された蛋白質である、請求項11記載の方法。
【請求項13】
カルモデュリン蛋白質からなる試料膜。


【図1】
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【図2】
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【図3】
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【公開番号】特開2006−133164(P2006−133164A)
【公開日】平成18年5月25日(2006.5.25)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2004−325005(P2004−325005)
【出願日】平成16年11月9日(2004.11.9)
【出願人】(302064588)株式会社 フューエンス (12)
【Fターム(参考)】