ユニークなカロテン産生生合成遺伝子クラスターが、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株から単離され、クラスターの遺伝子構成はｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺである。このクラスター内に含有される遺伝子は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）合成酵素（ＣｒｔＥ）、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（Ｉｄｉ）、リコペンシクラーゼ（ＣｒｔＹ）、フィトエンデサチュラーゼ（ＣｒｔＩ）、フィトエンシンターゼ（ＣｒｔＢ）、およびβ−カロテン水酸化酵素（ＣｒｔＺ）をコードする。遺伝子クラスター、遺伝子およびそれらの生成物は、ファルネシルピロリン酸のカロテノイドへの転換のために有用である。これらのＤＮＡセグメントを含有するベクター、ベクターを含有する宿主細胞、および形質転換宿主生物体内で組換えＤＮＡ技術によってこれらの酵素を製造する方法が開示される。

【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本願明細書は、２００３年６月１２日に出願された米国仮願第６０／４７７，８７４号、および、２００３年１２月３日に出願された米国仮出願第６０／５２７，０８３号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は微生物のカロテノイド化合物産生に有用な酵素（例えばリコピン、β−カロテン、およびゼアキサンチン）をコードする、・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）から単離される核酸断片に関連する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイドは、最も広く分布して構造的に多様性のあるクラスの天然色素の１つを代表し、淡黄色からオレンジから深紅色の色素色を生じる。カロテン産生性組織の顕著な例としては、ニンジン、トマト、赤ピーマン、およびラッパズイセンおよびマリーゴールドの花弁が挙げられる。カロテノイドは、全ての光合成生物体、ならびにいくつかの細菌および菌・カビ類によって合成される。これらの色素は、光合成、栄養、および光酸化損傷に対する保護おいて重要な機能を有する。例えば動物はカロテノイドを合成する能力を有さず、食物源を通じてこれらの栄養的に重要な化合物を得なくてはならない。
【０００４】
自然界における６００を越える異なるカロテノイドの存在にもかかわらず、工業的には、食物色素、動物飼料、医薬品、および化粧品のためにわずかなカロテノイドが使用されるのみである。これは生産の困難さが主因である。現在、工業目的で使用されるほとんどのカロテノイドは化学合成によって生産されるが、これらの化合物は化学的に製造することが非常に困難である（非特許文献１）。天然カロテノイドは、植物材料の抽出または微生物合成のいずれかによって得ることができる。しかし商業的なカロテノイド生産にはわずかな植物のみが広く使用され、これらの植物におけるカロテノイド合成の生産性は比較的低い。その結果、これらの植物から生成されるカロテノイドは非常に高価である。生合成の生産能力を増大させる一方法は、組換えＤＮＡ技術を応用することである（非特許文献２でレビューされている）。したがって非カロテン産生性細菌および酵母中でカロテノイドを生成することにより、最も適切で効率的な産生生物体の質、量、および選択のコントロールを可能にすることが望ましい。後者は、消費者にとって商業的生産経済（ひいては入手可能性）のために、特に重要である。
【０００５】
構造的に最も一般的なカロテノイドは、炭素４０個（Ｃ_４０）のテルペノイドである。しかし炭素原子３０個のみのカロテノイド（Ｃ_３０、ジアポカロテノイド）が、いくつかの種で検出される。これらの各タイプのカロテノイドの生合成は、イソプレン生合成経路、およびその五炭素ユニバーサルイソプレン構成単位であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に由来する。この生合成経路は、２つの部分に分割できる。１）ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）の形成をもたらす上流イソプレン経路、および２）ＦＰＰを長鎖Ｃ_３０およびＣ_４０カロテン産生性化合物に転換する様々なｃｒｔ遺伝子を含んでなる下流カロテノイド生合成経路。この経路の双方の部分を図１に示す。
【０００６】
典型的にフィトエンの形成が、Ｃ_４０カロテノイドの生合成にユニークな第１のステップを代表する（図１および２）。フィトエンそれ自体は無色のカロテノイドであり、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ（遺伝子ｉｄｉによってコードされる）によるＩＰＰからジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への異性化を通じて生じる。この反応に、
一続きの３プレニル転移酵素反応が続き、そこではゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）が形成される。ＧＧＰＰ合成酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＥが、この後者の反応を司る。最後に２個のＧＧＰＰ分子が縮合して、フィトエン（ＰＰＰＰ）を形成する。この反応はフィトエンシンターゼ（遺伝子ｃｒｔＢによってコードされる）によって触媒される。
【０００７】
リコピンはフィトエンから生成される「着色」カロテノイドである。リコピンは特徴的な赤色を熟したトマトに与え、食物色素として多くの用途を有する。それはまた、いくつかの細菌、菌・カビ類、および緑色植物におけるその他のカロテノイドの生合成の中間体でもある。リコピンは、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼをコードする）によって触媒される、８個の水素原子の除去による４つの逐次脱水素化反応を通じて、フィトエンから生合成的に調製される。この反応における中間物（Ｉｍｔｅｒｍｅｄｉａｒｉｅｓ）は、フィトフルエン、ζ−カロテン、およびニューロスポレンである。
【０００８】
リコピンシクラーゼ（ＣｒｔＹ）は、リコピンをβ−カロテンに転換する。β−カロテンは、カラースペクトルが黄色からオレンジの範囲である典型的なカロテンである。これは、マーガリンおよびバターの着色料として、ビタミンＡ生成源として、そして最近は特定種類の癌に対して防止効果の可能性がある化合物としての用途がある。
【０００９】
β−カロテンは、β−カロテン水酸化酵素活性（ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる）によってもたらされる水酸化反応を通じて、ゼアキサンチンに転換する。例えばこれはトウモロコシの種子中に存在する黄色色素である。ゼアキサンチンは雌鶏または錦鯉の飼料内に含有され、それらの着色の重要な色素源である。
【００１０】
フィトエン、リコピン、β−カロテン、およびゼアキサンチンの生成をつかさどるカロテノイド生合成遺伝子および酵素に加えて、（ｉ）水素付加、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスのあらゆる組み合わせによって、Ｃ_４０化合物の分子内転換を可能にして、多数のその他の官能性付与カロテノイド化合物を生成する、その他の様々なｃｒｔ遺伝子が知られている。
【００１１】
腸内細菌科内の細菌の多くは自然に着色しており、これらの生物体がカロテノイドを生成する能力が示される。さらにＣ_４０カロテノイド生合成は、かつて全てエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属に所属するとされていた、細菌の大まかなグループに分類されていた生物体の小さなグループであるパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属において、特に良く研究されている［エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレンネリア（Ｂｒｅｎｎｅｒｉａ）ｇｅｎ．ｎｏｖ．、およびパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）を含んでなる４つの系統学的群に、かつての大きなエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属が再分類された詳細については、非特許文献３を参照されたい］。例えば非特許文献４、非特許文献５などのいくつかのレビューが、カロテノイド色素生合成の遺伝学を考察している。ｃｒｔＥＸＹＩＢＺをコードする遺伝子配列は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）（かつてＥ．ヘルビコラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＥＨＯ−１０（ＡＴＣＣ番号３９３６８）として知られていた）、Ｐ．アナナティス（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ）（かつてＥ．ウレドボラ（Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）２０Ｄ３（ＡＴＣＣ番号１９３２１）として知られていた）、Ｐ．ステワルティ（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（かつてＥ．ステワルティ（Ｅ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ番号８２００）として知られていた）、およびＰ．アグロメランスｐｖ．ミレチア（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ｐｖ．ｍｉｌｌｅｔｉａｅ）について入手できる（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｍ８７２８０、Ｄ９００８７、ＡＹ１６６７１３、ＡＢ０７
６６６２もまたそれぞれ参照されたい）。しかし既存の文献は、これらの詳しく特性決定されたパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）種にあまり関連しない生物体におけるｃｒｔＥＸＹＩＢＺをコードする遺伝子配列、およびこれらの配列の遺伝子構成に関する限定的情報のみを提供する。
【００１２】
したがって解決すべき問題は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ番号３９３６８）、Ｐ．アナナティス（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ）（ＡＴＣＣ番号１９３２１）、Ｐ．ステワルティ（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ番号８２００）、およびＰ．アグロメランスｐｖ．ミレチア（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ｐｖ．ｍｉｌｌｅｔｉａｅ）とより遠縁の生物体から、カロテノイド生合成酵素の全てまたは一部をコードする核酸配列を同定して、カロテノイド生合成経路のより良い理解のための研究を容易にし、これらの経路の操作のための遺伝的ツールを提供して、適切な遺伝子を適切な宿主中に導入し発現することで、カロテノイドを大量に合成する手段を提供することである。これは合成方法に勝るカロテノイド生成をもたらすであろう。
【００１３】
本出願人は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株と称される黄色着色素細菌から、ＣｒｔＥ、Ｉｄｉ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、およびＣｒｔＺ酵素をコードするカロテノイド生合成経路中の６つのユニークな読み取り枠（ＯＲＦ）を単離することで、既述の問題を解決した。またこれらの配列の遺伝子構成は新しい。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，６５６，４７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５４５，８１６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５３０，１８９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５３０，１８８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４２９，９３９号明細書
【特許文献６】国際公開第０２／０７９３９５Ａ２号パンフレット
【非特許文献１】ネリス（Ｎｅｌｉｓ）およびレーンハー（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７０：１８１〜１９１（１９９１）
【非特許文献２】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）およびシマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５９：１６９〜１８１（１９９８）
【非特許文献３】ハウベン（Ｈａｕｂｅｎ）ら、Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１（３）：３８４〜３９７（１９９８年８月）
【非特許文献４】Ｇ．アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７６：４７９５〜４８０２（１９９４）
【非特許文献５】Ｇ．アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６２９−６５９（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、リコペン、β−カロテン、およびゼアキサンチンをはじめとする、様々なカロテノイドの合成に関与することが実証されたＤＣ４０４株から単離される、６つの遺伝子を提供する。遺伝子は同一オペロン上にクラスター化され、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子を含む。ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＯＲＦ１〜６および配列番号１、３、５、７、９、および１１にそれぞれ対応する。
【００１６】
したがって本発明は、カロテノイド生合成経路酵素をコードする単離された核酸分子を提供し、分子の遺伝子構成はｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺであり、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子は
記載順にクラスター化され、ｃｒｔＺの転写はｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢとは反対方向に起きる。
【００１７】
好ましい実施態様では、ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺ遺伝子クラスターのカロテノイド生合成経路酵素の少なくとも１つは、配列番号２、４、６、８、１０、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされる。そしてさらに好ましい実施態様では、単離された酸分子は配列番号１８に記載の配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる。
【００１８】
同様に本発明は、ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺを含んでなる配列番号１８で示される単離された核酸分子、または配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を有する遺伝子または単離された核酸分子を提供し、単離された核酸分子は、全てのポリペプチドｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺをコードする。
【００１９】
さらに本発明は、
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、カロテノイド生合成経路酵素をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および植物における遺伝子の遺伝的発現に適した制御領域を含んでなる、本遺伝子および遺伝的キメラによってコードされるポリペプチド、ならびに該物質を含んでなる形質転換宿主を提供する。
【００２１】
本発明は、
（ａ）本核酸分子ゲノムのライブラリーを探索し、
（ｂ）本核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定することを含んでなる、カロテノイド生合成経路酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供し、配列決定されたゲノム断片は、カロテノイド生合成酵素をコードする。
【００２２】
同様に本発明は、
（ａ）本核酸配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローン化ベクター中に存在するインサートを増幅しすること
を含んでなる、カロテノイド生合成経路酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供し、増幅されたインサートは、カロテノイド生合成経路酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする。
【００２３】
好ましい実施態様では、本発明は、
（ａ）（ｉ）適切なレベルのファルネシルピロリン酸、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、カロテノイド生合成経路酵素をコードする核酸分子
を含んでなる形質転換宿主細胞を提供し、
ここで、該分子の遺伝子構成はｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺであり、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子は記載順にクラスター化し、ｃｒｔＺの転写はｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢとは反対方向に起き、
（ｂ）適切な生育条件下でステップ（ａ）の宿主細胞を有効量の発酵性炭素基質に接触させることでカロテノイド化合物が生成することを含んでなるカロテノイド化合物の製造方法を提供する。
【００２４】
同様に本発明は、カロテノイド化合物の生成に適した制御領域を含んでなる、本カロテノイド酵素をコードする一組の核酸分子および遺伝子キメラをさらに提供する。
【００２５】
具体的な好ましい実施態様では、本発明は例えばメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣの称号ＰＴＡ２４０２）のような高生育メタノトローフ細菌株などのＣ１代謝宿主におけるカロテノイド化合物の製造方法を提供し、Ｃ１代謝宿主は、
（ａ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質で生育し、
（ｂ）機能性的エムデン−マイヤーホフ炭素経路を含んでなり、前記経路はピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる。
【００２６】
さらに本発明は、生物体においてカロテノイド生合成が改変されるように、生物体中で配列番号１、３、５、７、９、および１１よりなる群から選択される少なくとも１つのカロテノイド遺伝子を過剰発現するステップを含んでなる、生物体中でカロテノイド生合成を制御する方法を提供する。
【００２７】
代案の実施態様では、本発明は、
（ｉ）ａ）配列番号１、３、５、７、９、および１１よりなる群から選択されるカロテノイド生合成経路酵素をコードする単離された核酸分子、
ｂ）ステップ（ａ）の前記単離された核酸分子とハイブリダイズする第１のヌクレオチド断片集団、および
ｃ）ステップ（ａ）の前記単離された核酸分子とハイブリッドしない第２のヌクレオチド断片集団
を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して、
制限酵素消化断片の混合物を生成させ、
（ｉｉ）前記制限酵素消化断片の混合物を変性し、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の変性した前記制限酵素消化断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートし、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返して、改変された生物学的活性を有するタンパク質をコードする突然変異カロテノイド遺伝子を生成させること
を含んでなる方法によって生成された、改変された生物学的活性を有するカロテノイド生合成経路酵素をコードする突然変異遺伝子を提供する。
【００２８】
別の実施態様では、本発明は、配列番号１６に記載の１６ｓ ｒＤＮＡ配列を含んでなるパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株を提供する。
【００２９】
配列説明および生物学的寄託
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００３０】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ
ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００３１】
配列番号１〜１２は、表１で同定される完全長の遺伝子またはタンパク質である。
【００３２】
【表１】

【００３３】
配列番号１３〜１５、および１７は、プライマーＨＫ１２、ＪＣＲ１４、ＪＣＲ１５、およびＴＥＴ−１ＦＰ−１をそれぞれコードするヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１６は、ＤＣ４０４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を提供する。
【００３５】
配列番号１８は、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子をコードするＤＣ４０４株からのＤＮＡの８,８１４ｂｐ断片のヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号１９は、プライマーｐＷＥＢ４０４Ｆのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号２０は、プライマーｐＷＥＢ４０４Ｒのヌクレオチド配列である。
【００３８】
出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
【００３９】
【表２】

【００４０】
ここでの用法では、「ＡＴＣＣ」は、米国ＶＡ２０１１０−２２０９マナッサスのユニバーシティ・ブールヴァード１０８０１のＡＴＣＣに所在する米国微生物系統保存機関国際寄託局（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）を指す。「国際寄託名」は、ＡＴＣＣに寄託された培養物の登録番号である。
【００４１】
列挙した寄託株は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の遺伝子およびそれらの発現生成物は、様々なカロテノイド化合物を生成する能力を有する組換え生物体の作成のために有用である。ＣｒｔＥ、Ｉｄｉ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、およびＣｒｔＺをコードする核酸断片がパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株から単離され、当業者に良く知られているＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、ヌクレオチドおよびタンパク質配列を含む公共データベースとの比較によって同定されている。本発明の遺伝子および遺伝子産物は、カロテノイド化合物の改良または操作のために、多様なやり方で使用しても良い。これらの遺伝子を含んでなる遺伝子クラスターのユニークな遺伝子構成の結果として、さらなる利点があるかもしれない。
【００４３】
カロテノイド化合物は化学的に作ることが非常に困難なので、これらの化合物の微生物による生成には一般的な実用的用途がある。（ネリス（Ｎｅｌｉｓ）およびリーンハー（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、前出）。ほとんどのカロテノイドは濃色を有し、天然色素または着色剤と見なすことができる。さらに多くのカロテノイドは強力な抗酸化特性を有するので、食餌中にこれらの化合物を含めることは健康的であると考えられる。良く知られている例はβ−カロテン、カンタキサンチン、およびアスタキサンチンである。さらにカロテノイドは、水産養殖で必要とされる要素である。カロテノイド着色はサケおよびエビの生物体の価値に対して極めて重要であるので、これらの水産養殖は本発明の特に有用な用途である（シャヒディ（Ｓｈａｈｉｄｉ）Ｆ．、およびブラウン（Ｂｒｏｗｎ）Ｊ．Ａ．、Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３８（１）：１〜６７（１９９８））。最後にカロテノイドは、ステロイド、香料および香水、および可能な電気光学用途がある化合物の合成において中間体としての用途を有する。
【００４４】
下の開示は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株からのカロテノイド合成遺伝子の単離、遺伝子工学によるこれらの遺伝子の修飾、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、細菌、酵母、菌・カビ類、および高等植物中でのクローン化および発現に適した適合性プラスミド中へのそれらの挿入の詳細な説明を提供する。
【００４５】
定義
本開示では、いくつかの用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００４６】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
【００４７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
【００４８】
「高速液体クロマトグラフィー」はＨＰＬＣと略記される。
【００４９】
用語「イソプレノイド化合物」とは、形式的にイソプレン（２−メチルブタ−１，３−ジエン、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ＝ＣＨ_２）から誘導される化合物を指し、その骨格は分子中の反復として認識できる。これらの化合物は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）から開始して、イソプレノイド経路を通じて生合成的に生成されてイソプレン単位の頭尾縮合によって形成され、例えば長さが炭素５、１０、１５、２０、３０、または４０個であっても良い分子をもたらす。
【００５０】
「カロテノイド生合成経路」という用語は、図１で示すように、本発明の上流イソプレノイド経路、および／または下流カロテノイド生合成経路のメンバーを含んでなる遺伝子を指す。
【００５１】
「上流イソプレノイド経路」および「上流経路」という用語は区別なく使用され、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への転換に関与する酵素を指す。これらの酵素としては、「ｄｘｓ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする）、「ｄｘｒ」遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードする）、「ｉｓｐＤ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジル転移酵素をコードする、ｙｇｂＰとしても知られている）、「ｉｓｐＥ」遺伝子（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼをコードする、ｙｃｈＢとしても知られている）、「ｉｓｐＦ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼをコードする、ｙｇｂＢとしても知られている）、「ｐｙｒＧ」遺伝子（ＣＴＰシンターゼをコードする）、ジメチルアリル二リン酸の形成に関与する「ｌｙｔＢ」遺伝子、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸の合成に関与する「ｇｃｐＥ」遺伝子、「ｉｄｉ」遺伝子（ＩＰＰからジメチルアリルピロリン酸への分子内転換を司る）、およびイソプレノイド経路中の「ｉｓｐＡ」遺伝子（ゲラニル転移酵素またはファルネシル二リン酸シンターゼをコードする）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
「Ｉｄｉ」という用語は、ｉｄｉ遺伝子によってコードされるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．３．３．２）を指す。代表的なｉｄｉ遺伝子は、配列番号３として提供される。
【００５３】
用語「下流カロテノイド生合成経路」および「下流経路」は区別なく使用され、ＦＰＰを一連のカロテノイドに転換する酵素を指す。これらとしては（合成がＣ_３０カロテノイド生合成にユニークな第１のステップを代表する）ジアポフィトエン、または（合成がＣ_４０カロテノイド生合成にユニークな第１のステップを代表する）フィトエンのいずれかの即時の合成に関与する、遺伝子および遺伝子産物が挙げられる。様々なＣ_３０〜Ｃ_４０カロテノイド生成をもたらす全ての引き続く反応は、下流カロテノイド生合成経路に含まれる。これらの遺伝子および遺伝子産物には、ｃｒｔＭ、ｃｒｔＮ、ｃｒｔＮ２、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、ｃｒｔＡ、ｃｒｔＣ、ｃｒｔＤ、ｃｒｔＦ、およびｃｒｔＵをはじめとするが、これに限定されるものではない「ｃｒｔ」遺伝子の全てが含まれる。最後に「下流カロテノイド生合成酵素」という用語は、ＣｒｔＭ、ＣｒｔＮ、ＣｒｔＮ２、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、
ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＷ、ＣｒｔＯ、ＣｒｔＡ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤ、ＣｒｔＦ、およびＣｒｔＵをはじめとするが、これに限定されるものではない、本下流経路中のあらゆる酵素を指す包括的用語である。
【００５４】
本願明細書では、「カロテノイド化合物」という用語は、イソプレンから形式的に誘導される接合ポリエン炭素骨格を有する炭化水素のクラスとして定義される。このクラスの分子は、トリテルペン（Ｃ_３０ジアポカロテノイド）およびテトラテルペン（Ｃ_４０カロテノイド）およびそれらの酸素化誘導体から構成される。これらの分子は典型的に強力な光吸収特性を有し、長さがＣ_２００を超える範囲であっても良い。例えば長さがＣ_３５、Ｃ_５０、Ｃ_６０、Ｃ_７０、およびＣ_８０であるその他の「カロテノイド化合物」も知られている。
【００５５】
「Ｃ_３０ジアポカロテノイド」は、２個の中央メチル基が１，６−位の関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合する６個のイソプレノイド単位からなる。全てのＣ_３０カロテノイドは、（ｉ）水素付加、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせによって、接合二重結合の長い中央鎖を有する非環式Ｃ_３０Ｈ_４２構造から形式的に誘導されても良い。
【００５６】
「テトラテルペン」または「Ｃ_４０カロテノイド」は、２個の中央メチル基が１，６−位の関係にあり、残りの非末端メチル基が１，５−位の関係にあるように、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合した８個のイソプレノイド単位からなる。全てのＣ_４０カロテノイドは、（ｉ）水素付加、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、（ｖ）エステル化／グリコシル化、またはこれらのプロセスのいずれかの組み合わせによって、接合二重結合の長い中央鎖を有する非環式Ｃ_４０Ｈ_５６構造（下の式Ｉ）から形式的に誘導されても良い。このクラスはまた、炭素骨格（式Ｉ）の再配置、またはこの構造の一部の（形式的）除去から生じる特定の化合物も含む。
【００５７】
【化１】

【００５８】
便宜上、カロテノイドの式は、簡単な表記法で書かれることが多い（下の式ＩＡ）。
【００５９】
【化２】

【００６０】
式中、破線はイソプレノイド単位中の形式的区分を示す。
【００６１】
「官能性付与された」または「官能性付与」という用語は、あらゆるカロテノイド主鎖
部分の（ｉ）水素付加、（ｉｉ）脱水素化、（ｉｉｉ）環化、（ｉｖ）酸化、または（ｖ）エステル化／グリコシル化を指す。この主鎖は、接合二重結合の長い中央鎖として定義される。官能性付与はまた、上のプロセスのあらゆる組み合わせによって生じても良い。
【００６２】
「ＣｒｔＥ」という用語は、ｃｒｔＥ遺伝子によってコードされ、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸とイソペンテニル二リン酸をピロリン酸とゲラニルゲラニル二リン酸に転換する、ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素（ｓｙｎｔｈａｓｅ）を指す。代表的なｃｒｔＥ遺伝子は、配列番号１として提供される。
【００６３】
「ＣｒｔＹ」という用語は、ｃｒｔＹ遺伝子によってコードされ、リコペンをβ−カロテンに転換するリコペンシクラーゼ酵素を指す。代表的なｃｒｔＹ遺伝子は、配列番号５として提供される。
【００６４】
「ＣｒｔＩ」という用語は、ｃｒｔＩ遺伝子によってコードされるフィトエンデサチュラーゼ酵素を指す。ＣｒｔＩは４個の二重結合の導入により、フィトフルエン、β−カロテン、およびニューロスポレンの中間物を通じて、フィトエンをリコペンに転換する。代表的なｃｒｔＩ遺伝子は、配列番号７として提供される。
【００６５】
「ＣｒｔＢ」という用語は、プレフィトエン二リン酸からフィトエンへの反応を触媒するｃｒｔＢ遺伝子によってコードされるフィトエンシンターゼ酵素を指す。代表的なｃｒｔＢ遺伝子は、配列番号９として提供される。
【００６６】
「ＣｒｔＺ」という用語は、β−カロテンからゼアキサンチンへの水酸化反応を触媒するｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる、β−カロテン水酸化酵素を指す。代表的なｃｒｔＺ遺伝子は、配列番号１１として提供される。
【００６７】
「ＣｒｔＸ」という用語は、ｃｒｔＸ遺伝子によってコードされ、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドに転換する、ゼアキサンチングルコシル転移酵素を指す。
【００６８】
「遺伝子構成」という用語は、ＯＲＦが単一核酸断片上に組織化される順序と方向を指す。
【００６９】
本願明細書中では、３つの異なるＤＮＡクラスターの遺伝子構成について述べられ、それぞれは下のように定義される。
１．「ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺ」または「ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹＩＢＺ」という用語は、以下の遺伝子構成を有する分子を指す。ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子は述べられる順にクラスター化され、ｃｒｔＺの転写はｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢと反対の方向で起きる。
２．「ｃｒｔＥ−ｃｒｔＸ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺ」または「ｃｒｔＥＸＹＩＢＺ」という用語は、以下の遺伝子構成を有する分子を指す。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子は述べられる順にクラスター化され、ｃｒｔＺの転写はｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢと反対の方向で起きる。
３．「ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＸ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺ」または「ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＸＹＩＢＺ」という用語は、以下の遺伝子構成を有する分子を指す。ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子は述べられる順にクラスター化され、ｃｒｔＺの転写はｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢと反対の方向で起きる。
【００７０】
「エムデン−マイヤーホフ経路」という用語は、グルコースおよびフルクトースなどのヘキソースをグリセルアルデヒド３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸などの重要な細胞性三炭素中間体に転換するための一連の生化学的反応を指す。これらの反応は、ＡＴＰの形態の生化学的に有用なエネルギーの正味を生じて典型的に進行する。エムデン−マイヤーホフ経路にユニークな重要な酵素は、ホスホフルクトキナーゼおよびフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼである。
【００７１】
「エントナー−ドゥドロフ経路」という用語は、生化学的に有用なエネルギーの正味の生成なしに、グルコースまたはフルクトースなどのヘキソースを重要な三炭素細胞性中間体ピルビン酸およびグリセルアルデヒド３−リン酸に転換するための一連の生化学的反応を指す。エントナー−ドゥドロフ経路にユニークな重要な酵素は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼおよびケトデオキシホスホ−グルコン酸アルドラーゼである。
【００７２】
「Ｃ_１炭素基質」または「一炭素基質」という用語は、炭素−炭素結合が欠如するあらゆる炭素含有分子を指す。例はメタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルマート、メチル化アミン（例えばモノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、および二酸化炭素である。
【００７３】
「Ｃ_１代謝個体」という用語は、そのエネルギーおよびバイオマスの唯一の供給源として一炭素基質を使用する能力を有する微生物を指す。Ｃ_１代謝個体は、典型的にメチロトローフおよび／またはメタノトローフである。
【００７４】
「メチロトローフ」という用語は、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できる生物体を意味する。メチロトローフがＣＨ_４を酸化できる場合、メチロトローフはまたメタノトローフでもある。
【００７５】
「メタノトローフ」または「メタノトローフ細菌」という用語は、その主要な炭素およびエネルギー供給源としてメタンを利用できる原核生物を意味する。メタンから二酸化炭素への完全な酸化は、好気性分解経路によって起きる。本発明で有用なメタノトローフの典型的な例としては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、およびメチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属が挙げられる（がこれに限定されるものではない）。
【００７６】
「高生育メタノトローフ細菌株」という用語は、唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンまたはメタノールで生育できる、機能的エムデンマイヤーホフ炭素流経路を有する細菌を指し、高速の生育および代謝されるＣ_１基質１グラム当たりの高い細胞質量生成が得られる。ここで述べられる特定の「高生育メタノトローフ細菌株」は、「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ」、「１６ａ」または「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ」と称され、これらの用語は区別なく使用されてメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４０２）株を指す（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）。
【００７７】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）中の「ｃｒｔ遺伝子クラスター」という用語は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａの天然Ｃ_３０カロテノイド生合成経路において活性であるｃｒｔＮ１、ａｌｄ、およびｃｒｔＮ２を含んでなる読み取り枠を指す。
【００７８】
「ＣｒｔＮ１」という用語は、ｃｒｔＮ１遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）においてｃｒｔ遺伝子クラスター上に位置する第１の遺伝子である。
【００７９】
「ＡＬＤ」という用語は、ａｌｄ遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａの天然カロテノイド生合成経路において活性である酵素を指す。この遺伝子は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）においてｃｒｔ遺伝子クラスター上に位置する第２の遺伝子である。
【００８０】
「ＣｒｔＮ３」という用語は、ｃｒｔＮ３遺伝子によってコードされ、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａの天然カロテノイド生合成に影響する酵素を指す。この遺伝子はｃｒｔ遺伝子クラスター内に位置せず、代わりにこの遺伝子はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ゲノムの異なる遺伝子座内に存在する（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。
【００８１】
「色素なし」または「白色変異体」または「非着色株」という用語は、天然ピンク色素（例えばＣ_３０カロテノイド）を生成しないメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ細菌を指す。したがって細菌細胞の色はピンクとは対照的に、白色に見える。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ白色変異体は、天然Ｃ_３０カロテノイド遺伝子の全てまたは一部を消去して遺伝子操作された。例えばメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ中のａｌｄ／ｃｒｔＮ１遺伝子または天然ｃｒｔ遺伝子クラスターを駆動するプロモーターのどちらかの中断は、Ｃ_４０カロテノイド生成によりふさわしい非着色（「白色」）変異体を作り出す（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。
【００８２】
「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａＭＷＭ１０００」または「ＭＷＭ１１００」という用語は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａに天然であるａｌｄおよびｃｒｔＮ１遺伝子の一部を除去して作り出された、非着色メタノトローフ細菌株を指す（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。欠失は、ＭＷＭ１０００におけるＣ_３０カロテノイドの生成を中断させた。ａｌｄ／ｃｒｔＮ１欠失は「Δａｌｄ／ｃｒｔＮ１」と表される。
【００８３】
ここでの用法では、「単離された核酸断片」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、１つまたはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなっても良い。
【００８４】
核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸分子の一本鎖形態がその他の核酸分子とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイズおよび洗浄条件については良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）（１９８９）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される。（以下「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイズの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェンシー条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断
片をスクリーニングするため、そして（機能性酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイズ後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件の組は、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェンシー条件の組はより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェンシー条件の組は、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件の組は、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃のハイブリダイズ、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【００８５】
ハイブリダイズのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイズは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイズの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイズのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ））ら、前述１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。
【００８６】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ支援配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、概して１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイズ）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイズ）において使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅プライマーとして使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、１つまたはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的または完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に知られている目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、
ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【００８７】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列、ならびに実質的に類似した核酸配列に相補的である単離された核酸断片も含む。
【００８８】
技術分野で既知の「パーセント同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野において「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（レスク（Ｌｅｓｋ）Ａ．Ｍ．編）、オックスフォードユニバーシティ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８８）、２）「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｄ．Ｗ．編）、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ニューヨーク（１９９３）、３）「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、第一部、（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ａ．Ｍ．、およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ｈ．Ｇ．編）、ヒュマーナ（Ｈｕｍａｎａ）、ニュージャージー（ＮＪ）（１９９４）、４）「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（フォン・ハインェ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．編）、アカデミック（１９８７）、５）「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）Ｊ．編）、ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）、ニューヨーク（１９９１）で述べられたものをはじめとするがこれに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるように設計される。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化される。配列整合および同一性百分率の計算は、ウィスコンシンマディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施しても良い。Ｃｌｕｓｔａｌ整合法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３（１９８９））を使用して、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で、配列の複数の整合を実施する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用した対整合のデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。
【００８９】
適切な核酸断片（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一の、好ましくは少なくとも約７５％同一の、そしてより好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましい核酸断片は、ここで報告するアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする
。
【００９０】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードにおける性質を指す。したがって本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、および１２に記載される、本微生物のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコードするあらゆる核酸断片に関する。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００９１】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成しても良い。ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが生体内で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アセンブルされたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みの真価を認める。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づくことができる。
【００９２】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびその後ろの制御配列（３’非コード配列）を含めた特異性タンパクを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列を有して自然界に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された制御配列およびコード配列を含んでなっても良い。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム中の自然な部位にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。
【００９３】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでも良い。
【００９４】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえ良い。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して
、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しても良いこともさらに認識される。
【００９５】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列（常態では真核細胞に限られる）およびその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴付られる。
【００９６】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞過程に影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【００９７】
「作動的に結合した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動的に結合する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンスオリエンテーションで制御配列に作動的に結合できる。
【００９８】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指しても良い。
【００９９】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチド、すなわちそれから一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレ−またはプロペプチドが除去されたものを指す。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物、すなわちプレ−またはプロペプチドがなおも存在するものを指す。プレ−またはプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであっても良い（がそれに限定されない）。
【０１００】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌された成熟タンパク質に先行するアミノ末端ポリペプチドを指す。シグナルペプチドは成熟タンパク質から切断されるので、その中には存在しない。シグナルペプチドは、分泌されたタンパク質を細胞膜を越えて方向付け、転位置する機能を有する。シグナルペプチドはまた、シグナルタンパク質とも称される。
【０１０１】
「接合」とは、１つの細菌細胞（すなわち「供与体」）から別の（すなわち「受容体」）細菌細胞への一方向性のＤＮＡ転位（例えば細菌プラスミドからの）が起きる、特定の
タイプの形質転換を意味する。プロセスは直接的な細胞と細胞の接触を伴う。別の細菌細胞（すなわち「ヘルパー」）が存在して接合を容易にすることもある。
【０１０２】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体中のゲノムへの核酸断片の転移を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「遺伝子導入」、「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【０１０３】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外因子を指す。このような因子は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。
【０１０４】
「改変された生物学的活性」と言う用語は、アッセイ方法によって測定できる、ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に関連した活性を指し、活性は、天然配列に関連した活性を超え、またはそれ未満のいずれかである。「増強された生物学的活性」とは、天然配列に関連したものを超える改変された活性を指す。「低下した生物学的活性」とは、天然配列に関連したもの未満の改変された活性を指す。
【０１０５】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ウィスコンシン州マディソンのジェネティック・コンピュータ・グループからのＧＣＧパッケージプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））、および３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、および４．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、Ｐｌｅｎｕｍ、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ））、および５．）メリーランド州ベセズダのインフォマックス（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ））からのベクターＮＴＩプログラムが挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアに元々ロードされた、あらゆる値またはパラメータの組（製造業者によって設定される）を意味する。
【０１０６】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上述）；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ
．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）による出版（１９８７）で述べられている。
【０１０７】
カロテノイド生成に関与する遺伝子
カロテノイド化合物の生合成に関与する酵素経路は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸からファルネシルピロリン酸への転換を提供する上流イソプレノイド経路、およびジアポフィトエンまたはフィトエンいずれかの合成と、全ての引き続いて生成されるカロテノイドを提供する下流カロテノイド生合成経路の２つの部分に都合良く分けることができる（図１）。上流経路は多くの微生物に遍在性であり、これらの場合、所望のカロテノイド生合成のための下流経路を含んでなる遺伝子を導入することだけが必要かもしれない。２つの経路間の区分は、ファルネシルピロリン酸塩（ＦＰＰ）の合成に関わる。ＦＰＰが天然に存在する場合、下流カロテノイド生合成経路の要素のみが必要である。しかしカロテノイド生成において下流経路カロテノイド遺伝子が効果的であるためには、宿主細胞が細胞内に適切なレベルのＦＰＰを有することが必要なことが理解される。ＦＰＰ合成が宿主細胞によって提供されない場合、ＦＰＰの生成に必要な遺伝子を導入することが必要である。これらの各経路について下で詳細に述べる。
【０１０８】
上流イソプレノイド経路
イソプレノイド生合成は、一般的なＣ_５イソプレンサブユニットであるイソペンテニルピロリン酸塩（ＩＰＰ）を生じる２つの経路のどちらかを通じて起きる。最初に良く知られている酢酸／メバロン酸経路を通じてＩＰＰを合成しても良い。しかし最近の研究は、メバロン酸依存経路が全ての生物体で作動しているわけではないことを実証している。ＩＰＰ生合成のための代案のメバロン酸非依存経路が、細菌および緑藻類および高等植物で特性決定されている（ホルバック（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５〜１４０（１９９３）；ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７〜５２４（１９９３）；シュベンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３〜８０（１９９６）；アイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：６４３１〜６４３６（１９９６））。
【０１０９】
メバロン酸非依存イソプレノイド経路中の多くのステップが知られている（図１）。例えばＩＰＰの生成をもたらす代案の経路の最初のステップは、コール（Ｃｏｌｅ）ら（Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７〜５４４（１９９８））によって結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において研究されている。経路の第１のステップは、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸として知られている五炭素化合物を生じる、２つの三炭素分子（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の縮合を伴う。この反応はｄｘｓ遺伝子によってコードされるＤｘｓ酵素によって起きる。次にＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化および還元から、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸が生じる。異性化および還元プロセスに関与する酵素の１つは、遺伝子ｄｘｒによってコードされるＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｄｘｒ）である。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸を引き続いて、注釈なしの遺伝子ｙｇｂＰ（コール（Ｃｏｌｅ）ら、前出）でコードされる酵素によって、ＣＴＰ−依存反応において４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールに転換する。しかし最近ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスター
の一部としてｉｓｐＤと改名された（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｑ４６８９３）。
【０１１０】
次にｙｃｈＢ遺伝子によってコードされる酵素によって、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの第２位のヒドロキシ基をＡＴＰ−依存反応においてリン酸化できる。この生成物は４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールをリン酸化して、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸が得られる。ｙｃｈＢ遺伝子もまたｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＥと改名された（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｐ２４２０９）。最後にｙｇｂＢ遺伝子の生成物が、ＣＴＰ−依存様式で、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸に転換する。この遺伝子もまた最近改名されて、ｉｓｐ遺伝子クラスターに属する。具体的には、ｙｇｂＢ遺伝子の新しい名称はｉｓｐＦ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ登録番号Ｐ３６６６３）である。ｐｙｒＧ遺伝子の生成物は、ＣＴＰシンターゼとしてこれらの反応において重要である。
【０１１１】
ｌｙｔＢおよびｇｃｐＥ（およびおそらくはその他の）遺伝子によってコードされる酵素はイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の形成をもたらす反応に関与すると考えられる。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子によってコードされるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（または「ＩＰＰイソメラーゼ」）を通じてＤＭＡＰＰに異性化しても良いが、この酵素は生存には必須ではなく、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）経路を使用するいくつかの細菌では不在でも良い。最近の証拠はＭＥＰ経路がＩＰＰの前に分岐して、ｌｙｔＢ遺伝子産物を通じてＩＰＰとＤＭＡＰＰを別個に生成することを示唆する。ｌｙｔＢノックアウト変異は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの双方を補った培養液中以外では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して致死性である。
【０１１２】
ＦＰＰの合成は、ＩＰＰのジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）への異性化を通じて起きる。この反応に、ｉｓｐＡによって触媒される２つのプレニル転移酵素反応手順が続き、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ、炭素数１０の分子）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ、炭素数１５の分子）の生成をそれぞれもたらす。
【０１１３】
下流カロテノイド生合成経路
上流イソプレノイド経路と下流カロテノイド経路の間の区分は、幾分主観的である。ＦＰＰ合成はカロテン産生性および非カロテン産生性細菌の双方で一般的であるので、出願人は、Ｃ_３０ジアポカロテノイドまたはＣ_４０カロテノイドのどちらかの形成をもたらす分岐する２経路の化合物へのファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）の転換を開始するための下流カロテノイド生合成経路中の第１のステップを考察する。
【０１１４】
Ｃ_４０経路中では、生合成経路の第１のステップは、ＩＰＰの添加によって、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）として知られている炭素数２０の分子に転換するプレニル転移酵素反応で始まる。ＧＧＰＰ合成酵素をコードする遺伝子ｃｒｔＥ（ＥＣ２．５．１．２９）は、このプレニル転移酵素反応を司る。次に２個のＧＧＰＰ分子の縮合反応が起きて、下流カロテノイド生合成経路の第１の炭素数４０の分子であるフィトエン（（７，８，１１，１２，７’，８’，１１’，１２’−ω−オクタヒドロ−ω，ω−カロテン、またはＰＰＰＰ）を形成する。この酵素的反応はＣｒｔＢ（フィトエンシンターゼ、ＥＣ２．５．１．−）によって触媒される。
【０１１５】
引き続く水素付加、脱水素、環化、酸化、またはこれらのプロセスのあらゆる組み合わせによって、化合物フィトエンからＣ_４０カロテノイドのスペクトルを生成した。例えば
「赤色」着色スペクトルを与えるリコピンは、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼをコードする）によって触媒される、８個の水素原子の除去による４つの逐次脱水素化反応を通じて、フィトエンから生成される（図２参照）。リコピンシクラーゼ（ＣｒｔＹ）は、リコピンをβ−カロテン（β，β−カロテン）に転換する。β−カロテンは、β−カロテン水酸化酵素（ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる）活性に起因する水酸化反応を通じて、ゼアキサンチン（（３Ｒ，３’Ｒ）−β，β−カロテン−３，３’−ジオール）に転換される。
【０１１６】
フィトエン、リコペン、β−カロテン、およびゼアキサンチンを作り出す組み合わせで使用できるｃｒｔＥ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺに加えて、直鎖Ｃ_４０化合物の分子内転換を可能にし、多数のその他の官能性付与カロテノイド化合物を生成する様々なその他のｃｒｔ遺伝子が知られている。当業者は、公的に入手できる文献（例えばジェンバンク（登録商標））、特許文献、およびカロテノイドを生成する能力を有する微生物の実験的分析に従って、様々なその他のｃｒｔ遺伝子同定できるであろう。
例えば、
・ゼアキサンチンは、ｃｒｔＸ遺伝子（ＥＣ２.４.１.−、例えばジェンバンク（登録商標）登録番号Ｄ９００８７、Ｍ８７２８０、Ｍ９０６９８）によってコードされるゼアキサンチングルコシル転移酵素によってゼアンキサンチン−β−グルコシドに転換できる。
・β−カロテンは、ｃｒｔＷ（例えばジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＦ２１８４１５、Ｄ４５８８１、Ｄ５８４２０、Ｄ５８４２２、Ｘ８６７８２、Ｙ１５１１２）、ｃｒｔＯ（例えばジェンバンク（登録商標）登録番号Ｘ８６７８２、Ｙ１５１１２）またはｂｋｔによってコードされるβ−カロテンケトラーゼによって、カンタキサンチンに転換できる。エキネノンはこの反応における中間体である。
・カンタキサンチンは、ｃｒｔＺ遺伝子によってコードされるβ−カロテン水酸化酵素によって、アスタキサンチンに転換できる。アドニルビンはこの反応における中間体である。
・ゼアキサンチンは、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯ、またはｂｋｔによってコードされるβ−カロテンケトラーゼによって、アスタキサンチンに転換できる。アドニキサンチンはこの反応における中間体である。
・スフェロイデンは、ｃｒｔＡ（例えばジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＪ０１０３０２、Ｚ１１１６５、Ｘ５２２９１）によってコードされるスフェロイデンモノオキシゲナーゼによって、スフェロイデノンに転換できる。
ｃｒｔＣ（例えばジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＢ０３４７０４、ＡＦ１９５１２２、ＡＪ０１０３０２、ＡＦ２８７４８０、Ｕ７３９４４、Ｘ５２２９１、Ｚ１１１６５、Ｚ２１９５５）、ｃｒｔＤ（例えばジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＪ０１０３０２、Ｘ６３２０４、Ｕ７３９４４、Ｘ５２２９１、Ｚ１１１６５）、およびｃｒｔＦ（例えばジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＢ０３４７０４、ＡＦ２８８６０２、ＡＪ０１０３０２、Ｘ５２２９１、Ｚ１１１６５）遺伝子によってそれぞれコードされる、ヒドロキシニューロスポレンシンターゼ、メトキシニューロスポレンデサチュラーゼ、およびヒドロキシニューロスポレン−Ｏ−メチル転移酵素の逐次作用によって、ニューロスポレンはスフェロイデンに転換でき、リコペンはスピリロキサンチンに転換できる。
・β−カロテンは、ｃｒｔＵ（例えばジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＦ０４７４９０、ＡＦ１２１９４７、ＡＦ１３９９１６、ＡＦ１９５５０７、ＡＦ２７２７３７、ＡＦ３７２６１７、ＡＪ１３３７２４、ＡＪ２２４６８３、Ｄ２６０９５、Ｕ３８５５０、Ｘ８９８９７、Ｙ１５１１５）によってコードされる、β−カロテンデサチュラーゼによってイソレニエラテンに転換できる。
【０１１７】
これらの例は制限を意図せず、このＣ_４０下流カロテノイド生合成経路内には、その他の多くのカロテノイド遺伝子および生成物が存在する。したがって宿主生物体中で十分な
ＦＰＰ源が利用できれば、本発明の方法を使用して、場合により植物、動物、および／または細菌源から単離されたあらゆるその他の知られているｃｒｔ遺伝子に加えて、ここに示すｃｒｔＥ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子の様々な組み合わせを使用することで、無数の異なるカロテノイドおよびカロテノイド誘導体が作成できる。
【０１１８】
本発明の有用な生成物は、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、α−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコピン、ミキソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、およびゼアキサンチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、ここで定義されるあらゆるカロテノイド化合物を含むことが構想された。さらに本発明は、ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒド酸官能基、グリコシドエステル、またはスルフェートを作り出す、これらの分子の誘導化を包含する。
【０１１９】
上流イソプレノイド経路と下流カロテノイド生合成経路との相互作用
全体的なイソプレノイド生合成を促進させることによって、カロテノイド生成を促進する多様な研究が試みられている。特にｉｄｉの上方制御は、カロテノイド生成に劇的に影響することが実証されている。例えばカジワラ（Ｋａｊｉｗａｒａ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２４：４２１〜４２６（１９９７））は、「ＩＰＰイソメラーゼは、原核生物大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のイソプレノイド生合成において影響力が大きいステップを形成し、代謝遺伝子操作による工業的に有用なイソプレノイドの効率的生成の可能性がある」ことを最初に実証した。具体的には、外来性に発現されるＩＰＰイソメラーゼが、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）カロテノイド生合成遺伝子クラスターを含んでなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、対照と比べて３．６〜４．５倍高いレベルのリコピン生成を可能にし、同様に１．５〜２．７倍高いレベルのβ−カロテンおよび１．７〜２．１倍高いレベルのフィトエンが生成された。
【０１２０】
ワング（Ｗａｎｇ）らの引き続く研究（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６２（２）：２３５〜２４１（１９９９））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｄｉ遺伝子、アーキオグロバス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ｇｐｓ遺伝子、およびアグロバクテリウム・オーランチアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）ｃｒｔＢＩＹＺＷ遺伝子クラスターで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、５０倍高いアスタキサンチン生成をもたらした。ＧＧＰＰ合成における最後のステップが、カロテノイド生成における第１の速度制御ステップであり、第２の速度制御ステップはＩＰＰ異性化であると結論された。そして、最後にアルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１：７９１〜７９５（１９９９））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における内在性ｄｘｓおよびｄｘｒ遺伝子および外来性ｉｄｉ遺伝子（ファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）からの）の過剰発現が、カロテン産生を３．５倍まで刺激できることを見いだした。
【０１２１】
したがって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌における、工業的に価値あるカ
ロテノイド生成の最大化に向けた代謝操作法は、上流イソプレノイド経路中の流束および律速ステップ、ならびに下流カロテノイド生合成経路における発現レベルを注意深く考慮すべきである。上流イソプレノイド経路中の律速遺伝子（例えばｉｄｉ）の過剰発現は、カロテン産生を劇的に増大できる。
【０１２２】
Ｐ．アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株のカロテノイド生合成遺伝子および酵素の配列同定
Ｃ_４０カロテノイド生合成経路に関与する遺伝子産物をコードする多様なヌクレオチド配列が、ＤＣ４０４株から単離されている。例えばＯＲＦの１および３〜６は、下流カロテノイド生合成経路中のｃｒｔＥ、Ｙ、Ｉ、Ｂ、およびＺ遺伝子をコードし（図１および２参照）、それらの酵素生成物は、着色カロテノイド、リコペン、β−カロテン、およびゼアキサンチンの生成をもたらす。ＯＲＦ２は、上流イソプレノイド経路においてｉｄｉ遺伝子をコードする。これらの６個のＯＲＦは、ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺの遺伝子構成を有する１つの核酸断片（配列番号１８）上に構成される。ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ遺伝子は、オペロン内で作動的に結合されているように見え、他方ｃｒｔＺ遺伝子は、反対方向に転写される。
【０１２３】
ＤＣ４０４株から単離された遺伝子の組全体（ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺ）は、ここで１つの配列（配列番号１８）内に開示される。カロテノイド化合物の生成ために、この遺伝子クラスターをベクターに入れて、微生物宿主中で発現させる。当業者はコードされた全てのポリペプチドが発現して酵素的に活性ならば、その有用性に影響することなく、このような遺伝子クラスターに少数の核酸置換、付加、および欠失（特定の宿主細胞発現のための好ましいコドンの置換などの）があっても良いことを認識するであろう。したがってｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺを含んでなる配列番号１８で示される単離された核酸分子、配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を有する遺伝子または単離された核酸分子を提供することは本発明の範囲内であり、単離された核酸分子は、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺの全てのポリペプチドをコードする。
【０１２４】
スミス−ウォーターマン位置合わせアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を使用して、ｃｒｔＥヌクレオチド塩基および推定されるアミノ酸配列（ＯＲＦ１）と公共データベースとの比較から、最も類似した既知の配列が、アミノ酸３０１個の長さにわたり、ここで報告するＣｒｔＥのアミノ酸配列と約６５％同一であることが明らかにされる。より好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＥコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするもので、ここで報告するｃｒｔＥの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１２５】
スミス−ウォーターマンのアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、前出）を使用して、ｉｄｉヌクレオチド塩基および推定されるアミノ酸配列（ＯＲＦ２）と、公共データベースとの比較から、最も類似した既知の配列が、アミノ酸３４９個の長さにわたり、ここで報告するＩｄｉのアミノ酸配列と約６７％同一であることが明らかにされる。より好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する好ましいｉｄｉコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするもので、ここで報告するｉｄｉの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０
％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１２６】
スミス−ウォーターマンのアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、前出）を使用して、ｃｒｔＹヌクレオチド塩基および推定されるアミノ酸配列（ＯＲＦ３）と公共データベースとの比較から、最も類似した既知の配列が、アミノ酸３８９個の長さにわたり、ここで報告するＣｒｔＹのアミノ酸配列と約６１％同一であることが明らかにされる。より好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＹコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするもので、ここで報告するｃｒｔＹの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１２７】
スミス−ウォーターマンのアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、前出）を使用して、ｃｒｔＩヌクレオチド塩基および推定されるアミノ酸配列（ＯＲＦ４）と公共データベースとの比較から、最も類似した既知の配列が、アミノ酸４９２の長さにわたり、ここで報告するＣｒｔＩのアミノ酸配列と約８２％同一であることが明らかにされる。好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＩコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするもので、ここで報告するｃｒｔＩの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１２８】
スミス−ウォーターマンのアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、前出）を使用して、ｃｒｔＢヌクレオチド塩基および推定されるアミノ酸配列（ＯＲＦ５）と公共データベースとの比較から、最も類似した既知の配列が、アミノ酸３０８個の長さにわたり、ここで報告するＣｒｔＢのアミノ酸配列と約６７％同一であることが明らかにされる。より好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするもので、ここで報告するｃｒｔＢの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１２９】
スミス−ウォーターマンのアライメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアースン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、前出）を使用して、ｃｒｔＺヌクレオチド塩基および推定されるアミノ酸配列（ＯＲＦ６）と公共データベースとの比較から、最も類似した既知の配列が、アミノ酸１８５個の長さにわたり、ここで報告するＣｒｔＺのアミノ酸配列と約７３％同一であることが明らかにされる。好ましいアミノ酸断片は、ここでの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する好ましいｃｒｔＺコード核酸配列は、活性タンパク質をコードするもので、ここで報告するｃｒｔＺの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１３０】
相同体の単離
本発明のＣ_４０カロテノイド生合成経路の各核酸断片を使用して、同一またはその他の微生物の（または植物）種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離しても良い。配
列依存プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、技術分野で良く知られている。配列依存プロトコルの例としては、以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイズ法、２．）様々な核酸増幅技術の使用によって例証されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ミュリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボール（Ｔａｂｏｒ）Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３９２（１９９２）］、および３．）相補によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１３１】
例えば、ここで述べるようなＣ_４０カロテノイド生合成経路のものと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者に良く知られている方法を使用して、本核酸断片の全部または一部をＤＮＡハイブリダイズプローブとして使用して、あらゆる所望の細菌からのライブラリーをスクリーニングして直接単離できる（Ｃ_４０カロテノイドを生成する細菌が好ましい）。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で知られている方法によってデザインして合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。さらに当業者に知られている方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成し、または利用できる生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られる増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、プローブとして使用し、適切なストリンジェンシー条件下で完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１３２】
典型的にＰＣＲタイプ増幅技術ではプライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は一般的であり、技術分野で周知である。テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）著、「遺伝性疾患診断における特定のハイブリダイズプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、ヒト遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）中、Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）、３３〜５０ページ、ＩＲＬ：ヘルンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）バージニア（ＶＡ）；およびリュクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ）Ｗ．「分子生物学的方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第１５巻、３１〜３９ページ、ＰＣＲプロトコル：現行の方法と応用（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．編（１９９３）、ヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ）：ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）。
【０１３３】
概してポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本配列の２本の短い断片を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同的遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅しても良い。またポリメラーゼ連鎖反応は、１つのプライマーの配列が本核酸断片から誘導され、その他のプライマーの配列が微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸のトラクトの存在を利用する、クローン化された核酸断片のライブラリーにおいて実施しても良い。
【０１３４】
代案としては、第２のプライマー配列は、クローン化ベクターから誘導される配列に基づいても良い。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８））に従って、ＰＣＲを使用して、転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向に向けたプライマーは、本配列からデザインできる。メリーランド州ゲーサーズバーグのＢＲＬ（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から商業的に入手できる３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム系を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９））。
【０１３５】
代案としては、相同体の同定のために、ハイブリダイズ試薬としてＣ_４０カロテノイド生合成経路の本配列を用いても良い。核酸ハイブリダイズ試験の基本的構成要素には、プローブ、対象の遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイズ法が含まれる。本発明のプローブは典型的に、検出する核酸配列に相補的である一本鎖核酸配列である。プローブは、検出する核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動しても良く、実施する特定の試験に左右される。典型的に、約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出する核酸配列に相補的である必要がある。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくても良い。ハイブリダイズは不完全に相補的である分子間でも生じ、その結果、ハイブリッドした領域内の特定の塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０１３６】
ハイブリダイズ方法は良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイズを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイズが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイズが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイズインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加しても良い。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの高感応性でストリンジェントなハイブリダイズを可能にする（ヴァン・ネス（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望するならば、ハイブリダイズ混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【０１３７】
様々なハイブリダイズ溶液を用いることができる。典型的にこれらは、約２０〜６０％、好ましくは３０％容積の極性有機溶剤を含んでなる。一般的なハイブリダイズ溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（ｐＨ範囲約６〜９）、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイズ溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識のキャリア核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡなどの）断片化核ＤＮＡ、および場合により約０．５〜２％重量／容積のグリシンも含まれる。（例えばポ
リエチレングリコールなどの）多様な極性水溶性剤または膨潤剤をはじめとする容積排除剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）アニオン性ポリマー、および（例えば硫酸デキストランなどの）アニオン性糖ポリマーなどその他の添加剤を含めても良い。
【０１３８】
核酸ハイブリダイズは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイズに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は固形担体である。固形担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部分と相補的である固定核酸プローブを有する。
【０１３９】
本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングを容易にする。本アミノ酸配列の一部を代表する合成ペプチドを合成しても良い。これらのペプチドを用いて、動物を免疫し、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性があるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成できる。次にこれらの抗体を使用して、ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、対象の完全長ＤＮＡクローンを単離する（ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）Ｒ．Ａ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。
【０１４０】
遺伝子構成
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属内の様々な種からのｉｄｉおよびｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺをコードする多様な遺伝子配列が入手できるが、配列番号１８（８８１４ｂｐ）として開示される本核酸断片が、ユニークな遺伝子構成ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺを有するように見える。
・ｃｒｔＥ（配列番号１）は、ヌクレオチド２４００〜３３０５に位置し、直接的方向に翻訳される。
・ｉｄｉ（配列番号３）は、ヌクレオチド３３４３〜４３９２に位置し、配向方向に翻訳される。
・ｃｒｔＹ（配列番号５）は、ヌクレオチド４４２４〜５５９３に位置し、配向方向に翻訳される。
・ｃｒｔＩ（配列番号７）は、ヌクレオチド５５９０〜７０６８に位置し、配向方向に翻訳される。
・ｃｒｔＢ（配列番号９）は、ヌクレオチド７０６８〜７９９４に位置し、配向方向に翻訳される。
・ｃｒｔＺ（配列番号１１）は、ヌクレオチド７９０９〜８４６６に位置し、ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢと反対方向に翻訳される。
【０１４１】
最も「一般的な」遺伝子構成は、Ｐ．アナナティス（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ）（ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｄ９００８７）、Ｐ．ステワルティ（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ジェンバンク登録番号ＡＹ１６６７１３）、およびパントエア・アグロメランスｐｖ．ミレチア（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ｐｖ．ｍｉｌｌｅｔｉａｅ）（ジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＢ０７６６６２）で観察されるものであり、カロテン産生性クラスターはｃｒｔＥＸＹＩＢＺ（「ｃｒｔＥ−ｃｒｔＸ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺ」とも記述される）を含んでなる（図５）。Ｐ．アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＥＨＯ−１０（ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｍ８７２８０）は、ｃｒｔＥ−仮説タンパク質−ｃｒｔＸ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺのカロテン産生性クラスターを含んでなると注釈される。しかしながら、本願出願人らによる「仮説タンパク質」のバイオインフォマティクス分析は、真のＰ．アグロメ
ランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＥＨＯ−１０がｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＸ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺを含んでなるとみなされるべきだと判断した。
【０１４２】
同様に、より遠縁の生物体からのその他のカロテン産生性遺伝子クラスターは、ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺのユニークな遺伝子構成を含有しない。例えばブラジ根粒菌ダイズ根粒菌属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）ＯＲＳ２７８のカンタキサンチン遺伝子クラスターはｃｒｔＥ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＷであり、アグロバクテリウム・オーランティアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）からのアスタキサンチン遺伝子クラスターはｃｒｔＷ−ｃｒｔＺ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢであり、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ.Ｒ１５３４からのゼアキサンチン遺伝子クラスターはｃｒｔＺ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＥである（ジロー（Ｇｉｒａｕｄ）ら、米国特許仮出願第２００３／００８７３３７ Ａ１号）。
【０１４３】
ここで開示される遺伝子構成は、代謝の遺伝子操作中に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびその他の細菌において工業的に価値あるカロテノイドの生成を最大化するのに有用ないくつかのユニークな利点を与えるかもしれない。第一にイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼをコードするｉｄｉが、カロテノイド生成（カジワラ（Ｋａｊｉｗａｒａ）ら、前出；ワング（Ｗａｎｇ）ら、前出；アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、前出）に劇的に影響することが実証されているので、またこの遺伝子がここで述べられるカロテン産生性−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺクラスター中に直接組み込まれるので、オペロンの発現が、下流カロテノイド生合成経路への増大するイソプレノイド流束をもたらすことができ、それによって増大するカロテノイド生成および力価が帰結する。第二に、本カロテン産生性ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺクラスター中のｃｒｔＸ遺伝子の不在による利点があるかもしれない。具体的には、ＣｒｔＸによるゼアキサンチンからゼアキサンチン−β−グルコシドへの転換が排除されることで、ここで述べるカロテン産生性クラスターによってコードされる反応の生成物としてのゼアキサンチンの高レベルの蓄積が可能になる。クラスターから不要なｃｒｔＸ遺伝子を除去する余計な努力が必要でないため、発現クラスター中のｃｒｔＸの不在はまた、β−カロテンの合成にも有益かもしれない。
【０１４４】
したがって、本発明は、
（ａ）（ｉ）適切なレベルのファルネシルピロリン酸、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、カロテノイド生合成経路酵素をコードする核酸分子
を含んでなる形質転換宿主細胞を提供するステップと、
ここで、該分子の遺伝子構成はｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺであり、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子は記載順にクラスター化し、ｃｒｔＺの転写はｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢとは反対方向に起き、
（ｂ）適切な生育条件下で（ａ）の形質転換宿主細胞を有効量の発酵性炭素基質で生育させる、カロテノイド化合物の製造方法を提供する。
【０１４５】
微生物における組換え発現
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞中、特に微生物細胞宿主中で生成しても良い。組換え微生物宿主中の発現は、これまで宿主を使用して可能でなかった新しい生成物合成のために、様々な経路中間体を発現させ、および／または宿主中に既存の経路を調節するのに有用かもしれない。
【０１４６】
適切な上流イソプレン経路遺伝子をコードする遺伝子、および本発明の下流カロテノイ
ド生合成経路遺伝子の（場合によりその他のｃｒｔ遺伝子との）様々な組み合わせを適切な微生物宿主に導入する方法は、一般的である。当業者には明らかなように、特定のカロテノイド生成物の生成のために、宿主生物体への導入が必要とされる特定の機能性は、宿主細胞（およびそのイソプレノイド化合物の天然産生）、基質の利用可能性、および所望の最終生成物に左右される。
【０１４７】
本ｃｒｔ遺伝子がカロテノイド生成において効果的であるためには、宿主細胞が細胞内に適切なレベルのＦＰＰを有することが必要であることが理解される。ＦＰＰは、外来性に提供されても良く、または天然または導入された遺伝的経路のどちらかによって、細胞内に内在性に生成されても良い。したがって特定の宿主細胞が適切なレベルのＦＰＰを生成する遺伝的機構を有さない場合、上流イソプレノイド経路のあらゆる必要な遺伝子を得て、これらの遺伝子を宿主内に遺伝子操作して、下流経路を通じたカロテノイド生合成のための出発原料としてＦＰＰを生成することは、十分に当業者の理解の範囲内であると考察される。ＩＰＰをＦＰＰの前駆物質として、良く知られている酢酸／メバロン酸経路を通じて合成しても良い。代案としては、最近の研究は、メバロン酸依存経路が全ての生物体で作動しているわけではないことを実証している。ＩＰＰ生合成のための代案のメバロン酸非依存経路が、細菌および緑藻類および高等植物で特性決定されている（ホルバック（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５〜１４０（１９９３）；ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７〜５２４（１９９３）；シュベンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３〜８０（１９９６）；アイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６４３１〜６４３６（１９９６））。
【０１４８】
例えば、１つもしくはそれ以上の本下流Ｃ_４０カロテノイド生合成経路ｃｒｔＥＹＩＢＺ配列をコードするキメラ遺伝子の導入が、選択された宿主微生物におけるカロテノイド化合物の生成をもたらすことが期待される。適切な遺伝的形質転換システムによって、多様な非カロテン産生性宿主を遺伝子操作することが可能であろう。これは例えばエルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ｃｒｔ遺伝子を使用して、宿主の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（酵母）、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（菌・カビ類）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、および高等植物（米国特許第５，６５６，４７２号明細書）中で、様々なカロテノイドを生成して示されている。したっがってここで前述したように、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコピン、ミキソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、およびゼアキサンチンを全て、（例えば）以下のｃｒｔ酵素機能性の様々な組み合わせを導入することで、ここの技術を使用して微生物宿主中で生成しても良い。ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＺ、ＣｒｔＷ、ＣｒｔＯ、ＣｒｔＡ、ＣｒｔＣ、ＣｒｔＤ、ＣｒｔＦ、およびＣｒｔＵ。したがってＦＰＰからのフィトエンの形成は、ＣｒｔＥおよ
びＣｒｔＢと、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＩをはじめとするＦＰＰからのリコピン合成に必要なカロテノイド特異的遺伝子と、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＹをはじめとするＦＰＰからのβ−カロテン生成に必要な遺伝子を必要とする。ｃｒｔ遺伝子間の関係のこの理解に基づいて、あらゆる所望のカロテノイド生成物の発現に適した、微生物宿主細胞およびｃｒｔ遺伝子を選択することが可能であろう。類似の様式で、例えばｉｄｉなどの上流イソプレン経路遺伝子の上方制御によって、発現を増幅しても良い。
【０１４９】
外来性タンパクの高レベル発現を導く制御配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者には周知である。これらのいずれかを使用してキメラ遺伝子を構築し、本配列の遺伝子産物を生成できる。次に形質転換を通じて、これらキメラ遺伝子を適切な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１５０】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは、技術分野で周知である。典型的にベクターまたはカセットは、関連性のある遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能マーカー、および自律的複製または染色体組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写イニシエーション制御を含む遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導されなくて良いものと理解される。
【０１５１】
所望の宿主細胞において本ＯＲＦの発現を駆動させるのに有用なイニシエーション調節領域、またはプロモーターは多数有り、当業者には良く知られている。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（例えばピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰ_Ｌ、ｌＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に有用）ならびに例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーターをはじめとするが、これに限定されるものではない、実質的にこれらの遺伝子を駆動できるあらゆるプロモーターが、本発明において適切である。さらにデオキシ−キシルロースリン酸シンターゼまたはメタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモーター（スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １６０：１１９〜１２４（１９９８））、ポリヒドロキシアルカン酸合成のためのプロモーター（フェルナー（Ｆｏｅｌｌｎｅｒ）ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：２８４〜２９１（１９９３））、メチロトローフ内の天然プラスミドから同定されるプロモーター（欧州特許第２９６４８４号明細書）、Ｐｌａｃ（トヤマ（Ｔｏｙａｍａ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３：５９５〜６０２（１９９７）；欧州特許第６２９７１号明細書）、Ｐｔｒｃ（ブロシウス（Ｂｒｏｓｉｕｓ）ら、Ｇｅｎｅ ２７：１６１〜１７２（１９８４））、メタノトローフから同定されたプロモーター（ＰＣＴ／ＵＳ０３／３３６９８号明細書）、および抗生物質抵抗性に関連したプロモーター［例えばカナマイシン（スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ１６０：１１９〜１２４（１９９８）；ウエダ（Ｕｅｄａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：９２４〜９２６（１９９１））またはテトラサイクリン（米国特許第４，８２４，７８６号明細書）］が、Ｃ１代謝個体における発現に適している。
【０１５２】
ＲＢＳがベクターによって提供されない場合、発現する遺伝子上流に人工リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）を含めることが必要である。これは、単一プロモーターが、第１、
第２、第３、およびその他遺伝子群の発現を推進する場合に、発現するオペロンの第２、第３、およびその他の遺伝子のために必要とされることが多い。特定の宿主生物体におけるＲＢＳの好ましい配列を判定する方法は当業者には良く知られており、この合成部位の製造手段についても同様である。
【０１５３】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子から誘導されても良い。場合により、終結部位は必要ないかもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１５４】
遺伝子をクローン化ベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは確証されない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴として以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）リボソーム結合部位の強度、３．）クローンされた遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミドにあるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、４．）合成された外来タンパク質の最終細胞内位置、５．）宿主生物体中の翻訳効率、６．）宿主細胞内のクローン化遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および７．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくような、クローン化遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの修正は、Ｃ_４０カロテノイドの発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
【０１５５】
最後に、Ｃ_４０カロテノイドの蓄積を促進するには、エネルギーまたは炭素のシンクとして機能するかもしれない、標的経路中または競合経路中の特定の遺伝子の発現を低下させまたは排除することが必要かもしれない。代案としては、所望のカロテノイド中間体の上流の様々な遺伝子を過剰発現させ、生成を促進させることが有用かもしれない。上述の目的で遺伝的経路を操作する方法は、技術分野で一般的であり良く知られている。
【０１５６】
例えばひとたび重要な遺伝的経路が同定および配列決定されると、特定の遺伝子を上方制御して経路の産出量を増大できる。例えばｐＢＲ３２２などのマルチコピー型プラスミド上で、標的遺伝子の追加的コピーを宿主細胞に導入しても良い。代案としては、非天然プロモーターの調節の下におかれるように標的遺伝子を変性しても良い。経路が、細胞サイクル中または発酵生産中の特定点で作動することが所望される場合、制御されたまたは誘導可能プロモーターを使用して、標的遺伝子の天然プロモーターを置き換えても良い。同様に場合によっては、天然または内在性プロモーターを変性させて、遺伝子発現を増大させても良い。例えば内在性プロモーターは、生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）突然変異、欠失、および／または置換によって変性できる（米国特許第５，５６５，３５０号明細書、ザーリン（Ｚａｒｌｉｎｇ）らのＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号明細書を参照されたい）。
【０１５７】
代案としては、中断させる遺伝子配列が知られている場合、遺伝子下方制御の最も効果的な方法の１つは、外来ＤＮＡを構造的な遺伝子に挿入して転写を中断させる、標的を定めた遺伝子中断である。これは、中断させる遺伝子の一部に対して高度な相同性を有する配列で両脇を挟まれた、挿入するＤＮＡ（遺伝子マーカーであることが多い）を含んでなる遺伝子カセットの製造によってもたらされる。カセットの宿主細胞への導入は、細胞の天然ＤＮＡ複製機序を通じた、構造的遺伝子への外来ＤＮＡの挿入をもたらす（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２（１９８９）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ、１３６：２１１〜２１３（１９９３）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４（１９９６）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７（１９９６）参照）。
【０１５８】
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が知られている場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローン化して、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動的に結合する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスＲＮＡは、対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を低下させるために、特別な考察がアンチセンス技術の使用に関わることを理解する。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者に知られている異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
【０１５９】
配列が知られている場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子を下方制御する効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしても良い。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては、非複製ＤＮＡに影響する化学物質（例えばＨＮＯ_２およびＮＨ_２ＯＨ）、ならびに複製ＤＮＡに影響する薬剤（例えばフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料）が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特定の方法は、技術分野で良く文書化されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７〜２３４（１９９２）を参照されたい。
【０１６０】
別の非特異的遺伝子中断方法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的因子であるが、後で配列に基づいて検索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わされた転移因子の使用が関与する。転移因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸断片に接触すると、転移因子が核酸断片中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転移因子配列に基づいて同定されても良いので、技術は、ランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットは市販される（例えばニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ））から入手できる酵母Ｔｙ１因子に基づく、プライマー・アイランド転位キット、マサチューセッツ州ビバリーのニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づくゲノム・プライミング・システム、およびウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））から入手できる、Ｔｎ５細菌性転移因子に基づくＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい）。
【０１６１】
本発明の文脈で、上述のいずれかの一方法によって、カロテノイド生合成経路の発現を調節することが有用かもしれない。例えば本発明は、カロテノイド生合成経路中の酵素をコードするいくつかの単離された遺伝子、およびＣ_４０カロテノイドの生成をもたらす方法を提供する。したがってここでｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、お
よびｃｒｔＺ遺伝子の様々な組み合わせを過剰発現して、Ｃ_４０カロテノイドの増大する生成を促進するのに加えて、三炭素化合物（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の最初の縮合を上方制御して、（ｄｘｓ遺伝子によって媒介される）五炭素化合物Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の生成を増大させることもまた有用かもしれない。これは下流カロテノイド生合成経路に入る炭素の流束を増大させ、Ｃ_４０カロテノイドの増大する生成を可能にする。代案としては（またはそれに加えて）、微生物宿主がこれらのタイプの化合物を合成できれば、ｃｒｔＭ／ｃｒｔＮ遺伝子をノックアウトして、Ｃ_３０カロテノイドの合成をもたらすることが望ましかもしれない。または天然機能性ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子を有するシステムでは、上述のいずれかの一方法によって下流遺伝子（例えばｃｒｔＺまたはｃｒｔＸ）を中断させることで、β−カロテンまたはゼアキサンチンの蓄積をもたらしても良い。
【０１６２】
好ましい微生物宿主
本遺伝子およびカロテノイド生合成経路の核酸断片の発現のために好ましい異種宿主細胞は、菌・カビ類または細菌系統群中に広く見られ、広範な温度、ｐＨ価、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。例えばあらゆる細菌、酵母、および糸状菌類が、本核酸断片の発現のための適切な宿主であることが考察された。転写、翻訳およびタンパク質生合成器官は、それぞれの細胞供給原料に関係なく同一であるので、細胞バイオマスを生成するのに使用される炭素供給材料に関係なく、機能性遺伝子が発現される。大規模微生物生育および機能遺伝子発現は、広範な単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、および／または飽和炭化水素（例えば光合成または化学的自己栄養宿主の場合は、メタンまたは二酸化炭素などの）を利用しても良い。しかし機能遺伝子は、窒素、亜リン酸、イオウ、酸素、炭素、または小型無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量をはじめとする特定の生育条件によって、阻止または抑圧され制御されても良い。さらに機能遺伝子の制御は、培養に添加される典型的に栄養素またはエネルギー源とは見なされない、特定の制御分子の存在または不在によって達成されても良い。生育速度もまた、遺伝子発現における重要な制御因子であっても良い。
【０１６３】
適切な宿主株の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、スネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）
、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６４】
微生物宿主としてのメチロトローフおよびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ
組換え微生物源からいくつかのカロテノイドが生成されている［例えばリコピン（ｌｙｃｏｅｎｅ）生成のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉａ ｕｔｉｌｉｓ）（ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ）Ｗ．Ｒ．およびリヤオ（Ｌｉａｏ）Ｊ．Ｃ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７：５７〜６１（２００１）；ワング（Ｗａｎｇ）Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１６：９２２〜９２６（２０００）；ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）Ｎ．およびシマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：１６９〜１８１（１９９８）；シマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２６７６〜２６８０（１９９８））；β−カロテン生成のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉａ ｕｔｉｌｉｓ）、およびパフィア・ロドジマ（Ｐｆａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２１：７９１〜７９５（１９９９）；ミウラ（Ｍｉｕｒａ）Ｙ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１２２６〜１２２９（１９９８）；米国特許第５，６９１，１９０号明細書）；ゼアキサンチン生成のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉａ ｕｔｉｌｉｓ）（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、前出；ミウラ（Ｍｉｕｒａ）Ｙ．ら、前出）；アスタキサンチン生成のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびパフィア・ロドジマ（Ｐｆａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）（米国特許第５，４６６，５９９号明細書、米国特許第６，０１５，６８４号明細書、米国特許第５，１８２，２０８号明細書、米国特許第５，９７２，６４２号明細書；米国特許第５，６５６，４７２号明細書、米国特許第５，５４５，８１６号明細書、米国特許第５，５３０，１８９号明細書、米国特許第５，５３０，１８８号明細書、米国特許第５，４２９，９３９号明細書、および米国特許第６，１２４，１１３号明細書もまた参照されたい）]が、異なるｃｒｔ遺伝子の様々な組み合わせを使用したこれらのカロテノイド生成法には、低い収率と比較的高価な供給材料への依存という欠点がある。したがって微生物宿主中で安価な供給材料から、高収率のカロテノイドを製造する方法を同定することが望ましい。
【０１６５】
単一エネルギー源として一炭素基質を利用する、いくつかの微生物がある。このような微生物はここで「Ｃ１代謝個体」と称される。これらの生物体は、単一エネルギーおよびバイオマス源として炭素−炭素結合が欠如している炭素基質を使用する能力によって特徴付けられる。これらの炭素基質としては、メタン、メタノール、ホルメート、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン（例えば、モノ−、ジ−、およびトリ−メチルアミン）、メチル化チオール、二酸化炭素、およびその他の様々なあらゆる炭素−炭素結合が欠如している還元炭素化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６６】
全てのＣ１代謝微生物は、概してメチロトローフとして分類される。メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化できるあらゆる生物体として定義されても良い。しかし通性メチロトローフ、絶対メチロトローフ、絶対メタノトローフは、全てメチロトローフの様々なサブセットである。具体的には次のようである。
・通性メチロトローフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化する能力を有
するが、エネルギーおよびバイオマスのために、糖および複合炭水化物などのその他の炭素基質を使用しても良い。通性メチロトローフ細菌は多くの環境中に見られるが、最も一般には土壌、ごみ埋め立て、および廃棄物処理場から単離される。多くの通性メチロトローフは、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のβおよびγ亜群のメンバーである（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）ら、Ｃ１化合物上での微生物の生育（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）［国際シンポジウム］第７回（１９９３）、ｐ２８５〜３０２、マレルＪ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）およびドンＰ．ケリー（Ｄｏｎ Ｐ．Ｋｅｌｌｙ）編、インターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）：英国アンドーバー（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ）；マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、ブロックの微生物生物学（Ｂｒｏｃｋ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、第８版、プレンティスホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ）：ニュージャージー州アッパー・サドル・リバー（Ｕｐｐｅｒ Ｓａｄｄｌｅ Ｒｉｖｅｒ、ＮＪ）（１９９７））。
・絶対メチロトローフは、エネルギー生成が、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物の使用に限定された生物体である。
・絶対メタノトローフは、メタンを酸化する特徴的能力を有する絶対メチロトローフである。
【０１６７】
さらに一炭素基質を利用する能力は細菌に限定されず、酵母および菌・カビ類にも及ぶ。いくつかの酵母属は、エネルギー源としてより複雑な材料に加えて一炭素基質を使用できる（すなわちメチロトローフ酵母）。
【０１６８】
数多くのこれらのメチロトローフ生物体が知られているが、これらの微生物のわずかなものだけが材料合成のための工業プロセスにおいて成功裏に利用されている。そして一炭素基質は対費用効果の高いエネルギー源であるが、これらの微生物の遺伝子操作における困難さ、ならびにそれらの遺伝的機構に関する情報不足が、主に天然生成物合成のためのそれらの使用を制限している。
【０１６９】
これらの困難さにもかかわらず、多くのメタノトローフはこれらの生物体が色素を合成できるようにする固有のイソプレノイド経路を含有し、様々な非内在性イソプレノイド化合物を生成するために、これらの微生物を遺伝子操作する構想の可能性を提供する。メタノトローフは一炭素基質（すなわちメタンまたはメタノール）をエネルギー源として使用できるので、これらの生物体においてカロテノイドを安価に生成することが可能であろう。メタノトローフがβ−カロテン生成のために遺伝子操作される実施例の１つは、国際公開第０２／１８６１７号パンフレットで述べられる。
【０１７０】
本発明では、一炭素基質を唯一のエネルギー源として使用できる微生物における、カロテノイド化合物生合成に関与する遺伝子発現のための方法が提供される。宿主微生物は、カロテノイドのための代謝前駆物質として、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を合成する能力を有するあらゆるＣ１代謝個体であっても良い。より具体的には、本発明で適切な通性メチロトローフ細菌としては、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明で有用な具体的なメチロトローフ酵母としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）が挙げら
れるが、これに限定されるものではない。そして例示的なメタノトローフとしては、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロシクティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１７１】
本発明で特に興味深いのは、エネルギー的に好ましい炭素流経路を有する高生育絶対メタノトローフである。例えば出願人は、それを炭素流束操作のために特に有用なものにする、いくつかの経路特性を有するメタノトローフの特定の株を見いだした。この株はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ２４０２）（米国特許第６，６８９，６０１号明細書）として知られており、この特定の株およびその他の近縁メチロトローフは、Ｃ_４０カロテノイド生成に有用な本発明の遺伝子産物発現のための好ましい微生物宿主である（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。
【０１７２】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａは、Ｃ_３０カロテノイドを天然に生成する。オドム（Ｏｄｏｍ）らは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおけるＣ_４０カロテノイド遺伝子の発現が、Ｃ_３０およびＣ_４０カロテノイド混合物を生成することを報告している（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）。ｃｒｔＮ１、ａｌｄ、ｃｒｔＮ２、およびｃｒｔＮ３遺伝子をはじめとする（がこれに限定されるものではない）、この株中のＣ_３０カロテノイド生成に関与する遺伝子のいくつかが同定されている。ａｌｄ遺伝子の中断、またはｃｒｔＮ１／ａｌｄ／ｃｒｔＮ２遺伝子クラスターの発現を推進するプロモーターの中断は、Ｃ_４０カロテノイド生成により適した様々な非着色変異体（「白色変異体」）を作り出す（米国仮出願第６０／５２７０８３号を本願明細書に援用する）。例えば非着色メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ株ＭＷＭ１０００は、ａｌｄおよびｃｒｔＮ１遺伝子を中断することで作り出された。
【０１７３】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．１６ａ株は、炭素利用経路にいくつかの異常を含有する。例えばゲノム配列データに基づいて、株は２つのヘキソース代謝経路のための遺伝子を含有することが示される。エントナー−ドゥドロフ経路（ケト−デオキシホスホグルコン酸アルドラーゼ酵素を用いる）が株中に存在する。これが絶対メタノトローフにおいて稼働している経路であることは、概して広く認められている。しかしエムデン−マイヤーホフ経路もまた存在する（フルクトースビスリン酸アルドラーゼ酵素を用いる）。この経路が絶対メタノトローフ中に存在しないか、または稼働していないことは良く知られている。エネルギー的には後者の経路が最も好ましく、生物学的に有用なエネルギーのより高い収率を可能にして、究極的にメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａにおいて、細胞集団生成およびその他の細胞集団依存生成物のより高い収率が得られる。１６ａ株におけるこの経路の活性は、マイクロアレイデータおよびＡＴＰ還元を測定する生化学的証拠を通じて確認されている。１６ａ株は、エムデン−マイヤーホフおよびエントナー−ドゥドロフ経路酵素の双方を有することが示されているが、データは、エムデン−マイヤーホフ経路酵素がエントナー−ドゥドロフ経路酵素よりも強力に発現することをを示唆する。この結果は意外であり、メタノトローフ細菌解糖代謝に関する既存の信念に反する。出願人は、例えばメチロモナス・クララ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ
ｃｌａｒａ）およびメチロサイナス・スポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ）をはじめとする、この特徴を有する別のメタノトローフ細菌を見いだした。この活性は、ほとんどの細菌システム中の酵素の典型的なホスホリル供与体であるＡＴＰに対して酵素活性が欠如しているために、メタノトローフにおいて見いだされないままであったように思われる。
【０１７４】
１６ａ株中のエムデン−マイヤーホフ経路の特に新しく有用な特徴は、重要なホスホフルクトキナーゼステップがＡＴＰ−依存性でなく、ピロリン酸依存性であることである。この特徴は、ＡＴＰの代わりにピロリン酸を使用することで、経路のエネルギー収率を増大させる。
【０１７５】
メタノトローフ細菌では、リブロース一リン酸経路またはＲｕＭＰ回路として知られている、反応の循環セットを通じてメタンが生分子に転換される。この経路は３つの相を含んでなり、各相は一連の酵素的ステップである。第１のステップは、ヘキソースまたは六炭糖を形成する、ペントース中へのＣ−１（ホルムアルデヒド）の「固定」または組み込みである。これは五炭糖（ペントース）とホルムアルデヒドとの縮合反応を通じて起き、ヘキスロース一リン酸シンターゼによって触媒される。第２段階は「開裂」と称され、２個の三炭素分子へのヘキソースの分裂をもたらす。これらの三炭素分子の１つはＲｕＭＰ経路を通じてリサイクルされ、他の三炭素断片は細胞の生育に用いられる。
【０１７６】
メタノトローフおよびメチロトローフにおいて、ＲｕＭＰ経路は３つの変種の１つとして生じても良い。しかしこれらの変種の２つのみ、ＦＢＰ／ＴＡ（フルクトースビスホスホターゼ／トランスアルドラーゼ）経路またはＫＤＰＧ／ＴＡ（ケトデオキシホスホグルコン酸／トランスアルドラーゼ）経路が一般に見られる（ディクフイゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）Ｌ．およびドゥブリエ（Ｄｅｖｒｉｅｓ）Ｇ．Ｅ．「好気性メタノール利用グラム陰性およびグラム陽性細菌の生理学と生化学（Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｎｄ ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）」「メタンおよびメタノール利用細菌（Ｍｅｔｈａｎｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈａｎｏｌ Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ）」中、コリン・マレル（Ｃｏｌｉｎ Ｍｕｒｒｅｌｌ）およびハワード・ダルトン（Ｈｏｗａｒｄ Ｄａｌｔｏｎ）編より、Ｐｌｅｎｕｍ：ニューヨーク、１９９２）。
【０１７７】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ.１６ａ株は、「開裂」ステップの扱いにおいてユニークであり、重要な中間体としてフルクトースビスリン酸を経由して、この転換を行う遺伝子が見いだされた。フルクトースビスリン酸アルドラーゼおよびトランスアルドラーゼのための遺伝子は、１片のＤＮＡ上に一緒にクラスター化して見いだされている。次にケトデオキシホスホグルコン酸中間体が関与するその他の変種のための遺伝子もまた、一緒にクラスター化して見いだされている。入手できる文献は、これらの生物体（絶対メチロトローフおよびメタノトローフ）がＫＤＰＧ経路のみに依存し、ＦＢＰ依存固定経路が通性メチロトローフによって用いられることを教示する（ディクフイゼン（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ）ら、前出）。したがって後者の観察は予期されるが、前者はそうでない。絶対メタン利用細菌におけるＦＢＰ遺伝子の発見は意外であり、また有用性も示唆する。ＦＢＰ経路は、ＫＤＰＧ経路で利用されるよりも多くのエネルギー（ＡＴＰ）が利用されるとという事実のために、宿主微生物にとってエネルギー的に好ましい。したがってＦＢＰ経路を用いる生物体は、ＫＤＰＧ経路を用いるものに比べて、エネルギー上の利点および生育上の利点を有するかもしれない。この利点はまた、菌株中のエネルギー要求生成経路にとって有用かもしれない。この経路を使用することで、メタン利用細菌は、単細胞タンパク質、またはＲｕＭＰ経路を通る炭素の流れから誘導されるあらゆるその他の生成物（例えばカロテノイド）のための生成基盤として、その他のメタン利用生物体に比べて利点を有するかもしれない。
【０１７８】
したがって本発明は、
（ａ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質で生育し、
（ｂ）ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる、機能的エムデンマイヤーホフ炭素経路を含んでなる、
高生育でエネルギー的に好ましいメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）株におけるカロテノイド化合物の製造方法を提供する。
【０１７９】
Ｃ１代謝細菌の形質転換
Ｃ１代謝細菌形質の転換技術は十分開発されいないが、当業者に良く知られているその他の細菌のために用いられる一般方法を応用しても良い。メチロバクテリウム・エキストロクエン（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）ＡＭ１（トヤマ（Ｔｏｙａｍａ）Ｈ．、ら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１〜７（１９９８））、メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）ＡＳ１（キム（Ｋｉｍ）Ｃ．Ｓ．およびＴ．Ｋ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５〜１０８（１９９７））、およびメチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．株１２Ｓ（ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２３：７８７〜７９１（２００１））の形質転換のために、電気穿孔が成功裏に使用されている。しかし当業者には良く知られているように、１つの特定のＣ１代謝利用生物体から別の生物体への具体的電気穿孔パラメーターの推定は、困難かもしれない。
【０１８０】
供与細胞と受容細胞の直接接触に依存する細菌接合は、Ｃ１代謝細菌中への遺伝子の転位のために、より容易に受け入れられることが多い。簡単に述べると、この細菌接合プロセスは、「供与」細胞と「受容」細胞を互いに密接に接触させて一緒に混合することを伴う。接合は、新たに合成された供与ＤＮＡの受容細胞中への直接転位を伴う、「供与」細菌と「受容」細菌間の細胞質連絡の形成によって起きる。技術分野で良く知られているように、接合の受容体は、供与細菌からの水平転位を通じてＤＮＡを受容できるあらゆる細胞として定義される。接合転位中の供与体は、接合プラスミド、接合トランスポゾン、または可動性プラスミドを含有する細菌である。供与体プラスミドの物理的転位は、下で述べられる２つの様式の１つによって起きることができる。
１．場合によっては、供与体と受容体のみが接合にとって必要とされる。これは転位されるプラスミドが接合性かつ可動性である自己伝播性のプラスミドの場合（すなわちｔｒａ−遺伝子と、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子の双方を保有する）に起きる。一般にプロセスは、１．）ｏｒｉＴ中の特定部位で二本鎖プラスミドＤＮＡにニックが入れられるステップと、２．）ｐｏｒｅまたはｐｉｌｕｓ構造を通じて、一本鎖ＤＮＡが受容体に放出されるステップと、３．）ＤＮＡリラクセース酵素が二本鎖ＤＮＡをｏｒｉＴで開裂して結合し、５’末端を放出する（中間体構造としてリラクソゾームを形成する）ステップと、４．）引き続いて、補助タンパク質の複合体がｏｒｉＴでアセンブルして、ＤＮＡ転位プロセスを容易にするステップとを伴う。
２．代案としては、供与体プラスミドの受容体への転位のために「三親交雑」接合が必要とされる。このタイプの接合には、供与細胞、受容細胞、および「ヘルパー」プラスミドが関与する。供与細胞は、可動性プラスミドまたは接合トランスポゾンを保有する。可動性ベクターは、ニッケースをコードする遺伝子であるｏｒｉＴを含有し、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子を有する。しかしＭｏｂタンパク質は、単独ではゲノムの転位達成するのに十分でない。したがって可動性プラスミドは、ヘルパープラスミド（供与体内または「ヘルパー」細胞内に位置する）によって適切な接合システムが提供されない限り、それら自身の転位を促進できない。プラスミドは、ｐｏｒｅまたはｐｉｌｕｓの形成に関与する転位タンパク質（Ｔｒａ）をコードするので、接合プラスミドは噛合対の形成およびＤＮＡ転位のために必要とされる。
【０１８１】
Ｃ１代謝細菌が関与する成功裏の接合の例としては、ストリアー（Ｓｔｏｌｙａｒ）ら（Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ ６４（５）：６８６−６９１（１９９５））；モトヤマ（Ｍｏｔｏｙａｍａ）ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２（１）：６７〜７２（１９９４））；ロイド（Ｌｌｏｙｄ）ら（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ １７１（６）：３６４−３７０（１９９９））；およびオドム（Ｏｄｏｍ）ら（国際公開第０２／１８６１７号パンフレット）の研究が挙げられる。
【０１８２】
カロテノイドの生体内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）生物転換
代案としては、生体内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で本願明細書の生物転換を行うことが可能である。ＣｒｔＥ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、およびＣｒｔＺのための基質が、宿主細胞によって内在性に合成されない場合、基質を外来性に添加することが可能である。この実施態様では、適切なカロテノイド基質を中性洗剤（例えばＤＭＳＯ）で可溶化してもまたはリン脂質ベシクルと混合しても良い。細胞中への輸送を助けるために、宿主細胞を場合によりトルエンなどの適切な溶剤で透過化処理しても良い。このタイプのカロテノイド基質の生体外（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）生物転換法は、技術分野に基礎がある（例えばハンドル（Ｈｕｎｄｌｅ）Ｂ．Ｓ．ら、ＦＥＢＳ、３１５：３２９〜３３４（１９９３）；およびブラムリー（Ｂｒａｍｌｅｙ）、Ｐ．Ｍ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６：１９３５〜１９３９（１９８７）を参照されたい）。
【０１８３】
組換え微生物を使用した工業生産
本タンパク質の商業的生産が所望される場合、多様な培養方法を応用しても良い。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現する特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチまたは連続の培養方法の双方で生産しても良い。
【０１８４】
古典的なバッチ培養法は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の最初に設定され、培養プロセス中の人為的変化を受けない。したがって培養プロセス開始時に培養液に所望の生物体または生物体群を接種し、生育または代謝活動を生じさせながらシステムには何も添加しない。しかし典型的には「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物質量組成は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。システムによっては対数期にある細胞が、最終生成物または中間体の生産の大部分を担うことが多い。その他のシステムでは、静止または対数期後生成を得ることができる。
【０１８５】
標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ培養プロセスも本発明において適切であり、培養の進行と共に基質が段階的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含んでなる。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培養液中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ_２などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ培養法は、技術分野で一般的であり周知であって、実例はブロック（Ｂｒｏｃｋ）（前出）およびデシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）（前出）にある。
【０１８６】
本タンパク質の商業的生成は、連続培養によって達成しても良い。連続の培養は開放システムであり、規定の培地をバイオリアクターに連続的に添加して、等量の慣熟培地を工程から同時に除去する。連続培養は、概して細胞を恒常的な高い液相密度に維持し、そこでは細胞が主に対数増殖期にある。代案としては連続培養を固定細胞で実施しても良く、そこでは炭素および養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、天然および／または合成材料から構成される広範囲の固体担体を使用して実施しても良い。
【０１８７】
連続または半連続培養は、細胞生育または最終生成物濃度に影響する１つの因子またはあらゆるいくつかの因子の調節を可能にする。例えば一方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を固定された割合に維持し、その他の全パラメーターの調節ができるようにする。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの因子を連続的に変化させることができる。連続システムは定常状態生育条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、培養中の細胞生育率に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野で良く知られており、多様な方法が上記のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
【０１８８】
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質としては、単糖類（例えばグルコースおよびフルクトース）、二糖類（例えばラクトースまたはスクロース）、多糖類（例えばデンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物）、再生可能な供給材料（例えば乳清透過液、コーンスティープリーカー、甜菜モラセス、および大麦の麦芽）からの未精製混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素基質は、重要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている、二酸化炭素、メタンまたはメタノールなどの一炭素基質であっても良い。一または二炭素基質に加えて、メチロトローフ生物体はまた、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための多様なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｃ１化合物上での微生物の生育（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）［国際シンポジウム］第７回（１９９３）、４１５〜３２、マレルＪ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）およびドンＰ．ケリー（Ｄｏｎ Ｐ．Ｋｅｌｌｙ）編、インターセプト：英国アンドーバー）。同様に、様々なカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種が、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（サルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５〜４８９（１９９０））。したがって本発明で用いられる炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含しても良く、生物体の選択によってのみ制限されることが考察された。
【０１８９】
植物における組換え生成
植物および藻類もまた、カロテノイド化合物を製造することが知られている。本発明のｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ核酸断片を使用して、微生物タンパク質を発現する能力を有する遺伝子導入植物を作り出しても良い。好ましい植物宿主は、本タンパク質の高生成レベルを支えるいずれかの品種であることができる。適切な緑色植物としては、ダイズ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、オート麦（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ、Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ、アブラナ科の野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、オランダイチゴ、落花生、ブドウ、草の種、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ豆、ライ麦、亜麻、堅木、軟木、および飼料としての草が挙げられるが、これに限定されるものではない。藻類のとしては、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘモタコックス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびデュナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などの種商業的に重要な宿主が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１９０】
好ましいカロテノイド化合物の過剰発現は、最初に本発明のキメラ遺伝子を構築することによって達成されても良く、その中でコード領域は、所望の発生段階で所望の組織中の遺伝子の発現を導くプロモーターに作動的に結合される。便宜上、キメラ遺伝子は、同一遺伝子に由来するプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでなっても良い。転写終止シグナルをコードする３’非コード配列もまた、提供されなくてはならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を容易にするために１つもしくはそれ以上のイントロンも含んでなる。
【０１９１】
コード領域の発現を誘導できるあらゆるプロモーターとあらゆるターミネーターのあらゆる組み合わせをキメラ遺伝子配列で使用しても良い。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例としては、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）、およびカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用しても良い効率的な植物プロモーターの１タイプは、高等植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と機能的に連結するこのようなプロモーターは、本遺伝子産物の発現を促進できなくてはならない。本発明で使用しても良い高等植物プロモーターとしては、例えば１．）ダイズからのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小型サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３〜４９８（１９８２））、および２．）クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導されることが知られている（例えば「植物の遺伝子操作、農業における展望（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」Ａ．キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）編、Ｐｌｅｎｕｍ：ニューヨーク（１９８３）、ｐ２９〜３８；コルッジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｌ Ｃｈｅｍ．、２５８：１３９９（１９８３）；およびダンスミア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ）Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、２：２８５（１９８３）参照）。
【０１９２】
次に本キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築できる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに使用される方法に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択して増殖するためにプラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を良く知っている。当業者はまた、異なる独立形質転換イベントが、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらすことを認識するので（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）；デ・アルメイダ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
２１８：７８〜８６（１９８９））、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、複数イベントをスクリーニングしなくてはならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３））、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析によって達成しても良い。
【０１９３】
用途によっては、本タンパク質を異なる細胞区画に方向付けることが有用であろう。したがって適切な細胞内標的配列を添加することで、および／または以下のような既存の標的配列を除去することで、酵素をコードするコード配列を変更して、上述のキメラ遺伝子をさらに補完しても良いことが想定された。１．）トランジット配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）Ｋ．、Ｃｅｌｌ ５６：２４７〜２５３（１９８９））、２．）シグナル配列、または３．）小胞体局在化（クリスピールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））または核局在化シグナル（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ）、Ｎ．、Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））をコードする配列。引用した参考文献はこれらの各例を示すが、リストは網羅的でなく、有用なさらに多くの標的シグナルが、将来発見されるかもしれない。
【０１９４】
タンパク質操作
本ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、および／またはｃｒｔＺヌクレオチドを使用して、向上されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造できるかもしれないことが考察された。１．）誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９年２月１５日））、２．）部位特異的変異誘発（クームズ（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、ｐ２５９〜３１１、１プレート（アンジェレッティ，ルース・ホーグ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒｕｔｈ Ｈｏｇｕｅ）編、アカデミック：カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））、および３．）「遺伝子シャフリング」（本願明細書に援用する米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、および米国特許第５，８３７，４５８号明細書）をはじめとするが、これに限定されるものではない、天然遺伝子配列を変異させて活性が改変または向上された遺伝子産物を生成する様々な方法が知られている。
【０１９５】
遺伝子シャッフリング法は、その容易な実行、および高率な変異誘発と容易なスクリーニングのために特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスは、対象の遺伝子と類似したまたは違っている追加的なＤＮＡ領域集団存在下で、対象の遺伝子を特定サイズの断片に制限エンドヌクレアーゼ開裂することを伴う。次に断片のプールを変性させ再アニールして、変異遺伝子を作り出す。次に変異した遺伝子を変更した活性についてスクリーニングする。
【０１９６】
本発明の本微生物の配列を変異させて、この方法によって変更されまたは増強される活性についてスクリーニングしても良い。配列は二本鎖であるべきで、５０ｂｐ〜１０ｋＢ範囲の様々な長さであることができる。配列は技術分野で良く知られている制限エンドヌクレアーゼを使用して、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲の断片に無作為に消化されても良い（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、同上）。本微生物の配列に加えて、微生物の配列の全部または部分とハイブリダイズ可能な断片集団を添加しても良い。同様に、本配列とハイブリダイズ可能でない断片集団を添加しても良い。典型的にこれらの追加的断片集団は、総核酸と比較して重量で約１０〜２０倍過剰に添加される。一般にこのプロセスに従えば、混合物中の異なる特定の核酸断片の数は約１００〜約１０００個になる。無作為核酸断片の混合集団は、変性されて一本鎖核酸断片を形成し、次に再アニールされる。その他の一本鎖核酸断片との相同性領域を有する一本鎖核酸断片のみが再アニールする。無作為核酸断片は、加熱によって変性されても良い。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を判定できる。好ましくは温度は、約８０℃〜１００℃である。核酸断片を冷却によって再アニールしても良い。好ましくは温度は約２０℃〜７５℃である。再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって加速できる。適切な塩濃度は、０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲であっても良い。次にアニールされた核酸断片は、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、クレノウ断片、Ｔａｑポリメラーゼまたは技術分野で知られているあらゆるその他のＤＮＡポリメラーゼであっても良い。アニールに先だって、アニールと同時に、またはアニール後に、ポリメラーゼを無作為核酸断片に添加しても良い。変性、再生、およびポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルは、所望の回数反復される。好ましくはサイクルは約２〜５０回反復され、より好ましくは手順は１０〜４０回反復される。得られる核酸は約５０ｂｐ〜約１００ｋＢの範囲のより大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準クローン化および発
現プロトコルによって、発現および変更された活性についてスクリーニングしても良い（マニアティス（Ｍａｎａｔｉｓ）、同上）。
【０１９７】
さらにハイブリッドタンパク質は、遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）法を使用した、機能性領域の融合によってアセンブルできる（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１０６９〜１０７３（１９９７））。本遺伝子の機能性領域は、その他の遺伝子の機能性領域と組み合わせて、所望の触媒機能を有する新しい酵素作り出すことができる。ＰＣＲオーバーラップ伸長法を使用してハイブリッド酵素を構築し、当業者に良く知られている技術使用して、様々な発現ベクター中にクローンしても良い。
【実施例】
【０１９８】
以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみのために提供されるものと理解される。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特質を把握でき、その範囲と精神を逸脱することなく、本発明の様々な変化と修正を行って、様々な利用法および条件に適合させることができる。
【０１９９】
一般方法
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（前出）、シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら（前出）、およびオースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ）（前出）によって述べられている。
【０２００】
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、下に述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４）またはブロック（Ｂｒｏｃｋ）ら（前出）。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
【０２０１】
配列データは、ベクターと挿入特異性プライマーの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上で生成した。ミシガン州アナーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（商標）バージョン４．０．５中で配列編集およびアセンブリーを実施した。全配列は、双方向で少なくとも２回のカバレッジを示す。遺伝子配列の操作は、メリーランド州ベセズダのインフォマックス（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ））からのベクターＮＴＩプログラムを使用して達成した。ベクターＮＴＩにおけるデフォルト値を使用して、対合比較を実施した。米国バ
イオテクノロジカル情報センター（ＮＣＢＩ）で設定されたデフォルト値を使用して、ＢＬＡＳＴ分析を実施した。
【０２０２】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍＭ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」はモル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌ」マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０２０３】
実施例１
カロテノイド産生株パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４の単離
本実施例は、腸内細菌科に属する黄色素細菌株パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株の単離および同定について述べる。この生物体中で生成された天然カロテノイドの分析は、様々なゼアキサンチン前駆物質およびゼアキサンチン誘導体に加えて、ゼアキサンチンの生成を証明する。
【０２０４】
株単離および分類：新らしいカロテノイド産生細菌株を単離するために、環境サンプルの収集物から着色微生物を単離した。デラウェア州ウィルミントンの家庭菜園土壌を採取して、ルリア・ブロス（ＬＢ）に再懸濁した。１０μＬのループを満たす再懸濁液をＬＢプレート上に画線して、プレートを３０℃でインキュベートした。多様なコロニーの外見を有する着色細菌を選んで、ＬＢプレート上に均一に２回画線して、３０℃でインキュベートした。これらのコロニーから、淡黄色で滑らかな半透明コロニーを形成したものを「ＤＣ４０４株」と命名した。
【０２０５】
タイプＤＣ４０４株で１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定を実施した。具体的には、プライマーＨＫ１２（配列番号１３）およびＪＣＲ１４（配列番号１４）を使用して、株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。製造業者（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））の説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して増幅した１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子を精製し、自動ＡＢＩシーケンサーで配列決定した。配列決定反応をプライマーＨＫ１２、ＪＣＲ１４、およびＪＣＲ１５（配列番号１５）で開始した。アセンブルしたＤＣ４０４の１３２４ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号１６）をジェンバンク（登録商標）に対するＢＬＡＳＴＮ検索のためのクエリー配列として使用した（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７））。
【０２０６】
ＢＬＡＳＴ分析からは、ＤＣ４０４株が腸内細菌科に属することが示された。その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列はこの科内のいくつかの異なる種との配列類似性を示し、トップヒット（９６％同一性）はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であった。上で述べた分析に従って、ＤＣ４０４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列との９６％同一性を有するその他の種としては、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、シトロバクター・アマロナチカス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、およびパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）が挙げられる。しかし比較的低いヒットの相同性（９６％のみの同一性）に一致して、メリーランド州コッキーズヴィルのベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ））からのＢＢＬエンテロチューブ^ＴＭ ＩＩを使用した生化学的試験は、ＤＣ４０４がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種でないことを示唆する。
【０２０７】
外部会社であるデラウェア州ニューアークのマイクロビアルＩＤ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ＩＤ，Ｉｎｃ.（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ））によるその脂肪酸プロフィールに従って、ＤＣ４０４をさらに特性決定した。ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸プロファイリングは、ＤＣ４０４株がパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）に最も近縁であることを示唆した（類似度指数は０.５５７であった）。類似度指数は、未知のサンプルの脂肪酸組成が、そのマッチとしてリストされたライブラリーエントリを作成するのに使用した株の平均脂肪酸組成と比較して、どれだけ近いかを表す数値である。未知のサンプルの脂肪酸組成と、ライブラリーエントリの平均値との正確な一致は、類似度指数１.０００をもたらす。０.４００〜０.６００の類似度指数は種の一致であるかもしれず、異型株を示す。ＤＣ４０４株の１６Ｓ ｒＲＮＡ分析はまた、トップＢＬＡＳＴヒット（９６％の同一性を有する）の１つとして、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）を同定したので、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）の異型株としてＤＣ４０４株を命名した。
【０２０８】
ＤＣ４０４のカロテノイド分析：ＤＣ４０４中の黄色色素を抽出してＨＰＬＣで分析した。株を２００ｍＬのＬＢ中で３０℃において２日間生育させ、次に細胞を４０００ｇで３０ｍｉｎの遠心分離によって収集した。細胞ペレットを１０ｍＬのアセトンで抽出した。溶剤を窒素下で乾燥させ、カロテノイドを０．５ｍＬのアセトンに再懸濁した。抽出物をミシガン州アナーバーノのパル・コーポレーション（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）ＣＲ２５ｍｍシリンジフィルターで濾過して、次にカリフォルニア州フォスター・シティのアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ、（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））からのアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）シリーズ１１００ ＬＣ／ＭＳＤ ＳＩを使用して、０．１ｍＬの１０％アセトン＋９０％ＨＰＬＣ分析用アセトニトリル中で濃縮した。
【０２０９】
サンプル（２０μＬ）を１５０ｍｍ×４．６ｍｍのＺＯＲＢＡＸ Ｃ１８（３．５μｍ粒子）カラム（アジレントテクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））に装填した。カラム温度を４０℃に保った。流速は１ｍＬ／分であり、溶剤ランニングプログラムは次のとおりであった。
・０〜２分：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂ、
・２〜１０分：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂから６０％緩衝液Ａおよび４０％緩衝液Ｂへの直線的濃度勾配、
・１０〜１２分：６０％緩衝液Ａおよび４０％緩衝液Ｂから５０％緩衝液Ａおよび５０％緩衝液Ｂへの直線的濃度勾配、
・１２〜１８分：５０％緩衝液Ａおよび５０％緩衝液Ｂ、
・１８〜２０分：９５％緩衝液Ａおよび５％緩衝液Ｂ。
【０２１０】
緩衝液Ａは９５％アセトニトリルおよび５％ｄＨ_２Ｏであり、緩衝液Ｂは１００％テトラデヒドロフランであった。
【０２１１】
ＨＰＬＣ分析（図３）は、標品との比較で、ＤＣ４０４株がゼアキサンチン（６.２８ｍｉｎピーク）、β−クリプトキサンチン（１０.２３ｍｉｎピーク）およびβ−カロテン（１３.０２ｍｉｎピーク）を生成したことを示唆した。具体的には、ゼアキサンチンおよびβ−クリプトキサンチン標品は、スイス国ルプシンゲンのカロテナチュール（ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ（Ｌｕｐｓｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から購入し、
β−カロテン標品は、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から購入した。ＭＳ分析からゼアキサンチンピークの分子量が５６９であり、β−クリプトキサンチンピークの分子量が５５３であり、β−カロテンピークの分子量がが５３７であることを確認した。３．２２ｍｉｎに溶出するピークは、その分子量７３１が示唆するように、ゼアキサンチンモノグルコシドである可能性が高い。
【０２１２】
実施例２
パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４着色コスミドクローンの同定
実施例２は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４からのゲノムＤＮＡの約４０ｋＢの断片を発現できる、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）コスミドクローンの構造について述べる。この形質転換体は、主にゼアキサンチンを生成した。大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）コスミドクローン中にゼアキサンチングルコシドは検出されなかった。
【０２１３】
染色体ＤＮＡの調製：ＤＣ４０４株を２５ｍＬのＬＢ培地内で３０℃で一晩通気して生育させた。細菌性細胞を４，０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。細胞ペレットを５ｍＬの５０ｍＭトリス−１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中に穏やかに再懸濁して、リゾチームを最終濃度２ｍｇ／ｍＬに添加した。懸濁液を３７℃で１ｈインキュベートした。次にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度１％に添加して、タンパク質分解酵素Ｋを１００μｇ／ｍＬで添加した。懸濁液を５５℃で２ｈインキュベートした。懸濁液は透明になり、等容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で１回透明な溶解産物を抽出した。４，０００ｒｐｍで２０ｍｉｎの遠心処理後、水相を注意深く除去して新しい試験管に移した。２容積のエタノールを添加して、密封したガラス・パスツール・ピペットにＤＮＡを穏やかに巻き付けた。ＤＮＡを７０％エタノールを含有する試験管に浸した。風乾後、ＤＮＡをＲＮａｓｅＡ（１００μｇ／ｍＬ）と共に４００μＬのＴＥ（１０ｍＭトリス−１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再懸濁し、４℃に保管した。ＤＮＡの濃度および純度を分光光度法によりＯＤ_２６０／ＯＤ_２８０で測定した。
【０２１４】
コスミドライブラリーの構築：ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのｐＷＥＢコスミドクローン化キットを使用して、製造業者の説明書に従って、ＤＣ４０４のコスミドライブラリーを構築した。シリンジニードルを通過させて、ゲノムＤＮＡを剪断した。剪断したＤＮＡを末端修復して、４０ｋＢの標準との比較によって低融点アガロース上でサイズ選択した。大きさがほぼ４０ｋＢのＤＮＡ断片を精製して、ブラントエンドクローン化レディーのｐＷＥＢコスミドベクター中にライゲートした。超高効率ＭａｘＰｌａｘラムダ・パッケージング・エキストラクツ（Ｌａｍｂｄａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ）を使用して、ライブラリーをパッケージし、ＥＰＩ１００大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞上に播種した。コスミドライブラリークローンから２個の黄色コロニーが同定された。２個のクローンからのコスミドＤＮＡは、類似した制限酵素消化パターンを有したので、１個のクローン上でさらなる分析を実施した。
【０２１５】
黄色コスミドクローンのカロテノイド分析：実施例１で述べられるようにしてＬＣ−ＭＳによって、コスミドｐＷＥＢ−４０４を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＩ１００中のカロテノイドを分析した。ＨＰＬＣの結果を図４に示す。そのＵＶスペクトル、分子量、および標品との比較に基づいて、６．２７ｍｉｎのピークはゼアキサンチンと同定された。顕著な量のβ−カロテンまたはβ−クリプトキサンチン中間体のいずれも蓄積せず、ゼアキサンチングルコシドは生成されなかった。ＤＣ４０４（図３）中で観察された顕著なゼアキサンチンモノグルコシドピークは、この大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）コスミドクロ
ーン中には存在しなかった。分子重量がゼアキサンチンモノグルコシド（７３１ダルトン）と一致しなかったので、３.５６ｍｉｎの小さなピークはゼアキサンチンモノグルコシドの異性体ではなかった。コスミドｐＷＥＢ−４０４を含有する大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）内のゼアキサンチングルコシドの不在は、ゼアキサンチングルコシル転移酵素をコードするｃｒｔＸ遺伝子が、コスミドｐＷＥＢ−４０４中に存在しないかもしれないことを示唆する。
【０２１６】
実施例３
カロテノイド生合成遺伝子の同定
この実施例は、コスミドｐＷＥＢ−４０４中のパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４ ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子の同定について述べ、その他の知られているパントエア（Ｐａｎｔｅｏａ）ｃｒｔ遺伝子に関わるこれら遺伝子の関連性の比較を提供する。その他のパントエア（Ｐａｎｔｅｏａ）中の下流カロテノイド生合成経路の遺伝子構成とは対照的に、ｃｒｔＸ遺伝子は、ここで述べるＰ．アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４からのコスミド上に遺伝子クラスターの一部として存在しなかった。
【０２１７】
ＨＰＬＣ分析は、コスミドｐＷＥＢ−４０４が、ゼアキサンチンの合成のための遺伝子を含有するに違いないことを示唆した。カロテノイド合成遺伝子を配列決定するために、ウィスコンシン州マディソンのエピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））からのＥＺ：：ＴＮ＜ＴＥＴ−１＞キットを使用して製造業者の説明書に従って、コスミドＤＮＡ ｐＷＥＢ−４０４に生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）遺伝子転移を行った。ＴＥＴ−１ ＦＰ−１フォーワードプライマー（配列番号１７）を使用して、トランスポゾン末端から、２００個のテトラサイクリン抵抗性トランスポゾンインサートを配列決定した。ミシガン州アナーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）プログラムによって、配列アセンブリーを実施した。ＤＣ４０４からのカロテノイド生合成経路の６個の遺伝子を含有する、８８１４ｂｐのｃｏｎｔｉｇ（配列番号１８）をアセンブルした（図５）。
【０２１８】
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ジェンバンク（登録商標）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンクから誘導される配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に含有される配列との類似性に対するＢＬＡＳＴ（基礎的局在性整列化検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、前出）検索を行って、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺをコードする遺伝子を同定した。米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベースに含有されるあらゆる公的に入手できるＤＮＡ配列との類似性について、各配列を分析した。ＤＮＡ配列を全ての読み取り枠で翻訳し、ＮＣＢＩが提供するＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベースに含有されるあらゆる公的に入手できるタンパク質配列との類似性について比較した（ギッシュ（Ｇｉｓｈ）Ｗ．およびステート（Ｓｔａｔｅｓ）Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６〜２７２（１９９３））。
【０２１９】
ＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのどちらかを使用して、全ての比較を行った。ＢＬＡＳＴ比較の結果を表２に示し、各遺伝子が最も類似する配列を要約する。表２は、期待値に報告される値を有するＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づくデータを示す。期待値は、このサイズのデータベースの検索において絶対的に偶然に期待される、規定のスコアにおけるマッチ数を特定して、マッチの統計学的有意さを推定する。
【０２２０】
ベクターＮＴＩプログラム（前出）を使用して、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列もまた、その他のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）株からのものと比較した。表３に対合比較の同一性を要約する。
【０２２１】
【表３】

【０２２２】
【表４】

【０２２３】
【表５】

【０２２４】
様々なパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）種中のｃｒｔ遺伝子クラスター遺伝子構成の比較からは、遺伝子ｉｄｉおよびｃｒｔＸの存在に関する興味深い違い（図５）もまた明らかにされた。イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｉｄｉは、上流イソプレノイド経路に関与し、例えばパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）（ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｄ９００８７）およびパントエア・ステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＹ１６６７１３１）中のｃｒｔＥＸＹＩＢＺクラスターの遺伝子構成のように、通常、ｃｒｔ遺伝子クラスター内には存在しない。しかしときどき、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＥＨＯ−１０（ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｍ８７２８０）で見られるように、ｉｄｉがｃｒｔ遺伝子オペロンの一部であることが見いだされる。本願明細書の出願人が行ったＢＬＡＳＴ分析に従って、Ｐ.アグロメランス（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＥＨＯ−１０（ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｍ８７２８０）のｃｒｔＥ−仮説タンパク質−ｃｒｔＸ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺのカロテン産生性クラスター内に含有される「仮説タンパク質」は、ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＸ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺを含んでなると見なされるべきである。同様にｉｄｉはまた、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４のｃｒｔ遺伝子クラスター中にも存在し、ｃｒｔＥ遺伝子の下流である。しかし表３に示すように、ＤＣ４０４株のｉｄｉは、ＥＨＯ−１０のｉｄｉと６８％のみの同一性を有する。
【０２２５】
ｃｒｔＸ遺伝子に関してＤＣ４０４株は、ここで述べるカロテン産生性遺伝子クラスター内にこの遺伝子が不在である点が、その他のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）種と比べてユニークである（図５）。さらにコスミドクローンはゼアキサンチンのみを生成し、ゼアキサンチングルコシドを生成しないので、ＤＣ４０４からのｃｒｔ遺伝子クラスターを含有する大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）コスミドクローンｐＷＥＢ−４０４はｃｒｔＸ遺伝子を含有しない。ここで述べる遺伝子クラスター中のｃｒｔＸ遺伝子の欠如にも関わらず、ＤＣ４０４はゼアキサンチンモノグルコシドを主に生成するので、ｃｒｔＸ遺伝子を有さねばならない。ｃｒｔＸ遺伝子はＤＣ４０４染色体中の別の場所に位置し、ｃｒｔ遺伝子クラスターとは連結していないと結論された。ＤＣ４０４株中のｃｒｔＸの配列は、今回は同定されなかった。
【０２２６】
実施例４
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ.１６ａにおけるパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４のｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子クラスターの発現
以下の実施例は、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４（実施例３）からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子を含んでなるｃｒｔ遺伝子クラスターをメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ２４０２）中に導入して、β−カロテンなどの望ましい４０−炭素カロテノイドを合成できるようにすることについて述べる。
【０２２７】
最初に、プライマーｐＷＥＢ４０４Ｆ：５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＣＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴ−３’（配列番号１９）およびｐＷＥＢ４０４Ｒ：５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号２０）を使用して、ＰＣＲによって、ｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子を含有するＤＣ４０４からの断片を増幅した。以下の熱サイクル条件で、カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）からのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼと共に、コスミドＤＮＡ ｐＷＥＢ−４０４をテンプレートとして使用した。９２℃（５ｍｉｎ）；９４℃（１ｍｉｎ）、６０℃（１ｍｉｎ）、７２℃（９ｍｉｎ）を２５サイクル；および７２℃（１０ｍｉｎ）。ゲル電気泳動法に続いて、およそ５.６ｋＢの単一生成物が観察された。パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）からのＴａｑポリメラーゼを１０分間の７２℃の反応で使用して、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ中へのＴＯＰＯクローン化のために、追加的な３’アデノシンヌクレオチドを断片に付加した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞中への形質転換に続いて、いくつかのコロニーの色が明るい黄色に見え、それらがカロテノイド化合物を生成していることが示唆された。次に遺伝子クラスターをフロリダ州マルコ・アイランドのモビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ，ＬＬＣ（Ｍａｒｃｏ Ｉｓｌａｎｄ、ＦＬ））からの広範宿主ベクターｐＢＨＲ１中にサブクローン化し、ウィスコンシン州ミドルタウンのルシジェン（Ｌｕｃｉｇｅｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｗｎ、ＷＩ））からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０Ｇ細胞中に電気穿孔した。５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地上で、生成したプラスミドｐＤＣＱ３３０を含有する形質転換体を選択した。
【０２２８】
三親交雑接合噛合によって、プラスミドｐＤＣＱ３３０をメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ中に転位した。ｐＲＫ２０１３（ＡＴＣＣ番号３７１５９）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヘルパー株、およびｐＤＣＱ３３０を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０Ｇ供与株をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地中で一晩生育させてＬＢ中で３回洗浄し、元の培養容積のほぼ６０倍の濃度に相当する容積のＬＢ中に再懸濁した。
【０２２９】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ株ＭＷＭ１０００（Δａｌｄ／ｃｒｔＮ１）は、天然Ｃ_３０カロテノイドの合成を中断させるａｌｄ／ｃｒｔＮ１遺伝子の単一クロスオーバーノックアウトを含有した（米国特許出願第６０／５２７０８３号）。国際公開第０２／１８６１７号パンフレットで述べられる一般条件を使用して、この（Δａｌｄ／ｃｒｔＮ１）株を受容体として生育させた。簡単に述べると、少なくとも８：１の気体／液体比を使用して（すなわち１６０ｍＬ総容積中の２０ｍＬの硝酸塩液体「ＢＴＺ−３」培地）、３０℃で絶えず振盪しながら、イリノイ州ウィートンのウィートン・サイエンティフィック（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、（Ｗｈｅａｔｏｎ、ＩＬ））からの血清ストッパーしたウィートンボトル内で、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ株ＭＷＭ１０００を生育させた。
【０２３０】
ここで「合成培地」または「ＢＴＺ−３」培地とも称される硝酸塩液体培地は、下に示す溶液１と混合された様々な塩（表４および５）から構成され、または規定の硝酸塩が１５ｍＭの塩化アンモニウムで置き換えられている。溶液１は、１００倍に濃縮された微量元素原液のための組成物を提供する。
【０２３１】
【表６】

【０２３２】
【表７】

【０２３３】
培養のための標準気相は、空気中に２５％のメタンを含有する。これらの条件下で、ＭＷＭ１０００受容体をＢＴＺ−３培地中で４８ｈ培養してＢＴＺ−３中で３回洗浄し、元の培養容積の１５０倍の濃度に相当する容積のＢＴＺ−３に再懸濁した。
【０２３４】
次に０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物を含有するＢＴＺ−３寒天プレートの表面で、供与体、ヘルパー、および受容細胞のペーストをそれぞれ１：１：２の比率で合わせた。プレートを２５％メタン内で１６〜７２ｈ、３０℃に維持して接合を生じさせ、その後細胞ペーストを収集してＢＴＺ−３に再懸濁した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＴＺ−３寒天に希釈物を播種して、２５％メタン内において３０℃で１週間まで培養した。黄色の接合完了体をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）含有ＢＴＺ−３寒天上に画線した。
【０２３５】
カロテノイド組成物の分析のために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する２５ｍＬのＢＴＺ−３中で接合完了体を培養し、唯一の炭素源として２５％のメタン内で３０℃で３〜４日間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、−２０℃で凍結した。解凍後ペレットを抽出し、実施例１で述べるようにして、ＨＰＬＣによってカロテノイド含量を分析した。
【０２３６】
ｐＤＣＱ３３０を含有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＭＷＭ１０００からの抽出物のＨＰＬＣ分析は、β−カロテンのほぼ排他的名生成を示した（図６）。１４ｍｉｎピークの滞留時間、ＵＶスペクトル、および分子重量は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）からのβ−カロテン標品に一致する。これによって、このメタノトローフ宿主内でのＤＣ４０４からのｃｒｔＥｉｄｉＹＩＢ遺伝子クラスターを利用したＣ_４０カロテノイドの合成が確証された。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】上流イソプレノイドおよび下流カロテノイド生合成経路を示す。
【図２】ＣｒｔＥ、ＣｒｔＸ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、およびＣｒｔＺによって触媒される具体的な化学転換を図示する、下流Ｃ_４０カロテノイド生合成経路の一部を示す。
【図３】パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株内に含有されるカロテノイドのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図４】コスミドｐＷＥＢ−４０４を含んでなる形質転換大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）内に含有されるカロテノイドのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図５】パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）（ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｄ９００８７）、パントエア・ステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ（ジェンバンク（登録商標）登録番号ＡＹ１６６７１３）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＥＨＯ−１０（ジェンバンク（登録商標）登録番号Ｍ８７２８０）、およびパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４のカロテノイド遺伝子クラスターの組成の比較を示す。
【図６】ｐＤＣＱ３３０を含有するメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ ＣｒｔＮ１⁻株からのカロテノイドのＨＰＬＣ分析を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを含んでなる、カロテノイド生合成経路酵素をコードする単離された核酸分子であって、ポリヌクレオチドの遺伝子構成がｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺであり、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子が記載順にクラスター化されており、ｃｒｔＺの転写がｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢとは反対方向に起きる、単離された核酸分子。
【請求項２】
カロテノイド生合成経路酵素の少なくとも１つが、配列番号２、４、６、８、１０、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１８に記載の配列を有する、請求項１に記載の単離された酸分子。
【請求項４】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、カロテノイド生合成経路酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号１、３、５、７、９、および１１よりなる群から選択される、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
ｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺ、遺伝子を含んでなる、配列番号１８に記載の単離された核酸分子、または配列番号１８と少なくとも９５％の同一性を有する単離された核酸分子であって、ポリペプチドｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺの全てをコードする単離された核酸分子。
【請求項７】
パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）ＤＣ４０４株から単離される、請求項１または４に記載の単離された核酸断片。
【請求項８】
請求項４に記載の単離された核酸分子によってコードされる、ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２、４、６、８、１０、および１２よりなる群から選択される、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較したときに、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも３０１アミノ酸のゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較したときに、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも３４９アミノ酸のイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号６に記載の配列を有するポリペプチドと比較したときに、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも３８９アミノ酸のリコペンシクラーゼをコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列番号８に記載の配列を有するポリペプチドと比較したときに、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも８２％の同一性を有する少なくとも４９２アミノ酸のフィトエンデサチュラーゼをコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１０に記載の配列を有するポリペプチドと比較したときに、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも３０８アミノ酸のフィトエンシンターゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項１５】
配列番号１２に記載の配列を有するポリペプチドと比較したときに、スミス−ウォーターマンのアライメント法に基づいて、少なくとも７３％の同一性を有する少なくとも１８５アミノ酸のβ−カロテン水酸化酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、
または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項１６】
適切な制御配列に作動的に結合された、請求項４または１０〜１５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項１７】
請求項６に記載の単離された核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項１９】
請求項６に記載の単離された核酸分子を含んでなる形質転換宿主。
【請求項２０】
宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシ
ェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メティロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）よりなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）適切なレベルのファルネシルピロリン酸、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、カロテノイド生合成経路酵素をコードする核酸分子
を含んでなる形質転換宿主細胞を提供し、
ここで、該分子の遺伝子構成がｃｒｔＥ−ｉｄｉ−ｃｒｔＹ−ｃｒｔＩ−ｃｒｔＢ−ｃｒｔＺであり、ｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺ遺伝子が記載順にクラスター化されており、ｃｒｔＺの転写がｃｒｔＥ、ｉｄｉ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢとは反対方向に起き、
（ｂ）適切な生育条件下でステップ（ａ）の宿主細胞を有効量の発酵性炭素基質に接触させ、これによってカロテノイド化合物が生成することを含んでなる、
カロテノイド化合物の製造方法。
【請求項２３】
（ａ）（ｉ）適切なレベルのファルネシルピロリン酸、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、配列番号２、４、６、８、１０、および１２よりなる群から選択される酵素をコードする一組の核酸分子
を含んでなる形質転換宿主細胞を提供し、
（ｂ）適切な生育条件下でステップ（ａ）の宿主細胞を有効量の発酵性炭素基質に接触させ、これによってカロテノイド化合物が生成すること
を含んでなるカロテノイド化合物の製造方法。
【請求項２４】
（ａ）（ｉ）適切なレベルのファルネシルピロリン酸、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、請求項６に記載の単離された核酸分子を含んでなる形質転換宿主細胞を提供し、
（ｂ）適切な生育条件下でステップ（ａ）の宿主細胞を有効量の発酵性炭素基質に接触させ、これによってカロテノイド化合物が生成すること
を含んでなるカロテノイド化合物の製造方法。
【請求項２５】
形質転換宿主細胞が、Ｃ１代謝宿主、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｃ１代謝宿主がメタノトローフであり、発酵性炭素基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン、メチル化チオール、および二酸化炭素よりなる群
から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｃ１代謝宿主が、
（ａ）メタンおよびメタノールよりなる群から選択されるＣ１炭素基質で生育し、
（ｂ）機能的エムデンマイヤーホフ炭素経路を含んでなり、前記経路がピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含んでなる、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｃ１代謝宿主細胞が、高生育メタノトローフ細菌株であり、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａとして知られており、ＡＴＣＣ称号ＰＴＡ ２４０２を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
形質転換宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロマイクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メティロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、およびファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）よりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
生成されたカロテノイド化合物が、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキシキサンチン、ジアトキサンチン、７,８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミキソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−ト
ルレン、ウリオリド、ウリオリドアセタート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、およびゼアキサンチンよりなる群から選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
カロテノイド生合成が生物体において改変されるように、生物体において配列番号１、３、５、７、９、１１、および１８よりなる群から選択される、少なくとも１つのカロテノイド生合成経路遺伝子を過剰発現することを含んでなる、生物体においてカロテノイド生合成を制御する方法。
【請求項３２】
前記カロテノイド遺伝子がマルチコピープラスミドで過剰発現される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記カロテノイド遺伝子が誘導可能プロモーターまたは調節プロモーターに作動的に結合する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記カロテノイド遺伝子がアンチセンス方向で発現される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記カロテノイド遺伝子がコード領域への外来性ＤＮＡの挿入によって中断される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
配列番号１６で示される１６ｓ ｒＤＮＡ配列を含んでなるＤＣ４０４株。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【公表番号】特表２００７−５１６６９７（Ｐ２００７−５１６６９７Ａ）
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３３７９５（Ｐ２００６−５３３７９５）
【出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９０３８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４４９７５
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ　ＰＯＮＴ　ＤＥ　ＮＥＭＯＵＲＳ　ＡＮＤ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】