カーボンナノチューブ膜の製造方法
【課題】ＣＮＴが均一に分散したＣＮＴ膜を得る。
【解決手段】ＣＮＴと、水溶性キシランのようなＣＮＴを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を混合して、ＣＮＴが溶解した溶液を作製する工程と、ガラス板などの細胞を培養するための基材の表面にＣＮＴが溶解した溶液を滴下等に供給して、基材表面に液層を形成する工程と、液層を残した状態で前記水系溶媒を蒸散し、溶液中のＣＮＴを析出させて、当該基材表面にＣＮＴを沈着させる工程と、前記基材表面を水で洗浄する工程とによって基材表面に含むＣＮＴ膜を有する細胞培養用の器具を得る。
【解決手段】ＣＮＴと、水溶性キシランのようなＣＮＴを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を混合して、ＣＮＴが溶解した溶液を作製する工程と、ガラス板などの細胞を培養するための基材の表面にＣＮＴが溶解した溶液を滴下等に供給して、基材表面に液層を形成する工程と、液層を残した状態で前記水系溶媒を蒸散し、溶液中のＣＮＴを析出させて、当該基材表面にＣＮＴを沈着させる工程と、前記基材表面を水で洗浄する工程とによって基材表面に含むＣＮＴ膜を有する細胞培養用の器具を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カーボンナノチューブ膜の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カーボンナノチューブ（以下「ＣＮＴ」と称する場合がある。）は、１原子の厚さの炭素原子でできたグラフェンシートが単層又は多層の同軸管状になったものである。ＣＮＴは、化学的、電子的及び力学的に優れた物理特性があることから樹脂や金属との複合材料として注目されている。また、近年では、医療分野や食品科学分野への応用も期待されており、ＣＮＴを利用した細胞培養用の担体や容器、さらにはこれを利用した細胞培養方法及び治療方法が提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１（特開２００９−１４４２１８号公報）には表面にＣＮＴ層を有する細胞培養容器が開示されている。この細胞培養容器は、細胞培養に用いられるガラス製ディッシュなどの各種基材表面にＣＮＴ層を有する。ＣＮＴ層の形成には、ＣＮＴを水又は水と炭素数が１〜４程度の低級アルコールとの混合溶媒に分散したＣＮＴ分散液が用いられ、当該分散液の塗布と乾燥の繰り返しによりＣＮＴ層が形成されている。このＣＮＴ層で覆われた細胞培養容器のＣＮＴ膜上で、マウス骨芽細胞（ＭＣＴ３−Ｅ１）、マウス骨髄間葉系幹細胞（ＳＴ２細胞）、ラット歯髄細胞（ＲＰＣ−Ｃ２Ａ）、口腔扁平上皮がん細胞（ＫＢ）、ヒト至急頚部類上皮がん細胞（ＨｅＬａ）、ヒト胎児上皮細胞（ＨＥ２９３）及びマウス胎児皮膚繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）を培養すると細胞増殖促進効果が認められた。
【０００４】
特許文献２（特開２００９−５０２２４２号公報）にはＣＮＴなどのナノ繊維を含むナノフィブリル構造体で覆われた細胞培養製品、移植片、インプラントなど、生体に適用される医療器具が開示されている。この細胞培養製品等は、表面にＣＮＴの分散・溶解液から生成したメッシュ様のネットワークを備え、当該ネットワークが少なくとも１種のペンダント型アミン含有基などを有するポリマーによってコーティングされている。この細胞培養製品等は細胞付着性が良好で、例えば褐色細胞腫由来株（ＰＣ１２）などでは、神経細胞への分化を促進する。
【０００５】
特許文献３（特表２００９−５０２３０８号公報）にはＣＮＴが分散した培養液中で細胞を培養したり、幹細胞治療剤と共にＣＮＴを体内に注入したりすることが提案されている。ここでは、ＣＮＴが幹細胞であるＰ１９ ＥＣ細胞や神経細胞であるＳＫ−ＮＳＨ細胞、星状膠細胞に結合することに着目し、in vivoにおいて、移植された細胞が被移植組織においてネットワークを形成する際の支持体として利用され、細胞増殖や分化を促進した。この結果、ＣＮＴがin vivoにおいて幹細胞の長期生存を助け、持続的な治療効果に寄与する。
【０００６】
特許文献４（特開２００５−１３７０５９号公報）には、ＣＮＴがフラーレンに結合した複合体と細胞外マトリックスからなる三次元培養担体が培養槽内に設置されたバイオリアクターが開示されている。この三次元培養担体は前記ＣＮＴとフラーレンの複合体と、コラーゲンやフィブリン、フィブロネクチンなど、動物組織中で細胞外にあって安定な生体構造の維持に係わるタンパク質との混合物である。このバイオリアクターにおいて、ヒト肝がん細胞（ＨｅｐＧ２やＦｏｒ−２）や間質細胞、また植物細胞など、広範囲の細胞の増殖が促進される。
【０００７】
特許文献５（特開２００６−５０２３０８号公報）には、ＣＮＴと樹脂の混合物を焼成して、樹脂を炭化させたカーボン複合体からなる細胞培養用担体が開示されている。この細胞培養用担体は表面の一部にＣＮＴが露出している。この担体を用いてリンパ芽球細胞（Ｍｏｌｔ−４）を培養すると増殖率が向上し、細胞の生存期間が伸長するだけでなく、培養した細胞は担体から容易に分離される。
【０００８】
特許文献６（特開２００５−２７０３９７号公報）には、ＣＮＴから人工気管や人工消化管を作成することが提案されている。
【０００９】
さらに、非特許文献１（F. WATARI, et al., "Proliferation of osteoblast cells on nanotubes", Front. Mater. Sci. China, 3(2009), 169-173）には、ＣＮＴなどのナノチューブ上でヒト骨肉腫由来骨芽細胞様株化細胞Saos2が増殖が促進されることが報告されている。非特許文献２（Michiko TERADA et al., "Development of a multiwalled carbon nanotube coated collagen dish", Dental Materials J, 28(2009), 82-88）には多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）をコラーゲンディッシュ上にコーティングした細胞培養容器が開示されている。この細胞培養容器では、マウス骨芽細胞様株化細胞MC3T3-E1がコラーゲン上に比べてよく接着し、増殖率は劣るものの増殖はすることが報告されている。
【００１０】
非特許文献３（Yuki Usui et al., "Carbon Nanotubes with High Bone-Tissue Compatibility and Bone-Formation Acceleration Effects", Small, 4(2008), 240-246）には、骨欠損部位に多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）でできたパーティクルを移植し、生体内において骨形成の促進効果を調べたところ、ＭＷＮＴパーティクルを骨膜下に移植した場合、ＭＷＮＴパーティクルを移植しなかった場合に比べて骨沈着がやや早くなることが報告されている。
【００１１】
非特許文献４（Mooney E, Dockery P, Greiser U, Murphy M, Barron V, Carbon nanotubes and mesenchymal stem cells: biocompatibility, proliferation and differentiation., Nano letters 8, 2137-2143, (2008)）には、単層ＣＮＴ（ＳＭＮＴ）又は多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）を添加した培養液中でヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を培養、および、ＳＷＮＴまたはＭＷＮＴを添加した分化誘導培養液中でｈＭＳＣを分化誘導したところ、骨分化誘導条件でもいずれも対照と比較的比べて同程度の骨分化しか見られなかったという結果が報告されている。
【００１２】
非特許文献５（Liu D et al., "Inhibition of proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells by carboxylated carbon nanotubes", ACS Nano, 4(2010), 2185-2195）には、培養液中にＳＭＮＴとＭＷＮＴを混合して、昆明マウス骨髄由来間葉系幹細胞を培養したところ、骨分化や細胞増殖を促進する効果はなく、むしろ骨分化や細胞増殖を阻害することが開示されている。
【００１３】
一方、非特許文献６（Oh S et al., "Stem cell fate dictated solely by altered nanotube dimension", Proc Natl Acad Sci U S A 106(2009), 2130-2135）、非特許文献７（McCullen SD et al., "Characterization of electrospun nanocomposite scaffolds and biocompatibility with adipose-derived human mesenchymal stem cells", Int J Nanomedicine, 2(2007), 253-263）、非特許文献８（Kaur G et al,, "Regulation of osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells on 2D nanorod substrates. Biomaterials", 31(2010),1732-1741）には、それぞれＣＮＴ以外のナノチューブ、例えば酸化チタンナノチューブ（非特許文献６）やエレクトスピニングにより得られたナノ組成物（非特許文献７）、タバコモザイクウイルスで作製されたナノロッド（非特許文献８）が、間葉系幹細胞の骨分化を促進することが報告されている。
【００１４】
上記のように、ＣＮＴが各種細胞の増殖を促進することやＣＮＴ以外のナノチューブが幹細胞の分化を促進するという事例は報告されているが、これまでのところ、特許文献２で開示された褐色細胞腫由来株（ＰＣ１２）から神経細胞への分化を除き、未だ生体外において、幹細胞の分化を制御する方法は細胞、特に幹細胞の分化を促進させる効果があったとの報告は見あたらず、ＣＮＴを利用して幹細胞の分化を制御する方法は確立されていない。
【００１５】
このような状況下において、特許文献７（特開２００６−６３３０７号公報）や特許文献８（国際公開公報ＷＯ２００７／８３７７１号）、特許文献９（特開２００７−２１５５４２号公報）には、ＣＮＴを均一に分散・溶解したＣＮＴ分散・溶解液及びそれを利用してＣＮＴ膜を形成する方法並びにそれを利用した成型品などが本願発明者らによって開示されている。
【００１６】
特許文献７には、ＣＮＴを環状グルカンの溶液に溶解したＣＮＴ溶液を、プラスチック製のフィルムやガラス板の表面に塗布して、当該表面にＣＮＴコーティング層を形成することが開示されている。また、当該ＣＮＴ溶液にポリマーを配合して成型品を製造することが開示されている。この溶液は高濃度のＣＮＴが安定かつ均一に溶解した水溶液であり、この溶液の利用が化粧品や医薬品などＣＮＴの利用用途を広げる。また、得られたコーティング層は導電性や透過性を有し、強度が高められた成型品が得られる。
【００１７】
また、特許公報８や９には、ＣＮＴを水溶性キシランの水溶液に溶解した溶液を、プラスチック製のフィルムやガラス板の表面に塗布して、当該表面にＣＮＴコーティング層を形成する方法や溶解液を乾燥してフィルムを製造することが開示されている。この溶液も、高濃度でかつ長期に亘って安定なＣＮＴの水溶液であって、当該溶液から透明性及び導電性に優れたＣＮＴコーティング層やフィルムが形成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００９−１４４２１８号公報
【特許文献２】特開２００９−５０２２４２号公報
【特許文献３】特表２００９−５０２３０８号公報
【特許文献４】特開２００５−１３７０５９号公報
【特許文献５】特開２００６−５０２３０８号公報
【特許文献６】特開２００５−２７０３９７号公報
【特許文献７】特開２００６−６３３０７号公報
【特許文献８】国際公開公報ＷＯ２００７／８３７７１号
【特許文献９】特開２００７−２１５５４２号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】F. WATARI, et al., "Proliferation of osteoblast cells on nanotubes", Front. Mater. Sci. China, 3(2009), 169-173
【非特許文献２】Michiko TERADA et al., "Development of a multiwalled carbon nanotube coated collagen dish", Dental Materials J, 28(2009), 82-88
【非特許文献３】Yuki Usui et al., "Carbon Nanotubes with High Bone-Tissue Compatibility and Bone-Formation Acceleration Effects", Small, 4(2008), 240-246
【非特許文献４】Mooney E, Dockery P, Greiser U, Murphy M, Barron V, Carbon nanotubes and mesenchymal stem cells: biocompatibility, proliferation and differentiation., Nano letters 8, 2137-2143, (2008)
【非特許文献５】Liu D et al., "Inhibition of proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells by carboxylated carbon nanotubes", ACS Nano, 4(2010), 2185-2195
【非特許文献６】Oh S et al., "Stem cell fate dictated solely by altered nanotube dimension", Proc Natl Acad Sci U S A 106(2009), 2130-2135
【非特許文献７】McCullen SD et al., "Characterization of electrospun nanocomposite scaffolds and biocompatibility with adipose-derived human mesenchymal stem cells", Int J Nanomedicine, 2(2007), 253-263
【非特許文献８】Kaur G et al,, "Regulation of osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells on 2D nanorod substrates. Biomaterials", 31(2010),1732-1741
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ところで、特許文献２におけるＣＮＴなどのナノ繊維を含むナノフィブリル構造体で覆われた細胞培養容器等は、幹細胞の分化の促進には有効である。当該ナノフィブリル構造体は、ＣＮＴのネットワークが当該ネットワークに結合させるペンダント型の反応性基とペンダント型アミンを含む官能基を有するポリマーであって、該ポリマーによってコーティングされたのが特許文献２の細胞培養容器等である。この容器の製造にはポリマーによるコーティング作業を要するので作業工程が煩雑となり、しかも均一な製品が得がたいという問題がある。
【００２１】
また、特許文献１における細胞培養容器は、水又は水とアルコールの混合液を用いているために、比較的簡便な作業で製造され得る。しかしながら、混合液の単回塗布により製造された細胞培養容器では十分な細胞増殖促進効果が得られず、複数塗布、好ましくは１０回以上塗布と乾燥を繰り返して製造する必要があり、やはり製造工程に過大な作業量を要することになっていた。
【００２２】
一方、本願発明者らの提案による特許文献７〜９による方法であれば、比較的高濃度のＣＮＴを安定に分散させることができるので、単回塗布によっても十分な量のＣＮＴを塗布できる利点がある。また、分散性も優れているので、単回塗布でも極めて薄いＣＮＴ膜を形成でき、安定した品質の細胞培養容器を得ることができる。
【００２３】
しかしながら、この細胞培養容器においては、水溶性の環状グルカンやグルクロノキシラン等の水溶性キシランの水溶液にＣＮＴを溶解した溶液を用いるので、得られたＣＮＴ膜中に可溶化剤である環状グルカンや水溶性キシランが残留する。このために、細胞の増殖や分化が阻害される懸念があった。
【００２４】
そこで、ＣＮＴ以外にポリマーや水溶性の可溶化剤を含まないＣＮＴ膜で覆われた細胞培養容器を簡単な製造工程によって製造できるので、細胞の増殖や分化を促進して好ましい効果が得られると考えられた。
【００２５】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、本発明の目的は、ポリマーや水溶性の可溶化剤を含まないＣＮＴ膜を基材表面に薄膜でコーティングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本願発明者らは、グルクロノキシラン等の水溶性キシラン溶液におけるＣＮＴの溶解特性に着目したところ、水溶性キシランの水溶液においては、水溶性キシランの濃度を高めていくとある濃度を境にしてＣＮＴの溶解度が急速に低下する現象を見いだした。そして、この現象を利用すれば細胞培養用の器具にほぼＣＮＴのみからなるＣＮＴ薄膜を形成することができ、可溶化剤等に影響を受けることなく、細胞の増殖を促進し、あるいは幹細胞を分化させることができるのではないかと考え、本願発明を想起した。
【００２７】
つまり、本発明のカーボンナノチューブ膜の製造方法は、基材表面にカーボンナノチューブ膜を製造する方法であって、カーボンナノチューブとカーボンナノチューブを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を含み、カーボンナノチューブが溶解された溶液を作製する工程と、前記溶液を前記基材表面に供給する工程と、前記供給された溶液の溶媒の蒸散により溶液中のカーボンナノチューブを析出させて、当該基材表面にカーボンナノチューブを付着させる工程と、前記カーボンナノチューブが付着した基材表面を水で洗浄する工程を含む。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、ＣＮＴ溶液の供給、溶媒の蒸散、水洗という簡単な工程でほぼＣＮＴのみからなる薄膜のＣＮＴ膜を細胞培養用の基材表面に形成できる。そして、このＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具は、各種細胞の増殖促進だけでなく、骨芽細胞の分化も促進する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性との関係を示す図である。
【図２】図２はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性との関係を示す図である。
【図３】図３はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図４】図４はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図５】図５はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図６】図６はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図７】図７はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図８】図８はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図９】図９はＣＮＴ（ＳＷＮＴ）膜のＡＦＭ観察による画像である。図９ＡはＣＮＴ膜の表面画像、図９Ｂは図９Ａに示された線上における断面画像である。
【図１０】図１０はＣＮＴ（ＭＷＮＴ）膜のＡＦＭ観察による画像である。図１０ＡはＣＮＴ膜の表面画像、図１０Ｂは図１０Ａに示された線上における断面高さを示す画像である。
【図１１】図１１は市販品ディッシュにおけるＣＮＴ膜のＡＦＭ観察による画像である。図１１ＡはＣＮＴ膜の表面画像、図１１Ｂは図１１Ａに示された線上における断面高さを示す画像、図１１Ｃは図１１Ａに示された線上における断面高さを示す画像である。
【図１２】図１２はＣＮＴ膜におけるＧＸの残留性を調べるためのチャートである。
【図１３】図１３は培養されたＨＯＳ細胞の増殖を示す図である。図１３Ａは培養開始１日目の細胞数を示す図、図１３Ｂは培養開始３日目の細胞数を示す図、図１３Ｃは培養開始１日目から３日目の細胞増殖率を示す図である。
【図１４】図１４は培養されたＨＯＳ細胞の顕微鏡画像である。
【図１５】図１５はＰＬＯ上で培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像である。図１５Ａは細胞表面の拡大画像、図１５Ｂは図１５Ａに示された線上における断面高さを示す画像である。
【図１６】図１６はＣＮＴ（ＳＷＮＴ）膜上で培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像である。図１６Ａは培養面の表面画像、図１６Ｂは細胞表面の拡大画像、図１６Ｃは図１６Ｂに示された線上における断面高さを示す図である。
【図１７】図１７はＣＮＴ（ＭＷＮＴ）膜上で培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像である。図１７Ａは培養面の表面画像、図１７Ｂは細胞表面の拡大画像、図１７Ｃは図１７Ｂに示された線上における断面高さを示す図である。
【図１８】図１８は培養されたＨＯＳ細胞（１０％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像であって、各列とも上段の画像は細胞表面の画像、下段の画像は上段の画像に示された線上における断面高さを示す図である。
【図１９】図１９は培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）の蛍光顕微鏡観察による画像である。各列とも上段の画像はアクチンフィラメントの観察画像、中段の画像はビンキュリンの観察画像、下段は両者を同時に観察した際の画像である。
【図２０】図２０は培養されたＨＯＳ細胞（１０％ＦＢＳ培地）の多重蛍光顕微鏡観察による画像である。各列とも上段はアクチンフィラメントの観察画像、中段はビンキュリンの観察画像、下段は両者を同時に観察した際の画像である。
【図２１】図２１は培養されたｒＭＳＣの顕微鏡画像である。各列それぞれ上段の画像は培養開始３日目の観察画像、中段の画像は同１週間目の観察画像、下段の画像は同３週間目の観察画像である。
【図２２】図２２はＡＬＰ染色されたｒＭＳＣの顕微鏡画像である。図２２ＡはＰＬＯ上において培養されたｒＭＳＣの画像、図２２ＢはＣＮＴ（ＳＷＮＴ）膜上において培養されたｒＭＳＣの画像、図２３ＣはＣＮＴ（ＭＷＮＴ）膜上において培養されたｒＭＳＣの画像である。
【図２３】図２３は培養されたｒＭＳＣにおけるＡＬＰ活性量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明のＣＮＴ膜の製造方法は、基材表面にＣＮＴ膜を製造する方法であって、ＣＮＴとＣＮＴを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を含み、ＣＮＴが溶解された溶液を作製する工程と、前記溶液を前記基材表面に供給する工程と、前記供給された溶液の溶媒の蒸散により溶液中のＣＮＴを析出させて、当該基材表面にＣＮＴを付着させる工程と、前記ＣＮＴが付着した基材表面を水で洗浄する工程を含む。
【００３１】
本発明は、水溶性キシランの水溶液において、水溶液の温度を一定にした状態で、水溶性キシランの濃度を高めると当該溶液に可溶化するＣＮＴ量が、ある水溶性キシラン濃度を境にして減少するという事象に基づいて想起された発明である。
【００３２】
図１はＣＮＴを水溶性キシランの１つであるグルコノキシラン（以下「ＧＸ」ということがある。）の水溶液に溶解した場合の水溶性キシラン濃度とＣＮＴの溶解度との関係を示す図である（実施例１参照）。図１において、ＣＮＴの溶解度は相対吸光度として示されている。ＣＮＴはＧＸの水溶液に高濃度で安定かつ均一に溶解することが知られている（例えば、特許文献８や９参照）。このとき、図１に示すように、ＧＸ濃度が高まるにつれＣＮＴを溶解した溶液の吸光度は徐々に高まるが、ＧＸ濃度がある濃度（以下、「変曲点濃度」という場合がある。）以上になるとＣＮＴを溶解した溶液の吸光度は低下することが本発明者らのその後の研究により見いだされた。例えば、図１の場合、超音波ホモジナイザーによって溶解した場合、変曲点濃度は約０.２％（約２ｍｇ／ｍｌ）である。このことは、ＣＮＴを溶解したＧＸ水溶液中のＧＸ濃度が変曲点濃度よりも高くなると、ＧＸが析出しない状態でＣＮＴのみが析出し得ることを意味する。すなわち、ＣＮＴが溶解したＧＸの水溶液を、ＣＮＴ膜を形成しようとする基材表面に供給する。その後、供給された溶液から溶媒を蒸散させると、供給された溶液中におけるＧＸの濃度が高まりＣＮＴが基材表面に析出して付着する。この付着したＣＮＴが、ＣＮＴ分子の一部において重なりあったネットワークを形成し、基材表面にＣＮＴ膜として出現する。こうして得られたＣＮＴ膜を含む膜を水洗すると、ＧＸが、基材表面に付着せずに基材表面に析出したＣＮＴと一緒に洗い流され、基材表面にＣＮＴ膜が残る。なお、本発明において、ＣＮＴ分子とは、グラフェンシートが単層又は多層の同軸管状になったチューブ体の１本を意味する。
【００３３】
本発明のＣＮＴ膜は、顕微鏡観察した場合に、露出した基材表面が全く観察されない場合のみならず、露出した一部基材表面が観察される場合も含む。
【００３４】
得られたＣＮＴ膜では、ＣＮＴ分子が会合することなく１本１本のチューブとして存在している。また、ＣＮＴの膜は、均質に溶解したＣＮＴの溶液から析出したＣＮＴから形成されたものであるので、低濃度のＣＮＴ溶液からＣＮＴ膜を形成した場合には、ＣＮＴが一部において重なり合っただけの薄層のＣＮＴの膜が形成されうる（図９や図１０参照）。この点、特許文献１ではＣＮＴの分散液からコーティング膜が形成されているので、ＣＮＴが局在化しやすく、ＣＮＴのネットワークが十分に形成されないだけでなく、コーティング膜はＣＮＴが会合した状態で存在することが懸念される（特許文献１参照）。
【００３５】
（１）ＣＮＴ溶液の調製
本発明においては、まず、ＣＮＴと当該ＣＮＴを可溶化する水溶性の可溶化剤を含む水系溶液が調製される。本発明において、ＣＮＴは単層ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）又は多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）であり得る。
【００３６】
（１．ＣＮＴ）
ＣＮＴは、炭素の同素体であり、複数の炭素原子が結合して筒状に並んだものである。ＣＮＴとしては、任意のＣＮＴを用いることができる。ＣＮＴの例としては、単層ＣＮＴ及び多層ＣＮＴ、及びこれらがコイル状になったものが挙げられる。単層ＣＮＴは、グラファイトシートが一重で筒状になったものであり、多層ＣＮＴは、グラファイトシートが２層以上同心円状に重なったものである。本発明で用いられるＣＮＴは、多層ＣＮＴでも単層ＣＮＴでもよいが、より好ましくは単層ＣＮＴである。ＣＮＴの片側が閉じた形をしたカーボンナノホーン、その頭部に穴があいたコップ型のナノカーボン物質、両側に穴があいたＣＮＴなども用いることができる。
【００３７】
ＣＮＴは、任意の直径（外径）のものが使用される。ＣＮＴの直径は好ましくは約０.４ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.５ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.６ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約１.０ｎｍ以上であり、最も好ましくは約１.２ｎｍ以上である。ＣＮＴの直径は好ましくは約１００ｎｍ以下であり、より好ましくは約６０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約４０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約３０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約２０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約１０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約４ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約３ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約２ｎｍ以下であり、最も好ましくは約１.５ｎｍ以下である。
【００３８】
単層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約０.４ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.５ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.６ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約１.０ｎｍ以上であり、最も好ましくは約１.２ｎｍ以上である。単層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約５ｎｍ以下であり、より好ましくは約４ｎｍ以下であり、より好ましくは約３ｎｍ以下であり、より好ましくは約２ｎｍ以下であり、最も好ましくは約１.５ｎｍ以下である。
【００３９】
多層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約１ｎｍ以上であり、より好ましくは約２ｎｍ以上であり、より好ましくは約３ｎｍ以上であり、より好ましくは約４ｎｍ以上であり、より好ましくは約５ｎｍ以上であり、より好ましくは約１０ｎｍ以上であり、より好ましくは約２０ｎｍ以上であり、より好ましくは約３０ｎｍ以上であり、より好ましくは約４０ｎｍ以上であり、最も好ましくは約６０ｎｍ以上である。多層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約１００ｎｍ以下であり、より好ましくは約６０ｎｍ以下であり、より好ましくは約４０ｎｍ以下であり、より好ましくは約３０ｎｍ以下であり、より好ましくは約２０ｎｍ以下であり、最も好ましくは約１０ｎｍ以下である。本明細書中で、多層ナノチューブについて直径という場合、最も外側のＣＮＴの直径をいう。
【００４０】
ＣＮＴは、任意の長さ（すなわち、軸方向長さ）のものであり得る。ＣＮＴの長さは、好ましくは約０.６マイクロメートル以上であり、より好ましくは約１マイクロメートル以上であり、さらに好ましくは約２マイクロメートル以上であり、最も好ましくは約３マイクロメートル以上である。ＣＮＴの長さは、好ましくは約１０００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約５００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約２００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約１００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約５０マイクロメートル以下であり、より好ましくは約２０マイクロメートル以下であり、より好ましくは約１５マイクロメートル以下であり、さらに好ましくは約１０マイクロメートル以下であり、最も好ましくは約５マイクロメートル以下である。
【００４１】
本発明に用いられるＣＮＴは、市販のものであっても、当該分野で公知の任意の方法によって製造されてもよい。ＣＮＴは例えば、シンセンナノテクポート社（Shenzhen Nanotech Port Co., Ltd.）、CARBON NANOTECHNOLOGIES INC.、SES RESEARCH、昭和電工社などから販売されている。
【００４２】
ＣＮＴの製造方法の例としては、二酸化炭素の接触水素還元法、アーク放電法（例えば、C．Journetら、Nature（ロンドン）, 388（1997）, p.756を参照）、レーザー蒸発法（例えば、A. G. Rinzlerら、Appl. Phys. A, 1998, 67, p.29を参照）、ＣＶＤ法、気相成長法、一酸化炭素を高温高圧化で鉄触媒と共に反応させて気相で成長させるＨｉＰｃｏ法（例えば、P. Nikolaevら、Chem. Phys. Lett., 1999, 313, p.91を参照）などが挙げられる。
【００４３】
ＣＮＴは、洗浄、遠心分離、ろ過、酸化、クロマトグラフィーなどによって精製されたものであっても、未精製のものであってもよい。精製されたものであることが好ましい。用いられるＣＮＴの純度は、任意であり得るが、好ましくは約５％以上、より好ましくは約１０％以上、さらに好ましくは約２０％以上、さらに好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約４０％以上、さらに好ましくは約５０％以上、さらに好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上である。ＣＮＴの純度が高いほど、特有の機能が発現されやすい。なお、本明細書中でＣＮＴの純度という場合、特定の分子量の１種類のＣＮＴとしての純度ではなく、ＣＮＴ全体としての純度をいう。すなわち、ＣＮＴ粉末がＡという特定の分子量のＣＮＴ３０重量％と、Ｂという特定の分子量のＣＮＴ７０重量％とからなっている場合、この粉末の純度は１００％である。もちろん、用いられるＣＮＴは、特定の直径、特定の長さ、特定の構造（単層か多層か）などについて選択されたものであってもよい。
【００４４】
本発明に用いられるＣＮＴは、ボールミル、振動ミル、サンドミル、ロールミルなどのボール型混練装置等を用いて粉砕したもの、又は化学的処理もしくは物理的処理によって短く切断されたものであってもよい。
【００４５】
（２．可溶化剤）
本発明の可溶化剤はＣＮＴを水系溶媒に可溶化する任意の物質である。本発明において可溶化とは、難溶性又は不溶性であった物質が可溶性になるか若しくは可溶性物質と同様の挙動をするようになることを言う。ＣＮＴが溶液中に均質に溶解していることは、ＣＮＴ溶液を約７,０００ｇで５〜３０分間の遠心分離して沈殿が生じなければ溶解していると言える。また、ＣＮＴ溶液中のＣＮＴを遠心分離などにより回収し、溶媒で洗浄して回収物中に存在する可溶化剤を除いた後、原子間力顕微鏡を用いて確認することもできる。
【００４６】
本発明における可溶化剤として、当該可溶化剤の溶液にＣＮＴを溶解した場合に、図１に示すように、低濃度から高濃度に可溶化剤の濃度を高めると、当該可溶化剤の溶液におけるＣＮＴの溶解度がある濃度（「変曲点濃度」と言う場合がある。）を境に減少するという挙動を示す物資が好ましく用いられる。本発明の製造方法は、可溶化剤の濃度を高めることによって可溶化剤の溶液に溶解しているＣＮＴを析出させ、ＣＮＴ膜を形成させるものである。従って、変曲点濃度よりも高い可溶化剤濃度におけるＣＮＴの濃度が変曲点濃度におけるＣＮＴの濃度よりも小さくなればよい。また、変曲点濃度よりも低い可溶化剤濃度におけるＣＮＴの溶解性の変化はどのような変化であってもよく、変曲点濃度に向かって次第に高くなる場合（例えば図１参照）や変曲点濃度よりも低い濃度ではほとんど変化しない場合でもよい。また、変曲点濃度におけるＣＮＴの濃度と、変曲点濃度よりも高濃度におけるＣＮＴの濃度差が大きくなる物質がより好ましい。この点において、ＣＮＴが分散した溶液から塗膜を形成し、溶媒を蒸散させて製造したＣＮＴ膜とは異なる。
【００４７】
本発明における可溶剤として、特許文献８や９に示された水溶性キシランが例示される。以下においては、可溶化剤として水溶性キシランを用いた例について説明する。本明細書において「キシラン」とは、β−１，４結合によって連結された２以上のキシロース残基を含む分子をいう。本明細書中では、キシロース残基のみから構成される分子（すなわち、純粋なキシロースポリマー）に加えて、それらの修飾された分子、及びアラビノース残基などの他の残基が純粋なキシロースポリマーに結合した分子をも「キシラン」という。純粋なキシロースポリマーは、重合度５までは６ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水に溶解する。しかし、重合度６以上では水への溶解度は６ｍｇ／ｍＬ未満である。
【００４８】
本発明では上記キシランの中でも水溶性キシランが用いられる。本明細書において水溶性キシランとは、β−１，４結合によって連結された６以上のキシロース残基を含む分子であって、２０℃の水に６ｍｇ／ｍＬ以上溶解する分子をいう。水溶性キシランは、純粋なキシロースポリマーではなく、キシロースポリマー中の少なくとも一部の水酸基が他の置換基（例えば、アセチル基、グルクロン酸残基、アラビノース残基など）に置き換わっている分子である。キシロース残基のみからなるキシランの水酸基が他の置換基に置き換わることにより、キシロース残基のみからなるキシランよりも水溶性が高くなることがある。キシロース残基のみからなるキシランの水酸基が他の置換基に置き換わっている分子は、キシロースポリマーに置換基が結合した分子、又は修飾されたキシロースポリマーということもできる。なお、修飾されたキシロースポリマーは、人為的操作によって製造された分子だけでなく、天然に存在する分子をも含む。
【００４９】
水溶性キシランは、その主鎖にキシロース残基又はその修飾物のみを含むことが好ましく、その主鎖にキシロース残基又はアセチル化キシロース残基のみを含むことがより好ましい。本明細書中において、主鎖とは、β−１，４−結合によって連結された最も長い鎖をいう。水溶性キシロースが直鎖状である場合、その分子自体が主鎖であり、水溶性キシロースが分枝状である場合、β−１，４−結合によって連結された最も長い鎖が主鎖である。本発明で用いられる水溶性キシランの主鎖の平均重合度数は、好ましくは約６以上であり、より好ましくは約７以上であり、さらに好ましくは約８以上であり、特に好ましくは約９以上であり、最も好ましくは約１０以上である。本発明で用いられる水溶性キシランの主鎖の平均重合度数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約５００以下であり、特に好ましくは約１００以下であり、最も好ましくは約５０以下である。水溶性キシランの主鎖の平均重合度数が高すぎると水溶性が低すぎる場合がある。
【００５０】
キシロース残基を修飾する親水基は、キシロース残基の１位、２位、３位又は４位のいずれの位置においても結合し得る。１つのキシロース残基に対する親水基の結合箇所は、４箇所の全てであり得るが、３箇所以下が好ましく、２箇所以下がより好ましく、１箇所であることが最も好ましい。親水基は、キシロースポリマーの全てのキシロース残基に結合していてもよいが、好ましくは一部のキシロース残基にのみ結合している。親水基の結合の割合は、好ましくはキシロース残基１０個あたり１個以上であり、より好ましくはキシロース残基１０個あたり２個以上であり、さらに好ましくはキシロース残基１０個あたり３個以上であり、特に好ましくはキシロース残基１０個あたり４個以上であり、最も好ましくはキシロース残基１０個あたり５個以上である。親水基の例としては、アセチル基、α−Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基、Ｌ−アラビノフラノース残基が挙げられる。
【００５１】
キシロースポリマーに４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基及びアセチル基が結合したものは、一般に、グルクロノキシラン（本明細書では「狭義のグルクロノキシラン」と言う。）と呼ばれる。キシロースポリマーにアラビノース残基及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸が結合したものは、一般に、アラビノグルクロノキシランと呼ばれる。本発明における「グルクロノキシラン」は、シロースポリマーに４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基及びアセチル基が結合した狭義のグルクロノキシランやキシロースポリマーにアラビノース残基及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸が結合した狭義のアラビノグルクロノキシランに限定されず、キシロースポリマーにグルクロン酸残基又はグルクロン酸残基が有する水酸基の一部又は全部がメチル基等の修飾基で修飾されたグルクロン酸残基が結合した分子を包含する。
【００５２】
また、本発明では、キシロース残基の２位に他の糖残基が結合している水溶性キシランが好ましく用いられる。この水溶性キシランにおいて、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と他の糖残基との割合は、他の糖残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が２０モル以下であることが好ましく、１０モル以下であることがより好ましく、６モル以下であることがさらに好ましい。キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と他の糖残基との割合は、他の糖残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が１モル以上であることが好ましく、２モル以上であることがより好ましく、５モル以上であることがさらに好ましい。
【００５３】
また、本発明では、キシロース残基の２位に４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基がα−１，２−結合している水溶性のキシランが好ましく用いられる。この水溶性キシランにおいて、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基との割合は、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が１００モル以下であることが好ましく、５０モル以下であることがより好ましく、２０モル以下であることがさらに好ましい。キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基との割合は、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が１モル以上であることが好ましく、５モル以上であることがより好ましく、９モル以上であることがより好ましく、１０モル以上であることがより好ましく、１４モル以上であることがさらに好ましい。
【００５４】
水溶性キシランの数平均分子量は、好ましくは約１００万以下であり、より好ましくは約５０万以下であり、さらにより好ましくは約１０万以下であり、特に好ましくは約５万以下であり、最も好ましくは約２万以下である。水溶性キシランの数平均分子量は、好ましくは約１５００以上であり、より好ましくは約２０００以上であり、さらにより好ましくは約４０００以上であり、特に好ましくは約５０００以上であり、格別好ましくは約６０００以上であり、最も好ましくは約１万以上である。
【００５５】
本発明で用いられる好適な水溶性キシランは、好ましくは木本性植物由来である。水溶性キシランは、植物の細胞壁部分に多く含まれる。木材は特に、水溶性キシランを多く含む。水溶性キシランの構造は、由来する植物の種類に依存して様々である。広葉樹の木材に含まれるヘミセルロースの主成分は狭義のグルクロノキシランであることが公知である。広葉樹に含まれる狭義のグルクロノキシランは、キシロース残基１０：４−Ｏ−メチルグルクロン酸１：アセチル基６の割合で構成されることが多い。広葉樹のヘミセルロースは本発明で用いられる水溶性キシランを多く含む。広葉樹由来の水溶性キシランは、アラビノース残基をほとんど含まないため特に好適である。一方、針葉樹の木材に含まれるヘミセルロースの主成分はグルコマンナンであり、針葉樹の木材はまた狭義のグルクロノキシランや狭義のアラビノグルクロノキシランも含むことが公知である。なお、グルコマンナンは主鎖がマンノース残基とグルコース残基とから構成されており、その比は一般に、マンノース残基３〜４：グルコース残基１である。従って、本発明で用いられる水溶性キシランはより好ましくは広葉樹由来であり、より好ましくはブナ、カバ、アスペン、ニレ、ビーチ又はオーク由来である。
【００５６】
天然に存する水溶性キシランは、異なる分子量を有する種々の分子の混合物である。天然由来の水溶性キシランは、その効果を発揮し得る限り、夾雑物を含んだ状態で使用されてもよく、広い分子量分布を有する集団として使用されてもよく、より狭い分子量分布を有する集団になるように、より高純度に精製されてから使用されてもよい。
【００５７】
少量ではあるが、針葉樹、トウモロコシ、イネ、麦などのイネ科の草本植物などにも水溶性キシランは含まれる。これら由来の水溶性キシランは、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基以外に、α−Ｌ−アラビノース残基がキシロース残基に共有結合している。α−Ｌ−アラビノース残基の含量が高すぎるとＣＮＴの可溶化効果が得られない場合があるので、α−Ｌ−アラビノース残基の含量が高いキシランは本発明における使用には好適ではない。穀類（麦、米）、熊笹などの草本性植物から抽出されるヘミセルロースは、キシロース、４−Ｏ−メチルグルクロン酸及びアラビノースから主になるアラビノグルクロノキシランであり、アラビノースの含量が高い。これらの草本性植物由来の水溶性キシランは、水溶性を高めるために一部又は全部のＬ−アラビノース残基を除去することが望まれる。Ｌ−アラビノース残基は、化学的方法又は酵素的方法などの公知の方法によって除去され得る。
【００５８】
本発明では、水溶性キシランが、キシロース残基又はアセチル化キシロース残基と、アラビノース残基と４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基とからなることが好ましい。この実施態様において、水溶性キシラン中のＬ−アラビノース残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約７以上であり、より好ましくは約１０以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。また、この実施態様において、水溶性キシラン中のＬ−アラビノース残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約６０以下であり、さらに好ましくは約４０以下である。
【００５９】
前記の水溶性キシランにおいては、キシロース残基とＬ−アラビノース残基との割合は、Ｌ−アラビノース残基１モルに対し、キシロース残基が７モル以上であることが好ましく、１０モル以上であることがより好ましく、２０モル以上であることがさらに好ましい。Ｌ−アラビノース残基１モルに対するキシロース残基の比に上限はなく、Ｌ−アラビノース残基１モルに対して、キシロース残基は例えば、１００残基以下、６０残基以下、４０残基以下などである。
【００６０】
本発明の特に好ましい実施態様では、水溶性キシランは好ましくはＬ−アラビノース残基を含まない。当該水溶性キシランは、キシロース残基又はアセチル化キシロース残基と４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基とからなる。この実施形態において、水溶性キシラン中の４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約１以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約９以上であり、さらに好ましくは約１０以上であり、さらにより好ましくは約１４以上である。この実施形態において、水溶性キシラン中の４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約５０以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。本発明のさらに望ましい実施態様では、水溶性キシランはアセチル化キシロース残基を含まない。
【００６１】
水溶性キシランは、例えば木材から、公知の方法に従って精製される。水溶性キシランの精製方法としては、例えば、脱リグニン処理した木材を原料として、１０％程度の水酸化カリウム溶液で抽出する方法などが挙げられる。水溶性キシランはまた、木材から製造された粉末セルロースを水に分散し、この溶液を濾紙、０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルターで順次濾過して得られる濾液を乾燥することによっても得られる。例えば、特許文献８の調整例１に記載された水溶性キシランの製造方法がある。
【００６２】
（３．溶媒）
本発明で用いられる溶媒は、可溶化剤が溶解しうる溶媒であり、より好ましくは可溶化剤が室温（約２０℃）で１リットルあたり約１０ｇ以上溶解できる溶媒である。このような溶媒は水系溶媒であり、水及び水と混和性のある任意の有機溶媒である。本発明で用いられる水系溶媒は、より好ましくは水又は水と当該有機溶媒との混液であり、最も好ましくは水である。有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、γ−ブチルラクトン、プロピレンカーボネート、スルホラン、ニトロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、Ｎ−メチルピロリドン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタンが挙げられる。
【００６３】
水と有機溶媒とを混合する場合、溶媒全体のうちの水の割合は、約５０容積％以上であることが好ましく、約６０容積％以上であることが好ましく、約７０容積％以上であることが好ましく、約８０容積％以上であることが好ましく、約９０容積％以上であることが好ましく、約９５容積％以上であることが最も好ましい。水と混合される有機溶媒は、１種類であっても２種類以上であってもよい。環境への影響及び人体への影響などを考慮すると、溶媒は水であるか又は主に水からなること、つまり、溶媒の約８０容積％以上が水である溶媒が好ましい。
【００６４】
溶媒に可溶化剤、例えば水溶性キシランを添加して、可溶化剤の溶液を作製し得る。可溶化剤溶液中の可溶化剤の濃度は、可溶化剤が溶解し得る限り、任意に設定され得る。本発明においては、ＣＮＴを可溶化する最大の濃度、つまり変曲点濃度又はその近傍が選択される。可溶化剤溶液中の可溶化剤の濃度を変曲点濃度の近傍に調整することで、多量のＣＮＴを溶解させることができる。また、この濃度よりも極端に高い濃度や極端に低い濃度は好ましくない。ＣＮＴ溶液の作製時におけるＣＮＴの溶解度と、溶媒の蒸散により可溶化剤の濃度が高くなった際におけるＣＮＴの溶解度との差が小さく、ＣＮＴ膜の形成が不十分になる場合がある。
【００６５】
可能化剤の濃度は、可溶化剤の種類によっても異なるが、例えば０.０１重量％以上であり、好ましくは０.０５重量％以上であり、好ましくは０.１重量％以上であり、好ましくは１重量％以上、好ましくは２重量％以上、さらには５重量％以上である。また、可溶化剤の濃度は１０重量％以下であり、好ましくは５重量％以下であり、好ましくは２重量％以下であり、さらには１重量％以下である。また、可溶化剤として水溶性キシランを用いる場合は、水溶性キシラン溶液中の水溶性キシランの濃度は、好ましくは０.０５重量％以上であり、より好ましくは０.１重量％以上であり、より好ましくは０.２重量％以上である。溶液中の水溶性キシランの濃度は、好ましくは５重量％以下であり、好ましくは２重量％以下であり、好ましくは１.５重量％以下であり、より好ましくは１重量％以下、さらに好ましくは０.５重量％以下である。例えば、０.０５重量以上１重量％以下、好ましい場合では０.０５重量％以上０.５重量％以下の濃度範囲となる量であることが好ましい。最も好ましいのは、ＣＮＴの溶解量が最も高くなる濃度である。
【００６６】
（４．ＣＮＴ溶液の調製）
次いで、可溶化剤を含む混合液に、ＣＮＴを添加してＣＮＴの溶液を得る。添加するＣＮＴは、粉末の形態であることが好ましい。また、水溶性キシランとＣＮＴとを予め混合した後、これに溶媒を添加することによってＣＮＴ溶液を得てもよい。また、他の機械的手段によって充分に混合してもよい。
【００６７】
添加されるＣＮＴの量は任意に設定され得る。また、その量は、可溶化剤、例えば水溶性キシランの溶液に飽和するＣＮＴの量が最も好ましく、その量以下の量でもよい。また、その量以上の添加量であってもよい。溶解せずに溶液に分散しているＣＮＴは、例えば遠心分離により除去されうるからであり、溶液の上清を供給すればよいからである。添加されるＣＮＴの量は、例えば、溶液１００重量部に対して０.１重量部以上、０.２重量部以上、０.５重量部以上、１重量部以上、又は５重量部以上であり得る。添加されるＣＮＴの量は、例えば、溶液１００重量部に対して１０重量部以下、７.５重量部以下、５重量部以下、３重量部以下、は約１重量部以下であり得る。
【００６８】
次いで、例えば溶媒との混合物に超音波を投射することにより該ＣＮＴを溶解させる。超音波を投射する方法は、水溶性キシラン溶液にＣＮＴを均一に溶解させ得る方法である限り、その超音波の投射方法、周波数、時間などの条件は特に限定されるものではない。超音波を投射する際の温度及び圧力も、水溶性キシラン及びＣＮＴを含む溶液が、液体状態を保つ条件であればよい。例えば、水溶性キシラン及びＣＮＴを含む溶液をガラス容器に入れ、バス型ソニケーターや超音波ホモジナイザーを使用して、室温で超音波を投射することが行われる。超音波ホモジナイザーは、溶液に超音波振動を加えた際に生じるキャビテーションを利用して、溶液中の物質に激しい衝撃を加える装置である。キャビテーションとは、加えられた超音波振動が圧力波となり、溶液の中での局所的な圧力低下により形成される無数の極めて小さな気泡が連続してつぶれることであり、圧力波のサイクルが負のときに形成された気泡が、正のときにつぶれ、溶液中の物質に激しい衝撃を繰り返し与える。超音波ホモジナイザーは発振面が円錐形になったホーンを有しており、溶液に漬けたホーンの先端から投射された振動エネルギーが溶液を入れたカップの中央に集中し、強い衝撃が与えられる。ＣＮＴの溶解性を高めるには超音波ホモジナイザーがより好ましい。溶液のゼータ電位を測定した結果によると、超音波ホモジナイザーを用いるとゼータ電位が低くなる傾向にあり、ＣＮＴの会合が緩和されやすく、水溶性キシラン溶液への溶解性が上がるからである。
【００６９】
超音波発振機における定格出力は、超音波発振機の単位底面積当たり約０.１ワット／ｃｍ２以上が好ましく、約０.２ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約０.３ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約１０ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約５０ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約１００ワット／ｃｍ２以上が最も好ましい。超音波発振機における定格出力は、超音波発振機の単位底面積当たり約１５００ワット／ｃｍ２以下が好ましく、約７５０ワット／ｃｍ２以下がより好ましく、約５００ワット／ｃｍ２以下がより好ましく、約３００ワット／ｃｍ２以下が最も好ましい。発振周波数は約１０ＫＨｚ以上が好ましく、約１５ＫＨｚ以上がより好ましく、約２０ＫＨｚ以上が最も好ましい。発振周波数は２０から５０ＫＨｚの範囲で使用することが好ましい。振幅は、約２０μｍ以上であることが好ましく、約３０μｍ以上であることが最も好ましい。振幅は、約４０μｍ以下であることが好ましい。また、超音波投射処理の時間は約１分間〜約３時間が好ましく、より好ましくは約３分間〜約３０分間である。超音波を投射する際又はその前後に、ボルテックスミキサー、ホモジナイザー、スパイラルミキサー、プラネタリーミキサー、ディスパーサー、ハイブリットミキサーなどの撹拌装置を用いてもよい。混合物の温度は、ＣＮＴが分解又は変質せず、溶媒が揮発しすぎない温度であれば任意の温度であり得る。例えば、約５℃以上であり、好ましくは約１０℃以上であり、さらに好ましくは約１５℃以上であり、さらに好ましくは約２０℃以上であり、最も好ましくは約２５℃以上である。混合物の温度は、例えば、約１００℃以下であり、好ましくは約９０℃以下であり、さらに好ましくは約８０℃以下であり、さらに好ましくは約７０℃以下であり、最も好ましくは約６０℃以下である。もっとも、ＣＮＴが可溶化剤の溶液に溶解される限り、超音波の投射による方法に限らず、攪拌など機械的な手段によってもよい。
【００７０】
溶液中のＣＮＴの濃度は、ＣＮＴが溶解可能である限り、任意に設定され得る。溶液中のＣＮＴの濃度は、好ましくは３０ｍｇ／Ｌ（約０.００３重量％）以上であり、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ（約０.００５重量％）以上であり、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ（約０.０１重量％）以上であり、さらに好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ（約０.０１５重量％）以上であり、さらに好ましくは３００ｍｇ／Ｌ（約０.０３重量％）以上であり、さらに好ましくは４００ｍｇ／Ｌ（約０.０４重量％）以上であり、さらに好ましくは５００ｍｇ／Ｌ（約０.０５重量％）以上であり、さらに好ましくは６００ｍｇ／Ｌ（約０.０６重量％）以上であり、さらに好ましくは７００ｍｇ／Ｌ（約０.０７重量％）以上であり、最も好ましくは８００ｍｇ／Ｌ（約０.０８重量％）以上である。溶液中のＣＮＴの濃度はまた、１ｇ／Ｌ（約０.１重量％）以上、２ｇ／Ｌ（約０.２重量％）以上、３ｇ／Ｌ（約０.３重量％）以上、４ｇ／Ｌ（約０.４重量％）以上又は５ｇ／Ｌ（約０.５重量％）以上であることが好ましい場合がある。ＣＮＴが溶解し得る限り、本発明の溶液中に含まれるＣＮＴの濃度に上限はなく、その飽和濃度が最も好ましい。溶液中に含まれるＣＮＴの濃度は、通常、１００ｇ／Ｌ（約１０.０重量％）以下、７０ｇ／Ｌ（約７.０重量％）以下、５０ｇ／Ｌ（約５.０重量％）以下、４０ｇ／Ｌ（約４.０重量％）以下、３０ｇ／Ｌ（約３.０重量％）以下、２０ｇ／Ｌ（約２.０重量％）以下、１５ｇ／Ｌ（約１.５重量％）以下、１０ｇ／Ｌ（約１重量％）以下、５ｇ／Ｌ（約０.５重量％）以下、２ｇ／Ｌ（約０.２重量％）以下又は１ｇ／Ｌ（約０.１重量％）以下である。なお、これらの濃度は２０℃で測定した濃度である。
【００７１】
この溶液中にはＣＮＴが溶解している。ここにおいて、ＣＮＴが溶解しているとは、ＣＮＴを含む溶液を、２０℃にて２,２００×ｇで１０分間遠心分離した後にその液体全体にＣＮＴが依然として分布しており、ＣＮＴを含む溶液の呈色の低下、沈澱などが認められないことをいう。溶液中では、ＣＮＴは、ほぼ単一の分子として溶解している。
【００７２】
溶液中に溶解又は分散しているＣＮＴの量は、例えば、７０,０００×ｇ、１５分間遠心分離してＣＮＴを回収し、重量を測定することにより測定することができる。また、「Chem. Commun. J. p.193(2001)」に記載差れているように、ＣＮＴの濃度は、５００ｎｍでの吸光度と極めて良好な相関関係があり、水溶性キシランはこの波長での吸収はない。
【００７３】
（５．基材表面への供給）
上記で得られた溶液は、基材表面に供給され、基材表面に液の層を形成する。溶液の供給は、塗布や滴下などの方法により行われる。溶液の塗布量は適宜定められ得る。ＣＮＴの溶液の塗布量は、基材の表面積１ｃｍ２に対して、０.００１ｍｌ以上、好ましくは０.０１ｍｌ以上、好ましくは０.０５ｍｌ以上である。ＣＮＴの溶液の塗布量は、基材の表面積１ｃｍ２に対して、０.５ｍｌ以下、０.１ｍｌ以下、好ましくは０.０５ｍｌ以下である。
【００７４】
塗布の方法は、基材の表面に液の層を形成できる方法であれば特に限定されない。ここで、液の層は、塗膜のように薄く膜状になった液層に限らず、窪みに液を入れた場合に出来る液溜まりや液滴のように膜とは認識できないような厚みのある液層を含む。例えば、グラビアコーター、ロールコーター、カーテンフローコーター、スピンコーター、バーコーター、リバースコーター、キスコーター、ファンテンコーター、ロッドコーター、エアドクターコーター、ナイフコーター、ブレードコーター、キャストコーター、スクリーンコーター等を用いた塗布方法、エアスプレー、エアレススプレー等のスプレーコーティング等を用いた噴霧による方法、ディップ等の浸漬方法等が用いられる。塗布は刷毛を用いた手塗りによっても行われる。また、基材の表面に液滴を滴下する方法でもよい。細胞培養用のシャーレや有穴プレートのように窪みを有する基材であれば、当該窪みにＣＮＴの溶液を投入して、液の層を形成し得る。
【００７５】
基材の具体例として、細胞培養用の器具や体内埋め込み型医療器具が例示される。細胞培養用の器具は、細胞の培養に用いられるあらゆる器具であって、プレパラート用のスライドガラス、カバーガラス、シャーレ（laboratory dish）、ペトリ皿、細胞や培養液を入れる窪みを有する有穴プレート、培養液を入れるボトル、３次元的に細胞を増殖させるための立体構造を有する細胞培養用の支持体を含む。体内埋め込み型医療器具とは、一時的又は継続的に体内に埋め込まれて使用される医療器具を意味し、移植用に形成された骨や歯（いずれも人工のものを含む）、骨欠損部位や皮膚欠損部位に適用される補綴材、カテーテル、人工関節、骨スクリュー、人工歯根、人工椎体、人工椎間板、骨補填材、骨プレートなどを含む。幹細胞の培養・分化のためには、細胞培養用の器具、医療器具が好適である。
【００７６】
これらの基材は任意の材料、例えばプラスチック、高分子化合物、金属、セラミック又はこれらから選ばれる１種又は２種以上を含む複合材からなどから構成され得る。金属としては、金、銀、銅、白金、パラジウム、金合金、白金合金、銀合金、銅合金、金銀パラジウム合金、ステンレス鋼、コバルト−クロム合金、チタン合金、チタンニッケル合金などがある。プラスチックや高分子化合物としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キチン、アルブミン、再生セルロース、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、ポリ乳酸、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクトン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネートポリエーテル、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタラート、シリコーン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、メタクリル樹脂、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリアラミド、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンエーテル、ポリエーテルニトリル、ポリアミドイミド、ポリエーテルサルホン、ポリサルホン、ポリエーテルイミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリウレタン、そのフィルム、発泡体及びエラストマー、天然ゴム、合成ゴムなどがある。セラミックスとしては、ガラス、アルミナ、ジルコニア、バイオガラス、ハイドロキシアパタイトなどがある。ハイドロキシアパタイトは、一般組成をＣａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、とする化合物であり、ＣａＨＰＯ４ 、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４)２・Ｈ２Ｏなどリン酸カルシウムと称される１群の化合物を含む。Ｃａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｙ、Ｌａ、Ｎａ、Ｋ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｈなどから選ばれる１種以上で置換されてもよい。
【００７７】
これらの基材には、少なくともその一つの面状に薄膜を形成させるので、該薄膜の密着性を向上させる目的で上記フィルム表面をコロナ表面処理又はプラズマ処理することが好ましい。
【００７８】
（６．塗膜の乾燥）
次に基材表面に供給された溶液は乾燥に付され、溶媒が蒸散される。乾燥は、自然乾燥又は強制乾燥であり得る。自然乾燥は自然の状態で放置することである。強制乾燥は、強制的に高温にした環境下で放置することである。乾燥時の温度は、１０℃以上、好ましくは２０℃以上、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４０℃以上である。乾燥時の温度は１００℃以下、好ましくは８０℃以下、好ましくは７０℃以下、より好ましくは６０℃以下である。
【００７９】
基材表面にＣＮＴが少なくとも析出するまで、乾燥に付される。乾燥時間は適宜選択されうる。本発明においてＣＮＴが析出するとは、可溶化剤である水溶性キシラン濃度の高まりに従って、基材表面上の溶液に溶解できなくなったＣＮＴが基材表面に出現することである。少なくともＣＮＴが析出するとは、出現したＣＮＴがネットワークを形成する程度に、ＣＮＴが基材表面に出現することであり、ＣＮＴによるネットワークが基材表面に形成された後は溶媒が蒸散しなくなるまで乾燥してもよいことを含む。本発明においては、水溶性キシランとＣＮＴの溶液が基材表面に残る状態、つまり液の層を維持した状態で溶媒を蒸散するのが好ましい。これにより、析出したＣＮＴが基材表面に付着して、ＣＮＴのネットワークからなるＣＮＴ膜が形成される。
【００８０】
（８．溶液の除去）
溶媒の蒸散により、基材表面には析出したＣＮＴが付着すると共に水溶性キシランとＣＮＴを含む溶液が残る。この場合には、残った溶液を除去する。除去は任意的工程である。除去は吸引によることもできるが、除去のための特別な装置は不要である。基材表面を傾けると基材表面の溶液が流れ落ちる。形成されたＣＮＴ膜は、基材表面における分子間力によって基材表面に付着し、基材の傾斜では表面から剥離しない。
【００８１】
（９．水洗）
溶媒を蒸散させた後の基材表面は水洗される。水洗により、基材の表面に残留していたＧＸ及び余剰のＣＮＴが洗い流され、基材表面上にＣＮＴ膜が残る。その後、必要に応じて乾燥に付される。乾燥は、自然乾燥又は強制乾燥であり得る。自然乾燥は自然の状態で放置することである。強制乾燥は、強制的に高温にした環境下で放置することである。乾燥時の温度は、１０℃以上、好ましくは２０℃以上、好ましくは５０℃以上、より好ましくは８０℃以上、より好ましくは１００℃以上である。乾燥時の温度は２００℃以下、好ましくは１５０℃以下、好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下である。この乾燥により基材表面にＣＮＴ膜が固定される。
【００８２】
（１０．幹細胞の分化）
ＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具は細胞培養のために使用される。本発明の細胞培養用の器具は公知の器具と何ら変わるところなく使用できる。また、本発明の製造方法により形成されたＣＮＴ膜は幹細胞の分化を刺激し、又は促進しうる。分化を刺激するとは、ＣＮＴ膜を有しない細胞培養用の器具において分化が生じなかった細胞が、ＣＮＴ膜を有する細胞培養用の器具において分化が生じることであり、分化を促進するとは、ＣＮＴ膜を有しない細胞培養用の器具で培養した場合に比べて、分化を生じる細胞数が多いことあるいは分化を生じるまでの期間が短くなることを言う。
【００８３】
幹細胞は、未分化かつ無限定増殖及び特定細胞への分化能を有する細胞である。幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び胚性生殖細胞（ＥＧ）及び誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPS細胞）を含む全能性幹細胞（pluripotent stem cell）と組織幹細胞（tissue stem cell）であり得る。組織幹細胞は、体性幹細胞(somatic stem cell)もしくは成体幹細胞（adult stem cell）とも称される。胚性幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、胚性生殖細胞は５−１０週齢の生殖隆起(gonadalridge)の始原生殖細胞に由来する。組織幹細胞は胚組織、胎児組織及び成体組織で発見され、発生過程の組織や器官の形成と、障害時の再生・修復に関わる。全能性幹細胞は生体外（in-vitro）で無限定増殖し、３種類の胚葉（外胚葉、中胚葉と内胚葉）に由来する多様な細胞に分化する能力を有する。一方、組織幹細胞はそれが由来する特定組織に分化できる能力を有し、自己複製能力を、その染色体テロメアの伸長を伴わない６０回以内の体細胞分裂回数により制限される場合が多い。幹細胞の起源は全ての組織である。分化には、例えば、骨髄、血液、肝臓、皮膚、腸、膵臓、脳、骨格筋及び歯髄から主に分離された幹細胞が好ましく用いられ、特に骨髄から分離された幹細胞がより好ましい。
【００８４】
骨髄から分離される幹細胞は、造血系幹細胞(ＨＳＣ：hematopoietic stem cell)、間葉系幹細胞(ＭＳＣ：mesenchymal stem cell)などを含み得る。ＭＳＣは、臍帯血(cord blood)、脂肪組織（adipose tissue）などにも含まれることが報告されているので、骨髄由来の細胞については骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ：bone marrow stromal cell）とも呼ばれる。ＭＳＣは骨、軟骨、脂肪組織、心筋、腱などに分化する能力を持つ。ＨＳＣは血球（赤血球、白血球各種細胞、血小板）、免疫担当細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンパ球）などに分化できる能力を有する。
【００８５】
本発明のＣＮＴ膜は、細胞の分化にも寄与しうる。特にＭＳＣの分化に寄与し、骨芽細胞への分化を促進し得る。また、骨芽細胞における石灰化を促進する。間葉系幹細胞に由来する骨芽細胞（osteoblast）は、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ：alkaline phosphatase）の活性が高い細胞で、βグリセロリン酸存在下でコラーゲン線維の表面にリン酸カルシウムを沈着させて骨形成を行う。造血系幹細胞に由来する破骨細胞（osteoclast）は多核の大型の細胞で、骨基質を溶かす作用がある。従って、本発明の分化誘導には骨芽細胞がより好ましく用いられる。また、歯髄に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、象牙（質）芽細胞に分化し、歯の形成に係ることが知られている。歯髄由来の間葉系幹細胞も本発明の分化誘導に用いられる。
【００８６】
頭部を構成する骨の形成と首から下部にある骨格を構成する骨とは異なる。外胚葉（ectoderm）由来の神経堤（神経冠）細胞（ＮＣＣ： neural crest cell）に由来する一部の細胞が間葉系幹細胞に類似した性質を有し、これから分化した骨芽細胞が頭部を構成する骨を形成する。中胚葉(mesoderm)由来の間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞が首から下部にある骨格を構成する骨を形成する。本発明において用いられる骨芽細胞は、頭部の骨形成のための間葉系幹細胞及び首から下部にある骨格を構成する骨形成のための間葉系幹細胞の両者を含み得る。
【００８７】
骨芽細胞への分化や骨分化誘導は、培養細胞中に生成されたＡＬＰの活性により確認できる。対照となるＣＮＴ膜を有しない対照の細胞培養用の器具で培養した場合に比べて、ＡＬＰの活性が高ければ、分化が促進されたと言える。なお、本願発明者らの実験では、特許文献１に記載された細胞培養用の器具における分化誘導では間葉系幹細胞の骨分化を促進する効果は見られなかった（データ示さず）。一方、本発明のＣＮＴ膜を表面に備えた細胞培養用の器具における培養では骨分化の促進が見られた。両者の間で相違が見られる理由については説明できないが、ＣＮＴ膜におけるＣＮＴ分子の会合度の違いによるものと考えられる。
【００８８】
このように、本発明のＣＮＴ膜は、細胞培養用の器具において幹細胞の分化に利用される。また、本発明のＣＮＴ膜は、外胚葉由来の神経堤（神経冠）細胞（ＮＣＣ）の分化誘導も行い得る。ＮＣＣは、骨髄、毛包、後根神経節（ＤＲＧ）から分離される。ＮＣＣは本来末梢神経系に分化する能力を有するが、中枢神経系の再生にも寄与しうる。さらに、ＭＳＣは骨のほか、軟骨、脂肪組織、心筋、腱、などにも分化する能力を有する。従って、本発明のＣＮＴ膜を有する細胞培養用の支持体は、体内に埋め込まれ、各種臓器や神経などの修復（再生治療）としても好適に利用され得る。
【００８９】
本発明のＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具は、細胞増殖用の器具としても利用されうる。細胞増殖とは細胞が増殖することであり、分化をも含み得る。増殖可能な細胞は制限がなく、例えば、上皮細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、肝細胞、神経細胞、がん細胞等の接着性細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び胚性生殖細胞（ＥＧ）を含む全能性幹細胞や組織幹細胞のような幹細胞を含み得る。
【００９０】
細胞が由来する動物種は、ヒト、犬、猫、馬、牛などの哺乳類、鳥類などのすべての動物種を含む。
【００９１】
幹細胞の分化や細胞の培養に用いられる培地の制限はない。これらの培地は例えば、種々の組成のイーグル培地、ＲＰＭＩ培地、ＨａＭ'ｓ培地、Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ培地、ＭＣＤＢ培地等を含み得る。イーグル培地は、ＢＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等を含み得る。このうち、哺乳動物細胞の培養においては例えばイーグル培地を好ましく採用し得る。上記培地は５〜１０％程度の血清を含む血清培地、あるいは５％未満の血清を含む血清培地、さらには実質的に血清を含まない無血清培地であり得る。
【００９２】
培養手法は特に限定されず、培養する細胞や目的とする細胞培養物に応じた培養方法、培養条件等を適宜選択し得る。培地の組成や濃度、培養温度、培養期間等の条件は任意である。例えば、一般的な哺乳動物細胞の場合、室温から哺乳動物の体温程度の温度、例えば２０〜４０℃程度、より好ましくは３３〜３８℃程度の培養温度が採用され得る。また、例えば半日〜１２ヶ月程度、好ましくは１週間〜３カ月、より好ましくは１週間〜４週間の培養期間が好ましく採用され得る。培地のｐＨ上昇を防止するために、培養雰囲気中のＣＯ２濃度はほぼ一定に保たれるのが好ましい。そのＣＯ２濃度は、例えば０.５〜１０％以下、好ましくは１〜８％、より好ましくは３〜７％、最も好ましいのは５％程度である。
【実施例１】
【００９３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【００９４】
（ＣＮＴ溶液の調製）
水溶性キシランとしてグルクロノキシラン（スロヴァキア科学アカデミー製、数平均分子量１８，０００、キシロース残基：４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基＝１０：１；アセチル化なし；ブナ由来：及び江崎グリコ製Lot.080126）を用いた。
【００９５】
ＣＮＴとして、単層ＣＮＴ（ＳＷＮＴ：名城ナノカーボン製、マークプラズマジェット法及びUnidym製、HiPCO法）並びに多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ：バイエル製DP-LP150P、ＣＶＤ法及びナノシル製NC7000、ＣＶＤ法）を用いた。
【００９６】
各ＧＸの０.０１ｍｇ／ｍｌ、０.０５ｍｇ／ｍｌ、０.１ｍｇ／ｍ、０.２ｍｇ／ｍｌ、０.５ｍｇ／ｍｌ、１.０ｍｇ／ｍｌの水溶液を調製し、その１ｍｌにそれぞれ上記ＣＮＴの４ｍｇを添加し、室温（２０℃）にて５０分間超音波を連続的に投射した。超音波ホモジナイザー（BRANSON製 Sonifier 450）及びバスタイプ超音波洗浄器（SHARP製 T-304）を用いて超音波を投射し、ＣＮＴを溶解及び分散させた。
【００９７】
この溶液を、高速遠心機(HITACHI製himac CR22)を用いて２０℃、１０分間、１,６３０Ｇで遠心分離し、さらにその上清を２０℃、１５分間、２３,８００Ｇで遠心分離して、上清を分取した。
【００９８】
（グルクロノキシラン溶液におけるＣＮＴの溶解性）
上清中のＣＮＴの溶解度を測定した。その結果は図１〜８に示された。溶解度は５００ｎｍにおける吸光度で示した。吸光度の測定は室温（１５〜２５℃）にて行われた。また、吸光度の測定には分光光度計(島津製作所製UV-1600PC)を用いた。
【００９９】
各図に示すように、いずれの場合もある濃度（変曲点濃度）に至るまではＧＸ濃度が高くなるにつれ、ＣＮＴの溶解度は高くなる傾向にあるが、当該変曲点濃度よりＧＸ濃度が高くなればＣＮＴの溶解度が低下した。これにより、低い濃度のＧＸ水溶液中に溶解していたＣＮＴは、水の蒸散に従って濃度が高くなったＧＸ水溶液に溶解されずに析出し得ることが理解された。
【０１００】
（ＣＮＴ膜の形成）
ＣＮＴの溶解性が最もよかった１ｍｇ／ｍｌ又は２ｍｇ／ｍｌ濃度のＧＸ水溶液３ｍｌに、１２ｍｇのＣＮＴを添加した後、上記の条件に従って２種類の超音波装置を用いてＣＮＴを分散し、遠心分離（２０℃、１０分間、１,６００Ｇ）による上清をＣＮＴ溶液とした。
【０１０１】
この溶液の全量を細胞培養用のシャーレ（Laboratory dish：IWAKI製、直径３５ｍｍ）に添加し、室温で２日間静置した。静置後、シャーレを傾斜することによりシャーレ上のＣＮＴ溶液を除去した。次いでシャーレ表面を大量の水で３回洗浄した後、６０℃で乾燥させ、シャーレにＣＮＴ膜を形成した。
【０１０２】
（ＡＦＭ分析）
得られたＣＮＴ膜をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察した。シャーレ表面に傷をつけないようにＣＮＴ膜を５ｍｍ四方に切り取り観察に供した。Veeco製ＭＭＡＦＭ型マルチモードを使用し、Tappingモードで測定した。プローブはModel:RTESP、Part：MPP-11100-10を使用し、大気中、室温（１５〜２５℃）にて行った。また、その断面画像から接着しているＣＮＴの直径を測定し、全２０カ所の測定からその平均値を求めた。その代表的な画像を図９及び図１０に示した。図９はそれぞれＳＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜（スロヴァキア科学アカデミー製のＧＸ水溶液に、名城ナノカーボン製のＣＮＴを溶解した溶液を使用）の例であり、図１０はＭＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜（スロヴァキア科学アカデミー製のグルクロノキシラン水溶液に、バイエル製のＣＮＴを溶解した溶液を使用）の例である。参考のために、市販品である未使用の名城ナノカーボン製の単層ＣＮＴコートディッシュについても同様に観察した。その画像を図１１に示した。
【０１０３】
ＳＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜ではＣＮＴの直径は平均１.６４ｎｍ、ＭＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜ではＣＮＴの直径は約１４.９ｎｍ、参考例であるＣＮＴ膜では７.１〜９.４ｎｍと算出された。使用したＳＷＮＴの直径は約０.５〜１.８ｎｍ、ＭＷＮＴの直径は約５.０〜１０ｎｍであり、本発明のＣＮＴ膜では、ＣＮＴの会合が緩和され、十分に分散されたＣＮＴ膜が形成されていると言える。
【実施例２】
【０１０４】
（細胞培養用の器具の作製）
細胞培養のためにＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具（カバーガラス）を新たに作製した。０.２ｍｇ／ｍｌのＧＸ水溶液（スロヴァキア科学アカデミー製、数平均分子量１８，０００、キシロース残基：４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基＝１０：１；アセチル化なし）の３ｍｌに、１２ｍｇのＳＷＮＴ（名城ナノカーボン製）及びＭＷＮＴ（バイエル製DP-LP150P）を添加した後、実施例１に記載の条件に従って超音波ホモジナイザーを用いてＣＮＴを溶解した。このＣＮＴ溶液の１ｍｌを、直径１２ｍｍのカバーガラス上に滴下し、６０℃で乾燥して溶媒をほぼ蒸散させた。次いで、十分に水洗した後、６０℃で十分に乾燥して、ＣＮＴ膜を備えたカバーガラスを作製した。
【０１０５】
（ＧＸの残留）
ＣＮＴ膜に残留するＧＸの検出を試みた。ＧＸの存在量は、標準品となるＧＸがなく、ＧＸの分子量によっても異なる。そこで、ＣＮＴ膜の調整に用いたＧＸを用いて作製した標準サンプルと対比することで、ＧＸの存否を確認することにした。色素（ＲＢＢ：レナゾール・ブリリアント・ブルー；スロヴァキア科学アカデミー製）で標識されたＧＸの水溶液（０.２ｍｇ／ｍｌ）の３ｍｌに、１２ｍｇのＳＷＮＴ（名城ナノカーボン製）を添加し、上記と同様にしてＣＮＴ膜を有するカバーガラスを作製した。また、色素で標識されたＧＸの水溶液の１ｍｌをカバーガラスに滴下し、６０℃で乾燥して標準サンプルを作製した。なお、標準サンプルは水洗されていない。それぞれ標準サンプル及びＣＮＴ膜を備えたカバーガラスについて、それぞれ４００ｎｍ〜８００ｎｍにおける透過率を、分光光度計を用いて測定した。その結果を図１２に示す。色素による吸収が見られる約５００〜約７００ｎｍにおいて、ＣＮＴ膜を有するカバーグラスの透過率は低下せず、非処理のカバーグラスとほぼ同じ透過率であった。この結果から、基材（カバーグラス）上に形成されたＣＮＴ膜はＧＸを含まないと言える。
【０１０６】
（骨芽細胞の培養）
上記カバーグラス上において、骨芽細胞のモデル株であるヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ細胞）を培養し、細胞の接着量及び細胞の形態を観察した。対照としてポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）の膜を表面に備えたカバーグラスを用いて同様に培養を行った。ＰＬＯ水溶液（０.１ｍｇ／ｍｌ）にカバーグラスを３７℃で１２時間浸した後、室温で風乾させてＰＬＯの膜を有するカバーガラスを作製した。培養には１％ＦＢＳ(Cat No.12603C、Lot No.6M0672、６５℃、３０min非働化済)を含むＭＥＭ培地（Earle's minimum essential medium）と１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地を用いた。ＭＥＭ培地は１０ｍｇ／ｍｌのＮＥＡＡ（non-essential amino acid solution）、抗生物質−抗真菌剤 Mix（Antibiotic-Antimycotic：Invitrogen 15240-062）を含む。各培地にて０.５×１０５cells／ｍｌの細胞濃度でＨＯＳ細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２に調整されたインキュベーターで３日間培養した。培養開始１日目、３日目に、４％のパラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を添加して、細胞固定を行った。固定後、それぞれ光学顕微鏡による形態観察、細胞数の計測、ＡＦＭ観察及び蛍光顕微鏡観察を実施した。
【０１０７】
（初期接着量の計測）
ＨＯＳ細胞の初期接着量が、培養開始１日目に固定した細胞の顕微鏡画像（図１４参照）をもとにした単位面積当たりの細胞数を数えることによって求められた。その結果を図１３に示す。１０％ＦＢＳ含有条件下におけるＨＯＳ細胞の初期接着量は、ＳＷＮＴとＭＷＮＴのいずれのＣＮＴを用いた場合でも、対照の初期接着量と同等の値を示したが、１％ＦＢＳ添加条件下の初期接着量は対照の初期接着量よりも小さかった。また、１０％ＦＢＳ添加条件下の細胞増殖率は対照のそれとほぼ同じであったのに対し、１％ＦＢＳ添加条件下の細胞増殖率は対照のそれよりも小さくなった。１０％ＦＢＳ添加条件下では培養された細胞は均一に進展したのに対し、１％ＦＢＳ添加条件下では細胞同士が接着する傾向にあり、凝集した細胞群が多く見られた（図１４参照）。ＣＮＴ膜を有する細胞培養用の器具を利用した場合でも、ＦＢＳの添加量を多くした培地を用いれば、ＣＮＴ膜表面に細胞の付着が良好に観察され、増殖性に影響を及ぼすことなく培養できた。
【０１０８】
（ＡＦＭ観察）
細胞が付着したカバーガラスをＡＦＭ観察に供した。Veeco製ＭＭＡＦＭ型マルチモードを使用し、Tappingモードで測定した。プローブはModel:RTESP、Part：MPP-11100-10を使用し、大気中、室温（１５〜２５℃）にて行った。その結果を図１５〜図１７に示す。１％ＦＢＳ添加条件下では細胞同士の接着がみられ、１０％ＦＢＳ添加条件下では細胞同士の接着はみられなかった。しかしながら、ＡＦＭ観察によると、１％ＦＢＳ添加条件及び１０％ＦＢＳ添加条件いずれの培養条件でも、突起状の仮足が観察された（図１６及び図１７参照）。また、細胞が存在する場所における表面高さを測定したところ、１％ＦＢＳ添加条件下では、その表面高さは対照の表面高さよりも大きな値を示したが、１０％ＦＢＳ添加条件下ではその表面高さは対照の表面高さとほぼ同じであった。１％ＦＢＳ条件下では、接着性は良好であるとは言えないがＣＮＴ膜が接着性を阻害するものではなかった。一方、１０％ＦＢＳ条件下では良好な接着性を示した。以上の結果から、ＣＮＴ膜を備えたカバーガラスは接着性細胞の培養に使用し得るものと判断される。
【０１０９】
（蛍光顕微鏡観察）
アクチンフィラメント、ビンキュリン及び核を対象とする多重蛍光染色法により染色された細胞を顕微鏡観察に供した。ＰＬＯを用いた対照では、アクチンフィラメントは密な繊維状の網目構造を有し、ストレスファイバーが形成された。１％ＦＢＳ培養条件下ではアクチンフィラメントの構造を形成しなかったのに対し、１０％ＦＢＳ培養条件下では、対照と同様に、アクチンフィラメントは密な繊維状の網目構造を有し、ストレスファイバーが形成された。また、ＰＬＯを用いた対照では、ビンキュリンが染色されたフォーカルアドヒージョンが多く観察された。一方、１％ＦＢＳ培養条件下ではフォーカルアドヒージョンが観察されなかったのに対し、１０％ＦＢＳ培養条件下では、対照と同様に、フォーカルアドヒージョンを有する糸状仮足が多く観察された。
【０１１０】
上記形態観察、初期接着量（細胞数）、ＡＦＭ観察、蛍光顕微鏡観察から、ＣＮＴ膜が形成されたカバーガラスは、細胞の接着性が良好で、細胞培養の足場として利用できることが確認された。
【０１１１】
（幹細胞の分化）
次に、上記ＣＮＴ膜を有するカバーガラス上で、ラット骨髄由来の間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）を分化誘導した。分化誘導には、分化誘導因子としてデキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌを含む１５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地を用いた。ＭＥＭ培地は１０ｍｇ／ｍｌのＮＥＡＡ（non-essential amino acid solution）、抗生物質−抗真菌剤 Mix（Antibiotic-Antimycotic：Invitrogen 15240-062）を含む。各培地にて０.５×１０５cells／ｍｌの細胞濃度でｒＭＳＣを蒔き、３７℃ ５％ＣＯ２に調整されたインキュベーターで３週間培養した。培養開始から１週間経過後及び３週間後に、４％のパラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を添加して、細胞固定を行った。固定後、初期骨分化の指標であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色及び細胞抽出液のＡＬＰ活性の測定を行った。対照としてＣＮＴ膜を有しない培養皿を用いて同様に培養を行った。
【０１１２】
培養された細胞の顕微鏡画像を図２１に、ＡＬＰ染色された細胞の顕微鏡画像を図２２に、ＡＬＰ活性の測定結果を図２３に示す。ＡＬＰ染色は次の方法によった。０.３ｇ／ＬNaphtol AS-MX phosphate、５ｍｇ／ｍｌN,N-Dimethylformamide、０.６ｇ／ＬFast Blue BB Saltを０.２Ｍトリス緩衝液に溶解したＡＬＰ染色液を用いて細胞を染色した（ＡＬＰ染色）。細胞固定後、上記のＡＬＰ染色液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２気流下にて３０分間静置後、ＡＬＰ染色液を除去、ＰＢＳで２回洗浄したものを観察および撮影した。ＡＬＰ活性の測定はｐ−ニトロフェニルリン酸基質法によった。
【０１１３】
培養開始３日目の細胞はいずれも進展した形態で接着していることが観察された。１週間目には、対照に比べてＣＮＴ膜を有するカバーガラス上の細胞は部分的に集まっていることが観察され、３週間目には細胞が集まっていることが顕著に観察された。また、３週間目にはＣＮＴ膜上の細胞は、初期石灰化の様子も観察された。また、ＡＬＰ染色を行った細胞の画像からも、対照に比べて広範囲でＡＬＰ染色された細胞が観察された。さらに、培養開始後１週間目のＣＮＴ膜上の細胞は、対照に比べて高いＡＬＰ活性が認められ、培養開始後３週間目のＣＮＴ膜状の細胞は、対照に比べてさらに高いＡＬＰ活性が認められた。このように本発明の製造方法により製造されたＣＮＴ膜上では、骨芽細胞の分化が促進されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明によると、ＣＮＴの会合がなく、均一にＣＮＴが分散したＣＮＴ膜を表面に備えた細胞培養用の器具が提供される。この細胞培養用の器具を用いれば、幹細胞の分化を誘導して、例えば骨形成の促進に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カーボンナノチューブ膜の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カーボンナノチューブ（以下「ＣＮＴ」と称する場合がある。）は、１原子の厚さの炭素原子でできたグラフェンシートが単層又は多層の同軸管状になったものである。ＣＮＴは、化学的、電子的及び力学的に優れた物理特性があることから樹脂や金属との複合材料として注目されている。また、近年では、医療分野や食品科学分野への応用も期待されており、ＣＮＴを利用した細胞培養用の担体や容器、さらにはこれを利用した細胞培養方法及び治療方法が提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１（特開２００９−１４４２１８号公報）には表面にＣＮＴ層を有する細胞培養容器が開示されている。この細胞培養容器は、細胞培養に用いられるガラス製ディッシュなどの各種基材表面にＣＮＴ層を有する。ＣＮＴ層の形成には、ＣＮＴを水又は水と炭素数が１〜４程度の低級アルコールとの混合溶媒に分散したＣＮＴ分散液が用いられ、当該分散液の塗布と乾燥の繰り返しによりＣＮＴ層が形成されている。このＣＮＴ層で覆われた細胞培養容器のＣＮＴ膜上で、マウス骨芽細胞（ＭＣＴ３−Ｅ１）、マウス骨髄間葉系幹細胞（ＳＴ２細胞）、ラット歯髄細胞（ＲＰＣ−Ｃ２Ａ）、口腔扁平上皮がん細胞（ＫＢ）、ヒト至急頚部類上皮がん細胞（ＨｅＬａ）、ヒト胎児上皮細胞（ＨＥ２９３）及びマウス胎児皮膚繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）を培養すると細胞増殖促進効果が認められた。
【０００４】
特許文献２（特開２００９−５０２２４２号公報）にはＣＮＴなどのナノ繊維を含むナノフィブリル構造体で覆われた細胞培養製品、移植片、インプラントなど、生体に適用される医療器具が開示されている。この細胞培養製品等は、表面にＣＮＴの分散・溶解液から生成したメッシュ様のネットワークを備え、当該ネットワークが少なくとも１種のペンダント型アミン含有基などを有するポリマーによってコーティングされている。この細胞培養製品等は細胞付着性が良好で、例えば褐色細胞腫由来株（ＰＣ１２）などでは、神経細胞への分化を促進する。
【０００５】
特許文献３（特表２００９−５０２３０８号公報）にはＣＮＴが分散した培養液中で細胞を培養したり、幹細胞治療剤と共にＣＮＴを体内に注入したりすることが提案されている。ここでは、ＣＮＴが幹細胞であるＰ１９ ＥＣ細胞や神経細胞であるＳＫ−ＮＳＨ細胞、星状膠細胞に結合することに着目し、in vivoにおいて、移植された細胞が被移植組織においてネットワークを形成する際の支持体として利用され、細胞増殖や分化を促進した。この結果、ＣＮＴがin vivoにおいて幹細胞の長期生存を助け、持続的な治療効果に寄与する。
【０００６】
特許文献４（特開２００５−１３７０５９号公報）には、ＣＮＴがフラーレンに結合した複合体と細胞外マトリックスからなる三次元培養担体が培養槽内に設置されたバイオリアクターが開示されている。この三次元培養担体は前記ＣＮＴとフラーレンの複合体と、コラーゲンやフィブリン、フィブロネクチンなど、動物組織中で細胞外にあって安定な生体構造の維持に係わるタンパク質との混合物である。このバイオリアクターにおいて、ヒト肝がん細胞（ＨｅｐＧ２やＦｏｒ−２）や間質細胞、また植物細胞など、広範囲の細胞の増殖が促進される。
【０００７】
特許文献５（特開２００６−５０２３０８号公報）には、ＣＮＴと樹脂の混合物を焼成して、樹脂を炭化させたカーボン複合体からなる細胞培養用担体が開示されている。この細胞培養用担体は表面の一部にＣＮＴが露出している。この担体を用いてリンパ芽球細胞（Ｍｏｌｔ−４）を培養すると増殖率が向上し、細胞の生存期間が伸長するだけでなく、培養した細胞は担体から容易に分離される。
【０００８】
特許文献６（特開２００５−２７０３９７号公報）には、ＣＮＴから人工気管や人工消化管を作成することが提案されている。
【０００９】
さらに、非特許文献１（F. WATARI, et al., "Proliferation of osteoblast cells on nanotubes", Front. Mater. Sci. China, 3(2009), 169-173）には、ＣＮＴなどのナノチューブ上でヒト骨肉腫由来骨芽細胞様株化細胞Saos2が増殖が促進されることが報告されている。非特許文献２（Michiko TERADA et al., "Development of a multiwalled carbon nanotube coated collagen dish", Dental Materials J, 28(2009), 82-88）には多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）をコラーゲンディッシュ上にコーティングした細胞培養容器が開示されている。この細胞培養容器では、マウス骨芽細胞様株化細胞MC3T3-E1がコラーゲン上に比べてよく接着し、増殖率は劣るものの増殖はすることが報告されている。
【００１０】
非特許文献３（Yuki Usui et al., "Carbon Nanotubes with High Bone-Tissue Compatibility and Bone-Formation Acceleration Effects", Small, 4(2008), 240-246）には、骨欠損部位に多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）でできたパーティクルを移植し、生体内において骨形成の促進効果を調べたところ、ＭＷＮＴパーティクルを骨膜下に移植した場合、ＭＷＮＴパーティクルを移植しなかった場合に比べて骨沈着がやや早くなることが報告されている。
【００１１】
非特許文献４（Mooney E, Dockery P, Greiser U, Murphy M, Barron V, Carbon nanotubes and mesenchymal stem cells: biocompatibility, proliferation and differentiation., Nano letters 8, 2137-2143, (2008)）には、単層ＣＮＴ（ＳＭＮＴ）又は多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）を添加した培養液中でヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を培養、および、ＳＷＮＴまたはＭＷＮＴを添加した分化誘導培養液中でｈＭＳＣを分化誘導したところ、骨分化誘導条件でもいずれも対照と比較的比べて同程度の骨分化しか見られなかったという結果が報告されている。
【００１２】
非特許文献５（Liu D et al., "Inhibition of proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells by carboxylated carbon nanotubes", ACS Nano, 4(2010), 2185-2195）には、培養液中にＳＭＮＴとＭＷＮＴを混合して、昆明マウス骨髄由来間葉系幹細胞を培養したところ、骨分化や細胞増殖を促進する効果はなく、むしろ骨分化や細胞増殖を阻害することが開示されている。
【００１３】
一方、非特許文献６（Oh S et al., "Stem cell fate dictated solely by altered nanotube dimension", Proc Natl Acad Sci U S A 106(2009), 2130-2135）、非特許文献７（McCullen SD et al., "Characterization of electrospun nanocomposite scaffolds and biocompatibility with adipose-derived human mesenchymal stem cells", Int J Nanomedicine, 2(2007), 253-263）、非特許文献８（Kaur G et al,, "Regulation of osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells on 2D nanorod substrates. Biomaterials", 31(2010),1732-1741）には、それぞれＣＮＴ以外のナノチューブ、例えば酸化チタンナノチューブ（非特許文献６）やエレクトスピニングにより得られたナノ組成物（非特許文献７）、タバコモザイクウイルスで作製されたナノロッド（非特許文献８）が、間葉系幹細胞の骨分化を促進することが報告されている。
【００１４】
上記のように、ＣＮＴが各種細胞の増殖を促進することやＣＮＴ以外のナノチューブが幹細胞の分化を促進するという事例は報告されているが、これまでのところ、特許文献２で開示された褐色細胞腫由来株（ＰＣ１２）から神経細胞への分化を除き、未だ生体外において、幹細胞の分化を制御する方法は細胞、特に幹細胞の分化を促進させる効果があったとの報告は見あたらず、ＣＮＴを利用して幹細胞の分化を制御する方法は確立されていない。
【００１５】
このような状況下において、特許文献７（特開２００６−６３３０７号公報）や特許文献８（国際公開公報ＷＯ２００７／８３７７１号）、特許文献９（特開２００７−２１５５４２号公報）には、ＣＮＴを均一に分散・溶解したＣＮＴ分散・溶解液及びそれを利用してＣＮＴ膜を形成する方法並びにそれを利用した成型品などが本願発明者らによって開示されている。
【００１６】
特許文献７には、ＣＮＴを環状グルカンの溶液に溶解したＣＮＴ溶液を、プラスチック製のフィルムやガラス板の表面に塗布して、当該表面にＣＮＴコーティング層を形成することが開示されている。また、当該ＣＮＴ溶液にポリマーを配合して成型品を製造することが開示されている。この溶液は高濃度のＣＮＴが安定かつ均一に溶解した水溶液であり、この溶液の利用が化粧品や医薬品などＣＮＴの利用用途を広げる。また、得られたコーティング層は導電性や透過性を有し、強度が高められた成型品が得られる。
【００１７】
また、特許公報８や９には、ＣＮＴを水溶性キシランの水溶液に溶解した溶液を、プラスチック製のフィルムやガラス板の表面に塗布して、当該表面にＣＮＴコーティング層を形成する方法や溶解液を乾燥してフィルムを製造することが開示されている。この溶液も、高濃度でかつ長期に亘って安定なＣＮＴの水溶液であって、当該溶液から透明性及び導電性に優れたＣＮＴコーティング層やフィルムが形成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００９−１４４２１８号公報
【特許文献２】特開２００９−５０２２４２号公報
【特許文献３】特表２００９−５０２３０８号公報
【特許文献４】特開２００５−１３７０５９号公報
【特許文献５】特開２００６−５０２３０８号公報
【特許文献６】特開２００５−２７０３９７号公報
【特許文献７】特開２００６−６３３０７号公報
【特許文献８】国際公開公報ＷＯ２００７／８３７７１号
【特許文献９】特開２００７−２１５５４２号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】F. WATARI, et al., "Proliferation of osteoblast cells on nanotubes", Front. Mater. Sci. China, 3(2009), 169-173
【非特許文献２】Michiko TERADA et al., "Development of a multiwalled carbon nanotube coated collagen dish", Dental Materials J, 28(2009), 82-88
【非特許文献３】Yuki Usui et al., "Carbon Nanotubes with High Bone-Tissue Compatibility and Bone-Formation Acceleration Effects", Small, 4(2008), 240-246
【非特許文献４】Mooney E, Dockery P, Greiser U, Murphy M, Barron V, Carbon nanotubes and mesenchymal stem cells: biocompatibility, proliferation and differentiation., Nano letters 8, 2137-2143, (2008)
【非特許文献５】Liu D et al., "Inhibition of proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells by carboxylated carbon nanotubes", ACS Nano, 4(2010), 2185-2195
【非特許文献６】Oh S et al., "Stem cell fate dictated solely by altered nanotube dimension", Proc Natl Acad Sci U S A 106(2009), 2130-2135
【非特許文献７】McCullen SD et al., "Characterization of electrospun nanocomposite scaffolds and biocompatibility with adipose-derived human mesenchymal stem cells", Int J Nanomedicine, 2(2007), 253-263
【非特許文献８】Kaur G et al,, "Regulation of osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells on 2D nanorod substrates. Biomaterials", 31(2010),1732-1741
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ところで、特許文献２におけるＣＮＴなどのナノ繊維を含むナノフィブリル構造体で覆われた細胞培養容器等は、幹細胞の分化の促進には有効である。当該ナノフィブリル構造体は、ＣＮＴのネットワークが当該ネットワークに結合させるペンダント型の反応性基とペンダント型アミンを含む官能基を有するポリマーであって、該ポリマーによってコーティングされたのが特許文献２の細胞培養容器等である。この容器の製造にはポリマーによるコーティング作業を要するので作業工程が煩雑となり、しかも均一な製品が得がたいという問題がある。
【００２１】
また、特許文献１における細胞培養容器は、水又は水とアルコールの混合液を用いているために、比較的簡便な作業で製造され得る。しかしながら、混合液の単回塗布により製造された細胞培養容器では十分な細胞増殖促進効果が得られず、複数塗布、好ましくは１０回以上塗布と乾燥を繰り返して製造する必要があり、やはり製造工程に過大な作業量を要することになっていた。
【００２２】
一方、本願発明者らの提案による特許文献７〜９による方法であれば、比較的高濃度のＣＮＴを安定に分散させることができるので、単回塗布によっても十分な量のＣＮＴを塗布できる利点がある。また、分散性も優れているので、単回塗布でも極めて薄いＣＮＴ膜を形成でき、安定した品質の細胞培養容器を得ることができる。
【００２３】
しかしながら、この細胞培養容器においては、水溶性の環状グルカンやグルクロノキシラン等の水溶性キシランの水溶液にＣＮＴを溶解した溶液を用いるので、得られたＣＮＴ膜中に可溶化剤である環状グルカンや水溶性キシランが残留する。このために、細胞の増殖や分化が阻害される懸念があった。
【００２４】
そこで、ＣＮＴ以外にポリマーや水溶性の可溶化剤を含まないＣＮＴ膜で覆われた細胞培養容器を簡単な製造工程によって製造できるので、細胞の増殖や分化を促進して好ましい効果が得られると考えられた。
【００２５】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、本発明の目的は、ポリマーや水溶性の可溶化剤を含まないＣＮＴ膜を基材表面に薄膜でコーティングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本願発明者らは、グルクロノキシラン等の水溶性キシラン溶液におけるＣＮＴの溶解特性に着目したところ、水溶性キシランの水溶液においては、水溶性キシランの濃度を高めていくとある濃度を境にしてＣＮＴの溶解度が急速に低下する現象を見いだした。そして、この現象を利用すれば細胞培養用の器具にほぼＣＮＴのみからなるＣＮＴ薄膜を形成することができ、可溶化剤等に影響を受けることなく、細胞の増殖を促進し、あるいは幹細胞を分化させることができるのではないかと考え、本願発明を想起した。
【００２７】
つまり、本発明のカーボンナノチューブ膜の製造方法は、基材表面にカーボンナノチューブ膜を製造する方法であって、カーボンナノチューブとカーボンナノチューブを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を含み、カーボンナノチューブが溶解された溶液を作製する工程と、前記溶液を前記基材表面に供給する工程と、前記供給された溶液の溶媒の蒸散により溶液中のカーボンナノチューブを析出させて、当該基材表面にカーボンナノチューブを付着させる工程と、前記カーボンナノチューブが付着した基材表面を水で洗浄する工程を含む。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、ＣＮＴ溶液の供給、溶媒の蒸散、水洗という簡単な工程でほぼＣＮＴのみからなる薄膜のＣＮＴ膜を細胞培養用の基材表面に形成できる。そして、このＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具は、各種細胞の増殖促進だけでなく、骨芽細胞の分化も促進する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性との関係を示す図である。
【図２】図２はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性との関係を示す図である。
【図３】図３はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図４】図４はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図５】図５はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図６】図６はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図７】図７はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図８】図８はグルクロノキシラン水溶液のグルクロノキシラン濃度とＣＮＴの溶解性の関係を示す図である。
【図９】図９はＣＮＴ（ＳＷＮＴ）膜のＡＦＭ観察による画像である。図９ＡはＣＮＴ膜の表面画像、図９Ｂは図９Ａに示された線上における断面画像である。
【図１０】図１０はＣＮＴ（ＭＷＮＴ）膜のＡＦＭ観察による画像である。図１０ＡはＣＮＴ膜の表面画像、図１０Ｂは図１０Ａに示された線上における断面高さを示す画像である。
【図１１】図１１は市販品ディッシュにおけるＣＮＴ膜のＡＦＭ観察による画像である。図１１ＡはＣＮＴ膜の表面画像、図１１Ｂは図１１Ａに示された線上における断面高さを示す画像、図１１Ｃは図１１Ａに示された線上における断面高さを示す画像である。
【図１２】図１２はＣＮＴ膜におけるＧＸの残留性を調べるためのチャートである。
【図１３】図１３は培養されたＨＯＳ細胞の増殖を示す図である。図１３Ａは培養開始１日目の細胞数を示す図、図１３Ｂは培養開始３日目の細胞数を示す図、図１３Ｃは培養開始１日目から３日目の細胞増殖率を示す図である。
【図１４】図１４は培養されたＨＯＳ細胞の顕微鏡画像である。
【図１５】図１５はＰＬＯ上で培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像である。図１５Ａは細胞表面の拡大画像、図１５Ｂは図１５Ａに示された線上における断面高さを示す画像である。
【図１６】図１６はＣＮＴ（ＳＷＮＴ）膜上で培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像である。図１６Ａは培養面の表面画像、図１６Ｂは細胞表面の拡大画像、図１６Ｃは図１６Ｂに示された線上における断面高さを示す図である。
【図１７】図１７はＣＮＴ（ＭＷＮＴ）膜上で培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像である。図１７Ａは培養面の表面画像、図１７Ｂは細胞表面の拡大画像、図１７Ｃは図１７Ｂに示された線上における断面高さを示す図である。
【図１８】図１８は培養されたＨＯＳ細胞（１０％ＦＢＳ培地）のＡＦＭ画像であって、各列とも上段の画像は細胞表面の画像、下段の画像は上段の画像に示された線上における断面高さを示す図である。
【図１９】図１９は培養されたＨＯＳ細胞（１％ＦＢＳ培地）の蛍光顕微鏡観察による画像である。各列とも上段の画像はアクチンフィラメントの観察画像、中段の画像はビンキュリンの観察画像、下段は両者を同時に観察した際の画像である。
【図２０】図２０は培養されたＨＯＳ細胞（１０％ＦＢＳ培地）の多重蛍光顕微鏡観察による画像である。各列とも上段はアクチンフィラメントの観察画像、中段はビンキュリンの観察画像、下段は両者を同時に観察した際の画像である。
【図２１】図２１は培養されたｒＭＳＣの顕微鏡画像である。各列それぞれ上段の画像は培養開始３日目の観察画像、中段の画像は同１週間目の観察画像、下段の画像は同３週間目の観察画像である。
【図２２】図２２はＡＬＰ染色されたｒＭＳＣの顕微鏡画像である。図２２ＡはＰＬＯ上において培養されたｒＭＳＣの画像、図２２ＢはＣＮＴ（ＳＷＮＴ）膜上において培養されたｒＭＳＣの画像、図２３ＣはＣＮＴ（ＭＷＮＴ）膜上において培養されたｒＭＳＣの画像である。
【図２３】図２３は培養されたｒＭＳＣにおけるＡＬＰ活性量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明のＣＮＴ膜の製造方法は、基材表面にＣＮＴ膜を製造する方法であって、ＣＮＴとＣＮＴを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を含み、ＣＮＴが溶解された溶液を作製する工程と、前記溶液を前記基材表面に供給する工程と、前記供給された溶液の溶媒の蒸散により溶液中のＣＮＴを析出させて、当該基材表面にＣＮＴを付着させる工程と、前記ＣＮＴが付着した基材表面を水で洗浄する工程を含む。
【００３１】
本発明は、水溶性キシランの水溶液において、水溶液の温度を一定にした状態で、水溶性キシランの濃度を高めると当該溶液に可溶化するＣＮＴ量が、ある水溶性キシラン濃度を境にして減少するという事象に基づいて想起された発明である。
【００３２】
図１はＣＮＴを水溶性キシランの１つであるグルコノキシラン（以下「ＧＸ」ということがある。）の水溶液に溶解した場合の水溶性キシラン濃度とＣＮＴの溶解度との関係を示す図である（実施例１参照）。図１において、ＣＮＴの溶解度は相対吸光度として示されている。ＣＮＴはＧＸの水溶液に高濃度で安定かつ均一に溶解することが知られている（例えば、特許文献８や９参照）。このとき、図１に示すように、ＧＸ濃度が高まるにつれＣＮＴを溶解した溶液の吸光度は徐々に高まるが、ＧＸ濃度がある濃度（以下、「変曲点濃度」という場合がある。）以上になるとＣＮＴを溶解した溶液の吸光度は低下することが本発明者らのその後の研究により見いだされた。例えば、図１の場合、超音波ホモジナイザーによって溶解した場合、変曲点濃度は約０.２％（約２ｍｇ／ｍｌ）である。このことは、ＣＮＴを溶解したＧＸ水溶液中のＧＸ濃度が変曲点濃度よりも高くなると、ＧＸが析出しない状態でＣＮＴのみが析出し得ることを意味する。すなわち、ＣＮＴが溶解したＧＸの水溶液を、ＣＮＴ膜を形成しようとする基材表面に供給する。その後、供給された溶液から溶媒を蒸散させると、供給された溶液中におけるＧＸの濃度が高まりＣＮＴが基材表面に析出して付着する。この付着したＣＮＴが、ＣＮＴ分子の一部において重なりあったネットワークを形成し、基材表面にＣＮＴ膜として出現する。こうして得られたＣＮＴ膜を含む膜を水洗すると、ＧＸが、基材表面に付着せずに基材表面に析出したＣＮＴと一緒に洗い流され、基材表面にＣＮＴ膜が残る。なお、本発明において、ＣＮＴ分子とは、グラフェンシートが単層又は多層の同軸管状になったチューブ体の１本を意味する。
【００３３】
本発明のＣＮＴ膜は、顕微鏡観察した場合に、露出した基材表面が全く観察されない場合のみならず、露出した一部基材表面が観察される場合も含む。
【００３４】
得られたＣＮＴ膜では、ＣＮＴ分子が会合することなく１本１本のチューブとして存在している。また、ＣＮＴの膜は、均質に溶解したＣＮＴの溶液から析出したＣＮＴから形成されたものであるので、低濃度のＣＮＴ溶液からＣＮＴ膜を形成した場合には、ＣＮＴが一部において重なり合っただけの薄層のＣＮＴの膜が形成されうる（図９や図１０参照）。この点、特許文献１ではＣＮＴの分散液からコーティング膜が形成されているので、ＣＮＴが局在化しやすく、ＣＮＴのネットワークが十分に形成されないだけでなく、コーティング膜はＣＮＴが会合した状態で存在することが懸念される（特許文献１参照）。
【００３５】
（１）ＣＮＴ溶液の調製
本発明においては、まず、ＣＮＴと当該ＣＮＴを可溶化する水溶性の可溶化剤を含む水系溶液が調製される。本発明において、ＣＮＴは単層ＣＮＴ（ＳＷＮＴ）又は多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ）であり得る。
【００３６】
（１．ＣＮＴ）
ＣＮＴは、炭素の同素体であり、複数の炭素原子が結合して筒状に並んだものである。ＣＮＴとしては、任意のＣＮＴを用いることができる。ＣＮＴの例としては、単層ＣＮＴ及び多層ＣＮＴ、及びこれらがコイル状になったものが挙げられる。単層ＣＮＴは、グラファイトシートが一重で筒状になったものであり、多層ＣＮＴは、グラファイトシートが２層以上同心円状に重なったものである。本発明で用いられるＣＮＴは、多層ＣＮＴでも単層ＣＮＴでもよいが、より好ましくは単層ＣＮＴである。ＣＮＴの片側が閉じた形をしたカーボンナノホーン、その頭部に穴があいたコップ型のナノカーボン物質、両側に穴があいたＣＮＴなども用いることができる。
【００３７】
ＣＮＴは、任意の直径（外径）のものが使用される。ＣＮＴの直径は好ましくは約０.４ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.５ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.６ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約１.０ｎｍ以上であり、最も好ましくは約１.２ｎｍ以上である。ＣＮＴの直径は好ましくは約１００ｎｍ以下であり、より好ましくは約６０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約４０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約３０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約２０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約１０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約４ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約３ｎｍ以下であり、さらに好ましくは約２ｎｍ以下であり、最も好ましくは約１.５ｎｍ以下である。
【００３８】
単層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約０.４ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.５ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約０.６ｎｍ以上であり、さらに好ましくは約１.０ｎｍ以上であり、最も好ましくは約１.２ｎｍ以上である。単層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約５ｎｍ以下であり、より好ましくは約４ｎｍ以下であり、より好ましくは約３ｎｍ以下であり、より好ましくは約２ｎｍ以下であり、最も好ましくは約１.５ｎｍ以下である。
【００３９】
多層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約１ｎｍ以上であり、より好ましくは約２ｎｍ以上であり、より好ましくは約３ｎｍ以上であり、より好ましくは約４ｎｍ以上であり、より好ましくは約５ｎｍ以上であり、より好ましくは約１０ｎｍ以上であり、より好ましくは約２０ｎｍ以上であり、より好ましくは約３０ｎｍ以上であり、より好ましくは約４０ｎｍ以上であり、最も好ましくは約６０ｎｍ以上である。多層ＣＮＴの場合、その直径は好ましくは約１００ｎｍ以下であり、より好ましくは約６０ｎｍ以下であり、より好ましくは約４０ｎｍ以下であり、より好ましくは約３０ｎｍ以下であり、より好ましくは約２０ｎｍ以下であり、最も好ましくは約１０ｎｍ以下である。本明細書中で、多層ナノチューブについて直径という場合、最も外側のＣＮＴの直径をいう。
【００４０】
ＣＮＴは、任意の長さ（すなわち、軸方向長さ）のものであり得る。ＣＮＴの長さは、好ましくは約０.６マイクロメートル以上であり、より好ましくは約１マイクロメートル以上であり、さらに好ましくは約２マイクロメートル以上であり、最も好ましくは約３マイクロメートル以上である。ＣＮＴの長さは、好ましくは約１０００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約５００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約２００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約１００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約５０マイクロメートル以下であり、より好ましくは約２０マイクロメートル以下であり、より好ましくは約１５マイクロメートル以下であり、さらに好ましくは約１０マイクロメートル以下であり、最も好ましくは約５マイクロメートル以下である。
【００４１】
本発明に用いられるＣＮＴは、市販のものであっても、当該分野で公知の任意の方法によって製造されてもよい。ＣＮＴは例えば、シンセンナノテクポート社（Shenzhen Nanotech Port Co., Ltd.）、CARBON NANOTECHNOLOGIES INC.、SES RESEARCH、昭和電工社などから販売されている。
【００４２】
ＣＮＴの製造方法の例としては、二酸化炭素の接触水素還元法、アーク放電法（例えば、C．Journetら、Nature（ロンドン）, 388（1997）, p.756を参照）、レーザー蒸発法（例えば、A. G. Rinzlerら、Appl. Phys. A, 1998, 67, p.29を参照）、ＣＶＤ法、気相成長法、一酸化炭素を高温高圧化で鉄触媒と共に反応させて気相で成長させるＨｉＰｃｏ法（例えば、P. Nikolaevら、Chem. Phys. Lett., 1999, 313, p.91を参照）などが挙げられる。
【００４３】
ＣＮＴは、洗浄、遠心分離、ろ過、酸化、クロマトグラフィーなどによって精製されたものであっても、未精製のものであってもよい。精製されたものであることが好ましい。用いられるＣＮＴの純度は、任意であり得るが、好ましくは約５％以上、より好ましくは約１０％以上、さらに好ましくは約２０％以上、さらに好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約４０％以上、さらに好ましくは約５０％以上、さらに好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上である。ＣＮＴの純度が高いほど、特有の機能が発現されやすい。なお、本明細書中でＣＮＴの純度という場合、特定の分子量の１種類のＣＮＴとしての純度ではなく、ＣＮＴ全体としての純度をいう。すなわち、ＣＮＴ粉末がＡという特定の分子量のＣＮＴ３０重量％と、Ｂという特定の分子量のＣＮＴ７０重量％とからなっている場合、この粉末の純度は１００％である。もちろん、用いられるＣＮＴは、特定の直径、特定の長さ、特定の構造（単層か多層か）などについて選択されたものであってもよい。
【００４４】
本発明に用いられるＣＮＴは、ボールミル、振動ミル、サンドミル、ロールミルなどのボール型混練装置等を用いて粉砕したもの、又は化学的処理もしくは物理的処理によって短く切断されたものであってもよい。
【００４５】
（２．可溶化剤）
本発明の可溶化剤はＣＮＴを水系溶媒に可溶化する任意の物質である。本発明において可溶化とは、難溶性又は不溶性であった物質が可溶性になるか若しくは可溶性物質と同様の挙動をするようになることを言う。ＣＮＴが溶液中に均質に溶解していることは、ＣＮＴ溶液を約７,０００ｇで５〜３０分間の遠心分離して沈殿が生じなければ溶解していると言える。また、ＣＮＴ溶液中のＣＮＴを遠心分離などにより回収し、溶媒で洗浄して回収物中に存在する可溶化剤を除いた後、原子間力顕微鏡を用いて確認することもできる。
【００４６】
本発明における可溶化剤として、当該可溶化剤の溶液にＣＮＴを溶解した場合に、図１に示すように、低濃度から高濃度に可溶化剤の濃度を高めると、当該可溶化剤の溶液におけるＣＮＴの溶解度がある濃度（「変曲点濃度」と言う場合がある。）を境に減少するという挙動を示す物資が好ましく用いられる。本発明の製造方法は、可溶化剤の濃度を高めることによって可溶化剤の溶液に溶解しているＣＮＴを析出させ、ＣＮＴ膜を形成させるものである。従って、変曲点濃度よりも高い可溶化剤濃度におけるＣＮＴの濃度が変曲点濃度におけるＣＮＴの濃度よりも小さくなればよい。また、変曲点濃度よりも低い可溶化剤濃度におけるＣＮＴの溶解性の変化はどのような変化であってもよく、変曲点濃度に向かって次第に高くなる場合（例えば図１参照）や変曲点濃度よりも低い濃度ではほとんど変化しない場合でもよい。また、変曲点濃度におけるＣＮＴの濃度と、変曲点濃度よりも高濃度におけるＣＮＴの濃度差が大きくなる物質がより好ましい。この点において、ＣＮＴが分散した溶液から塗膜を形成し、溶媒を蒸散させて製造したＣＮＴ膜とは異なる。
【００４７】
本発明における可溶剤として、特許文献８や９に示された水溶性キシランが例示される。以下においては、可溶化剤として水溶性キシランを用いた例について説明する。本明細書において「キシラン」とは、β−１，４結合によって連結された２以上のキシロース残基を含む分子をいう。本明細書中では、キシロース残基のみから構成される分子（すなわち、純粋なキシロースポリマー）に加えて、それらの修飾された分子、及びアラビノース残基などの他の残基が純粋なキシロースポリマーに結合した分子をも「キシラン」という。純粋なキシロースポリマーは、重合度５までは６ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水に溶解する。しかし、重合度６以上では水への溶解度は６ｍｇ／ｍＬ未満である。
【００４８】
本発明では上記キシランの中でも水溶性キシランが用いられる。本明細書において水溶性キシランとは、β−１，４結合によって連結された６以上のキシロース残基を含む分子であって、２０℃の水に６ｍｇ／ｍＬ以上溶解する分子をいう。水溶性キシランは、純粋なキシロースポリマーではなく、キシロースポリマー中の少なくとも一部の水酸基が他の置換基（例えば、アセチル基、グルクロン酸残基、アラビノース残基など）に置き換わっている分子である。キシロース残基のみからなるキシランの水酸基が他の置換基に置き換わることにより、キシロース残基のみからなるキシランよりも水溶性が高くなることがある。キシロース残基のみからなるキシランの水酸基が他の置換基に置き換わっている分子は、キシロースポリマーに置換基が結合した分子、又は修飾されたキシロースポリマーということもできる。なお、修飾されたキシロースポリマーは、人為的操作によって製造された分子だけでなく、天然に存在する分子をも含む。
【００４９】
水溶性キシランは、その主鎖にキシロース残基又はその修飾物のみを含むことが好ましく、その主鎖にキシロース残基又はアセチル化キシロース残基のみを含むことがより好ましい。本明細書中において、主鎖とは、β−１，４−結合によって連結された最も長い鎖をいう。水溶性キシロースが直鎖状である場合、その分子自体が主鎖であり、水溶性キシロースが分枝状である場合、β−１，４−結合によって連結された最も長い鎖が主鎖である。本発明で用いられる水溶性キシランの主鎖の平均重合度数は、好ましくは約６以上であり、より好ましくは約７以上であり、さらに好ましくは約８以上であり、特に好ましくは約９以上であり、最も好ましくは約１０以上である。本発明で用いられる水溶性キシランの主鎖の平均重合度数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約５００以下であり、特に好ましくは約１００以下であり、最も好ましくは約５０以下である。水溶性キシランの主鎖の平均重合度数が高すぎると水溶性が低すぎる場合がある。
【００５０】
キシロース残基を修飾する親水基は、キシロース残基の１位、２位、３位又は４位のいずれの位置においても結合し得る。１つのキシロース残基に対する親水基の結合箇所は、４箇所の全てであり得るが、３箇所以下が好ましく、２箇所以下がより好ましく、１箇所であることが最も好ましい。親水基は、キシロースポリマーの全てのキシロース残基に結合していてもよいが、好ましくは一部のキシロース残基にのみ結合している。親水基の結合の割合は、好ましくはキシロース残基１０個あたり１個以上であり、より好ましくはキシロース残基１０個あたり２個以上であり、さらに好ましくはキシロース残基１０個あたり３個以上であり、特に好ましくはキシロース残基１０個あたり４個以上であり、最も好ましくはキシロース残基１０個あたり５個以上である。親水基の例としては、アセチル基、α−Ｄ−グルクロン酸残基、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基、Ｌ−アラビノフラノース残基が挙げられる。
【００５１】
キシロースポリマーに４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基及びアセチル基が結合したものは、一般に、グルクロノキシラン（本明細書では「狭義のグルクロノキシラン」と言う。）と呼ばれる。キシロースポリマーにアラビノース残基及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸が結合したものは、一般に、アラビノグルクロノキシランと呼ばれる。本発明における「グルクロノキシラン」は、シロースポリマーに４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基及びアセチル基が結合した狭義のグルクロノキシランやキシロースポリマーにアラビノース残基及び４−Ｏ−メチルグルクロン酸が結合した狭義のアラビノグルクロノキシランに限定されず、キシロースポリマーにグルクロン酸残基又はグルクロン酸残基が有する水酸基の一部又は全部がメチル基等の修飾基で修飾されたグルクロン酸残基が結合した分子を包含する。
【００５２】
また、本発明では、キシロース残基の２位に他の糖残基が結合している水溶性キシランが好ましく用いられる。この水溶性キシランにおいて、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と他の糖残基との割合は、他の糖残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が２０モル以下であることが好ましく、１０モル以下であることがより好ましく、６モル以下であることがさらに好ましい。キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と他の糖残基との割合は、他の糖残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が１モル以上であることが好ましく、２モル以上であることがより好ましく、５モル以上であることがさらに好ましい。
【００５３】
また、本発明では、キシロース残基の２位に４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基がα−１，２−結合している水溶性のキシランが好ましく用いられる。この水溶性キシランにおいて、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基との割合は、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が１００モル以下であることが好ましく、５０モル以下であることがより好ましく、２０モル以下であることがさらに好ましい。キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計と４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基との割合は、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基１モルに対し、キシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計が１モル以上であることが好ましく、５モル以上であることがより好ましく、９モル以上であることがより好ましく、１０モル以上であることがより好ましく、１４モル以上であることがさらに好ましい。
【００５４】
水溶性キシランの数平均分子量は、好ましくは約１００万以下であり、より好ましくは約５０万以下であり、さらにより好ましくは約１０万以下であり、特に好ましくは約５万以下であり、最も好ましくは約２万以下である。水溶性キシランの数平均分子量は、好ましくは約１５００以上であり、より好ましくは約２０００以上であり、さらにより好ましくは約４０００以上であり、特に好ましくは約５０００以上であり、格別好ましくは約６０００以上であり、最も好ましくは約１万以上である。
【００５５】
本発明で用いられる好適な水溶性キシランは、好ましくは木本性植物由来である。水溶性キシランは、植物の細胞壁部分に多く含まれる。木材は特に、水溶性キシランを多く含む。水溶性キシランの構造は、由来する植物の種類に依存して様々である。広葉樹の木材に含まれるヘミセルロースの主成分は狭義のグルクロノキシランであることが公知である。広葉樹に含まれる狭義のグルクロノキシランは、キシロース残基１０：４−Ｏ−メチルグルクロン酸１：アセチル基６の割合で構成されることが多い。広葉樹のヘミセルロースは本発明で用いられる水溶性キシランを多く含む。広葉樹由来の水溶性キシランは、アラビノース残基をほとんど含まないため特に好適である。一方、針葉樹の木材に含まれるヘミセルロースの主成分はグルコマンナンであり、針葉樹の木材はまた狭義のグルクロノキシランや狭義のアラビノグルクロノキシランも含むことが公知である。なお、グルコマンナンは主鎖がマンノース残基とグルコース残基とから構成されており、その比は一般に、マンノース残基３〜４：グルコース残基１である。従って、本発明で用いられる水溶性キシランはより好ましくは広葉樹由来であり、より好ましくはブナ、カバ、アスペン、ニレ、ビーチ又はオーク由来である。
【００５６】
天然に存する水溶性キシランは、異なる分子量を有する種々の分子の混合物である。天然由来の水溶性キシランは、その効果を発揮し得る限り、夾雑物を含んだ状態で使用されてもよく、広い分子量分布を有する集団として使用されてもよく、より狭い分子量分布を有する集団になるように、より高純度に精製されてから使用されてもよい。
【００５７】
少量ではあるが、針葉樹、トウモロコシ、イネ、麦などのイネ科の草本植物などにも水溶性キシランは含まれる。これら由来の水溶性キシランは、４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルクロン酸残基以外に、α−Ｌ−アラビノース残基がキシロース残基に共有結合している。α−Ｌ−アラビノース残基の含量が高すぎるとＣＮＴの可溶化効果が得られない場合があるので、α−Ｌ−アラビノース残基の含量が高いキシランは本発明における使用には好適ではない。穀類（麦、米）、熊笹などの草本性植物から抽出されるヘミセルロースは、キシロース、４−Ｏ−メチルグルクロン酸及びアラビノースから主になるアラビノグルクロノキシランであり、アラビノースの含量が高い。これらの草本性植物由来の水溶性キシランは、水溶性を高めるために一部又は全部のＬ−アラビノース残基を除去することが望まれる。Ｌ−アラビノース残基は、化学的方法又は酵素的方法などの公知の方法によって除去され得る。
【００５８】
本発明では、水溶性キシランが、キシロース残基又はアセチル化キシロース残基と、アラビノース残基と４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基とからなることが好ましい。この実施態様において、水溶性キシラン中のＬ−アラビノース残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約７以上であり、より好ましくは約１０以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。また、この実施態様において、水溶性キシラン中のＬ−アラビノース残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約６０以下であり、さらに好ましくは約４０以下である。
【００５９】
前記の水溶性キシランにおいては、キシロース残基とＬ−アラビノース残基との割合は、Ｌ−アラビノース残基１モルに対し、キシロース残基が７モル以上であることが好ましく、１０モル以上であることがより好ましく、２０モル以上であることがさらに好ましい。Ｌ−アラビノース残基１モルに対するキシロース残基の比に上限はなく、Ｌ−アラビノース残基１モルに対して、キシロース残基は例えば、１００残基以下、６０残基以下、４０残基以下などである。
【００６０】
本発明の特に好ましい実施態様では、水溶性キシランは好ましくはＬ−アラビノース残基を含まない。当該水溶性キシランは、キシロース残基又はアセチル化キシロース残基と４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基とからなる。この実施形態において、水溶性キシラン中の４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約１以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約９以上であり、さらに好ましくは約１０以上であり、さらにより好ましくは約１４以上である。この実施形態において、水溶性キシラン中の４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基１に対してキシロース残基及びアセチル化キシロース残基の合計は、好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約５０以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。本発明のさらに望ましい実施態様では、水溶性キシランはアセチル化キシロース残基を含まない。
【００６１】
水溶性キシランは、例えば木材から、公知の方法に従って精製される。水溶性キシランの精製方法としては、例えば、脱リグニン処理した木材を原料として、１０％程度の水酸化カリウム溶液で抽出する方法などが挙げられる。水溶性キシランはまた、木材から製造された粉末セルロースを水に分散し、この溶液を濾紙、０．４５μｍフィルター、０．２μｍフィルターで順次濾過して得られる濾液を乾燥することによっても得られる。例えば、特許文献８の調整例１に記載された水溶性キシランの製造方法がある。
【００６２】
（３．溶媒）
本発明で用いられる溶媒は、可溶化剤が溶解しうる溶媒であり、より好ましくは可溶化剤が室温（約２０℃）で１リットルあたり約１０ｇ以上溶解できる溶媒である。このような溶媒は水系溶媒であり、水及び水と混和性のある任意の有機溶媒である。本発明で用いられる水系溶媒は、より好ましくは水又は水と当該有機溶媒との混液であり、最も好ましくは水である。有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、γ−ブチルラクトン、プロピレンカーボネート、スルホラン、ニトロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、Ｎ−メチルピロリドン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタンが挙げられる。
【００６３】
水と有機溶媒とを混合する場合、溶媒全体のうちの水の割合は、約５０容積％以上であることが好ましく、約６０容積％以上であることが好ましく、約７０容積％以上であることが好ましく、約８０容積％以上であることが好ましく、約９０容積％以上であることが好ましく、約９５容積％以上であることが最も好ましい。水と混合される有機溶媒は、１種類であっても２種類以上であってもよい。環境への影響及び人体への影響などを考慮すると、溶媒は水であるか又は主に水からなること、つまり、溶媒の約８０容積％以上が水である溶媒が好ましい。
【００６４】
溶媒に可溶化剤、例えば水溶性キシランを添加して、可溶化剤の溶液を作製し得る。可溶化剤溶液中の可溶化剤の濃度は、可溶化剤が溶解し得る限り、任意に設定され得る。本発明においては、ＣＮＴを可溶化する最大の濃度、つまり変曲点濃度又はその近傍が選択される。可溶化剤溶液中の可溶化剤の濃度を変曲点濃度の近傍に調整することで、多量のＣＮＴを溶解させることができる。また、この濃度よりも極端に高い濃度や極端に低い濃度は好ましくない。ＣＮＴ溶液の作製時におけるＣＮＴの溶解度と、溶媒の蒸散により可溶化剤の濃度が高くなった際におけるＣＮＴの溶解度との差が小さく、ＣＮＴ膜の形成が不十分になる場合がある。
【００６５】
可能化剤の濃度は、可溶化剤の種類によっても異なるが、例えば０.０１重量％以上であり、好ましくは０.０５重量％以上であり、好ましくは０.１重量％以上であり、好ましくは１重量％以上、好ましくは２重量％以上、さらには５重量％以上である。また、可溶化剤の濃度は１０重量％以下であり、好ましくは５重量％以下であり、好ましくは２重量％以下であり、さらには１重量％以下である。また、可溶化剤として水溶性キシランを用いる場合は、水溶性キシラン溶液中の水溶性キシランの濃度は、好ましくは０.０５重量％以上であり、より好ましくは０.１重量％以上であり、より好ましくは０.２重量％以上である。溶液中の水溶性キシランの濃度は、好ましくは５重量％以下であり、好ましくは２重量％以下であり、好ましくは１.５重量％以下であり、より好ましくは１重量％以下、さらに好ましくは０.５重量％以下である。例えば、０.０５重量以上１重量％以下、好ましい場合では０.０５重量％以上０.５重量％以下の濃度範囲となる量であることが好ましい。最も好ましいのは、ＣＮＴの溶解量が最も高くなる濃度である。
【００６６】
（４．ＣＮＴ溶液の調製）
次いで、可溶化剤を含む混合液に、ＣＮＴを添加してＣＮＴの溶液を得る。添加するＣＮＴは、粉末の形態であることが好ましい。また、水溶性キシランとＣＮＴとを予め混合した後、これに溶媒を添加することによってＣＮＴ溶液を得てもよい。また、他の機械的手段によって充分に混合してもよい。
【００６７】
添加されるＣＮＴの量は任意に設定され得る。また、その量は、可溶化剤、例えば水溶性キシランの溶液に飽和するＣＮＴの量が最も好ましく、その量以下の量でもよい。また、その量以上の添加量であってもよい。溶解せずに溶液に分散しているＣＮＴは、例えば遠心分離により除去されうるからであり、溶液の上清を供給すればよいからである。添加されるＣＮＴの量は、例えば、溶液１００重量部に対して０.１重量部以上、０.２重量部以上、０.５重量部以上、１重量部以上、又は５重量部以上であり得る。添加されるＣＮＴの量は、例えば、溶液１００重量部に対して１０重量部以下、７.５重量部以下、５重量部以下、３重量部以下、は約１重量部以下であり得る。
【００６８】
次いで、例えば溶媒との混合物に超音波を投射することにより該ＣＮＴを溶解させる。超音波を投射する方法は、水溶性キシラン溶液にＣＮＴを均一に溶解させ得る方法である限り、その超音波の投射方法、周波数、時間などの条件は特に限定されるものではない。超音波を投射する際の温度及び圧力も、水溶性キシラン及びＣＮＴを含む溶液が、液体状態を保つ条件であればよい。例えば、水溶性キシラン及びＣＮＴを含む溶液をガラス容器に入れ、バス型ソニケーターや超音波ホモジナイザーを使用して、室温で超音波を投射することが行われる。超音波ホモジナイザーは、溶液に超音波振動を加えた際に生じるキャビテーションを利用して、溶液中の物質に激しい衝撃を加える装置である。キャビテーションとは、加えられた超音波振動が圧力波となり、溶液の中での局所的な圧力低下により形成される無数の極めて小さな気泡が連続してつぶれることであり、圧力波のサイクルが負のときに形成された気泡が、正のときにつぶれ、溶液中の物質に激しい衝撃を繰り返し与える。超音波ホモジナイザーは発振面が円錐形になったホーンを有しており、溶液に漬けたホーンの先端から投射された振動エネルギーが溶液を入れたカップの中央に集中し、強い衝撃が与えられる。ＣＮＴの溶解性を高めるには超音波ホモジナイザーがより好ましい。溶液のゼータ電位を測定した結果によると、超音波ホモジナイザーを用いるとゼータ電位が低くなる傾向にあり、ＣＮＴの会合が緩和されやすく、水溶性キシラン溶液への溶解性が上がるからである。
【００６９】
超音波発振機における定格出力は、超音波発振機の単位底面積当たり約０.１ワット／ｃｍ２以上が好ましく、約０.２ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約０.３ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約１０ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約５０ワット／ｃｍ２以上がより好ましく、約１００ワット／ｃｍ２以上が最も好ましい。超音波発振機における定格出力は、超音波発振機の単位底面積当たり約１５００ワット／ｃｍ２以下が好ましく、約７５０ワット／ｃｍ２以下がより好ましく、約５００ワット／ｃｍ２以下がより好ましく、約３００ワット／ｃｍ２以下が最も好ましい。発振周波数は約１０ＫＨｚ以上が好ましく、約１５ＫＨｚ以上がより好ましく、約２０ＫＨｚ以上が最も好ましい。発振周波数は２０から５０ＫＨｚの範囲で使用することが好ましい。振幅は、約２０μｍ以上であることが好ましく、約３０μｍ以上であることが最も好ましい。振幅は、約４０μｍ以下であることが好ましい。また、超音波投射処理の時間は約１分間〜約３時間が好ましく、より好ましくは約３分間〜約３０分間である。超音波を投射する際又はその前後に、ボルテックスミキサー、ホモジナイザー、スパイラルミキサー、プラネタリーミキサー、ディスパーサー、ハイブリットミキサーなどの撹拌装置を用いてもよい。混合物の温度は、ＣＮＴが分解又は変質せず、溶媒が揮発しすぎない温度であれば任意の温度であり得る。例えば、約５℃以上であり、好ましくは約１０℃以上であり、さらに好ましくは約１５℃以上であり、さらに好ましくは約２０℃以上であり、最も好ましくは約２５℃以上である。混合物の温度は、例えば、約１００℃以下であり、好ましくは約９０℃以下であり、さらに好ましくは約８０℃以下であり、さらに好ましくは約７０℃以下であり、最も好ましくは約６０℃以下である。もっとも、ＣＮＴが可溶化剤の溶液に溶解される限り、超音波の投射による方法に限らず、攪拌など機械的な手段によってもよい。
【００７０】
溶液中のＣＮＴの濃度は、ＣＮＴが溶解可能である限り、任意に設定され得る。溶液中のＣＮＴの濃度は、好ましくは３０ｍｇ／Ｌ（約０.００３重量％）以上であり、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ（約０.００５重量％）以上であり、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ（約０.０１重量％）以上であり、さらに好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ（約０.０１５重量％）以上であり、さらに好ましくは３００ｍｇ／Ｌ（約０.０３重量％）以上であり、さらに好ましくは４００ｍｇ／Ｌ（約０.０４重量％）以上であり、さらに好ましくは５００ｍｇ／Ｌ（約０.０５重量％）以上であり、さらに好ましくは６００ｍｇ／Ｌ（約０.０６重量％）以上であり、さらに好ましくは７００ｍｇ／Ｌ（約０.０７重量％）以上であり、最も好ましくは８００ｍｇ／Ｌ（約０.０８重量％）以上である。溶液中のＣＮＴの濃度はまた、１ｇ／Ｌ（約０.１重量％）以上、２ｇ／Ｌ（約０.２重量％）以上、３ｇ／Ｌ（約０.３重量％）以上、４ｇ／Ｌ（約０.４重量％）以上又は５ｇ／Ｌ（約０.５重量％）以上であることが好ましい場合がある。ＣＮＴが溶解し得る限り、本発明の溶液中に含まれるＣＮＴの濃度に上限はなく、その飽和濃度が最も好ましい。溶液中に含まれるＣＮＴの濃度は、通常、１００ｇ／Ｌ（約１０.０重量％）以下、７０ｇ／Ｌ（約７.０重量％）以下、５０ｇ／Ｌ（約５.０重量％）以下、４０ｇ／Ｌ（約４.０重量％）以下、３０ｇ／Ｌ（約３.０重量％）以下、２０ｇ／Ｌ（約２.０重量％）以下、１５ｇ／Ｌ（約１.５重量％）以下、１０ｇ／Ｌ（約１重量％）以下、５ｇ／Ｌ（約０.５重量％）以下、２ｇ／Ｌ（約０.２重量％）以下又は１ｇ／Ｌ（約０.１重量％）以下である。なお、これらの濃度は２０℃で測定した濃度である。
【００７１】
この溶液中にはＣＮＴが溶解している。ここにおいて、ＣＮＴが溶解しているとは、ＣＮＴを含む溶液を、２０℃にて２,２００×ｇで１０分間遠心分離した後にその液体全体にＣＮＴが依然として分布しており、ＣＮＴを含む溶液の呈色の低下、沈澱などが認められないことをいう。溶液中では、ＣＮＴは、ほぼ単一の分子として溶解している。
【００７２】
溶液中に溶解又は分散しているＣＮＴの量は、例えば、７０,０００×ｇ、１５分間遠心分離してＣＮＴを回収し、重量を測定することにより測定することができる。また、「Chem. Commun. J. p.193(2001)」に記載差れているように、ＣＮＴの濃度は、５００ｎｍでの吸光度と極めて良好な相関関係があり、水溶性キシランはこの波長での吸収はない。
【００７３】
（５．基材表面への供給）
上記で得られた溶液は、基材表面に供給され、基材表面に液の層を形成する。溶液の供給は、塗布や滴下などの方法により行われる。溶液の塗布量は適宜定められ得る。ＣＮＴの溶液の塗布量は、基材の表面積１ｃｍ２に対して、０.００１ｍｌ以上、好ましくは０.０１ｍｌ以上、好ましくは０.０５ｍｌ以上である。ＣＮＴの溶液の塗布量は、基材の表面積１ｃｍ２に対して、０.５ｍｌ以下、０.１ｍｌ以下、好ましくは０.０５ｍｌ以下である。
【００７４】
塗布の方法は、基材の表面に液の層を形成できる方法であれば特に限定されない。ここで、液の層は、塗膜のように薄く膜状になった液層に限らず、窪みに液を入れた場合に出来る液溜まりや液滴のように膜とは認識できないような厚みのある液層を含む。例えば、グラビアコーター、ロールコーター、カーテンフローコーター、スピンコーター、バーコーター、リバースコーター、キスコーター、ファンテンコーター、ロッドコーター、エアドクターコーター、ナイフコーター、ブレードコーター、キャストコーター、スクリーンコーター等を用いた塗布方法、エアスプレー、エアレススプレー等のスプレーコーティング等を用いた噴霧による方法、ディップ等の浸漬方法等が用いられる。塗布は刷毛を用いた手塗りによっても行われる。また、基材の表面に液滴を滴下する方法でもよい。細胞培養用のシャーレや有穴プレートのように窪みを有する基材であれば、当該窪みにＣＮＴの溶液を投入して、液の層を形成し得る。
【００７５】
基材の具体例として、細胞培養用の器具や体内埋め込み型医療器具が例示される。細胞培養用の器具は、細胞の培養に用いられるあらゆる器具であって、プレパラート用のスライドガラス、カバーガラス、シャーレ（laboratory dish）、ペトリ皿、細胞や培養液を入れる窪みを有する有穴プレート、培養液を入れるボトル、３次元的に細胞を増殖させるための立体構造を有する細胞培養用の支持体を含む。体内埋め込み型医療器具とは、一時的又は継続的に体内に埋め込まれて使用される医療器具を意味し、移植用に形成された骨や歯（いずれも人工のものを含む）、骨欠損部位や皮膚欠損部位に適用される補綴材、カテーテル、人工関節、骨スクリュー、人工歯根、人工椎体、人工椎間板、骨補填材、骨プレートなどを含む。幹細胞の培養・分化のためには、細胞培養用の器具、医療器具が好適である。
【００７６】
これらの基材は任意の材料、例えばプラスチック、高分子化合物、金属、セラミック又はこれらから選ばれる１種又は２種以上を含む複合材からなどから構成され得る。金属としては、金、銀、銅、白金、パラジウム、金合金、白金合金、銀合金、銅合金、金銀パラジウム合金、ステンレス鋼、コバルト−クロム合金、チタン合金、チタンニッケル合金などがある。プラスチックや高分子化合物としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、キチン、アルブミン、再生セルロース、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、ポリ乳酸、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリラクトン、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネートポリエーテル、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタラート、シリコーン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、メタクリル樹脂、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、ポリアラミド、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニレンエーテル、ポリエーテルニトリル、ポリアミドイミド、ポリエーテルサルホン、ポリサルホン、ポリエーテルイミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリウレタン、そのフィルム、発泡体及びエラストマー、天然ゴム、合成ゴムなどがある。セラミックスとしては、ガラス、アルミナ、ジルコニア、バイオガラス、ハイドロキシアパタイトなどがある。ハイドロキシアパタイトは、一般組成をＣａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、とする化合物であり、ＣａＨＰＯ４ 、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４)２・Ｈ２Ｏなどリン酸カルシウムと称される１群の化合物を含む。Ｃａ成分の一部分は、Ｓｒ、Ｂａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ａｌ、Ｙ、Ｌａ、Ｎａ、Ｋ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｈなどから選ばれる１種以上で置換されてもよい。
【００７７】
これらの基材には、少なくともその一つの面状に薄膜を形成させるので、該薄膜の密着性を向上させる目的で上記フィルム表面をコロナ表面処理又はプラズマ処理することが好ましい。
【００７８】
（６．塗膜の乾燥）
次に基材表面に供給された溶液は乾燥に付され、溶媒が蒸散される。乾燥は、自然乾燥又は強制乾燥であり得る。自然乾燥は自然の状態で放置することである。強制乾燥は、強制的に高温にした環境下で放置することである。乾燥時の温度は、１０℃以上、好ましくは２０℃以上、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４０℃以上である。乾燥時の温度は１００℃以下、好ましくは８０℃以下、好ましくは７０℃以下、より好ましくは６０℃以下である。
【００７９】
基材表面にＣＮＴが少なくとも析出するまで、乾燥に付される。乾燥時間は適宜選択されうる。本発明においてＣＮＴが析出するとは、可溶化剤である水溶性キシラン濃度の高まりに従って、基材表面上の溶液に溶解できなくなったＣＮＴが基材表面に出現することである。少なくともＣＮＴが析出するとは、出現したＣＮＴがネットワークを形成する程度に、ＣＮＴが基材表面に出現することであり、ＣＮＴによるネットワークが基材表面に形成された後は溶媒が蒸散しなくなるまで乾燥してもよいことを含む。本発明においては、水溶性キシランとＣＮＴの溶液が基材表面に残る状態、つまり液の層を維持した状態で溶媒を蒸散するのが好ましい。これにより、析出したＣＮＴが基材表面に付着して、ＣＮＴのネットワークからなるＣＮＴ膜が形成される。
【００８０】
（８．溶液の除去）
溶媒の蒸散により、基材表面には析出したＣＮＴが付着すると共に水溶性キシランとＣＮＴを含む溶液が残る。この場合には、残った溶液を除去する。除去は任意的工程である。除去は吸引によることもできるが、除去のための特別な装置は不要である。基材表面を傾けると基材表面の溶液が流れ落ちる。形成されたＣＮＴ膜は、基材表面における分子間力によって基材表面に付着し、基材の傾斜では表面から剥離しない。
【００８１】
（９．水洗）
溶媒を蒸散させた後の基材表面は水洗される。水洗により、基材の表面に残留していたＧＸ及び余剰のＣＮＴが洗い流され、基材表面上にＣＮＴ膜が残る。その後、必要に応じて乾燥に付される。乾燥は、自然乾燥又は強制乾燥であり得る。自然乾燥は自然の状態で放置することである。強制乾燥は、強制的に高温にした環境下で放置することである。乾燥時の温度は、１０℃以上、好ましくは２０℃以上、好ましくは５０℃以上、より好ましくは８０℃以上、より好ましくは１００℃以上である。乾燥時の温度は２００℃以下、好ましくは１５０℃以下、好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下である。この乾燥により基材表面にＣＮＴ膜が固定される。
【００８２】
（１０．幹細胞の分化）
ＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具は細胞培養のために使用される。本発明の細胞培養用の器具は公知の器具と何ら変わるところなく使用できる。また、本発明の製造方法により形成されたＣＮＴ膜は幹細胞の分化を刺激し、又は促進しうる。分化を刺激するとは、ＣＮＴ膜を有しない細胞培養用の器具において分化が生じなかった細胞が、ＣＮＴ膜を有する細胞培養用の器具において分化が生じることであり、分化を促進するとは、ＣＮＴ膜を有しない細胞培養用の器具で培養した場合に比べて、分化を生じる細胞数が多いことあるいは分化を生じるまでの期間が短くなることを言う。
【００８３】
幹細胞は、未分化かつ無限定増殖及び特定細胞への分化能を有する細胞である。幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び胚性生殖細胞（ＥＧ）及び誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPS細胞）を含む全能性幹細胞（pluripotent stem cell）と組織幹細胞（tissue stem cell）であり得る。組織幹細胞は、体性幹細胞(somatic stem cell)もしくは成体幹細胞（adult stem cell）とも称される。胚性幹細胞は胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、胚性生殖細胞は５−１０週齢の生殖隆起(gonadalridge)の始原生殖細胞に由来する。組織幹細胞は胚組織、胎児組織及び成体組織で発見され、発生過程の組織や器官の形成と、障害時の再生・修復に関わる。全能性幹細胞は生体外（in-vitro）で無限定増殖し、３種類の胚葉（外胚葉、中胚葉と内胚葉）に由来する多様な細胞に分化する能力を有する。一方、組織幹細胞はそれが由来する特定組織に分化できる能力を有し、自己複製能力を、その染色体テロメアの伸長を伴わない６０回以内の体細胞分裂回数により制限される場合が多い。幹細胞の起源は全ての組織である。分化には、例えば、骨髄、血液、肝臓、皮膚、腸、膵臓、脳、骨格筋及び歯髄から主に分離された幹細胞が好ましく用いられ、特に骨髄から分離された幹細胞がより好ましい。
【００８４】
骨髄から分離される幹細胞は、造血系幹細胞(ＨＳＣ：hematopoietic stem cell)、間葉系幹細胞(ＭＳＣ：mesenchymal stem cell)などを含み得る。ＭＳＣは、臍帯血(cord blood)、脂肪組織（adipose tissue）などにも含まれることが報告されているので、骨髄由来の細胞については骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ：bone marrow stromal cell）とも呼ばれる。ＭＳＣは骨、軟骨、脂肪組織、心筋、腱などに分化する能力を持つ。ＨＳＣは血球（赤血球、白血球各種細胞、血小板）、免疫担当細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンパ球）などに分化できる能力を有する。
【００８５】
本発明のＣＮＴ膜は、細胞の分化にも寄与しうる。特にＭＳＣの分化に寄与し、骨芽細胞への分化を促進し得る。また、骨芽細胞における石灰化を促進する。間葉系幹細胞に由来する骨芽細胞（osteoblast）は、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ：alkaline phosphatase）の活性が高い細胞で、βグリセロリン酸存在下でコラーゲン線維の表面にリン酸カルシウムを沈着させて骨形成を行う。造血系幹細胞に由来する破骨細胞（osteoclast）は多核の大型の細胞で、骨基質を溶かす作用がある。従って、本発明の分化誘導には骨芽細胞がより好ましく用いられる。また、歯髄に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、象牙（質）芽細胞に分化し、歯の形成に係ることが知られている。歯髄由来の間葉系幹細胞も本発明の分化誘導に用いられる。
【００８６】
頭部を構成する骨の形成と首から下部にある骨格を構成する骨とは異なる。外胚葉（ectoderm）由来の神経堤（神経冠）細胞（ＮＣＣ： neural crest cell）に由来する一部の細胞が間葉系幹細胞に類似した性質を有し、これから分化した骨芽細胞が頭部を構成する骨を形成する。中胚葉(mesoderm)由来の間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞が首から下部にある骨格を構成する骨を形成する。本発明において用いられる骨芽細胞は、頭部の骨形成のための間葉系幹細胞及び首から下部にある骨格を構成する骨形成のための間葉系幹細胞の両者を含み得る。
【００８７】
骨芽細胞への分化や骨分化誘導は、培養細胞中に生成されたＡＬＰの活性により確認できる。対照となるＣＮＴ膜を有しない対照の細胞培養用の器具で培養した場合に比べて、ＡＬＰの活性が高ければ、分化が促進されたと言える。なお、本願発明者らの実験では、特許文献１に記載された細胞培養用の器具における分化誘導では間葉系幹細胞の骨分化を促進する効果は見られなかった（データ示さず）。一方、本発明のＣＮＴ膜を表面に備えた細胞培養用の器具における培養では骨分化の促進が見られた。両者の間で相違が見られる理由については説明できないが、ＣＮＴ膜におけるＣＮＴ分子の会合度の違いによるものと考えられる。
【００８８】
このように、本発明のＣＮＴ膜は、細胞培養用の器具において幹細胞の分化に利用される。また、本発明のＣＮＴ膜は、外胚葉由来の神経堤（神経冠）細胞（ＮＣＣ）の分化誘導も行い得る。ＮＣＣは、骨髄、毛包、後根神経節（ＤＲＧ）から分離される。ＮＣＣは本来末梢神経系に分化する能力を有するが、中枢神経系の再生にも寄与しうる。さらに、ＭＳＣは骨のほか、軟骨、脂肪組織、心筋、腱、などにも分化する能力を有する。従って、本発明のＣＮＴ膜を有する細胞培養用の支持体は、体内に埋め込まれ、各種臓器や神経などの修復（再生治療）としても好適に利用され得る。
【００８９】
本発明のＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具は、細胞増殖用の器具としても利用されうる。細胞増殖とは細胞が増殖することであり、分化をも含み得る。増殖可能な細胞は制限がなく、例えば、上皮細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、肝細胞、神経細胞、がん細胞等の接着性細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び胚性生殖細胞（ＥＧ）を含む全能性幹細胞や組織幹細胞のような幹細胞を含み得る。
【００９０】
細胞が由来する動物種は、ヒト、犬、猫、馬、牛などの哺乳類、鳥類などのすべての動物種を含む。
【００９１】
幹細胞の分化や細胞の培養に用いられる培地の制限はない。これらの培地は例えば、種々の組成のイーグル培地、ＲＰＭＩ培地、ＨａＭ'ｓ培地、Ｆｉｓｈｅｒ'ｓ培地、ＭＣＤＢ培地等を含み得る。イーグル培地は、ＢＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等を含み得る。このうち、哺乳動物細胞の培養においては例えばイーグル培地を好ましく採用し得る。上記培地は５〜１０％程度の血清を含む血清培地、あるいは５％未満の血清を含む血清培地、さらには実質的に血清を含まない無血清培地であり得る。
【００９２】
培養手法は特に限定されず、培養する細胞や目的とする細胞培養物に応じた培養方法、培養条件等を適宜選択し得る。培地の組成や濃度、培養温度、培養期間等の条件は任意である。例えば、一般的な哺乳動物細胞の場合、室温から哺乳動物の体温程度の温度、例えば２０〜４０℃程度、より好ましくは３３〜３８℃程度の培養温度が採用され得る。また、例えば半日〜１２ヶ月程度、好ましくは１週間〜３カ月、より好ましくは１週間〜４週間の培養期間が好ましく採用され得る。培地のｐＨ上昇を防止するために、培養雰囲気中のＣＯ２濃度はほぼ一定に保たれるのが好ましい。そのＣＯ２濃度は、例えば０.５〜１０％以下、好ましくは１〜８％、より好ましくは３〜７％、最も好ましいのは５％程度である。
【実施例１】
【００９３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。
【００９４】
（ＣＮＴ溶液の調製）
水溶性キシランとしてグルクロノキシラン（スロヴァキア科学アカデミー製、数平均分子量１８，０００、キシロース残基：４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基＝１０：１；アセチル化なし；ブナ由来：及び江崎グリコ製Lot.080126）を用いた。
【００９５】
ＣＮＴとして、単層ＣＮＴ（ＳＷＮＴ：名城ナノカーボン製、マークプラズマジェット法及びUnidym製、HiPCO法）並びに多層ＣＮＴ（ＭＷＮＴ：バイエル製DP-LP150P、ＣＶＤ法及びナノシル製NC7000、ＣＶＤ法）を用いた。
【００９６】
各ＧＸの０.０１ｍｇ／ｍｌ、０.０５ｍｇ／ｍｌ、０.１ｍｇ／ｍ、０.２ｍｇ／ｍｌ、０.５ｍｇ／ｍｌ、１.０ｍｇ／ｍｌの水溶液を調製し、その１ｍｌにそれぞれ上記ＣＮＴの４ｍｇを添加し、室温（２０℃）にて５０分間超音波を連続的に投射した。超音波ホモジナイザー（BRANSON製 Sonifier 450）及びバスタイプ超音波洗浄器（SHARP製 T-304）を用いて超音波を投射し、ＣＮＴを溶解及び分散させた。
【００９７】
この溶液を、高速遠心機(HITACHI製himac CR22)を用いて２０℃、１０分間、１,６３０Ｇで遠心分離し、さらにその上清を２０℃、１５分間、２３,８００Ｇで遠心分離して、上清を分取した。
【００９８】
（グルクロノキシラン溶液におけるＣＮＴの溶解性）
上清中のＣＮＴの溶解度を測定した。その結果は図１〜８に示された。溶解度は５００ｎｍにおける吸光度で示した。吸光度の測定は室温（１５〜２５℃）にて行われた。また、吸光度の測定には分光光度計(島津製作所製UV-1600PC)を用いた。
【００９９】
各図に示すように、いずれの場合もある濃度（変曲点濃度）に至るまではＧＸ濃度が高くなるにつれ、ＣＮＴの溶解度は高くなる傾向にあるが、当該変曲点濃度よりＧＸ濃度が高くなればＣＮＴの溶解度が低下した。これにより、低い濃度のＧＸ水溶液中に溶解していたＣＮＴは、水の蒸散に従って濃度が高くなったＧＸ水溶液に溶解されずに析出し得ることが理解された。
【０１００】
（ＣＮＴ膜の形成）
ＣＮＴの溶解性が最もよかった１ｍｇ／ｍｌ又は２ｍｇ／ｍｌ濃度のＧＸ水溶液３ｍｌに、１２ｍｇのＣＮＴを添加した後、上記の条件に従って２種類の超音波装置を用いてＣＮＴを分散し、遠心分離（２０℃、１０分間、１,６００Ｇ）による上清をＣＮＴ溶液とした。
【０１０１】
この溶液の全量を細胞培養用のシャーレ（Laboratory dish：IWAKI製、直径３５ｍｍ）に添加し、室温で２日間静置した。静置後、シャーレを傾斜することによりシャーレ上のＣＮＴ溶液を除去した。次いでシャーレ表面を大量の水で３回洗浄した後、６０℃で乾燥させ、シャーレにＣＮＴ膜を形成した。
【０１０２】
（ＡＦＭ分析）
得られたＣＮＴ膜をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察した。シャーレ表面に傷をつけないようにＣＮＴ膜を５ｍｍ四方に切り取り観察に供した。Veeco製ＭＭＡＦＭ型マルチモードを使用し、Tappingモードで測定した。プローブはModel:RTESP、Part：MPP-11100-10を使用し、大気中、室温（１５〜２５℃）にて行った。また、その断面画像から接着しているＣＮＴの直径を測定し、全２０カ所の測定からその平均値を求めた。その代表的な画像を図９及び図１０に示した。図９はそれぞれＳＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜（スロヴァキア科学アカデミー製のＧＸ水溶液に、名城ナノカーボン製のＣＮＴを溶解した溶液を使用）の例であり、図１０はＭＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜（スロヴァキア科学アカデミー製のグルクロノキシラン水溶液に、バイエル製のＣＮＴを溶解した溶液を使用）の例である。参考のために、市販品である未使用の名城ナノカーボン製の単層ＣＮＴコートディッシュについても同様に観察した。その画像を図１１に示した。
【０１０３】
ＳＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜ではＣＮＴの直径は平均１.６４ｎｍ、ＭＷＮＴが使用されたＣＮＴ膜ではＣＮＴの直径は約１４.９ｎｍ、参考例であるＣＮＴ膜では７.１〜９.４ｎｍと算出された。使用したＳＷＮＴの直径は約０.５〜１.８ｎｍ、ＭＷＮＴの直径は約５.０〜１０ｎｍであり、本発明のＣＮＴ膜では、ＣＮＴの会合が緩和され、十分に分散されたＣＮＴ膜が形成されていると言える。
【実施例２】
【０１０４】
（細胞培養用の器具の作製）
細胞培養のためにＣＮＴ膜を備えた細胞培養用の器具（カバーガラス）を新たに作製した。０.２ｍｇ／ｍｌのＧＸ水溶液（スロヴァキア科学アカデミー製、数平均分子量１８，０００、キシロース残基：４−Ｏ−メチル−Ｄ−グルクロン酸残基＝１０：１；アセチル化なし）の３ｍｌに、１２ｍｇのＳＷＮＴ（名城ナノカーボン製）及びＭＷＮＴ（バイエル製DP-LP150P）を添加した後、実施例１に記載の条件に従って超音波ホモジナイザーを用いてＣＮＴを溶解した。このＣＮＴ溶液の１ｍｌを、直径１２ｍｍのカバーガラス上に滴下し、６０℃で乾燥して溶媒をほぼ蒸散させた。次いで、十分に水洗した後、６０℃で十分に乾燥して、ＣＮＴ膜を備えたカバーガラスを作製した。
【０１０５】
（ＧＸの残留）
ＣＮＴ膜に残留するＧＸの検出を試みた。ＧＸの存在量は、標準品となるＧＸがなく、ＧＸの分子量によっても異なる。そこで、ＣＮＴ膜の調整に用いたＧＸを用いて作製した標準サンプルと対比することで、ＧＸの存否を確認することにした。色素（ＲＢＢ：レナゾール・ブリリアント・ブルー；スロヴァキア科学アカデミー製）で標識されたＧＸの水溶液（０.２ｍｇ／ｍｌ）の３ｍｌに、１２ｍｇのＳＷＮＴ（名城ナノカーボン製）を添加し、上記と同様にしてＣＮＴ膜を有するカバーガラスを作製した。また、色素で標識されたＧＸの水溶液の１ｍｌをカバーガラスに滴下し、６０℃で乾燥して標準サンプルを作製した。なお、標準サンプルは水洗されていない。それぞれ標準サンプル及びＣＮＴ膜を備えたカバーガラスについて、それぞれ４００ｎｍ〜８００ｎｍにおける透過率を、分光光度計を用いて測定した。その結果を図１２に示す。色素による吸収が見られる約５００〜約７００ｎｍにおいて、ＣＮＴ膜を有するカバーグラスの透過率は低下せず、非処理のカバーグラスとほぼ同じ透過率であった。この結果から、基材（カバーグラス）上に形成されたＣＮＴ膜はＧＸを含まないと言える。
【０１０６】
（骨芽細胞の培養）
上記カバーグラス上において、骨芽細胞のモデル株であるヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ細胞）を培養し、細胞の接着量及び細胞の形態を観察した。対照としてポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）の膜を表面に備えたカバーグラスを用いて同様に培養を行った。ＰＬＯ水溶液（０.１ｍｇ／ｍｌ）にカバーグラスを３７℃で１２時間浸した後、室温で風乾させてＰＬＯの膜を有するカバーガラスを作製した。培養には１％ＦＢＳ(Cat No.12603C、Lot No.6M0672、６５℃、３０min非働化済)を含むＭＥＭ培地（Earle's minimum essential medium）と１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地を用いた。ＭＥＭ培地は１０ｍｇ／ｍｌのＮＥＡＡ（non-essential amino acid solution）、抗生物質−抗真菌剤 Mix（Antibiotic-Antimycotic：Invitrogen 15240-062）を含む。各培地にて０.５×１０５cells／ｍｌの細胞濃度でＨＯＳ細胞を蒔き、３７℃、５％ＣＯ２に調整されたインキュベーターで３日間培養した。培養開始１日目、３日目に、４％のパラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を添加して、細胞固定を行った。固定後、それぞれ光学顕微鏡による形態観察、細胞数の計測、ＡＦＭ観察及び蛍光顕微鏡観察を実施した。
【０１０７】
（初期接着量の計測）
ＨＯＳ細胞の初期接着量が、培養開始１日目に固定した細胞の顕微鏡画像（図１４参照）をもとにした単位面積当たりの細胞数を数えることによって求められた。その結果を図１３に示す。１０％ＦＢＳ含有条件下におけるＨＯＳ細胞の初期接着量は、ＳＷＮＴとＭＷＮＴのいずれのＣＮＴを用いた場合でも、対照の初期接着量と同等の値を示したが、１％ＦＢＳ添加条件下の初期接着量は対照の初期接着量よりも小さかった。また、１０％ＦＢＳ添加条件下の細胞増殖率は対照のそれとほぼ同じであったのに対し、１％ＦＢＳ添加条件下の細胞増殖率は対照のそれよりも小さくなった。１０％ＦＢＳ添加条件下では培養された細胞は均一に進展したのに対し、１％ＦＢＳ添加条件下では細胞同士が接着する傾向にあり、凝集した細胞群が多く見られた（図１４参照）。ＣＮＴ膜を有する細胞培養用の器具を利用した場合でも、ＦＢＳの添加量を多くした培地を用いれば、ＣＮＴ膜表面に細胞の付着が良好に観察され、増殖性に影響を及ぼすことなく培養できた。
【０１０８】
（ＡＦＭ観察）
細胞が付着したカバーガラスをＡＦＭ観察に供した。Veeco製ＭＭＡＦＭ型マルチモードを使用し、Tappingモードで測定した。プローブはModel:RTESP、Part：MPP-11100-10を使用し、大気中、室温（１５〜２５℃）にて行った。その結果を図１５〜図１７に示す。１％ＦＢＳ添加条件下では細胞同士の接着がみられ、１０％ＦＢＳ添加条件下では細胞同士の接着はみられなかった。しかしながら、ＡＦＭ観察によると、１％ＦＢＳ添加条件及び１０％ＦＢＳ添加条件いずれの培養条件でも、突起状の仮足が観察された（図１６及び図１７参照）。また、細胞が存在する場所における表面高さを測定したところ、１％ＦＢＳ添加条件下では、その表面高さは対照の表面高さよりも大きな値を示したが、１０％ＦＢＳ添加条件下ではその表面高さは対照の表面高さとほぼ同じであった。１％ＦＢＳ条件下では、接着性は良好であるとは言えないがＣＮＴ膜が接着性を阻害するものではなかった。一方、１０％ＦＢＳ条件下では良好な接着性を示した。以上の結果から、ＣＮＴ膜を備えたカバーガラスは接着性細胞の培養に使用し得るものと判断される。
【０１０９】
（蛍光顕微鏡観察）
アクチンフィラメント、ビンキュリン及び核を対象とする多重蛍光染色法により染色された細胞を顕微鏡観察に供した。ＰＬＯを用いた対照では、アクチンフィラメントは密な繊維状の網目構造を有し、ストレスファイバーが形成された。１％ＦＢＳ培養条件下ではアクチンフィラメントの構造を形成しなかったのに対し、１０％ＦＢＳ培養条件下では、対照と同様に、アクチンフィラメントは密な繊維状の網目構造を有し、ストレスファイバーが形成された。また、ＰＬＯを用いた対照では、ビンキュリンが染色されたフォーカルアドヒージョンが多く観察された。一方、１％ＦＢＳ培養条件下ではフォーカルアドヒージョンが観察されなかったのに対し、１０％ＦＢＳ培養条件下では、対照と同様に、フォーカルアドヒージョンを有する糸状仮足が多く観察された。
【０１１０】
上記形態観察、初期接着量（細胞数）、ＡＦＭ観察、蛍光顕微鏡観察から、ＣＮＴ膜が形成されたカバーガラスは、細胞の接着性が良好で、細胞培養の足場として利用できることが確認された。
【０１１１】
（幹細胞の分化）
次に、上記ＣＮＴ膜を有するカバーガラス上で、ラット骨髄由来の間葉系幹細胞（ｒＭＳＣ）を分化誘導した。分化誘導には、分化誘導因子としてデキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌを含む１５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ培地を用いた。ＭＥＭ培地は１０ｍｇ／ｍｌのＮＥＡＡ（non-essential amino acid solution）、抗生物質−抗真菌剤 Mix（Antibiotic-Antimycotic：Invitrogen 15240-062）を含む。各培地にて０.５×１０５cells／ｍｌの細胞濃度でｒＭＳＣを蒔き、３７℃ ５％ＣＯ２に調整されたインキュベーターで３週間培養した。培養開始から１週間経過後及び３週間後に、４％のパラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を添加して、細胞固定を行った。固定後、初期骨分化の指標であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色及び細胞抽出液のＡＬＰ活性の測定を行った。対照としてＣＮＴ膜を有しない培養皿を用いて同様に培養を行った。
【０１１２】
培養された細胞の顕微鏡画像を図２１に、ＡＬＰ染色された細胞の顕微鏡画像を図２２に、ＡＬＰ活性の測定結果を図２３に示す。ＡＬＰ染色は次の方法によった。０.３ｇ／ＬNaphtol AS-MX phosphate、５ｍｇ／ｍｌN,N-Dimethylformamide、０.６ｇ／ＬFast Blue BB Saltを０.２Ｍトリス緩衝液に溶解したＡＬＰ染色液を用いて細胞を染色した（ＡＬＰ染色）。細胞固定後、上記のＡＬＰ染色液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２気流下にて３０分間静置後、ＡＬＰ染色液を除去、ＰＢＳで２回洗浄したものを観察および撮影した。ＡＬＰ活性の測定はｐ−ニトロフェニルリン酸基質法によった。
【０１１３】
培養開始３日目の細胞はいずれも進展した形態で接着していることが観察された。１週間目には、対照に比べてＣＮＴ膜を有するカバーガラス上の細胞は部分的に集まっていることが観察され、３週間目には細胞が集まっていることが顕著に観察された。また、３週間目にはＣＮＴ膜上の細胞は、初期石灰化の様子も観察された。また、ＡＬＰ染色を行った細胞の画像からも、対照に比べて広範囲でＡＬＰ染色された細胞が観察された。さらに、培養開始後１週間目のＣＮＴ膜上の細胞は、対照に比べて高いＡＬＰ活性が認められ、培養開始後３週間目のＣＮＴ膜状の細胞は、対照に比べてさらに高いＡＬＰ活性が認められた。このように本発明の製造方法により製造されたＣＮＴ膜上では、骨芽細胞の分化が促進されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明によると、ＣＮＴの会合がなく、均一にＣＮＴが分散したＣＮＴ膜を表面に備えた細胞培養用の器具が提供される。この細胞培養用の器具を用いれば、幹細胞の分化を誘導して、例えば骨形成の促進に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面にカーボンナノチューブ膜を製造する方法であって、
カーボンナノチューブとカーボンナノチューブを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を含み、カーボンナノチューブが溶解された溶液を作製する工程と、
前記溶液を前記基材表面に供給する工程と、
前記供給された溶液の溶媒の蒸散により溶液中のカーボンナノチューブを析出させて、当該基材表面にカーボンナノチューブを付着させる工程と、
前記カーボンナノチューブが付着した基材表面を水で洗浄する工程を含むカーボンナノチューブ膜の製造方法。
【請求項２】
前記可溶化剤が、水系溶媒に溶解した溶液において、当該可溶化剤の濃度を高めた場合に、ある濃度を境にしてカーボンナノチューブの溶解度が低下する特性を有する物質である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記水溶性の可溶化剤は、水溶性キシランである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記水溶性キシランは、グルクロノキシランである請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記基材は、プラスチック、高分子化合物、金属、セラミック又はこれらから選ばれる１種又は２種以上を含む複合材からなる請求項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の製造方法により得られたカーボンナノチューブ膜を表面に有する物品。
【請求項７】
前記物品は、細胞培養用の器具又は体内埋め込み型医療器具である請求項６に記載の物品。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞培養用の器具を用いる幹細胞の分化誘導方法。
【請求項９】
前記幹細胞は組織幹細胞である請求項８に記載の分化誘導方法。
【請求項１】
基材表面にカーボンナノチューブ膜を製造する方法であって、
カーボンナノチューブとカーボンナノチューブを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を含み、カーボンナノチューブが溶解された溶液を作製する工程と、
前記溶液を前記基材表面に供給する工程と、
前記供給された溶液の溶媒の蒸散により溶液中のカーボンナノチューブを析出させて、当該基材表面にカーボンナノチューブを付着させる工程と、
前記カーボンナノチューブが付着した基材表面を水で洗浄する工程を含むカーボンナノチューブ膜の製造方法。
【請求項２】
前記可溶化剤が、水系溶媒に溶解した溶液において、当該可溶化剤の濃度を高めた場合に、ある濃度を境にしてカーボンナノチューブの溶解度が低下する特性を有する物質である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記水溶性の可溶化剤は、水溶性キシランである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記水溶性キシランは、グルクロノキシランである請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記基材は、プラスチック、高分子化合物、金属、セラミック又はこれらから選ばれる１種又は２種以上を含む複合材からなる請求項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の製造方法により得られたカーボンナノチューブ膜を表面に有する物品。
【請求項７】
前記物品は、細胞培養用の器具又は体内埋め込み型医療器具である請求項６に記載の物品。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞培養用の器具を用いる幹細胞の分化誘導方法。
【請求項９】
前記幹細胞は組織幹細胞である請求項８に記載の分化誘導方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２０１２−１４０２８４（Ｐ２０１２−１４０２８４Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９３８３５（Ｐ２０１０−２９３８３５）
【出願日】平成２２年１２月２８日（２０１０．１２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）刊行物名 日本農芸化学会関西支部 第４６５回講演会・ミニシンポジウム 講演要旨集 （２）発行日 平成２２年７月３日 （３）発行所 社団法人日本農芸化学会 関西支部 （４）該当ページ 第１８ページ
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２８日（２０１０．１２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）刊行物名 日本農芸化学会関西支部 第４６５回講演会・ミニシンポジウム 講演要旨集 （２）発行日 平成２２年７月３日 （３）発行所 社団法人日本農芸化学会 関西支部 （４）該当ページ 第１８ページ
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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