ガスクラスターイオンビーム技術の適用により生物学的材料の表面の湿潤性及び／又はその他の生体適合性特性を改質する方法と製造された生物学的材料
本発明は組織の外科的移植方法を提供する。この方法は、ドナーから移植片組織を外移植するステップと、移植片組織の少なくとも第１の部分にイオンビームを照射するステップと、ガスクラスターイオンビームが照射された移植片組織をレシピエントに外科的移植するステップとを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、哺乳類への移植用である生物学的材料に関し、特に、１）生物学的材料の表面への細胞付着のための宿主としての役割を果たし、２）生物学的材料の表面又は材料内部での細胞増殖を促進し、３）この生物学的材料の表面の中及び下での細胞浸透を促進し、及び／又は、４）その後の新組織形成を促進するために、湿潤性の改質、及び／又は、改質された生物学的材料の能力の改善を行うイオンビーム技術、好ましくは、ガスクラスターイオンビーム技術を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガスクラスターイオンビーム（ＧＣＩＢ）照射は、ナノスケール表面改質のため使用されている。同時係属中の、本願出願人により維持される米国特許出願第１２／２１０，０１８号、名称“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ ｂｙ ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｓ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｉｏｎ Ｂｅａｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍａｄｅ Ｔｈｅｒｅｂｙ”では、ＧＣＩＢが非生物学的材料表面の親水性を改質させることが明らかにされている。ＧＣＩＢ処理は、半導体装置及び薄膜の製造において十分に文書化されている。しかし、筋骨格系（例えば、骨、靱帯、腱、回旋腱板、軟骨など）の組織を含む生物学的材料表面の改質と、主要な哺乳類及び鳥類の臓器系内部の上皮組織及び内皮組織のようなその他の結合組織の改質のためのＧＣＩＢ処理の使用可能性は、これまでに知られていない。細胞付着の宿主構造としての役割を果たす靱帯表面の能力に関してＧＣＩＢ処理が靱帯表面に生じさせる物理的改質は、これまでに知られていない。線維芽細胞及び骨芽細胞のような付着依存性細胞が十分に付着し、成長し、又は、分化するため親水性表面から恩恵を受けることと、これらの付着依存性細胞がさらに被帯電表面の方を好むこととは、一般的に知られている。親水性に関して、液滴接触角は、湿潤性の尺度として使用されることがあり、接触角測定量の減少は、一般に、より強い表面親水性を意味する。非生物学的表面上の親水性を増加させるか、又は、電荷を変化させるため、サンドブラスト法と、酸エッチング法と、プラズマ溶射コーティングと、ＣＯ２レーザー平滑化と、機械的洗浄技術、超音波洗浄技術、プラズマ洗浄技術、及び、化学的洗浄技術を含む種々の形式の洗浄法のような多数の方法がこれまでに使用されている。その他のアプローチは、界面活性剤の添加、又は、異なる湿潤性特性を有している膜若しくはコーティングの塗布を含んでいる。表面の親水性の増加、表面電荷状態の改質、又は、表面化学的性質の改質、その他のメカニズムのいずれかを用いる細胞付着の増強のためのＧＣＩＢ照射による生物学的材料の表面の調製は、これまでに明らかにされていない。
【０００３】
高エネルギー従来型のイオン、加速された帯電原子、又は、帯電分子のビームは、半導体装置接合を形成し、スパッタリングによって表面を改質させ、そして、薄膜の特性を改質させるために広範に利用される。従来型のイオンと異なって、ガスクラスターイオンは、標準的な温度及び圧力の条件下でガス状である材料（一般に、酸素、窒素、又は、例えば、アルゴンのような不活性ガスであるが、どのような凝縮性ガスでもガスクラスターイオンを生成するために使用できる）の多数の（典型的な分布が数百個乃至数千個であり、平均値が数千個である）弱結合原子又は分子のクラスターから形成され、各クラスターイオンは、１つ以上の電荷を共有し、高い総エネルギーをもつために（約３ｋＶ乃至約７０ｋＶ以上のような）高電圧を通じて一緒に加速される。ガスクラスターイオンが形成され、加速された後、ガスクラスターイオンの電荷状態は、変更されてもよく、又は、変更状態にされてもよく（中和状態にされてもよく）、そして、ガスクラスターイオンは、より小さいクラスターイオン、及び／又は、中和されたより小さいクラスターに断片化されることがあるが、高電圧によって予め加速されることによって比較的高い総エネルギーを維持する傾向がある。ガスクラスターイオンビームは、洗浄、エッチング、平滑化、膜成長、などの目的で非生物学的材料の表面を処理するため使用されている。ガスクラスターイオンビームは、殆どの固体材料平面への平滑化効果のためよく知られ、ダイヤモンド、シリコン、及び、金属のような材料を平滑化するため使用されている。各ガスクラスターイオンの中の原子又は分子が多数であるため、かつ、原子又は分子が弱結合されているため、表面衝突時の原子又は分子の影響は、従来型の（モノマー又は分子）イオンと異なり、非常に浅い。クラスターは、衝突時に分裂させられ、各原子又は分子は、次に、加速クラスターの総エネルギーより比較的少ないエネルギー数ｅＶだけを運ぶ。瞬時温度及び圧力は、ガスクラスターイオン衝突場所では、非常に高くなる可能性があり、種々の表面化学的性質、エッチング、及び、その他の影響が起こる可能性がある。表面化学的性質は、（例えば）表面接合を暴露することによりＧＣＩＢ照射によって（従って、表面電荷状態を改質させることによって）、及び／又は、（酸素、窒素、炭素などのような反応原子又は分子を含むガスクラスターイオンを使用することにより）ガスクラスターイオンから表面へ反応原子又は分子を組み入れることによって改質させられることがある。しかし、これらの影響は、非常に表面的であり、衝突場所の下で多くても数十オングストロームだけ広がり、従って、表面的な表面衝突場所より下の深い位置にある材料には著しい破損がない。本明細書中で使用されるように、「ＧＣＩＢ」、「ガスクラスターイオンビーム」、及び、「ガスクラスターイオン」という用語は、加速の後に電荷状態の全部又は一部が改質（中和を含む）させられた加速ビーム及びイオンを包含することを目的とする。「ＧＣＩＢ」及び「ガスクラスターイオンビーム」という用語は、クラスター化されていない粒子をさらに含むことがあるとしても、加速ガスクラスターを含むすべてのビームを包含することを目的とする。ＧＣＩＢは、イオン浸透が非常に浅く、数十オングストローム（数ナノメートル）より深い破損又は改質は無視できるという理由のため、本発明のための好ましいイオンビームである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって生物学的材料の表面の湿潤性を増加させる、及び／又は、化学的性質若しくは電荷状態を変更する、及び／又は、その他の物理的特性を改質させる方法を提供する。
【０００５】
さらなる態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって新しい細胞成長の付着、増殖、移動などのため、場合によっては、骨、線維性結合組織、上皮、内皮などのような組織に分化する新しい細胞の刺激用の生物学的材料の表面を調製する方法を提供する。
【０００６】
さらに別の態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって、制御されたパターンで、生物学的材料の表面の一部の湿潤性を増加させる、及び／又は、新しい細胞成長の付着、増殖、移動などのため生物学的材料の表面を調製する方法を提供する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって、親水性が増加させられた表面又は表面部分を有している、及び／又は、細胞浸透の能力及び／又は新しい細胞の付着、成長及び分化のための宿主としての役割を果たす能力が増強された表面を有し、場合によっては、骨、繊維性結合組織、上皮、内皮などのような組織に分化する新しい細胞の刺激用の外科的に移植可能な生物学的材料を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、外科的移植用の、そして、場合によっては、骨、繊維性結合組織、上皮、内皮などのような組織に分化する特定の細胞材料を刺激するための生物学的材料、及び移植片と、特定の細胞材料を生物学的材料片に組み込む生物学的材料片の調製及び／又は、外科的移植の方法とを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上述の態様と、さらなる態様及びその他の態様と、利点とは、以下に説明される発明によって実現される。
【００１０】
本発明は、表面の親水性若しくは湿潤性の程度のような表面特性を改質させるため、及び／又は、新しい細胞成長、及び／又は、例えば、骨、靱帯、腱、回旋腱板、軟骨などの筋骨格系の組織を含む生物学的材料への付着のための宿主としての役割を果たすために表面若しくは表面の一部分の適合性を改善するため、生物学的材料の表面若しくは表面の一部分のガスクラスターイオンビーム（ＧＣＩＢ）処理を適用する。マスキング技術の使用によって、又は、表面へのＧＣＩＢの入射を制御することにより、又は、ＧＣＩＢ処理の空間的広がりを制御するその他の手段によって、表面特性は、所望の領域が改質され、その他の領域が改質されない制御されたパターンで改質されることがある。このように、生物学的材料への細胞付着は（外科的に移植されたとき）、外科的結果の成功に適さない領域で細胞付着を促進することなく、所望の領域で容易にされることがある。
【００１１】
発明者は、ＧＣＩＢ技術を用いて、例えば、（自然状態と脱細胞化状態の両方の状態で）骨及び靱帯のような筋骨格系の組織の表面を処理し、そして、ある種のＧＣＩＰ処理が生物学的材料の表面の親水性の増加と、新しい細胞成長及び付着のための表面の適合性の改善とをもたらすことが分かった。本明細書中に記載された実施例は、構造的組織であるが、発明は、構造的組織に限定されない。
【００１２】
パターン化された表面変化を生成するため、ＧＣＩＢ処理は、マスク若しくはビーム描画技術、又は、表面のある一定の領域に処理を制限するか、若しくは、ワークピースの様々な領域で様々なタイプのＧＣＩＢ処理を生じるように、ＧＣＩＢ処理によるワークピース表面への暴露を制御する様々な他の手段を用いて制御されることがある。利用されるマスクは、ワークピースの一部分へのＧＣＩＢ処理を遮断する機械的マスクでもよい。パターン化された表面変化の実現は、機械的マスクの使用に限定されない。
【００１３】
本発明は、組織の外科的移植方法を提供する。この方法は、ドナーから移植片組織を外移植するステップと、移植片組織の少なくとも第１の部分にイオンビームを照射するステップと、移植片組織をレシピエントに外科的移植するステップとを含む。
【００１４】
本発明は、ドナーから移植片組織を外移植するステップと、移植片組織の少なくとも第１の部分を脱細胞化するステップと、移植片組織の第１の部分のうちの少なくとも第２の部分を凍結乾燥するステップと、移植片組織の第２の部分のうちの少なくとも第３の部分に照射するステップと、移植片組織をレシピエントに外科的移植するステップとを含む、別の外科的移植方法をさらに提供する。この方法は、将来の使用のため移植片組織を保存する任意的なステップと、外科的移植のため移植片組織を離れた場所へ輸送する任意的なステップと、移植片組織の少なくとも第３の部分の少なくとも表面に細胞をシードする任意的なステップと、移植片組織の上又は中で細胞の望ましい程度の付着及び増殖を可能する任意的なステップとをさらに含む。
【００１５】
本発明のその他の目的及びさらなる目的と共に、本発明をより良く理解するため、添付図面及び詳細な説明を参照し、本発明の範囲は、請求項において指示される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＧＣＩＢ技術において知られ、かつ、本発明を実施するため適した型のガスクラスターイオンビーム処理システムの概略図である。
【図２】ワークピース・ホルダを示すガスクラスターイオンビーム処理システムの一部分の拡大図である。
【図３】本発明の実施形態による靱帯組織へのＧＣＩＢ照射から生じる測定液滴接触角の減少を示すグラフである。
【図４】本発明の実施形態による骨組織へのＧＣＩＢ照射から生じる測定液滴接触角の減少を示すグラフである。
【図５】対照靱帯標本上の細胞成長を示す顕微鏡写真である。
【図６】本発明の実施形態による処理された靱帯標本上の増強細胞成長を示す顕微鏡写真である。
【図７】本発明の改善された生物学的材料の有利な適用の例示的な実施形態を示す膝関節の略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
表面処理の技術において知られた型の典型的なガスクラスターイオンビーム（ＧＣＩＢ）処理装置１００を示す図面のうちの図１を参照する。本明細書中に記載された具体的なコンポーネントに制限されないが、処理装置１００は、３つの連通するチャンバ１０８、すなわち、線源チャンバ１０４と、イオン化／加速チャンバ１０６と、ガスクラスターイオンビームによる処理のためワークピース１０を位置合わせする能力をもつワークピース・ホルダ１５０を内部に含む処理チャンバ１０８とに分割された真空容器１０２で構成されている。
【００１８】
使用中に、３つのチャンバは、真空ポンプシステム１４６ａ、１４６ｂ、及び１４６ｃによってそれぞれに適当な動作圧力まで排出される。シリンダ１１１に蓄積された凝縮性線源ガス１１２（例えば、アルゴン又はＮ２）は、加圧下で、ガス調量弁１１３及びガス供給管１１４を通って、停滞チャンバ１１６に入れられ、適切に成形されたノズル１１０を通って実質的により低い圧力の中へ放出され、超音速ガスジェット１１８を生じる。ジェットの膨張から生じる冷却は、ガスジェット１１８の一部分を数百個から数千個（又は、さらに数万個）の弱結合原子又は分子でほとんど構成されたクラスターに凝集させる。ガス・スキマー・アパーチャ１２０は、このようなより高い圧力が有害である下流領域（例えば、イオナイザ１２２、高電圧電極１２６、及び、処理チャンバ１０８）における圧力を最小限に抑えるように、クラスタージェットに凝集されていないガス分子をクラスタージェットから部分的に分離する。適当な凝縮可能な線源ガス１１２は、必ずしも限定されることなく、（アルゴンのような）不活性ガスと、窒素と、二酸化炭素と、酸素とを含む。
【００１９】
ガスクラスターを含有する超音速ガスジェット１１８が形成された後、クラスターは、イオナイザ１２２の中でイオン化される。イオナイザ１２２は、１つ以上の白熱フィラメント１２４から熱電子を生成し、電子を加速し、電子を案内してガスジェット１１８の中のガスクラスターと電子を衝突させる電子衝撃イオナイザでもよく、ジェットは、イオナイザ１２２の中を通過する。電子衝突は、クラスターから電子を放出させ、クラスターの一部分を正にイオン化させる。適当に付勢された高電圧電極１２６の組は、イオナイザ１２２からクラスターイオンを抽出し、ビームを形成し、その後に、加速電位（典型的に、１ｋＶから数十ｋＶ程度まで）を用いてクラスターイオンを加速させ、初期軌道１５４を有するＧＣＩＢ １２８を形成するためクラスターイオンを集中させる。フィラメント電源１３６は、電圧ＶＦを供給し、イオナイザ・フィラメント１２４を加熱する。アノード電源１３４は、電圧ＶＡを供給し、フィラメントから放出された熱電子を加速し、熱電子をクラスター含有ガスジェット１１８に衝突させ、イオンを生成する。エクストラクション電源１３８は、電圧ＶＥを供給し、高電圧電極を付勢し、イオナイザ１２２のイオン化領域からイオンを抽出し、ＧＣＩＢ １２８を形成する。アクセラレータ電源１４０は、電圧ＶＡＣＣを供給し、イオナイザ１２２に関して高電圧電極を付勢し、その結果、ＶＡＣＣボルト（Ｖ）に一致する総ＧＣＩＢ加速電位を生じる。１つ以上のレンズ電源（例えば、１４２及び１４４）は、ＧＣＩＢ １２８を集中させる電位（例えば、ＶＬ１及びＶＬ２）を用いて高電圧電極を付勢するために設けられることがある。
【００２０】
ＧＣＩＢ処理装置１００によって処理されるワークピース１０は、ＧＣＩＢ １２８の経路に配置されたワークピース・ホルダ１５０に保持される。クリップ若しくはクランプでもよい任意的なリテーナ１２、又は、その他の固定用アイテムがワークピース・ホルダ１５０上の取付位置にワークピース１０を固定するため用いられることがある。ワークピース１０の一様な処理が行われるように、ワークピース・ホルダ１５０は、均一な処理のため必要とされることがあるように、ワークピース１０を適切に操作するため後述される仕方で設計される。
【００２１】
図２をさらに参照すると、非平面的である、すなわち、（生物学的材料に共通して見られるような）球状若しくはカップ状の構造、丸みを帯びた構造、不規則な構造、又は、その他の非平坦構造でもよいワークピース表面は、ワークピース表面の最適なＧＣＩＢ処理を実現するためにビーム入射に関してある角度の範囲内で方向付けられることがある。これは、処理最適化及び一様性をもたらすためにＧＣＩＢと適当なアライメントで処理されるすべての非平面的な表面を方向付けるため完全に関節化される能力をもつワークピース・ホルダ１５０を用いる。より具体的には、処理中のワークピース１０が非平面的であるとき、ワークピース・ホルダ１５０は、ＧＣＩＢ処理装置１００の端部に位置している機構部１５２によって回転させられ、関節化されることがある。関節／回転機構部１５２は、好ましくは、望ましいビーム入射範囲内にワークピース表面を維持するため、（ＧＣＩＢ １２８の初期軌道１５４と同軸でもよい）縦軸１５５の周りの３６０度装置回転と、軸１５５に垂直である軸１５７の周りの十分な関節化とを可能にする。
【００２２】
ある一定の条件下で、ワークピース１０のサイズに依存して、走査システムは、大型ワークピースの一様な照射を生じることが望ましい。ＧＣＩＢ処理のため不可欠ではないが、２対の直角に方向付けされた静電走査プレート１３０及び１３２は、拡大された処理エリアにラスタ又はその他の走査パターンを生じるため利用されることがある。このようなビーム走査が実行されるとき、走査発生器１５６は、Ｘ軸走査信号電圧及びＹ軸走査信号電圧をリード線の対１５８及び１６０のそれぞれを介して２対の走査プレート１３０及び１３２に供給する。走査信号電圧は、一般に、ＧＣＩＢ １２８を、ワークピース１０の表面全体を走査する走査型ＧＣＩＢ １４８に変換する異なる周波数をもつ三角波である。
【００２３】
拡大された領域上のビーム走査が望ましくないとき、処理は、一般に、ビームの直径によって画定された領域に限られる。ワークピース表面でのビームの径は、ワークピースで望ましいビーム径をもたらすために１つ以上のレンズ電源（例えば、図示された１４２及び１４４）の電圧（ＶＬ１及び／又はＶＬ２）を選択することにより設定できる。具体的に示されていないが、図１及び２では、このような従来技術のＧＣＩＢ処理システムは、典型的に、処理に重要であるＧＣＩＢパラメータ（例えば、加速電位、ビーム電流、ビーム焦点、ガス流量、ワークピースに加えられるビーム照射量、ワークピース操作など）を測定し制御するセンサ及び回路を利用し、自動処理と、処理手法管理、選択及び制御のための付加的な制御及び自動化もさらに利用する。
【００２４】
図１及び２は、ある種の平面的かつ簡単な形をした非平面的なワークピースを保持し操作するため適したワークピース・ホルダ及びマニピュレータを示すが、その他の種類のより簡単なホルダ及びマニピュレータとより複雑なホルダ及びマニピュレータが知られていることは、従来技術に精通した者によって理解されるであろう。例えば、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ他に付与された米国特許第６，６７６，９８９号は、血管ステントのような管状又は円筒状ワークピースを処理するため最適化されたホルダ及びマニピュレータを教示する。生物学的材料の多数の表面にＧＣＩＢ照射を当てるためのマニピュレータは、当該技術に精通している者に知られることになるか、及び／又は、通常の技能だけを使用して容易に構築されることがある。
【００２５】
試験が生物学的組織の（親水性の尺度としての）液滴接触角へのＧＣＩＢ照射の影響を判定するため実行された。若いブタの膝が内側側副靱帯（ＭＣＬ）及び外側側副靱帯（ＬＣＬ）を大腿骨骨幹軸と共に採取するため使用された。靱帯は、その他の疎性結合組織から注意深く切り裂かれ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い流され、長さ約１ｃｍと自然幅約５ｍｍをもつ断片に切断された。骨幹軸は、長さ約２ｃｍの円筒に切断され、さらに軸は、縦方向に切り落とされ半円形状の断片にされた。断片は、鉗子を使用して骨膜を引っ張ることにより骨膜が取り除かれ、その後にＰＢＳで洗い流された。引き続く骨及び靱帯組織標本（対照を含む）の両方の処理は、同一であった。組織は、一晩中、ＰＢＳの中に保存された。その後、組織標本（骨及び靱帯の両方）は、ＰＢＳから取り出され、個別にＧＣＩＢ処理システムの処理チャンバの中に導入された。処理チャンバは、約１００ミリトールの低真空まで排気された（低真空を実現するための排気時間は、骨標本に対し約３０分であり、靱帯標本に対し約２分であった）。低真空を実現後、標本は、引き続き、高真空に導入され、高真空（約６×１０−５トール）に暴露された。骨組織及び靱帯組織の両方の試験標本は、その後、ＧＣＩＢ照射によって高真空中で処理された。対照標本は、照射されなかったが、同じ真空条件及び持続期間に晒された。ＧＣＩＢ照射は、３０ｋＶ加速電位で１ｃｍ２当たり５×１０１４個のアルゴンクラスターの表面照射量を被照射表面に加えることからなる。照射時間及び対応する高真空暴露持続時間は、骨組織標本及び靱帯組織標本の両方共に約３分２０秒であった。
【００２６】
ＧＣＩＢ照射及び／又は真空暴露の後に続いて、組織標本は、生物学的安全キャビネットの中に一晩中空気乾燥するため放置された。
【００２７】
標本の湿潤性は、液滴形状分析システムを使用して検査された（ドイツ国ハンブルグ市、Ｋｒｕｓｓ ＧｍｂＨ製のモデルＤＳＡ−１０、Ｋｒｕｓｓ ＤＳＡ１バージョン１．８分析ソフトウェア付きが組織標本上の水滴の表面接触角を判定するため使用された）。同一の測定が骨組織及び靱帯組織の照射された標本及び照射されていない対照標本の両方に対して行われた。測定毎に、データは、脱イオン水の３マイクロリットル液滴をそれぞれ（靱帯及び骨の照射された対照及び照射されていない対照の両方）の表面に置いた５秒後に取得された。すべての測定は、大気条件下で行われ、各分析は、３重に行われた（標本１つずつに３回の試験）。
【００２８】
結果は、照射されていない対照標本と比較して、ＧＣＩＢ照射された靱帯標本及び骨標本の両方の減少した接触角によって測定されるように親水性の増加を示した。
【００２９】
図３は、ＧＣＩＢ被照射標本及び非照射対照標本の両方の靱帯組織標本に関する３回の測定のそれぞれの液滴表面接触角試験結果を示すグラフ３００である。靱帯組織上の脱イオン水を使用する液滴接触角測定は、ＧＣＩＢ処理に応じた靱帯組織上での表面親水性の減少を示す。液滴接触角は、非照射対照靱帯における平均５５．５９±９．０３からＧＣＩＢ被照射標本における３６．０９±１０．９３まで減少した（変化の統計的有意性ｐ＜０．００４）。
【００３０】
図４は、ＧＣＩＢ被照射標本及び非照射対照標本の両方の骨組織標本に関する３回の測定のそれぞれの液滴表面接触角試験結果を示すグラフ４００である。骨組織上の脱イオン水を使用する液滴接触角測定は、ＧＣＩＢ処理に応じた骨組織上での表面親水性の増加を示す。液滴接触角は、非照射対照骨における平均７２．８６±１．４７からＧＣＩＢ被照射標本における６１．４２±１．０６まで減少した（変化の統計的有意性ｐ＜０．０１５）。
【００３１】
生物学的表面のＧＣＩＢ処理がより高い親水性をもつ表面を生じるので、脱細胞化された靱帯のＧＣＩＢ処理が（例えば）線維芽細胞を用いてより良く再細胞化することができる表面を生じることを示すために追加試験が行われた。ブタの前十字靱帯（ＡＣＬ）が公開された外移植方法（Ｒｏｓｓ ＳＭ， Ｊｏｓｈｉ Ｒ， ａｎｄ Ｆｒａｎｋ ＣＢ； “Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｄｉａｌ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ａｎｄ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｂｉｔ”， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９０；２６：５７９−８４）を使用して線維芽細胞を採取するため使用された。若いブタの膝から新たに分離されたＬＣＬ及びＭＣＬは、次に、確立された方法の技術（Ｗｏｏｄｓ Ｔ， Ｇｒａｔｚｅｒ ＰＦ； “Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｂｏｎｅ−ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ−ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ”， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００５，２６：７３３９−７３４９）を使用して脱細胞化された。
ＧＣＩＢ照射を除いて、靱帯組織標本（試験標本及び対照の両方）の引き続く処理は、同一であった。脱細胞化組織は、一晩中ＰＢＳ中に保存された。その後、脱細胞化組織標本は、ＰＢＳから取り出され、ＧＣＩＢ処理システムの処理チャンバに個別に導入された。処理チャンバは、約１００ミリトールの低真空まで排気された（低真空を実現するための排気時間は、靱帯標本に対し約２分であった）。低真空を実現後、標本は、引き続き、高真空に導入され、高真空（約６×１０−５トール）に暴露された。脱細胞化靱帯組織の試験標本は、その後、ＧＣＩＢ照射によって高真空中で処理された。対照標本は、照射されなかったが、同じ真空条件及び持続期間に晒された。ＧＣＩＢ照射は、３０ｋＶ加速電位で１ｃｍ２当たり５×１０１４個のアルゴンクラスターの表面照射量を被照射表面に加えることからなる。照射時間及び対応する高真空暴露持続時間は、両方の脱細胞化靱帯組織標本（照射及び対照）に対して約３分２０秒であった。
【００３２】
Ｓｉｇｍａ Ｅ１２７０細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に懸濁する約２×１０５個の線維芽細胞が（脱細胞化され、照射された組織を新しい細胞でシードするため）靱帯標本の両側に載置され、適切な細胞成長培地（ダルベッコ改変イーグル培地と、１０％ウシ胎仔血清と、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給される）１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質）を含有する管の中に載置され、３日毎に規則的に培地を交換して１８日間成長のため放置された。靱帯試料がその後にホルマリン中に固定され、組織学のため処理され、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。靱帯の顕微鏡検査は、ＧＣＩＢ処理なしの靱帯標本対照と比べて、ＧＣＩＢ処理を受けた靱帯標本上での非常に増強された細胞付着及び増殖を明らかにした。
【００３３】
図５は、上述のように、真空暴露を含むが、ＧＣＩＢ照射なしで処理された、脱細胞化されたブタの靱帯組織５０４の非照射対照標本の表面領域５０２を示す顕微鏡写真５００を示す。新たに成長した線維芽細胞の１−２細胞層５０６は、下にある靱帯組織５０４に付着していることが分かる。
【００３４】
図６は、上述のように、真空暴露及びＧＣＩＢ照射の両方を含む処理がなされた、脱細胞化されたブタの靱帯組織６０４のＧＣＩＢ照射標本の表面領域６０２を示す顕微鏡写真６００を示す。図６における倍率は、図５における倍率と同じである。図６では、新たに成長した線維芽細胞の３−７細胞層６０６が照射された表面で下にある靱帯組織６０４に付着していることが分かる。さらに、多数の新しい線維芽細胞（例えば、６０８Ａ、６０８Ｂ及び６０８Ｃ）は、脱細胞化靱帯組織の中の非常に深い場所に埋め込まれていることが分かる。新たに成長した線維芽細胞は、ＧＣＩＢ被照射表面で増殖するのに加えて、靱帯に移動し始めた。
【００３５】
これらの結果は、より活発な表面成長と靱帯への移動の増加とが見られるように、脱細胞化された靱帯の表面のＧＣＩＢ照射が外側表面での線維芽細胞の付着、成長又は増殖のためのより好ましい環境を作り出したことを示唆する。靱帯への細胞の移動は、外科的移植のための靱帯組織エンジニアリングの分野において重要な進歩である。生物学的材料のＧＣＩＢ処理は、（例えば、ＡＣＬ再建のような）外科手術のための著しく改善された臨床転帰を生じることがある。これまでのところ、（例えば）ＡＣＬ再建外科手術は、一部で、移植された靱帯又は腱組織の身体への統合が比較的弱いため、長い間に亘って成功を制限していた。ＧＣＩＢ処理された靱帯又は腱は、より急速に統合し、従来型のＡＣＬ再建外科技術を用いて実現された利点を拡大するより堅固に接合された統合を形成することになる。
【００３６】
初代培養細胞は、体外成長中に脱分化することはよく知られている。様々な成長因子及び分裂促進因子が細胞の当初の遺伝子型及び形態を維持するために培養に添加されることがある。初代ヒト骨芽細胞は、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ダルベッコ改変イーグル培地と、１０％ウシ胎仔血清と、１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質の中で見られる因子以外の付加的な成長因子又は分裂促進因子を含まない組織培養プレート中で２乃至４継代に亘って成長させられた。２乃至４継代の骨芽細胞は、対照状態か、又は、１ｃｍ２当たりに５×１０１４個のアルゴンクラスターでＧＣＩＢによって照射された状態のいずれかでチタンにシードされ、そして、骨芽細胞は、１日間、７日間、又は、１０日間に亘って付着及び増殖のため放置された。この期間に続いて、ＲＮＡがＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から抽出された。ＵＶ分光分析によるＲＮＡ定量化に続いて、等量のＲＮＡ（１マイクログラム）がｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。結果として得られた１００ピコグラムのｃＤＮＡは、アルカリホスファターゼ−骨形成及び骨石化中に関連することが知られている肝臓、骨、腎臓（ＡＬＰＬ）と、オステオカルシンと呼ばれる骨タンパク質を生成することが知られ、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨが補正された骨γ−カルボキシグルタミン酸（ｇlａ）含有タンパク質（ＢＧＬＡＰ）とを含む骨形成に関連することが知られている種々の遺伝子の発現解析のためリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）に晒された。発現解析は、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと、遺伝子特異的プライマー（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが提供）を用いるＳｔｅｐＯｎｅシステムで、条件及び時点毎にｎ＝３で実行された。対照結果に対する倍率変化は、ΔΔＣＴ法を使用して取得された。アルゴンＧＣＩＢ処理されたチタン上で成長した骨芽細胞は、１０日目にＧＣＩＢ処理されていないチタンと比べて、ＡＬＰＬにおいて３．４１倍の増加をもたらし、ＢＧＬＡＰにおいて２．６６倍の増加をもたらすことが明らかにされ（変化の統計的有意性ｐ＜０．０５）、骨芽細胞が骨形成につながる分化を受けることを示す。このように、表面のＧＣＩＢ処理だけで、ＧＣＩＢ処理された表面上で増殖する細胞の分化を誘発する。
【００３７】
生物学的材料の場合、大抵は望ましくは、材料のうちの予め選択された部分だけがＧＣＩＢ照射によって処理されるべきであり、その他の部分は照射されるべきでない。このような状況では、ＧＣＩＢの照射の広がりを望ましいエリアだけに制限するために、ＧＣＩＢ断面積を制御し、ＧＣＩＢの走査及び／又は偏向を制御することは、生物学的材料の選択された部分のＧＣＩＢの暴露を制御することがある。代替的に、従来のマスキング技術は、照射されることが望ましくない生物学的材料のマスク表面積を制御し、照射されることが望ましい表面積だけを暴露するため使用されることがある。その後、マスクと、マスクを通して暴露された生物学的材料とは、ＧＣＩＢの拡散、又は、走査型ＧＣＩＢを用いて照射される。ＧＣＩＢ照射を生物学的材料の選択された領域に制限する様々なその他の方法は、当業者に周知であり、本発明に包含されることが意図されている。
【００３８】
生物学的材料のある一定の第１の被選択部分は、これらの被選択部分に第１のＧＣＩＢ照射を実行して処理されることがある。生物学的材料の追加的な被選択部分は、１回以上の追加的なＧＣＩＢ照射の処理を実行することによりさらに処理されることがある。追加的な（複数の）ＧＣＩＢ照射プロセスは、異なるＧＣＩＢと、真空処理条件、例えば、異なるＧＣＩＢ照射量、又は、ガスクラスターイオンの中の異なる組成ガス、又は、（異なるイオンビームエネルギー及び速度を生じる）異なるビーム加速電位を用いることがある。追加的な被選択部分は、第１の被選択部分とは異なる部分でもよく、又は、第１の被選択部分に部分的若しくは完全に一致してもよく、又は、第１の被選択部分のすべてと追加部分とを含むことがある。このような選択的処理は、外科的移植又は接合後に、再細胞化と、引き続く身体への統合とにおいて異なる望ましい応答を導き出すために用いられることがある。
【００３９】
さらに、生物学的材料の所定の断片は、単一のＧＣＩＢ照射プロセスによってさらに一様に処理され、続いて、手術箇所、他の薬剤の塗布、又は、その他の局部的な要因に応じて、異なる積極的な仕方で外科的移植プロセスに応答することがある。例えば、ＡＣＬ置換術のため使用される腱は、単一のＧＣＩＢ照射プロセスを用いて一様に処理されることがある。外科的に移植されたとき、局部的な影響が原因となって、骨と接触した部分は、骨芽細胞の増強された移動、付着、及び、分化を促進し、固定用骨への腱の統合を促進する骨形成をもたらし、一方、その他の細胞型は、骨と接触していない移植された腱の他の部分へ優先的に引き付けられる。最も重要であるのは、滑液包部分で見られる靱帯線維芽細胞を含む線維芽細胞は（移植片は置換靱帯としての役割を果たす）、優先的に移植片に引き付けられ、接着し、そして、移植片に入ることである。
【００４０】
多血小板血漿（ＰＲＰ）と、反発性ガイダンス分子（ＲＧＭａ、ＲＧＭｂ、及び／又は、ＲＧＭｃ）と、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒状マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１及びインターロイキン−９（ＩＬ１、ＩＬ６）、又は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を含むサイトカインと、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、並びに、すべての骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、アクチビンＡ、成長分化因子（ＧＤＦ）、及び、ノーダルを含む形質転換成長因子（ＴＧＦβスーパーファミリー）のメンバーと、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、及び、−ＢＢ）と、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と、インシュリンのような成長因子（ＩＦＧ）と、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、又は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような適切な成長因子及び分化因子の直接的な投与によって、或いは、ＴＧＦβ又はＴＧＦβ族のメンバーを含有する脱灰骨粉の投与によって、細胞再生が望ましい組織型を優先して分化できる。代替的に、関節滑膜腔、又は、レシピエントの大腿骨かどこかから採取された骨髄の軟膜層において見られる脂肪パッドからの間葉系幹細胞のｉｎ ｓｉｔｕ濃縮液を投与することにより、局所性のため適切な細胞へ自然に分化する細胞の再生が促進される。
【００４１】
図７は、損傷した関節における靱帯置換術のための本発明の改善された生物学的材料の有利な適用の例示的な実施形態を示す膝関節の略図７００である。この略図は、例示の目的のため示され、必ずしも正しい縮尺ではない。膝関節の前方十字靱帯（ＡＣＬ）の破裂は、多くの場合に負傷したＡＣＬの置換の外科的移植を必要とする負傷である。靱帯若しくは腱、又は、これらの一部分は、置換移植片としての機能を果たすことがある。移植片は、自家組織、同種組織、又は、異種組織から得ることができる。種々の従来型の外科的修復術が存在する。改善されたアプローチは、図７に移植片７１８として指定された、脱細胞化され凍結乾燥されたＧＣＩＢ照射された腱又は靱帯組織を使用する。略図７００は、膝関節におけるＡＣＬの置換移植片の断面図である。大腿骨７０２の下端部には大腿骨軟骨７０６がある。脛骨７０４の上端部には、脛骨軟骨７０８がある。軟骨７０６と軟骨７０８とは、膝関節の関節接触表面を形成する。大腿骨７０２及び脛骨７０４の斜線エリアは、それぞれ、（外科的に切断されたのではなく、単に例示の目的のため）大腿骨７０２の切断面及び脛骨７０４の切断面を表す。便宜のため、断面は、置換移植片７１８が位置する平面を通して示される。トンネル７１０及び７１２は、大腿骨及び脛骨７０４のそれぞれにドリルで開けられ、さらに、骨の間の脛骨軟骨７０８と大腿骨軟骨７０６を貫通する。種々のトンネル構造が用いられ、トンネル７１０及び７１２のため示された構造は、単に実施例として意図された。明瞭さのため、膝蓋骨は示されず、関節を囲み、関節のすべての内面を濡らす滑液を維持する滑液包も示されない。本発明の置換移植片７１８は、トンネル７１０及び７１２の中に置かれ、それぞれ留め具７１４及び７１６によって大腿骨端部及び脛骨端部に締め付けられる。種々の留め具及び固定技術（金属及び生物分解性ポリマー留め具を含む）のうちのいずれが用いられてもよく、留め具７１４及び７１６は、単に例示的であることが意図されている。移植片７１８は、大腿骨トンネル７１０の中に挿入され、維持された大腿骨挿入部７２２を有し、脛骨トンネルの中に挿入され、維持された脛骨挿入部７２０を有している。
【００４２】
一実施形態では、移植片７１８の脱細胞化され凍結乾燥されたＧＣＩＢ被照射組織は、この移植片の外科的置換及び関節での締め付けの前に再建されない。関節を湿らせる滑液（図示せず）は、大腿骨挿入部７２２及び脛骨挿入部７２０の両方を含む移植片７１８と接触する。滑液の中の（又は、損傷し、摘出されたＡＣＬの残存線維の内部に存在する）線維芽細胞は、移植片７１８と接触し、移植片７１８に付着し、移植片７１８の内部で増殖する。これらの線維芽細胞は、成長し、適切な靱帯線維芽細胞に分化し、最終的に健康な組織を再建する。移植片７１８の大腿骨挿入部７２２及び脛骨挿入部７２０では、移植片が脛骨の中のトンネル７１２の骨、及び、大腿骨の中のトンネル７１０の骨と接触する場所で、挿入部７２０及び７２２は、血液及び骨芽細胞の前駆細胞を含有する骨組織と接触する。骨芽細胞は、移植片７１８の挿入部７２０及び７２２の表面に広がり、付着し、増殖し、そして、移植片７１８の挿入部７２０及び７２２の中の移植片構造体を最終的に完全に再モデル化し、置換する骨組織に分化する。
【００４３】
別の実施形態では、移植片７１８の外科的配置の前に、挿入部７２０及び７２２になる移植片の部分、及び／又は、骨と共に挿入されない移植片の部分は、多血小板血漿（ＰＲＰ）と、反発性ガイダンス分子（ＲＧＭａ、ＲＧＭｂ、及び／又は、ＲＧＭｃ）と、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒状マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１及びインターロイキン−９（ＩＬ１、ＩＬ６）、又は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を含むサイトカインと、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、並びに、すべての骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンＡ、成長分化因子（ＧＤＦ）、及び、ノーダルを含む形質転換成長因子（ＴＧＦβスーパーファミリー）のメンバーと、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、及び、−ＢＢ）と、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と、インシュリンのような成長因子（ＩＦＧ）と、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、又は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような適切な成長因子及び分化因子の追加で処理されることがある。代替的に、関節滑膜腔、又は、レシピエントの大腿骨かどこかから採取された骨髄の軟膜層において見られる脂肪パッドからの間葉系幹細胞のｉｎ ｓｉｔｕ濃縮液を投与することにより、局所性のため適切な細胞へ自然に分化する細胞の移殖片内部での再生が促進され、例えば、健康な骨の生成に向けて挿入部７２０及び７２２の中で付着し増殖する細胞の分化を促進する。
【００４４】
さらに別の実施形態では、骨コラーゲンと、骨のその他の非石化成分とを含み、場合によっては、ＴＧＦβ又はＴＧＦβ族のメンバーを含有する脱灰骨粉は、トンネル７１０及び７１２に挿入され、移植片７１８の挿入部７２２及び７２０と接触し、健康な骨の生成に向けて挿入部７２０及び７２２の中で付着し増殖する細胞の分化を促進する。
【００４５】
さらなる実施形態では、関節滑膜腔、又は、患者の大腿骨かどこかから採取された骨髄の軟膜層において見られる脂肪パッドからの幹細胞が接触片７１８の挿入部７２０及び７２２にｉｎ ｓｉｔｕ投与され、健康な骨の生成に向けて挿入部７２０及び７２２の中で付着し増殖する細胞の分化を促進する。
【００４６】
発明は、例示の目的のため、骨、靱帯及び腱を含むある種の材料の観点から説明されているが、その他の生物学的材料が本発明の範囲に含まれることが分かる。例示的な実施形態は、ＡＣＬ関節修復の観点から説明されているが、広範囲のその他の関節及び軟組織移植片が本発明の恩恵を受け、本発明に含まれることが意図される。本発明の実施形態は、新鮮なブタの組織の観点から教示されているが、当業者は、用いられた技術が鳥類と人類を含むその他の哺乳類からの組織を含む、その他の組織への通常の変更と一体となって同様に用いられることが容易に分かることになり、発明者は、発明の方法が冷凍及び／又は凍結乾燥された外移植組織と一緒に、そして、類似の結果を伴う新鮮な外移植組織も同様に有利に用いることができることを実験的に確認している。
【００４７】
腱組織及び靱帯組織は、当業者によく知られた従来の技術を使用して容易に凍結乾燥される。凍結乾燥された組織は、いくつかの利点を提供し、従って、本発明の技術の多数の潜在的な適用において好ましい。凍結乾燥された組織は、凍結乾燥された組織が新鮮な組織又は冷凍組織のどちらかより少ない蒸気を放出するので、プロセスのイオン照射フェーズの準備中、及び、期間中にイオンビーム照射ツールの真空システムにより小さい負荷を与える。付加的に、凍結乾燥された組織は、照射の後に続くかなりの期間に亘って劣化なしに保存でき、そして、凍結乾燥された組織の外科的移植のため、低コストの従来型の輸送方法によって遠く離れた場所へ容易に輸送又は運搬できる。凍結乾燥された被照射組織は、後に、外科的移植の直前に外科手術の場所で、（例えば、生理食塩水を用いて、又は、レシピエントの身体流体又はその他の適当な流体を用いて）再建されることがある。同様に、凍結乾燥された被照射組織は、外科的移植の直前に外科手術の場所で細胞を用いてシードすることができる。再建及び細胞シードは、移植片の適合性を高めるために細胞含有体液を用いて行われることさえある。代替的に、凍結乾燥された被照射組織は、凍結乾燥された状態でレシピエントに外科的移植可能であり、凍結乾燥された被照射組織がレシピエントの体液及び細胞に接触すると直ちに、移植片の場所で移植片組織のｉｎ ｓｉｔｕ再建及び細胞シードを生じる。一般に、凍結乾燥された被照射細胞の長い貯蔵期間は、かなりの柔軟性及び実用性を全体的な調製のプロセス及び移植片組織の移植成功に与える。
【００４８】
本発明の方法と共に用いるため外移植された移植片材料は、種々の鳥類及び哺乳類の種（人類を含む）から採取されることがあり、本発明の方法によって調製された移植片材料の外科的移植は、多種多様の哺乳類の種（人類を含む）に行うことが可能であり、そして、このような移植片は、移植片組織のドナー及びレシピエントに応じて、同種移植片でもよく、自家移植片でもよく、又は、異種移植片でもよい。新しい細胞を採取し、（脱細胞化された組織及び／又は凍結乾燥された組織を含む）組織の上で成長させ、組織の中へシードする技術は、当業者に知られている技術に応じて、見込み移植片レシピエントから、又は、他の適当なドナー集団からの細胞を利用することがある。例示的なブタの靱帯を調製する際に用いられた外移植及び脱細胞化の技術は、腱組織に適用することも可能である。従って、本発明の方法は、当業者に周知の技術に従って、（必要に応じて）脱細胞化し、（必要に応じて）凍結乾燥し、そして、細胞付着及び増殖のため特定の新しい細胞を用いて、組織又は脱細胞化された組織をシードするため、（自家ドナーを含む）ドナー又は死体から腱、靱帯、又は、その他の組織を取り出すために使用できる。照射技術の使用によって、移植片材料への新しいセルの付着及び増殖の成功は、著しく改善され、レシピエントへの移植片の統合の成功可能性の増大と、全体的な医療結果の成功可能性の増大とに貢献する。
【００４９】
本明細書中で使用されるように、用語「生物学的材料」は、限定されることなく、脱細胞化又は自然に細胞化された状態、生きているか又は死んでいる、新鮮、凍結、凍結及び解凍、凍結乾燥、凍結乾燥及び再建、イオン照射の有無にかかわらず、腱、靱帯、骨、軟骨、軟組織、及び、その他の組織からなる材料を含む生物学的由来のすべての組織材料を包含することを意図している。本発明は、特有の加速電位を用いて形成され、特有の照射量で投与されたＧＣＩＢの適用に関して説明されているが、その他の照射量及び加速電位が利用されてもよいことと、このような変形がＧＣＩＢ照射の影響の程度に変化を生じることとが当業者によって認められることになる。本発明は、アルゴンガスで構成されたガスクラスターイオンを有するＧＣＩＢの適応に関して説明されているが、その他の組成のガス及びガス混合物も同様に有利に利用されることが当業者によって認められることになる。その他の組成のガス及びガス混合物は、希ガス、Ｎｅ、Ａｒ、Ｘｅ及びその他のガスを含み、限定されることなく、有機及び無機の両方の酸素ガス、窒素ガス、二酸化炭素ガス、その他の炭素含有ガスを含み、その他のガスと混合されたこれらのいずれかのガスからなるガス混合物をさらに含み、このような変形は、ＧＣＩＢ照射の効果の程度及び形の変化を生じることになる。本発明は、以上の開示及び請求項に記載された事項の趣旨及び範囲の中で多種多様のさらなる実施形態及びその他の実施形態もまた可能であることが認められるべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、哺乳類への移植用である生物学的材料に関し、特に、１）生物学的材料の表面への細胞付着のための宿主としての役割を果たし、２）生物学的材料の表面又は材料内部での細胞増殖を促進し、３）この生物学的材料の表面の中及び下での細胞浸透を促進し、及び／又は、４）その後の新組織形成を促進するために、湿潤性の改質、及び／又は、改質された生物学的材料の能力の改善を行うイオンビーム技術、好ましくは、ガスクラスターイオンビーム技術を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガスクラスターイオンビーム（ＧＣＩＢ）照射は、ナノスケール表面改質のため使用されている。同時係属中の、本願出願人により維持される米国特許出願第１２／２１０，０１８号、名称“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ ｂｙ ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｓ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｉｏｎ Ｂｅａｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｍａｄｅ Ｔｈｅｒｅｂｙ”では、ＧＣＩＢが非生物学的材料表面の親水性を改質させることが明らかにされている。ＧＣＩＢ処理は、半導体装置及び薄膜の製造において十分に文書化されている。しかし、筋骨格系（例えば、骨、靱帯、腱、回旋腱板、軟骨など）の組織を含む生物学的材料表面の改質と、主要な哺乳類及び鳥類の臓器系内部の上皮組織及び内皮組織のようなその他の結合組織の改質のためのＧＣＩＢ処理の使用可能性は、これまでに知られていない。細胞付着の宿主構造としての役割を果たす靱帯表面の能力に関してＧＣＩＢ処理が靱帯表面に生じさせる物理的改質は、これまでに知られていない。線維芽細胞及び骨芽細胞のような付着依存性細胞が十分に付着し、成長し、又は、分化するため親水性表面から恩恵を受けることと、これらの付着依存性細胞がさらに被帯電表面の方を好むこととは、一般的に知られている。親水性に関して、液滴接触角は、湿潤性の尺度として使用されることがあり、接触角測定量の減少は、一般に、より強い表面親水性を意味する。非生物学的表面上の親水性を増加させるか、又は、電荷を変化させるため、サンドブラスト法と、酸エッチング法と、プラズマ溶射コーティングと、ＣＯ２レーザー平滑化と、機械的洗浄技術、超音波洗浄技術、プラズマ洗浄技術、及び、化学的洗浄技術を含む種々の形式の洗浄法のような多数の方法がこれまでに使用されている。その他のアプローチは、界面活性剤の添加、又は、異なる湿潤性特性を有している膜若しくはコーティングの塗布を含んでいる。表面の親水性の増加、表面電荷状態の改質、又は、表面化学的性質の改質、その他のメカニズムのいずれかを用いる細胞付着の増強のためのＧＣＩＢ照射による生物学的材料の表面の調製は、これまでに明らかにされていない。
【０００３】
高エネルギー従来型のイオン、加速された帯電原子、又は、帯電分子のビームは、半導体装置接合を形成し、スパッタリングによって表面を改質させ、そして、薄膜の特性を改質させるために広範に利用される。従来型のイオンと異なって、ガスクラスターイオンは、標準的な温度及び圧力の条件下でガス状である材料（一般に、酸素、窒素、又は、例えば、アルゴンのような不活性ガスであるが、どのような凝縮性ガスでもガスクラスターイオンを生成するために使用できる）の多数の（典型的な分布が数百個乃至数千個であり、平均値が数千個である）弱結合原子又は分子のクラスターから形成され、各クラスターイオンは、１つ以上の電荷を共有し、高い総エネルギーをもつために（約３ｋＶ乃至約７０ｋＶ以上のような）高電圧を通じて一緒に加速される。ガスクラスターイオンが形成され、加速された後、ガスクラスターイオンの電荷状態は、変更されてもよく、又は、変更状態にされてもよく（中和状態にされてもよく）、そして、ガスクラスターイオンは、より小さいクラスターイオン、及び／又は、中和されたより小さいクラスターに断片化されることがあるが、高電圧によって予め加速されることによって比較的高い総エネルギーを維持する傾向がある。ガスクラスターイオンビームは、洗浄、エッチング、平滑化、膜成長、などの目的で非生物学的材料の表面を処理するため使用されている。ガスクラスターイオンビームは、殆どの固体材料平面への平滑化効果のためよく知られ、ダイヤモンド、シリコン、及び、金属のような材料を平滑化するため使用されている。各ガスクラスターイオンの中の原子又は分子が多数であるため、かつ、原子又は分子が弱結合されているため、表面衝突時の原子又は分子の影響は、従来型の（モノマー又は分子）イオンと異なり、非常に浅い。クラスターは、衝突時に分裂させられ、各原子又は分子は、次に、加速クラスターの総エネルギーより比較的少ないエネルギー数ｅＶだけを運ぶ。瞬時温度及び圧力は、ガスクラスターイオン衝突場所では、非常に高くなる可能性があり、種々の表面化学的性質、エッチング、及び、その他の影響が起こる可能性がある。表面化学的性質は、（例えば）表面接合を暴露することによりＧＣＩＢ照射によって（従って、表面電荷状態を改質させることによって）、及び／又は、（酸素、窒素、炭素などのような反応原子又は分子を含むガスクラスターイオンを使用することにより）ガスクラスターイオンから表面へ反応原子又は分子を組み入れることによって改質させられることがある。しかし、これらの影響は、非常に表面的であり、衝突場所の下で多くても数十オングストロームだけ広がり、従って、表面的な表面衝突場所より下の深い位置にある材料には著しい破損がない。本明細書中で使用されるように、「ＧＣＩＢ」、「ガスクラスターイオンビーム」、及び、「ガスクラスターイオン」という用語は、加速の後に電荷状態の全部又は一部が改質（中和を含む）させられた加速ビーム及びイオンを包含することを目的とする。「ＧＣＩＢ」及び「ガスクラスターイオンビーム」という用語は、クラスター化されていない粒子をさらに含むことがあるとしても、加速ガスクラスターを含むすべてのビームを包含することを目的とする。ＧＣＩＢは、イオン浸透が非常に浅く、数十オングストローム（数ナノメートル）より深い破損又は改質は無視できるという理由のため、本発明のための好ましいイオンビームである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって生物学的材料の表面の湿潤性を増加させる、及び／又は、化学的性質若しくは電荷状態を変更する、及び／又は、その他の物理的特性を改質させる方法を提供する。
【０００５】
さらなる態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって新しい細胞成長の付着、増殖、移動などのため、場合によっては、骨、線維性結合組織、上皮、内皮などのような組織に分化する新しい細胞の刺激用の生物学的材料の表面を調製する方法を提供する。
【０００６】
さらに別の態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって、制御されたパターンで、生物学的材料の表面の一部の湿潤性を増加させる、及び／又は、新しい細胞成長の付着、増殖、移動などのため生物学的材料の表面を調製する方法を提供する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって、親水性が増加させられた表面又は表面部分を有している、及び／又は、細胞浸透の能力及び／又は新しい細胞の付着、成長及び分化のための宿主としての役割を果たす能力が増強された表面を有し、場合によっては、骨、繊維性結合組織、上皮、内皮などのような組織に分化する新しい細胞の刺激用の外科的に移植可能な生物学的材料を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、外科的移植用の、そして、場合によっては、骨、繊維性結合組織、上皮、内皮などのような組織に分化する特定の細胞材料を刺激するための生物学的材料、及び移植片と、特定の細胞材料を生物学的材料片に組み込む生物学的材料片の調製及び／又は、外科的移植の方法とを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の上述の態様と、さらなる態様及びその他の態様と、利点とは、以下に説明される発明によって実現される。
【００１０】
本発明は、表面の親水性若しくは湿潤性の程度のような表面特性を改質させるため、及び／又は、新しい細胞成長、及び／又は、例えば、骨、靱帯、腱、回旋腱板、軟骨などの筋骨格系の組織を含む生物学的材料への付着のための宿主としての役割を果たすために表面若しくは表面の一部分の適合性を改善するため、生物学的材料の表面若しくは表面の一部分のガスクラスターイオンビーム（ＧＣＩＢ）処理を適用する。マスキング技術の使用によって、又は、表面へのＧＣＩＢの入射を制御することにより、又は、ＧＣＩＢ処理の空間的広がりを制御するその他の手段によって、表面特性は、所望の領域が改質され、その他の領域が改質されない制御されたパターンで改質されることがある。このように、生物学的材料への細胞付着は（外科的に移植されたとき）、外科的結果の成功に適さない領域で細胞付着を促進することなく、所望の領域で容易にされることがある。
【００１１】
発明者は、ＧＣＩＢ技術を用いて、例えば、（自然状態と脱細胞化状態の両方の状態で）骨及び靱帯のような筋骨格系の組織の表面を処理し、そして、ある種のＧＣＩＰ処理が生物学的材料の表面の親水性の増加と、新しい細胞成長及び付着のための表面の適合性の改善とをもたらすことが分かった。本明細書中に記載された実施例は、構造的組織であるが、発明は、構造的組織に限定されない。
【００１２】
パターン化された表面変化を生成するため、ＧＣＩＢ処理は、マスク若しくはビーム描画技術、又は、表面のある一定の領域に処理を制限するか、若しくは、ワークピースの様々な領域で様々なタイプのＧＣＩＢ処理を生じるように、ＧＣＩＢ処理によるワークピース表面への暴露を制御する様々な他の手段を用いて制御されることがある。利用されるマスクは、ワークピースの一部分へのＧＣＩＢ処理を遮断する機械的マスクでもよい。パターン化された表面変化の実現は、機械的マスクの使用に限定されない。
【００１３】
本発明は、組織の外科的移植方法を提供する。この方法は、ドナーから移植片組織を外移植するステップと、移植片組織の少なくとも第１の部分にイオンビームを照射するステップと、移植片組織をレシピエントに外科的移植するステップとを含む。
【００１４】
本発明は、ドナーから移植片組織を外移植するステップと、移植片組織の少なくとも第１の部分を脱細胞化するステップと、移植片組織の第１の部分のうちの少なくとも第２の部分を凍結乾燥するステップと、移植片組織の第２の部分のうちの少なくとも第３の部分に照射するステップと、移植片組織をレシピエントに外科的移植するステップとを含む、別の外科的移植方法をさらに提供する。この方法は、将来の使用のため移植片組織を保存する任意的なステップと、外科的移植のため移植片組織を離れた場所へ輸送する任意的なステップと、移植片組織の少なくとも第３の部分の少なくとも表面に細胞をシードする任意的なステップと、移植片組織の上又は中で細胞の望ましい程度の付着及び増殖を可能する任意的なステップとをさらに含む。
【００１５】
本発明のその他の目的及びさらなる目的と共に、本発明をより良く理解するため、添付図面及び詳細な説明を参照し、本発明の範囲は、請求項において指示される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＧＣＩＢ技術において知られ、かつ、本発明を実施するため適した型のガスクラスターイオンビーム処理システムの概略図である。
【図２】ワークピース・ホルダを示すガスクラスターイオンビーム処理システムの一部分の拡大図である。
【図３】本発明の実施形態による靱帯組織へのＧＣＩＢ照射から生じる測定液滴接触角の減少を示すグラフである。
【図４】本発明の実施形態による骨組織へのＧＣＩＢ照射から生じる測定液滴接触角の減少を示すグラフである。
【図５】対照靱帯標本上の細胞成長を示す顕微鏡写真である。
【図６】本発明の実施形態による処理された靱帯標本上の増強細胞成長を示す顕微鏡写真である。
【図７】本発明の改善された生物学的材料の有利な適用の例示的な実施形態を示す膝関節の略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
表面処理の技術において知られた型の典型的なガスクラスターイオンビーム（ＧＣＩＢ）処理装置１００を示す図面のうちの図１を参照する。本明細書中に記載された具体的なコンポーネントに制限されないが、処理装置１００は、３つの連通するチャンバ１０８、すなわち、線源チャンバ１０４と、イオン化／加速チャンバ１０６と、ガスクラスターイオンビームによる処理のためワークピース１０を位置合わせする能力をもつワークピース・ホルダ１５０を内部に含む処理チャンバ１０８とに分割された真空容器１０２で構成されている。
【００１８】
使用中に、３つのチャンバは、真空ポンプシステム１４６ａ、１４６ｂ、及び１４６ｃによってそれぞれに適当な動作圧力まで排出される。シリンダ１１１に蓄積された凝縮性線源ガス１１２（例えば、アルゴン又はＮ２）は、加圧下で、ガス調量弁１１３及びガス供給管１１４を通って、停滞チャンバ１１６に入れられ、適切に成形されたノズル１１０を通って実質的により低い圧力の中へ放出され、超音速ガスジェット１１８を生じる。ジェットの膨張から生じる冷却は、ガスジェット１１８の一部分を数百個から数千個（又は、さらに数万個）の弱結合原子又は分子でほとんど構成されたクラスターに凝集させる。ガス・スキマー・アパーチャ１２０は、このようなより高い圧力が有害である下流領域（例えば、イオナイザ１２２、高電圧電極１２６、及び、処理チャンバ１０８）における圧力を最小限に抑えるように、クラスタージェットに凝集されていないガス分子をクラスタージェットから部分的に分離する。適当な凝縮可能な線源ガス１１２は、必ずしも限定されることなく、（アルゴンのような）不活性ガスと、窒素と、二酸化炭素と、酸素とを含む。
【００１９】
ガスクラスターを含有する超音速ガスジェット１１８が形成された後、クラスターは、イオナイザ１２２の中でイオン化される。イオナイザ１２２は、１つ以上の白熱フィラメント１２４から熱電子を生成し、電子を加速し、電子を案内してガスジェット１１８の中のガスクラスターと電子を衝突させる電子衝撃イオナイザでもよく、ジェットは、イオナイザ１２２の中を通過する。電子衝突は、クラスターから電子を放出させ、クラスターの一部分を正にイオン化させる。適当に付勢された高電圧電極１２６の組は、イオナイザ１２２からクラスターイオンを抽出し、ビームを形成し、その後に、加速電位（典型的に、１ｋＶから数十ｋＶ程度まで）を用いてクラスターイオンを加速させ、初期軌道１５４を有するＧＣＩＢ １２８を形成するためクラスターイオンを集中させる。フィラメント電源１３６は、電圧ＶＦを供給し、イオナイザ・フィラメント１２４を加熱する。アノード電源１３４は、電圧ＶＡを供給し、フィラメントから放出された熱電子を加速し、熱電子をクラスター含有ガスジェット１１８に衝突させ、イオンを生成する。エクストラクション電源１３８は、電圧ＶＥを供給し、高電圧電極を付勢し、イオナイザ１２２のイオン化領域からイオンを抽出し、ＧＣＩＢ １２８を形成する。アクセラレータ電源１４０は、電圧ＶＡＣＣを供給し、イオナイザ１２２に関して高電圧電極を付勢し、その結果、ＶＡＣＣボルト（Ｖ）に一致する総ＧＣＩＢ加速電位を生じる。１つ以上のレンズ電源（例えば、１４２及び１４４）は、ＧＣＩＢ １２８を集中させる電位（例えば、ＶＬ１及びＶＬ２）を用いて高電圧電極を付勢するために設けられることがある。
【００２０】
ＧＣＩＢ処理装置１００によって処理されるワークピース１０は、ＧＣＩＢ １２８の経路に配置されたワークピース・ホルダ１５０に保持される。クリップ若しくはクランプでもよい任意的なリテーナ１２、又は、その他の固定用アイテムがワークピース・ホルダ１５０上の取付位置にワークピース１０を固定するため用いられることがある。ワークピース１０の一様な処理が行われるように、ワークピース・ホルダ１５０は、均一な処理のため必要とされることがあるように、ワークピース１０を適切に操作するため後述される仕方で設計される。
【００２１】
図２をさらに参照すると、非平面的である、すなわち、（生物学的材料に共通して見られるような）球状若しくはカップ状の構造、丸みを帯びた構造、不規則な構造、又は、その他の非平坦構造でもよいワークピース表面は、ワークピース表面の最適なＧＣＩＢ処理を実現するためにビーム入射に関してある角度の範囲内で方向付けられることがある。これは、処理最適化及び一様性をもたらすためにＧＣＩＢと適当なアライメントで処理されるすべての非平面的な表面を方向付けるため完全に関節化される能力をもつワークピース・ホルダ１５０を用いる。より具体的には、処理中のワークピース１０が非平面的であるとき、ワークピース・ホルダ１５０は、ＧＣＩＢ処理装置１００の端部に位置している機構部１５２によって回転させられ、関節化されることがある。関節／回転機構部１５２は、好ましくは、望ましいビーム入射範囲内にワークピース表面を維持するため、（ＧＣＩＢ １２８の初期軌道１５４と同軸でもよい）縦軸１５５の周りの３６０度装置回転と、軸１５５に垂直である軸１５７の周りの十分な関節化とを可能にする。
【００２２】
ある一定の条件下で、ワークピース１０のサイズに依存して、走査システムは、大型ワークピースの一様な照射を生じることが望ましい。ＧＣＩＢ処理のため不可欠ではないが、２対の直角に方向付けされた静電走査プレート１３０及び１３２は、拡大された処理エリアにラスタ又はその他の走査パターンを生じるため利用されることがある。このようなビーム走査が実行されるとき、走査発生器１５６は、Ｘ軸走査信号電圧及びＹ軸走査信号電圧をリード線の対１５８及び１６０のそれぞれを介して２対の走査プレート１３０及び１３２に供給する。走査信号電圧は、一般に、ＧＣＩＢ １２８を、ワークピース１０の表面全体を走査する走査型ＧＣＩＢ １４８に変換する異なる周波数をもつ三角波である。
【００２３】
拡大された領域上のビーム走査が望ましくないとき、処理は、一般に、ビームの直径によって画定された領域に限られる。ワークピース表面でのビームの径は、ワークピースで望ましいビーム径をもたらすために１つ以上のレンズ電源（例えば、図示された１４２及び１４４）の電圧（ＶＬ１及び／又はＶＬ２）を選択することにより設定できる。具体的に示されていないが、図１及び２では、このような従来技術のＧＣＩＢ処理システムは、典型的に、処理に重要であるＧＣＩＢパラメータ（例えば、加速電位、ビーム電流、ビーム焦点、ガス流量、ワークピースに加えられるビーム照射量、ワークピース操作など）を測定し制御するセンサ及び回路を利用し、自動処理と、処理手法管理、選択及び制御のための付加的な制御及び自動化もさらに利用する。
【００２４】
図１及び２は、ある種の平面的かつ簡単な形をした非平面的なワークピースを保持し操作するため適したワークピース・ホルダ及びマニピュレータを示すが、その他の種類のより簡単なホルダ及びマニピュレータとより複雑なホルダ及びマニピュレータが知られていることは、従来技術に精通した者によって理解されるであろう。例えば、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ他に付与された米国特許第６，６７６，９８９号は、血管ステントのような管状又は円筒状ワークピースを処理するため最適化されたホルダ及びマニピュレータを教示する。生物学的材料の多数の表面にＧＣＩＢ照射を当てるためのマニピュレータは、当該技術に精通している者に知られることになるか、及び／又は、通常の技能だけを使用して容易に構築されることがある。
【００２５】
試験が生物学的組織の（親水性の尺度としての）液滴接触角へのＧＣＩＢ照射の影響を判定するため実行された。若いブタの膝が内側側副靱帯（ＭＣＬ）及び外側側副靱帯（ＬＣＬ）を大腿骨骨幹軸と共に採取するため使用された。靱帯は、その他の疎性結合組織から注意深く切り裂かれ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い流され、長さ約１ｃｍと自然幅約５ｍｍをもつ断片に切断された。骨幹軸は、長さ約２ｃｍの円筒に切断され、さらに軸は、縦方向に切り落とされ半円形状の断片にされた。断片は、鉗子を使用して骨膜を引っ張ることにより骨膜が取り除かれ、その後にＰＢＳで洗い流された。引き続く骨及び靱帯組織標本（対照を含む）の両方の処理は、同一であった。組織は、一晩中、ＰＢＳの中に保存された。その後、組織標本（骨及び靱帯の両方）は、ＰＢＳから取り出され、個別にＧＣＩＢ処理システムの処理チャンバの中に導入された。処理チャンバは、約１００ミリトールの低真空まで排気された（低真空を実現するための排気時間は、骨標本に対し約３０分であり、靱帯標本に対し約２分であった）。低真空を実現後、標本は、引き続き、高真空に導入され、高真空（約６×１０−５トール）に暴露された。骨組織及び靱帯組織の両方の試験標本は、その後、ＧＣＩＢ照射によって高真空中で処理された。対照標本は、照射されなかったが、同じ真空条件及び持続期間に晒された。ＧＣＩＢ照射は、３０ｋＶ加速電位で１ｃｍ２当たり５×１０１４個のアルゴンクラスターの表面照射量を被照射表面に加えることからなる。照射時間及び対応する高真空暴露持続時間は、骨組織標本及び靱帯組織標本の両方共に約３分２０秒であった。
【００２６】
ＧＣＩＢ照射及び／又は真空暴露の後に続いて、組織標本は、生物学的安全キャビネットの中に一晩中空気乾燥するため放置された。
【００２７】
標本の湿潤性は、液滴形状分析システムを使用して検査された（ドイツ国ハンブルグ市、Ｋｒｕｓｓ ＧｍｂＨ製のモデルＤＳＡ−１０、Ｋｒｕｓｓ ＤＳＡ１バージョン１．８分析ソフトウェア付きが組織標本上の水滴の表面接触角を判定するため使用された）。同一の測定が骨組織及び靱帯組織の照射された標本及び照射されていない対照標本の両方に対して行われた。測定毎に、データは、脱イオン水の３マイクロリットル液滴をそれぞれ（靱帯及び骨の照射された対照及び照射されていない対照の両方）の表面に置いた５秒後に取得された。すべての測定は、大気条件下で行われ、各分析は、３重に行われた（標本１つずつに３回の試験）。
【００２８】
結果は、照射されていない対照標本と比較して、ＧＣＩＢ照射された靱帯標本及び骨標本の両方の減少した接触角によって測定されるように親水性の増加を示した。
【００２９】
図３は、ＧＣＩＢ被照射標本及び非照射対照標本の両方の靱帯組織標本に関する３回の測定のそれぞれの液滴表面接触角試験結果を示すグラフ３００である。靱帯組織上の脱イオン水を使用する液滴接触角測定は、ＧＣＩＢ処理に応じた靱帯組織上での表面親水性の減少を示す。液滴接触角は、非照射対照靱帯における平均５５．５９±９．０３からＧＣＩＢ被照射標本における３６．０９±１０．９３まで減少した（変化の統計的有意性ｐ＜０．００４）。
【００３０】
図４は、ＧＣＩＢ被照射標本及び非照射対照標本の両方の骨組織標本に関する３回の測定のそれぞれの液滴表面接触角試験結果を示すグラフ４００である。骨組織上の脱イオン水を使用する液滴接触角測定は、ＧＣＩＢ処理に応じた骨組織上での表面親水性の増加を示す。液滴接触角は、非照射対照骨における平均７２．８６±１．４７からＧＣＩＢ被照射標本における６１．４２±１．０６まで減少した（変化の統計的有意性ｐ＜０．０１５）。
【００３１】
生物学的表面のＧＣＩＢ処理がより高い親水性をもつ表面を生じるので、脱細胞化された靱帯のＧＣＩＢ処理が（例えば）線維芽細胞を用いてより良く再細胞化することができる表面を生じることを示すために追加試験が行われた。ブタの前十字靱帯（ＡＣＬ）が公開された外移植方法（Ｒｏｓｓ ＳＭ， Ｊｏｓｈｉ Ｒ， ａｎｄ Ｆｒａｎｋ ＣＢ； “Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｅｄｉａｌ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ ａｎｄ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｂｉｔ”， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９０；２６：５７９−８４）を使用して線維芽細胞を採取するため使用された。若いブタの膝から新たに分離されたＬＣＬ及びＭＣＬは、次に、確立された方法の技術（Ｗｏｏｄｓ Ｔ， Ｇｒａｔｚｅｒ ＰＦ； “Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｂｏｎｅ−ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ−ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ”， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００５，２６：７３３９−７３４９）を使用して脱細胞化された。
ＧＣＩＢ照射を除いて、靱帯組織標本（試験標本及び対照の両方）の引き続く処理は、同一であった。脱細胞化組織は、一晩中ＰＢＳ中に保存された。その後、脱細胞化組織標本は、ＰＢＳから取り出され、ＧＣＩＢ処理システムの処理チャンバに個別に導入された。処理チャンバは、約１００ミリトールの低真空まで排気された（低真空を実現するための排気時間は、靱帯標本に対し約２分であった）。低真空を実現後、標本は、引き続き、高真空に導入され、高真空（約６×１０−５トール）に暴露された。脱細胞化靱帯組織の試験標本は、その後、ＧＣＩＢ照射によって高真空中で処理された。対照標本は、照射されなかったが、同じ真空条件及び持続期間に晒された。ＧＣＩＢ照射は、３０ｋＶ加速電位で１ｃｍ２当たり５×１０１４個のアルゴンクラスターの表面照射量を被照射表面に加えることからなる。照射時間及び対応する高真空暴露持続時間は、両方の脱細胞化靱帯組織標本（照射及び対照）に対して約３分２０秒であった。
【００３２】
Ｓｉｇｍａ Ｅ１２７０細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に懸濁する約２×１０５個の線維芽細胞が（脱細胞化され、照射された組織を新しい細胞でシードするため）靱帯標本の両側に載置され、適切な細胞成長培地（ダルベッコ改変イーグル培地と、１０％ウシ胎仔血清と、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給される）１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質）を含有する管の中に載置され、３日毎に規則的に培地を交換して１８日間成長のため放置された。靱帯試料がその後にホルマリン中に固定され、組織学のため処理され、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された。靱帯の顕微鏡検査は、ＧＣＩＢ処理なしの靱帯標本対照と比べて、ＧＣＩＢ処理を受けた靱帯標本上での非常に増強された細胞付着及び増殖を明らかにした。
【００３３】
図５は、上述のように、真空暴露を含むが、ＧＣＩＢ照射なしで処理された、脱細胞化されたブタの靱帯組織５０４の非照射対照標本の表面領域５０２を示す顕微鏡写真５００を示す。新たに成長した線維芽細胞の１−２細胞層５０６は、下にある靱帯組織５０４に付着していることが分かる。
【００３４】
図６は、上述のように、真空暴露及びＧＣＩＢ照射の両方を含む処理がなされた、脱細胞化されたブタの靱帯組織６０４のＧＣＩＢ照射標本の表面領域６０２を示す顕微鏡写真６００を示す。図６における倍率は、図５における倍率と同じである。図６では、新たに成長した線維芽細胞の３−７細胞層６０６が照射された表面で下にある靱帯組織６０４に付着していることが分かる。さらに、多数の新しい線維芽細胞（例えば、６０８Ａ、６０８Ｂ及び６０８Ｃ）は、脱細胞化靱帯組織の中の非常に深い場所に埋め込まれていることが分かる。新たに成長した線維芽細胞は、ＧＣＩＢ被照射表面で増殖するのに加えて、靱帯に移動し始めた。
【００３５】
これらの結果は、より活発な表面成長と靱帯への移動の増加とが見られるように、脱細胞化された靱帯の表面のＧＣＩＢ照射が外側表面での線維芽細胞の付着、成長又は増殖のためのより好ましい環境を作り出したことを示唆する。靱帯への細胞の移動は、外科的移植のための靱帯組織エンジニアリングの分野において重要な進歩である。生物学的材料のＧＣＩＢ処理は、（例えば、ＡＣＬ再建のような）外科手術のための著しく改善された臨床転帰を生じることがある。これまでのところ、（例えば）ＡＣＬ再建外科手術は、一部で、移植された靱帯又は腱組織の身体への統合が比較的弱いため、長い間に亘って成功を制限していた。ＧＣＩＢ処理された靱帯又は腱は、より急速に統合し、従来型のＡＣＬ再建外科技術を用いて実現された利点を拡大するより堅固に接合された統合を形成することになる。
【００３６】
初代培養細胞は、体外成長中に脱分化することはよく知られている。様々な成長因子及び分裂促進因子が細胞の当初の遺伝子型及び形態を維持するために培養に添加されることがある。初代ヒト骨芽細胞は、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ダルベッコ改変イーグル培地と、１０％ウシ胎仔血清と、１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質の中で見られる因子以外の付加的な成長因子又は分裂促進因子を含まない組織培養プレート中で２乃至４継代に亘って成長させられた。２乃至４継代の骨芽細胞は、対照状態か、又は、１ｃｍ２当たりに５×１０１４個のアルゴンクラスターでＧＣＩＢによって照射された状態のいずれかでチタンにシードされ、そして、骨芽細胞は、１日間、７日間、又は、１０日間に亘って付着及び増殖のため放置された。この期間に続いて、ＲＮＡがＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から抽出された。ＵＶ分光分析によるＲＮＡ定量化に続いて、等量のＲＮＡ（１マイクログラム）がｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してｃＤＮＡに逆転写された。結果として得られた１００ピコグラムのｃＤＮＡは、アルカリホスファターゼ−骨形成及び骨石化中に関連することが知られている肝臓、骨、腎臓（ＡＬＰＬ）と、オステオカルシンと呼ばれる骨タンパク質を生成することが知られ、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨが補正された骨γ−カルボキシグルタミン酸（ｇlａ）含有タンパク質（ＢＧＬＡＰ）とを含む骨形成に関連することが知られている種々の遺伝子の発現解析のためリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）に晒された。発現解析は、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと、遺伝子特異的プライマー（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが提供）を用いるＳｔｅｐＯｎｅシステムで、条件及び時点毎にｎ＝３で実行された。対照結果に対する倍率変化は、ΔΔＣＴ法を使用して取得された。アルゴンＧＣＩＢ処理されたチタン上で成長した骨芽細胞は、１０日目にＧＣＩＢ処理されていないチタンと比べて、ＡＬＰＬにおいて３．４１倍の増加をもたらし、ＢＧＬＡＰにおいて２．６６倍の増加をもたらすことが明らかにされ（変化の統計的有意性ｐ＜０．０５）、骨芽細胞が骨形成につながる分化を受けることを示す。このように、表面のＧＣＩＢ処理だけで、ＧＣＩＢ処理された表面上で増殖する細胞の分化を誘発する。
【００３７】
生物学的材料の場合、大抵は望ましくは、材料のうちの予め選択された部分だけがＧＣＩＢ照射によって処理されるべきであり、その他の部分は照射されるべきでない。このような状況では、ＧＣＩＢの照射の広がりを望ましいエリアだけに制限するために、ＧＣＩＢ断面積を制御し、ＧＣＩＢの走査及び／又は偏向を制御することは、生物学的材料の選択された部分のＧＣＩＢの暴露を制御することがある。代替的に、従来のマスキング技術は、照射されることが望ましくない生物学的材料のマスク表面積を制御し、照射されることが望ましい表面積だけを暴露するため使用されることがある。その後、マスクと、マスクを通して暴露された生物学的材料とは、ＧＣＩＢの拡散、又は、走査型ＧＣＩＢを用いて照射される。ＧＣＩＢ照射を生物学的材料の選択された領域に制限する様々なその他の方法は、当業者に周知であり、本発明に包含されることが意図されている。
【００３８】
生物学的材料のある一定の第１の被選択部分は、これらの被選択部分に第１のＧＣＩＢ照射を実行して処理されることがある。生物学的材料の追加的な被選択部分は、１回以上の追加的なＧＣＩＢ照射の処理を実行することによりさらに処理されることがある。追加的な（複数の）ＧＣＩＢ照射プロセスは、異なるＧＣＩＢと、真空処理条件、例えば、異なるＧＣＩＢ照射量、又は、ガスクラスターイオンの中の異なる組成ガス、又は、（異なるイオンビームエネルギー及び速度を生じる）異なるビーム加速電位を用いることがある。追加的な被選択部分は、第１の被選択部分とは異なる部分でもよく、又は、第１の被選択部分に部分的若しくは完全に一致してもよく、又は、第１の被選択部分のすべてと追加部分とを含むことがある。このような選択的処理は、外科的移植又は接合後に、再細胞化と、引き続く身体への統合とにおいて異なる望ましい応答を導き出すために用いられることがある。
【００３９】
さらに、生物学的材料の所定の断片は、単一のＧＣＩＢ照射プロセスによってさらに一様に処理され、続いて、手術箇所、他の薬剤の塗布、又は、その他の局部的な要因に応じて、異なる積極的な仕方で外科的移植プロセスに応答することがある。例えば、ＡＣＬ置換術のため使用される腱は、単一のＧＣＩＢ照射プロセスを用いて一様に処理されることがある。外科的に移植されたとき、局部的な影響が原因となって、骨と接触した部分は、骨芽細胞の増強された移動、付着、及び、分化を促進し、固定用骨への腱の統合を促進する骨形成をもたらし、一方、その他の細胞型は、骨と接触していない移植された腱の他の部分へ優先的に引き付けられる。最も重要であるのは、滑液包部分で見られる靱帯線維芽細胞を含む線維芽細胞は（移植片は置換靱帯としての役割を果たす）、優先的に移植片に引き付けられ、接着し、そして、移植片に入ることである。
【００４０】
多血小板血漿（ＰＲＰ）と、反発性ガイダンス分子（ＲＧＭａ、ＲＧＭｂ、及び／又は、ＲＧＭｃ）と、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒状マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１及びインターロイキン−９（ＩＬ１、ＩＬ６）、又は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を含むサイトカインと、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、並びに、すべての骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、アクチビンＡ、成長分化因子（ＧＤＦ）、及び、ノーダルを含む形質転換成長因子（ＴＧＦβスーパーファミリー）のメンバーと、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、及び、−ＢＢ）と、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と、インシュリンのような成長因子（ＩＦＧ）と、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、又は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような適切な成長因子及び分化因子の直接的な投与によって、或いは、ＴＧＦβ又はＴＧＦβ族のメンバーを含有する脱灰骨粉の投与によって、細胞再生が望ましい組織型を優先して分化できる。代替的に、関節滑膜腔、又は、レシピエントの大腿骨かどこかから採取された骨髄の軟膜層において見られる脂肪パッドからの間葉系幹細胞のｉｎ ｓｉｔｕ濃縮液を投与することにより、局所性のため適切な細胞へ自然に分化する細胞の再生が促進される。
【００４１】
図７は、損傷した関節における靱帯置換術のための本発明の改善された生物学的材料の有利な適用の例示的な実施形態を示す膝関節の略図７００である。この略図は、例示の目的のため示され、必ずしも正しい縮尺ではない。膝関節の前方十字靱帯（ＡＣＬ）の破裂は、多くの場合に負傷したＡＣＬの置換の外科的移植を必要とする負傷である。靱帯若しくは腱、又は、これらの一部分は、置換移植片としての機能を果たすことがある。移植片は、自家組織、同種組織、又は、異種組織から得ることができる。種々の従来型の外科的修復術が存在する。改善されたアプローチは、図７に移植片７１８として指定された、脱細胞化され凍結乾燥されたＧＣＩＢ照射された腱又は靱帯組織を使用する。略図７００は、膝関節におけるＡＣＬの置換移植片の断面図である。大腿骨７０２の下端部には大腿骨軟骨７０６がある。脛骨７０４の上端部には、脛骨軟骨７０８がある。軟骨７０６と軟骨７０８とは、膝関節の関節接触表面を形成する。大腿骨７０２及び脛骨７０４の斜線エリアは、それぞれ、（外科的に切断されたのではなく、単に例示の目的のため）大腿骨７０２の切断面及び脛骨７０４の切断面を表す。便宜のため、断面は、置換移植片７１８が位置する平面を通して示される。トンネル７１０及び７１２は、大腿骨及び脛骨７０４のそれぞれにドリルで開けられ、さらに、骨の間の脛骨軟骨７０８と大腿骨軟骨７０６を貫通する。種々のトンネル構造が用いられ、トンネル７１０及び７１２のため示された構造は、単に実施例として意図された。明瞭さのため、膝蓋骨は示されず、関節を囲み、関節のすべての内面を濡らす滑液を維持する滑液包も示されない。本発明の置換移植片７１８は、トンネル７１０及び７１２の中に置かれ、それぞれ留め具７１４及び７１６によって大腿骨端部及び脛骨端部に締め付けられる。種々の留め具及び固定技術（金属及び生物分解性ポリマー留め具を含む）のうちのいずれが用いられてもよく、留め具７１４及び７１６は、単に例示的であることが意図されている。移植片７１８は、大腿骨トンネル７１０の中に挿入され、維持された大腿骨挿入部７２２を有し、脛骨トンネルの中に挿入され、維持された脛骨挿入部７２０を有している。
【００４２】
一実施形態では、移植片７１８の脱細胞化され凍結乾燥されたＧＣＩＢ被照射組織は、この移植片の外科的置換及び関節での締め付けの前に再建されない。関節を湿らせる滑液（図示せず）は、大腿骨挿入部７２２及び脛骨挿入部７２０の両方を含む移植片７１８と接触する。滑液の中の（又は、損傷し、摘出されたＡＣＬの残存線維の内部に存在する）線維芽細胞は、移植片７１８と接触し、移植片７１８に付着し、移植片７１８の内部で増殖する。これらの線維芽細胞は、成長し、適切な靱帯線維芽細胞に分化し、最終的に健康な組織を再建する。移植片７１８の大腿骨挿入部７２２及び脛骨挿入部７２０では、移植片が脛骨の中のトンネル７１２の骨、及び、大腿骨の中のトンネル７１０の骨と接触する場所で、挿入部７２０及び７２２は、血液及び骨芽細胞の前駆細胞を含有する骨組織と接触する。骨芽細胞は、移植片７１８の挿入部７２０及び７２２の表面に広がり、付着し、増殖し、そして、移植片７１８の挿入部７２０及び７２２の中の移植片構造体を最終的に完全に再モデル化し、置換する骨組織に分化する。
【００４３】
別の実施形態では、移植片７１８の外科的配置の前に、挿入部７２０及び７２２になる移植片の部分、及び／又は、骨と共に挿入されない移植片の部分は、多血小板血漿（ＰＲＰ）と、反発性ガイダンス分子（ＲＧＭａ、ＲＧＭｂ、及び／又は、ＲＧＭｃ）と、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒状マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１及びインターロイキン−９（ＩＬ１、ＩＬ６）、又は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を含むサイトカインと、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、並びに、すべての骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビンＡ、成長分化因子（ＧＤＦ）、及び、ノーダルを含む形質転換成長因子（ＴＧＦβスーパーファミリー）のメンバーと、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、及び、−ＢＢ）と、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と、インシュリンのような成長因子（ＩＦＧ）と、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、又は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のような適切な成長因子及び分化因子の追加で処理されることがある。代替的に、関節滑膜腔、又は、レシピエントの大腿骨かどこかから採取された骨髄の軟膜層において見られる脂肪パッドからの間葉系幹細胞のｉｎ ｓｉｔｕ濃縮液を投与することにより、局所性のため適切な細胞へ自然に分化する細胞の移殖片内部での再生が促進され、例えば、健康な骨の生成に向けて挿入部７２０及び７２２の中で付着し増殖する細胞の分化を促進する。
【００４４】
さらに別の実施形態では、骨コラーゲンと、骨のその他の非石化成分とを含み、場合によっては、ＴＧＦβ又はＴＧＦβ族のメンバーを含有する脱灰骨粉は、トンネル７１０及び７１２に挿入され、移植片７１８の挿入部７２２及び７２０と接触し、健康な骨の生成に向けて挿入部７２０及び７２２の中で付着し増殖する細胞の分化を促進する。
【００４５】
さらなる実施形態では、関節滑膜腔、又は、患者の大腿骨かどこかから採取された骨髄の軟膜層において見られる脂肪パッドからの幹細胞が接触片７１８の挿入部７２０及び７２２にｉｎ ｓｉｔｕ投与され、健康な骨の生成に向けて挿入部７２０及び７２２の中で付着し増殖する細胞の分化を促進する。
【００４６】
発明は、例示の目的のため、骨、靱帯及び腱を含むある種の材料の観点から説明されているが、その他の生物学的材料が本発明の範囲に含まれることが分かる。例示的な実施形態は、ＡＣＬ関節修復の観点から説明されているが、広範囲のその他の関節及び軟組織移植片が本発明の恩恵を受け、本発明に含まれることが意図される。本発明の実施形態は、新鮮なブタの組織の観点から教示されているが、当業者は、用いられた技術が鳥類と人類を含むその他の哺乳類からの組織を含む、その他の組織への通常の変更と一体となって同様に用いられることが容易に分かることになり、発明者は、発明の方法が冷凍及び／又は凍結乾燥された外移植組織と一緒に、そして、類似の結果を伴う新鮮な外移植組織も同様に有利に用いることができることを実験的に確認している。
【００４７】
腱組織及び靱帯組織は、当業者によく知られた従来の技術を使用して容易に凍結乾燥される。凍結乾燥された組織は、いくつかの利点を提供し、従って、本発明の技術の多数の潜在的な適用において好ましい。凍結乾燥された組織は、凍結乾燥された組織が新鮮な組織又は冷凍組織のどちらかより少ない蒸気を放出するので、プロセスのイオン照射フェーズの準備中、及び、期間中にイオンビーム照射ツールの真空システムにより小さい負荷を与える。付加的に、凍結乾燥された組織は、照射の後に続くかなりの期間に亘って劣化なしに保存でき、そして、凍結乾燥された組織の外科的移植のため、低コストの従来型の輸送方法によって遠く離れた場所へ容易に輸送又は運搬できる。凍結乾燥された被照射組織は、後に、外科的移植の直前に外科手術の場所で、（例えば、生理食塩水を用いて、又は、レシピエントの身体流体又はその他の適当な流体を用いて）再建されることがある。同様に、凍結乾燥された被照射組織は、外科的移植の直前に外科手術の場所で細胞を用いてシードすることができる。再建及び細胞シードは、移植片の適合性を高めるために細胞含有体液を用いて行われることさえある。代替的に、凍結乾燥された被照射組織は、凍結乾燥された状態でレシピエントに外科的移植可能であり、凍結乾燥された被照射組織がレシピエントの体液及び細胞に接触すると直ちに、移植片の場所で移植片組織のｉｎ ｓｉｔｕ再建及び細胞シードを生じる。一般に、凍結乾燥された被照射細胞の長い貯蔵期間は、かなりの柔軟性及び実用性を全体的な調製のプロセス及び移植片組織の移植成功に与える。
【００４８】
本発明の方法と共に用いるため外移植された移植片材料は、種々の鳥類及び哺乳類の種（人類を含む）から採取されることがあり、本発明の方法によって調製された移植片材料の外科的移植は、多種多様の哺乳類の種（人類を含む）に行うことが可能であり、そして、このような移植片は、移植片組織のドナー及びレシピエントに応じて、同種移植片でもよく、自家移植片でもよく、又は、異種移植片でもよい。新しい細胞を採取し、（脱細胞化された組織及び／又は凍結乾燥された組織を含む）組織の上で成長させ、組織の中へシードする技術は、当業者に知られている技術に応じて、見込み移植片レシピエントから、又は、他の適当なドナー集団からの細胞を利用することがある。例示的なブタの靱帯を調製する際に用いられた外移植及び脱細胞化の技術は、腱組織に適用することも可能である。従って、本発明の方法は、当業者に周知の技術に従って、（必要に応じて）脱細胞化し、（必要に応じて）凍結乾燥し、そして、細胞付着及び増殖のため特定の新しい細胞を用いて、組織又は脱細胞化された組織をシードするため、（自家ドナーを含む）ドナー又は死体から腱、靱帯、又は、その他の組織を取り出すために使用できる。照射技術の使用によって、移植片材料への新しいセルの付着及び増殖の成功は、著しく改善され、レシピエントへの移植片の統合の成功可能性の増大と、全体的な医療結果の成功可能性の増大とに貢献する。
【００４９】
本明細書中で使用されるように、用語「生物学的材料」は、限定されることなく、脱細胞化又は自然に細胞化された状態、生きているか又は死んでいる、新鮮、凍結、凍結及び解凍、凍結乾燥、凍結乾燥及び再建、イオン照射の有無にかかわらず、腱、靱帯、骨、軟骨、軟組織、及び、その他の組織からなる材料を含む生物学的由来のすべての組織材料を包含することを意図している。本発明は、特有の加速電位を用いて形成され、特有の照射量で投与されたＧＣＩＢの適用に関して説明されているが、その他の照射量及び加速電位が利用されてもよいことと、このような変形がＧＣＩＢ照射の影響の程度に変化を生じることとが当業者によって認められることになる。本発明は、アルゴンガスで構成されたガスクラスターイオンを有するＧＣＩＢの適応に関して説明されているが、その他の組成のガス及びガス混合物も同様に有利に利用されることが当業者によって認められることになる。その他の組成のガス及びガス混合物は、希ガス、Ｎｅ、Ａｒ、Ｘｅ及びその他のガスを含み、限定されることなく、有機及び無機の両方の酸素ガス、窒素ガス、二酸化炭素ガス、その他の炭素含有ガスを含み、その他のガスと混合されたこれらのいずれかのガスからなるガス混合物をさらに含み、このような変形は、ＧＣＩＢ照射の効果の程度及び形の変化を生じることになる。本発明は、以上の開示及び請求項に記載された事項の趣旨及び範囲の中で多種多様のさらなる実施形態及びその他の実施形態もまた可能であることが認められるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーから移植片組織を外移植することと、
前記移植片組織の少なくとも第１の部分にイオンビームを照射することと、
前記移植片組織をレシピエントに外科的移植することと、
を含む、組織の外科的移植方法。
【請求項２】
前記ドナーは、哺乳類種又は鳥類種であり、前記レシピエントは、哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記移植片組織は、同種移植片、自家移植片、又は、異種移植片である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記移植片組織は、靱帯組織又は腱組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記照射することの前に前記移植片組織を凍結乾燥することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記照射することの前に前記移植片組織の少なくとも第２の部分を脱細胞化することをさらに含み、前記第１の部分は、前記第２の部分のうちの少なくとも一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結乾燥することの前に前記移植片組織の少なくとも第２の部分を脱細胞化することをさらに含み、前記第１の部分は、前記第２の部分のうちの少なくとも一部を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
シードするため細胞を採取することと、
前記外科的移植することの前に、採取された細胞を用いて前記少なくとも第１の部分のうちの少なくとも第３の部分をシードすることと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記採取された細胞は、前記レシピエントから採取された細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結乾燥すること及び前記照射することの後に、かつ、前記外科的移植することの前に、前記移植片組織を再建することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結乾燥すること及び前記照射することの後に、かつ、前記シードすることの前に、前記移植片組織を再建することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記外科的移植することにおいて、ｉｎ ｓｉｔｕ再建又はシードのため、前記少なくとも第２の部分を前記レシピエントからの体液又は細胞と接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記外科的移植することの前に、前記外科的移植のため、前記移植片組織を離れた場所へ輸送することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記イオンビームはガスクラスターイオンビームである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ドナーから移植片組織を外移植することと、
前記移植片組織の少なくとも第１の部分を脱細胞化することと、
前記移植片組織の前記第１の部分のうちの少なくとも第２の部分を凍結乾燥することと、
前記移植片組織の前記第２の部分のうちの少なくとも第３の部分に照射することと、
将来の使用のため前記移植片組織を任意的に保存することと、
外科的移植のため前記移植片組織を離れた場所へ任意的に輸送することと、
前記移植片組織の前記少なくとも第３の部分の少なくとも表面に細胞を任意的にシードすることと、
前記移植片組織の上又は中に、前記細胞を所望の程度、任意的に付着及び増殖させることと、
前記移植片組織をレシピエントに外科的移植することと、
を含む、外科的移植方法。
【請求項１６】
前記第１の部分、前記第２の部分、又は、前記第３の部分は、少なくとも共通表面部分を有している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
成長因子と、
サイトカインと、
分化因子と、
脱灰骨粉と、
幹細胞と、
からなる群より選択された成分を含有する組成物を前記移植片組織に暴露することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
ドナーから移植片組織を外移植することと、
前記移植片組織の少なくとも第１の部分にイオンビームを照射することと、
前記移植片組織をレシピエントに外科的移植することと、
を含む、組織の外科的移植方法。
【請求項２】
前記ドナーは、哺乳類種又は鳥類種であり、前記レシピエントは、哺乳類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記移植片組織は、同種移植片、自家移植片、又は、異種移植片である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記移植片組織は、靱帯組織又は腱組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記照射することの前に前記移植片組織を凍結乾燥することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記照射することの前に前記移植片組織の少なくとも第２の部分を脱細胞化することをさらに含み、前記第１の部分は、前記第２の部分のうちの少なくとも一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結乾燥することの前に前記移植片組織の少なくとも第２の部分を脱細胞化することをさらに含み、前記第１の部分は、前記第２の部分のうちの少なくとも一部を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
シードするため細胞を採取することと、
前記外科的移植することの前に、採取された細胞を用いて前記少なくとも第１の部分のうちの少なくとも第３の部分をシードすることと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記採取された細胞は、前記レシピエントから採取された細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結乾燥すること及び前記照射することの後に、かつ、前記外科的移植することの前に、前記移植片組織を再建することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結乾燥すること及び前記照射することの後に、かつ、前記シードすることの前に、前記移植片組織を再建することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記外科的移植することにおいて、ｉｎ ｓｉｔｕ再建又はシードのため、前記少なくとも第２の部分を前記レシピエントからの体液又は細胞と接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記外科的移植することの前に、前記外科的移植のため、前記移植片組織を離れた場所へ輸送することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記イオンビームはガスクラスターイオンビームである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ドナーから移植片組織を外移植することと、
前記移植片組織の少なくとも第１の部分を脱細胞化することと、
前記移植片組織の前記第１の部分のうちの少なくとも第２の部分を凍結乾燥することと、
前記移植片組織の前記第２の部分のうちの少なくとも第３の部分に照射することと、
将来の使用のため前記移植片組織を任意的に保存することと、
外科的移植のため前記移植片組織を離れた場所へ任意的に輸送することと、
前記移植片組織の前記少なくとも第３の部分の少なくとも表面に細胞を任意的にシードすることと、
前記移植片組織の上又は中に、前記細胞を所望の程度、任意的に付着及び増殖させることと、
前記移植片組織をレシピエントに外科的移植することと、
を含む、外科的移植方法。
【請求項１６】
前記第１の部分、前記第２の部分、又は、前記第３の部分は、少なくとも共通表面部分を有している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
成長因子と、
サイトカインと、
分化因子と、
脱灰骨粉と、
幹細胞と、
からなる群より選択された成分を含有する組成物を前記移植片組織に暴露することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５２０１４３（Ｐ２０１２−５２０１４３Ａ）
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５４１９９（Ｐ２０１１−５５４１９９）
【出願日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２６９８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０５０５６
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５０８２１６５５２）エクソジェネシス コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２６９８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０５０５６
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５０８２１６５５２）エクソジェネシス コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
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