ガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子
【課題】新規なＤ−ガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子を提供する。
【解決手段】タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から、低温適応酵母であるCryptococcus diffluens FC11株を分離し、当該酵母株から１０〜３０℃の低温においても比較的高い活性を示すＤ−ガラクチュロン酸還元酵素をコードする配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子を得た。
【解決手段】タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から、低温適応酵母であるCryptococcus diffluens FC11株を分離し、当該酵母株から１０〜３０℃の低温においても比較的高い活性を示すＤ−ガラクチュロン酸還元酵素をコードする配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子を得た。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンは野菜や果実に多く含まれているが、その再利用に関して、例えばりんご搾汁残渣に含まれるペクチンは、その約７０％が農作物の肥料、家畜の飼料、増粘多糖類、ゲル化剤、乳タンパク安定剤などの食品添加物に再利用されるにすぎず、残る約３０％のペクチンが廃棄されているとの報告がある。また、ペクチンはりんご以外の果物、特に柑橘類の搾汁残渣にも多く含まれるが、その再利用率はりんごの場合よりもさらに低いといわれている。このようにペクチンの再利用は肥料等の安価な利用かつ食品産業など限られた産業における利用にとどまっており、ペクチンを幅広い産業でバイオマス資源として再利用することは天然資源の確保の面からも、ごみ処理という環境浄化の面からも注目に値する。
【０００３】
ペクチンは植物細胞壁・特に果実の細胞壁に多く含まれる非セルロース性多糖であり、ホモガラクツロナン、ラムノガラクツロナン−I、ラムノガラクツロナン−IIという３つの特徴的な構造ドメインから形成される複合多糖である。このうち、ホモガラクツロナンはペクチンの主要構成糖として知られており、ペクチンの約７０%を占める。ホモガラクツロナンの中でもっとも一般的な構造はガラクチュロン酸のみがα−１,４−結合したポリガラクチュロン酸であり、一部のガラクチュロン酸にはそのカルボキシル基がメチルエステル化されたものやその水酸基がアセチル化されたものが存在している。
【０００４】
ポリガラクチュロン酸は様々な微生物によって分解される。例えば、植物寄生性を示すバクテリア、例えば一部の糸状菌は、ガラクチュロン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸にまで代謝する。この代謝は、真性細菌によく見られる代謝系であるエントナードウトロフ（ＥＤ）経路を利用することによって行われている。また、Kluyveromyces属酵母など、酵母においても、ポリガラクチュロン酸のグルコシド結合を加水分解するポリガラクチュロン酸分解酵素（ポリガラクチュロナーゼ）を生産する種はいくつか知られている（例えば非特許文献１や２参照）。
【０００５】
しかしながら、ガラクチュロン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸にまで代謝するＥＤ経路は真核生物では確認されておらず、酵母ではポリガラクチュロン酸から分解されたガラクチュロン酸を利用することはできないと考えられていた。事実、Kluyveromyces属酵母をはじめとしたポリガラクチュロナーゼ生産酵母において、ポリガラクチュロナーゼ分解産物であるガラクチュロン酸が資化されたという報告例はない。そして、ガラクチュロン酸を資化する酵母を利用することができれば、ペクチンの再資源化においても有効な手段を与えると考えられる。
【０００６】
ガラクチュロン酸を還元する酵素として、これまでのところカビの一種であるHypocreajecorina株から得られたＬ−ガラクチュロン酸脱水素酵素が報告されているが（非特許文献３）、酵母を起源とするものは知られていない。しかも、低温においても活性を維持するものは知られていない。
【０００７】
一方、近年では、食品の熟成等に用いられている低温機能性酵素への期待が高まっており、その低温適応性微生物が着目されている。
【０００８】
このような状況下において、本願発明者らは、タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から、低温適応酵母であるCryptococcus diffluens FC11株を分離し、当該酵母株から１０〜３０℃の低温においても比較的高い活性を示すＤ−ガラクチュロン酸還元酵素を見いだした（非特許文献４、５）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hirose, N., Kishida, K., Kawasaki, H. and Sakai, T. (1999) Purification and characterization of an endo-polygalacturonase from a mutant of Saccharomyces cerevisiae., Bioscience Biotechnology and Biochemistry vol.63, 1100-1103
【非特許文献２】Sienkstele, R., Bartkeviciute, D. and Sasnauskas K. (1999) Cloning,targeted disruption and heterologous expression of the Kluyveromyces marxianus endo-polygalacturonase gene (EPG1). Yeast vol.15, 311-322
【非特許文献３】Kuorelahti, S., Kalkkinen, N., Penttila, M., Londesborough, J., Richard, P., Identification in the mold Hypocrea jecorina of the first fungal D-galacturonic acid reductase, Biochemistry vol. 44: 11234-11240 (2005)
【非特許文献４】Kishida M., Seike Y., Kawasaki H. (2009) Identification and characterization of psychrophilic yeast newly isolated from fermentative source (Loog-pang) of traditional drink in Thailand. Biocontrol Science Vol.14, p119-122.
【非特許文献５】岸田正夫ら、「低温適応酵母が生産するＤ−ガラクチュロン酸還元酵素」 第６０回日本生物工学回大会 講演要旨集、ｐ１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記Ｄ−ガラクチュロン酸還元酵素のアミノ酸配列を解析するとともにそれをコードする遺伝子を見いだし、工業的な生産を可能とすべく当該酵素をコードするｃＤＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｄ−ガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、低温でも高活性を示すＤ−ガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子が提供される。これにより当該酵素の工業的生産が可能となり、当該酵素を有効利用しうる新規な用途が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はガラクチュロン酸還元酵素の活性測定方法を示す図である。
【図２】図２はDEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムである。
【図３】図３はRed-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムである。
【図４】図４はMono Q カラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムである。
【図５】図５は各精製段階における酵素液の電気泳動画像である。
【図６】図６はゲルより抽出したペプチド断片のＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図７】図７はTOPO TAクローニングベクターpCR2.1-TOPOの遺伝子地図である。
【図８】図８は3'-RACE法により得られた約５５０ｂｐのｃＤＮＡ部分遺伝子の泳動画像である。
【図９】図９は3'-RACE法により得られた約５５０ｂｐのｃＤＮＡ部分遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図１０】図１０はカセットＰＣＲ法により得られた５´領域ゲノムＤＮＡ断片の電気泳動画像である。
【図１１】図１１はカセットＰＣＲ法により得られた５´領域ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図１２】図１２は決定されたＤ−ガラクチュロン産還元酵素の全遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図１３】図１３は決定されたＤ−ガラクチュロン産還元酵素をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図１４】図１４は決定されたＤ−ガラクチュロン産還元酵素のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の遺伝子がコードするＤ−ガラクチュロン酸還元酵素は、上記のようにタイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から分離された低温適応酵母であるCryptococcus diffluens FC11株（寄託番号：NITE P-611、寄託日：平成２０年７月１８日）から取得される。当該酵素はＤ−ガラクチュロン酸を還元してＬ−ガラクトン酸を生成する。当該酵素は特願２００８−２８５９７６号に開示されており、その記載が本願において援用される。その酵素の特徴として、特に１０〜３０℃の低温においても、至適温度における活性の６０％程度の活性効率で反応を行わせることができ、室温条件でもガラクチュロン酸をＬ−ガラクトン酸に変換できることが挙げられる。当該酵素は、以下の理化学的特徴を有する。
【００１５】
（１）温度安定性及びｐＨ安定性
２０〜４５℃及びｐＨ６.０〜８.４の環境下で安定である。
（２）至適温度及び至適ｐＨ
至適温度は４０℃付近、至適ｐＨは６.３付近である。
（３）基質特異性
ガラクチュロン酸、グルクロン酸に作用するが、ガラクトース、グルコース、マンノース、ソルビトール、グルコン酸には作用しない。
（４）金属による影響
各１ｍＭのＣｕ2+、Ｆｅ2+、Ｐｂ2+によって阻害を受けるが、各１ｍＭのＭｇ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+、Ｋ+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+によって阻害を受けない。
（５）電子供与体
ＮＡＤＰＨ特異的である
【００１６】
本発明に係る遺伝子は、上記ガラクチュロン酸還元酵素をコードするｃＤＮＡであって、配列番号１に示された塩基配列を有する。本発明においては、上記ガラクチュロン酸還元酵素を生産できる限りにおいて、配列番号１に示される塩基配列から、１〜数十個の塩基が欠失・置換・挿入された塩基配列からなるか、相同性が８０％以上、好ましくは９０%以上、望ましくは９５％以上である塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
【００１７】
本発明に係る遺伝子は下記実施例において説明した方法により取得されるが、一般の遺伝子工学的手法により合成することもできる。また、本発明の遺伝子は、一般的な遺伝子工学的手法によって、その５´末端側にプロモータ領域、３´末端側にターミネータ領域などタンパク質発現のために必要な領域が結合された上で発現ベクターに組み込まれ、その後大腸菌など適当な宿主を形質転換して目的とする酵素の生産に利用される。
【実施例１】
【００１８】
次に、本発明の遺伝子について下記の実施例に基づいて詳細に説明する。
〔ガラクチュロン酸還元酵素遺伝子のクローニング〕
１．菌の培養
単離された C. diffluens OPU-FC11株を使用した。種培養にはＧＹＰ培地（Yeast extract１％、Peptone１％、Glucose１％、ｐＨ５.０）、本培養にはガラクチュロン酸培地（Yeast extract１％、Peptone１％、D-Galacturonic acid (GalA)０.２％、ｐＨ５.０）を用いた。ＧＹＰ培地を入れた短試験管に、菌を１白金耳植菌し、３０℃１日間振盪培養した。その培養液を更に、種培養培地９本に５０ｍｌずつ植菌し、３０℃で１日間振盪培養した。その培養液を５００ｍｌ容坂口フラスコに２００ｍｌのガラクチュロン酸培地を入れた本培養培地２０本に２ｍｌずつ植菌し、計４Ｌを３０℃で２日間振盪培養した。
【００１９】
２．ガラクチュロン酸還元酵素の精製
２−１．粗酵素液の調整
培養菌体を遠心分離（10000rpm、１０分)で集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下「ＫＰＢ」という）（ｐＨ７.０）で洗菌後、同緩衝液で懸濁した。懸濁菌体はOHTAKE WORKSのFRENCH PRESSを用いて１５００ｋｇ／ｃｍ２で１回破砕を行った。破砕した菌体を遠心分離（10000rpm、１０分）により、上清画分と沈殿（細胞残渣）画分に分離した。上清画分を１０ｍＭＫＰＢで十分に透析したものを粗酵素として用いた。
【００２０】
２−２．酵素の精製
得られた粗酵素をDEAE-Toyopearlによるカラムクロマトグラフィーにて精製した。４℃下にて、酵素液を２０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で平衡化したDEAE-Toyopearl (東ソー社;φ３×１５ｃｍ)に供し、ＮａＣｌ０〜０.５Ｍの直線濃度勾配法により溶出した。流速は１.０ｍｌ／ｍｉｎで行い、５ｍｌずつ分画を行った。その後、それぞれのフラクションのタンパク質量と活性を測定した。酵素活性は、Ｄ−ガラクチュロン酸の還元に伴うＮＡＤＰＨの酸化減少量を、ＮＡＤＰＨの特異吸収波長（ＯＤ３４０）の初速度変化を測定することによって求めた（図１）。DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを図２に示す。活性の強い４５〜６０本目のフラクションを回収した。
【００２１】
次に、DEAE-Toyopearl カラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を回収し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したRed-Toyopearl (東ソー社;φ２×４ｃｍ)に供し、ＮａＣｌ０〜０.６Ｍの直線濃度勾配法により溶出した。流速は１.０ｍｌ／ｍｉｎで行い、５ｍｌずつ分画を行った。その後、それぞれのフラクションのタンパク質量と活性を測定した。Red-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを図３に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで活性のあった各フラクションの精製純度を確認後、夾雑タンパクが少ない６１〜６９本目のフラクションを回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Current Protocols in Molecular Biology（WILEY INTERSCIENCE社製）に記載されている方法に従った。このとき使用されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの組成を表１に示す。分子量マーカーはXL-Lader Broad（APRO社製）が用いられた。酵素液とその１／３量のサンプルバッファー（表２）を混合し、１００℃、５分間熱処理して調製した試料を２０ｍＡで電気泳動後、クマシーブルー染色を行った。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
Red-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を回収し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したMono Q HR 5/5パックカラム (Amersham Pharmacia Biotech社製)に供し、ＮａＣｌ〜０.４Ｍの直線濃度勾配法により溶出した。流速は１.０ｍｌ／ｍｉｎで行い、１ｍｌずつ分画を行った。その後、それぞれのフラクションのタンパク質量と活性を測定した。Mono Q カラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを図４に示す。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりMono Qカラムクロマトグラフィー後の活性画分の精製純度を調べた。７９〜８６本目のフラクションに約４５ｋＤａの電気泳動的に単一のバンドを確認することができた。各精製段階の酵素液の泳動写真による画像を図５に示す。
【００２５】
３．内部アミノ酸配列の決定
３−１．プロテインシーケンサーによるＮ末端アミノ酸配列の解析
上記培養菌体を遠心分離 (10000rpm、１０分)で集菌し、回収した菌体を適量１.５ｍｌのエッペンチューブに入れ、ビーズ（直径０.１ｍｍ）１.０ｇと１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）を１００μｌ加え、BIORUPTOR（コスモバイオ社製）を用いて、出力２５０Ｗ、インターバル３０秒の条件で２０分間超音波破砕を行った。その後、遠心分離（15000rpm、５分）し、上清を粗酵素液として回収した。
【００２６】
この粗酵素液３０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー染色後、酵素をHorizBLOT（ATTO社製）を用いてセミドライブロッティングを行い、PVDF膜に吸着させた。詳細な方法は説明書に従った。そして、プロテインシーケンサー PPSQ-33AでＮ末端アミノ酸配列解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは上記２.酵素の精製の項に記載の方法に従った。
【００２７】
３−２．ＬＣ／ＩＴ／ＴＯＦ−ＭＳによるアミノ酸配列の解析
３−１．で得られた粗酵素液５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色（Silver Stain, Wako Pure Chemicals Co）を行った。次にバンドを切り出し、下記の脱色、脱水、還元アルキル化、トリプシン消化を行い、分析用試料を得た。トリプシンペプチドのアミノ酸配列は、エレクトロスプレイイオン化ソース（NanoFrontier L; Hitachi High-Technologies, Ltd, Tokyo）を備え付けたＬＣ／ＩＴ／ＴＯＦＭＳとＮＣＢＩデータベース（NCBInr 20080523） に接続したMascot serch software (http://www.matrixscience.com）によって分析した。
【００２８】
（脱色）
１．１００μｌの脱色液を切り出したゲルに加え２０分間室温で攪拌する。
２．１００μｌのMilliQ水を加え室温で１０分間攪拌する。
３．溶媒を除去し、ゲルが完全に除去されるまで１.及び２.の操作を３回繰り返す。
【００２９】
（脱水）
１.２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む５０％アセトニトリルを上記脱色後の残留物に加え５分間室温で攪拌する。
２．アセトニトリルを除去し、Speed Vacuumにより１０分間乾燥させる。
【００３０】
（還元アルキル化）
１．上記乾燥物に２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む１０ｍＭジチオトレイトールを１００μｌ加え、窒素雰囲気下において５６℃、６０分間攪拌する。
２．溶媒を除去し、１００μｌの２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを加え、室温にて１０分間攪拌する。
３．２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む５５ｍＭヨードアセトアミド１００μｌを加え、暗所室温にて４５分間攪拌する。
４．溶媒を除去し、２．の工程を繰り返し、溶媒を除去する。
【００３１】
（トリプシン消化）
１．上記で得られた試料に、２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む５０％アセトニトリルを加え、室温で１０分間攪拌する。
２．溶媒を除去し、１．の工程を繰り返し、溶媒を除去する。
３．Speed Vacuumにより１５分間乾燥させる。
４．５０μｌのトリプシンゴールド（Promega社製;１０μｇ／ｍｌ２５ｍＭの炭酸水素ナトリウム）を加え、３７℃で１晩インキュベートする。
５．他の試験管に４．のトリプシン溶液を移し、１００μｌの２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを加え、室温で１５分間攪拌する。
６．溶液を他の試験管に移し、５％のホルマリンを含む５０％アセトニトリルを加え、室温で３０分間攪拌する。
７．上記５．及び６．の工程を再度繰り返す。
８．全ての溶液を集め（２９０μＬ）、Speed Vacuumにより約２０μＬまで濃縮する。
９.濃縮液をCosmospin filter G（Nakalai tesque社製）に移し、５,０００rpm、３分間遠心分離する。
【００３２】
３−３．プロテインシーケンサーによる内部配列の解析
上記２．酵素の精製の項で得られた精製酵素３０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー染色後、目的の４５ｋＤａバンド部分を切り出し、島津テクノリサーチ社に委託解析した。そこでは切り出したバンドを還元アルキル化、Lysyl Endopeptidase処理後In-gel digestion法により抽出したペプチド断片をＨＰＬＣにおいて精製分取を行った。そして、分取したペプチド断片を、プロテインシーケンサー PPSQ-33Aでアミノ酸配列解析を行った。得られた配列情報はNCBI BLAST （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて検索した。得られた配列情報はNCBI BLAST （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて検索した。
【００３３】
３−４．アミノ酸配列の決定
プロテインシーケンサーによるＮ末端アミノ酸配列の解析、ＬＣ／ＩＴ／ＴＯＦＭＳによるアミノ酸配列の解析では共にアミノ酸配列を決定することはできなかった。プロテインシーケンサーによる内部配列の解析で、決定することができた。ゲルより抽出したペプチド断片のＨＰＬＣの結果を図６に示す。これらの断片のうち、断片１、５、１０（Ｆｒ−１、５、１０) をプロテインシーケンサーPPSQ-33Aにてアミノ酸配列解析を行った。そのアミノ酸配列の結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
上記のように３つの断片のアミノ酸配列が決定された。得られたアミノ酸配列を、NCBI BLASTでデータベース (Non-redundant protein sequences) との相同性検索したところ、３つの断片のアミノ酸配列がそれぞれ、糸状菌Pyrenophora tritici-repentisのＤ−ガラクチュロン酸還元酵素 (ACCESSION : XP_001930351)の部分アミノ酸配列と８０％ほどの相同性を示した。よって得られたアミノ酸配列情報は正しいものであると考えられた。なお、断片Ｆｒ−１のＮ末端アミノ酸はGlu又はTyrの何れかであり、断片Ｆｒ−５のＮ末端アミノ酸はLys又はGlnの何れかであり、それに隣接するアミノ酸はGly又はHisの何れかであり、断片Ｆｒ−１０のＮ末端アミノ酸はGly又はHisの何れかであるが、いずれも確定できなかった。また、断片Ｆｒ−５の１０番目のアミノ酸も確定できなかった。
【００３５】
４．3'-RACE法によるｃＤＮＡ部分遺伝子のクローニングおよび塩基配列解析
４−１．酵素活性のタイムコース
ガラクチュロン酸還元酵素のｍＲＮＡを獲得するために、酵素活性の培養時間におけるタイムコースを測定した。上記２.１に示すガラクチュロン酸培地を１００ｍｌ入れた５００ｍｌ容坂口フラスコに、種培養したC. diffluens FC 11株を１ｍｌ植菌し、３０℃で振騰培養した。そして回収できる菌体量まで培養した後、タンパク量あたりのガラクチュロン酸還元酵素活性が次第に強くなっている培養時間を確認するまで、２時間ごとに菌体を回収し比活性を測定した。菌体は遠心分離（10000rpm、１０分間）で集菌し、上記３−１．プロテインシーケンサーによるＮ末端アミノ酸配列の解析の項に記載の方法で破砕し、酵素活性を測定した（結果は図示せず）。
【００３６】
４−２．C. diffluens FC 11株からのTotal ＲＮＡの抽出とｍＲＮＡの精製
菌体は、タンパク量あたりのガラクチュロン酸還元酵素活性が次第に強くなっている１１時間培養のものを使用した。培養菌体を遠心分離（10000 rpm、１０分間）で集菌し、その菌体を、１８０℃で乾熱滅菌したメタルコーンＭＣ−０２１２と共に破砕用チューブにいれ、液体窒素によって完全に凍結させた。その後、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて、1700rpm、２０秒の操作を１回行うことで破砕した。Total ＲＮＡ抽出はRNAqueous（AMBION社製）を用いて行った。方法は付属説明書に従った。混入したＤＮＡを完全に除去するためOligotexTM-dt30 mRNA Purification kit（タカラバイオ社製）を用い、説明書に従ってｍＲＮＡを精製した。
【００３７】
４−３．一本鎖ｃＤＮＡの合成
抽出したＲＮＡを用いて表４に示す試料を調製した。これを６５℃で５分間インキュベートし、氷冷後、表５に示すｃＤＮＡ合成反応液を調製した。３０℃で３０分間の前処理、続いて４２℃で６０分間反応し、９９℃で５分間処理して反応を停止させた後、氷冷した。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
４−４．ＰＣＲ
５´側のプライマーには、タンパク質の内部アミノ酸配列（表３）から作製した混合プライマーを使用した（表６）。また、３´側はT20APプライマーに相補するAP1およびAP2-2プライマーを用いた（表７）。ＰＣＲの特異性を高める為に、内部配列情報を基にしてnested PCRを行った。ＰＣＲには、Blend Ta（TOYOBO社製）を使用した。反応液組成とＰＣＲ条件は表に示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【表８】
【００４３】
４−５．TOPO TAクローニングベクターへのライゲーションおよび形質転換
増幅したＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した後、目的断片を切り出して、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス）を用いて精製した。精製後、TOPO TA cloning Kit（invitrogen社製）を用いてpCR2.1-TOPO（図７）へ導入した。ライゲーション条件はキット説明書に従った。ライゲーション後、大腸菌を形質転換して、生じた白コロニーからコロニーダイレクトＰＣＲ法（使用プライマー：Ｍ１３Forward、Ｍ１３Reverse）により、ＤＮＡ断片が挿入されているコロニーを選抜し、プラスミドを抽出した。獲得したプラスミドを鋳型としてＤＮＡシーケンスを行った。シーケンス時のプライマーは、Ｍ１３Forward、Ｍ１３Reverse（表９）を用いた。
【００４４】
【表９】
【００４５】
形質転換は次の方法に従った。ライゲーション後の反応液を用いてE. coli HB101の形質転換を行った。コンピテントセルはHB101 Competent cells（タカラバイオ社製）を使用した。コンピテントセル１０μｌとプラスミドＤＮＡをおだやかに混合し、２０分間氷中で放置した後、４２℃で４５秒間の熱ショックを与えた。氷冷後、ＬＢ液体培地（Yeast extract０.５％、Peptone１.０％、NaCl０.５％、ｐＨ７.０）を１００μｌ加え、３７℃で６０分間静置培養し、試料をＬＢＡプレート（ＬＢ液体培地に寒天１.５％を加え、１２０℃、２０分のオートクレーブを行った後、５０℃まで冷却し、アンピシリンを５０ｍｇ／ｍｌとなるように添加したもの）に塗布した後、３７℃で一晩静置培養した。
【００４６】
また、コロニーダイレクトＰＣＲは、生育したコロニーを鋳型としてＰＣＲを行って、ＤＮＡ断片が挿入されているコロニーを選抜した。反応液組成とＰＣＲ条件は表１０に示す。プライマーは目的とする遺伝子に適応したものを用いた。プラスミド抽出は、大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。菌体を回収後、アルカリＳＤＳ法により行った。
【００４７】
【表１０】
【００４８】
４−６．結果
FC11株のｍＲＮＡから合成した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とした3'-RACE法によって、約５５０ｂｐのｃＤＮＡ部分遺伝子を獲得した（図８）。サイズマーカーには100bp DNAラダーワン（ナカライテスク社製）を使用した。この断片を上記のとおりpCR2.1-TOPOへ導入し、HB101 Competent cellsを形質転換し、プラスミド取得後に当該部分遺伝子の塩基配列を解読した。塩基配列決定はタカラバイオ株式会社に依頼した。塩基配列の解析は遺伝子解析ソフトGENETYX（Software Development）を用いて行った。当該部分ｃＤＮＡのシーケンス結果を図９に示す。その塩基配列は配列番号１３に、それから得られる部分遺伝子のアミノ酸配列は配列番号１４に示される。このアミノ酸配列は、ガラクチュロン酸還元酵素のアミノ酸配列２７６番目のグリシンからＣ末端までに該当する。
【００４９】
５．カセットＰＣＲ法による５´領域ゲノムＤＮＡのクローニング及び塩基配列解析
５−１．ゲノムＤＮＡの調製
菌体は、上記４−１．酵素活性のタイムコースの項に準じて培養した。ただし、培養時間は菌体量の多い２日目のものを用いた。その培養菌体を遠心分離(10000rpm、１０分間)で集菌し、乳鉢に液体窒素を注いで乳鉢を十分に冷やした後に集菌した菌体を入れ、乳棒ですりつぶした。ゲノム抽出はDNeasy Plant Maxi Kit（QIAGEN社製）を用いて行った。方法は付属説明書に従った。
【００５０】
５−２．鋳型の調製
上記で調製したゲノムＤＮＡを各種制限酵素（EcoR I、Hind III、Pst I、Sal I、Xba I （TOYOBO社製）：２０Ｕ）で、３７℃、３時間の酵素処理を行った。制限酵素を熱失活させた後、PCR in vitro Cloning Kit（タカラバイオ社製）に添付の各種カセットとライゲーションを行い、カセットＰＣＲの鋳型を調製した。詳細な方法は説明書に従った。
【００５１】
５−３．ＰＣＲ法
３´側には上記４.3'-RACE法で得られたｃＤＮＡ塩基配列を基に作製したプライマーgar cas-1、gal cas-2を、５´側には各種カセット部分と相補するcassette c1、cassette c2を用いた（表１１）。調製した各種カセットＤＮＡを鋳型としnested PCRを行った。ＰＣＲ反応液組成および条件は表１２に示した。
【００５２】
【表１１】
【００５３】
【表１２】
【００５４】
５−４．ＤＮＡシーケンス
上記４−５．TOPO TAクローニングベクターへのライゲーションおよび形質転換の項に記載の方法に準じて行った。
【００５５】
５−５．結果
上記４−６．の結果を基に作製したプライマーと、鋳型としてカセット付ゲノムを用いて、カセットＰＣＲ法により、５´領域ゲノムＤＮＡ断片の獲得を試みた。鋳型にSalＩcassetteを用いた場合に、約１.４ｋｂｐのＤＮＡ断片を獲得した（図１０) 。この断片を精製し、pCR2.1-TOPOへ導入し、HB101 Competent cellsを形質転換した。プラスミド取得後塩基配列を解読した。シーケンス結果を図１１及び配列番号１９に示す。
【００５６】
６．ｃＤＮＡ及び遺伝子全長の塩基配列解析
上記3'-RACE法とカセットＰＣＲ法から決定したＤＮＡ配列情報を基に、ｃＤＮＡ及び遺伝子全長の塩基配列解析を行った。獲得した塩基配列とそれをアミノ酸情報にした配列を、それぞれBLAST検索した。その結果、塩基配列は相同性のあるものを見つけることはできなかったが、アミノ酸配列はCryptococcus neoformansをはじめとする生物の様々な酸化還元酵素、A. nigerや P. tritici-repentis、H. jecorinaのガラクチュロン酸還元酵素と５４〜６４%の高い相同性を示した。このことから全アミノ酸配列も、カビのガラクチュロン酸還元酵素と高い相同性を示すことが予想された。また、カセットＰＣＲ法によって５´領域ゲノムＤＮＡの塩基配列が取得された。ガラクチュロン酸還元酵素の分子量４５ｋＤａから考えると、Cdgar1の開始コドンまでの塩基配列情報を獲得できていると考えられた。また、５´領域ゲノムＤＮＡの塩基配列情報からGT-AGルールに則ってイントロン予測、アミノ酸配列情報の相同性検索を行った結果、アミノ酸配列情報とイントロンを予測できた。また、Ｎ末端アミノ酸をコードする塩基配列情報の予測もできた。これらの情報と3'-RACE法で獲得した情報を元に作製したプライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型としてCdgar1全長を取得した。また、前記プライマーを用いてＰＣＲ法によりATGから終止コドン部まで増幅した上で、ｃＤＮＡの５´上流領域（１３５塩基）を決定し全遺伝子全長の塩基配列を決定した。
【００５７】
６−１．ＰＣＲ法
カセットＰＣＲ法で決定した塩基配列をアミノ酸情報に変換後BLASTにて相同性検索し、Ｎ末端アミノ酸配列推定、そこからＮ末端プライマーを作製した。Ｃ末端プライマーは3'-RACE法で得られた塩基配列を元に作製した。４−３．の項で調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。また、５−１．の項で調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。各ＰＣＲにおいてプライマーには表１３に示すプライマーを、ＰＣＲにはPhusion DNA ポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ反応液組成および条件は表１４に示した。なお、ゲノムＤＮＡの場合はｃＤＮＡ代わりにゲノムＤＮＡ（０.１μg／μｌ）を使用した。
【表１３】
【表１４】
【００５８】
６−２．ＤＮＡシーケンス
上記４−５．TOPO TAクローニングベクターへのライゲーションおよび形質転換の項に記載の方法と同様にして行った。
【００５９】
６−３．配列決定
上記ＤＮＡシーケンスの結果から、Cryptococcus diffluens FC11株から得られるガラクチュロン酸還元酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列が決定され、それらは図１２及び配列番号２で示された。また、Ｄ−ガラクチュロン酸還元酵素（CdGar1）をコードするｃＤＮＡ塩基配列（CdGar1）は図１３及び配列番号１で示されると共にＤ−ガラクチュロン酸還元酵素（CdGar1）のアミノ酸配列は図１４及び配列番号２２で示される。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によると新規なガラクチュロン酸還元酵素の量産が容易になる。この酵素を利用することにより、ペクチンの有効利用を促進することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンは野菜や果実に多く含まれているが、その再利用に関して、例えばりんご搾汁残渣に含まれるペクチンは、その約７０％が農作物の肥料、家畜の飼料、増粘多糖類、ゲル化剤、乳タンパク安定剤などの食品添加物に再利用されるにすぎず、残る約３０％のペクチンが廃棄されているとの報告がある。また、ペクチンはりんご以外の果物、特に柑橘類の搾汁残渣にも多く含まれるが、その再利用率はりんごの場合よりもさらに低いといわれている。このようにペクチンの再利用は肥料等の安価な利用かつ食品産業など限られた産業における利用にとどまっており、ペクチンを幅広い産業でバイオマス資源として再利用することは天然資源の確保の面からも、ごみ処理という環境浄化の面からも注目に値する。
【０００３】
ペクチンは植物細胞壁・特に果実の細胞壁に多く含まれる非セルロース性多糖であり、ホモガラクツロナン、ラムノガラクツロナン−I、ラムノガラクツロナン−IIという３つの特徴的な構造ドメインから形成される複合多糖である。このうち、ホモガラクツロナンはペクチンの主要構成糖として知られており、ペクチンの約７０%を占める。ホモガラクツロナンの中でもっとも一般的な構造はガラクチュロン酸のみがα−１,４−結合したポリガラクチュロン酸であり、一部のガラクチュロン酸にはそのカルボキシル基がメチルエステル化されたものやその水酸基がアセチル化されたものが存在している。
【０００４】
ポリガラクチュロン酸は様々な微生物によって分解される。例えば、植物寄生性を示すバクテリア、例えば一部の糸状菌は、ガラクチュロン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸にまで代謝する。この代謝は、真性細菌によく見られる代謝系であるエントナードウトロフ（ＥＤ）経路を利用することによって行われている。また、Kluyveromyces属酵母など、酵母においても、ポリガラクチュロン酸のグルコシド結合を加水分解するポリガラクチュロン酸分解酵素（ポリガラクチュロナーゼ）を生産する種はいくつか知られている（例えば非特許文献１や２参照）。
【０００５】
しかしながら、ガラクチュロン酸をピルビン酸とグリセルアルデヒド３リン酸にまで代謝するＥＤ経路は真核生物では確認されておらず、酵母ではポリガラクチュロン酸から分解されたガラクチュロン酸を利用することはできないと考えられていた。事実、Kluyveromyces属酵母をはじめとしたポリガラクチュロナーゼ生産酵母において、ポリガラクチュロナーゼ分解産物であるガラクチュロン酸が資化されたという報告例はない。そして、ガラクチュロン酸を資化する酵母を利用することができれば、ペクチンの再資源化においても有効な手段を与えると考えられる。
【０００６】
ガラクチュロン酸を還元する酵素として、これまでのところカビの一種であるHypocreajecorina株から得られたＬ−ガラクチュロン酸脱水素酵素が報告されているが（非特許文献３）、酵母を起源とするものは知られていない。しかも、低温においても活性を維持するものは知られていない。
【０００７】
一方、近年では、食品の熟成等に用いられている低温機能性酵素への期待が高まっており、その低温適応性微生物が着目されている。
【０００８】
このような状況下において、本願発明者らは、タイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から、低温適応酵母であるCryptococcus diffluens FC11株を分離し、当該酵母株から１０〜３０℃の低温においても比較的高い活性を示すＤ−ガラクチュロン酸還元酵素を見いだした（非特許文献４、５）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hirose, N., Kishida, K., Kawasaki, H. and Sakai, T. (1999) Purification and characterization of an endo-polygalacturonase from a mutant of Saccharomyces cerevisiae., Bioscience Biotechnology and Biochemistry vol.63, 1100-1103
【非特許文献２】Sienkstele, R., Bartkeviciute, D. and Sasnauskas K. (1999) Cloning,targeted disruption and heterologous expression of the Kluyveromyces marxianus endo-polygalacturonase gene (EPG1). Yeast vol.15, 311-322
【非特許文献３】Kuorelahti, S., Kalkkinen, N., Penttila, M., Londesborough, J., Richard, P., Identification in the mold Hypocrea jecorina of the first fungal D-galacturonic acid reductase, Biochemistry vol. 44: 11234-11240 (2005)
【非特許文献４】Kishida M., Seike Y., Kawasaki H. (2009) Identification and characterization of psychrophilic yeast newly isolated from fermentative source (Loog-pang) of traditional drink in Thailand. Biocontrol Science Vol.14, p119-122.
【非特許文献５】岸田正夫ら、「低温適応酵母が生産するＤ−ガラクチュロン酸還元酵素」 第６０回日本生物工学回大会 講演要旨集、ｐ１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記Ｄ−ガラクチュロン酸還元酵素のアミノ酸配列を解析するとともにそれをコードする遺伝子を見いだし、工業的な生産を可能とすべく当該酵素をコードするｃＤＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｄ−ガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、低温でも高活性を示すＤ−ガラクチュロン酸還元酵素をコードする遺伝子が提供される。これにより当該酵素の工業的生産が可能となり、当該酵素を有効利用しうる新規な用途が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はガラクチュロン酸還元酵素の活性測定方法を示す図である。
【図２】図２はDEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムである。
【図３】図３はRed-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムである。
【図４】図４はMono Q カラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムである。
【図５】図５は各精製段階における酵素液の電気泳動画像である。
【図６】図６はゲルより抽出したペプチド断片のＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図７】図７はTOPO TAクローニングベクターpCR2.1-TOPOの遺伝子地図である。
【図８】図８は3'-RACE法により得られた約５５０ｂｐのｃＤＮＡ部分遺伝子の泳動画像である。
【図９】図９は3'-RACE法により得られた約５５０ｂｐのｃＤＮＡ部分遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図１０】図１０はカセットＰＣＲ法により得られた５´領域ゲノムＤＮＡ断片の電気泳動画像である。
【図１１】図１１はカセットＰＣＲ法により得られた５´領域ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を示す図である。
【図１２】図１２は決定されたＤ−ガラクチュロン産還元酵素の全遺伝子の塩基配列を示す図である。
【図１３】図１３は決定されたＤ−ガラクチュロン産還元酵素をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図１４】図１４は決定されたＤ−ガラクチュロン産還元酵素のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の遺伝子がコードするＤ−ガラクチュロン酸還元酵素は、上記のようにタイ地酒オウ（Ou）の酒もと（Cocha）から分離された低温適応酵母であるCryptococcus diffluens FC11株（寄託番号：NITE P-611、寄託日：平成２０年７月１８日）から取得される。当該酵素はＤ−ガラクチュロン酸を還元してＬ−ガラクトン酸を生成する。当該酵素は特願２００８−２８５９７６号に開示されており、その記載が本願において援用される。その酵素の特徴として、特に１０〜３０℃の低温においても、至適温度における活性の６０％程度の活性効率で反応を行わせることができ、室温条件でもガラクチュロン酸をＬ−ガラクトン酸に変換できることが挙げられる。当該酵素は、以下の理化学的特徴を有する。
【００１５】
（１）温度安定性及びｐＨ安定性
２０〜４５℃及びｐＨ６.０〜８.４の環境下で安定である。
（２）至適温度及び至適ｐＨ
至適温度は４０℃付近、至適ｐＨは６.３付近である。
（３）基質特異性
ガラクチュロン酸、グルクロン酸に作用するが、ガラクトース、グルコース、マンノース、ソルビトール、グルコン酸には作用しない。
（４）金属による影響
各１ｍＭのＣｕ2+、Ｆｅ2+、Ｐｂ2+によって阻害を受けるが、各１ｍＭのＭｇ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｎａ+、Ｃａ2+、Ｎｉ2+、Ｋ+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+によって阻害を受けない。
（５）電子供与体
ＮＡＤＰＨ特異的である
【００１６】
本発明に係る遺伝子は、上記ガラクチュロン酸還元酵素をコードするｃＤＮＡであって、配列番号１に示された塩基配列を有する。本発明においては、上記ガラクチュロン酸還元酵素を生産できる限りにおいて、配列番号１に示される塩基配列から、１〜数十個の塩基が欠失・置換・挿入された塩基配列からなるか、相同性が８０％以上、好ましくは９０%以上、望ましくは９５％以上である塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
【００１７】
本発明に係る遺伝子は下記実施例において説明した方法により取得されるが、一般の遺伝子工学的手法により合成することもできる。また、本発明の遺伝子は、一般的な遺伝子工学的手法によって、その５´末端側にプロモータ領域、３´末端側にターミネータ領域などタンパク質発現のために必要な領域が結合された上で発現ベクターに組み込まれ、その後大腸菌など適当な宿主を形質転換して目的とする酵素の生産に利用される。
【実施例１】
【００１８】
次に、本発明の遺伝子について下記の実施例に基づいて詳細に説明する。
〔ガラクチュロン酸還元酵素遺伝子のクローニング〕
１．菌の培養
単離された C. diffluens OPU-FC11株を使用した。種培養にはＧＹＰ培地（Yeast extract１％、Peptone１％、Glucose１％、ｐＨ５.０）、本培養にはガラクチュロン酸培地（Yeast extract１％、Peptone１％、D-Galacturonic acid (GalA)０.２％、ｐＨ５.０）を用いた。ＧＹＰ培地を入れた短試験管に、菌を１白金耳植菌し、３０℃１日間振盪培養した。その培養液を更に、種培養培地９本に５０ｍｌずつ植菌し、３０℃で１日間振盪培養した。その培養液を５００ｍｌ容坂口フラスコに２００ｍｌのガラクチュロン酸培地を入れた本培養培地２０本に２ｍｌずつ植菌し、計４Ｌを３０℃で２日間振盪培養した。
【００１９】
２．ガラクチュロン酸還元酵素の精製
２−１．粗酵素液の調整
培養菌体を遠心分離（10000rpm、１０分)で集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下「ＫＰＢ」という）（ｐＨ７.０）で洗菌後、同緩衝液で懸濁した。懸濁菌体はOHTAKE WORKSのFRENCH PRESSを用いて１５００ｋｇ／ｃｍ２で１回破砕を行った。破砕した菌体を遠心分離（10000rpm、１０分）により、上清画分と沈殿（細胞残渣）画分に分離した。上清画分を１０ｍＭＫＰＢで十分に透析したものを粗酵素として用いた。
【００２０】
２−２．酵素の精製
得られた粗酵素をDEAE-Toyopearlによるカラムクロマトグラフィーにて精製した。４℃下にて、酵素液を２０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で平衡化したDEAE-Toyopearl (東ソー社;φ３×１５ｃｍ)に供し、ＮａＣｌ０〜０.５Ｍの直線濃度勾配法により溶出した。流速は１.０ｍｌ／ｍｉｎで行い、５ｍｌずつ分画を行った。その後、それぞれのフラクションのタンパク質量と活性を測定した。酵素活性は、Ｄ−ガラクチュロン酸の還元に伴うＮＡＤＰＨの酸化減少量を、ＮＡＤＰＨの特異吸収波長（ＯＤ３４０）の初速度変化を測定することによって求めた（図１）。DEAE-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを図２に示す。活性の強い４５〜６０本目のフラクションを回収した。
【００２１】
次に、DEAE-Toyopearl カラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を回収し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したRed-Toyopearl (東ソー社;φ２×４ｃｍ)に供し、ＮａＣｌ０〜０.６Ｍの直線濃度勾配法により溶出した。流速は１.０ｍｌ／ｍｉｎで行い、５ｍｌずつ分画を行った。その後、それぞれのフラクションのタンパク質量と活性を測定した。Red-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを図３に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで活性のあった各フラクションの精製純度を確認後、夾雑タンパクが少ない６１〜６９本目のフラクションを回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Current Protocols in Molecular Biology（WILEY INTERSCIENCE社製）に記載されている方法に従った。このとき使用されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの組成を表１に示す。分子量マーカーはXL-Lader Broad（APRO社製）が用いられた。酵素液とその１／３量のサンプルバッファー（表２）を混合し、１００℃、５分間熱処理して調製した試料を２０ｍＡで電気泳動後、クマシーブルー染色を行った。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
Red-Toyopearlカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を回収し、１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したMono Q HR 5/5パックカラム (Amersham Pharmacia Biotech社製)に供し、ＮａＣｌ〜０.４Ｍの直線濃度勾配法により溶出した。流速は１.０ｍｌ／ｍｉｎで行い、１ｍｌずつ分画を行った。その後、それぞれのフラクションのタンパク質量と活性を測定した。Mono Q カラムクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムを図４に示す。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりMono Qカラムクロマトグラフィー後の活性画分の精製純度を調べた。７９〜８６本目のフラクションに約４５ｋＤａの電気泳動的に単一のバンドを確認することができた。各精製段階の酵素液の泳動写真による画像を図５に示す。
【００２５】
３．内部アミノ酸配列の決定
３−１．プロテインシーケンサーによるＮ末端アミノ酸配列の解析
上記培養菌体を遠心分離 (10000rpm、１０分)で集菌し、回収した菌体を適量１.５ｍｌのエッペンチューブに入れ、ビーズ（直径０.１ｍｍ）１.０ｇと１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７.０）を１００μｌ加え、BIORUPTOR（コスモバイオ社製）を用いて、出力２５０Ｗ、インターバル３０秒の条件で２０分間超音波破砕を行った。その後、遠心分離（15000rpm、５分）し、上清を粗酵素液として回収した。
【００２６】
この粗酵素液３０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー染色後、酵素をHorizBLOT（ATTO社製）を用いてセミドライブロッティングを行い、PVDF膜に吸着させた。詳細な方法は説明書に従った。そして、プロテインシーケンサー PPSQ-33AでＮ末端アミノ酸配列解析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは上記２.酵素の精製の項に記載の方法に従った。
【００２７】
３−２．ＬＣ／ＩＴ／ＴＯＦ−ＭＳによるアミノ酸配列の解析
３−１．で得られた粗酵素液５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色（Silver Stain, Wako Pure Chemicals Co）を行った。次にバンドを切り出し、下記の脱色、脱水、還元アルキル化、トリプシン消化を行い、分析用試料を得た。トリプシンペプチドのアミノ酸配列は、エレクトロスプレイイオン化ソース（NanoFrontier L; Hitachi High-Technologies, Ltd, Tokyo）を備え付けたＬＣ／ＩＴ／ＴＯＦＭＳとＮＣＢＩデータベース（NCBInr 20080523） に接続したMascot serch software (http://www.matrixscience.com）によって分析した。
【００２８】
（脱色）
１．１００μｌの脱色液を切り出したゲルに加え２０分間室温で攪拌する。
２．１００μｌのMilliQ水を加え室温で１０分間攪拌する。
３．溶媒を除去し、ゲルが完全に除去されるまで１.及び２.の操作を３回繰り返す。
【００２９】
（脱水）
１.２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む５０％アセトニトリルを上記脱色後の残留物に加え５分間室温で攪拌する。
２．アセトニトリルを除去し、Speed Vacuumにより１０分間乾燥させる。
【００３０】
（還元アルキル化）
１．上記乾燥物に２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む１０ｍＭジチオトレイトールを１００μｌ加え、窒素雰囲気下において５６℃、６０分間攪拌する。
２．溶媒を除去し、１００μｌの２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを加え、室温にて１０分間攪拌する。
３．２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む５５ｍＭヨードアセトアミド１００μｌを加え、暗所室温にて４５分間攪拌する。
４．溶媒を除去し、２．の工程を繰り返し、溶媒を除去する。
【００３１】
（トリプシン消化）
１．上記で得られた試料に、２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを含む５０％アセトニトリルを加え、室温で１０分間攪拌する。
２．溶媒を除去し、１．の工程を繰り返し、溶媒を除去する。
３．Speed Vacuumにより１５分間乾燥させる。
４．５０μｌのトリプシンゴールド（Promega社製;１０μｇ／ｍｌ２５ｍＭの炭酸水素ナトリウム）を加え、３７℃で１晩インキュベートする。
５．他の試験管に４．のトリプシン溶液を移し、１００μｌの２５ｍＭの炭酸水素ナトリウムを加え、室温で１５分間攪拌する。
６．溶液を他の試験管に移し、５％のホルマリンを含む５０％アセトニトリルを加え、室温で３０分間攪拌する。
７．上記５．及び６．の工程を再度繰り返す。
８．全ての溶液を集め（２９０μＬ）、Speed Vacuumにより約２０μＬまで濃縮する。
９.濃縮液をCosmospin filter G（Nakalai tesque社製）に移し、５,０００rpm、３分間遠心分離する。
【００３２】
３−３．プロテインシーケンサーによる内部配列の解析
上記２．酵素の精製の項で得られた精製酵素３０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー染色後、目的の４５ｋＤａバンド部分を切り出し、島津テクノリサーチ社に委託解析した。そこでは切り出したバンドを還元アルキル化、Lysyl Endopeptidase処理後In-gel digestion法により抽出したペプチド断片をＨＰＬＣにおいて精製分取を行った。そして、分取したペプチド断片を、プロテインシーケンサー PPSQ-33Aでアミノ酸配列解析を行った。得られた配列情報はNCBI BLAST （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて検索した。得られた配列情報はNCBI BLAST （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を用いて検索した。
【００３３】
３−４．アミノ酸配列の決定
プロテインシーケンサーによるＮ末端アミノ酸配列の解析、ＬＣ／ＩＴ／ＴＯＦＭＳによるアミノ酸配列の解析では共にアミノ酸配列を決定することはできなかった。プロテインシーケンサーによる内部配列の解析で、決定することができた。ゲルより抽出したペプチド断片のＨＰＬＣの結果を図６に示す。これらの断片のうち、断片１、５、１０（Ｆｒ−１、５、１０) をプロテインシーケンサーPPSQ-33Aにてアミノ酸配列解析を行った。そのアミノ酸配列の結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
上記のように３つの断片のアミノ酸配列が決定された。得られたアミノ酸配列を、NCBI BLASTでデータベース (Non-redundant protein sequences) との相同性検索したところ、３つの断片のアミノ酸配列がそれぞれ、糸状菌Pyrenophora tritici-repentisのＤ−ガラクチュロン酸還元酵素 (ACCESSION : XP_001930351)の部分アミノ酸配列と８０％ほどの相同性を示した。よって得られたアミノ酸配列情報は正しいものであると考えられた。なお、断片Ｆｒ−１のＮ末端アミノ酸はGlu又はTyrの何れかであり、断片Ｆｒ−５のＮ末端アミノ酸はLys又はGlnの何れかであり、それに隣接するアミノ酸はGly又はHisの何れかであり、断片Ｆｒ−１０のＮ末端アミノ酸はGly又はHisの何れかであるが、いずれも確定できなかった。また、断片Ｆｒ−５の１０番目のアミノ酸も確定できなかった。
【００３５】
４．3'-RACE法によるｃＤＮＡ部分遺伝子のクローニングおよび塩基配列解析
４−１．酵素活性のタイムコース
ガラクチュロン酸還元酵素のｍＲＮＡを獲得するために、酵素活性の培養時間におけるタイムコースを測定した。上記２.１に示すガラクチュロン酸培地を１００ｍｌ入れた５００ｍｌ容坂口フラスコに、種培養したC. diffluens FC 11株を１ｍｌ植菌し、３０℃で振騰培養した。そして回収できる菌体量まで培養した後、タンパク量あたりのガラクチュロン酸還元酵素活性が次第に強くなっている培養時間を確認するまで、２時間ごとに菌体を回収し比活性を測定した。菌体は遠心分離（10000rpm、１０分間）で集菌し、上記３−１．プロテインシーケンサーによるＮ末端アミノ酸配列の解析の項に記載の方法で破砕し、酵素活性を測定した（結果は図示せず）。
【００３６】
４−２．C. diffluens FC 11株からのTotal ＲＮＡの抽出とｍＲＮＡの精製
菌体は、タンパク量あたりのガラクチュロン酸還元酵素活性が次第に強くなっている１１時間培養のものを使用した。培養菌体を遠心分離（10000 rpm、１０分間）で集菌し、その菌体を、１８０℃で乾熱滅菌したメタルコーンＭＣ−０２１２と共に破砕用チューブにいれ、液体窒素によって完全に凍結させた。その後、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて、1700rpm、２０秒の操作を１回行うことで破砕した。Total ＲＮＡ抽出はRNAqueous（AMBION社製）を用いて行った。方法は付属説明書に従った。混入したＤＮＡを完全に除去するためOligotexTM-dt30 mRNA Purification kit（タカラバイオ社製）を用い、説明書に従ってｍＲＮＡを精製した。
【００３７】
４−３．一本鎖ｃＤＮＡの合成
抽出したＲＮＡを用いて表４に示す試料を調製した。これを６５℃で５分間インキュベートし、氷冷後、表５に示すｃＤＮＡ合成反応液を調製した。３０℃で３０分間の前処理、続いて４２℃で６０分間反応し、９９℃で５分間処理して反応を停止させた後、氷冷した。
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
４−４．ＰＣＲ
５´側のプライマーには、タンパク質の内部アミノ酸配列（表３）から作製した混合プライマーを使用した（表６）。また、３´側はT20APプライマーに相補するAP1およびAP2-2プライマーを用いた（表７）。ＰＣＲの特異性を高める為に、内部配列情報を基にしてnested PCRを行った。ＰＣＲには、Blend Ta（TOYOBO社製）を使用した。反応液組成とＰＣＲ条件は表に示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【表８】
【００４３】
４−５．TOPO TAクローニングベクターへのライゲーションおよび形質転換
増幅したＰＣＲ産物をアガロース電気泳動に供した後、目的断片を切り出して、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス）を用いて精製した。精製後、TOPO TA cloning Kit（invitrogen社製）を用いてpCR2.1-TOPO（図７）へ導入した。ライゲーション条件はキット説明書に従った。ライゲーション後、大腸菌を形質転換して、生じた白コロニーからコロニーダイレクトＰＣＲ法（使用プライマー：Ｍ１３Forward、Ｍ１３Reverse）により、ＤＮＡ断片が挿入されているコロニーを選抜し、プラスミドを抽出した。獲得したプラスミドを鋳型としてＤＮＡシーケンスを行った。シーケンス時のプライマーは、Ｍ１３Forward、Ｍ１３Reverse（表９）を用いた。
【００４４】
【表９】
【００４５】
形質転換は次の方法に従った。ライゲーション後の反応液を用いてE. coli HB101の形質転換を行った。コンピテントセルはHB101 Competent cells（タカラバイオ社製）を使用した。コンピテントセル１０μｌとプラスミドＤＮＡをおだやかに混合し、２０分間氷中で放置した後、４２℃で４５秒間の熱ショックを与えた。氷冷後、ＬＢ液体培地（Yeast extract０.５％、Peptone１.０％、NaCl０.５％、ｐＨ７.０）を１００μｌ加え、３７℃で６０分間静置培養し、試料をＬＢＡプレート（ＬＢ液体培地に寒天１.５％を加え、１２０℃、２０分のオートクレーブを行った後、５０℃まで冷却し、アンピシリンを５０ｍｇ／ｍｌとなるように添加したもの）に塗布した後、３７℃で一晩静置培養した。
【００４６】
また、コロニーダイレクトＰＣＲは、生育したコロニーを鋳型としてＰＣＲを行って、ＤＮＡ断片が挿入されているコロニーを選抜した。反応液組成とＰＣＲ条件は表１０に示す。プライマーは目的とする遺伝子に適応したものを用いた。プラスミド抽出は、大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。菌体を回収後、アルカリＳＤＳ法により行った。
【００４７】
【表１０】
【００４８】
４−６．結果
FC11株のｍＲＮＡから合成した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とした3'-RACE法によって、約５５０ｂｐのｃＤＮＡ部分遺伝子を獲得した（図８）。サイズマーカーには100bp DNAラダーワン（ナカライテスク社製）を使用した。この断片を上記のとおりpCR2.1-TOPOへ導入し、HB101 Competent cellsを形質転換し、プラスミド取得後に当該部分遺伝子の塩基配列を解読した。塩基配列決定はタカラバイオ株式会社に依頼した。塩基配列の解析は遺伝子解析ソフトGENETYX（Software Development）を用いて行った。当該部分ｃＤＮＡのシーケンス結果を図９に示す。その塩基配列は配列番号１３に、それから得られる部分遺伝子のアミノ酸配列は配列番号１４に示される。このアミノ酸配列は、ガラクチュロン酸還元酵素のアミノ酸配列２７６番目のグリシンからＣ末端までに該当する。
【００４９】
５．カセットＰＣＲ法による５´領域ゲノムＤＮＡのクローニング及び塩基配列解析
５−１．ゲノムＤＮＡの調製
菌体は、上記４−１．酵素活性のタイムコースの項に準じて培養した。ただし、培養時間は菌体量の多い２日目のものを用いた。その培養菌体を遠心分離(10000rpm、１０分間)で集菌し、乳鉢に液体窒素を注いで乳鉢を十分に冷やした後に集菌した菌体を入れ、乳棒ですりつぶした。ゲノム抽出はDNeasy Plant Maxi Kit（QIAGEN社製）を用いて行った。方法は付属説明書に従った。
【００５０】
５−２．鋳型の調製
上記で調製したゲノムＤＮＡを各種制限酵素（EcoR I、Hind III、Pst I、Sal I、Xba I （TOYOBO社製）：２０Ｕ）で、３７℃、３時間の酵素処理を行った。制限酵素を熱失活させた後、PCR in vitro Cloning Kit（タカラバイオ社製）に添付の各種カセットとライゲーションを行い、カセットＰＣＲの鋳型を調製した。詳細な方法は説明書に従った。
【００５１】
５−３．ＰＣＲ法
３´側には上記４.3'-RACE法で得られたｃＤＮＡ塩基配列を基に作製したプライマーgar cas-1、gal cas-2を、５´側には各種カセット部分と相補するcassette c1、cassette c2を用いた（表１１）。調製した各種カセットＤＮＡを鋳型としnested PCRを行った。ＰＣＲ反応液組成および条件は表１２に示した。
【００５２】
【表１１】
【００５３】
【表１２】
【００５４】
５−４．ＤＮＡシーケンス
上記４−５．TOPO TAクローニングベクターへのライゲーションおよび形質転換の項に記載の方法に準じて行った。
【００５５】
５−５．結果
上記４−６．の結果を基に作製したプライマーと、鋳型としてカセット付ゲノムを用いて、カセットＰＣＲ法により、５´領域ゲノムＤＮＡ断片の獲得を試みた。鋳型にSalＩcassetteを用いた場合に、約１.４ｋｂｐのＤＮＡ断片を獲得した（図１０) 。この断片を精製し、pCR2.1-TOPOへ導入し、HB101 Competent cellsを形質転換した。プラスミド取得後塩基配列を解読した。シーケンス結果を図１１及び配列番号１９に示す。
【００５６】
６．ｃＤＮＡ及び遺伝子全長の塩基配列解析
上記3'-RACE法とカセットＰＣＲ法から決定したＤＮＡ配列情報を基に、ｃＤＮＡ及び遺伝子全長の塩基配列解析を行った。獲得した塩基配列とそれをアミノ酸情報にした配列を、それぞれBLAST検索した。その結果、塩基配列は相同性のあるものを見つけることはできなかったが、アミノ酸配列はCryptococcus neoformansをはじめとする生物の様々な酸化還元酵素、A. nigerや P. tritici-repentis、H. jecorinaのガラクチュロン酸還元酵素と５４〜６４%の高い相同性を示した。このことから全アミノ酸配列も、カビのガラクチュロン酸還元酵素と高い相同性を示すことが予想された。また、カセットＰＣＲ法によって５´領域ゲノムＤＮＡの塩基配列が取得された。ガラクチュロン酸還元酵素の分子量４５ｋＤａから考えると、Cdgar1の開始コドンまでの塩基配列情報を獲得できていると考えられた。また、５´領域ゲノムＤＮＡの塩基配列情報からGT-AGルールに則ってイントロン予測、アミノ酸配列情報の相同性検索を行った結果、アミノ酸配列情報とイントロンを予測できた。また、Ｎ末端アミノ酸をコードする塩基配列情報の予測もできた。これらの情報と3'-RACE法で獲得した情報を元に作製したプライマーを用いて、ｃＤＮＡを鋳型としてCdgar1全長を取得した。また、前記プライマーを用いてＰＣＲ法によりATGから終止コドン部まで増幅した上で、ｃＤＮＡの５´上流領域（１３５塩基）を決定し全遺伝子全長の塩基配列を決定した。
【００５７】
６−１．ＰＣＲ法
カセットＰＣＲ法で決定した塩基配列をアミノ酸情報に変換後BLASTにて相同性検索し、Ｎ末端アミノ酸配列推定、そこからＮ末端プライマーを作製した。Ｃ末端プライマーは3'-RACE法で得られた塩基配列を元に作製した。４−３．の項で調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。また、５−１．の項で調製したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行った。各ＰＣＲにおいてプライマーには表１３に示すプライマーを、ＰＣＲにはPhusion DNA ポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ反応液組成および条件は表１４に示した。なお、ゲノムＤＮＡの場合はｃＤＮＡ代わりにゲノムＤＮＡ（０.１μg／μｌ）を使用した。
【表１３】
【表１４】
【００５８】
６−２．ＤＮＡシーケンス
上記４−５．TOPO TAクローニングベクターへのライゲーションおよび形質転換の項に記載の方法と同様にして行った。
【００５９】
６−３．配列決定
上記ＤＮＡシーケンスの結果から、Cryptococcus diffluens FC11株から得られるガラクチュロン酸還元酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列が決定され、それらは図１２及び配列番号２で示された。また、Ｄ−ガラクチュロン酸還元酵素（CdGar1）をコードするｃＤＮＡ塩基配列（CdGar1）は図１３及び配列番号１で示されると共にＤ−ガラクチュロン酸還元酵素（CdGar1）のアミノ酸配列は図１４及び配列番号２２で示される。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によると新規なガラクチュロン酸還元酵素の量産が容易になる。この酵素を利用することにより、ペクチンの有効利用を促進することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１】
配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−２００２１２（Ｐ２０１１−２００２１２Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７３６９３（Ｐ２０１０−７３６９３）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【Ｆターム（参考）】
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