説明

ガラス化用具のシーリング方法

【課題】 生殖細胞を凍結し、保存容器への保存のための作業中にウイルスや雑菌で汚染されることを防止し、かつ、生殖細胞を直接液体窒素に接触させることなく、急速に冷却可能であり、かつ、凍結保存容器内にて安定した状態を保つことができるガラス化用具のシーリング方法を提供する。
【解決手段】 粘性が高く、毒性がない液体からなるシーリング剤を、生殖細胞を含む凍結液を収容した凍結容器先端部に吸着させた後、液体窒素へ浸漬することにより速やかにシーリング剤を凍結させることで、凍結容器先端部を密閉、シールすることを特徴とするガラス化用具のシーリング方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物の生殖細胞(精子、卵子又は受精卵を含めた胚など)を急速に凍結(ガラス化)し、保存する際に使用するガラス化用具のシーリング方法に関するものであり、このシーリング方法を用いると、生殖細胞を良好な生存状態で保存し、体外受精、胚移植、顕微受精や哺乳動物(ヒトを除く)のクローン作出に利することができる。
【背景技術】
【0002】
急速冷却方法として、高濃度の凍結液の中に胚を浸漬し、液体窒素に滴下して−370℃/秒以上の超急速で凍結保存を行う方法が知られている。この方法は凍結液が結晶構造をとらないため、氷晶による細胞傷害が起きないため、融解後の胚の生存性が高い。しかし、この方法は卵子又は胚を再現性よく回収することが困難であり、卵子又は胚の個別識別ができなくなるという不都合があった。
【0003】
また、急速冷却できる方法として、ストロー状のプラスチック製の凍結容器を引き延ばして極細にして急速冷却できるようにしたものの中に卵子又は胚を含む凍結液を吸い上げ、これを液体窒素に浸漬してガラス化する方法(オープン・プルド・ストロー(OPS)法)が採用されてきた。しかし、この方法では、吸入液量が一定しないので、卵子又は胚を安定的にガラス化することは困難であった。
【0004】
さらに、特許文献1には、筒状の極細管部と、該極細部に続く、吸引及び吐出用器具に装填するための連結部とを含み、前記極細管部の長手方向に対する垂直断面の内空部分において対向する2点間の最短距離が、卵子又は胚の最小外径の2倍よりも短く、且つ卵子又は胚の最大径よりも長いため、当該極細管部の中に入った卵子又は胚が、極細管部の長手方向に対する垂直面上に2個以上並存しえないようにした卵子又は胚のガラス化用具及びガラス化方法、が記載されている。しかし、この方法においては、作業中あるいは保管中にウイルスや雑菌等が進入して、ガラス化用具内を汚染するおそれがあった。
【特許文献1】特開2001−252293号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、生殖細胞を凍結し、保存容器への保存のための作業中にウイルスや雑菌で汚染されることを防止し、かつ、生殖細胞を直接液体窒素に接触させることなく、急速に冷却可能であり、かつ、凍結保存容器内にて安定した状態を保つことができるガラス化用具のシーリング方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記課題を解決するための本発明は、粘性が高く、毒性がない液体からなるシーリング剤を、生殖細胞を含む凍結液を収容した凍結容器先端部に吸着させた後、液体窒素へ浸漬することにより速やかにシーリング剤を凍結させることで、凍結容器先端部を密閉、シールすることを特徴とするガラス化用具のシーリング方法である。そして、シーリング剤としては、グリセリンを用いることが好ましい。また、凍結容器先端部に吸着させるシーリング剤の吸着量が1〜3μlであることが好ましい。特に、精子の凍結に応用する場合には、凍結容器先端部において、凍結液とシーリング剤との間に空気層を設けることが望ましい。また、凍結保存後において、凍結容器先端部に吸着させ凍結させたシーリング剤を融解液中で速やかに融解、拡散、除去することが好ましい。
【発明の効果】
【0007】
本発明は、前記のように構成されているので、生殖細胞を凍結し、保存容器への保存のための作業中にウイルスや雑菌で汚染されることを防止し、かつ、生殖細胞を直接液体窒素に接触させることなく、急速に冷却可能であり、かつ、凍結保存容器内にて安定した状態を保つことができる。また、特に卵子又は受精卵を含めた胚の凍結ではシーリングしない超高速ガラス化法と同様の高い生存率が得られる。また、シーリング剤を少し冷却すると、粘性を高めることができるので、凍結容器先端部に吸着させることが容易になる。また、凍結容器先端部内において、凍結液とシーリング剤との間に空気層を設けるとシーリング剤と凍結液との接触を完全に防ぐことができて、特に精子の凍結保存には適している。また、融解時において、シーリング剤を容易に除去することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0008】
以下本発明を詳細に説明する。そして以下の説明では、主に生殖細胞として胚を用いた場合について説明する。
本発明で用いるガラス化用具の例を図1に示す。図1において、例えば、ガラス化用具1は、凍結容器2、凍結容器2の先端部を保護するための保護部材3、凍結容器2の後端部を封止するための封止部材4で構成されている。凍結容器2は、胚を保存するための細径部21、本体部22、及び後端部23により構成されており、細径部21は本体部22より細径になっている。
【0009】
胚を凍結容器2に装入するには図3に示すように、胚採取用の吸引具5を用いて、胚を含む凍結液を吸引して凍結容器2の細径部21内に胚を採取する。細径部21内に胚を採取したら、図4のAに示すように凍結容器2の先端部にシーリング剤6を吸着させる。細径部21の先端部にシーリング剤6を吸着させた後、図4のBに示すようにシーリング剤が吸着した細径部21の先端部を−196℃の液体窒素に浸漬して、速やかにシーリング剤を凍結させて、凍結容器先端部をシールするとともに胚を凍結する。そして、図6に示すように凍結容器2から胚採取用の吸引具5を外して、凍結容器2の後端部23に封止部材4を挿入して凍結容器2を封止して液体窒素に浸漬する。その後、図7に示すように、凍結容器2の細径部21を保護部材3に挿入した後、急速冷凍ボックス7内の液体窒素に浸漬し、その後、急速冷凍ボックス内7から凍結保存容器内に移して−196℃で保存する。保護部材3の一端は封止されていて、他端は開口していて、この開口へ凍結容器2の細径部21を挿入して収納し、細径部21を保護する。なお、凍結容器2の後端部23に封止部材4を装入して凍結容器2を封止する作業及び凍結容器2の細径部21を保護部材3に挿入する作業は、急速冷凍ボックス7の液体窒素上の窒素ガス中で行うと容易になる。
【0010】
本発明のガラス化用具のシーリング方法を用いた、胚の凍結保存方法は、上述したようにガラス化用具1を用い、凍結用の胚を準備する工程と、凍結容器2の細径部21内に胚を凍結液とともに採取する採取工程と、胚が装入された凍結容器2の細径部21の先端部にシーリング剤を吸着させ、シーリング剤を凍結させてシールするとともに胚を凍結する凍結工程と、凍結容器2の他端側を封止部材4で封止する封止工程と、封止された凍結容器2に保護部材3を取り付ける保護部材取付工程と、保護部材3が取り付けられた凍結容器2を急速冷凍ボックス7に浸漬する浸漬工程を含んでいる。そして、前記のようにして胚が装入されたガラス化用具は、凍結保存容器内で胚が必要とされるときまで、凍結保存される。
【0011】
融解時には、上述したガラス化用具1を凍結保存容器内から急速冷凍ボックス内7に移す。最初に、保護部材3から凍結容器2を取り出し、窒素ガス中で封止部材4を凍結容器2の後端部23から引き抜くことにより後端部23を開口させる。次に、シャーレの上の37℃に加温した0.25Mスクロース液0.5mlのドロップへ、シーリング剤が付着した凍結容器2の細径部21の先端部を浸漬し、融解液中で細径部21の先端部を揺り動かす。この作業で、シーリング剤はすみやかに融解液に溶解して、細径部21の先端部から拡散、遊離することによって、凍結容器細径部21の先端部の密閉が解除される。次に、液体窒素と接触したシーリング剤からのウイルスや細菌汚染を極力避けるために、別に用意した0.25Mスクロース液1mlのドロップへ凍結容器細径部21の先端部を移し、凍結容器2の後端部23の開口部を指で塞ぐことにより、窒素ガスの圧力で細径部21の先端部に存在する胚は融解液中へ移動する。
【0012】
それから、0.25Mスクロース液中で1分間保持し、次に、0.13Mスクロース液の1mlへ胚を移し、5分間浸漬後、培養液へ移しかえ、さらに5分間浸漬する。この一連の作業は37℃に加温して行うことによって、胚から凍結液は完全に除去される。
【0013】
本発明のガラス化用具のシーリング方法を用いた胚の融解方法は、上述したガラス化用具1を用いる。この場合の胚の融解方法は、保護部材3から凍結容器2を取り出し、窒素ガス中で封止部材4を凍結容器2の後端部23から引き抜くことにより後端部23を開口させる工程、シャーレの上の37℃に加温した融解液へシーリングが付着した凍結容器2の細径部21の先端部を浸漬し、融解液中で細径部21の先端部を揺り動かし、シーリング剤を取り除き、凍結容器細径部21の先端部の密閉を解除させる工程、別に用意した融解液へ凍結容器の細径部21の先端部を移し、凍結容器2の後端部23の開口部を指で塞ぐことによって、細径部21の先端部にある胚を融解液中へ取り出す工程を含んでいる。そして、胚を一連の融解液へ移しかえることによって、胚の凍結液は希釈除去され、培養によって発育を進めることや、移植によって受胎することが可能になる。
【0014】
凍結容器先端部に吸着させるシーリング剤としては、グリセリン、糖液シロップ(高濃度のブドウ糖液)、60%シロップの乳酸ナトリウム等が挙げられるが、グリセリンを用いることが好ましい。シーリング剤の吸着量としては1〜3μlであることが好ましく、特に1.0〜2μlであることがより好ましい。
【0015】
また、ここで用いる胚としてはヒト、マウス、ウシ、ヒツジ、ウサギ等の胚が挙げられる。採取用の胚を準備する工程において、平衡液としては10%エチレングリコール(EG)と10%ジメチルスルフォキサイド(DMSO)を添加した20%代用血清を含む修正ヒト卵管合成培地(m−HTF)、10%EGと10%DMSOを添加した20%子牛血清を含むダルベッコリン酸緩衝液(PBS)、10%EGと10%DMSOを添加した20%子牛血清を含む組織培養199液(TCM199)等が挙げられるが、10%EGと10%DMSOを添加した20%代用血清を含むm−HTFが好ましい。凍結液としては20%EG、20%DMSOと0.6Mスクロースを添加した20%代用血清を含むm−HTF、20%EGと20%DMSO、0.6Mスクロースを添加した20%子牛血清を含むPBS液、20%EG、20%DMSOと0.6Mスクロースを添加した20%子牛血清を含むTCM199液等が挙げられるが、20%EGと20%DMSOと0.6Mスクロースを添加した20%代用血清を含むm−HTFが望ましい。
【0016】
特に、本発明のガラス化用具のシーリング方法によれば、胚が装入された凍結容器2の細径部21の先端部がシールされ、本体部22において凍結容器の他端側も封止されるので、ウイルスや雑菌で胚が汚染されるのを防止できる。また、特に、生殖細胞が精子の場合、凍結保存のためには、図5に示すように、最後の凍結液を吸引した後に少量(0.1〜0.3μl)の空気を吸って、凍結液とシーリング剤との間に空気層を設けると凍結液とシーリング剤との接触を完全に防ぐことができて、汚染を完全に防止できる。
【0017】
本発明で用いるガラス化用具1において凍結容器2は、全長45〜60mmが好ましく、特に、45〜55mmが好ましい。細径部21の長さは10〜20mmが好ましく、特に、10〜15mmが好ましい。細径部21の内径は、100〜350μmが好ましく、特に150〜300μmが好ましい。細径部21の肉厚は50〜150μmが好ましく、特に90〜100μmが好ましい。本体部22の長さは30〜50mmが好ましく、特に35〜45mmが好ましい。本体部22の内径は2〜3mmが好ましく、特に2.1〜2.8mmが好ましい。また、本体部22の肉厚は300〜600μmであることが好ましく、特に400〜600μmが好ましい。また、細径部21の肉厚は、本体部22の肉厚より薄いことが好ましく、本体部22と細径部21との間の切込部は、外径および肉厚の移行領域を形成している。具体的には、切込部において、外径及び内径は細径部21側に向かって縮径する。
【0018】
また、凍結容器2の後端部23を封止するための封止部材4は、全長が40〜60mm好ましく、特に45〜55mmが好適である。その外径は凍結容器2の本体部22の内径に合致するように作製される。そして、その材質はポリエチレン等のプラスチック素材等が用いられる。
【0019】
保護部材3は、筒状になっていて、その一端は封止されている。保護部材3の他端は開口していて、凍結容器2の細径部21を挿入して収納するためのものであり、その内径は切込部と嵌合するようになっている。その長さは凍結容器2の切込部から先端部までを挿入できるようになっている。この、保護部材3は、凍結液とともに胚を採取した凍結容器2を、胚の冷却を阻害することなく保護するものである。凍結容器2の細径部21の先端は保護部材3の底面に当接しないようになっている。保護部材3の材質は、破損の可能性が低い、例えば、ポリエチレン等のプラスチック素材等が用いられる。通常は、保護部材3は胚とは別に液体窒素で冷却され、−150℃に冷却された状態で凍結容器2をカバーする。さらに、融解時も、液体窒素−196℃に保存された保護部材3は凍結容器2から外される。従って、迅速な冷却加温は重要ではなく、破損しにくく、透明であればよい。
【実施例】
【0020】
次に本発明の一実施の形態を挙げて、本発明を具体的に説明する。
(凍結のプロセス)
1.凍結用の胚を準備する工程
(1)あらかじめ、恒温槽内でm−HTF(修正ヒト合成卵管液)と平衡液(10%EGと10%DMSOを添加した20%代用血清を含むm−HTF)と凍結液(20%EGと20%DMSOと0.6Mスクロースを添加した20%代用血清を含むm−HTF)を37℃になるように温めておく。一方、シーリング剤は4℃で冷蔵保存しておく。
(2)37℃にセットしたウォーマーの上に置いた60mmシャーレ上に、m−HTFを滴下して、100μlのm−HTFのドロップを3つ作り、ミネラルオイルでカバーする。
(3)平衡液の準備
37℃にセットしたウォーマーの上に置いた60mmシャーレ上に、平衡液を滴下して、50μlの平衡液のドロップを3つ作る。
(4)ウォーマーを使わず、室温で60mmシャーレ上に、シーリング剤を滴下して、300μlのシーリング剤のドロップを1つ作る。
(5)パスツールピペットの先端に胚を採取し、前記(2)で準備したm−HTFのドロップで胚を洗ってから、胚を前記(3)で準備した平衡液のドロップの中に入れる(図2のA)。
(6)タイマーをスタートさせ、順に3つの平衡液のドロップへ胚を移動させながら、胚を平衡化する(図2のB)。
(7)凍結液の準備
前記(6)で用いたシャーレ上の3つの平衡液のドロップと平行して、凍結液を滴下して、7μlの凍結液のドロップを2つ、1〜2μlの凍結液のドロップを1つ作る(図2のC)。
(8)タイマーが1分30秒になったら平衡液ドロップから胚をパスツールピペットで吸引し、2分で凍結液に移す(図2のD)。
(9)パスツールピペットで胚を順に7μlの凍結液のドロップに移動させ、3回目に1〜2μlの凍結液のドロップに入れる(図2のD)。
【0021】
2.凍結容器への胚採取工程
(1)一連のガラス化用具のうちストロー(保護部材3)だけ前もって−196℃の液体窒素に入れて冷却しておく。NKチップ(凍結容器2)に0.5〜10μlの可変吸引ピペット(胚採取用の吸引具)を装着しておく。なお、ピペットの容量は0.6μlにセットする。
(2)吸引ピペットでNKチップに胚を含有する凍結液を吸引する(図3)。最後の凍結液を吸引した後に少量(0.1〜0.3μl)の空気を吸って、凍結液とシーリング剤との間に空気層を設けると凍結液とシーリング剤との接触を完全に防ぐことができる。
【0022】
3.シール工程
(1)タイマーが2分28秒になったら、NKチップの先端をシーリング剤に瞬時に漬けて、NKチップの先端のシーリング剤を吸着させて、先端を封じる(図4のA)。
(2)タイマーが2分30秒になったら、NKチップの先端部を−196℃の液体窒素に浸漬し、シーリング剤を凍結すると共に胚を凍結させる(図4のB)。
【0023】
(融解のプロセス)
(1)37℃にセットしたウォーマーに置いた60mmシャーレの中に、0.25Mスクロース液を滴下して、500μlのドロップを2つ作り、ウォーマーを設置した顕微鏡のレンズの下に置く。
(2)0.13Mスクロース液1,000μlを37℃にセットしたウォーマー上に置いた4wellプレートの1箇所に入れる。
(3)m−HTF1,000μlを同じ4−wellプレートの他の1箇所に入れる。
(4)一連の胚ガラス化用具を液体窒素から取り出してNKチップからストロー、次にスティックを外す。
(5)すばやく前記(1)の0.25Mスクロース液のドロップの一方にNKチップの先端を漬け、先端部を揺り動かしてシーリング剤を溶かして洗い落とし、すぐに他方のドロップにNKチップの先端部を漬け、後端を指で塞ぎ、強く押す(図8)。
液体窒素から取り出したNKチップは、5秒後に指で塞ぐと泡が少なくなる。タイマーは泡を出してからスタートさせる。なお、オートピペットで押し出してもよい。
泡が出たら胚はシャーレに移行している。このとき泡は1〜2個が望ましく、多数作らない。泡に胚が付いている場合があるので、ピペットで泡を押さえたり、泡を動かして探す。
(6)1分後、胚を0.25Mスクロース液から0.13Mスクロース液に移動させる。
(7)5分後(タイマー作動開始から6分後)、胚を0.13Mスクロース液からm−HTFに移動させる。
(8)5分後(タイマー作動開始から11分後)、胚をm−HTF(修正ヒト卵管合成液)やアルファーMEM(最小必須培地)等の媒液に移しかえて培養する。
なお、これらは一般的な実験例であり、実験の環境や諸条件によって、経過が変わってくるので、適宜操作を変える必要がある。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】本発明で用いる胚のガラス化用具の例を示す概略側面図である。
【図2】図2のA〜Dは、凍結するための胚を準備する工程を示す図である。
【図3】凍結容器内に胚を凍結液とともに採取する工程を示す図である。
【図4】図4のA,Bは、胚を採取した凍結容器の細径部内の胚を凍結すると共に先端部を凍結シールする工程を示す図である。
【図5】凍結容器に胚を採取し、シーリング液を吸着させる際の1実施態様を示す図である。
【図6】凍結容器の後端部を封止する工程を示す図である。
【図7】保護部材が取り付けられた凍結容器を液体窒素容器内に浸漬する工程を示す図である。
【図8】凍結容器から胚を取り出す様子を示す図である。
【符号の説明】
【0025】
1 ガラス化用具
2 凍結容器
3 保護部材
4 封止部材
5 吸引具
6 シーリング剤
7 急速冷凍ボックス

【特許請求の範囲】
【請求項1】
粘性が高く、毒性がない液体からなるシーリング剤を、生殖細胞を含む凍結液を収容した凍結容器先端部に吸着させた後、液体窒素へ浸漬することにより速やかにシーリング剤を凍結させることで、凍結容器先端部を密閉、シールすることを特徴とするガラス化用具のシーリング方法。
【請求項2】
シーリング剤が、グリセリンであることを特徴とする請求項1記載のガラス化用具のシーリング方法。
【請求項3】
凍結容器先端部に吸着させるシーリング剤の吸着量が、1〜3マイクロリットルであることを特徴とする請求項1又は2に記載のガラス化用具のシーリング方法。
【請求項4】
凍結容器の先端部内において、凍結液とシーリング剤との間に空気層を設けることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のガラス化用具のシーリング方法。
【請求項5】
凍結保存後において、凍結容器先端部に吸着させ凍結させたシーリング剤を融解液中で速やかに融解、拡散、除去することを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のガラス化用具のシーリング方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【公開番号】特開2007−111000(P2007−111000A)
【公開日】平成19年5月10日(2007.5.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−307660(P2005−307660)
【出願日】平成17年10月21日(2005.10.21)
【出願人】(500117772)
【出願人】(591221134)株式会社日本医化器械製作所 (9)
【Fターム(参考)】