ガンのエキソソーム−ベースの治療
患者におけるガンの治療法は、エプスタイン・バーウイルスでの感染により患者から回収したＢ細胞を不死化すること、細胞を潜伏期に形質転換すること、細胞をガン抗原の存在下で培養すること、細胞から放出されたエキソソームを採集すること、エキソソームを患者に投与することを含んでなる。或いは、採集したエキソソームは、ガン抗原を搭載している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えばＢ細胞又は樹状細胞に由来するエキソソームの使用により対象者において免疫調整性応答を誘起する方法及び手段に関する。本発明に従う方法により、エキソソームの使用に基づく患者におけるガンの治療が可能になる。より具体的には、本発明は、エキソソームにより、患者のガン性細胞上に提示される抗原に対する免疫応答を誘発させる方法に関する。本発明はまた、任意の組織移植の間の治療法で望ましくあり得る免疫応答の抑制のために、例えばＢ細胞に由来するエキソソームを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
毎年数百万人がガンに罹患する。過去数十年間にわたりガン治療に相当の進歩がなされているが、より良好な治療が未だ大いに必要とされている。
当該分野において、ガン治療での使用が証明されたか又は示唆された多数の化学物質及び生物学的物質(とりわけヒト起源のエキソソーム)が存在する。
【０００３】
エキソソームは、抗原も同時刺激性分子も保有することができるナノサイズのベシクルである。樹状細胞(DC)は、哺乳動物の免疫系に関係する、抗原をプロセッシングし抗原を提示する細胞である。抗原によって活性化された状態で、樹状細胞は、Ｂ細胞及びＴ細胞と相互作用して、養子免疫応答をトリガーする。最近十年間、樹状細胞(DC)由来エキソソームは、悪性疾患の治療について動物モデル及び臨床試験で試験されてきた。DC由来エキソソームは、Ｔ細胞活性化をインビトロ及びインビボで刺激し、マウスで腫瘍を根絶させることができる(Amigorena S, Anti-tumour immunotherapy using dendritic-cell-derived exosomes. Res Immunol 1998, 149(7-8): 661-662；Zitvogel Lら，Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: Dendritic cell-derived exosomes. Nat Med 1998, 4(5): 594-600)。種々の細胞タイプが、起源の細胞を反映する表現型を有するエキソソームを産生する(Johansson S Mら，Different types of in vitro generated human monocyte-derived dendritic cells release exosomes with distinct phenotypes. Immunology 2008, 123: 491-499；Seguraら，Mature dendritic cells secrete exosomes with strong ability to induce antigen-specific effector immune responses. Blood cell Mol Dis 2005, 35: 89-93)。現在の定説では、対応する細胞である樹状細胞が、ナイーブなＴ細胞の刺激において、Ｂ細胞と比べて効率的であるので、樹状細胞由来エキソソームがＢ細胞由来のものよりも好ましいと言われている。しかし、Ｂ細胞エキソソームは、今まで、これに関連して検討されたことがない。
【０００４】
完全なＴ細胞応答の生成におけるＢ細胞の役割が示唆されている(Ron Y及びSprent J, T Cell priming in vivo: a major role for B cells in presenting antigen to T cells in lymph nodes. J Immunol 1987, 138(9): 2848-2856)。最近、Dingらは、抗原のＢ細胞への標的化が、特異的Ｔ細胞応答を増強し、免疫寛容を破壊することができることを示した(Ding Cら，Targeting of antigens to B cells augments antigen-specific T-cell responses and breaks immune tolerance to tumor-associated antigen MUC1. Blood 2008, 112(7): 2817-2825)。更に、新たなデータにより、Ｂ細胞が長期Ｔ細胞免疫の達成に特に重要であることが示されている(Whitmire J Kら，Requirement of B Cells for Generating CD4+ T Cell Memory. J Immunol 2009, 182(4): 1868-1876)。エキソソームはＢ細胞エピトープを保有することができ；Ｂ細胞応答はＴ細胞増殖に必要とされる(Quazi KRら，Antigen loaded exosomes alone induce Th1 type memory through a B-cell dependent mechanism. Blood 2009, 113:2673-2683)。エキソソームがそれ自体のみでＴ細胞を刺激することができるのか(Admyre Cら，Direct exosome stimulation of peripheral human T cells detected by ELISPOT. Eur J Immunol 2006, 36: 1772-1781)又は媒介体として他の細胞が必要か(Vincent-Schneider Hら，Exosomes bearing HLA-DR1 molecules need dendritic cells to efficiently stimulate specific T cells. Int Immunol 2002, 14: 713-722)や、抗原特異性がエキソソームとＴ細胞との間の直接相互作用に影響し得るのかが議論されている。種々の起源のエキソソームがヒト血液中の特定の細胞集団を標的する(Johansson S Mら：Johansson S M, Exosomes - nano-vesicles in immune regulation. Thesis for doctoral degree 2008, Karolinska Instituted Stockholm, ISBN 978-91-7409-058-1)。
【０００５】
補体成分(3d/エプスタイン・バーウイルス)レセプター２(CD21；またCR2)は、Ｂ細胞の活性化及び成熟に関与するＢ細胞表面レセプターである。
エプスタイン・バーウイルス(EBV)はヒトリンパ球好性ヘルペスウイルスである。EBVは、一次Ｂ細胞をインビトロで増殖可能なリンパ芽球状細胞中に不死化できる。EBV糖タンパク質gp350のCD21への結合はＢ細胞へのウイルス付着に決定的に重要である(Young K Aら，Molecular basis of the interaction between complement receptor type 2 (CR2/CD21) and Epstein-Barr Virus Glycoprotein gp 350. J Virol 2008, 82: 11217-11227)。EBV-形質転換Ｂ細胞からのエキソソームは、Ｔ細胞阻害活性を有するEBVによりコードされる潜伏性膜タンパク質１(LMP1)を保有することが報告されている(Keryer-Bibens Cら，Exosomes released by EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the immunomodulatory protein galectin 9. BMC Cancer 2006, 6: 283)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明の発明者らは、驚くべきことに、EBV形質転換Ｂ細胞が、タンパク質gp350の媒介で天然型Ｂ細胞のCD21レセプターに特異的に結合するエキソソームを排出することを見出した。具体的には、溶解ステージのEBVが宿るＢ細胞は天然型Ｂ細胞に結合するエキソソームを産生する。他方で、本発明者らは、ヒト樹状細胞又は母乳からのエキソソームは単球を標的することを見出した。よって、以前に報告されていることとは対照的に、本発明に従うエキソソームは、天然型Ｂ細胞又は単球を特異的に標的し得、よってＴ細胞を特異的に標的しない。その結果、本発明の方法に従って製造することにより、エキソソームは、(例えば天然型Ｂ細胞の)CD21レセプターに特異的に結合し得るタンパク質を含んでなり、更に本発明に従うエキソソーム中に１以上の抗原を組み込むことにより、特異的免疫応答は、エキソソームと抗原提示細胞(APC)として作用する天然型Ｂ細胞との接触に際して、Ｔ細胞の更なる動員を生じ得る。要するに、本発明に従うエキソソームは、天然型Ｂ細胞レセプターと該天然型Ｂ細胞に移入される抗原とに接続する(タンパク質形態の)アンカーを含んでなると見ることができる。
【０００７】
発明の目的
エキソソームを用いて患者の免疫系を活性化することによって該患者においてガンを治療する方法を提供することが、本発明の目的である。
より具体的には、本発明の目的は、腫瘍抗原を標的してＢ細胞に刺激シグナルを与えることである。
本発明の別の重要な目的は、患者におけるガン治療に十分な量で腫瘍抗原提示エキソソームを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
よって、本発明は、とりわけ、例えばＢ細胞に由来するエキソソームに関する。ここで、該エキソソームは例えばＢ細胞レセプターに結合し得るタンパク質を保有し、また任意の種類の１以上の抗原も保有する。
本発明はまた、他のＢ細胞、樹状細胞、単球又はマクロファージを起源とするエキソソームによりＢ細胞を標的する方法に関する。ここで、該エキソソームは、標的するＢ細胞への結合後、免疫応答を誘発し得る抗原特性を保有する。
【０００９】
本発明は更に、免疫調整又は新形成に起源を有する疾患(例えばガン)の治療において使用するためのエキソソームに関する。該エキソソームは更に、感染、アレルギー、自己免疫疾患に関しても有用であり得、更に例えば移植の間の治療法において有用であり得る。ここで、本発明に従うエキソソームは、例えば腫瘍抗原のような１以上の抗原に対する免疫応答を誘発するように操作されていてもよいし、或いは例えば移植に関連して所望されるように移植組織が対象者の免疫系により拒絶されることを回避するために、免疫応答を抑制するように操作されていてもよい。
【００１０】
本発明はまた、天然型Ｂ細胞を標的するように設計されたエキソソームの製造方法に関する。
本発明の更なる目的は、下記の発明の要旨、図面により説明される発明の詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の説明
Ｂ細胞を標的するエキソソームの製造方法
本発明は、下記の工程：
(ｉ)Ｂ細胞を、エプスタイン・バーウイルスに感染させることで例示されるような適切な手段で、潜伏期に形質転換させることにより、天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分を発現させる工程、
(ii)(ｉ)の形質転換Ｂ細胞を培養する工程、
(iii)(ii)の形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集する工程
を含んでなり、
前記エキソソームは天然型Ｂ細胞に結合し得る１以上の成分を含んでなり、該エキソソームは直接的及び/又は間接的に１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を搭載している、Ｂ細胞を標的する特異的免疫調整性エキソソームの製造方法を提供する。
【００１３】
上記のように、エキソソームは、(ii)で形質転換Ｂ細胞を例えば１以上の抗原と同時培養することにより、１以上の抗原を搭載されてもよい(間接搭載(loading))。他方、本方法はまた、エキソソームの直接搭載を可能にする。すなわち、(iii)でエキソソームを採集した後、回収したエキソソームを例えば１以上の抗原に曝す。直接搭載は、通常、タンパク質のフラグメント(例えば８〜12アミノ酸残基又は15〜24アミノ酸残基を含んでなるペプチドフラグメントのようなペプチド又はペプチドフラグメントなど)を用いて実施する。或いは、(ii)で間接搭載を省略すると、工程(iv)での搭載が必要である。直接搭載は、EBTBエキソソーム又はDCエキソソームを任意の抗原(互いに独立した任意の種類の１以上の抗原)と、エキソソームによる１以上の抗原の取込みを促進する条件下で接触させることを含んでなる。これは、例えばpHシフトを含んでなる条件下であり得る。これは、少なくともpH５、好ましくはpH約5.2のpHの適切な培地中４℃にてエキソソームを懸濁することにより実現し得る。ペプチドフラグメントの添加及びその後の例えばTRIS緩衝液のような緩衝液の添加によりpHをpH約7.0に上昇させて、該ペプチドフラグメントをエキソソームに組み込む。pHを変化させる必要のない直接搭載の技術も存在する。しかし、直接的及び間接搭載技術の両方を用いる多搭載法を使用することができるとも考えられる。本発明者らは、間接搭載が特に効果的であることを見出している。
【００１４】
１以上の抗原は、内因性/自原性(対象者自身に由来する)であっても外因性/同種異系(別の対象者に由来する)であってもよく、より多くの抗原をエキソソーム中/上に組み込む場合には、抗原は自原性/同種異系抗原の任意の混合物であり得る。好ましくは、抗原は自原性である。更に、１以上の抗原は、例えばウイルス性若しくは細菌性のような任意の起源を有していても、腫瘍抗原であってもよく、更には免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せであり得る。
本発明の方法により１以上の異なる抗原の組込みが可能になり、その結果、エキソソームは例えば免疫抑制性抗原及びサイトメガロウイルス(CMV)に対する抗原を含んでなり得ると考えられる。結果として、本発明に従うエキソソームは、任意の種類又は起源の１以上の抗原、例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原を含んでなり得、したがって１以上の免疫刺激性抗原及び１以上の免疫抑制剤の組合せであり得る。
【００１５】
更に、本発明に従うエキソソームは、Ｂ細胞を標的するための任意の抗原(例えばウイルス性)を含み、ワクチン(例えばウイルスワクチン)として使用されるように操作され得ることが更に企図される。本発明に従うエキソソームは自己免疫疾患、アレルギーに関連して、又は任意の種類の移植を受け、免疫応答により移植組織が拒絶されるリスクにあり得る対象者の治療に関連して使用し得ることも企図される。この観点は、エキソソームに免疫抑制剤を組み込むことによって実現することができる。
上記のように、排出されたエキソソームは、直接的及び/又は間接搭載により、１以上の抗原若しくは１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せを搭載し得る。しかし、抗原性成分はＢに化学的に連結されていてもよい。Ｂ細胞結合性タンパク質又はリガンドの化学的連結は、該タンパク質又はリガンドを例えばBS3(ビス-(スルホ-スクシンイミジル)-スベリン酸)、DSS(ジスクシンイミジルスベリン酸)、DSG(ジスクシンイミジルグルタル酸)などのようなリンカーと反応させることにより実現することができる。リンカーは二官能性である、すなわち２つの連結点を有するので、リンカーにカップリングさせたタンパク質又はリガンドを、その後更に反応させてリンカーをエキソソームにカップリングさせることによりタンパク質又はリガンドをエキソソームにリンカー分子を介してカップリングさせる。
【００１６】
免疫抑制が望まれる場合、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物のような免疫抑制剤がエキソソーム中に組み込まれ得る。しかし、免疫抑制剤として作用し得る任意の物質を本発明に従って使用し得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００１７】
Ｂ細胞は、タンパク質gp350を発現するように、(例えばエプスタイン・バーウイルス(EBV)により)形質転換され得る。しかし、形質転換はまた、形質転換Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のタンパク質を発現するようになる当該分野で周知の他の技法により実施し得る。このようなレセプターは、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rであり得る。このようなＢ細胞レセプターに結合する適切なリガンドは、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αであり得るが、Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用し得る。結果として、Ｂ細胞から排出されるエキソソームは、形質転換Ｂ細胞が発現する成分と同じ天然型Ｂ細胞に結合し得る成分を発現するように操作され得る。本発明の発明者らは、驚くべきことに、EBVに感染したＢ細胞がgp350を発現することを発見した。
【００１８】
形質転換Ｂ細胞の培養条件は、当該分野において周知の細胞拡大手順に従うことができる。
例えば、Ｂ細胞は、例えばMEM、DMEM又は完全RPMI 1640培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)のような適切な培地で培養し得る。培地には、10％エキソソーム涸渇胎仔ウシ血清、100IU/mLのペニシリンストレプトマイシン、２mMのL-グルタミン、50μMのβ-メルカプトエタノール及び25ugのゲンタマイシン又はそれらの任意の組合せを補充し得る。他の細胞タイプ(Ｂ細胞以外)を使用する場合、例えばMDDC又はBMDCの培養には、例えばGM-CSF及びIL-4のような増殖因子を添加し得、上記の培地に加えて使用し得る。培養は、通常、５％ CO2の湿潤インキュベーター中で、37℃にて５日間のインキュベーションの間なされるが、CO2フリー条件の間でも、例えば約２日間、例えば約３日間、例えば約４日間のようなより短期間の間でもあり得る。
【００１９】
エキソソーム調製用に上清を採集するための形質転換Ｂ細胞の培養については、細胞は、例えば約48時間、例えば約72時間、例えば約96時間インキュベートし得る。MDDC又はBMDC培養には、インキュベーションは例えば６日間実施して未成熟DCを得て、その後更に48時間継続してエキソソーム調製用の上清を採集する。BMDCへの抗原搭載には、６日目に、細胞を一晩抗原でパルス/に曝露し、続いて洗浄し、湿潤インキュベーター中５％ CO2と５日間37℃にて48時間のインキュベーションを行う。
上記は、手引き的な説明であり、よって当該分野で公知の細胞培養法の範囲内で変え得ることを理解すべきである。
【００２０】
具体例として、例えばEBV-形質転換Ｂ細胞株は、25μg/mLのゲンタマイシン(Gibco)、10％熱不活化胎仔ウシ血清(Hyclone, Logan, Utah)、２mmol/LのL-グルタミン、100IU/mLのペニシリン(Gibco)、100μg/mLのストレプトマイシン(Gibco)及び50μmol/Lのβ-メルカプトエタノール(KEBO-lab, Spanga, Sweden)を補充したRPMI-1640(Gibco；Invitrogen Corp, Paisley, United Kingdom)からなる完全培地中で培養し得る。培地は、エキソソーム涸渇であった。細胞は、６％ CO2、37℃の湿潤インキュベーター中で培養し得る。
【００２１】
MDDC培養：末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)で製造業者の指示に従って遠心分離することより単離した。細胞は、その後、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で洗浄し、PBS、0.5％のウシ血清アルブミン(BSA)及び２mmエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有する細胞選別緩衝液中に再懸濁し、自動化マトリクス支援細胞ソーティング(AutoMACS；Miltenyi Biotech)を用いる単球のポジティブ選択用に抗CD14磁性ビーズ(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)で標識し得る。CD14+の純度は82〜99％の範囲であった(メジアン94％；ｎ＝29)。単球細胞培養物は、培養フラスコ(Costar, Cambridge, UK)において、RPMI 1640(HyClone, Logan, UT)を10％エキソソーム涸渇胎仔ウシ血清(FCS；HyClone)、２mmのL-グルタミン(Gibco, Paisley, UK)、100IU/mlのペニシリン(Gibco)、100μg/mlのストレプトマイシン(Gibco)、25μg/mlのゲンタマイシン(Gibco)、50μmの2-β-メルカプトエタノール(Sigma Chemical Company, St Louis, MO)、800U/mlの組換えヒト(rh)IL-4(BioSource International, Camarillo, CA)及び550U/mlのrhGM-CSF(BioSource International)と共に含有する完全培養培地中、４×105細胞/mlの濃度でセットアップし、３日目に再フィードした。６日目に、細胞を、補充物を有する新鮮培地中に再播種した。細胞密度は、両条件について同じ値に調整した。細胞生存は、培養６日目に、トリパンブルー排除により決定した。８日目に培養上清を回収し、3000ｇにて20分間室温にて遠心分離し、−80°で保存した。８日目に、細胞を採集し、フローサイトメトリにより表現型を分析した。
【００２２】
BMDC培養について：骨髄細胞は、10ng/mLのインターロイキン-４(IL-4；Invitrogen)及び10％顆粒球マクロファージコロニー刺激因子馴化培地(Ag8653/X63クローン)の存在下、完全RPMI 1640培地(Invitrogen, Carlsbad, CA；10％エキソソーム涸渇胎仔ウシ血清、１mMのピルビン酸ナトリウム、100IU/mLのペニシリンストレプトマイシン、200mMのL-グルタミン、50μMのβ-メルカプトエタノール)中で培養する。６日目に、培養上清の50％を新鮮培地と置換し、48時間後に上清を採集する。
細胞は、例えば少なくとも３日間、例えば少なくとも４日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも６日間、例えば少なくとも７日間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも１ヶ月間、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような例えば少なくとも２日間の間培養し得る。
【００２３】
本発明に従う方法により、エキソソームのより高収量が可能になり、その結果、効果的な治療が可能になる。高収量は、特に、EBV-形質転換Ｂ細胞で観察される。細胞培養物の上清は、例えば１日おき、例えば２日おき、例えば３日おき、例えば４日おき、例えば５日おき、例えば６日おきに採集し得、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような少なくとも例えば１ヶ月間の間に前記間隔のいずれかで採集し得る。
【００２４】
本発明に従う方法を使用するエキソソームの収量は、EBTB細胞の例えば約48時間培養の間に、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞のような例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/百万EBTB細胞であり得る。本発明の発明者らは、Ｂ細胞のEBV形質転換によって、より高収量のエキソソームが観察されることを見出した。エキソソームの収量は、例えば樹状細胞を使用して同期間培養すると、通常は、0.1μgエキソソーム/百万細胞の範囲である。
【００２５】
エキソソームの意図する目的又は使用に依存して、適切な抗原が選択されることを明確に理解すべきである；すなわち、エキソソームを例えばガン治療に関連して使用することを意図した場合、１以上のガン抗原がエキソソームに組み込まれ得る。エキソソームの意図する目的が例えばアレルギー治療に関連している場合、問題のアレルギー反応を抑制する１以上の免疫抑制剤をエキソソームに組み込み得る。このことは、例えば移植の概念にも必要な変更を加えた上で当てはまる。意図する目的又は必要性に依存して、１以上の抗原は例えば１以上の更なる抗原又は１以上の免疫抑制剤と組み合わせ得るとも考えられることもまた明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００２６】
エキソソームの採集は、例えば超遠心分離若しくは差分遠心分離又はそれらの任意の組合せ及びその後のペレット化エキソソームの回収により行い得る。ペレット化エキソソームは、更に、例えばPBSのような適切な培地で洗浄し得、そして任意に、その後適切な培地中に懸濁し得る。その後、遠心分離、エキソソームのペレット化及び例えばPBSでの洗浄の全サイクルを、エキソソームの純度が許容可能になるまで反復する。
本発明は、例えば樹状細胞又は濾胞性樹状細胞(FDC)のような他の細胞タイプにも必要な変更を加えた上で適用され得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００２７】
治療方法
本発明はまた、疾患の治療に使用するための、天然型Ｂ細胞を標的するエキソソームに関する。ここで、該方法は、
(ｉ)対象者から例えば血液サンプルのような生物学的サンプルを取得すること、
(ii)(i)の前記サンプルからＢ細胞を回収すること、
(iii)(ii)で回収したＢ細胞を、ウイルスで例示されるような適切な手段で、該Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得るタンパク質又はリガンドを発現するようにさせること、
(iv)形質転換Ｂ細胞を培養すること、
(ｖ)(iv)で形質転換Ｂ細胞から排出されたエキソソームを回収すること、
(vi)(ｖ)のエキソソームを対象者に戻すこと
を含んでなり、該エキソソームは、１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を直接的及び/又は間接的に搭載している。
【００２８】
形質転換すべきＢ細胞を回収するために対象者から回収するサンプルは、例えば、末梢血のような血液サンプルであってもよいし、骨髄サンプル若しくは対象者のリンパ系から抜き取られたサンプル又はそれらの任意の組合せ若しくは混合物であってもよい。
【００２９】
上記のように、エキソソームは、(iv)で形質転換Ｂ細胞を例えば１以上の抗原と同時培養することにより、１以上の抗原を搭載されてもよい(間接搭載)。他方、本方法はまた、エキソソームの直接搭載を可能にする。すなわち、(ｖ)でエキソソームを採集後、患者に戻す前に、回収したエキソソームを例えば１以上の抗原に曝す。直接搭載は、通常、タンパク質のフラグメント(例えば８〜12アミノ酸残基又は15〜24アミノ酸残基を含んでなるペプチドフラグメントのようなペプチド又はペプチドフラグメントなど)を用いて実施する。或いは、(ii)で間接搭載を省略すると、工程(iv)での搭載が必要である。直接搭載は、EBTBエキソソーム又はDCエキソソームを任意の抗原(互いに独立した任意の種類の１以上の抗原)と、エキソソームによる１以上の抗原の取込みを促進する条件下で接触させることを含んでなる。これは、例えばpHシフトを含んでなる条件下であり得る。これは、少なくともpH５、好ましくはpH約5.2のpHの適切な培地中４℃にてエキソソームを懸濁することにより実現し得る。ペプチドフラグメントの添加及びその後の例えばTRIS緩衝液のような緩衝液の添加によりpHをpH約7.0に上昇させて、該ペプチドフラグメントをエキソソームに組み込む。pHを変化させる必要のない直接搭載の技術も存在する。しかし、直接的及び間接搭載技術の両方を用いる多搭載法を使用することができるとも考えられる。
【００３０】
１以上の抗原は、内因性/自原性(対象者自身に由来する)であっても外因性/同種異系(別の対象者に由来する)であってもよく、より多くの抗原がエキソソーム中/上に組み込む場合には、抗原は自原性/同種異系抗原の任意の混合物であり得る。好ましくは、抗原は自原性である。更に、１以上の抗原は、例えばウイルス性若しくは細菌性のような任意の起源を有していても、腫瘍抗原であってもよく、更には免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せであり得る。
本発明の方法により１以上の異なる抗原の組込みが可能になり、その結果、エキソソームは例えば免疫抑制性抗原及びサイトメガロウイルス(CMV)に対する抗原を含んでなり得ると考えられる。結果として、本発明に従うエキソソームは、任意の種類又は起源の１以上の抗原、例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原を含んでなり得、したがって１以上の免疫刺激性抗原及び１以上の免疫抑制剤の組合せであり得る。
【００３１】
更に、本発明に従うエキソソームは、Ｂ細胞を標的するための任意の抗原(例えばウイルス性)を含み、ワクチン(例えばウイルスワクチン)として使用されるように操作され得ることが更に企図される。本発明に従うエキソソームは自己免疫疾患、アレルギーに関連して、又は任意の種類の移植を受け、免疫応答により移植組織が拒絶されるリスクにあり得る対象者の治療に関連して使用し得ることも企図される。この観点は、エキソソームに免疫抑制剤を組み込むことによって実現することができる。
上記のように、排出されたエキソソームは、直接的及び/又は間接搭載により、１以上の抗原若しくは１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せを搭載し得る。しかし、抗原性成分はＢに化学的に連結されていてもよい。Ｂ細胞結合性タンパク質又はリガンドの化学的連結は、該タンパク質又はリガンドを例えばBS3(ビス-(スルホ-スクシンイミジル)-スベリン酸)、DSS(ジスクシンイミジルスベリン酸)、DSG(ジスクシンイミジルグルタル酸)などのようなリンカーと反応させることにより実現することができる。リンカーは二官能性である、すなわち２つの連結点を有するので、リンカーにカップリングさせたタンパク質又はリガンドを、その後更に反応させてリンカーをエキソソームにカップリングさせることによりタンパク質又はリガンドをエキソソームにリンカー分子を介してカップリングさせる。
【００３２】
免疫抑制が望まれる場合、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物のような免疫抑制剤がエキソソーム中に組み込まれ得る。しかし、免疫抑制剤として作用し得る任意の物質を本発明に従って使用し得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００３３】
Ｂ細胞は、タンパク質gp350を発現するように、(例えばエプスタイン・バーウイルス(EBV)により)形質転換され得る。しかし、形質転換はまた、形質転換Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のタンパク質を発現するようになる当該分野で周知の他の技法により実施し得る。このようなレセプターは、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rであり得る。このようなＢ細胞レセプターに結合する適切なリガンドは、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αであり得るが、Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用し得る。結果として、Ｂ細胞から排出されるエキソソームは、形質転換Ｂ細胞が発現する成分と同じ天然型Ｂ細胞に結合し得る部分を発現するように操作され得る。本発明の発明者らは、驚くべきことに、EBVに感染したＢ細胞がgp350を発現することを発見した。
【００３４】
形質転換Ｂ細胞の培養条件は、当該分野において周知の細胞拡大手順に従うことができる。細胞は、例えば少なくとも３日間、例えば少なくとも４日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも６日間、例えば少なくとも７日間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも１ヶ月間、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような例えば少なくとも２日間の間培養し得る。
本発明に従う方法により、エキソソームのより高収量が可能になり、その結果、効果的な治療が可能になる。高収量は、特に、EBV-形質転換Ｂ細胞で観察される。細胞培養物の上清は、例えば１日おき、例えば２日おき、例えば３日おき、例えば４日おき、例えば５日おき、例えば６日おきに採集し得、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような少なくとも例えば１ヶ月間の間に前記間隔のいずれかで採集し得る。
【００３５】
本発明に従う方法を使用するエキソソームの収量は、EBTB細胞の例えば約48時間培養の間に、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞のような例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/百万EBTB細胞であり得る。本発明の発明者らは、Ｂ細胞のEBV形質転換によって、より高収量のエキソソームが観察されることを見出した。エキソソームの収量は、例えば樹状細胞を使用して同期間培養すると、通常は、0.1μgエキソソーム/百万細胞の範囲である。
【００３６】
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
エキソソームの採集は、例えば超遠心分離若しくは差分遠心分離又はそれらの任意の組合せ及びその後のペレット化エキソソームの回収により行い得る。ペレット化エキソソームは、更に、例えばPBSのような適切な培地で洗浄し得、そして任意に、その後適切な培地中に懸濁し得る。その後、遠心分離、エキソソームのペレット化及び例えばPBSでの洗浄の全サイクルを、エキソソームの純度が許容可能になるまで反復する。
本発明は、例えば樹状細胞又は濾胞性樹状細胞(FDC)のような他の細胞タイプにも必要な変更を加えた上で適用され得ることを明確に理解すべきである。
【００３７】
エキソソームの意図する目的又は使用に依存して、適切な抗原が選択されることを明確に理解すべきである；すなわち、エキソソームを例えばガン治療に関連して使用することを意図した場合、１以上のガン抗原がエキソソームに組み込まれ得る。エキソソームの意図する目的が例えばアレルギー治療に関連している場合、問題のアレルギー反応を抑制する１以上の免疫抑制剤をエキソソームに組み込み得る。このことは、例えば移植の概念にも必要な変更を加えた上で当てはまる。意図する目的又は必要性に依存して、１以上の抗原は例えば１以上の更なる抗原又は１以上の免疫抑制剤と組み合わせ得るとも考えられることもまた明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００３８】
エキソソームの投与態様は、例えば非経口投与のような当該分野で公知の種々の形態であり得、したがって静脈内、動脈内、骨内、鞘内(intrathecal)、皮内又は腹腔内投与であり得る。
対象者における効果的な免疫応答に必要とされるエキソソームの十分な用量は、例えば少なくとも0.2mg/kg、例えば少なくとも0.3mg/kg、例えば少なくとも0.4mg/kg、例えば少なくとも0.5mg/kg、例えば少なくとも0.75mg/kg、例えば少なくとも0.9mg/kg、例えば少なくとも1.0mg/kg、例えば少なくとも3.0mg/kg、例えば少なくとも5.0mg/kg、例えば少なくとも7.0mg/kg、例えば少なくとも10.0mg/kg、例えば少なくとも15.0mg/kgのような例えば少なくとも0.1mg/kgであり得る。
【００３９】
エキソソームは、約１時間、例えば約２時間、例えば４時間、例えば６時間の間、例えば静脈内注入として、投与することができる。或いは、エキソソームはまた、約20秒間、例えば約30秒間、例えば約40秒間、約１分間の期間の注射として投与し得る。
本発明に従う治療法は、単回用量又は複数回用量としてエキソソームを投与することにより得る。本治療法は、疾患の重篤度に依存して、一回実施してもよいし、反復してもよい。更に、治療は、疾患の再発に際して、繰り返し得る。
本治療法は、ガン、アレルギー、自己免疫疾患に対して及び移植療法の間に意図される。この治療レジメンは他の治療と組み合わせてもよいし他の治療で補充してもよいことを明確に理解すべきである。例えばガンに関しては、化学療法を本発明に従う治療と組み合わせ得、アレルギー治療では、例えば抗ヒスタミンを本発明に従う方法と組み合わせ得、感染の治療では、例えば抗生物質を本発明に従う方法と組み合わせ得る、などである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４０】
医薬組成物
エキソソームは、例えば、患者への例えば静脈内、動脈内、鞘内、皮内又は腹腔内投与のような非経口投与に適切な医薬組成物として製剤化し得る。
エキソソームは、非経口投与するとき、等張性培地中、すなわち血液と同じ張度を有する培地中で製剤化し得、エキソソームの凝集を防止する１以上の物質を更に含んでなり得る。例えば約0.91％ w/vのNaCl、約300mOsm/Lの溶液である正常生理食塩水(NS)のような生理食塩水溶液を用い得る。しかし、例えば下記のような他の生理食塩水溶液を使用し得る：
1/2-正常生理食塩水(0.45％ NaCl)(しばしば「D5」(５％デキストロース)を含む)は、77mEq/LのNa及びCl並びに50g/Lグルコースを含有する。
1/4-正常生理食塩水(0.22％ NaCl)は、39mEq/LのNa及びClを有し、浸透圧の理由から常に５％デキストロースを含有する。
【００４１】
例えば中心静脈カテーテルを介して投与される２％ NaClを超える濃縮物のような高張性生理食塩水もまた使用し得る。通常は、２つの強度が入手可能である：
３％ NaClは513mEq/LのNa及びClを有する。
５％ NaClは856mEq/LのNa及びClを有する。
これら溶液には、更に、例えば0.18％生理食塩水中デキストロース(グルコース)４％のようなデキストロース(グルコース)を補充し得る。
更なる添加物は、例えば２％までのヒト血清アルブミン又は１％までのヒト血清アルブミンのような例えば３％までのヒト血清アルブミンであり得る。
【００４２】
静脈内投与のためには、投与する組成物中のエキソソーム濃度は、通常、例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/ml培地、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも15.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも20.0μgエキソソーム/ml培地のようなおよそ少なくとも約0.1μgエキソソーム/ml培地の範囲である。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４３】
エキソソーム
本発明はまた、エキソソーム、好ましくはＢ細胞に起源を有するか又は樹状細胞、濾胞性樹状細胞などに起源を有するエキソソームに関する。
本発明に従うエキソソームは、天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る少なくとも１つの成分若しくは薬剤又はタンパク質若しくはペプチドフラグメントを含んでなる。レセプターは、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rであり得るが、これらに限定されない。更に、天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る１つの成分若しくは薬剤又はタンパク質若しくはペプチドフラグメントは、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αであり得るが、これらに限定されない。しかし、Ｂ細胞に結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用し得る。
【００４４】
更に、本発明に従うエキソソームは、１以上の抗原を更に含んでなり得る。１以上の抗原は、内因性/自原性(対象者自身に由来する)であっても外因性/同種異系(別の対象者に由来する)であってもよく、より多くの抗原をエキソソーム中/上に組み込む場合には、抗原は自原性/同種異系抗原の任意の混合物であり得る。好ましくは、抗原は自原性である。更に、１以上の抗原は、例えばウイルス性若しくは細菌性のような任意の起源を有していても、腫瘍抗原であってもよく、更には免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せであり得る。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４５】
本発明の方法により１以上の異なる抗原の組込みが可能になり、その結果、エキソソームは例えば免疫抑制性抗原及びサイトメガロウイルス(CMV)に対する抗原を含んでなり得ると考えられる。結果として、本発明に従うエキソソームは、任意の種類又は起源の１以上の抗原、例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原を含んでなり得、したがって１以上の免疫刺激性抗原及び１以上の免疫抑制剤の組合せであり得る。
【００４６】
更に、本発明に従うエキソソームは、Ｂ細胞を標的するための任意の抗原(例えばウイルス性)を含み、ワクチン(例えばウイルスワクチン)として使用されるように操作され得ることが更に企図される。本発明に従うエキソソームは自己免疫疾患、アレルギーに関連して、又は任意の種類の移植を受け、免疫応答により移植組織が拒絶されるリスクがあり得る対象者の治療に関連して使用し得ることも企図される。この観点は、エキソソームに免疫抑制剤を組み込むことによって実現することができる。このような免疫抑制剤は、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物であり得るが、これらに限定されない。しかし、免疫抑制剤として作用し得る任意の物質を本発明に従って使用し得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４７】
本発明はまた、対象者における病気又は病的状態の治療に使用するためのエキソソーム(例えばその組成物)に関する。病気又は病的状態は、例えばガン、任意の自己免疫疾患、移植下での療法、アレルギー又は免疫抑制若しくは免疫刺激を必要とする任意の病的状態であり得る(本明細書中の説明に関して必要な変更を加えて)。
【００４８】
本発明は、エプスタイン・バーウイルス-形質転換Ｂ細胞(EBTB細胞)により放出されたエキソソーム(EBTBエキソソーム)が天然型Ｂ細胞をCD21を介して標的するという洞察に基づく。この洞察は、EBTB細胞エキソソームと天然型Ｂ細胞との間の相互作用が抗CD21により効率的にブロックされるという知見によって支持される。このことは、CD21とEBV糖タンパク質gp350又はCD21に対するその他のリガンド、例えばCD23、C3b、C3d又はインターフェロン-αとの間の相互作用を示唆している。本発明に従って使用し得る他のリガンドは、例えばBAFF、APRIL、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αである。Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用することができると考えられる。Ｂ細胞レセプターはCD21であり得るがこれに限定されず、天然型Ｂ細胞上の他のレセプター、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rでもあり得る。結果として、本発明は、エキソソームの外部に天然型Ｂ細胞に結合し得るリガンド、及びエキソソーム中に組み込まれた１以上の抗原のその後の移行を提供すると考えることができる。よって、この予想外で驚くべき知見は、１以上の抗原のより効率的な移行を提供することによって、より効率的で特異的な免疫応答を提供する。重要なことには、エキソソームはＴ細胞ではなくＢ細胞を標的するので、Ｔ細胞の直接刺激による場合より強力なＴ細胞応答が生じる。
【００４９】
本発明によれば、EBTBエキソソームは、研究室で、例えばＢ細胞のEBV形質転換によって、機能的効果を変更するように操作することができる。操作したEBTBエキソソームの天然型Ｂ細胞への特異的標的付けは、治療的有用性を増大させる。更に、Ｂ細胞のEBV形質転換により、エキソソームの供給源が無制限になる。
よって、本発明によれば、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と腫瘍抗原とを保有するEBTB細胞が開示される；EBTB細胞は、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と腫瘍抗原とを保有するEBTBエキソソームを放出することができる。
本発明によれば、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と腫瘍抗原とを保有するEBTBエキソソームもまた開示される。
本発明によれば、更に、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と例えば腫瘍抗原又は感染性抗原(ウイルス性、細菌性又はミコバクテリア性)からの抗原とを保有する樹状細胞(DC)エキソソームが開示される。
【００５０】
本発明のエキソソームは、単一の腫瘍抗原又は複数の腫瘍抗原が搭載され、これを保有し得る。
本出願において、用語「形質転換」は、(エプスタイン・バーウイルス)EBVがＢリンパ球に感染するとき、そしてその結果として終には無限に増殖可能なリンパ芽球様細胞株が出現することを意味するものとする。これら細胞株の増殖性形質転換は、ウイルス性タンパク質発現の結果である。生じる細胞株は、時に、不死化細胞株と呼ばれる。
本出願において、「抗原」は、対象者において、免疫応答を誘発することができる任意の物質を意味するものとする。この目的のため、抗原は、例えばウイルス抗原、細菌抗原、ミコバクテリア抗原、腫瘍抗原又は例えば移植の間若しくはアレルギー反応において若しくは自己免疫反応の間に遭遇するような、対象者の免疫系が応答する任意の物質であり得るが、これらに限定されない。
【００５１】
本出願において、「腫瘍抗原」又は「ガン抗原」(この表現は「腫瘍関連抗原」を包含する)は、天然又は合成のペプチドであって、それを投与された生物がそれに対する抗体又は抗原特異的Ｔ細胞応答を形成する天然又は合成のペプチドである。詳細には、腫瘍抗原は、抗原提示細胞(APC)、特にＢ細胞、EBTB細胞又は樹状細胞(DC)が提示することができる天然又は合成のペプチドである。しかし、本発明の腫瘍抗原は、抗原効果を発揮するために、抗原提示細胞によりプロセッシング及び提示され得るが、必要ではない。
本発明のEBTBエキソソーム又はDCエキソソームは、腫瘍抗原を間接的に又は直接的に搭載していてもよい。直接搭載は、EBTB細胞又は樹状細胞を腫瘍抗原と、該細胞による１以上の抗原の取込みを促進する条件下で培養し、抗原搭載細胞に抗原搭載エキソソームを放出させることを含んでなる。直接搭載は、EBTBエキソソーム又はDCエキソソームを腫瘍抗原と、エキソソームによる腫瘍抗原の取込みを促進する条件下、特にpHシフトを含んでなる条件下で接触させることを含んでなる。
【００５２】
本発明によれば、更に、ガンの治療における本発明のEBTB細胞及びEBTBエキソソームの使用並びに本発明の樹状細胞及びDCエキソソームの使用が開示される。
EBTBエキソソームは、Ｂ細胞を標的するタンパク質が提供されるときには、天然型Ｂ細胞を特異的に標的することが可能である。このようなＢ細胞標的化に特に有用なタンパク質は、gp350、CD23、C3b、CD19及びC3dであるが、これらに限定されない。
本発明によれば、天然型Ｂ細胞は、患者の循環から採取した血液から単離され、EBVでEBTB細胞に形質転換されて培養される。培養EBTB細胞はガン抗原を搭載される。ガン抗原搭載EBTB細胞から放出されるEBTBエキソソームを回収する。この様式で、患者の効果的なガン治療に十分な数(量)のガン抗原搭載EBTBエキソソームが生成される。本発明のガン抗原搭載EBTBエキソソームはCD21結合性タンパク質を保有する。
或いは、患者以外の者の循環から採取した血液から単離した天然型Ｂ細胞を使用することも可能である(但し、このＢ細胞は、治療すべき患者のＢ細胞と免疫学的に適合性である)。よって、本発明の方法は、自家及び同種異系のＢ細胞の使用を含んでなる。
【００５３】
患者の治療に十分な数のエキソソームを提供するために、自家/自原性又は同種異系の抗原を提示する本発明の天然型Ｂ細胞及びそれからEBV感染により得られるEBTB細胞を、例えば少なくとも３週間、例えば４週間、例えば５週間、例えば６週間、例えば７週間、例えば８週間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間又はそれ以上のような少なくとも２週間の間の培養で拡大/増殖させることが好ましい。本発明によれば、EBTBエキソソームに含まれる免疫阻害に関与する物質(例えばLMP-1)は、例えばFabフラグメント分子により、患者への投与の前に中和化され得る。
本発明によれば、CD40/IL-4刺激Ｂ細胞(「CD40刺激Ｂ細胞」)により放出されたエキソソームが開示される。CD40刺激Ｂ細胞株の長期培養物は、M Wiesnerら(2008), Conditional Immortalization of Human B Cells by CD40 Ligation. Plos ONE 3(l):e1464. Doi:10.1371/journal.pone.0001464に開示されている。CD40刺激Ｂ細胞株及び該Ｂ細胞から放出されるエキソソームは、ETBT細胞株及びETBTエキソソームと同様な有用性を有する。詳細には、それらは、腫瘍抗原を搭載し得、Ｔ細胞及び/又はＢ細胞活性化に使用され得る。
【００５４】
本発明の腫瘍抗原は、Ｂ細胞(EBTB細胞を含む)若しくは樹状細胞により又は対応するエンドソームにより提示可能な抗原である。本出願において、「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞表面に発現される抗原、その抗原的に活性なフラグメント、特にＴ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基又は15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメントを包含する。用語「腫瘍抗原」はまた、抗原提示細胞表面に提示されることなくＢ細胞を刺激し得る、より大きなペプチド又はタンパク質を包含する。このようなより大きな腫瘍抗原ペプチド又はタンパク質は、有利には、US 2007/0134275 A1に開示されるもののような腫瘍細胞溶解物の形態で本発明において使用することができる。
【００５５】
本発明によれば、本発明の腫瘍抗原は、下記からなる群より選択される：ERBB2(HER2)、BIRC5(サービビン)、CEACAM5(CEA)、WDRK46(BING4)、BAGE(BAGE1)、CSAG2(TRAG-3)、DCT(TRP-2)、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2(インターロイキン13レセプターα２)、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR(チロシナーゼ)、TYRP1(TRP-1)、SAGE1(SAGE)、SYCP1(HOM-TES-14/SCP1)、SSX2(HOM-MEL-40)、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4(α-アクチニン-４)、CTNNB1、CASP8(カスパーゼ-８)、CDC27、CDK4、EEF2、FN1(フィブロネクチン)、HSPA1B(Hisp70)、LPGAT1(KIAA0205)、ME1(リンゴ酸酵素)、HHAT(MART-2)、TRAPPC1(MUM-2)、MUM3、MYO1B(非通常型ミオシンクラス１遺伝子)、PAPOLG(neo-PAP)、OS9、PTPRK(レセプター様タンパク質チロシンホスファターゼκ)、TPI1(トリオースリン酸イソメラーゼ)、ADFP(アディオフィリン)、AFP(α-フェトプロテイン)、AIM2、ANXA2(アネキシンII)、ART4(小胞体耐性タンパク質)、CLCA2、CPSF1(CPSF)、PPIB(サイクロフィリンＢ)、EPHA2、EPHA3、FGF5(フィブロブラスト増殖因子５)、CA9(カルボニックアンヒドラーゼ９)、TERT(hTERT)、MGAT5(GNT-V；N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ)、CEL(腸カルボキシエステラーゼ)、F4.2、CAN(CAN-タンパク質)、ETV6(TEL1)、BIRC7(リビン/ML-IAP)、CSF1(マクロファージコロニー刺激因子)、OGT、MUC1(ムチン)、MUC2、MUM1、CTAG1A(NY-ESO-1；LAGE-2)、CTAG2(NY-ESO-ORF2；LAGE-1)、CTAG(CAMEL)、MRPL28(メラノーマ抗原p15)、FOLH1(前立腺特異的膜抗原)、RAGE、SFMBT1(腎臓遍在性タンパク質１)、KAAG1(RU2AS)、SART1、TSPYL1(SART-2)、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1(Ep-CAM)、SILV(Pmel17；gp100)、SCGB2A2(マンマグロビンＡ)、MC1R、MLANA(MART-1；メラン-Ａ)、GPR143(OA1)、OCA2(Ｐポリペプチド)、KLK3(PSA；前立腺特異的抗原)、SUPT7L(ART-1)、ARTC1、BRAF、CASP5(カスパーゼ-５)、ウロプラキン；CDKN2A、UBXD5(COA-1)、EFTUD2(伸長因子Tu GTP結合性ドメイン含有；nSNRP116)、GPNMB、NFYC、PRDX5(パーオキシレドキシン５)、ZUBR1(RBAF600)、SIRT2、SNRPD1、HERV-K-MEL、CXorf61(KK-LC-1)、CCDC110(KM-HN-1)、VENTXP1(NA88A)、前立腺膜特異的抗原、SPA17(精子タンパク質17)、KLK4、ANKRD30A(NY-BR1)、RAB38(NY-MEL-1)、CCND1(サイクリンD1)、CYP1B1(P450 1B1)、MDM2、MMP2(マトリクスメタロプロテイナーゼ-２)、テラトカルシノーマ由来増殖因子(CRIPTO-1)、ZNF395(PBF；パピローマウイルス結合因子)、RNF43、SCRN1(セセルニン１)、STEAP1(STEAP)、707-AP、TGFBR2(TGF-βレセプタータイプMB)、PXDNL(MG50)、AKAP13(リンパ急性転化(lymphoid blast crisis；Lbc)オンコジーン腫瘍性タンパク質)、PRTN3(プロテイナーゼ３)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、RHAMM(CD168)、ACPP(前立腺酸性ホスファターゼ)、ACRBP(OY-TES-1)、LCK、RCVRN(レコベリン)、RPS2(リボソームタンパク質S2)、RPL10A(リボソームタンパク質L10a)、SLC45A3(プロステイン)、BCL2L1(Bcl-xL)、DKK1(dickkopf-1)、ENAH(ヒトmenaタンパク質)、CSPG4(メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン；MSCP)、RGS5、BCR(切断点クラスター領域)、BCR-ABL、ABL-BCR、DEK(DEK-オンコジーン)、DEK-CAN、ETV6-AML1、LDLR-FUT、NPM1-ALK1、PML-RARA、SYT-SSX1、SYT-SSX2、FLT3(FLT1)、ABL1(プロト-オンコジーンチロシンタンパク質キナーゼ)、AML1(AML)、LDLR(低密度脂質レセプター)、FUT1(GDP-L-フコース)、NPM1(NPM)、ALK、PML1(前骨髄球性白血病；PML)、RARA(RARA α)、SYT、SSX1、MSLN(メソテイン)、UBE2V1(ユビキチン結合酵素変異体Kua)、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL-2、MCL1、CTSH(カテプシンＨ)、ABCC3(多剤耐性関連タンパク質３；MPR3)、BST2(HM1.24)、MFGE8(乳脂肪球膜タンパク質BA46；ラクトアドへリン)、TPBG(5T4ガン胎児性抗原)、FMOD(フィブロモジュリン)、XAGE1(XAGE抗原)、RPSA(ガン胎児性(oncofetal)Ag未成熟ラミニンレセプター；OFA-ILR)、COTL1(コアクトシン様１)、CALR3(CRT2)、PA2G4(ErbB3結合性タンパク質１)、EZH2(zesteホモログのポリコーム群タンパク質エンハンサー２；polycomb group protein enhancer of homolog 2)、FMNL1(白血球中のフォルミン関連タンパク質１；formin-related protein in leukocytes 1)、HPSE(ヘパラナーゼ)、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1(ヘムオキシゲナーゼ-１；HO-1)、TPM4(トロポミオシン-４)、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP(Mac-2結合性タンパク質)、PAGE4、PAK2(P21活性化セリンキナーゼ２)、CDKN1A(サイクリン依存性キナーゼインヒビター1A)、PTHLH(副甲状腺ホルモン関連タンパク質；PTHrP)、SOX2、SOX11、TRPM8(前立腺特異的タンパク質一過性受容体電位-p8)、TYMS(チミジレートシンターゼ)、ATIC(5'-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-d-リボヌクレオチドトランスホルミラーゼ/イノシニカーゼ)、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ１)、SOX4、TOR3A(ATP-依存性インターフェロン応答性；ADIR)、TRGC2(Ｔ細胞レセプターγオルタネートリーディングフレームタンパク質；TARP)、BTBD2(BTBドメイン含有２；BTB domain containin 2)、SLBP(ヘパリン結合タンパク質)、EGFR(表皮増殖因子レセプター)、IER3(最初期応答遺伝子X-1；IEX-1)、TTK(TTKタンパク質キナーゼ)、LY6K(リンパ球抗原Ｂ複合体遺伝子座Ｋ)、IGF2BP3(インスリン様増殖因子(IGF)-II mRNA結合タンパク質３；IMP-3)、GPC3(グリピカン-３)、SLC35A4、HSMD(HMSD-v-コードmHA)、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET(c-Metタンパク質)、CCNB1(サイクリンB1)、PAX3-FKHR、PAX3、FOXO1(FKHR)、ユビキリン-１、HOX-B6、IFI27、YB-1、KIAA0136、オステオネクチン、F-boxオンリータンパク質21(F-box only protein 21)、ILF3、UBP3、BRAP-2；H+-ATPase、KOO8-1、MAIAP、Gene AS、BR-1、BR-2、KIAA0603、TPR、NOR-90、N-CAM(ニューロン細胞接着分子)、ルイスＹ糖鎖抗原、Ep-CAM(上皮細胞接着分子)、MUC-1タンパク質、36P6D5、シアリルTn糖鎖抗原、Globo H糖鎖、CA 125、CA 19-9、CA 15-3、TAG-72、Her2/Neuレセプター、p97、CD20、CD21、WT1遺伝子の発現産物。
【００５６】
更に有用な腫瘍関連抗原は、例えば、DeVitaら編，Biological Therapy of Cancer 第２版，第３章：Biology of Tumor Agents. Lippincott Comp. 1995に記載されている。
本発明で有用な扁平上皮細胞ガン腫抗原はUS 2007/0009501 A1に開示されている。
更なる腫瘍関連抗原は、米国特許第7,524,930号、同第7,427,660号、同第7,408,037号、同第7,432,354号、同第7,232,887号、同第7425607号、同第7,084239号に開示されている。
本発明によれば、本発明の腫瘍抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドが開示される。ポリヌクレオチドは、プロテアーゼによって腫瘍抗原ペプチドが切断され得る融合タンパク質産物をコードすることが可能なポリヌクレオチドに包含されていることが好ましい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、天然型Ｂ細胞、樹状細胞又は本発明のEBTB細胞を遺伝子改変して、該細胞に融合タンパク質を発現させ、本発明の腫瘍抗原ペプチドに変換するために使用することができる。よって、遺伝子改変した細胞は、表面に本発明の腫瘍抗原ペプチドを保有するエキソソームを放出し得る。しかし、細胞質に抗原を保有するエキソソームを製造するための技術もまた存在する。
【００５７】
本発明によれば、下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)単離したＢ細胞をエプスタイン・バーウイルス(EBV)に感染させること；
(ｄ)感染Ｂ細胞を潜伏期(但し、gp350は発現する)に形質転換すること；
(ｅ)EBV形質転換Ｂ細胞をガン抗原の存在下で培養すること；
(ｆ)EBV形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｇ)採集したエキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法が開示される。
或いは、EBV形質転換Ｂ細胞をガン抗原の存在下で培養することに代えて又は加えて、本方法は、採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載エキソソームを製造することを含んでなる。
【００５８】
本発明によれば、下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルから単球を単離すること；
(ｃ)単球を未成熟樹状細胞に培養すること；
(ｄ)未成熟樹状細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること;
(ｅ)改変未成熟樹状細胞をガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載成熟樹状細胞に形質転換させること；
(ｆ)成熟樹状細胞から放出されたガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを採集すること；
(ｇ)ガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法が開示される。
【００５９】
本発明によれば、更に、下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離し；Ｂ細胞を培養すること；
(ｃ)Ｂ細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること；
(ｄ)CD21結合性成分を発現する改変Ｂ細胞をガン抗原と接触させること；
(ｅ)ガン抗原に接触した改変Ｂ細胞から放出されたガン抗原搭載エキソソームを採集すること；
(ｆ)ガン抗原搭載Ｂ細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法が開示される。
或いは、改変Ｂ細胞をガン抗原と接触させることに代えて又は加えて、本方法は、採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載エキソソームを製造することを含んでなる。
【００６０】
本発明に従うガン治療法では、CD21結合性タンパク質成分が下記の１又は数個を含んでなることが好ましい：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-α。
本発明によれば、更に、本発明の方法により取得されたか又は取得可能であるエキソソーム；エキソソームの製造方法；エキソソームを含んでなるガンワクチン；インビトロでエキソソームにより刺激されたＴ細胞；CD21結合性成分、特に下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αからなる群より選択されるCD21結合性成分を含んでなるＢ細胞又は樹状細胞(DC)エキソソームが開示される。
本発明は、特定タイプのガンの治療に限定されない。しかし、乳ガン、膀胱ガン、皮膚ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、甲状腺ガン、胃ガン、頭部頸部ガン、メラノーマからなる群より選択されるガンの治療への適用が好ましい。
以下で、幾つかの好適な実施形態(その一部は幾つかの図で説明される)に言及することで本発明をより詳細に説明する。
【００６１】
図面の説明
図１は、EBV形質転換Ｂ細胞エキソソーム(EBTB-exo)及びバーキットリンパ腫細胞株(BJAB)のエキソソームの天然型Ｂ細胞への付着(抗CD18及び抗CD21並びに対応するアイソタイプコントロール抗体による相互作用のブロッキングを含む)を説明するグラフである；
図2a、2bは、３人のドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)中のエキソソーム陽性細胞(１時間及び４時間でのフローサイトメトリによるPKH67+シグナルとして測定)のDCエキソソームパーセンテージ(PBMCについて平均＋s.d.)を説明するグラフである；
【００６２】
図３は、３人のドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)中のエキソソーム陽性細胞(４時間でのフローサイトメトリによるPKH67+シグナルとして測定)のEBVエキソソームパーセンテージ(PBMCについて平均＋s.d.)を説明するグラフである；
図４ エキソソームはPBMC中の特定の亜集団を標的する。PKH67染色した(Ａ，Ｄ)DC-、(Ｂ，Ｅ)LCL1-及び(Ｃ，Ｆ)母乳-エキソソームを、健常な血液ドナーからのPBMCと１時間(Ａ〜Ｃ、ｎ＝９)及び４時間(Ｄ〜Ｆ、ｎ＝８)インキュベートした。10μgのエキソソーム/５×105 PBMCを添加した。バックグランドコントロールとして、並行して遠心分離したPKH67色素ペレットを使用した(これは低くて検出不可能な蛍光を示した；データは示さず)。エキソソームの結合は、四色フローサイトメトリにおいてサンプルあたり104イベントを収集して測定した。データは、各亜集団の細胞中のPKH67+細胞のパーセントとして表す。バーは平均値を示す。異なる血液ドナーを個別記号で示す。
【００６３】
図５ エキソソームは主に単球によって内在化される一方で、Ｂ細胞の細胞膜に結合する。PBMCを、PKH67染色した(Ａ)DC-、(Ｂ)LCL1-及び(Ｃ)母乳-エキソソームと４時間インキュベートし(10μgのエキソソーム/５×105 PBMC)、次いで抗CD14又は抗CD19のいずれかについて染色し、続いてAlexa Fluor 546標識した(赤色に見える)。細胞を共焦点レーザ走査顕微鏡観察により分析した。バックグランドコントロールとして、並行して遠心分離したPKH67色素ペレットを使用した(これは検出不可能な蛍光を示した；データは示さず)。スケールバーは10μmを表す。PBMCの画像は２つ実験のうちの代表的実験として示す。(Ｄ)ImageStream分析により、HLA-DR+CD14+細胞が主にエキソソームを内在化することが示される。一例として、４時間後の、PKH67+母乳エキソソーム(10μgのエキソソーム/５×105 PBMC)とHLA-DR+CD14+細胞との相互作用のヒストグラムをプロットする。表面エキソソーム(<0)又は内部エキソソーム(>0)を有する細胞の合成画像を示す；HLA-DR(ピンク)、CD14(オレンジ)及びPKH67+エキソソーム(グリーン)。左下の画像中に10μmに対応するバーを示す。異なる血液ドナーを使用した２つの実験うちの代表的実験として結果を示す。少なくとも104の合計イベントを各サンプルについて収集した。(Ｅ)HLA-DR+CD14+細胞に結合したエキソソームのパーセンテージ及び内在化エキソソームを有する細胞のパーセンテージ(内在化特徴(Internalization feature)により算出)を挿入表に示す。内在化特徴で２千イベントを分析した。
【００６４】
図６ LCL1由来エキソソームとＢ細胞との間の結合は、温度非依存性である。PBMCを、DC、EBV形質転換Ｂ細胞又は母乳に由来するPKH67標識エキソソームと、37℃又は４℃で１又は４時間インキュベートし、図１に記載したように分析した。バーは、HLA-DR+細胞の各亜集団内でのエキソソーム陽性細胞(フローサイトメトリによりPKH67+シグナルとして測定)のパーセンテージを表す。３人の異なるドナーからのPBMCについての平均及びs.d.を示す。
【００６５】
図７ Ｂ細胞とEBV形質転換Ｂ細胞由来エキソソームとの間の相互作用は、CD21とgp350との間の相互作用によって媒介される。PBMC培養物を、抗CD21、抗CD18又はアイソタイプ適合コントロール(20μg/ml)で処理した後、LCL1-エキソソーム(Ａ)又はBJAB-エキソソーム(Ｂ)を４時間添加した。(Ｃ)LCL1-エキソソームを72A1マウスハイブリドーマからの抗gp350上清(総容量の30％)、抗CD23(30μg/ml)又はアイソタイプ適合コントロールとプレインキュベートし、次いで精製Ｂ細胞に４時間添加した。代表的なフローサイトメトリドットプロット(パーセンテージ数を含む)により、アイソタイプコントロール(上)又は抗gp350 mAb(下)で処理したＢ細胞とのLCL1-エキソソームの結合が示される。分析は図１に記載したように行った。３人の異なるドナーからのPBMCについての平均及びs.d.を示す(Ａ〜Ｃ)。(Ｄ)フローサイトメトリヒストグラムは、gp350の細胞外発現及び細胞内発現を、BJAB細胞(グレー)とLCL1細胞(黒線)とを比較して示す。１万の細胞を分析した。(Ｅ)LCL1エキソソーム調製物及びBJABエキソソーム調製物からのスクロースグラジエント画分のペレットを、LMP1、gp350、CD81及びHLA-DRに対するAbを用いるイムノブロットで分析した(下パネル)。各画分の密度を屈折率測定により決定した。３つの実験のうちの代表的実験を示す。
【００６６】
図８ エキソソームシグナルはエキソソームに由来し、ビリオンに由来しない。(Ａ)エキソソーム調製物中の感染性EBVの存在を調べるために、10 000×ｇペレット並びにBJAB及びLCL1の上清(SN)からのエキソソーム調製物(100 000×ｇ)を臍帯血単核細胞(CBMC)に添加し、33日後にLCLの増殖を3H-チミジン組込みによりモニターした。EBV産生性B95-8細胞からの上清を陽性コントロールとし、細胞培養培地単独を陰性コントロールとした。３つの異なるBJAB及びLCL1上清調製物からの10 000×ｇペレットを１人のCBMCドナーで試験した。５つの異なるBJAB及びLCL1エキソソーム調製物を５人の異なるCBMCドナーで試験し、平均値で示した。(Ｂ)Ｂ細胞表面に結合したエキソソームの代表的画像。(Ｃ)TEM画像は、ネガティブ染色により、プロセシングされたLCL1エキソソーム調製物を示す。(Ｂ及びＣ中の)矢印はエキソソームを示す。(Ｄ)免疫EMにおいて、CD63(矢印１)及びHLA-DR(矢印２)に対するmAbをLCL1エキソソーム調製物に添加し、金接合二次Ab(それぞれ10nm及び15nm)により検出した。(Ｅ)LCL1-エキソソーム、BJAB-エキソソーム及びEBVからの調製物中の粒子サイズ分布のNanoSight測定。データは平均値(ｎ＝３)として示し、サイズ比較のために１に規格化した。
【００６７】
図９ エキソソームは、OVAパルスした骨髄DC培養物の上清から調製した(OVAExo)。OVAExo上にC3dを連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。C3d連結Ovaエキソソームを抗CD9ラテックスビーズと一晩インキュベートした。次いで、エキソソームを、それぞれPE又はFITCに接合した(Ａ)抗MHCクラスII又は(Ｂ)抗C3d抗体で標識し、FACSにより分析した。
【００６８】
図10 エキソソームは、OVAパルスした骨髄DC培養物の上清から調製した(OVAExo)。OVAExo上にC3dを連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。インビトロ増殖アッセイのために、OVA TCRトランスジェニック脾臓細胞(DO11.10)をcfseで標識し、OVAExo又はC3dOVAExoと５日間37℃にてインキュベートした。増殖細胞中のCfse希釈をフローサイトメトリにより分析した。結果を総脾臓細胞の％増殖細胞として示す。
【００６９】
図11 エキソソームは、OVAパルスした骨髄DC培養物の上清から調製した(OVAExo)。OVAExo上にC3dを連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。BALB/cマウスに25マイクログラムのOVAexo又はC3dOVAExoを注射し、３日後に脾臓細胞をFACSで分析した。
図12 OVAExo上にC3dと連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。DO11.10 OVAトランスジェニック脾臓細胞をBALB/cマウスに養子移入し、続いて翌日25マイクログラムのOVAexo又はC3dOVAExoを注射し、３日後に脾臓細胞をFACSで分析した。
【００７０】
図13 CFSE標識OT-I脾臓細胞を野生型C57BL/6マウスに移入し、続いて翌日、OVA間接搭載エキソソーム(Exo-OVA)又はCD8 OVAペプチド直接搭載エキソソーム(Exo-SIIN)又はコントロール(Exo-BSA)を注射した。５日後、脾臓細胞をCFSE希釈について、OVA特異的CD8+細胞の増殖についてのFACSによって分析した。
図14 図14Aは、マウスにおける免疫スケジュールを説明する。Ｔ細胞をマウスに注射し、その１日後エキソソームを投与し、その４日後に免疫応答を測定する。図14Bは、直接搭載エキソソーム(Pep-Exo)、間接搭載エキソソーム(OVA-exo)、未搭載エキソソーム(Exo)を用いた免疫応答を示す。PBSはバックグランドである。KJ1-26は、DO11.10tg TCRを特異的に認識するモノクローナル抗体である。
【実施例】
【００７１】
下記の実験の節では、指針として例示的な実施例を提供する。これら実施例は、如何様にしても、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００７２】
実験の節
エキソソームと天然型Ｂ細胞及び末梢血単核細胞との相互作用
エキソソームは、ヒトエプスタイン・バーウイルス形質転換Ｂ細胞株(EBTB細胞株)及びEBV-バーキットリンパ腫細胞株(BJAB細胞株)の培養上清から単離した。エキソソームを、天然型Ｂ細胞(図1a、1b)及びPBMC培養物中の異なる細胞(図2a、2b)に対する接着に関して比較した。エキソソームを、膜一般の色素PKH67(Morelli A Eら，Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood 2004, 104: 3257-3266で直接染色した。PKH67での染色後もエキソソームが構造を保持しているかを調べるために、PKH67を磁性抗MHCクラスIIビーズに結合させた(Clayton, Aら，Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. J Immunol Methods 2001, 247: 163-174)。フローサイトメトリ分析により、緑色蛍光MHCクラスII含有ベシクルがビーズに捕獲されたことが示され、透過型電子顕微鏡観察(TEM)で、インタクトな脂質二重層を有するナノベシクルが表示された。このことは、PKH67標識がエキソソームの形態と干渉しなかったことを示している。次いで、異なるエキソソームを天然型Ｂ細胞又はヒトPBMCと共に４時間インキュベートし、多色フローサイトメトリにより分析した。抗CD18又は抗CD21(20μg/ml)での天然型Ｂ細胞の処理を、エキソソームとのインキュベーションに先行させた。サンプルあたり１万細胞を分析した。
【００７３】
Ｂ細胞エキソソームとＢ細胞との間の相互作用は、大部分がエネルギー非依存性であり、したがって接着分子又は表面レセプターにより媒介されている可能性がより高い。EBTBエキソソームはＢ細胞レセプターを発現し、これが異なるパターンの接着分子、例えばICAM-1及びインテグリン(Clayton Aら，Adhesion and signaling by B cell-derived exosomes: the role of integrins. Faseb J 2004, 18: 977-979)と共に、EBTBエキソソームの観察された強力なＢ細胞嗜好性を媒介している可能性がある。しかし、この接着効果は、或いは又は追加的に、EBTBエキソソーム表面に発現した、EBV形質転換によりアップレギュレートされた記憶性(reminiscent)EBVタンパク質又は他のタンパク質により媒介されている可能性もある。
【００７４】
EBTBエキソソームのＢ細胞標的化が他のＢ細胞エキソソームのものと類似しているのか又はEBTBエキソソームに特異的であるのか(gp350の関与の可能性)を調べるために、EBTBエキソソームのＢ細胞結合能を、EBV-バーキットリンパ腫Ｂ細胞株BJAB27からのエキソソーム(BJABエキソソーム)のものと比較した。BJABエキソソームは、EBTBエキソソームと比較して、天然型Ｂ細胞に対して遥かにより小さな程度で結合することが見出された。このことはこの結合へのEBVの関与を示唆する(図３)。結合の特異性を明らかにするために、抗CD21によるCD21のブロッキングを試みた。抗CD21はEBTBエキソソームと天然型Ｂ細胞との間の相互作用を効率的にブロックすることが見出された。このことは、Ｂ細胞とEBTBエキソソームとの間の結合が天然型Ｂ細胞上のレセプターCD21とEBTBエキソソーム上のリガンド(恐らくはgp350又はCD23)との間の相互作用により引き起こされることを示唆する。この結合におけるLFA-I(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)及びp150,95(CD11c/CD18)のようなインテグリンの更なる関与を排除するために、これらインテグリンを抗CD18によりブロックした。しかし、図３から明らかなように、このブロッキングは、EBTBエキソソームと天然型Ｂ細胞との間の相互作用に影響しない。よって、CD21がＢ細胞/Ｂ細胞エキソソームの結合に必須でありそうである。
【００７５】
EBV粒子がEBTB細胞株に存在する可能性、よってEBV粒子がエキソソーム調製物に混入し得るリスクを、Ｂ細胞に結合したPKH67染色ベシクルが確かにエキソソームであり、EBV粒子でないことを確かめることにより排除した。EBV+ Ｂ細胞からのエキソソーム調製物及びエキソソームとＢ細胞との共培養物からのサンプルを、TEMにより注意深く検査した。ウイルス粒子はエキソソーム中にも、Ｂ細胞上にも検出できなかった(データは示さず)。
【００７６】
異なる細胞タイプがその起源の細胞を反映する表現型を有するエキソソームを産生することは公知である一方で、異なる細胞タイプからのエキソソームが細胞の標的化においてどのように異なるのかという疑問は未解明のままであった。起源とは無関係に、天然型エキソソームは、ヒト末梢血中に同じ主標的、すなわちHLA-DR+CD14+細胞を有するようである(天然型エキソソームはこの細胞によって能動的に貪食されるようである)ことが見出された。しかし、EBTBエキソソームは、特異性をHLA-DR+CD14+細胞から天然型Ｂ細胞に変化させたエキソソームを産生することが見出された。このことは、EBV- Ｂ細胞株であるBJAB細胞株からのエキソソーム(BJABエキソソーム)をEBV+ Ｂ細胞株であるEBTB細胞株からのエキソソーム(EBTBエキソソーム)と比較することによって証明された。EBTBエキソソームと天然型Ｂ細胞との間の高い相互作用は、抗CD21により効率的にブロックすることができたが、抗CD18ではブロックすることができなかった。標的されたＢ細胞とのこの新規な連絡機序は、EBV感染個体におけるインビボ状況をも反映する可能性がある。これは、EBVに対する長期免疫保護における重要な役割を有する可能性がある。
【００７７】
方法
エキソソーム供給源。カロリンスカ大学病院の血液バンクにある健常血液ドナーからのバフィーコートを、末梢血単核細胞(PBMC)のFicoll Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)分離に使用した。エプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換Ｂ細胞株は、ウィーン医科大学(Vienna, Austria)のBarbara Bohle博士の厚意により寄贈されたものであった。EBV陰性リンパ腫Ｂ細胞株BJABは、カロリンスカ研究所のMichael Karlssonの厚意により寄贈されたものであった。
エキソソーム単離。エキソソームは、細胞培養上清(Ｂ細胞株)から差分遠心分離を用いて単離した。すなわち、300×ｇにて10分間から始めて細胞を除去し、続いて3,000×ｇにて20分間、次いで10,000×ｇにて30分間、４℃で超遠心分離(Ti45 rotor in Optima L-100 XP Ultra centrifuge, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)して上清から可能性のある細胞残渣を涸渇させた。100,000×ｇで70分間の超遠心分離によりエキソソームをペレット化し、その後PBS中で洗浄し、最終の超遠心分離を繰り返した。最終の洗浄直後にペレット化エキソソームを小量のPBS中に再懸濁し、BioRad Dcアッセイ(BioRad, Hercules, CA, USA)を製造業者のプロトコルに従って用いてタンパク質濃度を決定した。４つのエキソソーム供給源の各々から同量のタンパク質を使用した。
【００７８】
末梢血単核細胞とエキソソームとの同時インキュベーション。健常血液ドナーからのバフィーコートを新鮮な単離PBMCの供給源として使用した。細胞は、製造業者の指示に従ってFicoll Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech AB)で単離した。ACK溶解緩衝液(0.15Ｍ NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA、pH7.2)を５分間使用して、残存する赤血球を溶解させた。PBMCを、６mlチューブにおいて、CCM中、PKH67+エキソソームと10μg/５×105細胞で37℃にて４時間インキュベートした。幾つかの実験は４℃で行った。
【００７９】
エキソソーム染色。エキソソームを、膜一般の標識のために緑色蛍光色素PKH67(Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)を用いて染色した。100,000×ｇにて70分間の遠心分離(NVT90 rotor, Beckman Coulter)によりエキソソームをPBSから希釈剤Ｃ(Sigma)溶液中に移した。PKH67染色液は、エキソソームサンプル(希釈剤Ｃ中300μg/mL)と同量の４μMの２×ストックに希釈し、このストックを小さな0.2μmシリンジフィルター中で濾過して、この染色液により形成されている可能性のある凝集物を除去した。次いで、エキソソームサンプルを、0.2nmシリンジフィルターに通して、PKH67ストック溶液と1:1で混合し、RTで５分間染色した。その後、１％ BSAで１分間停止させた。次いで、エキソソームをCCMで洗浄し、上記のようにNVT90ローターで遠心分離した。ペレットを注意深くリンスして未結合PKH67染色液を除去した。予備的な顕微鏡分析により、エキソソームが染色後凝集物を形成した(データは示さず)ので、CCM中に再懸濁し、小容量0.2μmシリンジフィルターで濾過した直後に細胞に添加した。コントロールとして、同濃度のPKH67を並行して遠心分離し、可能性のあるペレット化未結合染色液についてのバックグランドコントロールを作成した。
【００８０】
PKH67染色エキソソームとPBMCとの同時培養。予め濾過したPKH67染色エキソソームを、１時間及び４時間37℃にて、温度研究の間には４℃にても、PBMCに添加した。10μgのエキソソーム/５×105 PBMCを添加した。バックグランドコントロールとして、並行して遠心分離したPKH67色素ペレットを使用した。
【００８１】
透過型電子顕微鏡観察(TEM)。抗HLAクラスII磁性ビーズでエキソソームを捕獲した(Clayton, Aら，Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. J Immunol Methods 2001, 247: 163-174)。ビーズを、0.1Ｍスクロース及び３mM CaCl2を含有する0.1Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中２％のグルタルアルデヒドで４℃にて一晩固定し、遠心分離してペレットにした。ペレットを、３mM CaCl2を含有する0.15Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中でリンスし、続いて1.5mM CaCl2を含有する0.07Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中２％の四酸化オスニウムで４℃にて２時間、後固定し、エタノール中続いてアセトン中で脱水し、LX-112(Ladd, Burlington, Vermont, USA)中に包埋した。切片を酢酸ウラニルで、続いてクエン酸鉛で対比染色し、Tecnai 10透過型電子顕微鏡(Fei, Acht, The Netherlands)で80kVにて検査した。Mega View IIIデジタルカメラ(Soft Imaging System, GmbH, Munster, Germany)によりデジタル画像を得た。
【００８２】
フローサイトメトリ。２つの異なるマウスモノクローナル(m)Abパネルを使用してPBMCを染色した：「APC」抗HLA-DR(MHCクラスII)PECy5、抗CD14-PE及び抗CD19パシフィックブルー(又はPE-テキサスレッド)と、「Ｔ細胞」抗CD8 APC(又はPECy5)、抗CD4 PE及びCD3パシフィックブルー(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)。ゲーティングは、先ず、FSC/SSCでリンパ球/単球について行った。パネルAPCについては、、HLA-DR+CD14+及びHLA-DR+CD14-集団を先ずゲート通過させた。次いで、HLA-DR+CD14-細胞のうち、CD19+細胞をゲート通過させた。Ｔ細胞パネルについては、リンパ球/単球ゲートから直接、CD3+CD4+ 対 CD3+CD8+として集団を選択した。各亜集団については、対応するPKH67+ゲートを、エキソソームなしサンプルについて設定した。サンプルをFACS Ariaフローサイトメータ(BD Biosciences)に流した。各個体からのデータ収集の前に単一染色細胞の補償コントロールを行なった。補償は、獲得データの分析に使用したFACS Diva(BD Biosciences)ソフトウェアにより自動的に算出した。リンパ球/単球ゲートにおいて、サンプルあたり10,000イベントを収集した。
【００８３】
共焦点レーザ走査顕微鏡観察(CLSM)。PKH67+エキソソームとの４℃又は37℃での４時間のインキュベーション後、PBMCを４％ホルムアルデヒドで15分間固定した。染色は、抗CD3、抗CD14又は抗CD19 mAb(BD Biosciences)のいずれかを製造業者の指示に従って用いて行い、続いてPBSで洗浄した。Alexa Fluor 546で標識した二次ヤギ抗マウスmAb(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)を検出に使用した。サイトスピン(cytospin)後、90％グリセロールを用いてスライドにマウントした。１つのアルゴンレーザ及び２つのHeNeレーザを備えたCLSM(TCS SP2；Leica Microsystems, Mannheim, Germany)で蛍光画像を得た。PKH67を488nmレーザ線で励起し、490〜530nmの波長範囲で光を検出した。Alexa 546は543nmレーザ線で励起し、580〜700nmの範囲で光検出を行った。
【００８４】
ImageStream分析。エキソソームを染色し、フローサイトメトリ用に上記のようにPBMCとインキュベートした。細胞をImageStream(登録商標)マルチスペクトルイメージングフローサイトメータに流し、IDEAS(登録商標)画像分析ソフトウェア(Amnis Corporation, Seattle, WA, USA)を用いて画像を分析した。各サンプルにおいて10 000イベントを収集し、単一染色補償コントロールを使用して、ピクセルごとを基準にしてチャンネル画像間の蛍光を補償した。FACSの原理に従ってゲーティングを行った。内在化特徴を用いてPKH67蛍光の細胞内位置を測定した。内在化特徴は、細胞全体の強度に対する細胞内強度の比として規定される。スコアが高いほど、細胞内の強度集積が大きくなる。細胞の内部は、細胞膜にフィットするマスクの侵食(erosion)により定義される。この特徴は細胞サイズに対して不変であり、高密度の輝く領域及び小さな薄暗いスポットに対応する(accommodate)ことができる。ダイナミックレンジを[-inf, inf]間の値にまで増大させるために、比をログスケールにマッピングする。主に内部蛍光を有する細胞は正のスコアを有し、内在化をほとんど示さない細胞は負のスコアを有する。
【００８５】
ブロッキングアッセイ。PBMC(106/ml)を、CD18に対するmAb(クローンMEM48)、CD21に対するmAb(クローンB-E5)又はアイソタイプ適合Ab(20μg/ml；Nordic BioSite, Taby, Sweden)のいずれかと細胞培養培地中30分間、RTにてインキュベートし、その後、PBSで洗浄した後、エキソソームを10μg/５×105細胞で37℃にて１又は４時間添加した。FACS分析を前記のように実施した。LCL1-エキソソームを、抗CD23(クローン9P25、30μg/ml Beckman Coulter)又はgp350/250中和化mAb 72A1(DSMZ, Braunschweig, Germany)を産生するマウスハイブリドーマ培養物からの上清(総容量の30％)で処理した。無関係のアイソタイプコントロール又はハイブリドーマ上清をコントロールとして使用した。RTの細胞培養培地中で30分後、前処理したLCL1-エキソソームをＢ細胞に４時間添加した(10μg/2.5×105細胞)後、FACS分析を行った。Ｂ細胞は、Ｂ細胞単離キットII(Miltenyi Biotech)を用いて、PBMCから単離した。
【００８６】
細胞内フローサイトメトリ染色。LCL1-及びBJAB細胞(５×104)を４％ホルムアルデヒドで５分間RTにて固定した。PBSでの３回の洗浄工程後、細胞を10分間、１％サポニン溶液中RTにてインキュベートした。RTのマウスハイブリドーマ培養物からの上清を１時間添加することにより、gp350/250に対する一次mAb 72A1で細胞を染色した。0.1％サポニン溶液での２回の洗浄工程後、細胞を二次Alexa Fluor 488(Invitrogen, CA, USA)Abと45分間RTにてインキュベートし、洗浄してフローサイトメトリにより分析した。
【００８７】
スクロースグラジエント。エキソソーム調製物の画分を、以前(５)に記載されたようにスクロースグラジエントにより収集した。これらは、フローサイトメトリ分析のためには抗MHCクラスII Dynaビーズ(Dynal, Oslo, Norway)に直接搭載し、イムノブロット分析のためには200 000×ｇで35分間４℃にての遠心分離によりペレット化した。
【００８８】
イムノブロット分析。各ペレット化エキソソーム画分をSDS-PAGE(12％)により分離し、ポリビニリデンジフルオリドメンブレン(Millipore, MA, USA)に移した。膜を、LMP1に対するmAb(クローンCS. 1.4；DakoCytomation)、gp350に対するmAb(クローン2L10, Millipore, MA, USA)、CD81に対するmAb(クローンH-121, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)又はHLA-DRに対するmAb(クローンTAL.1B5, DakoCytomation, Glostrup, Denmark)で製造業者の指示に従って染色した。ECLアドバンスウェスタンブロッティング検出キットでメンブレンを可視化し、Hyperfilms(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)に露光した。
【００８９】
臍帯血形質転換アッセイ。現地の倫理委員会の承認を得てカロリンスカ大学病院から得たヘパリン処理臍帯血サンプルを、Ficoll Paque密度遠心分離に供した。百万の臍帯血単核細胞(CBMC)を、湿潤インキュベータ(37℃、５％ CO2)中で、BJAB若しくはLCL1上清からの10 000×ｇペレットと又は24μgのBJAB若しくはLCL1エキソソーム調製物と1.5時間インキュベートした。CBMCを洗浄し、完全RPMI中に106細胞/mLで再懸濁し、96ウェルプレートに５連で２×105細胞/ウェル/200μLにて播種した。EBV誘導細胞形質転換の陽性コントロールとして、CBMCをB95-8ウイルス含有上清に曝露した。培養培地を陰性コントロールとした。CBMCに毎週新鮮な培地を供給した。33日目に、形質転換を、典型的な細胞凝集物の出現及びチミジン組込みアッセイにより視覚的に記録した。１μCiの3H-チミジン(GE Healthcare)を培養物に添加し、16時間インキュベートした。CBMCをグラスファイバーフィルター上に採集し、シンチレーションカウンター(1205 Betaplate, Wallac)で放射能を測定した。
【００９０】
NanoSight。高速ビデオキャプチャ及び粒子追跡ソフトウェア(NanoSight Ltd., Amesbury, UK)を備えたNanoSight(登録商標)LM10システムを用いてブラウン運動の速度を測定することによって、エキソソーム調製物内でのサイズ分布を分析した。コントロールとして使用したEBV(B95-8株)は、Kerstin Falk博士(カロリンスカ研究所、微生物・腫瘍・細胞生物学部門)の厚意により寄贈されたものであった。NanoSightでの分析の前に、EBVを56℃で20分間熱不活化した。
【００９１】
統計分析。対応のある対のWilcoxon検定を使用し、GraphPad Prismソフトウェアバージョン4.03を用いて群間の差を比較した。0.05未満のＰ値を有意と見なした。
【００９２】
EBV感染Ｂ細胞株の作製。Ｂ細胞を含んでなる単核細胞懸濁物は、本発明の方法による処置のために選択したメラノーマガン患者又は免疫学的に匹敵するドナーから取得した末梢血(50ml)から単離した。EBV感染Ｂ細胞株(EBTB細胞株)は、この懸濁物から、Tosato及びCohen(Curr Protoc Immunol 2007, 7.22.1-7.22.4)より考案されたプロトコルに従って調製した。
【００９３】
EBTBエキソソームの単離。EBTBエキソソームは、EBTB細胞株から、基本的には天然型Ｂ細胞からのエキソソームについて上記したように単離した。
【００９４】
EBTBエキソソーム搭載。N Chaputら(Exosomes as potent cell-free peptide-based vaccine. II. Exosomes in CpG adjuvants efficiently prime native Tc1 lymphocytes leading to tumor rejection. J immunol 2004, 172:2137-2146)及びD H Hsuら(Exosomes as a tumor vaccine enhancing potency through direct loading of antigenic peptides. J Immunol 2003, 26:2137-2364)の方法を適合させることにより、単離したEBTBエキソソームにMHCクラスＩ及びIIペプチド又はガン抗原ペプチドを搭載した。
【００９５】
抗原搭載ETBTエキソソームの精製。抗原搭載EBTBエキソソームは、B. Escudierら(Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic (DC) derived-exosomes: results of the first phase I clinical trial. J Translat Med 2005, 3:10)の方法により精製した。
【００９６】
インビトロでCD40/IL-4刺激したＢ細胞株エキソソーム。カロリンスカ大学病院の血液バンクの健常血液ドナーからのバフィーコートを、末梢血単核細胞(PBMC)のFicoll Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)分離に使用した。３つの並行する約１・105 PBMCの培養物を各々樹立し、Wiesnerら(前出)のプロトコルに従って刺激した。この細胞株の２つは70日間維持された一方、３つめの細胞株は約３週間後に増殖が停止した。２つの長期CD40刺激Ｂ細胞株は、EBV感染リンパ芽球及びその他の細胞タイプを含まないことが見出された。エキソソームは、２つのうちの１つの細胞培養物の上清から、ETBTエキソソームについて上記したものと同じ様式で単離した。単離エキソソームに腫瘍抗原を搭載し、ETBTエキソソームについて上記したように精製した。
【００９７】
結果
ヒトDC及び母乳に由来するエキソソームは単球を標的する一方、LCL1エキソソームはＢ細胞を好む
免疫細胞への異なるエキソソームの結合を解明するために、本発明者らは、ヒト単球由来DC、EBV形質転換リンパ芽球様Ｂ細胞株(LCL1)及びヒト母乳から単離したエキソソームをPBMCへの接着に関して比較した。エキソソームを、フローサイトメトリにより検出可能である緑色蛍光膜色素PKH67で染色した。エキソソームが適切に標識されているかどうか及びPKH67での染色後に構造が保持されていることを調べるために、エキソソームを磁性抗MHCクラスIIビーズに結合した。フローサイトメトリ分析により、緑色蛍光MHCクラスII含有ベシクルがビーズに捕獲されたことが示され、TEMで、インタクトな脂質二重層を有するナノベシクルが表示された。このことは、PKH67標識がエキソソームの形態と干渉しなかったことを示す。次いで、異なるエキソソームをPBMCと１時間又は４時間インキュベートし、多色フローサイトメトリにより分析して、細胞へのエキソソームの結合パターンを解明した。１時間後、DC由来エキソソームは、主に、単球(HLA-DR+CD14+；平均46％)と相互作用する一方、17％のみがＢ細胞(HLA-DR+CD14-CD19+)に結合した(図4A)。対照的に、LCL1エキソソームは、Ｂ細胞に関して強力な嗜好性を有する逆の結合パターンを示した。Ｂ細胞の63％がLCL1エキソソームについて陽性であった一方で、平均で僅かに17％の単球が１時間でこれらエキソソームと結合した(図4B)。４時間のインキュベーション後、各細胞集団内のエキソソーム陽性細胞のパーセンテージは概して増加したが、異なる細胞集団に対する異なる結合パターンは残っていた(図4D〜F)。乳エキソソーム相互作用は、１時間のインキュベーション後で概して低かった(図4C)。しかし、４時間では、単球の55％及びＢ細胞の18％が乳エキソソームと結合し(図4C)、DCエキソソームの１時間でのパターンと似ていた。以前に、本発明者らは、乳エキソソーム調製物は、エキソソームベシクルの含有量がエキソソームペレット中の総タンパク質量に関して他のエキソソームタイプからのペレットと比較して低いことを見出している。したがって、乳エキソソームの量を５倍(50μg/５×105 PBMC)に増やすと、１時間での乳エキソソーム相互作用のレベルは単球とは平均64％に、Ｂ細胞とは平均26％に達する(ｎ＝３、データは示さず)。これらは、DCエキソソームと10μg/５×105 PBMCでインキュベートしたときに１時間で観察されるものに匹敵するレベルである。このことは、他のエキソソーム調製物と比較して、乳エキソソーム調製物の非エキソソームタンパク質量が高いことを示唆している。
【００９８】
Ｔ細胞はPBMCの多数を構成する(本発明者らの研究では、およそ70％)が、CD4+又はCD8+Ｔ細胞の８％未満が４時間後にいずれかのエキソソームとの結合を示した(図４)。異なるエキソソームタイプで、CD8+ Ｔ細胞と比較して、CD4+ Ｔ細胞への嗜好性に一貫した差は観察されなかった。
【００９９】
エキソソームは、主に、Ｂ細胞の細胞膜に結合するが、単球によって内在化される
次に、本発明者らは、異なる細胞タイプ内でエキソソームが何処に局在するかを調べた。本発明者らは、PKH67標識エキソソームをPBMCとインキュベートし、エキソソーム結合を共焦点レーザ走査顕微鏡観察(CLSM)により分析した。おそらくはフローサイトメトリと比較して低いCLSMの検出レベルに起因して、１時間では、概して、細胞に関連したエキソソームシグナルは検出できなかったか又は弱いシグナルしか検出できなかった(データは示さず)。４時間後、DCエキソソームは、主に、単球(CD14+)により内在化され、Ｂ細胞(CD19+)ではより少ない程度であり、Ｂ細胞は、多くの場合で、細胞膜結合エキソソームを有していた(図5A)。対照的に、LCL1エキソソームはＢ細胞と、より高い程度に相互作用し、主に細胞膜に局在していた(図5B)。単球は、LCL1 Ｂ細胞エキソソームに関して、より弱いシグナルを示した(図5B)。一般には、乳エキソソームは、フローサイトメトリで観察されたように、弱いシグナルを示し、単球中に内在化されているか又はＢ細胞の細胞膜に結合しているものとして検出された(図5C)。エキソソームとCD3+ Ｔ細胞との間の相互作用が生じた少数例(ほぼ50細胞中１例)で、エキソソームは、主に、細胞膜の近傍又は細胞膜に接触して局在した(データは示さず)。よって、これらCLSMデータは、本発明者らのフローサイトメトリデータと一致している。このことは、EBV形質転換Ｂ細胞からのエキソソームが優先的にはＢ細胞を標的する一方、DC由来エキソソームはより多くが単球と結合することを示す。しかし、これら結果はまた、エキソソームが異なる細胞タイプと異なって相互作用し、エキソソームはほとんどがＢ細胞及びＴ細胞の細胞膜に結合し続けるが、単球によって内在化されることを示唆する。
【０１００】
別の技術アプローチによって異なるエキソソームの免疫細胞との結合及び免疫細胞での内在化を検証するために、本発明者らは、ImageStreamシステムを調べることにした。このシステムは、フローセルを非常に高速で通過する各細胞のマルチスペクトル画像を自動的に取得する、フローサイトメータと蛍光顕微鏡との組合せシステムであり、これにより、サンプルあたり多くの細胞を画像ベース分析することが可能になる。内在化特徴を用いて、本発明者らは、表面に結合したエキソソーム、内在化したエキソソーム又はその両方(中間)を有する単球(HLA-DR+CD14+)を区別した(図5D)。技術的理由のために、Ｂ細胞データは取得しなかったが、得られた単球データは、本発明者らの従来のフローサイトメトリ及びCLSMのデータと一致した。ImageStreamにより、DC及び乳エキソソームは優先的には単球と結合する一方、LCL1エキソソームは結合しないことが示された(図5E)。更に、単球の多数が種々のエキソソームを内在化することが観察され、このことによって本発明者らの以前の知見が補強された(図5E)。よって、本発明者らはまた、この方法は、多数の細胞中のエキソソーム局在を定量することができることを示す。
【０１０１】
LCL1由来エキソソームとＢ細胞との間の結合は温度非依存性である
異なるエキソソームのPBMCとの結合がレセプターに媒介されているのか又は能動的内在化に依存しているのかを調べるために、本発明者らは、PKH67+エキソソームをPBMCと４℃及び37℃で同時培養した。３つの全てのエキソソームタイプについて、インキュベーションが４℃にて１時間及び４時間実施されたときは、単球との結合が減少した(図6A〜F)。このことは、この細胞タイプの能動的な(おそらく貪食による)取込みを示している。DCエキソソーム(図6A及びD)及び乳エキソソーム(図6C及びF)のＢ細胞との結合は、冷条件の間は同様に減少した。対照的に、LCL1エキソソームとＢ細胞との間の相互作用には、４℃にて両時点でほんの僅かな減少が観察された(図6B及びE)。よって、LCL1エキソソームとＢ細胞との間の相互作用は、大部分が温度非依存性であり、したがって接着分子又は表面レセプターにより媒介されている可能性がより高い。このため、本発明者らは、この相互作用を更に分析することを試みた。
【０１０２】
LCL1由来エキソソームとＢ細胞との間の結合はＢ細胞に発現するCD21に依存する
Ｂ細胞は、ヒト補体レセプター２(CD21)のような細胞表面レセプターを発現する。この細胞表面レセプターは、異なるパターンの接着分子、例えばICAM-1又はインテグリン(例えばLFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)又はp150,95(CD11c/CD18))と共に、Ｂ細胞エキソソームの観察された強力なＢ細胞嗜好性を媒介している可能性がある。エキソソーム結合の特異性を明らかにするために、エキソソームとのインキュベーション前に、CD21又はCD18に対するmAbをPBMCに添加した。LCL1エキソソームと末梢血Ｂ細胞との間の相互作用は、抗CD21により効率的にブロックすることができた一方、抗CD18 Abではブロッキング効果は観察されなかった(図7A)。
観察されたＢ細胞標的化がＢ細胞のEBV形質転換に依存性であるかどうかを解明するために、本発明者らは、EBV陰性Ｂ細胞株BJABからのエキソソームと比較した。結果は、BJABエキソソームが、Ｂ細胞にLCL1エキソソームと比較して10倍低い程度で結合することを示した。このことは、この結合にEBV由来又は誘導性のタンパク質が関与していることを示唆する(図7B)。まとめると、これらデータは、LCL1エキソソームとＢ細胞との間の結合がCD21との相互作用に依存性であり、LFA-1、Mac-1、p150,95のいずれとの相互作用にも依存しないことを示し、EBV形質転換Ｂ細胞に由来するエキソソームに特異的である選択的Ｂ細胞エキソソーム標的化を示唆している。
【０１０３】
LCL1-エキソソーム上のgp350はＢ細胞への結合を媒介する
次に、本発明者らは、Ｂ細胞上でCD21結合に関与するエキソソームのリガンドを解明することを目的とした。CD21に対する既知のリガンドとしては、IgEの低親和性レセプター(CD23)、EBVエンベロープ糖タンパク質gp350及び補体因子C3dが挙げられる。Ｂ細胞及びマクロファージから放出されたエキソソームはC3-フラグメントを含有することが示されているが、本発明者らの細胞培養物の全てで熱不活化胎仔ウシ血清(FCS)を使用したので、C3dが差を生じさせた可能性はない。CD23(EBV形質転換Ｂ細胞株に高度に発現する)は、LCL1エキソソームで検出されたが、BJABエキソソームでは検出されなかった。EBV糖タンパク質gp350は、Ｂ細胞へのウイルス付着に決定的に重要である溶解性タンパク質であるが、エキソソームに存在することはこれまでに示されていない。よって、gp350及びCD23が、エキソソーム-Ｂ細胞相互作用への関与の可能性について調べるべき最初の候補であった。。これらリガンドを、抗gp350/220 Ab又は抗CD23 Abのいずれかでブロックした。LCL1エキソソームのＢ細胞への結合は、gp350をブロックすると実質的に減少したが、興味深いことに、CD23をブロックしてもエキソソーム結合の減少は観察されなかった(図7C)。この観察は、LCL1エキソソームの表面にgp350が存在すること、及びこのEBVタンパク質がエキソソーム結合を媒介し、CD23はしないことを示唆している。コントロールとして、本発明者らはまた、非中和化抗gp350 mAb(2L10)を添加した。この抗体は、エキソソーム結合をブロックしなかった(データは示さず)。このことは、中和mAb(72A1)を介するgp350の特異的ブロッキングの概念を補強する。LCL1細胞におけるgp350の存在は、フローサイトメトリ分析により確証され(図7D)、エキソソームについては、イムノブロッティングにより、スクロースグラジエント中で、gp350はHLA-DR及びCD81と共に局在した(図7E)。これらマーカーはまた、一部が、EBVによりコードされる潜伏性膜タンパク質１(LMP1)(これは以前にエキソソーム上に見出されている)と共に局在した。予想されたように、gp350もLMP1もいずれもBJABエキソソーム中で検出されなかった(図7E)。
【０１０４】
エキソソームシグナルはエキソソームに由来し、ビリオンに由来しない
LCL1の細胞及びエキソソームの両方でのgp350の発現は、我々のLCL1細胞の幾つかがEBVライフサイクルの溶解ステージにある(これは、EBVが、EBV形質転換Ｂ細胞培養物中に遊離のウイルス粒子として存在する可能性も示す)のかという疑問を生じさせた。したがって、本発明者らの実験において、ビリオンがエキソソーム調製物に混入し、そのためにエキソソームに関する偽陽性シグナルを生じた可能性がある。予備実験で、本発明者らはPCRによりウイルスDNAを検出した。しかし、DNAの存在は、常に完全ビリオンの存在に対応するものではない。よって、エキソソーム調製物において、より高感度の臍帯血アッセイを使用して感染性EBVビリオンの存在を調べ、TEM及び免疫EM分析を使用してEBV粒子を検出した。10 000×ｇペレット(エキソソーム単離手順の間の中間遠心分離工程で取得)並びにBJAB及びLCL1上清からのエキソソーム調製物を臍帯血単核細胞(CBMC)に添加して、EBV形質転換初代Ｂ細胞の成長をモニターした(図8A)。十分に確立されたEBV産生性マーモセットＢリンパ芽球様細胞株(B95-8)からの上清を陽性コントロールとして使用した。BJAB上清からのプールした10 000×ｇペレットの添加は、3H-チミジン組込みにより定量したところ、LCLの成長を誘導しなかった。加えて、この培養物の目視検査によって、形質転換Ｂ細胞の典型的な凝集物は明らかにならなかった。対照的に、LCL1上清からのプールした10 000×ｇペレットのCBMCへの添加は、LCLの成長を誘導した。このことは、LCL1細胞による感染性ウイルス粒子の産生を示している。この知見は、観察したLCL1細胞上でのgp350の細胞表面発現と一致している(図7D)。このことは、LCL1細胞が溶解性のウイルス産生ステージにあることを示している。しかし、LCLの成長は、BJAB及びLCL1上清からのエキソソーム調製物(100 000×ｇ)のCBMCへの添加後には観察されなかった。このことは、本発明者らのLCL1エキソソーム調製物中には感染性EBVが存在しないことを示している。よって、LCL1により産生されるビリオンは全て、10 000×ｇの遠心分離工程の間に沈殿してペレット化する。加えて、本発明者らは、LCL1細胞からのエキソソーム調製物が、ヘルペスウイルスの一般的特徴である多形態EBV粒子を含有しているかどうかをTEM及び免疫EMで調べた。初代Ｂ細胞に付着したエキソソーム(図8B)及びエキソソーム調製物単独(図8C及びD)のいずれも、感染性EBVのサイズ(200nm)のEBV粒子も、裸の高密度ウイルスカプシドも示さなかった。およそ100nmのベシクルのみが観察され、多数がCD63及びHLA-DRで標識されていた。このことは、エキソソームであることを示している(図8C)。これら結果はまた、イムノブロットでの本発明者らの知見と一致しており、gp350はHLA-DR及びCD81とと共に局在していた(図7E)。ナノ粒子追跡分析(NTA；NanoSight)によりサイズ分布を更に調べた。この方法により、LCL1-及びBJAB-エキソソーム調製物内での、EBV(150nmを超えるピークを有する)と比較して小サイズ範囲(平均およそ100nmを有する)が定量的に確証された(図8E)。このことは、本発明者らのエキソソーム調製物中にビリオンが存在しないことを更に支持する。
【０１０５】
考察
異なる細胞タイプは、その起源の細胞を主として反映する表現型を有するエキソソームを産生することが知られている。ここで、本発明者らは、エキソソーム連絡経路の他の面に着目し、試験したエキソソーム(MDDC由来及び母乳由来の両方)がヒト末梢血中に同じ主標的(すなわち単球)を有するようであることを証明した。単球に達すると、エキソソームは、おそらくは貪食作用によって、能動的に飲み込まれるようである。貪食作用はまた、マクロファージのような他の貪食細胞によるエキソソーム取り込みの機序であることが最近証明されている。しかし、このことはまた、エキソソーム産生性細胞が病原体特異的分子を保有する場合には、標的単球に対するエキソソームの選択性が変化し得ることを示している。このことを、本発明者らは、本明細書中で、EBV陰性Ｂ細胞株(BJAB)からのエキソソームをEBV陽性Ｂ細胞株(LCL1)からのエキソソームと比較することによって証明した。LCL1由来エキソソームは、主として、Ｂ細胞を標的しているが、このことはBJABエキソソームについては観察されなかった。LCL1エキソソームとＢ細胞との間の相互作用は、Ｂ細胞についてはCD21に対するAbにより、エキソソームについてはgp350に対するAbによって効率的にブロックされたが、抗CD18及び抗CD23のいずれによってもブロックされなかった。このことはEBVの関与を証明している。CD23は、BJABと比較してLCL1上により豊富であるにもかかわらず、抗CD23が細胞-エキソソーム相互作用に対して効果を有さなかった理由は、gp350-CD21相互作用と比較して、CD23とCD21との間のより低親和性の相互作用に起因し得る。このことは、非常に高い分子親和性がインビトロでのエキソソームの迅速な(１時間)結合に必要とされることを示している(おそらくはインビボでは更により重要であろう)。
【０１０６】
DC及びＢ細胞のエキソソームは、例えばＴ細胞上に発現したLFA-1に結合する細胞内接着分子(ICAM)-1を表示することが知られているにもかかわらず、種々のエキソソームとＴ細胞との相互作用はむしろ低かった(エキソソームについての陽性Ｔ細胞の８％未満)。
LCL1エキソソーム上のgp350についての観察は、本発明者らのエキソソーム調製物中に感染性及び/又は多形態性EBV粒子(これがＢ細胞で観察されるPKH67シグナルを担っている可能性がある)が存在するかという疑問を生じさせた。CD21へのEBVの結合は十分に確立されている。高感度の臍帯血形質転換アッセイ及びTEM分析(図8B〜D)を使用して、本発明者らは、エキソソーム調製物中のビリオンに関する証拠を何ら見出さなかった。よって、このサンプルは遠心分離よってビリオンが除去されたようであり、したがってＢ細胞で観察される蛍光シグナルをビリオンが担っている可能性は少ないと考えられる。
【０１０７】
gp350保有エキソソームを介する標的されるＢ細胞の連絡についての本発明者らの新規な知見はまた、インビボ状況を反映している可能性があった。gp350保有エキソソームは、EBVの無症候性キャリアにおいて分泌され得る。本発明者らは、非感染Ｂ細胞へのエキソソームの結合が、EBV侵入レセプターCD21の遮断によりビリオン結合(したがって感染)の効率を低下させるという仮説を立てた。本研究で、本発明者らはまた、EBV形質転換Ｂ細胞が、EBV陰性Ｂ細胞と比較して、タンパク質濃度として測定されるエキソソームをより多く産生するようであるとの観察をした。このこともまた、多数のエキソソームがEBV感染の拡大を抑制するために寄与している可能性があるインビボ状況を反映し得る。或いは、エキソソーム産生の誘導及びgp350のエキソソーム発現は、EBVの免疫調整能に寄与し得る。
【０１０８】
本発明者らの知見はまた、細胞標的をＢ細胞に変更させる(このことが治療上の有用性を増強し得る)ために、エキソソームをどのように(例えばgp350の発現を誘導することにより)操作することができるかを示唆する。完全なＴ細胞応答の生成におけるＢ細胞の役割は、80年代に既に示唆された。更に、Ｂ細胞は、長期Ｔ細胞免疫の達成に特に重要である。最近、本発明者らは、エキソソームが、インビボで抗原特異的Ｔ細胞応答を生じるためには、活性化したＢ細胞のサポートを必要とすることを示した。したがって、ガンワクチンにおいてＢ細胞を標的することによって、寛容を破壊することができ、より長く持続するＴ細胞免疫が達成され得る。更に、CD21はＢ細胞だけでなく、濾胞性樹状細胞(FDC)によっても発現される。このことは、表面結合gp350を有するエキソソームはインビボでFDCをも標的し得、よって可能な免疫活性化及び免疫記憶をインビボで増強し得ることを示唆している。
【０１０９】
結論として、本発明者らは、母乳中に見出されるエキソソーム、ヒト単球由来DC及びEBV陰性Ｂ細胞株により産生されるエキソソームが、好ましくは、Ｂ細胞に結合しないことを示した。代わりに、これらは、乳及びDCのエキソソームについて証明されたように、主として、エキソソームを能動的に飲み込む単球を標的する。しかし、Ｂ細胞が溶解ステージのEBVを保有する場合、産生されたエキソソームは、嗜好性を単球からＢ細胞に変化させ、そのことにより、エキソソーム結合gp350は、Ｂ細胞上のEBV侵入レセプターCD21に結合する。EBV形質転換Ｂ細胞に由来するエキソソームは、EBV感染の間のＢ細胞によるウイルス取込みの減少に或る役割を有している可能性がある。更に、Ｂ細胞を標的するエキソソームは、細胞性及び体液性の両タイプの長期免疫応答の誘導に効率的である可能性があり、よってそれらは、ガン及び炎症性疾患の治療における可能性のあるツールとして考えられる。
【０１１０】
臨床プロトコル
抗原搭載ETBTエキソソーム又は抗原搭載DCエキソソーム又は抗原搭載CD40刺激Ｂ細胞エキソソームのガン患者への投与は、B Escudierら(前出)に記載されるように行うことができる。
【０１１１】
モデル研究
本発明によれば、エキソソーム上のEBV由来糖タンパク質gp350は、インビトロで、CD21を介してヒトＢ細胞を特異的に標的している。本発明の発明者らはまた、マウスモデルにおいて、Ｂ細胞活性化が強力なOVA(オボアルブミン)搭載エキソソーム誘導Ｔ細胞応答に必要であることを観察した。したがって、このモデル研究は、gp350を保有するエキソソームを用いCD21を介してＢ細胞を標的することが、インビトロ及びインビボで、Ｂ細胞活性化を容易にし、Ｔ細胞応答を誘導することができるかを試験することを目的とする。gp350は立体障害によりマウスCD21に結合しないので、マウスシステムでは代替モデルを使用する。
【０１１２】
C3dは、補体因子C3のプロテアーゼ耐性35kDaフラグメントであり、補体活性化の過程で生じる。研究により、Ｂ細胞上のCD21はC3dタグ化抗原に結合し、これがBCRとCD19との架橋を導くことによってＢ細胞活性化の閾値を減少させると共にシグナルの大きさを増幅させるので、C3dは分子アジュバントとして使用できることが示されている。CD21は、３コピーのC3dで人工的にタグ化されたモデル抗原を、未修飾抗原の最小免疫原性用量の0.001％の濃度で免疫原性にする。C3dの役割は下記のように要約することができる
・ C3dタグ付加により抗原をCD21(CR2)に標的付けることで、全てのＢ細胞及びFDCでAgプロセシング及びAg提示の増大を生じる
・ CD21とBCRとの間の架橋は、Ag特異的Ｂ細胞の完全な活性化を生じる
・ C3dタグ化抗原は、脾臓においてFDCにより捕獲され、長期間、細胞表面に結合したままであり、記憶Ｂ細胞を生じ、維持する
・ C3dは、抗原と多量体を形成することによって又はタンパク質キャリアとして作用することによって、抗原のインビボ寿命を増大させることができる。
【０１１３】
モデル研究の実験手順：
BMDC培養：
BMDC(骨髄樹状細胞)は、IL-4及び10％ GM-CSF馴化培地(Ag8653/X63クローン)の存在下に骨髄幹細胞から作製した。６日目、培養上清の50％を新鮮培地と交換した。エキソソームへのOVA搭載のために、300μgのOVAタンパク質を６日目のDC培養物に添加し、ONインキュベートし、続いて１回洗浄し、次いでLPSを培養物に添加した。48時間後、エキソソーム(OVAExo)を培養上清から超遠心分離により精製した。
【０１１４】
DC(樹状細胞)培養上清からのエキソソームの調製
培養上清を、3.000×ｇ続いて10.000×ｇの遠心分離に30分間付した。エキソソームを100.000×ｇで２時間ペレット化し、100.000×ｇで洗浄した。ペレット化エキソソームをPBSに溶解した。タンパク質含量をDCタンパク質アッセイ(Biorad)により測定した。
【０１１５】
FACSによるエキソソームの表現型分析
10マイクログラムのエキソソームを、予め抗CD9抗体を被覆した10μlのアルデヒド/硫酸ラテックスビーズとインキュベートし、室温(RT)にて一晩(ON)回転させた。１mlの100mMグリシン(Sigma)で反応を停止させた。エキソソームを有するビーズを、H-2Kd、CD9、CD54、CD80、CD81、CD86、C3dに特異的なFITC又はPE接合抗体(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)及び対応するアイソタイプ適合抗体のパネルで標識した。
【０１１６】
OVAExoへのC3d連結：
OVAExoへのC3d連結のために、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d-BS3含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化した。
【０１１７】
DO11.10 CD4+ Ｔ細胞の単離及びインビトロＴ細胞増殖アッセイ
DO11.10脾臓細胞を５μM CFSE(カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル)で15分間37℃にて染色した。冷PBS/10％ FCSの添加により標識化を停止した。次いで、細胞をPBS中で３回洗浄し、１×106細胞/mlの濃度でPep-Exo、OVA-Exo及びそれぞれのコントロールと共に培養し、続いて５％ CO2の湿潤インキュベーター中、37℃のインキュベーションを５日間行った。
【０１１８】
インビボＴ細胞増殖アッセイ
０日目に、DO11.10マウスからの脾臓細胞をBALB/cマウスにi.v.にて5.5×106細胞/マウスで養子移入した。１日目に、マウスをC3dOVAExo、OVAExo又はそれぞれのPBSコントロールでi.v.免疫した。４日目に、マウスを犠牲にし、脾臓細胞を抗CD3-APC抗体とOVA TCRに特異的な抗CD4-PE抗KJ1-26+-FITC抗体で染色し、KJ1-26+細胞の数をFACSにより評価した。リンパ球の早期活性化もまた、抗CD69及び抗CD25抗体を用いFACSにより検査した。
【０１１９】
ELISAによる血清抗体レベルの決定
特異的抗体応答を決定するため、マイクロタイタープレートを10μg/mlのOVAタンパク質で被覆し、ONインキュベートし、続いて血清の系列希釈物とONインキュベーションを行った。この反応性抗体のアイソタイプは、マウスμ及びγアイソタイプに特異的なアルカリホスファターゼ接合ヤギ免疫グロブリンと２時間RTにてインキュベートすることによって決定した。発色はp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを用いてRTで行い、吸光度はELISAリーダーにより種々の時点で405nmにて測定した。治療目的には、通常、プロセスあたりの産生エキソソームの量を、MHCクラスII分子の量に関して、吸着ELISAにより評価した。吸着ELISAアッセイにより、Raji細胞及び未成熟の７日目MDDCに結合したMHCクラスII分子の総数を算出することで、それぞれおよそ1.0及び5.5×106 MHCクラスII分子/細胞と評価された。炎症性刺激が樹状細胞上でのMHCクラスII複合体の蓄積を誘導する。GMPプロセスにより、約５×1014エキソソームMHCクラスII分子の採集が可能になった。
【０１２０】
結論
結論として、これら結果は、C3dに連結したエキソソームは、C3dを有さないエキソソームと比較して、マウスシステムにおいて、インビボで、天然型Ｂ細胞を介するＴ細胞応答の誘導に、より効率的であることを示している。このことは、ヒトにおいて、gp350発現エキソソーム(これはC3dと同じ分子を標的する)がまた、gp350を発現しないエキソソームと比較して、Ｂ細胞の抗原提示を介するＴ細胞応答の誘導に、より効率的であることを示唆している。
本発明及びその好適な実施形態の説明において言及した全ての先行技術文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１２１】
具体的実施形態において、本発明はまた以下の項目に関する：
１．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)単離したＢ細胞をエプスタイン・バーウイルス(EBV)に感染させること；
(ｄ)感染Ｂ細胞を潜伏期に形質転換すること；
(ｅ)EBV形質転換Ｂ細胞をガン抗原の存在下で培養すること；
(ｆ)EBV形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｇ)採集したエキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２２】
２．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)単離したＢ細胞をエプスタイン・バーウイルス(EBV)に感染させること；
(ｄ)感染Ｂ細胞を潜伏期に形質転換すること；
(ｅ)EBV形質転換Ｂ細胞を培養すること；
(ｆ)EBV形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｇ)採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、抗原搭載エキソソームを製造すること；
(ｈ)ガン抗原搭載エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２３】
３．エキソソーム上の潜伏性膜タンパク質１(LMP-1)を中和することを含んでなる項目１又は２の方法。
４．中和化剤がFab-フラグメント分子を含んでなる項目３の方法。
【０１２４】
５．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルから単球を単離すること；
(ｃ)単球を未成熟樹状細胞に培養すること；
(ｄ)未成熟樹状細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること;
(ｅ)改変未成熟樹状細胞をガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載成熟樹状細胞に形質転換させること；
(ｆ)成熟樹状細胞から放出されたガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを採集すること；
(ｇ)ガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２５】
６．CD21結合性タンパク質成分が下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１又は数個を含んでなる項目５の方法。
【０１２６】
７．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)Ｂ細胞を培養すること；
(ｄ)Ｂ細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること；
(ｅ)CD21結合性成分を発現する改変Ｂ細胞をガン抗原と接触させること；
(ｆ)ガン抗原に接触した改変Ｂ細胞から放出されたガン抗原搭載エキソソームを採集すること；
(ｇ)ガン抗原搭載Ｂ細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２７】
８．CD21結合性タンパク質部分が下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１又は数個を含んでなる項目７の方法。
【０１２８】
９．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)Ｂ細胞を培養すること；
(ｄ)Ｂ細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること；
(ｅ)CD21結合性成分を発現するＢ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｆ)採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、抗原搭載エキソソームを製造すること；
(ｇ)ガン抗原搭載Ｂ細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２９】
10．CD21結合性タンパク質成分が下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１又は数個を含んでなる項目９の方法。
11．下記：請求項１の工程(ａ)から工程(ｆ)まで；請求項２の工程(ａ)から工程(ｇ)まで；請求項５の工程(ａ)から工程(ｆ)まで；請求項７の工程(ａ)から工程(ｆ)まで；請求項９の工程(ａ)から工程(ｆ)までのいずれかを含んでなるガン抗原搭載エキソソームの製造方法。
12．項目11の方法により取得されたか又は取得可能であるエキソソーム。
【０１３０】
13．項目12のエキソソームを含んでなるガンワクチン。
14．項目12のエキソソームによりインビトロで刺激されたＴ細胞。
15．CD21結合性成分を含んでなるＢ細胞又は樹状細胞(DC)エキソソーム。
【０１３１】
16．CD21結合性成分がgp350；EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αから選択される項目15のエキソソーム。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えばＢ細胞又は樹状細胞に由来するエキソソームの使用により対象者において免疫調整性応答を誘起する方法及び手段に関する。本発明に従う方法により、エキソソームの使用に基づく患者におけるガンの治療が可能になる。より具体的には、本発明は、エキソソームにより、患者のガン性細胞上に提示される抗原に対する免疫応答を誘発させる方法に関する。本発明はまた、任意の組織移植の間の治療法で望ましくあり得る免疫応答の抑制のために、例えばＢ細胞に由来するエキソソームを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
毎年数百万人がガンに罹患する。過去数十年間にわたりガン治療に相当の進歩がなされているが、より良好な治療が未だ大いに必要とされている。
当該分野において、ガン治療での使用が証明されたか又は示唆された多数の化学物質及び生物学的物質(とりわけヒト起源のエキソソーム)が存在する。
【０００３】
エキソソームは、抗原も同時刺激性分子も保有することができるナノサイズのベシクルである。樹状細胞(DC)は、哺乳動物の免疫系に関係する、抗原をプロセッシングし抗原を提示する細胞である。抗原によって活性化された状態で、樹状細胞は、Ｂ細胞及びＴ細胞と相互作用して、養子免疫応答をトリガーする。最近十年間、樹状細胞(DC)由来エキソソームは、悪性疾患の治療について動物モデル及び臨床試験で試験されてきた。DC由来エキソソームは、Ｔ細胞活性化をインビトロ及びインビボで刺激し、マウスで腫瘍を根絶させることができる(Amigorena S, Anti-tumour immunotherapy using dendritic-cell-derived exosomes. Res Immunol 1998, 149(7-8): 661-662；Zitvogel Lら，Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: Dendritic cell-derived exosomes. Nat Med 1998, 4(5): 594-600)。種々の細胞タイプが、起源の細胞を反映する表現型を有するエキソソームを産生する(Johansson S Mら，Different types of in vitro generated human monocyte-derived dendritic cells release exosomes with distinct phenotypes. Immunology 2008, 123: 491-499；Seguraら，Mature dendritic cells secrete exosomes with strong ability to induce antigen-specific effector immune responses. Blood cell Mol Dis 2005, 35: 89-93)。現在の定説では、対応する細胞である樹状細胞が、ナイーブなＴ細胞の刺激において、Ｂ細胞と比べて効率的であるので、樹状細胞由来エキソソームがＢ細胞由来のものよりも好ましいと言われている。しかし、Ｂ細胞エキソソームは、今まで、これに関連して検討されたことがない。
【０００４】
完全なＴ細胞応答の生成におけるＢ細胞の役割が示唆されている(Ron Y及びSprent J, T Cell priming in vivo: a major role for B cells in presenting antigen to T cells in lymph nodes. J Immunol 1987, 138(9): 2848-2856)。最近、Dingらは、抗原のＢ細胞への標的化が、特異的Ｔ細胞応答を増強し、免疫寛容を破壊することができることを示した(Ding Cら，Targeting of antigens to B cells augments antigen-specific T-cell responses and breaks immune tolerance to tumor-associated antigen MUC1. Blood 2008, 112(7): 2817-2825)。更に、新たなデータにより、Ｂ細胞が長期Ｔ細胞免疫の達成に特に重要であることが示されている(Whitmire J Kら，Requirement of B Cells for Generating CD4+ T Cell Memory. J Immunol 2009, 182(4): 1868-1876)。エキソソームはＢ細胞エピトープを保有することができ；Ｂ細胞応答はＴ細胞増殖に必要とされる(Quazi KRら，Antigen loaded exosomes alone induce Th1 type memory through a B-cell dependent mechanism. Blood 2009, 113:2673-2683)。エキソソームがそれ自体のみでＴ細胞を刺激することができるのか(Admyre Cら，Direct exosome stimulation of peripheral human T cells detected by ELISPOT. Eur J Immunol 2006, 36: 1772-1781)又は媒介体として他の細胞が必要か(Vincent-Schneider Hら，Exosomes bearing HLA-DR1 molecules need dendritic cells to efficiently stimulate specific T cells. Int Immunol 2002, 14: 713-722)や、抗原特異性がエキソソームとＴ細胞との間の直接相互作用に影響し得るのかが議論されている。種々の起源のエキソソームがヒト血液中の特定の細胞集団を標的する(Johansson S Mら：Johansson S M, Exosomes - nano-vesicles in immune regulation. Thesis for doctoral degree 2008, Karolinska Instituted Stockholm, ISBN 978-91-7409-058-1)。
【０００５】
補体成分(3d/エプスタイン・バーウイルス)レセプター２(CD21；またCR2)は、Ｂ細胞の活性化及び成熟に関与するＢ細胞表面レセプターである。
エプスタイン・バーウイルス(EBV)はヒトリンパ球好性ヘルペスウイルスである。EBVは、一次Ｂ細胞をインビトロで増殖可能なリンパ芽球状細胞中に不死化できる。EBV糖タンパク質gp350のCD21への結合はＢ細胞へのウイルス付着に決定的に重要である(Young K Aら，Molecular basis of the interaction between complement receptor type 2 (CR2/CD21) and Epstein-Barr Virus Glycoprotein gp 350. J Virol 2008, 82: 11217-11227)。EBV-形質転換Ｂ細胞からのエキソソームは、Ｔ細胞阻害活性を有するEBVによりコードされる潜伏性膜タンパク質１(LMP1)を保有することが報告されている(Keryer-Bibens Cら，Exosomes released by EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the immunomodulatory protein galectin 9. BMC Cancer 2006, 6: 283)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
本発明の発明者らは、驚くべきことに、EBV形質転換Ｂ細胞が、タンパク質gp350の媒介で天然型Ｂ細胞のCD21レセプターに特異的に結合するエキソソームを排出することを見出した。具体的には、溶解ステージのEBVが宿るＢ細胞は天然型Ｂ細胞に結合するエキソソームを産生する。他方で、本発明者らは、ヒト樹状細胞又は母乳からのエキソソームは単球を標的することを見出した。よって、以前に報告されていることとは対照的に、本発明に従うエキソソームは、天然型Ｂ細胞又は単球を特異的に標的し得、よってＴ細胞を特異的に標的しない。その結果、本発明の方法に従って製造することにより、エキソソームは、(例えば天然型Ｂ細胞の)CD21レセプターに特異的に結合し得るタンパク質を含んでなり、更に本発明に従うエキソソーム中に１以上の抗原を組み込むことにより、特異的免疫応答は、エキソソームと抗原提示細胞(APC)として作用する天然型Ｂ細胞との接触に際して、Ｔ細胞の更なる動員を生じ得る。要するに、本発明に従うエキソソームは、天然型Ｂ細胞レセプターと該天然型Ｂ細胞に移入される抗原とに接続する(タンパク質形態の)アンカーを含んでなると見ることができる。
【０００７】
発明の目的
エキソソームを用いて患者の免疫系を活性化することによって該患者においてガンを治療する方法を提供することが、本発明の目的である。
より具体的には、本発明の目的は、腫瘍抗原を標的してＢ細胞に刺激シグナルを与えることである。
本発明の別の重要な目的は、患者におけるガン治療に十分な量で腫瘍抗原提示エキソソームを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
よって、本発明は、とりわけ、例えばＢ細胞に由来するエキソソームに関する。ここで、該エキソソームは例えばＢ細胞レセプターに結合し得るタンパク質を保有し、また任意の種類の１以上の抗原も保有する。
本発明はまた、他のＢ細胞、樹状細胞、単球又はマクロファージを起源とするエキソソームによりＢ細胞を標的する方法に関する。ここで、該エキソソームは、標的するＢ細胞への結合後、免疫応答を誘発し得る抗原特性を保有する。
【０００９】
本発明は更に、免疫調整又は新形成に起源を有する疾患(例えばガン)の治療において使用するためのエキソソームに関する。該エキソソームは更に、感染、アレルギー、自己免疫疾患に関しても有用であり得、更に例えば移植の間の治療法において有用であり得る。ここで、本発明に従うエキソソームは、例えば腫瘍抗原のような１以上の抗原に対する免疫応答を誘発するように操作されていてもよいし、或いは例えば移植に関連して所望されるように移植組織が対象者の免疫系により拒絶されることを回避するために、免疫応答を抑制するように操作されていてもよい。
【００１０】
本発明はまた、天然型Ｂ細胞を標的するように設計されたエキソソームの製造方法に関する。
本発明の更なる目的は、下記の発明の要旨、図面により説明される発明の詳細な説明、及び添付の特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の説明
Ｂ細胞を標的するエキソソームの製造方法
本発明は、下記の工程：
(ｉ)Ｂ細胞を、エプスタイン・バーウイルスに感染させることで例示されるような適切な手段で、潜伏期に形質転換させることにより、天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分を発現させる工程、
(ii)(ｉ)の形質転換Ｂ細胞を培養する工程、
(iii)(ii)の形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集する工程
を含んでなり、
前記エキソソームは天然型Ｂ細胞に結合し得る１以上の成分を含んでなり、該エキソソームは直接的及び/又は間接的に１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を搭載している、Ｂ細胞を標的する特異的免疫調整性エキソソームの製造方法を提供する。
【００１３】
上記のように、エキソソームは、(ii)で形質転換Ｂ細胞を例えば１以上の抗原と同時培養することにより、１以上の抗原を搭載されてもよい(間接搭載(loading))。他方、本方法はまた、エキソソームの直接搭載を可能にする。すなわち、(iii)でエキソソームを採集した後、回収したエキソソームを例えば１以上の抗原に曝す。直接搭載は、通常、タンパク質のフラグメント(例えば８〜12アミノ酸残基又は15〜24アミノ酸残基を含んでなるペプチドフラグメントのようなペプチド又はペプチドフラグメントなど)を用いて実施する。或いは、(ii)で間接搭載を省略すると、工程(iv)での搭載が必要である。直接搭載は、EBTBエキソソーム又はDCエキソソームを任意の抗原(互いに独立した任意の種類の１以上の抗原)と、エキソソームによる１以上の抗原の取込みを促進する条件下で接触させることを含んでなる。これは、例えばpHシフトを含んでなる条件下であり得る。これは、少なくともpH５、好ましくはpH約5.2のpHの適切な培地中４℃にてエキソソームを懸濁することにより実現し得る。ペプチドフラグメントの添加及びその後の例えばTRIS緩衝液のような緩衝液の添加によりpHをpH約7.0に上昇させて、該ペプチドフラグメントをエキソソームに組み込む。pHを変化させる必要のない直接搭載の技術も存在する。しかし、直接的及び間接搭載技術の両方を用いる多搭載法を使用することができるとも考えられる。本発明者らは、間接搭載が特に効果的であることを見出している。
【００１４】
１以上の抗原は、内因性/自原性(対象者自身に由来する)であっても外因性/同種異系(別の対象者に由来する)であってもよく、より多くの抗原をエキソソーム中/上に組み込む場合には、抗原は自原性/同種異系抗原の任意の混合物であり得る。好ましくは、抗原は自原性である。更に、１以上の抗原は、例えばウイルス性若しくは細菌性のような任意の起源を有していても、腫瘍抗原であってもよく、更には免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せであり得る。
本発明の方法により１以上の異なる抗原の組込みが可能になり、その結果、エキソソームは例えば免疫抑制性抗原及びサイトメガロウイルス(CMV)に対する抗原を含んでなり得ると考えられる。結果として、本発明に従うエキソソームは、任意の種類又は起源の１以上の抗原、例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原を含んでなり得、したがって１以上の免疫刺激性抗原及び１以上の免疫抑制剤の組合せであり得る。
【００１５】
更に、本発明に従うエキソソームは、Ｂ細胞を標的するための任意の抗原(例えばウイルス性)を含み、ワクチン(例えばウイルスワクチン)として使用されるように操作され得ることが更に企図される。本発明に従うエキソソームは自己免疫疾患、アレルギーに関連して、又は任意の種類の移植を受け、免疫応答により移植組織が拒絶されるリスクにあり得る対象者の治療に関連して使用し得ることも企図される。この観点は、エキソソームに免疫抑制剤を組み込むことによって実現することができる。
上記のように、排出されたエキソソームは、直接的及び/又は間接搭載により、１以上の抗原若しくは１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せを搭載し得る。しかし、抗原性成分はＢに化学的に連結されていてもよい。Ｂ細胞結合性タンパク質又はリガンドの化学的連結は、該タンパク質又はリガンドを例えばBS3(ビス-(スルホ-スクシンイミジル)-スベリン酸)、DSS(ジスクシンイミジルスベリン酸)、DSG(ジスクシンイミジルグルタル酸)などのようなリンカーと反応させることにより実現することができる。リンカーは二官能性である、すなわち２つの連結点を有するので、リンカーにカップリングさせたタンパク質又はリガンドを、その後更に反応させてリンカーをエキソソームにカップリングさせることによりタンパク質又はリガンドをエキソソームにリンカー分子を介してカップリングさせる。
【００１６】
免疫抑制が望まれる場合、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物のような免疫抑制剤がエキソソーム中に組み込まれ得る。しかし、免疫抑制剤として作用し得る任意の物質を本発明に従って使用し得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００１７】
Ｂ細胞は、タンパク質gp350を発現するように、(例えばエプスタイン・バーウイルス(EBV)により)形質転換され得る。しかし、形質転換はまた、形質転換Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のタンパク質を発現するようになる当該分野で周知の他の技法により実施し得る。このようなレセプターは、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rであり得る。このようなＢ細胞レセプターに結合する適切なリガンドは、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αであり得るが、Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用し得る。結果として、Ｂ細胞から排出されるエキソソームは、形質転換Ｂ細胞が発現する成分と同じ天然型Ｂ細胞に結合し得る成分を発現するように操作され得る。本発明の発明者らは、驚くべきことに、EBVに感染したＢ細胞がgp350を発現することを発見した。
【００１８】
形質転換Ｂ細胞の培養条件は、当該分野において周知の細胞拡大手順に従うことができる。
例えば、Ｂ細胞は、例えばMEM、DMEM又は完全RPMI 1640培地(Invitrogen, Carlsbad, CA)のような適切な培地で培養し得る。培地には、10％エキソソーム涸渇胎仔ウシ血清、100IU/mLのペニシリンストレプトマイシン、２mMのL-グルタミン、50μMのβ-メルカプトエタノール及び25ugのゲンタマイシン又はそれらの任意の組合せを補充し得る。他の細胞タイプ(Ｂ細胞以外)を使用する場合、例えばMDDC又はBMDCの培養には、例えばGM-CSF及びIL-4のような増殖因子を添加し得、上記の培地に加えて使用し得る。培養は、通常、５％ CO2の湿潤インキュベーター中で、37℃にて５日間のインキュベーションの間なされるが、CO2フリー条件の間でも、例えば約２日間、例えば約３日間、例えば約４日間のようなより短期間の間でもあり得る。
【００１９】
エキソソーム調製用に上清を採集するための形質転換Ｂ細胞の培養については、細胞は、例えば約48時間、例えば約72時間、例えば約96時間インキュベートし得る。MDDC又はBMDC培養には、インキュベーションは例えば６日間実施して未成熟DCを得て、その後更に48時間継続してエキソソーム調製用の上清を採集する。BMDCへの抗原搭載には、６日目に、細胞を一晩抗原でパルス/に曝露し、続いて洗浄し、湿潤インキュベーター中５％ CO2と５日間37℃にて48時間のインキュベーションを行う。
上記は、手引き的な説明であり、よって当該分野で公知の細胞培養法の範囲内で変え得ることを理解すべきである。
【００２０】
具体例として、例えばEBV-形質転換Ｂ細胞株は、25μg/mLのゲンタマイシン(Gibco)、10％熱不活化胎仔ウシ血清(Hyclone, Logan, Utah)、２mmol/LのL-グルタミン、100IU/mLのペニシリン(Gibco)、100μg/mLのストレプトマイシン(Gibco)及び50μmol/Lのβ-メルカプトエタノール(KEBO-lab, Spanga, Sweden)を補充したRPMI-1640(Gibco；Invitrogen Corp, Paisley, United Kingdom)からなる完全培地中で培養し得る。培地は、エキソソーム涸渇であった。細胞は、６％ CO2、37℃の湿潤インキュベーター中で培養し得る。
【００２１】
MDDC培養：末梢血単核細胞(PBMC)は、Ficoll Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)で製造業者の指示に従って遠心分離することより単離した。細胞は、その後、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で洗浄し、PBS、0.5％のウシ血清アルブミン(BSA)及び２mmエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有する細胞選別緩衝液中に再懸濁し、自動化マトリクス支援細胞ソーティング(AutoMACS；Miltenyi Biotech)を用いる単球のポジティブ選択用に抗CD14磁性ビーズ(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)で標識し得る。CD14+の純度は82〜99％の範囲であった(メジアン94％；ｎ＝29)。単球細胞培養物は、培養フラスコ(Costar, Cambridge, UK)において、RPMI 1640(HyClone, Logan, UT)を10％エキソソーム涸渇胎仔ウシ血清(FCS；HyClone)、２mmのL-グルタミン(Gibco, Paisley, UK)、100IU/mlのペニシリン(Gibco)、100μg/mlのストレプトマイシン(Gibco)、25μg/mlのゲンタマイシン(Gibco)、50μmの2-β-メルカプトエタノール(Sigma Chemical Company, St Louis, MO)、800U/mlの組換えヒト(rh)IL-4(BioSource International, Camarillo, CA)及び550U/mlのrhGM-CSF(BioSource International)と共に含有する完全培養培地中、４×105細胞/mlの濃度でセットアップし、３日目に再フィードした。６日目に、細胞を、補充物を有する新鮮培地中に再播種した。細胞密度は、両条件について同じ値に調整した。細胞生存は、培養６日目に、トリパンブルー排除により決定した。８日目に培養上清を回収し、3000ｇにて20分間室温にて遠心分離し、−80°で保存した。８日目に、細胞を採集し、フローサイトメトリにより表現型を分析した。
【００２２】
BMDC培養について：骨髄細胞は、10ng/mLのインターロイキン-４(IL-4；Invitrogen)及び10％顆粒球マクロファージコロニー刺激因子馴化培地(Ag8653/X63クローン)の存在下、完全RPMI 1640培地(Invitrogen, Carlsbad, CA；10％エキソソーム涸渇胎仔ウシ血清、１mMのピルビン酸ナトリウム、100IU/mLのペニシリンストレプトマイシン、200mMのL-グルタミン、50μMのβ-メルカプトエタノール)中で培養する。６日目に、培養上清の50％を新鮮培地と置換し、48時間後に上清を採集する。
細胞は、例えば少なくとも３日間、例えば少なくとも４日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも６日間、例えば少なくとも７日間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも１ヶ月間、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような例えば少なくとも２日間の間培養し得る。
【００２３】
本発明に従う方法により、エキソソームのより高収量が可能になり、その結果、効果的な治療が可能になる。高収量は、特に、EBV-形質転換Ｂ細胞で観察される。細胞培養物の上清は、例えば１日おき、例えば２日おき、例えば３日おき、例えば４日おき、例えば５日おき、例えば６日おきに採集し得、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような少なくとも例えば１ヶ月間の間に前記間隔のいずれかで採集し得る。
【００２４】
本発明に従う方法を使用するエキソソームの収量は、EBTB細胞の例えば約48時間培養の間に、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞のような例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/百万EBTB細胞であり得る。本発明の発明者らは、Ｂ細胞のEBV形質転換によって、より高収量のエキソソームが観察されることを見出した。エキソソームの収量は、例えば樹状細胞を使用して同期間培養すると、通常は、0.1μgエキソソーム/百万細胞の範囲である。
【００２５】
エキソソームの意図する目的又は使用に依存して、適切な抗原が選択されることを明確に理解すべきである；すなわち、エキソソームを例えばガン治療に関連して使用することを意図した場合、１以上のガン抗原がエキソソームに組み込まれ得る。エキソソームの意図する目的が例えばアレルギー治療に関連している場合、問題のアレルギー反応を抑制する１以上の免疫抑制剤をエキソソームに組み込み得る。このことは、例えば移植の概念にも必要な変更を加えた上で当てはまる。意図する目的又は必要性に依存して、１以上の抗原は例えば１以上の更なる抗原又は１以上の免疫抑制剤と組み合わせ得るとも考えられることもまた明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００２６】
エキソソームの採集は、例えば超遠心分離若しくは差分遠心分離又はそれらの任意の組合せ及びその後のペレット化エキソソームの回収により行い得る。ペレット化エキソソームは、更に、例えばPBSのような適切な培地で洗浄し得、そして任意に、その後適切な培地中に懸濁し得る。その後、遠心分離、エキソソームのペレット化及び例えばPBSでの洗浄の全サイクルを、エキソソームの純度が許容可能になるまで反復する。
本発明は、例えば樹状細胞又は濾胞性樹状細胞(FDC)のような他の細胞タイプにも必要な変更を加えた上で適用され得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００２７】
治療方法
本発明はまた、疾患の治療に使用するための、天然型Ｂ細胞を標的するエキソソームに関する。ここで、該方法は、
(ｉ)対象者から例えば血液サンプルのような生物学的サンプルを取得すること、
(ii)(i)の前記サンプルからＢ細胞を回収すること、
(iii)(ii)で回収したＢ細胞を、ウイルスで例示されるような適切な手段で、該Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得るタンパク質又はリガンドを発現するようにさせること、
(iv)形質転換Ｂ細胞を培養すること、
(ｖ)(iv)で形質転換Ｂ細胞から排出されたエキソソームを回収すること、
(vi)(ｖ)のエキソソームを対象者に戻すこと
を含んでなり、該エキソソームは、１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を直接的及び/又は間接的に搭載している。
【００２８】
形質転換すべきＢ細胞を回収するために対象者から回収するサンプルは、例えば、末梢血のような血液サンプルであってもよいし、骨髄サンプル若しくは対象者のリンパ系から抜き取られたサンプル又はそれらの任意の組合せ若しくは混合物であってもよい。
【００２９】
上記のように、エキソソームは、(iv)で形質転換Ｂ細胞を例えば１以上の抗原と同時培養することにより、１以上の抗原を搭載されてもよい(間接搭載)。他方、本方法はまた、エキソソームの直接搭載を可能にする。すなわち、(ｖ)でエキソソームを採集後、患者に戻す前に、回収したエキソソームを例えば１以上の抗原に曝す。直接搭載は、通常、タンパク質のフラグメント(例えば８〜12アミノ酸残基又は15〜24アミノ酸残基を含んでなるペプチドフラグメントのようなペプチド又はペプチドフラグメントなど)を用いて実施する。或いは、(ii)で間接搭載を省略すると、工程(iv)での搭載が必要である。直接搭載は、EBTBエキソソーム又はDCエキソソームを任意の抗原(互いに独立した任意の種類の１以上の抗原)と、エキソソームによる１以上の抗原の取込みを促進する条件下で接触させることを含んでなる。これは、例えばpHシフトを含んでなる条件下であり得る。これは、少なくともpH５、好ましくはpH約5.2のpHの適切な培地中４℃にてエキソソームを懸濁することにより実現し得る。ペプチドフラグメントの添加及びその後の例えばTRIS緩衝液のような緩衝液の添加によりpHをpH約7.0に上昇させて、該ペプチドフラグメントをエキソソームに組み込む。pHを変化させる必要のない直接搭載の技術も存在する。しかし、直接的及び間接搭載技術の両方を用いる多搭載法を使用することができるとも考えられる。
【００３０】
１以上の抗原は、内因性/自原性(対象者自身に由来する)であっても外因性/同種異系(別の対象者に由来する)であってもよく、より多くの抗原がエキソソーム中/上に組み込む場合には、抗原は自原性/同種異系抗原の任意の混合物であり得る。好ましくは、抗原は自原性である。更に、１以上の抗原は、例えばウイルス性若しくは細菌性のような任意の起源を有していても、腫瘍抗原であってもよく、更には免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せであり得る。
本発明の方法により１以上の異なる抗原の組込みが可能になり、その結果、エキソソームは例えば免疫抑制性抗原及びサイトメガロウイルス(CMV)に対する抗原を含んでなり得ると考えられる。結果として、本発明に従うエキソソームは、任意の種類又は起源の１以上の抗原、例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原を含んでなり得、したがって１以上の免疫刺激性抗原及び１以上の免疫抑制剤の組合せであり得る。
【００３１】
更に、本発明に従うエキソソームは、Ｂ細胞を標的するための任意の抗原(例えばウイルス性)を含み、ワクチン(例えばウイルスワクチン)として使用されるように操作され得ることが更に企図される。本発明に従うエキソソームは自己免疫疾患、アレルギーに関連して、又は任意の種類の移植を受け、免疫応答により移植組織が拒絶されるリスクにあり得る対象者の治療に関連して使用し得ることも企図される。この観点は、エキソソームに免疫抑制剤を組み込むことによって実現することができる。
上記のように、排出されたエキソソームは、直接的及び/又は間接搭載により、１以上の抗原若しくは１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せを搭載し得る。しかし、抗原性成分はＢに化学的に連結されていてもよい。Ｂ細胞結合性タンパク質又はリガンドの化学的連結は、該タンパク質又はリガンドを例えばBS3(ビス-(スルホ-スクシンイミジル)-スベリン酸)、DSS(ジスクシンイミジルスベリン酸)、DSG(ジスクシンイミジルグルタル酸)などのようなリンカーと反応させることにより実現することができる。リンカーは二官能性である、すなわち２つの連結点を有するので、リンカーにカップリングさせたタンパク質又はリガンドを、その後更に反応させてリンカーをエキソソームにカップリングさせることによりタンパク質又はリガンドをエキソソームにリンカー分子を介してカップリングさせる。
【００３２】
免疫抑制が望まれる場合、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物のような免疫抑制剤がエキソソーム中に組み込まれ得る。しかし、免疫抑制剤として作用し得る任意の物質を本発明に従って使用し得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００３３】
Ｂ細胞は、タンパク質gp350を発現するように、(例えばエプスタイン・バーウイルス(EBV)により)形質転換され得る。しかし、形質転換はまた、形質転換Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のタンパク質を発現するようになる当該分野で周知の他の技法により実施し得る。このようなレセプターは、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rであり得る。このようなＢ細胞レセプターに結合する適切なリガンドは、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αであり得るが、Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用し得る。結果として、Ｂ細胞から排出されるエキソソームは、形質転換Ｂ細胞が発現する成分と同じ天然型Ｂ細胞に結合し得る部分を発現するように操作され得る。本発明の発明者らは、驚くべきことに、EBVに感染したＢ細胞がgp350を発現することを発見した。
【００３４】
形質転換Ｂ細胞の培養条件は、当該分野において周知の細胞拡大手順に従うことができる。細胞は、例えば少なくとも３日間、例えば少なくとも４日間、例えば少なくとも５日間、例えば少なくとも６日間、例えば少なくとも７日間、例えば少なくとも２週間、例えば少なくとも３週間、例えば少なくとも１ヶ月間、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような例えば少なくとも２日間の間培養し得る。
本発明に従う方法により、エキソソームのより高収量が可能になり、その結果、効果的な治療が可能になる。高収量は、特に、EBV-形質転換Ｂ細胞で観察される。細胞培養物の上清は、例えば１日おき、例えば２日おき、例えば３日おき、例えば４日おき、例えば５日おき、例えば６日おきに採集し得、例えば少なくとも２ヶ月間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間のような少なくとも例えば１ヶ月間の間に前記間隔のいずれかで採集し得る。
【００３５】
本発明に従う方法を使用するエキソソームの収量は、EBTB細胞の例えば約48時間培養の間に、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞のような例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/百万EBTB細胞であり得る。本発明の発明者らは、Ｂ細胞のEBV形質転換によって、より高収量のエキソソームが観察されることを見出した。エキソソームの収量は、例えば樹状細胞を使用して同期間培養すると、通常は、0.1μgエキソソーム/百万細胞の範囲である。
【００３６】
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
エキソソームの採集は、例えば超遠心分離若しくは差分遠心分離又はそれらの任意の組合せ及びその後のペレット化エキソソームの回収により行い得る。ペレット化エキソソームは、更に、例えばPBSのような適切な培地で洗浄し得、そして任意に、その後適切な培地中に懸濁し得る。その後、遠心分離、エキソソームのペレット化及び例えばPBSでの洗浄の全サイクルを、エキソソームの純度が許容可能になるまで反復する。
本発明は、例えば樹状細胞又は濾胞性樹状細胞(FDC)のような他の細胞タイプにも必要な変更を加えた上で適用され得ることを明確に理解すべきである。
【００３７】
エキソソームの意図する目的又は使用に依存して、適切な抗原が選択されることを明確に理解すべきである；すなわち、エキソソームを例えばガン治療に関連して使用することを意図した場合、１以上のガン抗原がエキソソームに組み込まれ得る。エキソソームの意図する目的が例えばアレルギー治療に関連している場合、問題のアレルギー反応を抑制する１以上の免疫抑制剤をエキソソームに組み込み得る。このことは、例えば移植の概念にも必要な変更を加えた上で当てはまる。意図する目的又は必要性に依存して、１以上の抗原は例えば１以上の更なる抗原又は１以上の免疫抑制剤と組み合わせ得るとも考えられることもまた明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００３８】
エキソソームの投与態様は、例えば非経口投与のような当該分野で公知の種々の形態であり得、したがって静脈内、動脈内、骨内、鞘内(intrathecal)、皮内又は腹腔内投与であり得る。
対象者における効果的な免疫応答に必要とされるエキソソームの十分な用量は、例えば少なくとも0.2mg/kg、例えば少なくとも0.3mg/kg、例えば少なくとも0.4mg/kg、例えば少なくとも0.5mg/kg、例えば少なくとも0.75mg/kg、例えば少なくとも0.9mg/kg、例えば少なくとも1.0mg/kg、例えば少なくとも3.0mg/kg、例えば少なくとも5.0mg/kg、例えば少なくとも7.0mg/kg、例えば少なくとも10.0mg/kg、例えば少なくとも15.0mg/kgのような例えば少なくとも0.1mg/kgであり得る。
【００３９】
エキソソームは、約１時間、例えば約２時間、例えば４時間、例えば６時間の間、例えば静脈内注入として、投与することができる。或いは、エキソソームはまた、約20秒間、例えば約30秒間、例えば約40秒間、約１分間の期間の注射として投与し得る。
本発明に従う治療法は、単回用量又は複数回用量としてエキソソームを投与することにより得る。本治療法は、疾患の重篤度に依存して、一回実施してもよいし、反復してもよい。更に、治療は、疾患の再発に際して、繰り返し得る。
本治療法は、ガン、アレルギー、自己免疫疾患に対して及び移植療法の間に意図される。この治療レジメンは他の治療と組み合わせてもよいし他の治療で補充してもよいことを明確に理解すべきである。例えばガンに関しては、化学療法を本発明に従う治療と組み合わせ得、アレルギー治療では、例えば抗ヒスタミンを本発明に従う方法と組み合わせ得、感染の治療では、例えば抗生物質を本発明に従う方法と組み合わせ得る、などである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４０】
医薬組成物
エキソソームは、例えば、患者への例えば静脈内、動脈内、鞘内、皮内又は腹腔内投与のような非経口投与に適切な医薬組成物として製剤化し得る。
エキソソームは、非経口投与するとき、等張性培地中、すなわち血液と同じ張度を有する培地中で製剤化し得、エキソソームの凝集を防止する１以上の物質を更に含んでなり得る。例えば約0.91％ w/vのNaCl、約300mOsm/Lの溶液である正常生理食塩水(NS)のような生理食塩水溶液を用い得る。しかし、例えば下記のような他の生理食塩水溶液を使用し得る：
1/2-正常生理食塩水(0.45％ NaCl)(しばしば「D5」(５％デキストロース)を含む)は、77mEq/LのNa及びCl並びに50g/Lグルコースを含有する。
1/4-正常生理食塩水(0.22％ NaCl)は、39mEq/LのNa及びClを有し、浸透圧の理由から常に５％デキストロースを含有する。
【００４１】
例えば中心静脈カテーテルを介して投与される２％ NaClを超える濃縮物のような高張性生理食塩水もまた使用し得る。通常は、２つの強度が入手可能である：
３％ NaClは513mEq/LのNa及びClを有する。
５％ NaClは856mEq/LのNa及びClを有する。
これら溶液には、更に、例えば0.18％生理食塩水中デキストロース(グルコース)４％のようなデキストロース(グルコース)を補充し得る。
更なる添加物は、例えば２％までのヒト血清アルブミン又は１％までのヒト血清アルブミンのような例えば３％までのヒト血清アルブミンであり得る。
【００４２】
静脈内投与のためには、投与する組成物中のエキソソーム濃度は、通常、例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/ml培地、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも15.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも20.0μgエキソソーム/ml培地のようなおよそ少なくとも約0.1μgエキソソーム/ml培地の範囲である。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４３】
エキソソーム
本発明はまた、エキソソーム、好ましくはＢ細胞に起源を有するか又は樹状細胞、濾胞性樹状細胞などに起源を有するエキソソームに関する。
本発明に従うエキソソームは、天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る少なくとも１つの成分若しくは薬剤又はタンパク質若しくはペプチドフラグメントを含んでなる。レセプターは、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rであり得るが、これらに限定されない。更に、天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る１つの成分若しくは薬剤又はタンパク質若しくはペプチドフラグメントは、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αであり得るが、これらに限定されない。しかし、Ｂ細胞に結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用し得る。
【００４４】
更に、本発明に従うエキソソームは、１以上の抗原を更に含んでなり得る。１以上の抗原は、内因性/自原性(対象者自身に由来する)であっても外因性/同種異系(別の対象者に由来する)であってもよく、より多くの抗原をエキソソーム中/上に組み込む場合には、抗原は自原性/同種異系抗原の任意の混合物であり得る。好ましくは、抗原は自原性である。更に、１以上の抗原は、例えばウイルス性若しくは細菌性のような任意の起源を有していても、腫瘍抗原であってもよく、更には免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せであり得る。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４５】
本発明の方法により１以上の異なる抗原の組込みが可能になり、その結果、エキソソームは例えば免疫抑制性抗原及びサイトメガロウイルス(CMV)に対する抗原を含んでなり得ると考えられる。結果として、本発明に従うエキソソームは、任意の種類又は起源の１以上の抗原、例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原を含んでなり得、したがって１以上の免疫刺激性抗原及び１以上の免疫抑制剤の組合せであり得る。
【００４６】
更に、本発明に従うエキソソームは、Ｂ細胞を標的するための任意の抗原(例えばウイルス性)を含み、ワクチン(例えばウイルスワクチン)として使用されるように操作され得ることが更に企図される。本発明に従うエキソソームは自己免疫疾患、アレルギーに関連して、又は任意の種類の移植を受け、免疫応答により移植組織が拒絶されるリスクがあり得る対象者の治療に関連して使用し得ることも企図される。この観点は、エキソソームに免疫抑制剤を組み込むことによって実現することができる。このような免疫抑制剤は、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物であり得るが、これらに限定されない。しかし、免疫抑制剤として作用し得る任意の物質を本発明に従って使用し得ることを明確に理解すべきである。
本発明の他の観点の下で言及又は議論される詳細な事項は、必要な変更を加えることで、本観点にも当てはまる。
【００４７】
本発明はまた、対象者における病気又は病的状態の治療に使用するためのエキソソーム(例えばその組成物)に関する。病気又は病的状態は、例えばガン、任意の自己免疫疾患、移植下での療法、アレルギー又は免疫抑制若しくは免疫刺激を必要とする任意の病的状態であり得る(本明細書中の説明に関して必要な変更を加えて)。
【００４８】
本発明は、エプスタイン・バーウイルス-形質転換Ｂ細胞(EBTB細胞)により放出されたエキソソーム(EBTBエキソソーム)が天然型Ｂ細胞をCD21を介して標的するという洞察に基づく。この洞察は、EBTB細胞エキソソームと天然型Ｂ細胞との間の相互作用が抗CD21により効率的にブロックされるという知見によって支持される。このことは、CD21とEBV糖タンパク質gp350又はCD21に対するその他のリガンド、例えばCD23、C3b、C3d又はインターフェロン-αとの間の相互作用を示唆している。本発明に従って使用し得る他のリガンドは、例えばBAFF、APRIL、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αである。Ｂ細胞レセプターに結合し得る任意のリガンドを本発明に従って使用することができると考えられる。Ｂ細胞レセプターはCD21であり得るがこれに限定されず、天然型Ｂ細胞上の他のレセプター、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rでもあり得る。結果として、本発明は、エキソソームの外部に天然型Ｂ細胞に結合し得るリガンド、及びエキソソーム中に組み込まれた１以上の抗原のその後の移行を提供すると考えることができる。よって、この予想外で驚くべき知見は、１以上の抗原のより効率的な移行を提供することによって、より効率的で特異的な免疫応答を提供する。重要なことには、エキソソームはＴ細胞ではなくＢ細胞を標的するので、Ｔ細胞の直接刺激による場合より強力なＴ細胞応答が生じる。
【００４９】
本発明によれば、EBTBエキソソームは、研究室で、例えばＢ細胞のEBV形質転換によって、機能的効果を変更するように操作することができる。操作したEBTBエキソソームの天然型Ｂ細胞への特異的標的付けは、治療的有用性を増大させる。更に、Ｂ細胞のEBV形質転換により、エキソソームの供給源が無制限になる。
よって、本発明によれば、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と腫瘍抗原とを保有するEBTB細胞が開示される；EBTB細胞は、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と腫瘍抗原とを保有するEBTBエキソソームを放出することができる。
本発明によれば、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と腫瘍抗原とを保有するEBTBエキソソームもまた開示される。
本発明によれば、更に、天然型Ｂ細胞を標的するタンパク質と例えば腫瘍抗原又は感染性抗原(ウイルス性、細菌性又はミコバクテリア性)からの抗原とを保有する樹状細胞(DC)エキソソームが開示される。
【００５０】
本発明のエキソソームは、単一の腫瘍抗原又は複数の腫瘍抗原が搭載され、これを保有し得る。
本出願において、用語「形質転換」は、(エプスタイン・バーウイルス)EBVがＢリンパ球に感染するとき、そしてその結果として終には無限に増殖可能なリンパ芽球様細胞株が出現することを意味するものとする。これら細胞株の増殖性形質転換は、ウイルス性タンパク質発現の結果である。生じる細胞株は、時に、不死化細胞株と呼ばれる。
本出願において、「抗原」は、対象者において、免疫応答を誘発することができる任意の物質を意味するものとする。この目的のため、抗原は、例えばウイルス抗原、細菌抗原、ミコバクテリア抗原、腫瘍抗原又は例えば移植の間若しくはアレルギー反応において若しくは自己免疫反応の間に遭遇するような、対象者の免疫系が応答する任意の物質であり得るが、これらに限定されない。
【００５１】
本出願において、「腫瘍抗原」又は「ガン抗原」(この表現は「腫瘍関連抗原」を包含する)は、天然又は合成のペプチドであって、それを投与された生物がそれに対する抗体又は抗原特異的Ｔ細胞応答を形成する天然又は合成のペプチドである。詳細には、腫瘍抗原は、抗原提示細胞(APC)、特にＢ細胞、EBTB細胞又は樹状細胞(DC)が提示することができる天然又は合成のペプチドである。しかし、本発明の腫瘍抗原は、抗原効果を発揮するために、抗原提示細胞によりプロセッシング及び提示され得るが、必要ではない。
本発明のEBTBエキソソーム又はDCエキソソームは、腫瘍抗原を間接的に又は直接的に搭載していてもよい。直接搭載は、EBTB細胞又は樹状細胞を腫瘍抗原と、該細胞による１以上の抗原の取込みを促進する条件下で培養し、抗原搭載細胞に抗原搭載エキソソームを放出させることを含んでなる。直接搭載は、EBTBエキソソーム又はDCエキソソームを腫瘍抗原と、エキソソームによる腫瘍抗原の取込みを促進する条件下、特にpHシフトを含んでなる条件下で接触させることを含んでなる。
【００５２】
本発明によれば、更に、ガンの治療における本発明のEBTB細胞及びEBTBエキソソームの使用並びに本発明の樹状細胞及びDCエキソソームの使用が開示される。
EBTBエキソソームは、Ｂ細胞を標的するタンパク質が提供されるときには、天然型Ｂ細胞を特異的に標的することが可能である。このようなＢ細胞標的化に特に有用なタンパク質は、gp350、CD23、C3b、CD19及びC3dであるが、これらに限定されない。
本発明によれば、天然型Ｂ細胞は、患者の循環から採取した血液から単離され、EBVでEBTB細胞に形質転換されて培養される。培養EBTB細胞はガン抗原を搭載される。ガン抗原搭載EBTB細胞から放出されるEBTBエキソソームを回収する。この様式で、患者の効果的なガン治療に十分な数(量)のガン抗原搭載EBTBエキソソームが生成される。本発明のガン抗原搭載EBTBエキソソームはCD21結合性タンパク質を保有する。
或いは、患者以外の者の循環から採取した血液から単離した天然型Ｂ細胞を使用することも可能である(但し、このＢ細胞は、治療すべき患者のＢ細胞と免疫学的に適合性である)。よって、本発明の方法は、自家及び同種異系のＢ細胞の使用を含んでなる。
【００５３】
患者の治療に十分な数のエキソソームを提供するために、自家/自原性又は同種異系の抗原を提示する本発明の天然型Ｂ細胞及びそれからEBV感染により得られるEBTB細胞を、例えば少なくとも３週間、例えば４週間、例えば５週間、例えば６週間、例えば７週間、例えば８週間、例えば少なくとも３ヶ月間、例えば少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間又はそれ以上のような少なくとも２週間の間の培養で拡大/増殖させることが好ましい。本発明によれば、EBTBエキソソームに含まれる免疫阻害に関与する物質(例えばLMP-1)は、例えばFabフラグメント分子により、患者への投与の前に中和化され得る。
本発明によれば、CD40/IL-4刺激Ｂ細胞(「CD40刺激Ｂ細胞」)により放出されたエキソソームが開示される。CD40刺激Ｂ細胞株の長期培養物は、M Wiesnerら(2008), Conditional Immortalization of Human B Cells by CD40 Ligation. Plos ONE 3(l):e1464. Doi:10.1371/journal.pone.0001464に開示されている。CD40刺激Ｂ細胞株及び該Ｂ細胞から放出されるエキソソームは、ETBT細胞株及びETBTエキソソームと同様な有用性を有する。詳細には、それらは、腫瘍抗原を搭載し得、Ｔ細胞及び/又はＢ細胞活性化に使用され得る。
【００５４】
本発明の腫瘍抗原は、Ｂ細胞(EBTB細胞を含む)若しくは樹状細胞により又は対応するエンドソームにより提示可能な抗原である。本出願において、「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞表面に発現される抗原、その抗原的に活性なフラグメント、特にＴ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基又は15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメントを包含する。用語「腫瘍抗原」はまた、抗原提示細胞表面に提示されることなくＢ細胞を刺激し得る、より大きなペプチド又はタンパク質を包含する。このようなより大きな腫瘍抗原ペプチド又はタンパク質は、有利には、US 2007/0134275 A1に開示されるもののような腫瘍細胞溶解物の形態で本発明において使用することができる。
【００５５】
本発明によれば、本発明の腫瘍抗原は、下記からなる群より選択される：ERBB2(HER2)、BIRC5(サービビン)、CEACAM5(CEA)、WDRK46(BING4)、BAGE(BAGE1)、CSAG2(TRAG-3)、DCT(TRP-2)、MAGED4、GAGE1、GAGE2、GAGE3、GAGE4、GAGE5、GAGE6、GAGE7、GAGE8、IL13RA2(インターロイキン13レセプターα２)、MAGEA1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、MAGEB1、MAGEB2、MAGEC2、TP53、TYR(チロシナーゼ)、TYRP1(TRP-1)、SAGE1(SAGE)、SYCP1(HOM-TES-14/SCP1)、SSX2(HOM-MEL-40)、SSX4、KRAS、PRAME、NRAS、ACTN4(α-アクチニン-４)、CTNNB1、CASP8(カスパーゼ-８)、CDC27、CDK4、EEF2、FN1(フィブロネクチン)、HSPA1B(Hisp70)、LPGAT1(KIAA0205)、ME1(リンゴ酸酵素)、HHAT(MART-2)、TRAPPC1(MUM-2)、MUM3、MYO1B(非通常型ミオシンクラス１遺伝子)、PAPOLG(neo-PAP)、OS9、PTPRK(レセプター様タンパク質チロシンホスファターゼκ)、TPI1(トリオースリン酸イソメラーゼ)、ADFP(アディオフィリン)、AFP(α-フェトプロテイン)、AIM2、ANXA2(アネキシンII)、ART4(小胞体耐性タンパク質)、CLCA2、CPSF1(CPSF)、PPIB(サイクロフィリンＢ)、EPHA2、EPHA3、FGF5(フィブロブラスト増殖因子５)、CA9(カルボニックアンヒドラーゼ９)、TERT(hTERT)、MGAT5(GNT-V；N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ)、CEL(腸カルボキシエステラーゼ)、F4.2、CAN(CAN-タンパク質)、ETV6(TEL1)、BIRC7(リビン/ML-IAP)、CSF1(マクロファージコロニー刺激因子)、OGT、MUC1(ムチン)、MUC2、MUM1、CTAG1A(NY-ESO-1；LAGE-2)、CTAG2(NY-ESO-ORF2；LAGE-1)、CTAG(CAMEL)、MRPL28(メラノーマ抗原p15)、FOLH1(前立腺特異的膜抗原)、RAGE、SFMBT1(腎臓遍在性タンパク質１)、KAAG1(RU2AS)、SART1、TSPYL1(SART-2)、SART3、SOX10、TRG、WT1、TACSTD1(Ep-CAM)、SILV(Pmel17；gp100)、SCGB2A2(マンマグロビンＡ)、MC1R、MLANA(MART-1；メラン-Ａ)、GPR143(OA1)、OCA2(Ｐポリペプチド)、KLK3(PSA；前立腺特異的抗原)、SUPT7L(ART-1)、ARTC1、BRAF、CASP5(カスパーゼ-５)、ウロプラキン；CDKN2A、UBXD5(COA-1)、EFTUD2(伸長因子Tu GTP結合性ドメイン含有；nSNRP116)、GPNMB、NFYC、PRDX5(パーオキシレドキシン５)、ZUBR1(RBAF600)、SIRT2、SNRPD1、HERV-K-MEL、CXorf61(KK-LC-1)、CCDC110(KM-HN-1)、VENTXP1(NA88A)、前立腺膜特異的抗原、SPA17(精子タンパク質17)、KLK4、ANKRD30A(NY-BR1)、RAB38(NY-MEL-1)、CCND1(サイクリンD1)、CYP1B1(P450 1B1)、MDM2、MMP2(マトリクスメタロプロテイナーゼ-２)、テラトカルシノーマ由来増殖因子(CRIPTO-1)、ZNF395(PBF；パピローマウイルス結合因子)、RNF43、SCRN1(セセルニン１)、STEAP1(STEAP)、707-AP、TGFBR2(TGF-βレセプタータイプMB)、PXDNL(MG50)、AKAP13(リンパ急性転化(lymphoid blast crisis；Lbc)オンコジーン腫瘍性タンパク質)、PRTN3(プロテイナーゼ３)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、RHAMM(CD168)、ACPP(前立腺酸性ホスファターゼ)、ACRBP(OY-TES-1)、LCK、RCVRN(レコベリン)、RPS2(リボソームタンパク質S2)、RPL10A(リボソームタンパク質L10a)、SLC45A3(プロステイン)、BCL2L1(Bcl-xL)、DKK1(dickkopf-1)、ENAH(ヒトmenaタンパク質)、CSPG4(メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン；MSCP)、RGS5、BCR(切断点クラスター領域)、BCR-ABL、ABL-BCR、DEK(DEK-オンコジーン)、DEK-CAN、ETV6-AML1、LDLR-FUT、NPM1-ALK1、PML-RARA、SYT-SSX1、SYT-SSX2、FLT3(FLT1)、ABL1(プロト-オンコジーンチロシンタンパク質キナーゼ)、AML1(AML)、LDLR(低密度脂質レセプター)、FUT1(GDP-L-フコース)、NPM1(NPM)、ALK、PML1(前骨髄球性白血病；PML)、RARA(RARA α)、SYT、SSX1、MSLN(メソテイン)、UBE2V1(ユビキチン結合酵素変異体Kua)、HNRPL、WHSC2、EIF4EBP1、WNK2、OAS3、BCL-2、MCL1、CTSH(カテプシンＨ)、ABCC3(多剤耐性関連タンパク質３；MPR3)、BST2(HM1.24)、MFGE8(乳脂肪球膜タンパク質BA46；ラクトアドへリン)、TPBG(5T4ガン胎児性抗原)、FMOD(フィブロモジュリン)、XAGE1(XAGE抗原)、RPSA(ガン胎児性(oncofetal)Ag未成熟ラミニンレセプター；OFA-ILR)、COTL1(コアクトシン様１)、CALR3(CRT2)、PA2G4(ErbB3結合性タンパク質１)、EZH2(zesteホモログのポリコーム群タンパク質エンハンサー２；polycomb group protein enhancer of homolog 2)、FMNL1(白血球中のフォルミン関連タンパク質１；formin-related protein in leukocytes 1)、HPSE(ヘパラナーゼ)、APC、UBE2A、BCAP31、TOP2A、TOP2B、ITGB8、RPA1、ABI2、CCNI、CDC2、SEPT2、STAT1、LRP1、ADAM17、JUP、DDR1、ITPR2、HMOX1(ヘムオキシゲナーゼ-１；HO-1)、TPM4(トロポミオシン-４)、BAAT、DNAJC8、TAPBP、LGALS3BP(Mac-2結合性タンパク質)、PAGE4、PAK2(P21活性化セリンキナーゼ２)、CDKN1A(サイクリン依存性キナーゼインヒビター1A)、PTHLH(副甲状腺ホルモン関連タンパク質；PTHrP)、SOX2、SOX11、TRPM8(前立腺特異的タンパク質一過性受容体電位-p8)、TYMS(チミジレートシンターゼ)、ATIC(5'-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド-1-β-d-リボヌクレオチドトランスホルミラーゼ/イノシニカーゼ)、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ１)、SOX4、TOR3A(ATP-依存性インターフェロン応答性；ADIR)、TRGC2(Ｔ細胞レセプターγオルタネートリーディングフレームタンパク質；TARP)、BTBD2(BTBドメイン含有２；BTB domain containin 2)、SLBP(ヘパリン結合タンパク質)、EGFR(表皮増殖因子レセプター)、IER3(最初期応答遺伝子X-1；IEX-1)、TTK(TTKタンパク質キナーゼ)、LY6K(リンパ球抗原Ｂ複合体遺伝子座Ｋ)、IGF2BP3(インスリン様増殖因子(IGF)-II mRNA結合タンパク質３；IMP-3)、GPC3(グリピカン-３)、SLC35A4、HSMD(HMSD-v-コードmHA)、H3F3A、ALDH1A1、MFI2、MMP14、SDCBP、PARP12、MET(c-Metタンパク質)、CCNB1(サイクリンB1)、PAX3-FKHR、PAX3、FOXO1(FKHR)、ユビキリン-１、HOX-B6、IFI27、YB-1、KIAA0136、オステオネクチン、F-boxオンリータンパク質21(F-box only protein 21)、ILF3、UBP3、BRAP-2；H+-ATPase、KOO8-1、MAIAP、Gene AS、BR-1、BR-2、KIAA0603、TPR、NOR-90、N-CAM(ニューロン細胞接着分子)、ルイスＹ糖鎖抗原、Ep-CAM(上皮細胞接着分子)、MUC-1タンパク質、36P6D5、シアリルTn糖鎖抗原、Globo H糖鎖、CA 125、CA 19-9、CA 15-3、TAG-72、Her2/Neuレセプター、p97、CD20、CD21、WT1遺伝子の発現産物。
【００５６】
更に有用な腫瘍関連抗原は、例えば、DeVitaら編，Biological Therapy of Cancer 第２版，第３章：Biology of Tumor Agents. Lippincott Comp. 1995に記載されている。
本発明で有用な扁平上皮細胞ガン腫抗原はUS 2007/0009501 A1に開示されている。
更なる腫瘍関連抗原は、米国特許第7,524,930号、同第7,427,660号、同第7,408,037号、同第7,432,354号、同第7,232,887号、同第7425607号、同第7,084239号に開示されている。
本発明によれば、本発明の腫瘍抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドが開示される。ポリヌクレオチドは、プロテアーゼによって腫瘍抗原ペプチドが切断され得る融合タンパク質産物をコードすることが可能なポリヌクレオチドに包含されていることが好ましい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、天然型Ｂ細胞、樹状細胞又は本発明のEBTB細胞を遺伝子改変して、該細胞に融合タンパク質を発現させ、本発明の腫瘍抗原ペプチドに変換するために使用することができる。よって、遺伝子改変した細胞は、表面に本発明の腫瘍抗原ペプチドを保有するエキソソームを放出し得る。しかし、細胞質に抗原を保有するエキソソームを製造するための技術もまた存在する。
【００５７】
本発明によれば、下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)単離したＢ細胞をエプスタイン・バーウイルス(EBV)に感染させること；
(ｄ)感染Ｂ細胞を潜伏期(但し、gp350は発現する)に形質転換すること；
(ｅ)EBV形質転換Ｂ細胞をガン抗原の存在下で培養すること；
(ｆ)EBV形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｇ)採集したエキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法が開示される。
或いは、EBV形質転換Ｂ細胞をガン抗原の存在下で培養することに代えて又は加えて、本方法は、採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載エキソソームを製造することを含んでなる。
【００５８】
本発明によれば、下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルから単球を単離すること；
(ｃ)単球を未成熟樹状細胞に培養すること；
(ｄ)未成熟樹状細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること;
(ｅ)改変未成熟樹状細胞をガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載成熟樹状細胞に形質転換させること；
(ｆ)成熟樹状細胞から放出されたガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを採集すること；
(ｇ)ガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法が開示される。
【００５９】
本発明によれば、更に、下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離し；Ｂ細胞を培養すること；
(ｃ)Ｂ細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること；
(ｄ)CD21結合性成分を発現する改変Ｂ細胞をガン抗原と接触させること；
(ｅ)ガン抗原に接触した改変Ｂ細胞から放出されたガン抗原搭載エキソソームを採集すること；
(ｆ)ガン抗原搭載Ｂ細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法が開示される。
或いは、改変Ｂ細胞をガン抗原と接触させることに代えて又は加えて、本方法は、採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載エキソソームを製造することを含んでなる。
【００６０】
本発明に従うガン治療法では、CD21結合性タンパク質成分が下記の１又は数個を含んでなることが好ましい：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-α。
本発明によれば、更に、本発明の方法により取得されたか又は取得可能であるエキソソーム；エキソソームの製造方法；エキソソームを含んでなるガンワクチン；インビトロでエキソソームにより刺激されたＴ細胞；CD21結合性成分、特に下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αからなる群より選択されるCD21結合性成分を含んでなるＢ細胞又は樹状細胞(DC)エキソソームが開示される。
本発明は、特定タイプのガンの治療に限定されない。しかし、乳ガン、膀胱ガン、皮膚ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、甲状腺ガン、胃ガン、頭部頸部ガン、メラノーマからなる群より選択されるガンの治療への適用が好ましい。
以下で、幾つかの好適な実施形態(その一部は幾つかの図で説明される)に言及することで本発明をより詳細に説明する。
【００６１】
図面の説明
図１は、EBV形質転換Ｂ細胞エキソソーム(EBTB-exo)及びバーキットリンパ腫細胞株(BJAB)のエキソソームの天然型Ｂ細胞への付着(抗CD18及び抗CD21並びに対応するアイソタイプコントロール抗体による相互作用のブロッキングを含む)を説明するグラフである；
図2a、2bは、３人のドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)中のエキソソーム陽性細胞(１時間及び４時間でのフローサイトメトリによるPKH67+シグナルとして測定)のDCエキソソームパーセンテージ(PBMCについて平均＋s.d.)を説明するグラフである；
【００６２】
図３は、３人のドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)中のエキソソーム陽性細胞(４時間でのフローサイトメトリによるPKH67+シグナルとして測定)のEBVエキソソームパーセンテージ(PBMCについて平均＋s.d.)を説明するグラフである；
図４ エキソソームはPBMC中の特定の亜集団を標的する。PKH67染色した(Ａ，Ｄ)DC-、(Ｂ，Ｅ)LCL1-及び(Ｃ，Ｆ)母乳-エキソソームを、健常な血液ドナーからのPBMCと１時間(Ａ〜Ｃ、ｎ＝９)及び４時間(Ｄ〜Ｆ、ｎ＝８)インキュベートした。10μgのエキソソーム/５×105 PBMCを添加した。バックグランドコントロールとして、並行して遠心分離したPKH67色素ペレットを使用した(これは低くて検出不可能な蛍光を示した；データは示さず)。エキソソームの結合は、四色フローサイトメトリにおいてサンプルあたり104イベントを収集して測定した。データは、各亜集団の細胞中のPKH67+細胞のパーセントとして表す。バーは平均値を示す。異なる血液ドナーを個別記号で示す。
【００６３】
図５ エキソソームは主に単球によって内在化される一方で、Ｂ細胞の細胞膜に結合する。PBMCを、PKH67染色した(Ａ)DC-、(Ｂ)LCL1-及び(Ｃ)母乳-エキソソームと４時間インキュベートし(10μgのエキソソーム/５×105 PBMC)、次いで抗CD14又は抗CD19のいずれかについて染色し、続いてAlexa Fluor 546標識した(赤色に見える)。細胞を共焦点レーザ走査顕微鏡観察により分析した。バックグランドコントロールとして、並行して遠心分離したPKH67色素ペレットを使用した(これは検出不可能な蛍光を示した；データは示さず)。スケールバーは10μmを表す。PBMCの画像は２つ実験のうちの代表的実験として示す。(Ｄ)ImageStream分析により、HLA-DR+CD14+細胞が主にエキソソームを内在化することが示される。一例として、４時間後の、PKH67+母乳エキソソーム(10μgのエキソソーム/５×105 PBMC)とHLA-DR+CD14+細胞との相互作用のヒストグラムをプロットする。表面エキソソーム(<0)又は内部エキソソーム(>0)を有する細胞の合成画像を示す；HLA-DR(ピンク)、CD14(オレンジ)及びPKH67+エキソソーム(グリーン)。左下の画像中に10μmに対応するバーを示す。異なる血液ドナーを使用した２つの実験うちの代表的実験として結果を示す。少なくとも104の合計イベントを各サンプルについて収集した。(Ｅ)HLA-DR+CD14+細胞に結合したエキソソームのパーセンテージ及び内在化エキソソームを有する細胞のパーセンテージ(内在化特徴(Internalization feature)により算出)を挿入表に示す。内在化特徴で２千イベントを分析した。
【００６４】
図６ LCL1由来エキソソームとＢ細胞との間の結合は、温度非依存性である。PBMCを、DC、EBV形質転換Ｂ細胞又は母乳に由来するPKH67標識エキソソームと、37℃又は４℃で１又は４時間インキュベートし、図１に記載したように分析した。バーは、HLA-DR+細胞の各亜集団内でのエキソソーム陽性細胞(フローサイトメトリによりPKH67+シグナルとして測定)のパーセンテージを表す。３人の異なるドナーからのPBMCについての平均及びs.d.を示す。
【００６５】
図７ Ｂ細胞とEBV形質転換Ｂ細胞由来エキソソームとの間の相互作用は、CD21とgp350との間の相互作用によって媒介される。PBMC培養物を、抗CD21、抗CD18又はアイソタイプ適合コントロール(20μg/ml)で処理した後、LCL1-エキソソーム(Ａ)又はBJAB-エキソソーム(Ｂ)を４時間添加した。(Ｃ)LCL1-エキソソームを72A1マウスハイブリドーマからの抗gp350上清(総容量の30％)、抗CD23(30μg/ml)又はアイソタイプ適合コントロールとプレインキュベートし、次いで精製Ｂ細胞に４時間添加した。代表的なフローサイトメトリドットプロット(パーセンテージ数を含む)により、アイソタイプコントロール(上)又は抗gp350 mAb(下)で処理したＢ細胞とのLCL1-エキソソームの結合が示される。分析は図１に記載したように行った。３人の異なるドナーからのPBMCについての平均及びs.d.を示す(Ａ〜Ｃ)。(Ｄ)フローサイトメトリヒストグラムは、gp350の細胞外発現及び細胞内発現を、BJAB細胞(グレー)とLCL1細胞(黒線)とを比較して示す。１万の細胞を分析した。(Ｅ)LCL1エキソソーム調製物及びBJABエキソソーム調製物からのスクロースグラジエント画分のペレットを、LMP1、gp350、CD81及びHLA-DRに対するAbを用いるイムノブロットで分析した(下パネル)。各画分の密度を屈折率測定により決定した。３つの実験のうちの代表的実験を示す。
【００６６】
図８ エキソソームシグナルはエキソソームに由来し、ビリオンに由来しない。(Ａ)エキソソーム調製物中の感染性EBVの存在を調べるために、10 000×ｇペレット並びにBJAB及びLCL1の上清(SN)からのエキソソーム調製物(100 000×ｇ)を臍帯血単核細胞(CBMC)に添加し、33日後にLCLの増殖を3H-チミジン組込みによりモニターした。EBV産生性B95-8細胞からの上清を陽性コントロールとし、細胞培養培地単独を陰性コントロールとした。３つの異なるBJAB及びLCL1上清調製物からの10 000×ｇペレットを１人のCBMCドナーで試験した。５つの異なるBJAB及びLCL1エキソソーム調製物を５人の異なるCBMCドナーで試験し、平均値で示した。(Ｂ)Ｂ細胞表面に結合したエキソソームの代表的画像。(Ｃ)TEM画像は、ネガティブ染色により、プロセシングされたLCL1エキソソーム調製物を示す。(Ｂ及びＣ中の)矢印はエキソソームを示す。(Ｄ)免疫EMにおいて、CD63(矢印１)及びHLA-DR(矢印２)に対するmAbをLCL1エキソソーム調製物に添加し、金接合二次Ab(それぞれ10nm及び15nm)により検出した。(Ｅ)LCL1-エキソソーム、BJAB-エキソソーム及びEBVからの調製物中の粒子サイズ分布のNanoSight測定。データは平均値(ｎ＝３)として示し、サイズ比較のために１に規格化した。
【００６７】
図９ エキソソームは、OVAパルスした骨髄DC培養物の上清から調製した(OVAExo)。OVAExo上にC3dを連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。C3d連結Ovaエキソソームを抗CD9ラテックスビーズと一晩インキュベートした。次いで、エキソソームを、それぞれPE又はFITCに接合した(Ａ)抗MHCクラスII又は(Ｂ)抗C3d抗体で標識し、FACSにより分析した。
【００６８】
図10 エキソソームは、OVAパルスした骨髄DC培養物の上清から調製した(OVAExo)。OVAExo上にC3dを連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。インビトロ増殖アッセイのために、OVA TCRトランスジェニック脾臓細胞(DO11.10)をcfseで標識し、OVAExo又はC3dOVAExoと５日間37℃にてインキュベートした。増殖細胞中のCfse希釈をフローサイトメトリにより分析した。結果を総脾臓細胞の％増殖細胞として示す。
【００６９】
図11 エキソソームは、OVAパルスした骨髄DC培養物の上清から調製した(OVAExo)。OVAExo上にC3dを連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。BALB/cマウスに25マイクログラムのOVAexo又はC3dOVAExoを注射し、３日後に脾臓細胞をFACSで分析した。
図12 OVAExo上にC3dと連結するため、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化させた。DO11.10 OVAトランスジェニック脾臓細胞をBALB/cマウスに養子移入し、続いて翌日25マイクログラムのOVAexo又はC3dOVAExoを注射し、３日後に脾臓細胞をFACSで分析した。
【００７０】
図13 CFSE標識OT-I脾臓細胞を野生型C57BL/6マウスに移入し、続いて翌日、OVA間接搭載エキソソーム(Exo-OVA)又はCD8 OVAペプチド直接搭載エキソソーム(Exo-SIIN)又はコントロール(Exo-BSA)を注射した。５日後、脾臓細胞をCFSE希釈について、OVA特異的CD8+細胞の増殖についてのFACSによって分析した。
図14 図14Aは、マウスにおける免疫スケジュールを説明する。Ｔ細胞をマウスに注射し、その１日後エキソソームを投与し、その４日後に免疫応答を測定する。図14Bは、直接搭載エキソソーム(Pep-Exo)、間接搭載エキソソーム(OVA-exo)、未搭載エキソソーム(Exo)を用いた免疫応答を示す。PBSはバックグランドである。KJ1-26は、DO11.10tg TCRを特異的に認識するモノクローナル抗体である。
【実施例】
【００７１】
下記の実験の節では、指針として例示的な実施例を提供する。これら実施例は、如何様にしても、本発明を限定するものとして解釈されるべきでない。
【００７２】
実験の節
エキソソームと天然型Ｂ細胞及び末梢血単核細胞との相互作用
エキソソームは、ヒトエプスタイン・バーウイルス形質転換Ｂ細胞株(EBTB細胞株)及びEBV-バーキットリンパ腫細胞株(BJAB細胞株)の培養上清から単離した。エキソソームを、天然型Ｂ細胞(図1a、1b)及びPBMC培養物中の異なる細胞(図2a、2b)に対する接着に関して比較した。エキソソームを、膜一般の色素PKH67(Morelli A Eら，Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood 2004, 104: 3257-3266で直接染色した。PKH67での染色後もエキソソームが構造を保持しているかを調べるために、PKH67を磁性抗MHCクラスIIビーズに結合させた(Clayton, Aら，Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. J Immunol Methods 2001, 247: 163-174)。フローサイトメトリ分析により、緑色蛍光MHCクラスII含有ベシクルがビーズに捕獲されたことが示され、透過型電子顕微鏡観察(TEM)で、インタクトな脂質二重層を有するナノベシクルが表示された。このことは、PKH67標識がエキソソームの形態と干渉しなかったことを示している。次いで、異なるエキソソームを天然型Ｂ細胞又はヒトPBMCと共に４時間インキュベートし、多色フローサイトメトリにより分析した。抗CD18又は抗CD21(20μg/ml)での天然型Ｂ細胞の処理を、エキソソームとのインキュベーションに先行させた。サンプルあたり１万細胞を分析した。
【００７３】
Ｂ細胞エキソソームとＢ細胞との間の相互作用は、大部分がエネルギー非依存性であり、したがって接着分子又は表面レセプターにより媒介されている可能性がより高い。EBTBエキソソームはＢ細胞レセプターを発現し、これが異なるパターンの接着分子、例えばICAM-1及びインテグリン(Clayton Aら，Adhesion and signaling by B cell-derived exosomes: the role of integrins. Faseb J 2004, 18: 977-979)と共に、EBTBエキソソームの観察された強力なＢ細胞嗜好性を媒介している可能性がある。しかし、この接着効果は、或いは又は追加的に、EBTBエキソソーム表面に発現した、EBV形質転換によりアップレギュレートされた記憶性(reminiscent)EBVタンパク質又は他のタンパク質により媒介されている可能性もある。
【００７４】
EBTBエキソソームのＢ細胞標的化が他のＢ細胞エキソソームのものと類似しているのか又はEBTBエキソソームに特異的であるのか(gp350の関与の可能性)を調べるために、EBTBエキソソームのＢ細胞結合能を、EBV-バーキットリンパ腫Ｂ細胞株BJAB27からのエキソソーム(BJABエキソソーム)のものと比較した。BJABエキソソームは、EBTBエキソソームと比較して、天然型Ｂ細胞に対して遥かにより小さな程度で結合することが見出された。このことはこの結合へのEBVの関与を示唆する(図３)。結合の特異性を明らかにするために、抗CD21によるCD21のブロッキングを試みた。抗CD21はEBTBエキソソームと天然型Ｂ細胞との間の相互作用を効率的にブロックすることが見出された。このことは、Ｂ細胞とEBTBエキソソームとの間の結合が天然型Ｂ細胞上のレセプターCD21とEBTBエキソソーム上のリガンド(恐らくはgp350又はCD23)との間の相互作用により引き起こされることを示唆する。この結合におけるLFA-I(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)及びp150,95(CD11c/CD18)のようなインテグリンの更なる関与を排除するために、これらインテグリンを抗CD18によりブロックした。しかし、図３から明らかなように、このブロッキングは、EBTBエキソソームと天然型Ｂ細胞との間の相互作用に影響しない。よって、CD21がＢ細胞/Ｂ細胞エキソソームの結合に必須でありそうである。
【００７５】
EBV粒子がEBTB細胞株に存在する可能性、よってEBV粒子がエキソソーム調製物に混入し得るリスクを、Ｂ細胞に結合したPKH67染色ベシクルが確かにエキソソームであり、EBV粒子でないことを確かめることにより排除した。EBV+ Ｂ細胞からのエキソソーム調製物及びエキソソームとＢ細胞との共培養物からのサンプルを、TEMにより注意深く検査した。ウイルス粒子はエキソソーム中にも、Ｂ細胞上にも検出できなかった(データは示さず)。
【００７６】
異なる細胞タイプがその起源の細胞を反映する表現型を有するエキソソームを産生することは公知である一方で、異なる細胞タイプからのエキソソームが細胞の標的化においてどのように異なるのかという疑問は未解明のままであった。起源とは無関係に、天然型エキソソームは、ヒト末梢血中に同じ主標的、すなわちHLA-DR+CD14+細胞を有するようである(天然型エキソソームはこの細胞によって能動的に貪食されるようである)ことが見出された。しかし、EBTBエキソソームは、特異性をHLA-DR+CD14+細胞から天然型Ｂ細胞に変化させたエキソソームを産生することが見出された。このことは、EBV- Ｂ細胞株であるBJAB細胞株からのエキソソーム(BJABエキソソーム)をEBV+ Ｂ細胞株であるEBTB細胞株からのエキソソーム(EBTBエキソソーム)と比較することによって証明された。EBTBエキソソームと天然型Ｂ細胞との間の高い相互作用は、抗CD21により効率的にブロックすることができたが、抗CD18ではブロックすることができなかった。標的されたＢ細胞とのこの新規な連絡機序は、EBV感染個体におけるインビボ状況をも反映する可能性がある。これは、EBVに対する長期免疫保護における重要な役割を有する可能性がある。
【００７７】
方法
エキソソーム供給源。カロリンスカ大学病院の血液バンクにある健常血液ドナーからのバフィーコートを、末梢血単核細胞(PBMC)のFicoll Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)分離に使用した。エプスタイン・バーウイルス(EBV)形質転換Ｂ細胞株は、ウィーン医科大学(Vienna, Austria)のBarbara Bohle博士の厚意により寄贈されたものであった。EBV陰性リンパ腫Ｂ細胞株BJABは、カロリンスカ研究所のMichael Karlssonの厚意により寄贈されたものであった。
エキソソーム単離。エキソソームは、細胞培養上清(Ｂ細胞株)から差分遠心分離を用いて単離した。すなわち、300×ｇにて10分間から始めて細胞を除去し、続いて3,000×ｇにて20分間、次いで10,000×ｇにて30分間、４℃で超遠心分離(Ti45 rotor in Optima L-100 XP Ultra centrifuge, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)して上清から可能性のある細胞残渣を涸渇させた。100,000×ｇで70分間の超遠心分離によりエキソソームをペレット化し、その後PBS中で洗浄し、最終の超遠心分離を繰り返した。最終の洗浄直後にペレット化エキソソームを小量のPBS中に再懸濁し、BioRad Dcアッセイ(BioRad, Hercules, CA, USA)を製造業者のプロトコルに従って用いてタンパク質濃度を決定した。４つのエキソソーム供給源の各々から同量のタンパク質を使用した。
【００７８】
末梢血単核細胞とエキソソームとの同時インキュベーション。健常血液ドナーからのバフィーコートを新鮮な単離PBMCの供給源として使用した。細胞は、製造業者の指示に従ってFicoll Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech AB)で単離した。ACK溶解緩衝液(0.15Ｍ NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA、pH7.2)を５分間使用して、残存する赤血球を溶解させた。PBMCを、６mlチューブにおいて、CCM中、PKH67+エキソソームと10μg/５×105細胞で37℃にて４時間インキュベートした。幾つかの実験は４℃で行った。
【００７９】
エキソソーム染色。エキソソームを、膜一般の標識のために緑色蛍光色素PKH67(Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)を用いて染色した。100,000×ｇにて70分間の遠心分離(NVT90 rotor, Beckman Coulter)によりエキソソームをPBSから希釈剤Ｃ(Sigma)溶液中に移した。PKH67染色液は、エキソソームサンプル(希釈剤Ｃ中300μg/mL)と同量の４μMの２×ストックに希釈し、このストックを小さな0.2μmシリンジフィルター中で濾過して、この染色液により形成されている可能性のある凝集物を除去した。次いで、エキソソームサンプルを、0.2nmシリンジフィルターに通して、PKH67ストック溶液と1:1で混合し、RTで５分間染色した。その後、１％ BSAで１分間停止させた。次いで、エキソソームをCCMで洗浄し、上記のようにNVT90ローターで遠心分離した。ペレットを注意深くリンスして未結合PKH67染色液を除去した。予備的な顕微鏡分析により、エキソソームが染色後凝集物を形成した(データは示さず)ので、CCM中に再懸濁し、小容量0.2μmシリンジフィルターで濾過した直後に細胞に添加した。コントロールとして、同濃度のPKH67を並行して遠心分離し、可能性のあるペレット化未結合染色液についてのバックグランドコントロールを作成した。
【００８０】
PKH67染色エキソソームとPBMCとの同時培養。予め濾過したPKH67染色エキソソームを、１時間及び４時間37℃にて、温度研究の間には４℃にても、PBMCに添加した。10μgのエキソソーム/５×105 PBMCを添加した。バックグランドコントロールとして、並行して遠心分離したPKH67色素ペレットを使用した。
【００８１】
透過型電子顕微鏡観察(TEM)。抗HLAクラスII磁性ビーズでエキソソームを捕獲した(Clayton, Aら，Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. J Immunol Methods 2001, 247: 163-174)。ビーズを、0.1Ｍスクロース及び３mM CaCl2を含有する0.1Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中２％のグルタルアルデヒドで４℃にて一晩固定し、遠心分離してペレットにした。ペレットを、３mM CaCl2を含有する0.15Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中でリンスし、続いて1.5mM CaCl2を含有する0.07Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)中２％の四酸化オスニウムで４℃にて２時間、後固定し、エタノール中続いてアセトン中で脱水し、LX-112(Ladd, Burlington, Vermont, USA)中に包埋した。切片を酢酸ウラニルで、続いてクエン酸鉛で対比染色し、Tecnai 10透過型電子顕微鏡(Fei, Acht, The Netherlands)で80kVにて検査した。Mega View IIIデジタルカメラ(Soft Imaging System, GmbH, Munster, Germany)によりデジタル画像を得た。
【００８２】
フローサイトメトリ。２つの異なるマウスモノクローナル(m)Abパネルを使用してPBMCを染色した：「APC」抗HLA-DR(MHCクラスII)PECy5、抗CD14-PE及び抗CD19パシフィックブルー(又はPE-テキサスレッド)と、「Ｔ細胞」抗CD8 APC(又はPECy5)、抗CD4 PE及びCD3パシフィックブルー(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)。ゲーティングは、先ず、FSC/SSCでリンパ球/単球について行った。パネルAPCについては、、HLA-DR+CD14+及びHLA-DR+CD14-集団を先ずゲート通過させた。次いで、HLA-DR+CD14-細胞のうち、CD19+細胞をゲート通過させた。Ｔ細胞パネルについては、リンパ球/単球ゲートから直接、CD3+CD4+ 対 CD3+CD8+として集団を選択した。各亜集団については、対応するPKH67+ゲートを、エキソソームなしサンプルについて設定した。サンプルをFACS Ariaフローサイトメータ(BD Biosciences)に流した。各個体からのデータ収集の前に単一染色細胞の補償コントロールを行なった。補償は、獲得データの分析に使用したFACS Diva(BD Biosciences)ソフトウェアにより自動的に算出した。リンパ球/単球ゲートにおいて、サンプルあたり10,000イベントを収集した。
【００８３】
共焦点レーザ走査顕微鏡観察(CLSM)。PKH67+エキソソームとの４℃又は37℃での４時間のインキュベーション後、PBMCを４％ホルムアルデヒドで15分間固定した。染色は、抗CD3、抗CD14又は抗CD19 mAb(BD Biosciences)のいずれかを製造業者の指示に従って用いて行い、続いてPBSで洗浄した。Alexa Fluor 546で標識した二次ヤギ抗マウスmAb(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)を検出に使用した。サイトスピン(cytospin)後、90％グリセロールを用いてスライドにマウントした。１つのアルゴンレーザ及び２つのHeNeレーザを備えたCLSM(TCS SP2；Leica Microsystems, Mannheim, Germany)で蛍光画像を得た。PKH67を488nmレーザ線で励起し、490〜530nmの波長範囲で光を検出した。Alexa 546は543nmレーザ線で励起し、580〜700nmの範囲で光検出を行った。
【００８４】
ImageStream分析。エキソソームを染色し、フローサイトメトリ用に上記のようにPBMCとインキュベートした。細胞をImageStream(登録商標)マルチスペクトルイメージングフローサイトメータに流し、IDEAS(登録商標)画像分析ソフトウェア(Amnis Corporation, Seattle, WA, USA)を用いて画像を分析した。各サンプルにおいて10 000イベントを収集し、単一染色補償コントロールを使用して、ピクセルごとを基準にしてチャンネル画像間の蛍光を補償した。FACSの原理に従ってゲーティングを行った。内在化特徴を用いてPKH67蛍光の細胞内位置を測定した。内在化特徴は、細胞全体の強度に対する細胞内強度の比として規定される。スコアが高いほど、細胞内の強度集積が大きくなる。細胞の内部は、細胞膜にフィットするマスクの侵食(erosion)により定義される。この特徴は細胞サイズに対して不変であり、高密度の輝く領域及び小さな薄暗いスポットに対応する(accommodate)ことができる。ダイナミックレンジを[-inf, inf]間の値にまで増大させるために、比をログスケールにマッピングする。主に内部蛍光を有する細胞は正のスコアを有し、内在化をほとんど示さない細胞は負のスコアを有する。
【００８５】
ブロッキングアッセイ。PBMC(106/ml)を、CD18に対するmAb(クローンMEM48)、CD21に対するmAb(クローンB-E5)又はアイソタイプ適合Ab(20μg/ml；Nordic BioSite, Taby, Sweden)のいずれかと細胞培養培地中30分間、RTにてインキュベートし、その後、PBSで洗浄した後、エキソソームを10μg/５×105細胞で37℃にて１又は４時間添加した。FACS分析を前記のように実施した。LCL1-エキソソームを、抗CD23(クローン9P25、30μg/ml Beckman Coulter)又はgp350/250中和化mAb 72A1(DSMZ, Braunschweig, Germany)を産生するマウスハイブリドーマ培養物からの上清(総容量の30％)で処理した。無関係のアイソタイプコントロール又はハイブリドーマ上清をコントロールとして使用した。RTの細胞培養培地中で30分後、前処理したLCL1-エキソソームをＢ細胞に４時間添加した(10μg/2.5×105細胞)後、FACS分析を行った。Ｂ細胞は、Ｂ細胞単離キットII(Miltenyi Biotech)を用いて、PBMCから単離した。
【００８６】
細胞内フローサイトメトリ染色。LCL1-及びBJAB細胞(５×104)を４％ホルムアルデヒドで５分間RTにて固定した。PBSでの３回の洗浄工程後、細胞を10分間、１％サポニン溶液中RTにてインキュベートした。RTのマウスハイブリドーマ培養物からの上清を１時間添加することにより、gp350/250に対する一次mAb 72A1で細胞を染色した。0.1％サポニン溶液での２回の洗浄工程後、細胞を二次Alexa Fluor 488(Invitrogen, CA, USA)Abと45分間RTにてインキュベートし、洗浄してフローサイトメトリにより分析した。
【００８７】
スクロースグラジエント。エキソソーム調製物の画分を、以前(５)に記載されたようにスクロースグラジエントにより収集した。これらは、フローサイトメトリ分析のためには抗MHCクラスII Dynaビーズ(Dynal, Oslo, Norway)に直接搭載し、イムノブロット分析のためには200 000×ｇで35分間４℃にての遠心分離によりペレット化した。
【００８８】
イムノブロット分析。各ペレット化エキソソーム画分をSDS-PAGE(12％)により分離し、ポリビニリデンジフルオリドメンブレン(Millipore, MA, USA)に移した。膜を、LMP1に対するmAb(クローンCS. 1.4；DakoCytomation)、gp350に対するmAb(クローン2L10, Millipore, MA, USA)、CD81に対するmAb(クローンH-121, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)又はHLA-DRに対するmAb(クローンTAL.1B5, DakoCytomation, Glostrup, Denmark)で製造業者の指示に従って染色した。ECLアドバンスウェスタンブロッティング検出キットでメンブレンを可視化し、Hyperfilms(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)に露光した。
【００８９】
臍帯血形質転換アッセイ。現地の倫理委員会の承認を得てカロリンスカ大学病院から得たヘパリン処理臍帯血サンプルを、Ficoll Paque密度遠心分離に供した。百万の臍帯血単核細胞(CBMC)を、湿潤インキュベータ(37℃、５％ CO2)中で、BJAB若しくはLCL1上清からの10 000×ｇペレットと又は24μgのBJAB若しくはLCL1エキソソーム調製物と1.5時間インキュベートした。CBMCを洗浄し、完全RPMI中に106細胞/mLで再懸濁し、96ウェルプレートに５連で２×105細胞/ウェル/200μLにて播種した。EBV誘導細胞形質転換の陽性コントロールとして、CBMCをB95-8ウイルス含有上清に曝露した。培養培地を陰性コントロールとした。CBMCに毎週新鮮な培地を供給した。33日目に、形質転換を、典型的な細胞凝集物の出現及びチミジン組込みアッセイにより視覚的に記録した。１μCiの3H-チミジン(GE Healthcare)を培養物に添加し、16時間インキュベートした。CBMCをグラスファイバーフィルター上に採集し、シンチレーションカウンター(1205 Betaplate, Wallac)で放射能を測定した。
【００９０】
NanoSight。高速ビデオキャプチャ及び粒子追跡ソフトウェア(NanoSight Ltd., Amesbury, UK)を備えたNanoSight(登録商標)LM10システムを用いてブラウン運動の速度を測定することによって、エキソソーム調製物内でのサイズ分布を分析した。コントロールとして使用したEBV(B95-8株)は、Kerstin Falk博士(カロリンスカ研究所、微生物・腫瘍・細胞生物学部門)の厚意により寄贈されたものであった。NanoSightでの分析の前に、EBVを56℃で20分間熱不活化した。
【００９１】
統計分析。対応のある対のWilcoxon検定を使用し、GraphPad Prismソフトウェアバージョン4.03を用いて群間の差を比較した。0.05未満のＰ値を有意と見なした。
【００９２】
EBV感染Ｂ細胞株の作製。Ｂ細胞を含んでなる単核細胞懸濁物は、本発明の方法による処置のために選択したメラノーマガン患者又は免疫学的に匹敵するドナーから取得した末梢血(50ml)から単離した。EBV感染Ｂ細胞株(EBTB細胞株)は、この懸濁物から、Tosato及びCohen(Curr Protoc Immunol 2007, 7.22.1-7.22.4)より考案されたプロトコルに従って調製した。
【００９３】
EBTBエキソソームの単離。EBTBエキソソームは、EBTB細胞株から、基本的には天然型Ｂ細胞からのエキソソームについて上記したように単離した。
【００９４】
EBTBエキソソーム搭載。N Chaputら(Exosomes as potent cell-free peptide-based vaccine. II. Exosomes in CpG adjuvants efficiently prime native Tc1 lymphocytes leading to tumor rejection. J immunol 2004, 172:2137-2146)及びD H Hsuら(Exosomes as a tumor vaccine enhancing potency through direct loading of antigenic peptides. J Immunol 2003, 26:2137-2364)の方法を適合させることにより、単離したEBTBエキソソームにMHCクラスＩ及びIIペプチド又はガン抗原ペプチドを搭載した。
【００９５】
抗原搭載ETBTエキソソームの精製。抗原搭載EBTBエキソソームは、B. Escudierら(Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic (DC) derived-exosomes: results of the first phase I clinical trial. J Translat Med 2005, 3:10)の方法により精製した。
【００９６】
インビトロでCD40/IL-4刺激したＢ細胞株エキソソーム。カロリンスカ大学病院の血液バンクの健常血液ドナーからのバフィーコートを、末梢血単核細胞(PBMC)のFicoll Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)分離に使用した。３つの並行する約１・105 PBMCの培養物を各々樹立し、Wiesnerら(前出)のプロトコルに従って刺激した。この細胞株の２つは70日間維持された一方、３つめの細胞株は約３週間後に増殖が停止した。２つの長期CD40刺激Ｂ細胞株は、EBV感染リンパ芽球及びその他の細胞タイプを含まないことが見出された。エキソソームは、２つのうちの１つの細胞培養物の上清から、ETBTエキソソームについて上記したものと同じ様式で単離した。単離エキソソームに腫瘍抗原を搭載し、ETBTエキソソームについて上記したように精製した。
【００９７】
結果
ヒトDC及び母乳に由来するエキソソームは単球を標的する一方、LCL1エキソソームはＢ細胞を好む
免疫細胞への異なるエキソソームの結合を解明するために、本発明者らは、ヒト単球由来DC、EBV形質転換リンパ芽球様Ｂ細胞株(LCL1)及びヒト母乳から単離したエキソソームをPBMCへの接着に関して比較した。エキソソームを、フローサイトメトリにより検出可能である緑色蛍光膜色素PKH67で染色した。エキソソームが適切に標識されているかどうか及びPKH67での染色後に構造が保持されていることを調べるために、エキソソームを磁性抗MHCクラスIIビーズに結合した。フローサイトメトリ分析により、緑色蛍光MHCクラスII含有ベシクルがビーズに捕獲されたことが示され、TEMで、インタクトな脂質二重層を有するナノベシクルが表示された。このことは、PKH67標識がエキソソームの形態と干渉しなかったことを示す。次いで、異なるエキソソームをPBMCと１時間又は４時間インキュベートし、多色フローサイトメトリにより分析して、細胞へのエキソソームの結合パターンを解明した。１時間後、DC由来エキソソームは、主に、単球(HLA-DR+CD14+；平均46％)と相互作用する一方、17％のみがＢ細胞(HLA-DR+CD14-CD19+)に結合した(図4A)。対照的に、LCL1エキソソームは、Ｂ細胞に関して強力な嗜好性を有する逆の結合パターンを示した。Ｂ細胞の63％がLCL1エキソソームについて陽性であった一方で、平均で僅かに17％の単球が１時間でこれらエキソソームと結合した(図4B)。４時間のインキュベーション後、各細胞集団内のエキソソーム陽性細胞のパーセンテージは概して増加したが、異なる細胞集団に対する異なる結合パターンは残っていた(図4D〜F)。乳エキソソーム相互作用は、１時間のインキュベーション後で概して低かった(図4C)。しかし、４時間では、単球の55％及びＢ細胞の18％が乳エキソソームと結合し(図4C)、DCエキソソームの１時間でのパターンと似ていた。以前に、本発明者らは、乳エキソソーム調製物は、エキソソームベシクルの含有量がエキソソームペレット中の総タンパク質量に関して他のエキソソームタイプからのペレットと比較して低いことを見出している。したがって、乳エキソソームの量を５倍(50μg/５×105 PBMC)に増やすと、１時間での乳エキソソーム相互作用のレベルは単球とは平均64％に、Ｂ細胞とは平均26％に達する(ｎ＝３、データは示さず)。これらは、DCエキソソームと10μg/５×105 PBMCでインキュベートしたときに１時間で観察されるものに匹敵するレベルである。このことは、他のエキソソーム調製物と比較して、乳エキソソーム調製物の非エキソソームタンパク質量が高いことを示唆している。
【００９８】
Ｔ細胞はPBMCの多数を構成する(本発明者らの研究では、およそ70％)が、CD4+又はCD8+Ｔ細胞の８％未満が４時間後にいずれかのエキソソームとの結合を示した(図４)。異なるエキソソームタイプで、CD8+ Ｔ細胞と比較して、CD4+ Ｔ細胞への嗜好性に一貫した差は観察されなかった。
【００９９】
エキソソームは、主に、Ｂ細胞の細胞膜に結合するが、単球によって内在化される
次に、本発明者らは、異なる細胞タイプ内でエキソソームが何処に局在するかを調べた。本発明者らは、PKH67標識エキソソームをPBMCとインキュベートし、エキソソーム結合を共焦点レーザ走査顕微鏡観察(CLSM)により分析した。おそらくはフローサイトメトリと比較して低いCLSMの検出レベルに起因して、１時間では、概して、細胞に関連したエキソソームシグナルは検出できなかったか又は弱いシグナルしか検出できなかった(データは示さず)。４時間後、DCエキソソームは、主に、単球(CD14+)により内在化され、Ｂ細胞(CD19+)ではより少ない程度であり、Ｂ細胞は、多くの場合で、細胞膜結合エキソソームを有していた(図5A)。対照的に、LCL1エキソソームはＢ細胞と、より高い程度に相互作用し、主に細胞膜に局在していた(図5B)。単球は、LCL1 Ｂ細胞エキソソームに関して、より弱いシグナルを示した(図5B)。一般には、乳エキソソームは、フローサイトメトリで観察されたように、弱いシグナルを示し、単球中に内在化されているか又はＢ細胞の細胞膜に結合しているものとして検出された(図5C)。エキソソームとCD3+ Ｔ細胞との間の相互作用が生じた少数例(ほぼ50細胞中１例)で、エキソソームは、主に、細胞膜の近傍又は細胞膜に接触して局在した(データは示さず)。よって、これらCLSMデータは、本発明者らのフローサイトメトリデータと一致している。このことは、EBV形質転換Ｂ細胞からのエキソソームが優先的にはＢ細胞を標的する一方、DC由来エキソソームはより多くが単球と結合することを示す。しかし、これら結果はまた、エキソソームが異なる細胞タイプと異なって相互作用し、エキソソームはほとんどがＢ細胞及びＴ細胞の細胞膜に結合し続けるが、単球によって内在化されることを示唆する。
【０１００】
別の技術アプローチによって異なるエキソソームの免疫細胞との結合及び免疫細胞での内在化を検証するために、本発明者らは、ImageStreamシステムを調べることにした。このシステムは、フローセルを非常に高速で通過する各細胞のマルチスペクトル画像を自動的に取得する、フローサイトメータと蛍光顕微鏡との組合せシステムであり、これにより、サンプルあたり多くの細胞を画像ベース分析することが可能になる。内在化特徴を用いて、本発明者らは、表面に結合したエキソソーム、内在化したエキソソーム又はその両方(中間)を有する単球(HLA-DR+CD14+)を区別した(図5D)。技術的理由のために、Ｂ細胞データは取得しなかったが、得られた単球データは、本発明者らの従来のフローサイトメトリ及びCLSMのデータと一致した。ImageStreamにより、DC及び乳エキソソームは優先的には単球と結合する一方、LCL1エキソソームは結合しないことが示された(図5E)。更に、単球の多数が種々のエキソソームを内在化することが観察され、このことによって本発明者らの以前の知見が補強された(図5E)。よって、本発明者らはまた、この方法は、多数の細胞中のエキソソーム局在を定量することができることを示す。
【０１０１】
LCL1由来エキソソームとＢ細胞との間の結合は温度非依存性である
異なるエキソソームのPBMCとの結合がレセプターに媒介されているのか又は能動的内在化に依存しているのかを調べるために、本発明者らは、PKH67+エキソソームをPBMCと４℃及び37℃で同時培養した。３つの全てのエキソソームタイプについて、インキュベーションが４℃にて１時間及び４時間実施されたときは、単球との結合が減少した(図6A〜F)。このことは、この細胞タイプの能動的な(おそらく貪食による)取込みを示している。DCエキソソーム(図6A及びD)及び乳エキソソーム(図6C及びF)のＢ細胞との結合は、冷条件の間は同様に減少した。対照的に、LCL1エキソソームとＢ細胞との間の相互作用には、４℃にて両時点でほんの僅かな減少が観察された(図6B及びE)。よって、LCL1エキソソームとＢ細胞との間の相互作用は、大部分が温度非依存性であり、したがって接着分子又は表面レセプターにより媒介されている可能性がより高い。このため、本発明者らは、この相互作用を更に分析することを試みた。
【０１０２】
LCL1由来エキソソームとＢ細胞との間の結合はＢ細胞に発現するCD21に依存する
Ｂ細胞は、ヒト補体レセプター２(CD21)のような細胞表面レセプターを発現する。この細胞表面レセプターは、異なるパターンの接着分子、例えばICAM-1又はインテグリン(例えばLFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)又はp150,95(CD11c/CD18))と共に、Ｂ細胞エキソソームの観察された強力なＢ細胞嗜好性を媒介している可能性がある。エキソソーム結合の特異性を明らかにするために、エキソソームとのインキュベーション前に、CD21又はCD18に対するmAbをPBMCに添加した。LCL1エキソソームと末梢血Ｂ細胞との間の相互作用は、抗CD21により効率的にブロックすることができた一方、抗CD18 Abではブロッキング効果は観察されなかった(図7A)。
観察されたＢ細胞標的化がＢ細胞のEBV形質転換に依存性であるかどうかを解明するために、本発明者らは、EBV陰性Ｂ細胞株BJABからのエキソソームと比較した。結果は、BJABエキソソームが、Ｂ細胞にLCL1エキソソームと比較して10倍低い程度で結合することを示した。このことは、この結合にEBV由来又は誘導性のタンパク質が関与していることを示唆する(図7B)。まとめると、これらデータは、LCL1エキソソームとＢ細胞との間の結合がCD21との相互作用に依存性であり、LFA-1、Mac-1、p150,95のいずれとの相互作用にも依存しないことを示し、EBV形質転換Ｂ細胞に由来するエキソソームに特異的である選択的Ｂ細胞エキソソーム標的化を示唆している。
【０１０３】
LCL1-エキソソーム上のgp350はＢ細胞への結合を媒介する
次に、本発明者らは、Ｂ細胞上でCD21結合に関与するエキソソームのリガンドを解明することを目的とした。CD21に対する既知のリガンドとしては、IgEの低親和性レセプター(CD23)、EBVエンベロープ糖タンパク質gp350及び補体因子C3dが挙げられる。Ｂ細胞及びマクロファージから放出されたエキソソームはC3-フラグメントを含有することが示されているが、本発明者らの細胞培養物の全てで熱不活化胎仔ウシ血清(FCS)を使用したので、C3dが差を生じさせた可能性はない。CD23(EBV形質転換Ｂ細胞株に高度に発現する)は、LCL1エキソソームで検出されたが、BJABエキソソームでは検出されなかった。EBV糖タンパク質gp350は、Ｂ細胞へのウイルス付着に決定的に重要である溶解性タンパク質であるが、エキソソームに存在することはこれまでに示されていない。よって、gp350及びCD23が、エキソソーム-Ｂ細胞相互作用への関与の可能性について調べるべき最初の候補であった。。これらリガンドを、抗gp350/220 Ab又は抗CD23 Abのいずれかでブロックした。LCL1エキソソームのＢ細胞への結合は、gp350をブロックすると実質的に減少したが、興味深いことに、CD23をブロックしてもエキソソーム結合の減少は観察されなかった(図7C)。この観察は、LCL1エキソソームの表面にgp350が存在すること、及びこのEBVタンパク質がエキソソーム結合を媒介し、CD23はしないことを示唆している。コントロールとして、本発明者らはまた、非中和化抗gp350 mAb(2L10)を添加した。この抗体は、エキソソーム結合をブロックしなかった(データは示さず)。このことは、中和mAb(72A1)を介するgp350の特異的ブロッキングの概念を補強する。LCL1細胞におけるgp350の存在は、フローサイトメトリ分析により確証され(図7D)、エキソソームについては、イムノブロッティングにより、スクロースグラジエント中で、gp350はHLA-DR及びCD81と共に局在した(図7E)。これらマーカーはまた、一部が、EBVによりコードされる潜伏性膜タンパク質１(LMP1)(これは以前にエキソソーム上に見出されている)と共に局在した。予想されたように、gp350もLMP1もいずれもBJABエキソソーム中で検出されなかった(図7E)。
【０１０４】
エキソソームシグナルはエキソソームに由来し、ビリオンに由来しない
LCL1の細胞及びエキソソームの両方でのgp350の発現は、我々のLCL1細胞の幾つかがEBVライフサイクルの溶解ステージにある(これは、EBVが、EBV形質転換Ｂ細胞培養物中に遊離のウイルス粒子として存在する可能性も示す)のかという疑問を生じさせた。したがって、本発明者らの実験において、ビリオンがエキソソーム調製物に混入し、そのためにエキソソームに関する偽陽性シグナルを生じた可能性がある。予備実験で、本発明者らはPCRによりウイルスDNAを検出した。しかし、DNAの存在は、常に完全ビリオンの存在に対応するものではない。よって、エキソソーム調製物において、より高感度の臍帯血アッセイを使用して感染性EBVビリオンの存在を調べ、TEM及び免疫EM分析を使用してEBV粒子を検出した。10 000×ｇペレット(エキソソーム単離手順の間の中間遠心分離工程で取得)並びにBJAB及びLCL1上清からのエキソソーム調製物を臍帯血単核細胞(CBMC)に添加して、EBV形質転換初代Ｂ細胞の成長をモニターした(図8A)。十分に確立されたEBV産生性マーモセットＢリンパ芽球様細胞株(B95-8)からの上清を陽性コントロールとして使用した。BJAB上清からのプールした10 000×ｇペレットの添加は、3H-チミジン組込みにより定量したところ、LCLの成長を誘導しなかった。加えて、この培養物の目視検査によって、形質転換Ｂ細胞の典型的な凝集物は明らかにならなかった。対照的に、LCL1上清からのプールした10 000×ｇペレットのCBMCへの添加は、LCLの成長を誘導した。このことは、LCL1細胞による感染性ウイルス粒子の産生を示している。この知見は、観察したLCL1細胞上でのgp350の細胞表面発現と一致している(図7D)。このことは、LCL1細胞が溶解性のウイルス産生ステージにあることを示している。しかし、LCLの成長は、BJAB及びLCL1上清からのエキソソーム調製物(100 000×ｇ)のCBMCへの添加後には観察されなかった。このことは、本発明者らのLCL1エキソソーム調製物中には感染性EBVが存在しないことを示している。よって、LCL1により産生されるビリオンは全て、10 000×ｇの遠心分離工程の間に沈殿してペレット化する。加えて、本発明者らは、LCL1細胞からのエキソソーム調製物が、ヘルペスウイルスの一般的特徴である多形態EBV粒子を含有しているかどうかをTEM及び免疫EMで調べた。初代Ｂ細胞に付着したエキソソーム(図8B)及びエキソソーム調製物単独(図8C及びD)のいずれも、感染性EBVのサイズ(200nm)のEBV粒子も、裸の高密度ウイルスカプシドも示さなかった。およそ100nmのベシクルのみが観察され、多数がCD63及びHLA-DRで標識されていた。このことは、エキソソームであることを示している(図8C)。これら結果はまた、イムノブロットでの本発明者らの知見と一致しており、gp350はHLA-DR及びCD81とと共に局在していた(図7E)。ナノ粒子追跡分析(NTA；NanoSight)によりサイズ分布を更に調べた。この方法により、LCL1-及びBJAB-エキソソーム調製物内での、EBV(150nmを超えるピークを有する)と比較して小サイズ範囲(平均およそ100nmを有する)が定量的に確証された(図8E)。このことは、本発明者らのエキソソーム調製物中にビリオンが存在しないことを更に支持する。
【０１０５】
考察
異なる細胞タイプは、その起源の細胞を主として反映する表現型を有するエキソソームを産生することが知られている。ここで、本発明者らは、エキソソーム連絡経路の他の面に着目し、試験したエキソソーム(MDDC由来及び母乳由来の両方)がヒト末梢血中に同じ主標的(すなわち単球)を有するようであることを証明した。単球に達すると、エキソソームは、おそらくは貪食作用によって、能動的に飲み込まれるようである。貪食作用はまた、マクロファージのような他の貪食細胞によるエキソソーム取り込みの機序であることが最近証明されている。しかし、このことはまた、エキソソーム産生性細胞が病原体特異的分子を保有する場合には、標的単球に対するエキソソームの選択性が変化し得ることを示している。このことを、本発明者らは、本明細書中で、EBV陰性Ｂ細胞株(BJAB)からのエキソソームをEBV陽性Ｂ細胞株(LCL1)からのエキソソームと比較することによって証明した。LCL1由来エキソソームは、主として、Ｂ細胞を標的しているが、このことはBJABエキソソームについては観察されなかった。LCL1エキソソームとＢ細胞との間の相互作用は、Ｂ細胞についてはCD21に対するAbにより、エキソソームについてはgp350に対するAbによって効率的にブロックされたが、抗CD18及び抗CD23のいずれによってもブロックされなかった。このことはEBVの関与を証明している。CD23は、BJABと比較してLCL1上により豊富であるにもかかわらず、抗CD23が細胞-エキソソーム相互作用に対して効果を有さなかった理由は、gp350-CD21相互作用と比較して、CD23とCD21との間のより低親和性の相互作用に起因し得る。このことは、非常に高い分子親和性がインビトロでのエキソソームの迅速な(１時間)結合に必要とされることを示している(おそらくはインビボでは更により重要であろう)。
【０１０６】
DC及びＢ細胞のエキソソームは、例えばＴ細胞上に発現したLFA-1に結合する細胞内接着分子(ICAM)-1を表示することが知られているにもかかわらず、種々のエキソソームとＴ細胞との相互作用はむしろ低かった(エキソソームについての陽性Ｔ細胞の８％未満)。
LCL1エキソソーム上のgp350についての観察は、本発明者らのエキソソーム調製物中に感染性及び/又は多形態性EBV粒子(これがＢ細胞で観察されるPKH67シグナルを担っている可能性がある)が存在するかという疑問を生じさせた。CD21へのEBVの結合は十分に確立されている。高感度の臍帯血形質転換アッセイ及びTEM分析(図8B〜D)を使用して、本発明者らは、エキソソーム調製物中のビリオンに関する証拠を何ら見出さなかった。よって、このサンプルは遠心分離よってビリオンが除去されたようであり、したがってＢ細胞で観察される蛍光シグナルをビリオンが担っている可能性は少ないと考えられる。
【０１０７】
gp350保有エキソソームを介する標的されるＢ細胞の連絡についての本発明者らの新規な知見はまた、インビボ状況を反映している可能性があった。gp350保有エキソソームは、EBVの無症候性キャリアにおいて分泌され得る。本発明者らは、非感染Ｂ細胞へのエキソソームの結合が、EBV侵入レセプターCD21の遮断によりビリオン結合(したがって感染)の効率を低下させるという仮説を立てた。本研究で、本発明者らはまた、EBV形質転換Ｂ細胞が、EBV陰性Ｂ細胞と比較して、タンパク質濃度として測定されるエキソソームをより多く産生するようであるとの観察をした。このこともまた、多数のエキソソームがEBV感染の拡大を抑制するために寄与している可能性があるインビボ状況を反映し得る。或いは、エキソソーム産生の誘導及びgp350のエキソソーム発現は、EBVの免疫調整能に寄与し得る。
【０１０８】
本発明者らの知見はまた、細胞標的をＢ細胞に変更させる(このことが治療上の有用性を増強し得る)ために、エキソソームをどのように(例えばgp350の発現を誘導することにより)操作することができるかを示唆する。完全なＴ細胞応答の生成におけるＢ細胞の役割は、80年代に既に示唆された。更に、Ｂ細胞は、長期Ｔ細胞免疫の達成に特に重要である。最近、本発明者らは、エキソソームが、インビボで抗原特異的Ｔ細胞応答を生じるためには、活性化したＢ細胞のサポートを必要とすることを示した。したがって、ガンワクチンにおいてＢ細胞を標的することによって、寛容を破壊することができ、より長く持続するＴ細胞免疫が達成され得る。更に、CD21はＢ細胞だけでなく、濾胞性樹状細胞(FDC)によっても発現される。このことは、表面結合gp350を有するエキソソームはインビボでFDCをも標的し得、よって可能な免疫活性化及び免疫記憶をインビボで増強し得ることを示唆している。
【０１０９】
結論として、本発明者らは、母乳中に見出されるエキソソーム、ヒト単球由来DC及びEBV陰性Ｂ細胞株により産生されるエキソソームが、好ましくは、Ｂ細胞に結合しないことを示した。代わりに、これらは、乳及びDCのエキソソームについて証明されたように、主として、エキソソームを能動的に飲み込む単球を標的する。しかし、Ｂ細胞が溶解ステージのEBVを保有する場合、産生されたエキソソームは、嗜好性を単球からＢ細胞に変化させ、そのことにより、エキソソーム結合gp350は、Ｂ細胞上のEBV侵入レセプターCD21に結合する。EBV形質転換Ｂ細胞に由来するエキソソームは、EBV感染の間のＢ細胞によるウイルス取込みの減少に或る役割を有している可能性がある。更に、Ｂ細胞を標的するエキソソームは、細胞性及び体液性の両タイプの長期免疫応答の誘導に効率的である可能性があり、よってそれらは、ガン及び炎症性疾患の治療における可能性のあるツールとして考えられる。
【０１１０】
臨床プロトコル
抗原搭載ETBTエキソソーム又は抗原搭載DCエキソソーム又は抗原搭載CD40刺激Ｂ細胞エキソソームのガン患者への投与は、B Escudierら(前出)に記載されるように行うことができる。
【０１１１】
モデル研究
本発明によれば、エキソソーム上のEBV由来糖タンパク質gp350は、インビトロで、CD21を介してヒトＢ細胞を特異的に標的している。本発明の発明者らはまた、マウスモデルにおいて、Ｂ細胞活性化が強力なOVA(オボアルブミン)搭載エキソソーム誘導Ｔ細胞応答に必要であることを観察した。したがって、このモデル研究は、gp350を保有するエキソソームを用いCD21を介してＢ細胞を標的することが、インビトロ及びインビボで、Ｂ細胞活性化を容易にし、Ｔ細胞応答を誘導することができるかを試験することを目的とする。gp350は立体障害によりマウスCD21に結合しないので、マウスシステムでは代替モデルを使用する。
【０１１２】
C3dは、補体因子C3のプロテアーゼ耐性35kDaフラグメントであり、補体活性化の過程で生じる。研究により、Ｂ細胞上のCD21はC3dタグ化抗原に結合し、これがBCRとCD19との架橋を導くことによってＢ細胞活性化の閾値を減少させると共にシグナルの大きさを増幅させるので、C3dは分子アジュバントとして使用できることが示されている。CD21は、３コピーのC3dで人工的にタグ化されたモデル抗原を、未修飾抗原の最小免疫原性用量の0.001％の濃度で免疫原性にする。C3dの役割は下記のように要約することができる
・ C3dタグ付加により抗原をCD21(CR2)に標的付けることで、全てのＢ細胞及びFDCでAgプロセシング及びAg提示の増大を生じる
・ CD21とBCRとの間の架橋は、Ag特異的Ｂ細胞の完全な活性化を生じる
・ C3dタグ化抗原は、脾臓においてFDCにより捕獲され、長期間、細胞表面に結合したままであり、記憶Ｂ細胞を生じ、維持する
・ C3dは、抗原と多量体を形成することによって又はタンパク質キャリアとして作用することによって、抗原のインビボ寿命を増大させることができる。
【０１１３】
モデル研究の実験手順：
BMDC培養：
BMDC(骨髄樹状細胞)は、IL-4及び10％ GM-CSF馴化培地(Ag8653/X63クローン)の存在下に骨髄幹細胞から作製した。６日目、培養上清の50％を新鮮培地と交換した。エキソソームへのOVA搭載のために、300μgのOVAタンパク質を６日目のDC培養物に添加し、ONインキュベートし、続いて１回洗浄し、次いでLPSを培養物に添加した。48時間後、エキソソーム(OVAExo)を培養上清から超遠心分離により精製した。
【０１１４】
DC(樹状細胞)培養上清からのエキソソームの調製
培養上清を、3.000×ｇ続いて10.000×ｇの遠心分離に30分間付した。エキソソームを100.000×ｇで２時間ペレット化し、100.000×ｇで洗浄した。ペレット化エキソソームをPBSに溶解した。タンパク質含量をDCタンパク質アッセイ(Biorad)により測定した。
【０１１５】
FACSによるエキソソームの表現型分析
10マイクログラムのエキソソームを、予め抗CD9抗体を被覆した10μlのアルデヒド/硫酸ラテックスビーズとインキュベートし、室温(RT)にて一晩(ON)回転させた。１mlの100mMグリシン(Sigma)で反応を停止させた。エキソソームを有するビーズを、H-2Kd、CD9、CD54、CD80、CD81、CD86、C3dに特異的なFITC又はPE接合抗体(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)及び対応するアイソタイプ適合抗体のパネルで標識した。
【０１１６】
OVAExoへのC3d連結：
OVAExoへのC3d連結のために、リンカーBS3をC3dと混合し、続いて30分間インキュベーションを行った。未反応試薬をゲル濾過により除去し、C3d-BS3含有溶出液をエキソソームに添加した(C3dOVAExo)。グリシンを用いて反応を安定化した。
【０１１７】
DO11.10 CD4+ Ｔ細胞の単離及びインビトロＴ細胞増殖アッセイ
DO11.10脾臓細胞を５μM CFSE(カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル)で15分間37℃にて染色した。冷PBS/10％ FCSの添加により標識化を停止した。次いで、細胞をPBS中で３回洗浄し、１×106細胞/mlの濃度でPep-Exo、OVA-Exo及びそれぞれのコントロールと共に培養し、続いて５％ CO2の湿潤インキュベーター中、37℃のインキュベーションを５日間行った。
【０１１８】
インビボＴ細胞増殖アッセイ
０日目に、DO11.10マウスからの脾臓細胞をBALB/cマウスにi.v.にて5.5×106細胞/マウスで養子移入した。１日目に、マウスをC3dOVAExo、OVAExo又はそれぞれのPBSコントロールでi.v.免疫した。４日目に、マウスを犠牲にし、脾臓細胞を抗CD3-APC抗体とOVA TCRに特異的な抗CD4-PE抗KJ1-26+-FITC抗体で染色し、KJ1-26+細胞の数をFACSにより評価した。リンパ球の早期活性化もまた、抗CD69及び抗CD25抗体を用いFACSにより検査した。
【０１１９】
ELISAによる血清抗体レベルの決定
特異的抗体応答を決定するため、マイクロタイタープレートを10μg/mlのOVAタンパク質で被覆し、ONインキュベートし、続いて血清の系列希釈物とONインキュベーションを行った。この反応性抗体のアイソタイプは、マウスμ及びγアイソタイプに特異的なアルカリホスファターゼ接合ヤギ免疫グロブリンと２時間RTにてインキュベートすることによって決定した。発色はp-ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを用いてRTで行い、吸光度はELISAリーダーにより種々の時点で405nmにて測定した。治療目的には、通常、プロセスあたりの産生エキソソームの量を、MHCクラスII分子の量に関して、吸着ELISAにより評価した。吸着ELISAアッセイにより、Raji細胞及び未成熟の７日目MDDCに結合したMHCクラスII分子の総数を算出することで、それぞれおよそ1.0及び5.5×106 MHCクラスII分子/細胞と評価された。炎症性刺激が樹状細胞上でのMHCクラスII複合体の蓄積を誘導する。GMPプロセスにより、約５×1014エキソソームMHCクラスII分子の採集が可能になった。
【０１２０】
結論
結論として、これら結果は、C3dに連結したエキソソームは、C3dを有さないエキソソームと比較して、マウスシステムにおいて、インビボで、天然型Ｂ細胞を介するＴ細胞応答の誘導に、より効率的であることを示している。このことは、ヒトにおいて、gp350発現エキソソーム(これはC3dと同じ分子を標的する)がまた、gp350を発現しないエキソソームと比較して、Ｂ細胞の抗原提示を介するＴ細胞応答の誘導に、より効率的であることを示唆している。
本発明及びその好適な実施形態の説明において言及した全ての先行技術文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１２１】
具体的実施形態において、本発明はまた以下の項目に関する：
１．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)単離したＢ細胞をエプスタイン・バーウイルス(EBV)に感染させること；
(ｄ)感染Ｂ細胞を潜伏期に形質転換すること；
(ｅ)EBV形質転換Ｂ細胞をガン抗原の存在下で培養すること；
(ｆ)EBV形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｇ)採集したエキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２２】
２．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)単離したＢ細胞をエプスタイン・バーウイルス(EBV)に感染させること；
(ｄ)感染Ｂ細胞を潜伏期に形質転換すること；
(ｅ)EBV形質転換Ｂ細胞を培養すること；
(ｆ)EBV形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｇ)採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、抗原搭載エキソソームを製造すること；
(ｈ)ガン抗原搭載エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２３】
３．エキソソーム上の潜伏性膜タンパク質１(LMP-1)を中和することを含んでなる項目１又は２の方法。
４．中和化剤がFab-フラグメント分子を含んでなる項目３の方法。
【０１２４】
５．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルから単球を単離すること；
(ｃ)単球を未成熟樹状細胞に培養すること；
(ｄ)未成熟樹状細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること;
(ｅ)改変未成熟樹状細胞をガン抗原と接触させて、ガン抗原搭載成熟樹状細胞に形質転換させること；
(ｆ)成熟樹状細胞から放出されたガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを採集すること；
(ｇ)ガン抗原搭載樹状細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２５】
６．CD21結合性タンパク質成分が下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１又は数個を含んでなる項目５の方法。
【０１２６】
７．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)Ｂ細胞を培養すること；
(ｄ)Ｂ細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること；
(ｅ)CD21結合性成分を発現する改変Ｂ細胞をガン抗原と接触させること；
(ｆ)ガン抗原に接触した改変Ｂ細胞から放出されたガン抗原搭載エキソソームを採集すること；
(ｇ)ガン抗原搭載Ｂ細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２７】
８．CD21結合性タンパク質部分が下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１又は数個を含んでなる項目７の方法。
【０１２８】
９．下記：
(ａ)ヒトからの末梢血サンプルを準備すること；
(ｂ)サンプルからＢ細胞を単離すること；
(ｃ)Ｂ細胞を培養すること；
(ｄ)Ｂ細胞を改変してCD21結合性成分を発現させること；
(ｅ)CD21結合性成分を発現するＢ細胞から放出されたエキソソームを採集すること；
(ｆ)採集したエキソソームをガン抗原と接触させて、抗原搭載エキソソームを製造すること；
(ｇ)ガン抗原搭載Ｂ細胞エキソソームを患者に投与して免疫応答を誘発すること
を含んでなる、患者のガン性細胞に表示される抗原に対して免疫応答を誘発することよりヒトにおけるガンを治療する方法。
【０１２９】
10．CD21結合性タンパク質成分が下記：gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１又は数個を含んでなる項目９の方法。
11．下記：請求項１の工程(ａ)から工程(ｆ)まで；請求項２の工程(ａ)から工程(ｇ)まで；請求項５の工程(ａ)から工程(ｆ)まで；請求項７の工程(ａ)から工程(ｆ)まで；請求項９の工程(ａ)から工程(ｆ)までのいずれかを含んでなるガン抗原搭載エキソソームの製造方法。
12．項目11の方法により取得されたか又は取得可能であるエキソソーム。
【０１３０】
13．項目12のエキソソームを含んでなるガンワクチン。
14．項目12のエキソソームによりインビトロで刺激されたＴ細胞。
15．CD21結合性成分を含んでなるＢ細胞又は樹状細胞(DC)エキソソーム。
【０１３１】
16．CD21結合性成分がgp350；EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αから選択される項目15のエキソソーム。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
(ｉ)Ｂ細胞を、エプスタイン・バーウイルスに感染させることで例示されるような適切な手段で、潜伏期に形質転換させることにより、天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分を発現させる工程；
(ii)(ｉ)の形質転換Ｂ細胞を培養する工程；
(iii)(ii)で形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集する工程
を含んでなり、
前記エキソソームは天然型Ｂ細胞に結合し得る１以上の成分を含んでなりかつ該エキソソームは直接的及び/又は間接的に１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を搭載している、特異的免疫調整性エキソソームを製造する方法。
【請求項２】
エキソソーム上の潜伏性膜タンパク質１(LMP-1)を中和することを任意に更に含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
LMP-1の中和がFab-フラグメント分子で達成される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１以上のＢ細胞レセプターが、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｂ細胞レセプターに結合し得る成分が、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１以上又はそれらの混合物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１以上の抗原が、例えば１以上のガン抗原、１以上のウイルス抗原、１以上の細菌抗原、１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せから選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１以上のガン抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの混合物である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
間接搭載が、１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤の存在下で形質転換Ｂ細胞を同時培養することにより実施される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
直接搭載が、採集したエキソソームを１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤と接触させ、例えば培地のpHを変化させるか又は１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤を化学的に連結させることにより実施される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
１以上の抗原が、自原性及び/又は同種異系である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１以上の抗原が、例えば２以上の抗原、例えば３以上の抗原、例えば４以上の抗原、例えば５以上の抗原、例えば６以上の抗原のような１以上の抗原である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
形質転換細胞が、例えば少なくとも２日間、例えば３日間、例えば４日間、例えば５日間、例えば６日間、例えば１週間、例えば２週間、例えば少なくとも３週間、例えば４週間、例えば５週間、例えば６週間、例えば７週間、例えば８週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間の間培養される請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
エキソソームが、例えば１日おき、例えば２日おき、例えば３日おき、例えば４日おき、例えば５日おき、例えば６日おきに採集される請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
エキソソームの収率が、例えばEBTB細胞の約48時間培養の間に、例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
エキソソームが、例えば超遠心分離若しくは差分遠心分離又はそれらの任意の組合せ及びその後のペレット化エキソソームの回収、任意に回収したペレット化エキソソームを適切な培地で洗浄することによって採集及び回収される請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
免疫調整性エキソソームを含んでなり、該エキソソームが天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分を保有し、更に１以上の抗原及び/若しくは１以上の免疫抑制剤又はそれらの混合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
Ｂ細胞レセプターが、CD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rである請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分が、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-α又はそれらの混合物から選択される請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
１以上の抗原が、１以上のガン抗原、１以上のウイルス抗原、１以上の細菌抗原、１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せから選択される請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
１以上のガン抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの任意の混合物からなる群より選択される請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
１以上の抗原が、自原性又は同種異系である請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
１以上の抗原が、例えば２以上の抗原、例えば３以上の抗原、例えば４以上の抗原、例えば５以上の抗原、例えば６以上の抗原のような１以上の抗原である請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
１以上の抗原が、任意に１以上の免疫抑制剤と組み合わされていてもよい請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
血液と同じ張度を有する等張性培地培地を更に含んでなる請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
エキソソームの凝集を防止する１以上の物質を更に含んでなる請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
約0.91％ w/vのNaCl、約300mOsm/Lの溶液である正常生理食塩水(NS)を含んでなる請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
例えば２％までのヒト血清アルブミン又は１％までのヒト血清アルブミンのような３％までのヒト血清アルブミンを更に含んでなる請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
少なくとも約0.1μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/ml培地、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも15.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも20.0μgエキソソーム/ml培地の範囲のエキソソームを含んでなる請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により得られるエキソソームを含んでなる医薬組成物。
【請求項３０】
天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る少なくとも１つの成分又は薬剤、タンパク質、ペプチドフラグメントを含んでなるエキソソーム。
【請求項３１】
Ｂ細胞レセプターが、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rである請求項３０に記載のエキソソーム。
【請求項３２】
天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る成分若しくは薬剤又はタンパク質若しくはペプチドフラグメントが、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-α又はそれらの任意の混合物である請求項３０又は３１に記載のエキソソーム。
【請求項３３】
１以上の抗原を更に含んでなる請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３４】
１以上の抗原が内因性/自原性若しくは外因性/同種異系又はそれらの任意の混合物である請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３５】
１以上の抗原が、免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せである請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３６】
１以上の抗原が、例えばウイルス性、細菌性、腫瘍抗原のような任意の起源を有する請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３７】
１以上の腫瘍抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの任意の混合物の群より選択される請求項３６に記載のエキソソーム。
【請求項３８】
例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原のような１以上の抗原を含んでなる請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３９】
免疫抑制剤が、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物である請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項４０】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のように得られるエキソソーム。
【請求項４１】
医薬に使用するための請求項３０〜３９のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項４２】
(ｉ)対象者から例えば血液サンプルのような生物学的サンプルを獲得すること、
(ii)(ｉ)の前記サンプルからＢ細胞を回収すること、
(iii)(ii)で回収したＢ細胞を、ウイルスで例示されるような適切な手段で、該Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得るタンパク質又はリガンドを発現するようにさせること、
(iv)形質転換Ｂ細胞を培養すること、
(ｖ)(iv)で形質転換Ｂ細胞から排出されたエキソソームを回収すること
(vi)(ｖ)のエキソソームを対象者に戻すこと
を含んでなり、
前記エキソソームが直接的及び/又は間接的に１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を搭載している、必要とする対象者を治療する方法。
【請求項４３】
エキソソーム上の潜伏性膜タンパク質１(LMP-1)を中和することを任意に更に含んでなる請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
LMP-1の中和がFab-フラグメント分子で達成される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｂ細胞レセプターが、CD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rの１以上である請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
Ｂ細胞レセプターに結合し得る成分が、BAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１以上又はそれらの任意の混合物である請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
１以上の抗原が、例えば１以上のガン抗原、１以上のウイルス抗原、１以上の細菌抗原、１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せから選択される請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
１以上のガン抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの混合物である請求項４２〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
間接搭載が、１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤の存在下で形質転換Ｂ細胞を同時培養することにより実施される請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
直接搭載が、採集したエキソソームを１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤と接触させ、例えば培地のpHを変化させるか又は１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤を化学的に連結させることにより実施される請求項４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
１以上の抗原が自原性及び/又は同種異系である請求項４２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
１以上の抗原が、例えば２以上の抗原、例えば３以上の抗原、例えば４以上の抗原、例えば５以上の抗原、例えば６以上の抗原のような１以上の抗原である請求項４２〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
１以上の抗原が、任意に１以上の免疫抑制剤と組み合わされていてもよい請求項４２〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
形質転換細胞が、例えば少なくとも２日間、例えば３日間、例えば４日間、例えば５日間、例えば６日間、例えば１週間、例えば２週間、例えば少なくとも３週間、例えば４週間、例えば５週間、例えば６週間、例えば７週間、例えば８週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間の間培養される請求項４２〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
対象者から回収されたサンプルが、例えば末梢血のような血液サンプル、骨髄サンプル若しくは対象者のリンパ系から取り出されたサンプル又はそれらの任意の混合物である請求項４２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
エキソソームが、例えば、静脈内、動脈内、骨内、鞘内又は腹腔内投与のように非経口的に投与される請求項４２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
エキソソームが単回用量又は複数回用量として投与される請求項４２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
エキソソームが、約20秒間、例えば約30秒間、例えば約40秒間、約１分間の期間中に又は１〜２時間若しくはそれ以上、例えば３時間以上、例えば４時間以上、例えば５時間以上、例えば６時間以上にわたって、注入又は注射される請求項４２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
エキソソームが、例えば少なくとも0.2mg/kg、例えば少なくとも0.3mg/kg、例えば少なくとも0.4mg/kg、例えば少なくとも0.5mg/kg、例えば少なくとも0.75mg/kg、例えば少なくとも0.9mg/kg、例えば少なくとも1.0mg/kg、例えば少なくとも3.0mg/kg、例えば少なくとも5.0mg/kg、例えば少なくとも7.0mg/kg、例えば少なくとも10.0mg/kg、例えば少なくとも15.0mg/kgのような少なくとも0.1mg/kgの投薬量で投与される請求項４２〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
疾患の重篤度に応じて１回実施されてもよいし、反復されてもよい請求項４２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
例えばガン用、自己免疫疾患用、移植の間の療法用、アレルギー用、ウイルス若しくは細菌感染の間用の他の任意の関連処置が補充される請求項４２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
乳ガン、膀胱ガン、皮膚ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、甲状腺ガン、胃ガン、頭部頸部ガン若しくはメラノーマ又はそれらの任意の組合せの治療で利用される請求項４２〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
下記の工程：
(ｉ)Ｂ細胞を、エプスタイン・バーウイルスに感染させることで例示されるような適切な手段で、潜伏期に形質転換させることにより、天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分を発現させる工程；
(ii)(ｉ)の形質転換Ｂ細胞を培養する工程；
(iii)(ii)で形質転換Ｂ細胞から放出されたエキソソームを採集する工程
を含んでなり、
前記エキソソームは天然型Ｂ細胞に結合し得る１以上の成分を含んでなりかつ該エキソソームは直接的及び/又は間接的に１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を搭載している、特異的免疫調整性エキソソームを製造する方法。
【請求項２】
エキソソーム上の潜伏性膜タンパク質１(LMP-1)を中和することを任意に更に含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
LMP-1の中和がFab-フラグメント分子で達成される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１以上のＢ細胞レセプターが、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｂ細胞レセプターに結合し得る成分が、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１以上又はそれらの混合物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１以上の抗原が、例えば１以上のガン抗原、１以上のウイルス抗原、１以上の細菌抗原、１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せから選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１以上のガン抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの混合物である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
間接搭載が、１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤の存在下で形質転換Ｂ細胞を同時培養することにより実施される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
直接搭載が、採集したエキソソームを１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤と接触させ、例えば培地のpHを変化させるか又は１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤を化学的に連結させることにより実施される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
１以上の抗原が、自原性及び/又は同種異系である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１以上の抗原が、例えば２以上の抗原、例えば３以上の抗原、例えば４以上の抗原、例えば５以上の抗原、例えば６以上の抗原のような１以上の抗原である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
形質転換細胞が、例えば少なくとも２日間、例えば３日間、例えば４日間、例えば５日間、例えば６日間、例えば１週間、例えば２週間、例えば少なくとも３週間、例えば４週間、例えば５週間、例えば６週間、例えば７週間、例えば８週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間の間培養される請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
エキソソームが、例えば１日おき、例えば２日おき、例えば３日おき、例えば４日おき、例えば５日おき、例えば６日おきに採集される請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
エキソソームの収率が、例えばEBTB細胞の約48時間培養の間に、例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/百万EBTB細胞、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/百万EBTB細胞である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
エキソソームが、例えば超遠心分離若しくは差分遠心分離又はそれらの任意の組合せ及びその後のペレット化エキソソームの回収、任意に回収したペレット化エキソソームを適切な培地で洗浄することによって採集及び回収される請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
免疫調整性エキソソームを含んでなり、該エキソソームが天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分を保有し、更に１以上の抗原及び/若しくは１以上の免疫抑制剤又はそれらの混合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
Ｂ細胞レセプターが、CD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rである請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得る１以上の成分が、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-α又はそれらの混合物から選択される請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
１以上の抗原が、１以上のガン抗原、１以上のウイルス抗原、１以上の細菌抗原、１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せから選択される請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
１以上のガン抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの任意の混合物からなる群より選択される請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
１以上の抗原が、自原性又は同種異系である請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
１以上の抗原が、例えば２以上の抗原、例えば３以上の抗原、例えば４以上の抗原、例えば５以上の抗原、例えば６以上の抗原のような１以上の抗原である請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
１以上の抗原が、任意に１以上の免疫抑制剤と組み合わされていてもよい請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
血液と同じ張度を有する等張性培地培地を更に含んでなる請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
エキソソームの凝集を防止する１以上の物質を更に含んでなる請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
約0.91％ w/vのNaCl、約300mOsm/Lの溶液である正常生理食塩水(NS)を含んでなる請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
例えば２％までのヒト血清アルブミン又は１％までのヒト血清アルブミンのような３％までのヒト血清アルブミンを更に含んでなる請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
少なくとも約0.1μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.2μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.3μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.4μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.6μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.7μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.8μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約0.9μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約1.5μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約2.5μgエキソソーム/ml培地、少なくとも例えば約3.0μgエキソソーム/ml培地、例えば少なくとも約5.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも約10.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも15.0μgエキソソーム/ml培地又は例えば少なくとも20.0μgエキソソーム/ml培地の範囲のエキソソームを含んでなる請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により得られるエキソソームを含んでなる医薬組成物。
【請求項３０】
天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る少なくとも１つの成分又は薬剤、タンパク質、ペプチドフラグメントを含んでなるエキソソーム。
【請求項３１】
Ｂ細胞レセプターが、例えばCD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rである請求項３０に記載のエキソソーム。
【請求項３２】
天然型Ｂ細胞のレセプターに結合し得る成分若しくは薬剤又はタンパク質若しくはペプチドフラグメントが、例えばBAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-α又はそれらの任意の混合物である請求項３０又は３１に記載のエキソソーム。
【請求項３３】
１以上の抗原を更に含んでなる請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３４】
１以上の抗原が内因性/自原性若しくは外因性/同種異系又はそれらの任意の混合物である請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３５】
１以上の抗原が、免疫刺激性若しくは免疫抑制性又はそれらの組合せである請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３６】
１以上の抗原が、例えばウイルス性、細菌性、腫瘍抗原のような任意の起源を有する請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３７】
１以上の腫瘍抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの任意の混合物の群より選択される請求項３６に記載のエキソソーム。
【請求項３８】
例えば２以上の異なる抗原、例えば３以上の異なる抗原、例えば４以上の異なる抗原、例えば５以上の異なる抗原、例えば６以上の異なる抗原のような１以上の抗原を含んでなる請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項３９】
免疫抑制剤が、例えばLMP-1、CTLA-4、PD1又はそれらの任意の混合物である請求項３０〜３８のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項４０】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のように得られるエキソソーム。
【請求項４１】
医薬に使用するための請求項３０〜３９のいずれか１項に記載のエキソソーム。
【請求項４２】
(ｉ)対象者から例えば血液サンプルのような生物学的サンプルを獲得すること、
(ii)(ｉ)の前記サンプルからＢ細胞を回収すること、
(iii)(ii)で回収したＢ細胞を、ウイルスで例示されるような適切な手段で、該Ｂ細胞が天然型Ｂ細胞レセプターに結合し得るタンパク質又はリガンドを発現するようにさせること、
(iv)形質転換Ｂ細胞を培養すること、
(ｖ)(iv)で形質転換Ｂ細胞から排出されたエキソソームを回収すること
(vi)(ｖ)のエキソソームを対象者に戻すこと
を含んでなり、
前記エキソソームが直接的及び/又は間接的に１以上の抗原及び/又は免疫抑制剤を搭載している、必要とする対象者を治療する方法。
【請求項４３】
エキソソーム上の潜伏性膜タンパク質１(LMP-1)を中和することを任意に更に含んでなる請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
LMP-1の中和がFab-フラグメント分子で達成される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｂ細胞レセプターが、CD19、CD21、CD20、CD23、CD79、BAFF-R、TACI、BCMA、IFN-Rの１以上である請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
Ｂ細胞レセプターに結合し得る成分が、BAFF、APRIL、gp350、EBV gp350/220 (gp350 (470t)、CD23、C3b、iC3b、C3d、IFN-αの１以上又はそれらの任意の混合物である請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
１以上の抗原が、例えば１以上のガン抗原、１以上のウイルス抗原、１以上の細菌抗原、１以上の免疫抑制剤又はそれらの任意の組合せから選択される請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
１以上のガン抗原が、腫瘍細胞表面に発現する１以上の抗原若しくはその抗原的に活性なフラグメント、Ｔ細胞を刺激し得る８〜12アミノ酸残基若しくは15〜24アミノ酸残基を含んでなる腫瘍抗原ペプチドフラグメント、腫瘍細胞溶解物又はそれらの混合物である請求項４２〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
間接搭載が、１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤の存在下で形質転換Ｂ細胞を同時培養することにより実施される請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
直接搭載が、採集したエキソソームを１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤と接触させ、例えば培地のpHを変化させるか又は１以上の抗原及び/又は１以上の免疫抑制剤を化学的に連結させることにより実施される請求項４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
１以上の抗原が自原性及び/又は同種異系である請求項４２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
１以上の抗原が、例えば２以上の抗原、例えば３以上の抗原、例えば４以上の抗原、例えば５以上の抗原、例えば６以上の抗原のような１以上の抗原である請求項４２〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
１以上の抗原が、任意に１以上の免疫抑制剤と組み合わされていてもよい請求項４２〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
形質転換細胞が、例えば少なくとも２日間、例えば３日間、例えば４日間、例えば５日間、例えば６日間、例えば１週間、例えば２週間、例えば少なくとも３週間、例えば４週間、例えば５週間、例えば６週間、例えば７週間、例えば８週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、例えば少なくとも５ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間の間培養される請求項４２〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
対象者から回収されたサンプルが、例えば末梢血のような血液サンプル、骨髄サンプル若しくは対象者のリンパ系から取り出されたサンプル又はそれらの任意の混合物である請求項４２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
エキソソームが、例えば、静脈内、動脈内、骨内、鞘内又は腹腔内投与のように非経口的に投与される請求項４２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
エキソソームが単回用量又は複数回用量として投与される請求項４２〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
エキソソームが、約20秒間、例えば約30秒間、例えば約40秒間、約１分間の期間中に又は１〜２時間若しくはそれ以上、例えば３時間以上、例えば４時間以上、例えば５時間以上、例えば６時間以上にわたって、注入又は注射される請求項４２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
エキソソームが、例えば少なくとも0.2mg/kg、例えば少なくとも0.3mg/kg、例えば少なくとも0.4mg/kg、例えば少なくとも0.5mg/kg、例えば少なくとも0.75mg/kg、例えば少なくとも0.9mg/kg、例えば少なくとも1.0mg/kg、例えば少なくとも3.0mg/kg、例えば少なくとも5.0mg/kg、例えば少なくとも7.0mg/kg、例えば少なくとも10.0mg/kg、例えば少なくとも15.0mg/kgのような少なくとも0.1mg/kgの投薬量で投与される請求項４２〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
疾患の重篤度に応じて１回実施されてもよいし、反復されてもよい請求項４２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
例えばガン用、自己免疫疾患用、移植の間の療法用、アレルギー用、ウイルス若しくは細菌感染の間用の他の任意の関連処置が補充される請求項４２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
乳ガン、膀胱ガン、皮膚ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、甲状腺ガン、胃ガン、頭部頸部ガン若しくはメラノーマ又はそれらの任意の組合せの治療で利用される請求項４２〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５３１３９１（Ｐ２０１２−５３１３９１Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６５８９（Ｐ２０１２−５１６５８９）
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００３９４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０００５５１
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１２０００５７０）アイティーエイチ イミュン セラピー ホールディングス エービー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＴＨ ＩＭＭＵＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ＨＯＬＤＩＮＧＳ ＡＢ
【住所又は居所原語表記】Ａｖｄ Ｌ２ ０４， Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｏｌｎａ， Ｓ−１７１ ７６ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， ＳＷＥＤＥＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００３９４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０００５５１
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１２０００５７０）アイティーエイチ イミュン セラピー ホールディングス エービー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＴＨ ＩＭＭＵＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ＨＯＬＤＩＮＧＳ ＡＢ
【住所又は居所原語表記】Ａｖｄ Ｌ２ ０４， Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｓｏｌｎａ， Ｓ−１７１ ７６ Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， ＳＷＥＤＥＮ
【Ｆターム（参考）】
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