ガンの予防におけるヒドロキシマタイレシノール
【課題】ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防。
【解決手段】ヒドロキシマタイレシノールを含む医薬品、食品添加物および食品。ヒドロキシマタイレシノールによる、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防、ならびにヒドロキシマタイレシノールによる、ヒトの血清中のエンテロラクトンまたはヒドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度の増加により、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患の予防をもたらす。
【解決手段】ヒドロキシマタイレシノールを含む医薬品、食品添加物および食品。ヒドロキシマタイレシノールによる、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防、ならびにヒドロキシマタイレシノールによる、ヒトの血清中のエンテロラクトンまたはヒドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度の増加により、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患の予防をもたらす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシマタイレシノールをヒトに投与することによる、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防方法に関する。本発明はさらに、ヒドロキシマタイレシノールをヒトに投与することによるヒトの血清中のエンテロラクトンまたはヒドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度を増加させる方法であって、それによってヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防をもたらす方法に関する。また、本発明はヒドロキシマタイレシノールを含有する医薬品、食品添加物および食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景、およびとくに実用に関してさらに詳細に述べた例を説明するため、ここで用いた刊行物などを参考文献として組み入れる。
【０００３】
リグナン類は２,３−ジベンジルブタン骨格を有するフェノール系化合物の一群である。これらは、前駆体とよばれる桂皮酸、コーヒー酸、フェルラ酸、クマリン酸およびガリウム酸などの単量体単位のカップリングによって形成される（エアおよびロイク、１９９０年）。リグナンは植物に広く分布しており、さまざまな部位（根、葉、幹、種子、果実）に見られるが、少量である。多くの供給源（種子や果実）において、リグナンは植物の繊維成分と結びついたグリコシド共役体として検出される。哺乳類のリグナン前駆体の最も一般的な供給源食物は未精製の穀物である。食用植物のなかでリグナンの濃度が最も高いのは亜麻仁（flaxseed）であり、次に未精製の穀物、とくにライ麦があげられる。表１にさまざまな植物性食品から生成される哺乳類のリグナンを示す。
【０００４】
針葉樹にも多量のリグナンが見られる。リグナンの型は種によって異なり、リグナンの量は樹木の部位によって相違する。トウヒ（Picea abies）の心材に見られる典型的なリグナンには、ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）、α−コニデンドリン（conidendrin）、コニデンドリン酸、マタイレシノール、イソラリシレシノール（isolariciresinol）、セコイソラリシレシノール（secoisolariciresinol）、リオヴァイル（liovile）、ピセアレシノ−ル（picearesinol）、ラリシレシノールおよびピノレシノールがある（エクマン、１９７９年）。トウヒ中のリグナンのうち、最も豊富に含まれる単一成分はＨＭＲであり、全リグナンの約６０パーセントを占め、主に非共役遊離形で存在する。太い根におけるリグナン濃度は２〜３パーセントである。大量のリグナンは枝の心材（５〜１０パーセント）やねじれた部分（twists）の心材に含まれ、とくに木節ではリグナンの量は１０パーセントより多い（エクマン、１９７６年および１９７９年）。これらの濃度は、リグナン高含有材料として知られる、亜麻を挽いて粉末にしたものと比べ約１００倍である。
【０００５】
ヒドロキシマタイレシノールの化学構造は
【化１】
である。
【０００６】
リグナンはたとえば、圧縮材の繊維から単離することができる。これらの繊維は幹や、紙の品質を悪化させる木節（大き過ぎる木材チップの画分）の圧縮材から生じる（エクマン、１９７６年）。
【０００７】
マタイレシノールやセコイソラリシレシノールなどの植物性リグナンは、腸内微生物（gut microflora）によって、哺乳類リグナン、つまりそれぞれエンテロラクトンおよびエンテロジオールに変換される（アクセルソンら、１９８２年）。それらは腸肝循環し、グルクロニド共役体として尿に排出される（アクセルソンおよびセッチェル、１９８２年）。リグナンの化学的な予防作用の実験的な証拠として、脂肪分の多い食品にリグナン高含有亜麻仁粉末（５〜１０％）または亜麻仁リグナン（セコイソラリシレシノール−ジグリコシド（ＳＤＧ））を加えると、ラットにおいて抗エストロゲン感受性ＤＭＢＡ誘発性乳ガンの進行が抑制された（セレイノおよびトンプソン、１９９１年、１９９２年、トンプソンら１９９６年ａ、１９９６年ｂ）。それらにより、上皮細胞の増殖、核異常、腫瘍の成長および新しい腫瘍の発生が減少した。また、大量のリグナンの摂取が実験的前立腺および結腸ガンを防ぐ可能性もある。食用ライ麦（リグナンを含む）によって、ラットの移植されたダニングＲ３３２７前立腺ガンの成長が初期段階で抑制された（ツァンら、１９９７年；ランドストロームら、１９９８年）。明らかな腫瘍を有する動物の割合、腫瘍の大きさ、および成長率はかなり低かった。さらに、亜麻仁またはＳＤＧを加えることによって、ラットの結腸において化学的に誘導された異常陰窩の形成が抑制された（セレイノおよびトンプソン、１９９２年。ジェナブおよびトンプソン、１９９６年）。よって、抗腫瘍作用は、弱いエストロゲン−抗エストロゲン様特性および／またはほかのメカニズムによって起こる可能性があるが、それら特性やメカニズムはあまり解明されていない。
【０００８】
乳ガンの女性では、エンテロラクトンの尿への排出および血清中濃度が低く（イングラムら、１９９７年；フルテンら、１９９８年）、それはリグナンが化学的予防性であることを示している。哺乳類のリグナン（エンテロラクトンおよびエンテロジオール）は、エストロゲンと構造が似ているので、ホルモン性のガン、つまり乳ガンなどを緩和する、と仮定されてきた。エンテロラクトンはＭＣＦ−７細胞において弱いエストロゲン様の潜在力を有するが（モサビおよびアドラクルツ、１９９２年）、マウスの子宮重量においてはエストロゲン様の応答は見られなかった（セッチェルら、１９８１年）。エストロゲン様活性の兆候として、ラットに妊娠および授乳期間中ＳＤＧを与えることによって、離乳時には子宮重量が増加したが、後期にはその効果ははっきりしなかった（タウら、１９９８年）。また、予想される抗腫瘍効果は、リグナンの抗エストロゲン様作用と結びついている（ウォーターズおよびノーラー、１９８２年）。哺乳類リグナン、つまりエンテロラクトンによるアロマターゼの阻害は、リグナン高含有植物性食品の消費により乳ガンなどのエストロゲン依存性疾病を低減するメカニズムを提示していることが考えられる（アドラクルツら、１９９３年；ワンら１９９４年）。リグナンの潜在的な抗酸化活性もまた、ガンの進行を予防するリグナン作用のメカニズムを示していることが考えられる。さらに、哺乳類のリグナンは、テストステロンの、強い細胞内アンドロゲンである５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）への変換をヒトにおいて可能な濃度で阻害することを示した（エバンズら、１９９５年）。ＤＨＴ濃度の低下は、前立腺ガン（ＰＣ）や良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の危険性を緩和するであろう。
【０００９】
エンテロラクトンの前駆体としてのリグナンはまた、下部尿道症（ＬＵＴＳ）および女性化乳房を軽減することができる。我々は、動物実験の結果に基づき、膀胱頸部共同運動障害あるいは外括約筋偽共同運動障害として顕われる尿道共同運動障害における筋機能障害の進行に、エストロゲンが重要な役割を果たすことを示唆した（シュトレングら、考察は未発表）。そのような神経筋の変化は、アロマターゼ阻害剤（ＭＰＶ−２２１３ａｄ）によって少なくとも部分的に元に戻るが、それはエストロゲンの役割を表している。さらに、女性化乳房はエストロゲンとの接触やアンドロゲンよりエストロゲンが多く存在する場合などに誘発される。女性化乳房はアロマターゼ阻害剤によってうまく治療できる。５α−還元酵素および／またはアロマターゼを阻害するリグナンの能力は、潜在的な抗酸化活性と合わせて、男性においてホルモン性疾病が進行する際のリグナンによる予防作用のメカニズムを示している可能性がある。
【００１０】
リグナンに潜在するヒトへの効果に関するデータはない。ヒトにおけるリグナンの作用に関する最近の学説は、亜麻仁粉（つまりリグナン）を加えた食品がもたらす効果の研究から導き出されてきた。女性の食事に亜麻仁粉を含ませた場合、月経周期に変化が現れた（フィップスら、１９９３年）。正常な月経周期の被験者らでは、常食に加えて１日１０ｇの亜麻仁粉を摂取した場合、黄体期の平均長さがより長くなり、黄体期の血清中の１７β−エストラジオールに対するプロゲステロンの比率がより高くなった（フィップスら、１９９３年）。エストロンまたは１７β−エストラジオールの濃度に関しては、亜麻摂取グループと対照グループのあいだに大きな相違点はなかった。また、閉経後の女性の血清中エストロゲン濃度に関しても、亜麻摂取グループと対照グループのあいだに大きな相違点はなかった（ブレジンスキーら、１９９７年）。亜麻仁粉の追加によって血清中のＳＨＢＧ（エストラジオールを強力に結合するタンパク質）の濃度が増加した。これは、肝臓組織で見られる典型的なエストロゲン様効果である。一方、ＳＨＢＧの濃度の増加により、内因性エストロゲンのバイオアべイラビリティは低下する。健康な青年の場合、短期間（６週間）の食事への亜麻仁の添加（マフィンに１日１０ｇ）は、テストステロンの血漿中濃度に目立った影響を示さず、男性におけるエストロゲン作用（estrogenicity）の欠如を示している（シュルツら、１９９１年）。同時にこれらの研究は、リグナンは弱いホルモン（エストロゲン様および抗エストロゲン様）効果を有するが、リグナンの作用機構はそのホルモン効果によってすべて説明され得るわけではない、ということを示す。
【００１１】
結論として、以前は動物実験や臨床実験で使用するのに充分な量の単離哺乳類リグナンを入手することはできず、リグナン摂取量を増加させる唯一の可能性は、繊維質の多い亜麻仁などの食品の消費を増加させることであった。効率よくエンテロラクトンに変換し、大量に生成され単離されうるＨＭＲなどのリグナンは、ガン、他のホルモン性疾患および心疾患を化学的に予防するための医薬品および機能性食品などの食品の開発において貴重なものである。
【発明の概要】
【００１２】
ある側面において、本発明は有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体をヒトに投与することからなる、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防方法に関する。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体をヒトに投与することからなる、ヒトの血清中のエンテロラクトンまたはヒドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度を増加させる方法であって、それによってヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防をもたらす方法に関する。
【００１４】
第３の側面において、本発明は、有効量のヒドロキシマタイレシノールまたは幾何異性体もしくは立体異性体と、薬学的に許容しうる担体とからなる医薬品に関する。
【００１５】
第４の側面において、本発明は、ヒドロキシマタイレシノールまたはその幾何異性体もしくは立体異性体を濃縮した液体または固体材料からなる、食品添加物用製品に関する。
【００１６】
第５の側面において、本発明は、有効量のヒドロキシマタイレシノールまたはその幾何異性体もしくは立体異性体からなる食品に関する。
【００１７】
もう１つの側面において、本発明は、前記有効量のヒドロキシマタイレシノール、その幾何異性体または立体異性体を食品に添加することからなる食品の安定性を高める方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はＪＥＧ−３細胞におけるリグナンによるアロマターゼの濃度相関阻害を示す。
【図２】図２はＨＭＲの存在下および非存在下におけるＭＣＦ−７細胞の増殖を示す。
【図３】図３はＨＭＲまたはアロマターゼ阻害剤で処理した未成熟ラットの子宮の湿重量を示す。
【図４】図４はメスのラットにおけるＤＭＢＡ誘発性乳腺腫瘍に対するＨＭＲの抗腫瘍活性を示す。
【図５】図５は種々の投与量のＨＭＲで処理したラットの、エンテロラクトンの尿への排出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明はヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）を食品に添加し、また医薬品として用いることによってヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患を予防する、リグナン、つまりＨＭＲの用途に関する。驚いたことに、ＨＭＲはインビボでエンテロラクトンへ代謝されるが、これがリグナンの抗腫瘍特性の原因の一つであると考えられている。インビトロでのＨＭＲの抗酸化活性は大きく、この特性は、ＨＭＲが、体内において有害な遊離酸素種に対する保護効果を通して心疾患をも防ぐことができるということを示している。また、本発明は食品の安定性を向上する（つまり栄養価の損失や食品の風味の低下につながる、脂質および色素の酸化とビタミンの喪失とを抑制する）ための食品添加物としてのＨＭＲの用途に関する。
【００２０】
本発明の方法は、乳ガン、前立腺ガンおよび結腸ガン、下部尿路症、尿道共同運動障害、膀胱不安定性、膀胱排出口閉塞、良性前立腺過形成および男性の女性化乳房などの非ガン性ホルモン依存性疾患、および血清中の酸化ＬＤＬに起因する心疾患の予防に特に効果的である。
【００２１】
本発明による医薬品は経口処方であることが好ましい。活性化合物（ＨＭＲ）の必要量は、予防すべき特定の症状によって異なるが、標準的な投与量は大人で１日約１０〜１００ｍｇである。
【００２２】
本発明の食品添加物において、ヒドロキシマタイレシノールで強化される材料は、ＨＭＲとの混合に適し、ＨＭＲの特性を損なわない、食用で中毒性のない固体または液体の材料であればどのようなものでもよい。この材料の役割は主に、ＨＭＲの確実な投与を容易にすることである。好ましい濃度は、たとえば強化された材料１００ｇ中にＨＭＲ１００ｍｇ〜１ｇである。
【００２３】
本発明の食品とは、とくに機能性食品、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品、遺伝子操作食品（designer food）または任意の食品である。食品中のＨＭＲの好ましい濃度は、たとえば食品１００ｇに対してＨＭＲ１〜２０ｍｇである。
【００２４】
本発明の機能性食品はたとえば、バター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、アメ、菓子類、ヨーグルトもしくは他の発酵乳製品、またはムースリなどのシリアルの形が可能である。
【００２５】
ヒドロキシマタイレシノールの添加は、栄養価の損失と食品の風味の低下につながる、脂質、ビタミンおよび色素の酸化を抑制することを目的として、食品の安定性を向上する場合にとくに有用である。このためにＨＭＲの好ましい濃度は、たとえば約０．１％である。
【００２６】
本発明で使用するＨＭＲは、圧縮材の大き過ぎるチップ画分（oversize chip fraction）（枝、ねじれ部分および木節を含む）から単離する。ＨＭＲはガンや心疾患などの疾病の予防に用いる。
【００２７】
ＨＭＲの特性を７つの異なる分析方法によって検討した。
１．インビトロにおける抗酸化力の測定
２．ＪＥＧ−３細胞におけるアロマターゼ阻害力の測定
３．ＭＣＦ−７培養細胞におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の測定
４．子宮成長の生物学的検定によるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
５．オスの成体ラットにおけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の測定
６．ラットＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおける抗腫瘍活性の調査
７．種々の量のＨＭＲを投与した後のラットの尿に含まれる代謝産物の分析
【００２８】
以前は、ＨＭＲが樹木のリグナン成分であることから、その特徴はあまり注目されておらず、生物学的試験を行なうのに充分な量のＨＭＲを単離し、精製することは不可能であった。しかし、トウヒ（spruce）の様々な部位におけるＨＭＲの分布が知られ（エクマン、１９７６年および１９７９年）、リグナン、とくにＨＭＲの詳細な研究の機会が得られた。
【００２９】
ＨＭＲの投与量と尿中のエンテロラクトンの量との間に線形相関が見られた。エンテロラクトンは広く知られた哺乳類のリグナンであり、マタイレジノールから腸内細菌によって、またはエンテロジオールの酸化によって形成される（アクセルソンおよびセッチェル、１９８１年；アクセルソンら、１９８２年）。わずかな量の代謝されなかったＨＭＲとほかの代謝産物（エンテロジオールと７−ヒドロキシエンテロラクトン）とが尿中に見られた。それらの量は、毎日のＨＭＲの投与量を増やしても変化しなかった。これらの発見は、ＨＭＲが代謝されエンテロラクトンとなり、さらにジメチル化およびジヒドロキシル化を経てＨＭＲから生じたエンテロラクトンは、エンテロジオールには変換しないということを示唆している。ＨＭＲの構造に基づいて、７−ヒドロキシエンテロラクトンが主なＨＭＲの代謝産物であると考えられたが、それは違っていた。このヒドロキシル基は代謝の際に脱離する。ＨＭＲの代謝は、ＳＤＧの代謝とは異なる。ＳＤＧは代謝によってエンテロジオールになり、その一部は酸化されエンテロラクトンになる（リカードら、１９９６年、ランペら、１９９４年）。ＨＭＲはしたがって、エンテロラクトンの直接の前駆体として、ＳＤＧよりも有利である。
【００３０】
ＨＭＲはラットの子宮または男性において、たとえあるとしても弱いエストロゲン様活性しか示さない。ＨＭＲはＭＣＦ−７細胞において、弱く有意性のないエストロゲン様活性しか示さない。また、ＨＭＲに関して抗エストロゲン活性は見られなかった。それゆえ、図２に示すように、ＨＭＲがラットのＤＭＢＡ誘発性腫瘍モデルにおいて非常に有意な抗腫瘍活性を示したことは驚きである。ＨＭＲの活性はＨＭＲ自身あるいはエンテロラクトンが原因であると考えられる。しかし、ラットにＤＭＢＡ処理ののち、２種類の投与量（３および１５ｍｇ／ｋｇ）でＨＭＲを与えた場合、ＨＭＲの化学的予防作用には投与量との因果関係はなかった。よって、抗腫瘍効果を得るためには、ＨＭＲは必ずしもエンテロラクトンに変換される必要はなく、またこれらのリグナンの投与量はより少量でも最大の化学的予防効果を得るのに充分である。
【００３１】
表２および３に示すように、ＨＭＲは非常に有効な抗酸化剤である。ＨＭＲは、既知の最も強力な、脂質過酸化反応の阻害剤のひとつであり、ＬＤＬの酸化を防ぐ優れた阻害剤である。ＬＤＬの酸化の阻害はヒトにおいて非常に重要であるとされている。なぜなら、酸化ＬＤＬの血清中濃度が、アテローム性動脈硬化症といった心疾患を予測する最良のものの一つとされているからである。ＨＭＲは食品の安定性を向上する（つまり栄養価の損失と食品の風味の低下につながるビタミン、脂質および色素の酸化を抑制する）食品添加物となりうる。なぜなら、ＨＭＲは、食品安定性の向上のために通常用いられる、よく知られた抗酸化剤、すなわちブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などよりもさらに優れたスーパーオキシドアニオンの捕捉剤およびペルオキシラジカルの捕捉剤であるからである。
【００３２】
実験
薬品
リグナンのエストロゲン様作用、抗エストロゲン様作用、芳香族化（aromatization）を阻害する能力そして抗酸化特性を調べるため、様々なリグナンをインビトロで試験した。試験用化合物は以下から入手した。エンテロジオールおよびエンテロラクトンは、イギリス、ロンドンのプランテック社（Plantech）より購入した。２つの７−ＯＨエナンチオマーを有する７−ヒドロキシエンテロラクトンはフィンランド、ヘルシンキ大学応用化学研究室、クリスティナ・ワララ教授（Dr. Kristina Waehaelae）のご好意により提供された。
【００３３】
樹木からのＨＭＲの抽出
エクマン（１９７６年）およびエクマン（１９７９年）に記載の方法によって、ＨＭＲ抽出物をノルウェイ・トウヒ（Picea Abies）より単離した。簡単言うと、凍結乾燥粉末心材をヘキサンでソックスレー抽出し、無極性、親油性の抽出物を除去した。その木材試料をアセトン／水（９：１ ｖ／ｖ）を用いて、同じ装置でさらに抽出し、粗リグナンを得た。ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）およびその異性体を単離し、さらに精製するため、ＸＡＤ樹脂で再度クロマトグラフィーを行なった。
【００３４】
インビトロにおける抗酸化力の測定
リグナンの抗酸化力を４つの異なる方法で評価した。１）脂質過酸化の阻害、２）低比重リポタンパク（ＬＤＬ）酸化の阻害、３）スーパーオキシド アニオンの捕捉および４）ぺルオキシラジカルの捕捉の分析である。
【００３５】
脂質過酸化の阻害は、インビトロでのラット肝臓ミクロソームにおいてtert−ブチルハイドロパーオキサイド誘発脂質過酸化（ｔ−ＢｕＯＯＨ−ＬＰ）を阻害するリグナンの能力により評価した（アホトゥパら、１９９７年）。ｔ−ＢｕＯＯＨ−ＬＰに対する試験は次のように行なった。緩衝液０．８ｍｌ（５０ｍＭ 炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を照度計のキュベットにピペットで注入した。最終濃度が１．５ｍｇ タンパク質／ｍｌ の希釈肝臓ミクロソーム２０μｌを添加し、ついで、ルミノール６ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）および試験用薬品（test chemicals）を加えた。エタノールまたはジメチルスルホキシド（インキュベーション体積の２％）で希釈した少量の被験化合物をインキュベーション混合物に加え、ビヒクル（vehicle）（エタノールまたはジメチルスルホキシド）の場合と脂質過酸化力を比較した。０．９ｍＭのｔ−ＢｕＯＯＨ ０．０５ｍｌを用いて３３℃で反応を開始した。化学発光を１分ごとに約４５分間測定し、曲線下部の面積（積分）を求めた。化学発光の測定は分析専用ソフトを用いてパーソナルコンピュータに接続したバイオ−オービット（Bio-Orbit）１２５１照度計（バイオ−オービット社製、ツルク、フィンランド）を用いて行なった。
【００３６】
ＬＤＬの酸化の阻害は、アホトゥパら（１９９６年）に記載の方法によって評価した。簡単に言うと、緩衝化ヘパリンを用いて沈殿（precipitation）によりＬＤＬを単離した。リン酸緩衝液中で再度懸濁した後、２０ｍＭのＣｕＣｌ2を添加し、混合液を３７℃で３時間インキュベートした。こののちクロロフォルム−メタノールによりＬＤＬ脂質を抽出し、窒素下で乾燥し、シクロヘキサンに再び溶解させ、分光光度法を用い、２３４ｎｍで分析した。吸光度の強度はＬＤＬの酸化を示す。さまざまな化合物のＬＤＬ酸化防止力を調べるため、ＣｕＣｌ2添加前のインキュベーション混合物にそれらの化合物を加えた。分析中に被験化合物の妨げとなりうるものは、インキュベーション期間の前後に２３４ｎｍでの吸収を測定することによって取り除いた。初期濃度（０．１ｍＭ）で抗酸化効果を示した化合物に関し、ＩＣ−５０値（被験化合物によってＬＤＬの酸化が５０％阻害された濃度）を求めた。
【００３７】
スーパーオキシドアニオン捕捉方法は、キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系により調製した条件下で生成されるスーパーオキシドアニオン、および生成した反応性酸素種の照度計による検出にもとづいた（アホトゥパら、１９９７年）。被験化合物が化学発光を減少させる能力を評価した。ＩＣ−５０濃度（５０％の化学発光が抑制された濃度）を求めた。
【００３８】
ペルオキシラジカル捕捉の分析は、２，２'−アゾビス（２−アミジノプロパン）ＨＣｌの熱分解によるペルオキシラジカルの発生、および化学発光によるその検出にもとづいた（アホトゥパら、１９９７年）。その結果を化学量論的な因子、つまり被験化合物１モルにつき何モルのペルオキシラジカルが捕捉されうるか、として求めた。
【００３９】
ＪＥＧ−３細胞におけるアロマターゼ阻害力の測定
ＨＭＲおよび構造的に関連するリグナン（エンテロラクトン、エンテロジオールおよび７−ヒドロキシエンテロラクトン）の効果を、ヒト絨毛癌細胞株であるＪＥＧ−３細胞における3Ｈ−アンドロステンジオンからの3Ｈ−１７β−エストラジオールの生成にもとづいて調べた。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞は、インビトロでアロマターゼ阻害作用を調査し得る有効なアロマターゼ・モデルである（クレッケルら、１９９１年）。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％含有ＤＭＥＭ中に細胞を保持した。3Ｈ−アンドロスト−４−エン,３,１７−ジオン（０．５ｎＭ）５０μｌ、非標識アンドロステンジオン（０．５ｎＭ）５０μｌ、被験化合物（１０ｍＭ）１００μｌおよび細胞懸濁液８００μｌ（細胞１００万個）をインキュベーション混合物とした。４時間のインキュベーションののち、非標識の担体（アンドロステンジオン、テストステロン、１７β−エストラジオールおよびエストロン）を加えた。ジクロロメタン３．０ｍｌを用いてそれらステロイドを２回抽出した。以前に述べられたように、ＨＰＬＣを用いて放射性標識3Ｈ−１７β−エストラジオールの分離と定量を行なった（マケラら、１９９５年）。カラム系は保護カラム、続いてＣ１８ １５０×３．９ｍｍＩＤ分析カラム（テクノパック１０Ｃ１８ＨＰＬＣテクノロジー；ウェリントンハウス、チェシャー州、イギリス）から構成された。移動相はアセトニトリル／水（３５／６５）であり、流速は１．２ｍｌ／分であった。放射性代謝物質のインライン検出のため、ＨＰＬＣカラムの溶離液を液体蛍光体（liquid scintillant）と連続的に混合し、インライン放射能検出器を用いてモニターした。
【００４０】
ＭＣＦ−７培養細胞におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の測定
ＭＣＦ−７細胞株（ヒト乳ガン細胞）保存培養物（stock cultures）は、５％ＦＣＳ、ペニシリン１００ Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、インシュリン１０μｇ／ｍｌおよび１７β−エストラジオール１ｎＭを加えたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地中、Ｔ−７５細胞培養びん内で培養した。培地は１週間に３回新しいものと交換した。保存培養物をトリプシン処理によって取り出し、フェノールレッドを含まないベルセン溶液（versene solution）１０ｍｌ中に懸濁し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５％デキストラン木炭除去（dextran charcoal stripped）ＦＳＣ（ｄｃＦＳＣ）を加えたＲＰＭＩ培地中に細胞ペレットを慎重に再懸濁し、６穴プレートに５００００細胞個／３．０ｍｌ溶媒／ウェルの割合で播種した。培養２日目に培地を交換し、被験化合物を加えた。リグナン化合物のエストロゲン様効果を調べるため、リグナン化合物をエタノールに希釈し、細胞培養物に加え、最終濃度を１．０Ｍとした。各増殖検定において、１．０ｎＭ１７β−エストラジオールのエタノール溶液をエストロゲン様反応に関する陽性対照として使用した。同量のエタノールを対照ウェルに加えた。また、抗エストロゲン様効果を調べるため、１７β−エストラジオールとリグナンとの両溶液を培養細胞に加えた。被験化合物の存在下において５日〜７日間細胞を培養し、培地は２日おきに交換した。細胞増殖は、コールター計数器を用いて溶出した核を数えることによって定量化した。
【００４１】
未成熟ラットの子宮向性（uterotropic）試験におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
３日であった処理時間を７日に変えた以外は、以前に記述された方法（ジョーダンら、１９７７年）にもとづき、未成熟ラットの子宮向性検定を行ない、ＨＭＲのエストロゲン様活性を評価した。処理時間を延長したのは、被験化合物のエストロゲン性が弱いと予測されるからである。エストラジオールの生合成を防ぐアロマターゼ阻害剤（ＭＰＶ−２２１３ａｄ）による未成熟ラットの処置は、非エストロゲン刺激子宮に対応する実験方法上の対照として使用される。
【００４２】
オスの成体ラットにおけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
正常および低アンドロゲンのノーブル（Noble）系オスラット（６〜９月齢）において、ＨＭＲのエストロゲン（抗アンドロゲン）様および抗エストロゲン様効果をそれぞれ調べた。オス生殖器系の構造および機能の変化を伴う慢性の低アンドロゲン状態を新生児期のエストロゲン化により誘発した（ジエチルスチルベストロール１０．０μｇ／体重ｋｇ（菜種油に溶解）を生後１〜５日間皮下注射）。これらの変化は、ＭＰＶ−２２１３ａｄを一日に１０〜３０ｍｇ／体重ｋｇ投与することによるアロマターゼ阻害剤処理によって部分的に回複することが知られている（シュトレングら、考察は未発表）。
【００４３】
動物に大豆を含まない基礎食（ＳＤＳ、ウィンザム、エセックス州、イギリス）を与えた。水は自由に飲ませた。正常な動物および低アンドロゲンの動物１２匹に、菜種油に溶解して一日量ＨＭＲ５０ｍｇ／体重ｋｇをチューブにより補給した。両方の動物モデルのほかの１２匹に対し、プラセボ処理として菜種油のみをチューブにより補給した。４週間の処置ののち、動物を殺し、精巣および付属する性腺（腹側前立腺、精嚢および凝固腺）の重量を測定した。血清および精巣テストステロン、ならびに下垂体および血清黄体ホルモン（ＬＨ）のレベルを免疫学的検定法によって測定した（ハービストら、１９９３年）。
【００４４】
ラットＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおける抗腫瘍活性の調査
ラットの乳ガンにおけるＨＭＲの抗腫瘍活性を、以前に述べられた方法（カンガスら、１９８６年）により調査した。生後５０日のメスのスプレーグ−ダウレイ（Sprague-Dawley）系ラットにＤＭＢＡ（ジメチルベンツ[a]アントラセン（dimethylbentz[a]anthracene））１２．０ｍｇをチューブにより補給した。約６週間後には明らかな腫瘍が見られ、そののち腫瘍の幅（ｗ）および長さ（ｌ）を１週間に１度測定し、式Ｖ＝（πｗ2ｌ）／１２にしたがって腫瘍の大きさを求めた。また、１週間に１度ラットの体重を測った。実験開始時に各グループの腫瘍の総数が同じになるように、ラットを３グループに分けた。（１）対照グループ８匹、（２）ＨＭＲ３．０ｍｇ／ｋｇ７匹、および（３）ＨＭＲ１５．０ｍｇ／ｋｇ７匹であり、実験終了前に１匹を殺さなければならなかった。
【００４５】
ＤＭＢＡ誘導の９週間後、つまり明白な腫瘍が見られるようになって３週間後のころから、ＨＭＲの経口投与を開始し、７．５週間にわたって毎日投与した。実験終了時、腫瘍を成長パターンにより各群、１．成長腫瘍（ＰＤ＝進行性疾患）；２．非成長、安定腫瘍（ＳＤ＝安定性疾患、腫瘍の大きさに変化なし、または７５％に満たない退化が見られる）；３．退化腫瘍（ＰＲ＝部分的な応答、つまり７５％を超える腫瘍体積の退化が見られる）；４．消失腫瘍（ＣＲ＝完全な応答、明らかな腫瘍は見られない）に分類した。
【００４６】
種々の量のＨＭＲを投与した後のラットの尿に含まれる代謝産物の分析
オスのスプレーグ−ダウレイラット（４月齢）１０匹を用いてＨＭＲの代謝をインビボで調査した。代謝調査のあいだ、ラットを２匹１組、１２時間の明暗周期で収容し、水は自由に飲ませ、大豆抜きの基礎食（ＳＤＳ、ウィンザム、エセックス州、イギリス）を与えた。
【００４７】
１０％エタノール−ＰＥＧ溶液に溶解したＨＭＲを３、１５、２５および５０ｍｇ／体重ｋｇの投与量で１日１回２日間ラットにチューブにより補給した。２回目のチューブによる補給後、０．５６Ｍアスコルビン酸１２０μｌ、および防腐剤として０．１５Ｍナトリウムアジド１２０μｌが入った回収器内の代謝物保持器に２４時間分の尿を集めた。遠心分離した尿の容量を測定し、−２０℃で保管した。前処理として、解凍した尿３．０ｍｌに０．２Ｍ酢酸緩衝液７５０μｌ（ｐＨ４．０±０．１）を加えた。Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラム（シリカをベースにした樹脂１００ｍｇ／カラム）を尿の抽出に用いた。水３．０ｍｌ、メタノール３．０ｍｌおよび酢酸緩衝液３．０ｍｌを用いてカラムをあらかじめ調整した。尿をカラムに通し、酢酸緩衝液３．０ｍｌで洗浄したのち、メタノール３．０ｍｌを用いてポリフェノール類（polyphenolics）を溶出した。溶出物を窒素下４５℃のウォーターバスで蒸発乾固し、乾燥した残渣を０．２Ｍ酢酸緩衝液３．０ｍｌ中に再溶解した。エスカルゴ（Helix pomatia）酵素混合物３０μｌを加え、溶液を３７℃でインキュベートし、グルクロニドおよび硫酸エステルをともに加水分解した。フラボン原液（ＥｔＯＨ中１００μｇ／ｍｌ）３００μlを加水分解した試料に加え、Ｃ−１８カラムを用いて試料を抽出し、前記のように蒸発乾固し、ＧＣ−ＭＳによる分析まで−２０℃で保管した。
【００４８】
蒸発させた尿試料をピリジンに溶解し、ＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ（１０：１）のシリル化試薬を加えシリル化した。シリル化した試料のＧＣ−ＭＳ分析は、ＨＰ６８９０−５９７３ＧＣ−ＭＳ装置を用いて行なった。ＧＣカラムはＨＰ−１架橋メチルポリシロキサンカラム（１５ｍ×直径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を使用し、ヘリウムをキャリヤーガスとして流速１ｍｌ／分で用いた。ＧＣ炉の温度は昇温速度８℃／分で６０℃から２９０℃に設定し、ＧＣ注入器はスプリット率１：１５のスプリットモードに設定した。注入器の温度は２５０℃であった。化合物の同定は質量スペクトルに基づいて行なった。定量計算は内標準に相対的な対象化合物の無修正のピーク面積に基づいて行なった。
【００４９】
結果
インビトロでの抗酸化作用の評価
本実験において、ＨＭＲはほかのリグナンまたはフラボノイドより脂質過酸化阻害作用が大きかった（表２）。よく知られた抗酸化剤、たとえば水溶性ビタミンＥ誘導体であるＴＲＯＬＥＸや、ＢＨＡおよびＢＨＴを、脂質過酸化阻害力、ＬＤＬ酸化阻害力およびスーパーオキシドならびにペルオキシラジカル捕捉力においてＨＭＲと比較した（表３）。全体として、ＨＭＲは最も強力な抗酸化剤であり、すべての検定においてＢＨＡやＢＨＴより効果が大きく、脂質過酸化阻害検定以外のすべての実験においてＴＲＯＬＥＸより強力であった。脂質過酸化防止実験では、両化合物はほぼ同じように活性であった。
【００５０】
ＪＥＧ−３細胞におけるアロマターゼ阻害力
ＪＥＧ−３細胞における3Ｈ−アンドロステンジオンからの3Ｈ−１７β−エストラジオールの生成の阻害について、様々なＨＭＲ濃度で実験した。ＨＭＲの阻害力をエンテロラクトン、７−ヒドロキシエンテロラクトンおよびエンテロジオールと比較した。エンテロラクトンは１．０〜１０．０μＭの濃度範囲内で投与量に依存した芳香族化阻害を生じた。さらに、エンテロジオールには阻害作用はなく、阻害作用にはラクトン環が不可欠であることが示された。７−ヒドロキシエンテロラクトンおよびヒドロキシマタイレシノールには阻害効果はなく（図１）、アロマターゼ阻害におけるリグナン分子内の水酸基の数と位置の重要性を示唆している。
【００５１】
ＭＣＦ−７培養細胞におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性
ＭＣＦ−７細胞増殖において、図２に示すようにＨＭＲは非常に弱い、統計的に有意とは言えないエストロゲン様および抗エストロゲン様活性しか有さなかった。
【００５２】
未成熟ラットの子宮向性試験におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
図３は未成熟ラットの子宮の成長に対するＨＭＲの作用を例示している。ＨＭＲは、未成熟ラットの子宮重量の増加に有意なエストロゲン様効果を示さなかった。ＨＭＲにより、子宮重量が減少することもなく、抗エストロゲン様効果もないことが示された。アロマターゼ阻害剤は、予想通り子宮重量の増加を抑制し、アロマターゼ阻害剤の測定の方法は適切であったことが示された。
【００５３】
オスの成体ラットにおけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
ＨＭＲ処理の４週間後、対照および低アンドロゲングループでは、付属生殖腺および精巣の重量において有意な変化は見られなかった（表４）。テストステロンやＬＨの濃度にも有意な変化は見られなかった（表５）。これらの結果は、ＨＭＲは男性において完全なエストロゲン作用薬ではない、ということを示している。なぜなら、ＨＭＲは視床下部−脳下垂体−生殖腺−軸に対して典型的なエストロゲン様作用（ＬＨおよびアンドロゲン分泌の抑制）を及ぼさないからである。また、オスのラットにおける新生児期のエストロゲン化により誘発された変化は、ＨＭＲにより元に戻ることはないので、ＨＭＲは抗エストロゲンでもない。
【００５４】
ラットＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおける抗腫瘍活性の調査
進行腫瘍（ＰＤ）と安定腫瘍（ＳＤ）、退化腫瘍（ＰＲ）および消失腫瘍（ＣＲ）の数を表４に示す。ＨＭＲの抗腫瘍効果は統計的に非常に有意であることがわかった。本モデルでは、抗腫瘍作用の明確な投与量依存性はなかった。ＨＭＲの抗酸化特性および腫瘍成長退化特性はともに、インビボでの抗腫瘍活性と結び付いている、という可能性がある。ＨＭＲのインビボでの抗腫瘍活性のメカニズムは依然知られていない。
【００５５】
種々の量のＨＭＲを投与した後のラットの尿に含まれる代謝産物の分析
図５は、ラットにおけるＨＭＲの主な分泌代謝物が、生物学的活性化合物であると考えられる、エンテロラクトンであることを示している。これはＨＭＲの化学構造を考慮すると、ヒドロキシエンテロラクトンが主な代謝物であると考えられるので、驚くべきことである。ＨＭＲのエンテロラクトンへの代謝は、ラットの肝臓よりむしろ腸内細菌叢（bacterial intestinal flora）によって触媒され得る。
【００５６】
結論
ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）は、ＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおいて、他の物質に変化せずに、および／またはエンテロラクトンに変化したのちに抗腫瘍活性を有する。それゆえ、ＨＭＲは乳ガン（ＢＣ）、前立腺ガン（ＰＣ）、結腸癌または良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を患う恐れのあるヒトにおいて、有益な効果をもたらす可能性がある。ＨＭＲは代謝によってエンテロラクトンとなり、インビトロにおける芳香族化を阻害する。ＨＭＲはアロマターゼ阻害剤の前駆体として下部尿路症（ＬＵＴＳ）、膀胱不安定性、膀胱排出口閉塞、尿道共同運動障害および女性化乳房の進行を抑制し得る。また、ＨＭＲには強い抗酸化活性があり、それゆえに食品添加物（抗酸化剤）として用いることができる。医薬品や栄養補助食品（dietary supplement）としてのＨＭＲは、ヒトに対する有益な心血管効果を与え得る。新しい画期的な機能性食品、栄養補給食品、健康食品、治療用食品、遺伝子操作食品、あるいは新規な食品を製造するために、ＨＭＲを添加することは実行性のあることである。
【００５７】
本発明の方法は、様々な形の実施態様によって具体的に表され、ここに記載したものはわずか一部であるということは充分理解されるであろう。ほかの実施態様が考えられ、それらが本発明の主旨に沿っていることは当業者に明らかであろう。このように、記載した実施態様は例示的なものであり、限定的なものと解釈されるべきではない。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
［参考文献］
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシマタイレシノールをヒトに投与することによる、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防方法に関する。本発明はさらに、ヒドロキシマタイレシノールをヒトに投与することによるヒトの血清中のエンテロラクトンまたはヒドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度を増加させる方法であって、それによってヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防をもたらす方法に関する。また、本発明はヒドロキシマタイレシノールを含有する医薬品、食品添加物および食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景、およびとくに実用に関してさらに詳細に述べた例を説明するため、ここで用いた刊行物などを参考文献として組み入れる。
【０００３】
リグナン類は２,３−ジベンジルブタン骨格を有するフェノール系化合物の一群である。これらは、前駆体とよばれる桂皮酸、コーヒー酸、フェルラ酸、クマリン酸およびガリウム酸などの単量体単位のカップリングによって形成される（エアおよびロイク、１９９０年）。リグナンは植物に広く分布しており、さまざまな部位（根、葉、幹、種子、果実）に見られるが、少量である。多くの供給源（種子や果実）において、リグナンは植物の繊維成分と結びついたグリコシド共役体として検出される。哺乳類のリグナン前駆体の最も一般的な供給源食物は未精製の穀物である。食用植物のなかでリグナンの濃度が最も高いのは亜麻仁（flaxseed）であり、次に未精製の穀物、とくにライ麦があげられる。表１にさまざまな植物性食品から生成される哺乳類のリグナンを示す。
【０００４】
針葉樹にも多量のリグナンが見られる。リグナンの型は種によって異なり、リグナンの量は樹木の部位によって相違する。トウヒ（Picea abies）の心材に見られる典型的なリグナンには、ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）、α−コニデンドリン（conidendrin）、コニデンドリン酸、マタイレシノール、イソラリシレシノール（isolariciresinol）、セコイソラリシレシノール（secoisolariciresinol）、リオヴァイル（liovile）、ピセアレシノ−ル（picearesinol）、ラリシレシノールおよびピノレシノールがある（エクマン、１９７９年）。トウヒ中のリグナンのうち、最も豊富に含まれる単一成分はＨＭＲであり、全リグナンの約６０パーセントを占め、主に非共役遊離形で存在する。太い根におけるリグナン濃度は２〜３パーセントである。大量のリグナンは枝の心材（５〜１０パーセント）やねじれた部分（twists）の心材に含まれ、とくに木節ではリグナンの量は１０パーセントより多い（エクマン、１９７６年および１９７９年）。これらの濃度は、リグナン高含有材料として知られる、亜麻を挽いて粉末にしたものと比べ約１００倍である。
【０００５】
ヒドロキシマタイレシノールの化学構造は
【化１】
である。
【０００６】
リグナンはたとえば、圧縮材の繊維から単離することができる。これらの繊維は幹や、紙の品質を悪化させる木節（大き過ぎる木材チップの画分）の圧縮材から生じる（エクマン、１９７６年）。
【０００７】
マタイレシノールやセコイソラリシレシノールなどの植物性リグナンは、腸内微生物（gut microflora）によって、哺乳類リグナン、つまりそれぞれエンテロラクトンおよびエンテロジオールに変換される（アクセルソンら、１９８２年）。それらは腸肝循環し、グルクロニド共役体として尿に排出される（アクセルソンおよびセッチェル、１９８２年）。リグナンの化学的な予防作用の実験的な証拠として、脂肪分の多い食品にリグナン高含有亜麻仁粉末（５〜１０％）または亜麻仁リグナン（セコイソラリシレシノール−ジグリコシド（ＳＤＧ））を加えると、ラットにおいて抗エストロゲン感受性ＤＭＢＡ誘発性乳ガンの進行が抑制された（セレイノおよびトンプソン、１９９１年、１９９２年、トンプソンら１９９６年ａ、１９９６年ｂ）。それらにより、上皮細胞の増殖、核異常、腫瘍の成長および新しい腫瘍の発生が減少した。また、大量のリグナンの摂取が実験的前立腺および結腸ガンを防ぐ可能性もある。食用ライ麦（リグナンを含む）によって、ラットの移植されたダニングＲ３３２７前立腺ガンの成長が初期段階で抑制された（ツァンら、１９９７年；ランドストロームら、１９９８年）。明らかな腫瘍を有する動物の割合、腫瘍の大きさ、および成長率はかなり低かった。さらに、亜麻仁またはＳＤＧを加えることによって、ラットの結腸において化学的に誘導された異常陰窩の形成が抑制された（セレイノおよびトンプソン、１９９２年。ジェナブおよびトンプソン、１９９６年）。よって、抗腫瘍作用は、弱いエストロゲン−抗エストロゲン様特性および／またはほかのメカニズムによって起こる可能性があるが、それら特性やメカニズムはあまり解明されていない。
【０００８】
乳ガンの女性では、エンテロラクトンの尿への排出および血清中濃度が低く（イングラムら、１９９７年；フルテンら、１９９８年）、それはリグナンが化学的予防性であることを示している。哺乳類のリグナン（エンテロラクトンおよびエンテロジオール）は、エストロゲンと構造が似ているので、ホルモン性のガン、つまり乳ガンなどを緩和する、と仮定されてきた。エンテロラクトンはＭＣＦ−７細胞において弱いエストロゲン様の潜在力を有するが（モサビおよびアドラクルツ、１９９２年）、マウスの子宮重量においてはエストロゲン様の応答は見られなかった（セッチェルら、１９８１年）。エストロゲン様活性の兆候として、ラットに妊娠および授乳期間中ＳＤＧを与えることによって、離乳時には子宮重量が増加したが、後期にはその効果ははっきりしなかった（タウら、１９９８年）。また、予想される抗腫瘍効果は、リグナンの抗エストロゲン様作用と結びついている（ウォーターズおよびノーラー、１９８２年）。哺乳類リグナン、つまりエンテロラクトンによるアロマターゼの阻害は、リグナン高含有植物性食品の消費により乳ガンなどのエストロゲン依存性疾病を低減するメカニズムを提示していることが考えられる（アドラクルツら、１９９３年；ワンら１９９４年）。リグナンの潜在的な抗酸化活性もまた、ガンの進行を予防するリグナン作用のメカニズムを示していることが考えられる。さらに、哺乳類のリグナンは、テストステロンの、強い細胞内アンドロゲンである５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）への変換をヒトにおいて可能な濃度で阻害することを示した（エバンズら、１９９５年）。ＤＨＴ濃度の低下は、前立腺ガン（ＰＣ）や良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の危険性を緩和するであろう。
【０００９】
エンテロラクトンの前駆体としてのリグナンはまた、下部尿道症（ＬＵＴＳ）および女性化乳房を軽減することができる。我々は、動物実験の結果に基づき、膀胱頸部共同運動障害あるいは外括約筋偽共同運動障害として顕われる尿道共同運動障害における筋機能障害の進行に、エストロゲンが重要な役割を果たすことを示唆した（シュトレングら、考察は未発表）。そのような神経筋の変化は、アロマターゼ阻害剤（ＭＰＶ−２２１３ａｄ）によって少なくとも部分的に元に戻るが、それはエストロゲンの役割を表している。さらに、女性化乳房はエストロゲンとの接触やアンドロゲンよりエストロゲンが多く存在する場合などに誘発される。女性化乳房はアロマターゼ阻害剤によってうまく治療できる。５α−還元酵素および／またはアロマターゼを阻害するリグナンの能力は、潜在的な抗酸化活性と合わせて、男性においてホルモン性疾病が進行する際のリグナンによる予防作用のメカニズムを示している可能性がある。
【００１０】
リグナンに潜在するヒトへの効果に関するデータはない。ヒトにおけるリグナンの作用に関する最近の学説は、亜麻仁粉（つまりリグナン）を加えた食品がもたらす効果の研究から導き出されてきた。女性の食事に亜麻仁粉を含ませた場合、月経周期に変化が現れた（フィップスら、１９９３年）。正常な月経周期の被験者らでは、常食に加えて１日１０ｇの亜麻仁粉を摂取した場合、黄体期の平均長さがより長くなり、黄体期の血清中の１７β−エストラジオールに対するプロゲステロンの比率がより高くなった（フィップスら、１９９３年）。エストロンまたは１７β−エストラジオールの濃度に関しては、亜麻摂取グループと対照グループのあいだに大きな相違点はなかった。また、閉経後の女性の血清中エストロゲン濃度に関しても、亜麻摂取グループと対照グループのあいだに大きな相違点はなかった（ブレジンスキーら、１９９７年）。亜麻仁粉の追加によって血清中のＳＨＢＧ（エストラジオールを強力に結合するタンパク質）の濃度が増加した。これは、肝臓組織で見られる典型的なエストロゲン様効果である。一方、ＳＨＢＧの濃度の増加により、内因性エストロゲンのバイオアべイラビリティは低下する。健康な青年の場合、短期間（６週間）の食事への亜麻仁の添加（マフィンに１日１０ｇ）は、テストステロンの血漿中濃度に目立った影響を示さず、男性におけるエストロゲン作用（estrogenicity）の欠如を示している（シュルツら、１９９１年）。同時にこれらの研究は、リグナンは弱いホルモン（エストロゲン様および抗エストロゲン様）効果を有するが、リグナンの作用機構はそのホルモン効果によってすべて説明され得るわけではない、ということを示す。
【００１１】
結論として、以前は動物実験や臨床実験で使用するのに充分な量の単離哺乳類リグナンを入手することはできず、リグナン摂取量を増加させる唯一の可能性は、繊維質の多い亜麻仁などの食品の消費を増加させることであった。効率よくエンテロラクトンに変換し、大量に生成され単離されうるＨＭＲなどのリグナンは、ガン、他のホルモン性疾患および心疾患を化学的に予防するための医薬品および機能性食品などの食品の開発において貴重なものである。
【発明の概要】
【００１２】
ある側面において、本発明は有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体をヒトに投与することからなる、ヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防方法に関する。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体をヒトに投与することからなる、ヒトの血清中のエンテロラクトンまたはヒドロキシマタイレシノールのほかの代謝産物の濃度を増加させる方法であって、それによってヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患の予防をもたらす方法に関する。
【００１４】
第３の側面において、本発明は、有効量のヒドロキシマタイレシノールまたは幾何異性体もしくは立体異性体と、薬学的に許容しうる担体とからなる医薬品に関する。
【００１５】
第４の側面において、本発明は、ヒドロキシマタイレシノールまたはその幾何異性体もしくは立体異性体を濃縮した液体または固体材料からなる、食品添加物用製品に関する。
【００１６】
第５の側面において、本発明は、有効量のヒドロキシマタイレシノールまたはその幾何異性体もしくは立体異性体からなる食品に関する。
【００１７】
もう１つの側面において、本発明は、前記有効量のヒドロキシマタイレシノール、その幾何異性体または立体異性体を食品に添加することからなる食品の安定性を高める方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はＪＥＧ−３細胞におけるリグナンによるアロマターゼの濃度相関阻害を示す。
【図２】図２はＨＭＲの存在下および非存在下におけるＭＣＦ−７細胞の増殖を示す。
【図３】図３はＨＭＲまたはアロマターゼ阻害剤で処理した未成熟ラットの子宮の湿重量を示す。
【図４】図４はメスのラットにおけるＤＭＢＡ誘発性乳腺腫瘍に対するＨＭＲの抗腫瘍活性を示す。
【図５】図５は種々の投与量のＨＭＲで処理したラットの、エンテロラクトンの尿への排出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明はヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）を食品に添加し、また医薬品として用いることによってヒトのガン、ある種の非ガン性ホルモン依存性疾患および／または心疾患を予防する、リグナン、つまりＨＭＲの用途に関する。驚いたことに、ＨＭＲはインビボでエンテロラクトンへ代謝されるが、これがリグナンの抗腫瘍特性の原因の一つであると考えられている。インビトロでのＨＭＲの抗酸化活性は大きく、この特性は、ＨＭＲが、体内において有害な遊離酸素種に対する保護効果を通して心疾患をも防ぐことができるということを示している。また、本発明は食品の安定性を向上する（つまり栄養価の損失や食品の風味の低下につながる、脂質および色素の酸化とビタミンの喪失とを抑制する）ための食品添加物としてのＨＭＲの用途に関する。
【００２０】
本発明の方法は、乳ガン、前立腺ガンおよび結腸ガン、下部尿路症、尿道共同運動障害、膀胱不安定性、膀胱排出口閉塞、良性前立腺過形成および男性の女性化乳房などの非ガン性ホルモン依存性疾患、および血清中の酸化ＬＤＬに起因する心疾患の予防に特に効果的である。
【００２１】
本発明による医薬品は経口処方であることが好ましい。活性化合物（ＨＭＲ）の必要量は、予防すべき特定の症状によって異なるが、標準的な投与量は大人で１日約１０〜１００ｍｇである。
【００２２】
本発明の食品添加物において、ヒドロキシマタイレシノールで強化される材料は、ＨＭＲとの混合に適し、ＨＭＲの特性を損なわない、食用で中毒性のない固体または液体の材料であればどのようなものでもよい。この材料の役割は主に、ＨＭＲの確実な投与を容易にすることである。好ましい濃度は、たとえば強化された材料１００ｇ中にＨＭＲ１００ｍｇ〜１ｇである。
【００２３】
本発明の食品とは、とくに機能性食品、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品、遺伝子操作食品（designer food）または任意の食品である。食品中のＨＭＲの好ましい濃度は、たとえば食品１００ｇに対してＨＭＲ１〜２０ｍｇである。
【００２４】
本発明の機能性食品はたとえば、バター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、アメ、菓子類、ヨーグルトもしくは他の発酵乳製品、またはムースリなどのシリアルの形が可能である。
【００２５】
ヒドロキシマタイレシノールの添加は、栄養価の損失と食品の風味の低下につながる、脂質、ビタミンおよび色素の酸化を抑制することを目的として、食品の安定性を向上する場合にとくに有用である。このためにＨＭＲの好ましい濃度は、たとえば約０．１％である。
【００２６】
本発明で使用するＨＭＲは、圧縮材の大き過ぎるチップ画分（oversize chip fraction）（枝、ねじれ部分および木節を含む）から単離する。ＨＭＲはガンや心疾患などの疾病の予防に用いる。
【００２７】
ＨＭＲの特性を７つの異なる分析方法によって検討した。
１．インビトロにおける抗酸化力の測定
２．ＪＥＧ−３細胞におけるアロマターゼ阻害力の測定
３．ＭＣＦ−７培養細胞におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の測定
４．子宮成長の生物学的検定によるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
５．オスの成体ラットにおけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の測定
６．ラットＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおける抗腫瘍活性の調査
７．種々の量のＨＭＲを投与した後のラットの尿に含まれる代謝産物の分析
【００２８】
以前は、ＨＭＲが樹木のリグナン成分であることから、その特徴はあまり注目されておらず、生物学的試験を行なうのに充分な量のＨＭＲを単離し、精製することは不可能であった。しかし、トウヒ（spruce）の様々な部位におけるＨＭＲの分布が知られ（エクマン、１９７６年および１９７９年）、リグナン、とくにＨＭＲの詳細な研究の機会が得られた。
【００２９】
ＨＭＲの投与量と尿中のエンテロラクトンの量との間に線形相関が見られた。エンテロラクトンは広く知られた哺乳類のリグナンであり、マタイレジノールから腸内細菌によって、またはエンテロジオールの酸化によって形成される（アクセルソンおよびセッチェル、１９８１年；アクセルソンら、１９８２年）。わずかな量の代謝されなかったＨＭＲとほかの代謝産物（エンテロジオールと７−ヒドロキシエンテロラクトン）とが尿中に見られた。それらの量は、毎日のＨＭＲの投与量を増やしても変化しなかった。これらの発見は、ＨＭＲが代謝されエンテロラクトンとなり、さらにジメチル化およびジヒドロキシル化を経てＨＭＲから生じたエンテロラクトンは、エンテロジオールには変換しないということを示唆している。ＨＭＲの構造に基づいて、７−ヒドロキシエンテロラクトンが主なＨＭＲの代謝産物であると考えられたが、それは違っていた。このヒドロキシル基は代謝の際に脱離する。ＨＭＲの代謝は、ＳＤＧの代謝とは異なる。ＳＤＧは代謝によってエンテロジオールになり、その一部は酸化されエンテロラクトンになる（リカードら、１９９６年、ランペら、１９９４年）。ＨＭＲはしたがって、エンテロラクトンの直接の前駆体として、ＳＤＧよりも有利である。
【００３０】
ＨＭＲはラットの子宮または男性において、たとえあるとしても弱いエストロゲン様活性しか示さない。ＨＭＲはＭＣＦ−７細胞において、弱く有意性のないエストロゲン様活性しか示さない。また、ＨＭＲに関して抗エストロゲン活性は見られなかった。それゆえ、図２に示すように、ＨＭＲがラットのＤＭＢＡ誘発性腫瘍モデルにおいて非常に有意な抗腫瘍活性を示したことは驚きである。ＨＭＲの活性はＨＭＲ自身あるいはエンテロラクトンが原因であると考えられる。しかし、ラットにＤＭＢＡ処理ののち、２種類の投与量（３および１５ｍｇ／ｋｇ）でＨＭＲを与えた場合、ＨＭＲの化学的予防作用には投与量との因果関係はなかった。よって、抗腫瘍効果を得るためには、ＨＭＲは必ずしもエンテロラクトンに変換される必要はなく、またこれらのリグナンの投与量はより少量でも最大の化学的予防効果を得るのに充分である。
【００３１】
表２および３に示すように、ＨＭＲは非常に有効な抗酸化剤である。ＨＭＲは、既知の最も強力な、脂質過酸化反応の阻害剤のひとつであり、ＬＤＬの酸化を防ぐ優れた阻害剤である。ＬＤＬの酸化の阻害はヒトにおいて非常に重要であるとされている。なぜなら、酸化ＬＤＬの血清中濃度が、アテローム性動脈硬化症といった心疾患を予測する最良のものの一つとされているからである。ＨＭＲは食品の安定性を向上する（つまり栄養価の損失と食品の風味の低下につながるビタミン、脂質および色素の酸化を抑制する）食品添加物となりうる。なぜなら、ＨＭＲは、食品安定性の向上のために通常用いられる、よく知られた抗酸化剤、すなわちブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などよりもさらに優れたスーパーオキシドアニオンの捕捉剤およびペルオキシラジカルの捕捉剤であるからである。
【００３２】
実験
薬品
リグナンのエストロゲン様作用、抗エストロゲン様作用、芳香族化（aromatization）を阻害する能力そして抗酸化特性を調べるため、様々なリグナンをインビトロで試験した。試験用化合物は以下から入手した。エンテロジオールおよびエンテロラクトンは、イギリス、ロンドンのプランテック社（Plantech）より購入した。２つの７−ＯＨエナンチオマーを有する７−ヒドロキシエンテロラクトンはフィンランド、ヘルシンキ大学応用化学研究室、クリスティナ・ワララ教授（Dr. Kristina Waehaelae）のご好意により提供された。
【００３３】
樹木からのＨＭＲの抽出
エクマン（１９７６年）およびエクマン（１９７９年）に記載の方法によって、ＨＭＲ抽出物をノルウェイ・トウヒ（Picea Abies）より単離した。簡単言うと、凍結乾燥粉末心材をヘキサンでソックスレー抽出し、無極性、親油性の抽出物を除去した。その木材試料をアセトン／水（９：１ ｖ／ｖ）を用いて、同じ装置でさらに抽出し、粗リグナンを得た。ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）およびその異性体を単離し、さらに精製するため、ＸＡＤ樹脂で再度クロマトグラフィーを行なった。
【００３４】
インビトロにおける抗酸化力の測定
リグナンの抗酸化力を４つの異なる方法で評価した。１）脂質過酸化の阻害、２）低比重リポタンパク（ＬＤＬ）酸化の阻害、３）スーパーオキシド アニオンの捕捉および４）ぺルオキシラジカルの捕捉の分析である。
【００３５】
脂質過酸化の阻害は、インビトロでのラット肝臓ミクロソームにおいてtert−ブチルハイドロパーオキサイド誘発脂質過酸化（ｔ−ＢｕＯＯＨ−ＬＰ）を阻害するリグナンの能力により評価した（アホトゥパら、１９９７年）。ｔ−ＢｕＯＯＨ−ＬＰに対する試験は次のように行なった。緩衝液０．８ｍｌ（５０ｍＭ 炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を照度計のキュベットにピペットで注入した。最終濃度が１．５ｍｇ タンパク質／ｍｌ の希釈肝臓ミクロソーム２０μｌを添加し、ついで、ルミノール６ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）および試験用薬品（test chemicals）を加えた。エタノールまたはジメチルスルホキシド（インキュベーション体積の２％）で希釈した少量の被験化合物をインキュベーション混合物に加え、ビヒクル（vehicle）（エタノールまたはジメチルスルホキシド）の場合と脂質過酸化力を比較した。０．９ｍＭのｔ−ＢｕＯＯＨ ０．０５ｍｌを用いて３３℃で反応を開始した。化学発光を１分ごとに約４５分間測定し、曲線下部の面積（積分）を求めた。化学発光の測定は分析専用ソフトを用いてパーソナルコンピュータに接続したバイオ−オービット（Bio-Orbit）１２５１照度計（バイオ−オービット社製、ツルク、フィンランド）を用いて行なった。
【００３６】
ＬＤＬの酸化の阻害は、アホトゥパら（１９９６年）に記載の方法によって評価した。簡単に言うと、緩衝化ヘパリンを用いて沈殿（precipitation）によりＬＤＬを単離した。リン酸緩衝液中で再度懸濁した後、２０ｍＭのＣｕＣｌ2を添加し、混合液を３７℃で３時間インキュベートした。こののちクロロフォルム−メタノールによりＬＤＬ脂質を抽出し、窒素下で乾燥し、シクロヘキサンに再び溶解させ、分光光度法を用い、２３４ｎｍで分析した。吸光度の強度はＬＤＬの酸化を示す。さまざまな化合物のＬＤＬ酸化防止力を調べるため、ＣｕＣｌ2添加前のインキュベーション混合物にそれらの化合物を加えた。分析中に被験化合物の妨げとなりうるものは、インキュベーション期間の前後に２３４ｎｍでの吸収を測定することによって取り除いた。初期濃度（０．１ｍＭ）で抗酸化効果を示した化合物に関し、ＩＣ−５０値（被験化合物によってＬＤＬの酸化が５０％阻害された濃度）を求めた。
【００３７】
スーパーオキシドアニオン捕捉方法は、キサンチン−キサンチンオキシダーゼ系により調製した条件下で生成されるスーパーオキシドアニオン、および生成した反応性酸素種の照度計による検出にもとづいた（アホトゥパら、１９９７年）。被験化合物が化学発光を減少させる能力を評価した。ＩＣ−５０濃度（５０％の化学発光が抑制された濃度）を求めた。
【００３８】
ペルオキシラジカル捕捉の分析は、２，２'−アゾビス（２−アミジノプロパン）ＨＣｌの熱分解によるペルオキシラジカルの発生、および化学発光によるその検出にもとづいた（アホトゥパら、１９９７年）。その結果を化学量論的な因子、つまり被験化合物１モルにつき何モルのペルオキシラジカルが捕捉されうるか、として求めた。
【００３９】
ＪＥＧ−３細胞におけるアロマターゼ阻害力の測定
ＨＭＲおよび構造的に関連するリグナン（エンテロラクトン、エンテロジオールおよび７−ヒドロキシエンテロラクトン）の効果を、ヒト絨毛癌細胞株であるＪＥＧ−３細胞における3Ｈ−アンドロステンジオンからの3Ｈ−１７β−エストラジオールの生成にもとづいて調べた。ＪＥＧ−３絨毛癌細胞は、インビトロでアロマターゼ阻害作用を調査し得る有効なアロマターゼ・モデルである（クレッケルら、１９９１年）。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）１０％含有ＤＭＥＭ中に細胞を保持した。3Ｈ−アンドロスト−４−エン,３,１７−ジオン（０．５ｎＭ）５０μｌ、非標識アンドロステンジオン（０．５ｎＭ）５０μｌ、被験化合物（１０ｍＭ）１００μｌおよび細胞懸濁液８００μｌ（細胞１００万個）をインキュベーション混合物とした。４時間のインキュベーションののち、非標識の担体（アンドロステンジオン、テストステロン、１７β−エストラジオールおよびエストロン）を加えた。ジクロロメタン３．０ｍｌを用いてそれらステロイドを２回抽出した。以前に述べられたように、ＨＰＬＣを用いて放射性標識3Ｈ−１７β−エストラジオールの分離と定量を行なった（マケラら、１９９５年）。カラム系は保護カラム、続いてＣ１８ １５０×３．９ｍｍＩＤ分析カラム（テクノパック１０Ｃ１８ＨＰＬＣテクノロジー；ウェリントンハウス、チェシャー州、イギリス）から構成された。移動相はアセトニトリル／水（３５／６５）であり、流速は１．２ｍｌ／分であった。放射性代謝物質のインライン検出のため、ＨＰＬＣカラムの溶離液を液体蛍光体（liquid scintillant）と連続的に混合し、インライン放射能検出器を用いてモニターした。
【００４０】
ＭＣＦ−７培養細胞におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の測定
ＭＣＦ−７細胞株（ヒト乳ガン細胞）保存培養物（stock cultures）は、５％ＦＣＳ、ペニシリン１００ Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、インシュリン１０μｇ／ｍｌおよび１７β−エストラジオール１ｎＭを加えたフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ培地中、Ｔ−７５細胞培養びん内で培養した。培地は１週間に３回新しいものと交換した。保存培養物をトリプシン処理によって取り出し、フェノールレッドを含まないベルセン溶液（versene solution）１０ｍｌ中に懸濁し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５％デキストラン木炭除去（dextran charcoal stripped）ＦＳＣ（ｄｃＦＳＣ）を加えたＲＰＭＩ培地中に細胞ペレットを慎重に再懸濁し、６穴プレートに５００００細胞個／３．０ｍｌ溶媒／ウェルの割合で播種した。培養２日目に培地を交換し、被験化合物を加えた。リグナン化合物のエストロゲン様効果を調べるため、リグナン化合物をエタノールに希釈し、細胞培養物に加え、最終濃度を１．０Ｍとした。各増殖検定において、１．０ｎＭ１７β−エストラジオールのエタノール溶液をエストロゲン様反応に関する陽性対照として使用した。同量のエタノールを対照ウェルに加えた。また、抗エストロゲン様効果を調べるため、１７β−エストラジオールとリグナンとの両溶液を培養細胞に加えた。被験化合物の存在下において５日〜７日間細胞を培養し、培地は２日おきに交換した。細胞増殖は、コールター計数器を用いて溶出した核を数えることによって定量化した。
【００４１】
未成熟ラットの子宮向性（uterotropic）試験におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
３日であった処理時間を７日に変えた以外は、以前に記述された方法（ジョーダンら、１９７７年）にもとづき、未成熟ラットの子宮向性検定を行ない、ＨＭＲのエストロゲン様活性を評価した。処理時間を延長したのは、被験化合物のエストロゲン性が弱いと予測されるからである。エストラジオールの生合成を防ぐアロマターゼ阻害剤（ＭＰＶ−２２１３ａｄ）による未成熟ラットの処置は、非エストロゲン刺激子宮に対応する実験方法上の対照として使用される。
【００４２】
オスの成体ラットにおけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
正常および低アンドロゲンのノーブル（Noble）系オスラット（６〜９月齢）において、ＨＭＲのエストロゲン（抗アンドロゲン）様および抗エストロゲン様効果をそれぞれ調べた。オス生殖器系の構造および機能の変化を伴う慢性の低アンドロゲン状態を新生児期のエストロゲン化により誘発した（ジエチルスチルベストロール１０．０μｇ／体重ｋｇ（菜種油に溶解）を生後１〜５日間皮下注射）。これらの変化は、ＭＰＶ−２２１３ａｄを一日に１０〜３０ｍｇ／体重ｋｇ投与することによるアロマターゼ阻害剤処理によって部分的に回複することが知られている（シュトレングら、考察は未発表）。
【００４３】
動物に大豆を含まない基礎食（ＳＤＳ、ウィンザム、エセックス州、イギリス）を与えた。水は自由に飲ませた。正常な動物および低アンドロゲンの動物１２匹に、菜種油に溶解して一日量ＨＭＲ５０ｍｇ／体重ｋｇをチューブにより補給した。両方の動物モデルのほかの１２匹に対し、プラセボ処理として菜種油のみをチューブにより補給した。４週間の処置ののち、動物を殺し、精巣および付属する性腺（腹側前立腺、精嚢および凝固腺）の重量を測定した。血清および精巣テストステロン、ならびに下垂体および血清黄体ホルモン（ＬＨ）のレベルを免疫学的検定法によって測定した（ハービストら、１９９３年）。
【００４４】
ラットＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおける抗腫瘍活性の調査
ラットの乳ガンにおけるＨＭＲの抗腫瘍活性を、以前に述べられた方法（カンガスら、１９８６年）により調査した。生後５０日のメスのスプレーグ−ダウレイ（Sprague-Dawley）系ラットにＤＭＢＡ（ジメチルベンツ[a]アントラセン（dimethylbentz[a]anthracene））１２．０ｍｇをチューブにより補給した。約６週間後には明らかな腫瘍が見られ、そののち腫瘍の幅（ｗ）および長さ（ｌ）を１週間に１度測定し、式Ｖ＝（πｗ2ｌ）／１２にしたがって腫瘍の大きさを求めた。また、１週間に１度ラットの体重を測った。実験開始時に各グループの腫瘍の総数が同じになるように、ラットを３グループに分けた。（１）対照グループ８匹、（２）ＨＭＲ３．０ｍｇ／ｋｇ７匹、および（３）ＨＭＲ１５．０ｍｇ／ｋｇ７匹であり、実験終了前に１匹を殺さなければならなかった。
【００４５】
ＤＭＢＡ誘導の９週間後、つまり明白な腫瘍が見られるようになって３週間後のころから、ＨＭＲの経口投与を開始し、７．５週間にわたって毎日投与した。実験終了時、腫瘍を成長パターンにより各群、１．成長腫瘍（ＰＤ＝進行性疾患）；２．非成長、安定腫瘍（ＳＤ＝安定性疾患、腫瘍の大きさに変化なし、または７５％に満たない退化が見られる）；３．退化腫瘍（ＰＲ＝部分的な応答、つまり７５％を超える腫瘍体積の退化が見られる）；４．消失腫瘍（ＣＲ＝完全な応答、明らかな腫瘍は見られない）に分類した。
【００４６】
種々の量のＨＭＲを投与した後のラットの尿に含まれる代謝産物の分析
オスのスプレーグ−ダウレイラット（４月齢）１０匹を用いてＨＭＲの代謝をインビボで調査した。代謝調査のあいだ、ラットを２匹１組、１２時間の明暗周期で収容し、水は自由に飲ませ、大豆抜きの基礎食（ＳＤＳ、ウィンザム、エセックス州、イギリス）を与えた。
【００４７】
１０％エタノール−ＰＥＧ溶液に溶解したＨＭＲを３、１５、２５および５０ｍｇ／体重ｋｇの投与量で１日１回２日間ラットにチューブにより補給した。２回目のチューブによる補給後、０．５６Ｍアスコルビン酸１２０μｌ、および防腐剤として０．１５Ｍナトリウムアジド１２０μｌが入った回収器内の代謝物保持器に２４時間分の尿を集めた。遠心分離した尿の容量を測定し、−２０℃で保管した。前処理として、解凍した尿３．０ｍｌに０．２Ｍ酢酸緩衝液７５０μｌ（ｐＨ４．０±０．１）を加えた。Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ１８カラム（シリカをベースにした樹脂１００ｍｇ／カラム）を尿の抽出に用いた。水３．０ｍｌ、メタノール３．０ｍｌおよび酢酸緩衝液３．０ｍｌを用いてカラムをあらかじめ調整した。尿をカラムに通し、酢酸緩衝液３．０ｍｌで洗浄したのち、メタノール３．０ｍｌを用いてポリフェノール類（polyphenolics）を溶出した。溶出物を窒素下４５℃のウォーターバスで蒸発乾固し、乾燥した残渣を０．２Ｍ酢酸緩衝液３．０ｍｌ中に再溶解した。エスカルゴ（Helix pomatia）酵素混合物３０μｌを加え、溶液を３７℃でインキュベートし、グルクロニドおよび硫酸エステルをともに加水分解した。フラボン原液（ＥｔＯＨ中１００μｇ／ｍｌ）３００μlを加水分解した試料に加え、Ｃ−１８カラムを用いて試料を抽出し、前記のように蒸発乾固し、ＧＣ−ＭＳによる分析まで−２０℃で保管した。
【００４８】
蒸発させた尿試料をピリジンに溶解し、ＢＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ（１０：１）のシリル化試薬を加えシリル化した。シリル化した試料のＧＣ−ＭＳ分析は、ＨＰ６８９０−５９７３ＧＣ−ＭＳ装置を用いて行なった。ＧＣカラムはＨＰ−１架橋メチルポリシロキサンカラム（１５ｍ×直径０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）を使用し、ヘリウムをキャリヤーガスとして流速１ｍｌ／分で用いた。ＧＣ炉の温度は昇温速度８℃／分で６０℃から２９０℃に設定し、ＧＣ注入器はスプリット率１：１５のスプリットモードに設定した。注入器の温度は２５０℃であった。化合物の同定は質量スペクトルに基づいて行なった。定量計算は内標準に相対的な対象化合物の無修正のピーク面積に基づいて行なった。
【００４９】
結果
インビトロでの抗酸化作用の評価
本実験において、ＨＭＲはほかのリグナンまたはフラボノイドより脂質過酸化阻害作用が大きかった（表２）。よく知られた抗酸化剤、たとえば水溶性ビタミンＥ誘導体であるＴＲＯＬＥＸや、ＢＨＡおよびＢＨＴを、脂質過酸化阻害力、ＬＤＬ酸化阻害力およびスーパーオキシドならびにペルオキシラジカル捕捉力においてＨＭＲと比較した（表３）。全体として、ＨＭＲは最も強力な抗酸化剤であり、すべての検定においてＢＨＡやＢＨＴより効果が大きく、脂質過酸化阻害検定以外のすべての実験においてＴＲＯＬＥＸより強力であった。脂質過酸化防止実験では、両化合物はほぼ同じように活性であった。
【００５０】
ＪＥＧ−３細胞におけるアロマターゼ阻害力
ＪＥＧ−３細胞における3Ｈ−アンドロステンジオンからの3Ｈ−１７β−エストラジオールの生成の阻害について、様々なＨＭＲ濃度で実験した。ＨＭＲの阻害力をエンテロラクトン、７−ヒドロキシエンテロラクトンおよびエンテロジオールと比較した。エンテロラクトンは１．０〜１０．０μＭの濃度範囲内で投与量に依存した芳香族化阻害を生じた。さらに、エンテロジオールには阻害作用はなく、阻害作用にはラクトン環が不可欠であることが示された。７−ヒドロキシエンテロラクトンおよびヒドロキシマタイレシノールには阻害効果はなく（図１）、アロマターゼ阻害におけるリグナン分子内の水酸基の数と位置の重要性を示唆している。
【００５１】
ＭＣＦ−７培養細胞におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性
ＭＣＦ−７細胞増殖において、図２に示すようにＨＭＲは非常に弱い、統計的に有意とは言えないエストロゲン様および抗エストロゲン様活性しか有さなかった。
【００５２】
未成熟ラットの子宮向性試験におけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
図３は未成熟ラットの子宮の成長に対するＨＭＲの作用を例示している。ＨＭＲは、未成熟ラットの子宮重量の増加に有意なエストロゲン様効果を示さなかった。ＨＭＲにより、子宮重量が減少することもなく、抗エストロゲン様効果もないことが示された。アロマターゼ阻害剤は、予想通り子宮重量の増加を抑制し、アロマターゼ阻害剤の測定の方法は適切であったことが示された。
【００５３】
オスの成体ラットにおけるエストロゲン様および抗エストロゲン様活性の評価
ＨＭＲ処理の４週間後、対照および低アンドロゲングループでは、付属生殖腺および精巣の重量において有意な変化は見られなかった（表４）。テストステロンやＬＨの濃度にも有意な変化は見られなかった（表５）。これらの結果は、ＨＭＲは男性において完全なエストロゲン作用薬ではない、ということを示している。なぜなら、ＨＭＲは視床下部−脳下垂体−生殖腺−軸に対して典型的なエストロゲン様作用（ＬＨおよびアンドロゲン分泌の抑制）を及ぼさないからである。また、オスのラットにおける新生児期のエストロゲン化により誘発された変化は、ＨＭＲにより元に戻ることはないので、ＨＭＲは抗エストロゲンでもない。
【００５４】
ラットＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおける抗腫瘍活性の調査
進行腫瘍（ＰＤ）と安定腫瘍（ＳＤ）、退化腫瘍（ＰＲ）および消失腫瘍（ＣＲ）の数を表４に示す。ＨＭＲの抗腫瘍効果は統計的に非常に有意であることがわかった。本モデルでは、抗腫瘍作用の明確な投与量依存性はなかった。ＨＭＲの抗酸化特性および腫瘍成長退化特性はともに、インビボでの抗腫瘍活性と結び付いている、という可能性がある。ＨＭＲのインビボでの抗腫瘍活性のメカニズムは依然知られていない。
【００５５】
種々の量のＨＭＲを投与した後のラットの尿に含まれる代謝産物の分析
図５は、ラットにおけるＨＭＲの主な分泌代謝物が、生物学的活性化合物であると考えられる、エンテロラクトンであることを示している。これはＨＭＲの化学構造を考慮すると、ヒドロキシエンテロラクトンが主な代謝物であると考えられるので、驚くべきことである。ＨＭＲのエンテロラクトンへの代謝は、ラットの肝臓よりむしろ腸内細菌叢（bacterial intestinal flora）によって触媒され得る。
【００５６】
結論
ヒドロキシマタイレシノール（ＨＭＲ）は、ＤＭＢＡ誘発性乳ガンモデルにおいて、他の物質に変化せずに、および／またはエンテロラクトンに変化したのちに抗腫瘍活性を有する。それゆえ、ＨＭＲは乳ガン（ＢＣ）、前立腺ガン（ＰＣ）、結腸癌または良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を患う恐れのあるヒトにおいて、有益な効果をもたらす可能性がある。ＨＭＲは代謝によってエンテロラクトンとなり、インビトロにおける芳香族化を阻害する。ＨＭＲはアロマターゼ阻害剤の前駆体として下部尿路症（ＬＵＴＳ）、膀胱不安定性、膀胱排出口閉塞、尿道共同運動障害および女性化乳房の進行を抑制し得る。また、ＨＭＲには強い抗酸化活性があり、それゆえに食品添加物（抗酸化剤）として用いることができる。医薬品や栄養補助食品（dietary supplement）としてのＨＭＲは、ヒトに対する有益な心血管効果を与え得る。新しい画期的な機能性食品、栄養補給食品、健康食品、治療用食品、遺伝子操作食品、あるいは新規な食品を製造するために、ＨＭＲを添加することは実行性のあることである。
【００５７】
本発明の方法は、様々な形の実施態様によって具体的に表され、ここに記載したものはわずか一部であるということは充分理解されるであろう。ほかの実施態様が考えられ、それらが本発明の主旨に沿っていることは当業者に明らかであろう。このように、記載した実施態様は例示的なものであり、限定的なものと解釈されるべきではない。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
【表５】
【００６３】
［参考文献］
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体を濃縮した液体または固体材料からなり、食品添加物として用いられる製品。
【請求項２】
前記食品が機能性食品、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品、遺伝子操作食品または任意の食品からなる群から選択される請求項１記載の製品。
【請求項３】
前記食品がバター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、アメ、菓子類、ヨーグルトもしくは他の発酵乳製品、またはムースリなどのシリアルの形の機能性食品である請求項１記載の製品。
【請求項４】
有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体からなる食品。
【請求項５】
前記食品が機能性食品、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品、遺伝子操作食品または任意の食品からなる群から選択される請求項４記載の食品。
【請求項６】
前記食品がバター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、アメ、菓子類、ヨーグルトもしくは他の発酵乳製品、またはムースリなどのシリアルの形の機能性食品である請求項５記載の食品。
【請求項７】
前記有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体を食品に添加することからなる食品の安定性を高める方法。
【請求項８】
食品の栄養価を損ない、味の低下をもたらす脂質、ビタミンおよび色素の酸化を抑えることによって食品の安定性を高めることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１】
ヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体を濃縮した液体または固体材料からなり、食品添加物として用いられる製品。
【請求項２】
前記食品が機能性食品、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品、遺伝子操作食品または任意の食品からなる群から選択される請求項１記載の製品。
【請求項３】
前記食品がバター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、アメ、菓子類、ヨーグルトもしくは他の発酵乳製品、またはムースリなどのシリアルの形の機能性食品である請求項１記載の製品。
【請求項４】
有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体からなる食品。
【請求項５】
前記食品が機能性食品、栄養補助食品、栄養剤、治療用食品、栄養補給食品、健康食品、遺伝子操作食品または任意の食品からなる群から選択される請求項４記載の食品。
【請求項６】
前記食品がバター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、アメ、菓子類、ヨーグルトもしくは他の発酵乳製品、またはムースリなどのシリアルの形の機能性食品である請求項５記載の食品。
【請求項７】
前記有効量のヒドロキシマタイレシノール、またはその幾何異性体もしくは立体異性体を食品に添加することからなる食品の安定性を高める方法。
【請求項８】
食品の栄養価を損ない、味の低下をもたらす脂質、ビタミンおよび色素の酸化を抑えることによって食品の安定性を高めることを特徴とする請求項７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−５２０２４（Ｐ２０１１−５２０２４Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８０７１２（Ｐ２０１０−２８０７１２）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【分割の表示】特願２０００−６０９４５５（Ｐ２０００−６０９４５５）の分割
【原出願日】平成１２年３月９日（２０００．３．９）
【出願人】（３０１０６２１２３）ホルモス ヌトラセウティカル オサケ ユキチュア リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【分割の表示】特願２０００−６０９４５５（Ｐ２０００−６０９４５５）の分割
【原出願日】平成１２年３月９日（２０００．３．９）
【出願人】（３０１０６２１２３）ホルモス ヌトラセウティカル オサケ ユキチュア リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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