キトサンをその酸性溶液から回収するための簡易法
ある塩析塩の混合物を含有する塩析したキトサンポリマーの組成物、並びにその作製方法及び使用方法が開示される。これらの方法で作製されたキトサンポリマー調製品は、実質的にキトサナーゼ、望ましくない塩及び過剰な酸を含まず、且つその生理学的特性並びに生物学的特性及び物理化学特性を保持している。本発明のキトサン調製品は、薬物又は食品サプリメントの形態での生物学的に活性なキトサンの調剤に有用である。これら調製品の多くは、胃のような水性酸性環境に容易に溶解する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年１月６日出願の米国仮出願第６０／５３４，４３６号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、キトサンを酸性水溶液から回収するための簡易法に関する。より詳細には、本発明は、塩の添加によりキトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
キトサンは、キチンの脱アセチル化型であって、Ｎ−アセチル−２−アミノ−β−Ｄ−グルコースの線状ポリマーであり、高含量のアミノ及びヒドロキシル官能基を含有する。このポリカチオン性ポリマーは、通常、甲殻類及び昆虫の外骨格に由来する天然のキチンの限定加水分解によって商業的に調製される。キチンは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース）モノマー単位で構成されるポリマーであるが、市販のキトサンは、さまざまな分子量のキチンの異種混合物であり、さまざまな範囲で脱アセチル化されている。
【０００４】
キトサンは広範な商業用途及び生体医学的応用を有し、それらは分子サイズ及びアセチル化度に関連している。生体医学的応用に関して、キトサンのコレステロール低下効率はそのサイズとアセチル化の割合に反比例して上昇することが報告されている（ＬｅＨｏｕｘら（１９９３）ラットにおけるキトサンの肝機能への効果。Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：１０７８−１０８４；Ｓｕｇａｎｏら（１９９２）部分的に加水分解されたキトサンのラットにおけるコレステロール低下作用。『キチン及びキトサンの進歩』、Ｂｒｉｎｅら（編集者）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ロンドン、ｐｐ．４７２−４７８）。他の研究は、２５〜５０キロダルトン（ｋＤａ）のキトサン分子が、胃潰瘍の治療（Ｉｔｏら（２０００）ラットにおけるキチン・キトサン健康食品の抗潰瘍効果。Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８２：２１８−２２５）、及び腸内免疫機能の活性化によるモデルマウスの腫瘍増殖防止（Ｍａｅｄａら（２００４）肉腫１８０を有するマウスにおけるさまざまな低分子量キトサンの抗腫瘍効果は腸上皮内リンパ球のナチュラルキラー活性の増加による。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １３４：９４５−９５０）に有効であると報告している。２８ｋＤａのキトサン分子は、薬物（医薬品）の制御放出にナノ粒子として使用されている（Ｃｈｅｎら（２００３）水溶液系におけるリノール酸修飾キトサンの自己会合及びナノ粒子形成のための乳化。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３１３５−３１３９）。低分子量キトサン（ＬＭＷＣ）（約２ｋＤａ）は、ｔｕｂｅｒｃｕｌｅｓ、ｓａｌａｄｓ及びタバコ種子を保護するための抗真菌薬として農業に使用されている（Ｂｅａｕｌｉｅｕら（２００３）農業におけるキトサンの利用可能性：生長刺激及び植物疾患の生体制御。第９回国際キチン−キトサン会議、モントリオール、ケベック州、カナダ、８月２７〜３０日）。逆に、４００ｋＤａのキトサンは、マウスにおいてピーナッツアレルゲンに対し脱感作するＤＮＡワクチン接種アプローチの好適なビヒクルであることが示されている（Ｒｏｙら（１９９９）キトサンによる経口遺伝子送達−ＤＮＡナノ粒子はマウスピーナッツアレルギーモデルにおいて免疫学的防御を生ずる。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：３８７−３９１）。これらのわずかな例は、数々のキトサンの利用、及び特定の応用に関するキトサン分子のサイズの重要性を説明している。したがって、キトサンの目標とする応用には、厳密に再現性のある条件下で調製されなければならない、十分特徴付けられた産物が必要であるということになる。
【０００５】
市販のキトサンの分子サイズは、一般に７０ｋＤａから１，０００ｋＤａを越えるものまでさまざまであり、一方、脱アセチル化の割合は、通常約５０〜１００％の範囲である。キトサンを生ずるためのキチンの脱アセチル化の割合及びその脱重合は、水性塩基による化学処理の条件の関数である。長時間の処理は、多分散として知られる特性である、より断片化したキトサン分子をもたらす。多分散のキトサン調製品は、先に議論したように、そのサイズ及び脱アセチル化に関連した特性の観察結果によると、あまり望ましくない。
【０００６】
市販のキトサンポリマーの制御酵素加水分解は、低分散で規定の分子量特性を有する産物を作製するために存在する唯一の再現性のある方法である。出発物質（キトサン）の物理的特徴は、酵素による消化条件に影響するため、重要である（サイズ、アセチル化の割合）。市販のキトサンのサイズは多様であり、この特性は、生体医学、農業、化粧品その他の分野における商業的利用のために規定の分子サイズの脱重合キトサンを産生するのに必要な時間に影響する。
【０００７】
キトサナーゼによるキトサンの酵素消化は、多分散度が低いＬＭＷＣを再現性よく作製するために使用できる唯一の方法である。キトサナーゼは、キトサンに対する特異性が高い酵素である（Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ（１９９６）キトサン加水分解に使用する酵素。米国特許第５，４８２，８４３号）。キトサナーゼによるキトサンの消化は、弱酸性溶液中で行われる。以下のようないくつかの実験条件を制御する必要がある：
キトサンの更なる脱重合や多分散産物の産生を妨げるために、酵素消化を迅速に止める必要がある。
【０００８】
消化産物を迅速に、且つ乾燥が容易な固体の形態で、理想的には粉末状で単離するために簡便な手法を採用する必要がある。この考慮すべき事項は、商業目的のために大量の（例えば数百ｋｇ）のキトサンを処理すべき場合に非常に望ましい。
【０００９】
消化産物は酵素（キトサナーゼ）を含まない必要がある。
加水分解産物は、生体医学の分野における利用を探求している場合は特に、ヒトの利用に適合させた条件下で単離される必要がある。
【００１０】
食品サプリメントとしてキトサンを使用する場合、加水分解産物は、胃のような水性酸性環境で容易に溶解する必要がある。この条件は、酵素消化のために用いられる酸性溶液から、又は他の工程から産物を回収するために使用できる手法の数を制限する。
【００１１】
酸性水溶液からキトサンを単離するために多くの手法が用いられている。最も一般的に用いられる技術は、無機塩基（１例として水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム）の添加によりｐＨを上昇させることによってキトサンの溶解性を低下させることである。この手順はそのような溶液からキトサンを沈殿させるには非常に有効であるが、得られる混合物が非常に粘性であり、慣用の分離技術によって沈殿したキトサンを単離することを困難にするという事実に悩まされている。更に、望ましい産物は過剰な塩基を含まないことが必要である。これは、時間がかかり、かなりのキトサンの（機械的な又は溶解による）損失をもたらすアプローチである、非常に強力な洗浄を費やすことでのみ達成することができる。キトサナーゼによる処理でキトサンを加水分解する場合に考慮すべき他の側面は、キトサナーゼが同時に沈殿し、ｐＨ処理に対する耐性のために依然として活性であり得る可能性及び／又は沈殿から余分な塩基を取り除いた後の処理産物中に混入物質として残留する可能性である。最重要な更なるポイントの１つは、最終産物が、特に生体医学的目的に使用される場合は、夾雑アルカリを含まない必要があるということである。
【００１２】
水溶液からキトサンを沈殿させる多くの場合効率的な方法は、ポリリン酸（Ｓｈｕら（２００２）薬物制御放出のためのイオンにより架橋されたキトサンフィルムの特性に対する多価リン酸構造の影響。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５４：２３５−２４３）又はポリリン酸塩（Ｃｈｉｏｕら（２００３）化学架橋されたキトサンビーズにより水溶液中の色素を吸着させる方法。米国特許出願第２０，０３０，１０１，５２１号）の添加にある。キトサンのリン酸塩は水性媒体に不溶である。しかしながら、この方法の主な欠点は、キトサンのリン酸塩は、胃環境のような生理的酸性環境にほとんど溶解しないということである。
【００１３】
更に、キトサナーゼによる処理でキトサンを調製する場合、キトサナーゼ作用を止めるために熱が用いられていることを指摘することは興味深いことである。この場合、熱変性に対するキトサナーゼの固有の安定性により、反応温度を６０℃以上に上昇させることが必要である。この温度は、十分に記載され且つ公知のメイラード反応に有利に働く（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（編者）（１９９８）食品及び医薬におけるメイラード反応。王立化学会、ケンブリッジ、英国；Ｉｋａｎ（編者）（１９９６）メイラード反応。Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国）。この反応は、キトサンの部分的分解及びキトサン分子の１級アミンの反応から生ずる着色産物の産生をもたらす。これらの同じアミノ基がキトサンの生物特性に重要であるため、この反応は非常に望ましくないものである。２つの付加的ポイントは更に興味深い。第１に、熱変性キトサナーゼは、沈殿し、その後のキトサンの（例えば沈殿による）単離工程に持ち越され得る。第２に、熱変性に対するキトサナーゼの部分的な耐性により、その再生及び活性の部分的な回復を可能にし、キトサンが更に消化される可能性を増大させる。
【００１４】
概して、キトサンを化学又は酵素加水分解産物から沈殿及び単離する現行の方法はしたがって適当ではない。商業的利用、特に生体医学的用途に好適なキトサンを高収率で提供する簡便な手法は、最も興味深いものである。アルカリの添加又はキトサンの不溶塩の形成によりｐＨを上昇させることによって酸性水溶液からキトサンを単離する現行の技術は、これらの要求を満たさない。
【００１５】
したがって、商業的利用、特に、食品及び生体医学産業に関する応用に好適なキトサンを高収率で化学又は酵素加水分解産物から回収するための単純で、信頼性があり、再現性のある方法に関する必要性がある。
【００１６】
混入物質（例えばキトサナーゼ、望ましくない塩）を含まない産物を提供し、ヒトの使用に適合した、水性酸性環境に容易に溶解するキトサンを酸性溶液から回収するための方法に関する必要性もある。
【００１７】
本発明は、これらの必要性及び他の必要性を満たすことを追求する。本明細書は多くの文献を引用しており、文献の内容は本明細書にその全体が援用される。
【００１８】
【非特許文献１】Ｂｅａｕｌｉｅｕ，Ｃ．、Ｌａｃａｓｓｅ，Ｓ．及びＬｅｃｌｅｒｃ，Ｃ．（２００３）農業におけるキトサンの利用可能性：生長刺激及び植物疾患の生体制御。第９回国際キチン−キトサン会議、モントリオール、ケベック州、カナダ、８月２７〜３０日。
【特許文献１】Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｕｓｅ ｉｎ キトサン加水分解に使用する酵素。米国特許第５，４８２，８４３号。
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｇ．、Ｌｅｅ，Ｃ．Ｍ．及びＰａｒｋ，Ｈ．Ｊ．（２００３）水溶液系におけるリノール酸修飾キトサンの自己会合及びナノ粒子形成のための乳化。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３１３５−３１３９。
【非特許文献３】Ｃａｃａｃｅ，Ｍ．Ｇ．、Ｌａｎｄａｕ，Ｅ．Ｍ．及びＲａｍｓｄｅｎ，Ｊ．Ｊ．（１９９７）ホフマイスター系列：界面現象に対する塩及び溶媒の効果。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３０：２４１−２７７。
【特許文献２】Ｃｈｉｏｕ，Ｍ．Ｓ．及びＬｉ，Ｈ．−Ｙ．（２００３）化学架橋されたキトサンビーズにより水溶液中の色素を吸着させる方法。米国特許第２０，０３０，１０１，５２１号。
【非特許文献４】Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｄ．及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｗ．（１９８５）界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２。
【非特許文献５】Ｃｕｒｏｔｔｏ，Ｅ．及びＡｒｏｓ，Ｆ．（１９９３）キトサンの定量及び遊離アミノ基の割合。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１１：２４０−２４１。
【非特許文献６】Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｆ．（１８８８）Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．ＩＩ．Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ（Ｌｅｉｐｚｉｇ）２４：２４７−２６０。
【非特許文献７】Ｈｕｇｅｒｔｈ，Ａ．、Ｃａｒａｍ−Ｌｅｌｈａｍ，Ｎ．及びＳｕｎｄｅｌｏｆ，Ｌ．Ｏ．カラギーナンとキトサンとの高分子電解質複合体形成に対する電荷密度と立体構造の効果。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３４：１４９−１５６。
【非特許文献８】Ｉｋａｎ，Ｒ．（編者）（１９９６）メイラード反応。Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国。
【非特許文献９】Ｉｔｏ，Ｍ．、Ｂａｎ，Ａ．及びＩｓｈｉｈａｒａ，Ｍ．（２０００）ラットにおけるキチン・キトサン健康食品の抗潰瘍効果。Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８２：２１８−２２５。
【非特許文献１０】Ｋｕｎｚ，Ｗ．、Ｈｅｎｌｅ，Ｊ．及びＮｉｎｈａｍ，Ｂ．Ｗ．（２００４）‘Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．’（塩の効果の科学について）：フランツ・ホフマイスターの歴史的論文。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９−３７。
【非特許文献１１】ＬｅＨｏｕｘ，Ｊ．Ｇ．及びＧｒｏｎｄｉｎ，Ｆ．（１９９３）ラットにおけるキトサンの肝機能への効果。Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：１０７８−１０８４。
【非特許文献１２】Ｍａｅｄａ，Ｙ．及びＫｉｍｕｒａ，Ｙ．（２００４）肉腫１８０を有するマウスにおけるさまざまな低分子量キトサンの抗腫瘍効果は腸上皮内リンパ球のナチュラルキラー活性の増加による。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １３４：９４５−９５０。
【非特許文献１３】Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．（１９９８）キトサンの比色定量。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６０：２５５−２５７。
【非特許文献１４】Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．Ａ．、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｅ．及びＢｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．（１９８９）ピクリン酸によるキチン−キトサンのＮ−アセチル化度の測定。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：３６３−３６７。
【非特許文献１５】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．、Ｎｕｒｓｔｅｎ，Ｈ．Ｅ．、Ｃｒａｂｂｅ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．及びＡｍｅｓ，Ｊ．Ｍ．（編者）（１９９８）食品及び医薬におけるメイラード反応。王立化学会、ケンブリッジ、英国。
【非特許文献１６】Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇ．Ａ．Ｆ．（１９９２）キチンの化学、ＭａｃＭｉｌｌａｎ出版社、Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ、ハンプシャー、英国、第２８１頁。
【非特許文献１７】Ｒｏｙ，Ｋ．、Ｍａｏ，Ｈ．Ｑ．、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｋ．及びＬｅｏｎｇ，Ｋ．Ｗ．（１９９９）キトサンによる経口遺伝子送達−ＤＮＡナノ粒子はマウスピーナッツアレルギーモデルにおいて免疫学的防御を生ずる。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：３８７−３９１。
【非特許文献１８】Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．及びＺｈｕ，Ｋ．Ｊ．（２００２）薬物制御放出のためのイオンにより架橋されたキトサンフィルムの特性に対する多価リン酸構造の影響。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５４：２３５−２４３。
【非特許文献１９】Ｓｏｒｌｉｅｒ，Ｐ．、Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｄｅｎｕｚｉｅｒｅ，Ａ．、Ｖｉｔｏｎ，Ｃ．及びＤｏｍａｒｄ，Ａ．（２００３）抗キトサン抗体の調製及び開発。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７Ａ：７６６−７７４。
【非特許文献２０】Ｓｕｇａｎｏ，Ｍ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．、Ｅｎｏｍａｔｏ，Ｋ．及びＨｉｒａｎｏ，Ｓ．（１９９２）部分的に加水分解されたキトサンのラットにおけるコレステロール低下作用。『キチン及びキトサンの進歩』（Ｃ．Ｊ．Ｂｒｉｎｅ、Ｐ．Ａ．Ｓａｎｆｏｒｄ及びＪ．Ｐ．Ｚｉｋａｋｉｓ、編者）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ロンドン、英国 ４７２−４７８。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
したがって、広義では、本発明は、キトサン調製品及びその製造方法に関する。
１つの態様では、本発明は、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。１つの態様では、本発明は、食品適合性及び生体医学適合性の無機塩又は有機塩のような塩析塩の添加（例えばコスモトロピック塩、その混合物、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）によって、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。
【００２０】
１つの態様では、本発明は、無機酸の塩のような塩析物質の添加によりキトサンを酸性溶液から回収するための方法に関する。更なる態様では、本発明は、ヒトの摂取に好適な有機酸の塩の添加によりキトサンを酸性溶液から回収するための方法に関する。塩析塩（及びその組み合わせ）、又はコスモトロピック塩（及びその組み合わせ）、又はコスモトロピック塩とカオトロピック塩との組み合わせの添加は、水分子と添加した塩との再組織化による塩析効果を生じ、溶解したキトサン分子の脱水及び溶液からの沈殿をもたらす。
【００２１】
１つの態様では、塩析反応は非変性条件下で行われる。本発明にしたがい使用され得るｐＨ値の非限定的な例は、約３〜約７（例えば３、３．５、４、４．５、５、４．５、６、６．５、及び７）である。本発明の方法を実施可能な温度の非限定的な例には、約４℃〜約５５℃の温度（例えば４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、２８、３０、３２、３５、３８、４０、４２、４５、４８、５０、５２、５５℃）が含まれる。より高い温度（例えば６０、６５、６８℃など）又はより低い温度（３又は２℃）も本発明にしたがい使用することができる。簡潔にするために、単位（例えばｐＨ３．２、３．４、５．７、６．８など、及び温度５、７、９、２１、２２℃など）を明確に記載していないが、それでもなお本発明の範囲内であるとみなされる。
【００２２】
更に、本発明は、キトサンを酸性溶液から回収するための方法に関するものであり、その回収されたキトサンは天然キトサンのイオン電荷や分子サイズのような物理特性を保持している。本発明の方法によって分子量およそ７〜分子量およそ数百ｋＤａ以上（例えば３００センチポアズ）のキトサンポリマーを沈殿させることができる。本発明に記載の方法は、アセチル化度およそ０％〜アセチル化度およそ少なくとも５０％のキトサンポリマーに更に適用される。
【００２３】
更に、本発明は、非粘性で繊維状の外観を有する沈殿したキトサン調製品の産生を可能にする、キトサンを酸性溶液から塩析させる方法に関する。したがって、そのようなキトサン調製品は、限外ろ過、遠心、又は液相から固相を回収する他の公知で通常の方法などの単純な慣用技術を用いて、酸性溶液から容易に回収することができる。
【００２４】
他の態様では、本発明は、キトサナーゼに対してキトサンを選択的に塩析可能な、酵素加水分解物からの精製に好適な酸性溶液からキトサンを回収するための方法に関する。この選択的塩析は、キトサンの更なる加水分解を妨げ、したがって、その多分散性を低下させ、実質的にキトサナーゼを含まないキトサン調製品を生ずる。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、無視できる量のキトサナーゼを含有するキトサン調製品に関するものである。本発明は、キトサンを酸性溶液から回収する方法を提供する；その回収されたキトサン調製品は塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、及びカオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物）、及び他の可溶性物質を容易に取り除くことができる。１つの態様では、本発明のキトサン調製品は、少なくとも９０％（例えば９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）の回収レベルを達成する。他の態様では、本発明のキトサン調製品は、少なくとも９５％（例えば９５、９６、９７、９８、９９、１００％）の回収レベルを達成する。更なる態様では、本発明のキトサン調製品は少なくとも９８％の回収レベルを達成する。
【００２６】
更に、本発明は、酸性溶液からキトサンを精製する方法及びそれから得たキトサンの調製品に関する。そのような精製キトサン調製品はヒト又は動物の食用に好適であり、したがって、生体医学的応用の基準又は食品添加物としての基準を満たす。
【００２７】
１つの態様では、本発明は、さまざまな分子サイズのキトサンの精製方法に関するものである。本発明の方法で得たキトサンは容易に乾燥することができ、その結果として得られる粉末は、胃の酸含有量に類似する塩酸溶液のような低濃度の有機酸及び好ましくは無機酸に容易に溶解する。この特性は、キトサン調製品を食品添加物として用いる場合に非常に好適である。１つの態様では、本発明は、希塩酸溶液に容易に溶解する選択した分子サイズのキトサン調製品にも関する。１つの態様では、この希塩酸溶液は胃の酸含有量を模倣している。
【００２８】
他の態様では、本発明は、実質的に又は完全にキトサナーゼを含まない、ヒトの食用に好適な、胃内のような水性酸性環境に可溶性であり、実質的に沈殿塩（例えば塩析塩）を含まない、キトサン調製品に関する。
【００２９】
本発明の他の利点及び特徴は、例示の目的でのみ提示した以下の具体的態様の非限定的説明を読むことによって更に明らかになるであろう。
特に定義されていない限り、本明細書において使用する科学用語及び技術用語並びに命名は、本発明が属する分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同様の意味を有する。
【００３０】
定義
「１つの」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語とともに用いる場合、「１」を意味し得るが、「１以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１又はそれより多い」の意味とも一致する。
【００３１】
本願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために採用する装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。一般に、「約」という用語は、１０％までの起こり得る変動を設定することを意味する。したがって、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０％の変動は約という用語の中に含まれる。
【００３２】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（comprising）」（及び含むの他の形態）、「有する（having）」（及び有するの他の形態）、「含める（including）」（及び含めるの他の形態）又は「含有する（containing）」（及び含有するの他の形態）という語は、包括的であり、又は制限がなく、引用されていない追加の要素又は方法工程を排除するものではない。
【００３３】
本明細書において、「精製した」とは、それがもともと存在した組成物の成分から分離された分子（例えばキトサン）を意味する。したがって、例えば、キトサンは自然に見られないレベルまで精製されている。「実質的に純粋な」分子とは、大部分の他の成分（例えば混入物質が３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％含まれない）が欠失している分子である。反対に、「粗製」という用語は、それが存在したもともとの組成物の成分から分離されていない分子を意味する（例えばキトサナーゼを含む酸性溶液）。したがって、「分離」又は「精製」という用語は、サンプルの１以上の成分がサンプルの１以上の他の成分から除去される方法を意味する。サンプル成分には、昆虫又は動物（甲殻類などを含む）の外骨格からの抽出物及び市販のキトサン調製品が含まれる。抽出物は、天然供給源にもともと見られる成分の全て又は一部を含んでいてよい。したがって、抽出物は、キトサンの他に、タンパク質（例えばキトサナーゼ）、炭水化物、脂質又は核酸のような他の成分を含んでいてよい。１つの態様では、分離又は精製工程は、サンプル中に存在する他の成分の少なくとも約５０％（例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）を所望の成分から除去する。他の態様では、精製工程は、サンプル中に存在する他の成分の、少なくとも約８０％（例えば８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）、更なる態様では、少なくとも約９５％（例えば９５、９６、９７、９８、９９、１００％）を所望の成分から除去する。簡潔にするため、単位（例えば６６、６７．．．８１、８２．．．９１、９２％．．．．）を体系的に列挙していないが、それでも、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００３４】
「酸性環境」、「酸性条件」又は「酸性ｐＨレベル」は、約７より低い全てのｐＨレベルをカバーすることを意図する。しかしながら、本発明の目的のため、水性酸性環境からキトサンを塩析させるための酸性溶液を意味する場合は、約２〜約６のｐＨレベルが好ましいｐＨレベルである。本発明にしたがい使用し得る弱有機酸の非限定的な例には、リンゴ酸及び乳酸が含まれる。使用し得る酸の他の例には、酢酸及び塩素酸（ＨＣｌ）が含まれる。酢酸、乳酸及びリンゴ酸の場合、好ましい濃度は、量を基準として約５〜１０％である。ＨＣｌの場合、好ましい濃度は約０．２Ｎである。当然、本発明にしたがい、他の濃度の酸を使用することもできる。
【００３５】
２つの化学物質が反応する場合又は条件が変化した場合（例えば塩の添加、温度変化、溶液の周囲圧又はｐＨによって）、溶液中で沈殿が起こり、溶液に不溶で、雨又は雪のように溶液と不和状態になる産物を形成する。「沈殿物」は、化学反応又は条件変化（例えば塩析反応）の結果として溶液から分離する固体物質である。沈殿物は多かれ少なかれ微粒子から成り、それが混合物に与える混濁した、乳白色の、ゲル状の、又は粒状の外観によって同定され得る。固体は容器の底に沈むこともあるであろう。
【００３６】
広義では、溶解性という用語は、１つの物質が他の物質に溶解する能力又は傾向として定義される。化合物の溶解性は全体的又は部分的であり、それが取り込まれる溶媒の物理化学特性（例えば温度、圧力、ｐＨ、など）に依存してさまざまであり得る。モル溶解度は、溶解する溶質の最大量として、溶液１リットルあたりのモル数で定義される。物質の「溶解性」は、具体的条件下で特定した量の溶媒に溶解する最大量（グラム又はモルで表される）として表すこともできる。
【００３７】
曇り点：本発明の目的では、曇り点は、具体的条件下で（ｐＨ、温度、キトサンの分子量、脱アセチル化度、周囲圧及び塩析に用いた具体的な塩）、キトサンが沈殿し始める塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、コスモトロピック塩とカオトロピック塩との混合物、有機酸又は無機酸の塩など）の濃度である。曇り点は、（溶液がもはや均一でない場合、即ち濁ったか混濁した場合）単純な目視検査によって測定することができる。曇り点は、所定条件下（例えば、所定の温度及びｐＨで所定分子量及びある脱アセチル化度のキトサン）、所定濃度の塩によって沈殿したキトサン量を測定することによる、当該技術分野に周知の、より正確な分析法によって測定することもできる。本発明にしたがい使用し得る分析法には、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって開発されたＣｉｂｒａｃｏｎブリリアントレッド３Ｂ−Ａ色素を用いる方法（１９９８）（キトサンの比色定量。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６０：２５５−２５７）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒらによって公開されたピクリン酸法（１９８９）（ピクリン酸によるキチン−キトサンのＮ−アセチル化度の測定。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８９、３６３−３６９）、信頼性の低い（Ｈｕｇｅｒｔｈら（１９９７）カラギーナンとキトサンとの高分子電解質複合体形成に対する電荷密度と立体構造の効果。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３４ １４９−１５６）Ｃｕｒｏｔｔｏ及びＡｒｏｓにより記載されたニンヒドリン法（１９９３）（キトサンの定量及び遊離アミノ基の割合。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１１：２４０−２４１）、又はそれらから派生した方法のような比色法が含まれる。本発明にしたがい、例えばキトサンに特異的な抗体の使用に基づいた、当該技術分野に周知の他の方法を用いることもできる（例えば免疫沈降法又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））。使用可能なキトサン抗体の非限定的な例は、Ｓｏｒｌｉｅｒら（２００３）（抗キトサン抗体の調製及び開発。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７Ａ：７６６−７７４）に提供されている。
【００３８】
カオトロピックという用語はカオス形成性を意味し、生化学では、通常、水中の整然とした水素結合構造を崩壊させる化合物の能力を意味する。この水素結合は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び多糖（例えばキトサン）のような生体高分子の２次構造、及び水性媒体でのそれらの溶解性に大いに影響を及ぼす。カオトロピック塩は、水素結合及び疎水性相互作用を破壊することによって構造を減少させる（カオスを増加させる）。カオトロピック塩（不安定化物質）の非限定的な例には、ＮａＣｌＯ４、ＮａＳＣＮ、ＮａＮＯ３及びＮａＢｒが含まれる。反対に、コスモトロピック塩（安定剤）は水分子と強力な相互作用を発揮する。したがって、水分子は、溶質周辺の正常な組織化が減少して溶質が固相で結合できる（即ち沈殿する）程度までコスモトロピック塩イオンの周辺で組織化する。コスモトロピック塩（安定剤）の非限定的な例には、Ｎａ２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム及びＮａＨ２ＰＯ４が含まれる。
【００３９】
「塩析」。「塩析」効果は、溶質に代わってイオン周辺で水分子の組織化が増加することによって、溶質の溶解性を低下させる。主として、添加した塩イオンと他の溶解した溶質とのあいだの分子回収のための競合の結果である。高塩濃度では、非常に多くの添加イオンが溶媒和するため、利用可能なバルク溶媒の量が、他の溶質（例えばキトサン）を溶解するには不十分になる。したがって、溶質−溶質相互作用は、溶質−溶媒相互作用よりも強力になる。この塩析効果は、溶質の脱水及び溶液からの沈殿をもたらす（Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ（１９８５）界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２；Ｃａｃａｃｅら（１９９７）ホフマイスター系列：界面現象に対する塩及び溶媒の効果。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３０：２４１−２７７；Ｋｕｎｚら（２００４）‘Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ’（塩の効果の科学について）：フランツ・ホフマイスターの歴史的論文。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９−３７）。このように、中性塩の濃度が高レベルである場合（例えば＞０．１Ｍ）、多くの場合、タンパク質は沈殿する。溶媒和の低下と反発力の中和はタンパク質を凝集及び沈殿させる。
【００４０】
塩析塩。本発明の塩析塩は、一般に、キトサンに代わってその周囲で水分子の組織化を増加させることにより、キトサンの溶解性を低下させる能力によって特徴付けられる（塩析効果）。したがって、本明細書において、「塩析塩」という用語は、キトサンの脱水及び水溶液からの沈殿を引き起こすあらゆる塩を含めることを意味する（例えば、コスモトロピック塩、その混合物、無機塩又は有機塩、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）。
【００４１】
本明細書において、「塩」という用語は、無機及び／又は有機の酸及び塩基とともに形成された酸性及び／又は塩基性の塩であると理解される。双性イオン（内塩）は、アルキルアンモニウム塩のような四級アンモニウム塩のように、本明細書における「塩」という用語の中に含まれると理解される。他の塩も例えば単離又は精製工程に有用であり得るが、非毒性の医薬的に許容可能な塩が好ましい。
【００４２】
酸付加塩の例としては、限定されるものではないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。
【００４３】
塩基性塩の例としては、限定されるものではないが、アンモニウム塩；ナトリウム塩、リチウム塩、及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アミン（例えば、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミン及びｔ−アミルアミンのようなアルキルアミン、置換アルキルアミン、ベンジルアミンのようなアリール−アルキルアミン、ジアルキルアミン、Ｎ−メチル グルカミン（特にＮ−メチル Ｄ−グルカミン）のような置換ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、並びに置換トリアルキルアミン）のような有機塩基を含む塩が挙げられる。
【００４４】
本明細書において、「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、塩素、臭素、フッ素及びヨウ素として理解される。
本発明を以下の特定の実施例によって更に具体的に説明する。実施例は説明のためにのみ提供するものであり、如何なる場合も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４５】
本発明を一般的に説明する上で、具体的態様を説明するためにのみ示す添付の図面が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
具体的態様の説明
本明細書において、酸性水溶液に溶解したキトサンの高収率で迅速な回収を可能にする簡便で再現性のよいプロトコールが記載される。このプロトコールは、塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）の添加により、キトサンポリマーの水和した殻が再組織化される原理に基づいている。塩析塩の非限定的な例には、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、マロン酸、酢酸、乳酸、コハク酸、プロピオン酸又はリン酸のナトリウム塩又はカリウム塩が含まれる。硫酸のアンモニウム塩、カリウム塩又はナトリウム塩、及び硝酸のナトリウム塩又はカリウム塩も本発明にしたがい有効に使用することができる。
【００４７】
本プロトコールは、高ｐＨ又は凝固物の処理を利用するこれまで使用された酸性溶液からのキトサンの回収法とは異なっている。本発明の方法は：ａ）非腐食性試薬の使用による操作の安全性；ｂ）キトサンの高回収率；及びｃ）残存するイオン電荷及び分子サイズなどのキトサンポリマーの物理特性の修飾の欠如、などの多くの利点を提供する。このプロトコールは広範な分子サイズのキトサンに適用可能である。更に、１つの態様では、本発明のキトサン調製品は、実質的にキトサナーゼを含まないという事実により安定性が増加した利点を有する。
【００４８】
キトサンは、甲殻類及び昆虫の外骨格のような天然キチンの限定塩基性加水分解により、通常商業的に調製されるポリカチオン性ポリマーである。キチンは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース）モノマー単位で構成されるポリマーであるが、市販のキトサンは、通常、さまざまな程度に脱アセチル化された、キチンの分子サイズの不均一な混合物で構成される。キチン及びキトサンの基本概略構造を以下に示す。
【００４９】
【化１】
【００５０】
したがって、本発明は、概して、先行技術の調製品及び方法の欠陥を克服するキトサン及びその製造方法を提供する。
１つの態様では、本発明は、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。より詳細には、本発明の目的は、塩（塩析塩、例えばコスモトロピック塩、その混合物、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）の添加により、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法を提供することである。１つの具体的態様では、食品適合性の無機塩又は有機塩を用いてキトサンを酸性水溶液から沈殿させる。
【００５１】
キトサンは高分子電解質の性質を有する。したがって、水性媒体でのその溶解性は、水性媒体でのタンパク質の溶解性に適用される経験則に類似した法則に従うはずである。これらの要因には、溶解媒体のｐＨ、温度及びイオン強度が含まれる。本明細書に記載の革新的プロトコールは、選択されたホフマイスター系列（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ（１８８８）、Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．ＩＩ．Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ（Ｌｅｉｐｚｉｇ）２４：２４７−２６０；Ｋｕｎｚら（２００４）Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．ＩＩ．（塩の効果の科学について）：フランツ・ホフマイスターの歴史的論文、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９−３７；Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ（１９８５）界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２；Ｃａｃａｃｅら（１９９７）ホフマイスター系列：界面現象に対する塩及び溶媒の効果。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３０：２４１−２７７）の電解質、又は食品適合性有機塩の添加によって引き起こされる塩析効果に対するキトサンの感受性に基づいている。塩析効果は、溶質に代わってイオン周辺で水分子の組織化を増加させることによって溶質の溶解性を減少させる。この塩析効果は、溶質の脱水及び溶液からの沈殿をもたらす（Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ（１９８５）、界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２）。
【式１】
【００５２】
【００５３】
本発明の方法は、ホフマイスター系列の塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、コスモトロピック塩とカオトロピック塩との混合物など）を、キトサンの酸性水溶液へ添加することを含む。１つの具体的態様では、食品適合性塩又は食品適合性電解質をキトサンの酸性水溶液へ添加してキトサンを沈殿させる。本発明にしたがい使用し得る塩析塩の非限定的な例には以下が含まれる：
・硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム
・リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム
・クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム
・酒石酸ナトリウム
・リンゴ酸ナトリウム
・硝酸ナトリウム
・乳酸ナトリウム
・マロン酸ナトリウム
・コハク酸ナトリウム
・酢酸ナトリウム
・プロピオン酸ナトリウム
キトサンが溶解され、塩析塩が添加される希酸水溶液の非限定的な例には、酢酸、乳酸、リンゴ酸又は塩酸が含まれる。当然、本発明にしたがい、他の希酸性水溶液を使用することもできるであろう。キトサンを沈殿させるのに要する塩析塩又は有機塩の有効量は、温度、酸性水溶液中のキトサン濃度、用いた具体的な塩、周囲圧、具体的なキトサンの分子量、及びポリマーの脱アセチル化度を含めた多くの因子に依存する。本発明は、わずか１種類の塩（例えば有機又は無機の食品適合性塩）の添加に限定されるものではない。２種類以上の塩析塩の組み合わせ（例えば３、４、５、６種類など）も本発明にしたがい用いることができる。更に、異なる塩の組み合わせは、コスモトロピック塩の組み合わせに限定されるものではない。包括的効果が酸性水溶液からのキトサンの塩析である限り、本発明にしたがい、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物を用いることができる。
【００５４】
塩析したキトサンは、洗浄液の導電率を測定することによって例えば工業規模で容易にモニターできる塩析沈殿塩が取り除かれている。キトサンは、ろ過、遠心、蒸発、噴霧乾燥又はそれらの組み合わせを含めた当該技術分野に公知の手段によって酸水溶液から容易に回収することができる。
【００５５】
１つの態様では、塩水溶液中、具体的な温度で長時間（例えば１週間）、キトサンポリマーを撹拌又はかき混ぜたとき、特定のキトサンが溶解して透明な均一溶液を形成していない場合、特定のキトサンポリマーは具体的酸性水溶液から塩析されたとみなされる。
【００５６】
以上より、具体的酸性塩水溶液中の特定のキトサンポリマーの溶解性は温度依存性であり得るため、キトサンはより低温の水溶液では塩析され得るが、より高温では可溶性であり得、又はその逆であることが理解されるはずである。本明細書に記載のいくつかの実施例は、一連の有機塩及び無機塩によるキトサンの塩析に対する温度の効果について説明する。したがって、キトサンを具体的な酸性塩水溶液から回収するために、この特殊性を活用することができる。
【００５７】
具体的濃度の具体的キトサンポリマーを沈殿させる１以上の有効な塩析塩、及びそれらの組み合わせ（例えばヒトの食用に好適な有機塩）を同定するために用いられる通常の実験は、多くの方法で行なうことができる。１つの態様では、必要な塩の有効濃度の同定は、ポリリン酸の添加により、又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉの方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ（１９９８）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６０：２５５−２５７）にしたがって比色アッセイにより、溶液中に沈殿したキトサンの割合を測定することによって実施される。他の態様では、具体的なキトサンを沈殿させるための塩析塩又は有機塩の有効量を決定するために曇り点が測定される。これは単純な目視検査によって行なうことができ、具体的なキトサンの溶解性様式は、所定温度におけるそれぞれの塩の種類及び濃度に相関があり得る。
【００５８】
全て又はわずか一部のキトサンが沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。１つの態様では、少なくとも９０％（９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）のキトサンが沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。他の態様では、少なくとも９５％（９５、９６、９７、９８、９９、１００％）が沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。更に他の態様では、少なくとも９８％（９８、９９、１００％）が沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。
【００５９】
本発明に使用する塩は、如何なる塩析無機塩又は有機塩でもよい。非限定的な例には、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、硝酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、及びリン酸水素塩が含まれる。対イオンは効果が小さく、アンモニア、又はナトリウム、マグネシウム、カルシウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属であり得る。包括的効果が酸性水溶液からのキトサンの塩析（即ち沈殿）である限り、無機塩又は有機塩の混合物、及びカオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物も本発明にしたがい使用することができる。
【００６０】
塩析塩を用いてキトサンを塩析するための一般手順
１つの態様では、キトサンを水溶液から回収するための一般手順は以下を含む。約１〜１０重量％、特に５重量％のキトサンを含有する溶液は、キトサンを希酸水溶液（例えば塩酸（約０．２Ｎ）、酢酸、乳酸、リンゴ酸（約５〜１０％））に溶解することによって調製する。沈殿塩を固体の形態で又は好ましくは濃溶液として、好ましくは少しずつ混合しながら加える。沈殿塩の比は、以下に示すさまざまな実施例、及び沈殿塩と溶解したキトサン量との比の関係を説明する図面にしたがい、重量を基準として調整することができる。更に、当業者は、キトサンの回収手順は、本発明の態様内で提示する実施例で説明するように、さまざまな温度で達成することができるという事実を理解するであろう（しかし限定されるものではない）。得られた塩析したキトサンの懸濁液を３０分間攪拌するか、又は回収すべきキトサン量に応じて長時間（例えば１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間など）撹拌する。沈殿物を回収し、洗浄し、そして乾燥する。当業者は、回収すべきキトサン量に最適なように上記方法のいずれか１つを選択するであろう。
【実施例１】
【００６１】
Ｎａ２ＳＯ４で塩析するキトサン（７０ｋＤａ、８４％脱アセチル化）
Ｆｌｕｋａ（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、ＵＳＡ）より入手した７０ｋＤａのキトサン２０ｇを５％酢酸（５００ｍｌ）に溶解する。７５ｇのＮａ２ＳＯ４（終濃度０．４７Ｍ）を攪拌しながら少しずつ加える。塩析したキトサンを４℃で約３０分間保ち、その後約２０分間遠心する（８０００×ｇ）。水性媒体に不溶性のキトサン塩を形成することが当該技術分野においてすでに知られている例として（Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９２）、キチンの化学、ＭａｃＭｉｌｌａｎ出版社、Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ、ハンプシャー、英国、第２８１頁）ポリリン酸の添加により定性的にアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。あるいは、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって記載された比色アッセイ（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）を用いて溶液に残留するキトサン量を定量的に測定する。このアッセイは、他の公開された技術よりも、水性媒体に溶解したキトサンを定量するための感受性が高く再現性のある方法であると報告されている（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）。塩析したキトサンを水で３〜５回洗浄し、遠心して回収する。
【実施例２】
【００６２】
クエン酸三ナトリウムで塩析するキトサン（７０ｋＤａ、８４％脱アセチル化）
Ｆｌｕｋａ（シグマ−アルドリッチ）より入手した７０ｋＤａのキトサン２０ｇを５％酢酸（５００ｍｌ）に溶解する。８０ｇのクエン酸三ナトリウム（終濃度０．３４Ｍ）を攪拌しながら少しずつ加える。塩析したキトサンを４℃で３０分間保ち、その後２０分間遠心する（８０００×ｇ）。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で３〜５回洗浄し、遠心して回収する。
【実施例３】
【００６３】
硫酸アンモニウムで塩析するキトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）
市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ、Ｒｉｖｉｅｒｅ−ａｕ−Ｒｅｎａｒｄ、Ｇａｓｐｅｓｉｅ、ケベック州、カナダ）の酵素加水分解によって得た、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社、ヒューストン、テキサス州、ＵＳＡ）で測定して分子量３０ｋＤａの９２％脱アセチル化キトサン１部を、５％酢酸水溶液に溶解する。濃硫酸アンモニウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を４℃で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で３〜５回洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例４】
【００６４】
リン酸一ナトリウムで塩析するキトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）
市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定して分子量３０ｋＤａの９２％脱アセチル化キトサン１部を、５％酢酸水溶液に溶解する。濃リン酸一ナトリウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例５】
【００６５】
硫酸ナトリウムで塩析するキトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）
Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ワシントン、ＵＳＡ）から入手した２４０ｋＤａの９２％脱アセチル化キトサン１部を１０％酢酸水溶液に溶解する。濃硫酸ナトリウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例６】
【００６６】
硫酸アンモニウムで塩析する高分子量キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）
Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ワシントン、ＵＳＡ）から入手した高分子量の（３００ｃｐｓ）９２％脱アセチル化キトサン１部を１０％酢酸水溶液に溶解する。濃硫酸アンモニウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例７】
【００６７】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を４℃で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
図１は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサン加水分解産物のサンプルを４℃まで冷却する。クエン酸三ナトリウム水溶液５部を４℃で加え、処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を４℃で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図１は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率も表す。当業者は、加水分解産物の可溶性相にキトサナーゼ活性が残留することに留意することが重要である。
【実施例８】
【００６８】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を室温で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
図２は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサンのサンプルを室温に保つ。次に、クエン酸三ナトリウム水溶液５部を室温で加え、処理すべきキトサン量に応じて溶液を室温で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図２は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率も表す。当業者は、キトサナーゼ活性が可溶性相に残留することに留意することが重要である。
【実施例９】
【００６９】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を４℃で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
図３は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサン加水分解産物のサンプルを４℃まで冷却させる。４℃まで冷却した硫酸アンモニウム水溶液５部を少しずつ加え、処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を４℃で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図３は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率も表す。
【実施例１０】
【００７０】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を室温で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
図４は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサンのサンプルを室温に保つ。硫酸アンモニウム水溶液５部を室温で少しずつ加え、処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図４は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率も表す。
【実施例１１】
【００７１】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、硫酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硫酸ナトリウム又は好ましくは濃硫酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図５に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１２】
【００７２】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
増加する量の固体クエン酸三ナトリウム又は好ましくは濃クエン酸三ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図６に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１３】
【００７３】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
増加する量の固体硫酸アンモニウム又は好ましくは濃硫酸アンモニウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図７に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１４】
【００７４】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、酒石酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体酒石酸二ナトリウム又は好ましくは濃酒石酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図８に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１５】
【００７５】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、リン酸一ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸一ナトリウム又は好ましくは濃リン酸一ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図９に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１６】
【００７６】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、リンゴ酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体リンゴ酸二ナトリウム又は好ましくは濃リンゴ酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１０に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１７】
【００７７】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、硝酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硝酸ナトリウム又は好ましくは濃硝酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１１に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１８】
【００７８】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、リン酸水素二ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸水素二ナトリウム又は好ましくは濃リン酸水素二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１２に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１９】
【００７９】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、コハク酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体コハク酸二ナトリウム又は好ましくは濃コハク酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサンの３つのキトサン溶液１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１３に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２０】
【００８０】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、酢酸ナトリウムの効率
増加する量の固体酢酸ナトリウム又は好ましくは濃酢酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１４に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２１】
【００８１】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）で４℃及び室温で塩析させる、マロン酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体マロン酸二ナトリウム又は好ましくは濃マロン酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１５に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２２】
【００８２】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、乳酸ナトリウムの効率
増加する量の固体乳酸ナトリウム又は好ましくは濃乳酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１６に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２３】
【００８３】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、プロピオン酸ナトリウムの効率
増加する量のプロピオン酸ナトリウム又は好ましくは濃プロピオン酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１７に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２４】
【００８４】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の比で用いた塩析無機塩及び有機塩の相対効率
キトサンに対し１：１及び４：１の質量比の無機又は有機の塩析塩を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１８に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２５】
【００８５】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
増加する量の固体硫酸アンモニウム又は好ましくは濃硫酸アンモニウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１９に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２６】
【００８６】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硫酸ナトリウム又は好ましくは濃硫酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２０に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２７】
【００８７】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
増加する量の固体クエン酸三ナトリウム又は好ましくは濃クエン酸三ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２１に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２８】
【００８８】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、リン酸一ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸一ナトリウム又は好ましくは濃リン酸一ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２２に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２９】
【００８９】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の比で用いた塩析無機塩及び有機塩の相対効率
溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の質量比の無機又は有機の塩析塩を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２３に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３０】
【００９０】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
増加する量の固体硫酸アンモニウム又は好ましくは濃硫酸アンモニウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２４に示した温度で３０〜６０間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３１】
【００９１】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硫酸ナトリウム又は好ましくは濃硫酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量キトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２５に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３２】
【００９２】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、リン酸一ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸一ナトリウム又は好ましくは濃リン酸一ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量キトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２６に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３３】
【００９３】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
増加する量の固体クエン酸三ナトリウム又は好ましくは濃クエン酸三ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量キトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２７に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３４】
【００９４】
キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の比で用いた塩析無機塩及び有機塩の相対効率
キトサンに対し１：１及び４：１の質量比の無機又は有機の塩析塩を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２８に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３５】
【００９５】
有機又は無機の塩析塩による塩析によって水溶液から回収されたキトサンの溶解性。溶解性は希塩酸水溶液又は希酢酸水溶液中で定性的にアッセイされる。
表１は、本発明の態様内で記載した一連の塩析塩で塩析した（即ち沈殿した）さまざまな分子量のキトサンの溶解性の例について記載する。希酢酸水溶液（５％）及び胃に見出される濃度（０．２Ｎ）と類似の濃度で用いられる塩酸水溶液におけるサンプルの溶解性を定性的に示す。
【００９６】
【表１】
【００９７】
キトサンは、例示したクエン酸三ナトリウムと硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム又はリン酸一ナトリウムのような塩析塩の組み合わせ（例えばコスモトロピック塩、その混合物、コスモトロピック塩とカオトロピック塩との混合物など）の添加により、希酢酸水溶液から回収することもできる。
【００９８】
要約すれば、本明細書の開示に基づき、当業者は、塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、又はカオトロピック塩とコスモトロピック塩との組み合わせ）の添加により、キトサンを酸性水溶液から精製することができる。本発明により精製したキトサンは、残存するイオン電荷や分子サイズなど、少なくともいくつかのキトサンポリマーの物理特性の修飾を妨げる（即ち、天然のキトサンの生理学的特性を保持している）。本明細書に記載の手法は、単純で、経費を削減し、簡便で、広範囲に及ぶものである。最低限の実施しやすい操作で、産物の完全性を維持しながら、酸性水溶液からのキトサンの迅速、効率的及び定量的回収を可能にする。この手法は、処理される必要がある溶解したキトサン量に関して制限なく適用することができ、本発明の方法を、商業生産のための小規模、大規模、又は極大規模の調製に発展させる。更に、本発明によって精製されたキトサン調製品は、食品適合性塩析塩を用いて溶液からキトサンを塩析する場合、ヒト又は動物の食用に好適である。更に、本発明は、１つの塩の添加又はわずか１種類の塩（例えばコスモトロピック塩）の使用に限定されない。包括的効果が酸性水溶液からのキトサンの塩析である限り、塩の混合物（例えばカオトロピック塩とコスモトロピック塩）を使用してもよい。これは、生体医学及び食品産業に関する応用のようなヒト及び動物へのキトサンの投与に関する応用の場合は考慮すべき重要事項である。
【００９９】
ある具体的態様を参照して本発明を記載しているが、当業者は、本発明の精神及び性質を逸脱することなくさまざまな修飾、改変、省略及び置換がなされ得ることを認識するであろう。例えば、特定のキトサンを塩析させるのに要する塩析塩又は有機塩の有効量は、酸性水溶液中のキトサン濃度、温度、用いた無機塩又は有機塩、特定のキトサンの分子量、１％未満から７０％を越えるまでさまざまであり得るそのアセチル化度、溶液のｐＨ及び周囲圧を含めた多くの因子に依存する。したがって、本発明は、開示した具体的態様に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の精神及び範囲内での修飾をカバーすることを意図することが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。実験は４℃で行なった。
【図２】図２は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社、ヒューストン、テキサス州、ＵＳＡ）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。実験は室温で行なった。
【図３】図３は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。実験は４℃で行なった。
【図４】図４は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。実験は室温で行なった。
【図５】図５ａ、５ｂ及び５ｃは、４℃（５ａ）、室温（５ｂ）及び５０℃（５ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸ナトリウムの効率を示す。
【図６】図６ａ、６ｂ及び６ｃは、４℃（６ａ）、室温（６ｂ）及び５０℃（６ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。
【図７】図７ａ、７ｂ及び７ｃは、４℃（７ａ）、室温（７ｂ）及び５０℃（７ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。
【図８】図８ａ、８ｂ及び８ｃは、４℃（８ａ）、室温（８ｂ）及び５０℃（８ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、酒石酸二ナトリウムの効率を示す。
【図９】図９ａ、９ｂ及び９ｃは、４℃（９ａ）、室温（９ｂ）及び５０℃（９ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸一ナトリウムの効率を示す。
【図１０】図１０ａ、１０ｂ及び１０ｃは、４℃（１０ａ）、室温（１０ｂ）及び５０℃（１０ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リンゴ酸二ナトリウムの効率を示す。
【図１１】図１１ａ、１１ｂ及び１１ｃは、４℃（１１ａ）、室温（１１ｂ）及び５０℃（１１ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硝酸ナトリウムの効率である。
【図１２】図１２ａ、１２ｂ及び１２ｃは、４℃（１２ａ）、室温（１２ｂ）及び５０℃（１２ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸水素二ナトリウムの効率を示す。
【図１３】図１３ａ、１３ｂ及び１３ｃは、４℃（１３ａ）、室温（１３ｂ）及び５０℃（１３ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、コハク酸二ナトリウムの効率を示す。
【図１４】図１４ａ、１４ｂ及び１４ｃは、４℃（１４ａ）、室温（１４ｂ）及び５０℃（１４ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、酢酸ナトリウムの効率を示す。
【図１５】図１５ａ及び１５ｂは、４℃（１５ａ）及び室温（１５ｂ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、マロン酸二ナトリウムの効率を示す。
【図１６】図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃは、４℃（１６ａ）、室温（１６ｂ）及び５０℃（１６ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、乳酸ナトリウムの効率を示す。
【図１７】図１７ａ及び１７ｂは、４℃（１７ａ）及び室温（１７ｂ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、プロピオン酸ナトリウムの効率を示す。
【図１８】図１８ａ及び１８ｂは、４℃、室温及び５０℃でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、溶解したキトサンに対して１：１（１８ａ）及び４：１（１８ｂ）の比で用いた無機及び有機の塩析塩の相対的な効率を示す。
【図１９】図１９ａ及び１９ｂは、４℃（１９ａ）及び室温（１９ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。
【図２０】図２０ａ及び２０ｂは、４℃（２０ａ）及び室温（２０ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸ナトリウムの効率を示す。
【図２１】図２１ａ及び２１ｂは、４℃（２１ａ）及び室温（２１ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。
【図２２】図２２ａ及び２２ｂは、４℃（２２ａ）及び室温（２２ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸一ナトリウムの効率を示す。
【図２３】図２３ａ及び２３ｂは、４℃及び室温でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、溶解したキトサンに対して１：１（２３ａ）及び４：１（２３ｂ）の比で用いた無機及び有機の塩析塩の相対的な効率を示す。
【図２４】図２４ａ及び２４ｂは、４℃（２４ａ）及び室温（２４ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。
【図２５】図２５ａ及び２５ｂは、４℃（２５ａ）及び室温（２５ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸ナトリウムの効率を示す。
【図２６】図２６ａ及び２６ｂは、４℃（２６ａ）及び室温（２６ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸一ナトリウムの効率を示す。
【図２７】図２７ａ及び２７ｂは、４℃（２７ａ）及び室温（２７ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。
【図２８】図２８ａ及び２８ｂは、４℃及び室温で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、溶解したキトサンに対して１：１（２８ａ）及び４：１（２８ｂ）の比で用いた無機及び有機の塩析塩の相対的な効率を示す。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年１月６日出願の米国仮出願第６０／５３４，４３６号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、キトサンを酸性水溶液から回収するための簡易法に関する。より詳細には、本発明は、塩の添加によりキトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
キトサンは、キチンの脱アセチル化型であって、Ｎ−アセチル−２−アミノ−β−Ｄ−グルコースの線状ポリマーであり、高含量のアミノ及びヒドロキシル官能基を含有する。このポリカチオン性ポリマーは、通常、甲殻類及び昆虫の外骨格に由来する天然のキチンの限定加水分解によって商業的に調製される。キチンは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース）モノマー単位で構成されるポリマーであるが、市販のキトサンは、さまざまな分子量のキチンの異種混合物であり、さまざまな範囲で脱アセチル化されている。
【０００４】
キトサンは広範な商業用途及び生体医学的応用を有し、それらは分子サイズ及びアセチル化度に関連している。生体医学的応用に関して、キトサンのコレステロール低下効率はそのサイズとアセチル化の割合に反比例して上昇することが報告されている（ＬｅＨｏｕｘら（１９９３）ラットにおけるキトサンの肝機能への効果。Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：１０７８−１０８４；Ｓｕｇａｎｏら（１９９２）部分的に加水分解されたキトサンのラットにおけるコレステロール低下作用。『キチン及びキトサンの進歩』、Ｂｒｉｎｅら（編集者）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ロンドン、ｐｐ．４７２−４７８）。他の研究は、２５〜５０キロダルトン（ｋＤａ）のキトサン分子が、胃潰瘍の治療（Ｉｔｏら（２０００）ラットにおけるキチン・キトサン健康食品の抗潰瘍効果。Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８２：２１８−２２５）、及び腸内免疫機能の活性化によるモデルマウスの腫瘍増殖防止（Ｍａｅｄａら（２００４）肉腫１８０を有するマウスにおけるさまざまな低分子量キトサンの抗腫瘍効果は腸上皮内リンパ球のナチュラルキラー活性の増加による。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １３４：９４５−９５０）に有効であると報告している。２８ｋＤａのキトサン分子は、薬物（医薬品）の制御放出にナノ粒子として使用されている（Ｃｈｅｎら（２００３）水溶液系におけるリノール酸修飾キトサンの自己会合及びナノ粒子形成のための乳化。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３１３５−３１３９）。低分子量キトサン（ＬＭＷＣ）（約２ｋＤａ）は、ｔｕｂｅｒｃｕｌｅｓ、ｓａｌａｄｓ及びタバコ種子を保護するための抗真菌薬として農業に使用されている（Ｂｅａｕｌｉｅｕら（２００３）農業におけるキトサンの利用可能性：生長刺激及び植物疾患の生体制御。第９回国際キチン−キトサン会議、モントリオール、ケベック州、カナダ、８月２７〜３０日）。逆に、４００ｋＤａのキトサンは、マウスにおいてピーナッツアレルゲンに対し脱感作するＤＮＡワクチン接種アプローチの好適なビヒクルであることが示されている（Ｒｏｙら（１９９９）キトサンによる経口遺伝子送達−ＤＮＡナノ粒子はマウスピーナッツアレルギーモデルにおいて免疫学的防御を生ずる。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：３８７−３９１）。これらのわずかな例は、数々のキトサンの利用、及び特定の応用に関するキトサン分子のサイズの重要性を説明している。したがって、キトサンの目標とする応用には、厳密に再現性のある条件下で調製されなければならない、十分特徴付けられた産物が必要であるということになる。
【０００５】
市販のキトサンの分子サイズは、一般に７０ｋＤａから１，０００ｋＤａを越えるものまでさまざまであり、一方、脱アセチル化の割合は、通常約５０〜１００％の範囲である。キトサンを生ずるためのキチンの脱アセチル化の割合及びその脱重合は、水性塩基による化学処理の条件の関数である。長時間の処理は、多分散として知られる特性である、より断片化したキトサン分子をもたらす。多分散のキトサン調製品は、先に議論したように、そのサイズ及び脱アセチル化に関連した特性の観察結果によると、あまり望ましくない。
【０００６】
市販のキトサンポリマーの制御酵素加水分解は、低分散で規定の分子量特性を有する産物を作製するために存在する唯一の再現性のある方法である。出発物質（キトサン）の物理的特徴は、酵素による消化条件に影響するため、重要である（サイズ、アセチル化の割合）。市販のキトサンのサイズは多様であり、この特性は、生体医学、農業、化粧品その他の分野における商業的利用のために規定の分子サイズの脱重合キトサンを産生するのに必要な時間に影響する。
【０００７】
キトサナーゼによるキトサンの酵素消化は、多分散度が低いＬＭＷＣを再現性よく作製するために使用できる唯一の方法である。キトサナーゼは、キトサンに対する特異性が高い酵素である（Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ（１９９６）キトサン加水分解に使用する酵素。米国特許第５，４８２，８４３号）。キトサナーゼによるキトサンの消化は、弱酸性溶液中で行われる。以下のようないくつかの実験条件を制御する必要がある：
キトサンの更なる脱重合や多分散産物の産生を妨げるために、酵素消化を迅速に止める必要がある。
【０００８】
消化産物を迅速に、且つ乾燥が容易な固体の形態で、理想的には粉末状で単離するために簡便な手法を採用する必要がある。この考慮すべき事項は、商業目的のために大量の（例えば数百ｋｇ）のキトサンを処理すべき場合に非常に望ましい。
【０００９】
消化産物は酵素（キトサナーゼ）を含まない必要がある。
加水分解産物は、生体医学の分野における利用を探求している場合は特に、ヒトの利用に適合させた条件下で単離される必要がある。
【００１０】
食品サプリメントとしてキトサンを使用する場合、加水分解産物は、胃のような水性酸性環境で容易に溶解する必要がある。この条件は、酵素消化のために用いられる酸性溶液から、又は他の工程から産物を回収するために使用できる手法の数を制限する。
【００１１】
酸性水溶液からキトサンを単離するために多くの手法が用いられている。最も一般的に用いられる技術は、無機塩基（１例として水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム）の添加によりｐＨを上昇させることによってキトサンの溶解性を低下させることである。この手順はそのような溶液からキトサンを沈殿させるには非常に有効であるが、得られる混合物が非常に粘性であり、慣用の分離技術によって沈殿したキトサンを単離することを困難にするという事実に悩まされている。更に、望ましい産物は過剰な塩基を含まないことが必要である。これは、時間がかかり、かなりのキトサンの（機械的な又は溶解による）損失をもたらすアプローチである、非常に強力な洗浄を費やすことでのみ達成することができる。キトサナーゼによる処理でキトサンを加水分解する場合に考慮すべき他の側面は、キトサナーゼが同時に沈殿し、ｐＨ処理に対する耐性のために依然として活性であり得る可能性及び／又は沈殿から余分な塩基を取り除いた後の処理産物中に混入物質として残留する可能性である。最重要な更なるポイントの１つは、最終産物が、特に生体医学的目的に使用される場合は、夾雑アルカリを含まない必要があるということである。
【００１２】
水溶液からキトサンを沈殿させる多くの場合効率的な方法は、ポリリン酸（Ｓｈｕら（２００２）薬物制御放出のためのイオンにより架橋されたキトサンフィルムの特性に対する多価リン酸構造の影響。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５４：２３５−２４３）又はポリリン酸塩（Ｃｈｉｏｕら（２００３）化学架橋されたキトサンビーズにより水溶液中の色素を吸着させる方法。米国特許出願第２０，０３０，１０１，５２１号）の添加にある。キトサンのリン酸塩は水性媒体に不溶である。しかしながら、この方法の主な欠点は、キトサンのリン酸塩は、胃環境のような生理的酸性環境にほとんど溶解しないということである。
【００１３】
更に、キトサナーゼによる処理でキトサンを調製する場合、キトサナーゼ作用を止めるために熱が用いられていることを指摘することは興味深いことである。この場合、熱変性に対するキトサナーゼの固有の安定性により、反応温度を６０℃以上に上昇させることが必要である。この温度は、十分に記載され且つ公知のメイラード反応に有利に働く（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（編者）（１９９８）食品及び医薬におけるメイラード反応。王立化学会、ケンブリッジ、英国；Ｉｋａｎ（編者）（１９９６）メイラード反応。Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国）。この反応は、キトサンの部分的分解及びキトサン分子の１級アミンの反応から生ずる着色産物の産生をもたらす。これらの同じアミノ基がキトサンの生物特性に重要であるため、この反応は非常に望ましくないものである。２つの付加的ポイントは更に興味深い。第１に、熱変性キトサナーゼは、沈殿し、その後のキトサンの（例えば沈殿による）単離工程に持ち越され得る。第２に、熱変性に対するキトサナーゼの部分的な耐性により、その再生及び活性の部分的な回復を可能にし、キトサンが更に消化される可能性を増大させる。
【００１４】
概して、キトサンを化学又は酵素加水分解産物から沈殿及び単離する現行の方法はしたがって適当ではない。商業的利用、特に生体医学的用途に好適なキトサンを高収率で提供する簡便な手法は、最も興味深いものである。アルカリの添加又はキトサンの不溶塩の形成によりｐＨを上昇させることによって酸性水溶液からキトサンを単離する現行の技術は、これらの要求を満たさない。
【００１５】
したがって、商業的利用、特に、食品及び生体医学産業に関する応用に好適なキトサンを高収率で化学又は酵素加水分解産物から回収するための単純で、信頼性があり、再現性のある方法に関する必要性がある。
【００１６】
混入物質（例えばキトサナーゼ、望ましくない塩）を含まない産物を提供し、ヒトの使用に適合した、水性酸性環境に容易に溶解するキトサンを酸性溶液から回収するための方法に関する必要性もある。
【００１７】
本発明は、これらの必要性及び他の必要性を満たすことを追求する。本明細書は多くの文献を引用しており、文献の内容は本明細書にその全体が援用される。
【００１８】
【非特許文献１】Ｂｅａｕｌｉｅｕ，Ｃ．、Ｌａｃａｓｓｅ，Ｓ．及びＬｅｃｌｅｒｃ，Ｃ．（２００３）農業におけるキトサンの利用可能性：生長刺激及び植物疾患の生体制御。第９回国際キチン−キトサン会議、モントリオール、ケベック州、カナダ、８月２７〜３０日。
【特許文献１】Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｕｓｅ ｉｎ キトサン加水分解に使用する酵素。米国特許第５，４８２，８４３号。
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｇ．、Ｌｅｅ，Ｃ．Ｍ．及びＰａｒｋ，Ｈ．Ｊ．（２００３）水溶液系におけるリノール酸修飾キトサンの自己会合及びナノ粒子形成のための乳化。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：３１３５−３１３９。
【非特許文献３】Ｃａｃａｃｅ，Ｍ．Ｇ．、Ｌａｎｄａｕ，Ｅ．Ｍ．及びＲａｍｓｄｅｎ，Ｊ．Ｊ．（１９９７）ホフマイスター系列：界面現象に対する塩及び溶媒の効果。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３０：２４１−２７７。
【特許文献２】Ｃｈｉｏｕ，Ｍ．Ｓ．及びＬｉ，Ｈ．−Ｙ．（２００３）化学架橋されたキトサンビーズにより水溶液中の色素を吸着させる方法。米国特許第２０，０３０，１０１，５２１号。
【非特許文献４】Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｄ．及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ，Ｍ．Ｗ．（１９８５）界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２。
【非特許文献５】Ｃｕｒｏｔｔｏ，Ｅ．及びＡｒｏｓ，Ｆ．（１９９３）キトサンの定量及び遊離アミノ基の割合。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１１：２４０−２４１。
【非特許文献６】Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｆ．（１８８８）Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．ＩＩ．Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ（Ｌｅｉｐｚｉｇ）２４：２４７−２６０。
【非特許文献７】Ｈｕｇｅｒｔｈ，Ａ．、Ｃａｒａｍ−Ｌｅｌｈａｍ，Ｎ．及びＳｕｎｄｅｌｏｆ，Ｌ．Ｏ．カラギーナンとキトサンとの高分子電解質複合体形成に対する電荷密度と立体構造の効果。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３４：１４９−１５６。
【非特許文献８】Ｉｋａｎ，Ｒ．（編者）（１９９６）メイラード反応。Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州、米国。
【非特許文献９】Ｉｔｏ，Ｍ．、Ｂａｎ，Ａ．及びＩｓｈｉｈａｒａ，Ｍ．（２０００）ラットにおけるキチン・キトサン健康食品の抗潰瘍効果。Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８２：２１８−２２５。
【非特許文献１０】Ｋｕｎｚ，Ｗ．、Ｈｅｎｌｅ，Ｊ．及びＮｉｎｈａｍ，Ｂ．Ｗ．（２００４）‘Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．’（塩の効果の科学について）：フランツ・ホフマイスターの歴史的論文。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９−３７。
【非特許文献１１】ＬｅＨｏｕｘ，Ｊ．Ｇ．及びＧｒｏｎｄｉｎ，Ｆ．（１９９３）ラットにおけるキトサンの肝機能への効果。Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３２：１０７８−１０８４。
【非特許文献１２】Ｍａｅｄａ，Ｙ．及びＫｉｍｕｒａ，Ｙ．（２００４）肉腫１８０を有するマウスにおけるさまざまな低分子量キトサンの抗腫瘍効果は腸上皮内リンパ球のナチュラルキラー活性の増加による。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １３４：９４５−９５０。
【非特許文献１３】Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．（１９９８）キトサンの比色定量。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６０：２５５−２５７。
【非特許文献１４】Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｗ．Ａ．、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｅ．及びＢｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．（１９８９）ピクリン酸によるキチン−キトサンのＮ−アセチル化度の測定。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：３６３−３６７。
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【非特許文献１６】Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇ．Ａ．Ｆ．（１９９２）キチンの化学、ＭａｃＭｉｌｌａｎ出版社、Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ、ハンプシャー、英国、第２８１頁。
【非特許文献１７】Ｒｏｙ，Ｋ．、Ｍａｏ，Ｈ．Ｑ．、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｋ．及びＬｅｏｎｇ，Ｋ．Ｗ．（１９９９）キトサンによる経口遺伝子送達−ＤＮＡナノ粒子はマウスピーナッツアレルギーモデルにおいて免疫学的防御を生ずる。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：３８７−３９１。
【非特許文献１８】Ｓｈｕ，Ｘ．Ｚ．及びＺｈｕ，Ｋ．Ｊ．（２００２）薬物制御放出のためのイオンにより架橋されたキトサンフィルムの特性に対する多価リン酸構造の影響。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５４：２３５−２４３。
【非特許文献１９】Ｓｏｒｌｉｅｒ，Ｐ．、Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｄｅｎｕｚｉｅｒｅ，Ａ．、Ｖｉｔｏｎ，Ｃ．及びＤｏｍａｒｄ，Ａ．（２００３）抗キトサン抗体の調製及び開発。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７Ａ：７６６−７７４。
【非特許文献２０】Ｓｕｇａｎｏ，Ｍ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．、Ｅｎｏｍａｔｏ，Ｋ．及びＨｉｒａｎｏ，Ｓ．（１９９２）部分的に加水分解されたキトサンのラットにおけるコレステロール低下作用。『キチン及びキトサンの進歩』（Ｃ．Ｊ．Ｂｒｉｎｅ、Ｐ．Ａ．Ｓａｎｆｏｒｄ及びＪ．Ｐ．Ｚｉｋａｋｉｓ、編者）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ロンドン、英国 ４７２−４７８。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
したがって、広義では、本発明は、キトサン調製品及びその製造方法に関する。
１つの態様では、本発明は、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。１つの態様では、本発明は、食品適合性及び生体医学適合性の無機塩又は有機塩のような塩析塩の添加（例えばコスモトロピック塩、その混合物、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）によって、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。
【００２０】
１つの態様では、本発明は、無機酸の塩のような塩析物質の添加によりキトサンを酸性溶液から回収するための方法に関する。更なる態様では、本発明は、ヒトの摂取に好適な有機酸の塩の添加によりキトサンを酸性溶液から回収するための方法に関する。塩析塩（及びその組み合わせ）、又はコスモトロピック塩（及びその組み合わせ）、又はコスモトロピック塩とカオトロピック塩との組み合わせの添加は、水分子と添加した塩との再組織化による塩析効果を生じ、溶解したキトサン分子の脱水及び溶液からの沈殿をもたらす。
【００２１】
１つの態様では、塩析反応は非変性条件下で行われる。本発明にしたがい使用され得るｐＨ値の非限定的な例は、約３〜約７（例えば３、３．５、４、４．５、５、４．５、６、６．５、及び７）である。本発明の方法を実施可能な温度の非限定的な例には、約４℃〜約５５℃の温度（例えば４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、２８、３０、３２、３５、３８、４０、４２、４５、４８、５０、５２、５５℃）が含まれる。より高い温度（例えば６０、６５、６８℃など）又はより低い温度（３又は２℃）も本発明にしたがい使用することができる。簡潔にするために、単位（例えばｐＨ３．２、３．４、５．７、６．８など、及び温度５、７、９、２１、２２℃など）を明確に記載していないが、それでもなお本発明の範囲内であるとみなされる。
【００２２】
更に、本発明は、キトサンを酸性溶液から回収するための方法に関するものであり、その回収されたキトサンは天然キトサンのイオン電荷や分子サイズのような物理特性を保持している。本発明の方法によって分子量およそ７〜分子量およそ数百ｋＤａ以上（例えば３００センチポアズ）のキトサンポリマーを沈殿させることができる。本発明に記載の方法は、アセチル化度およそ０％〜アセチル化度およそ少なくとも５０％のキトサンポリマーに更に適用される。
【００２３】
更に、本発明は、非粘性で繊維状の外観を有する沈殿したキトサン調製品の産生を可能にする、キトサンを酸性溶液から塩析させる方法に関する。したがって、そのようなキトサン調製品は、限外ろ過、遠心、又は液相から固相を回収する他の公知で通常の方法などの単純な慣用技術を用いて、酸性溶液から容易に回収することができる。
【００２４】
他の態様では、本発明は、キトサナーゼに対してキトサンを選択的に塩析可能な、酵素加水分解物からの精製に好適な酸性溶液からキトサンを回収するための方法に関する。この選択的塩析は、キトサンの更なる加水分解を妨げ、したがって、その多分散性を低下させ、実質的にキトサナーゼを含まないキトサン調製品を生ずる。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、無視できる量のキトサナーゼを含有するキトサン調製品に関するものである。本発明は、キトサンを酸性溶液から回収する方法を提供する；その回収されたキトサン調製品は塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、及びカオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物）、及び他の可溶性物質を容易に取り除くことができる。１つの態様では、本発明のキトサン調製品は、少なくとも９０％（例えば９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）の回収レベルを達成する。他の態様では、本発明のキトサン調製品は、少なくとも９５％（例えば９５、９６、９７、９８、９９、１００％）の回収レベルを達成する。更なる態様では、本発明のキトサン調製品は少なくとも９８％の回収レベルを達成する。
【００２６】
更に、本発明は、酸性溶液からキトサンを精製する方法及びそれから得たキトサンの調製品に関する。そのような精製キトサン調製品はヒト又は動物の食用に好適であり、したがって、生体医学的応用の基準又は食品添加物としての基準を満たす。
【００２７】
１つの態様では、本発明は、さまざまな分子サイズのキトサンの精製方法に関するものである。本発明の方法で得たキトサンは容易に乾燥することができ、その結果として得られる粉末は、胃の酸含有量に類似する塩酸溶液のような低濃度の有機酸及び好ましくは無機酸に容易に溶解する。この特性は、キトサン調製品を食品添加物として用いる場合に非常に好適である。１つの態様では、本発明は、希塩酸溶液に容易に溶解する選択した分子サイズのキトサン調製品にも関する。１つの態様では、この希塩酸溶液は胃の酸含有量を模倣している。
【００２８】
他の態様では、本発明は、実質的に又は完全にキトサナーゼを含まない、ヒトの食用に好適な、胃内のような水性酸性環境に可溶性であり、実質的に沈殿塩（例えば塩析塩）を含まない、キトサン調製品に関する。
【００２９】
本発明の他の利点及び特徴は、例示の目的でのみ提示した以下の具体的態様の非限定的説明を読むことによって更に明らかになるであろう。
特に定義されていない限り、本明細書において使用する科学用語及び技術用語並びに命名は、本発明が属する分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同様の意味を有する。
【００３０】
定義
「１つの」という語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語とともに用いる場合、「１」を意味し得るが、「１以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１又はそれより多い」の意味とも一致する。
【００３１】
本願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために採用する装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。一般に、「約」という用語は、１０％までの起こり得る変動を設定することを意味する。したがって、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０％の変動は約という用語の中に含まれる。
【００３２】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（comprising）」（及び含むの他の形態）、「有する（having）」（及び有するの他の形態）、「含める（including）」（及び含めるの他の形態）又は「含有する（containing）」（及び含有するの他の形態）という語は、包括的であり、又は制限がなく、引用されていない追加の要素又は方法工程を排除するものではない。
【００３３】
本明細書において、「精製した」とは、それがもともと存在した組成物の成分から分離された分子（例えばキトサン）を意味する。したがって、例えば、キトサンは自然に見られないレベルまで精製されている。「実質的に純粋な」分子とは、大部分の他の成分（例えば混入物質が３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％含まれない）が欠失している分子である。反対に、「粗製」という用語は、それが存在したもともとの組成物の成分から分離されていない分子を意味する（例えばキトサナーゼを含む酸性溶液）。したがって、「分離」又は「精製」という用語は、サンプルの１以上の成分がサンプルの１以上の他の成分から除去される方法を意味する。サンプル成分には、昆虫又は動物（甲殻類などを含む）の外骨格からの抽出物及び市販のキトサン調製品が含まれる。抽出物は、天然供給源にもともと見られる成分の全て又は一部を含んでいてよい。したがって、抽出物は、キトサンの他に、タンパク質（例えばキトサナーゼ）、炭水化物、脂質又は核酸のような他の成分を含んでいてよい。１つの態様では、分離又は精製工程は、サンプル中に存在する他の成分の少なくとも約５０％（例えば５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）を所望の成分から除去する。他の態様では、精製工程は、サンプル中に存在する他の成分の、少なくとも約８０％（例えば８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）、更なる態様では、少なくとも約９５％（例えば９５、９６、９７、９８、９９、１００％）を所望の成分から除去する。簡潔にするため、単位（例えば６６、６７．．．８１、８２．．．９１、９２％．．．．）を体系的に列挙していないが、それでも、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００３４】
「酸性環境」、「酸性条件」又は「酸性ｐＨレベル」は、約７より低い全てのｐＨレベルをカバーすることを意図する。しかしながら、本発明の目的のため、水性酸性環境からキトサンを塩析させるための酸性溶液を意味する場合は、約２〜約６のｐＨレベルが好ましいｐＨレベルである。本発明にしたがい使用し得る弱有機酸の非限定的な例には、リンゴ酸及び乳酸が含まれる。使用し得る酸の他の例には、酢酸及び塩素酸（ＨＣｌ）が含まれる。酢酸、乳酸及びリンゴ酸の場合、好ましい濃度は、量を基準として約５〜１０％である。ＨＣｌの場合、好ましい濃度は約０．２Ｎである。当然、本発明にしたがい、他の濃度の酸を使用することもできる。
【００３５】
２つの化学物質が反応する場合又は条件が変化した場合（例えば塩の添加、温度変化、溶液の周囲圧又はｐＨによって）、溶液中で沈殿が起こり、溶液に不溶で、雨又は雪のように溶液と不和状態になる産物を形成する。「沈殿物」は、化学反応又は条件変化（例えば塩析反応）の結果として溶液から分離する固体物質である。沈殿物は多かれ少なかれ微粒子から成り、それが混合物に与える混濁した、乳白色の、ゲル状の、又は粒状の外観によって同定され得る。固体は容器の底に沈むこともあるであろう。
【００３６】
広義では、溶解性という用語は、１つの物質が他の物質に溶解する能力又は傾向として定義される。化合物の溶解性は全体的又は部分的であり、それが取り込まれる溶媒の物理化学特性（例えば温度、圧力、ｐＨ、など）に依存してさまざまであり得る。モル溶解度は、溶解する溶質の最大量として、溶液１リットルあたりのモル数で定義される。物質の「溶解性」は、具体的条件下で特定した量の溶媒に溶解する最大量（グラム又はモルで表される）として表すこともできる。
【００３７】
曇り点：本発明の目的では、曇り点は、具体的条件下で（ｐＨ、温度、キトサンの分子量、脱アセチル化度、周囲圧及び塩析に用いた具体的な塩）、キトサンが沈殿し始める塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、コスモトロピック塩とカオトロピック塩との混合物、有機酸又は無機酸の塩など）の濃度である。曇り点は、（溶液がもはや均一でない場合、即ち濁ったか混濁した場合）単純な目視検査によって測定することができる。曇り点は、所定条件下（例えば、所定の温度及びｐＨで所定分子量及びある脱アセチル化度のキトサン）、所定濃度の塩によって沈殿したキトサン量を測定することによる、当該技術分野に周知の、より正確な分析法によって測定することもできる。本発明にしたがい使用し得る分析法には、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって開発されたＣｉｂｒａｃｏｎブリリアントレッド３Ｂ−Ａ色素を用いる方法（１９９８）（キトサンの比色定量。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６０：２５５−２５７）、Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒらによって公開されたピクリン酸法（１９８９）（ピクリン酸によるキチン−キトサンのＮ−アセチル化度の測定。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８９、３６３−３６９）、信頼性の低い（Ｈｕｇｅｒｔｈら（１９９７）カラギーナンとキトサンとの高分子電解質複合体形成に対する電荷密度と立体構造の効果。Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３４ １４９−１５６）Ｃｕｒｏｔｔｏ及びＡｒｏｓにより記載されたニンヒドリン法（１９９３）（キトサンの定量及び遊離アミノ基の割合。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１１：２４０−２４１）、又はそれらから派生した方法のような比色法が含まれる。本発明にしたがい、例えばキトサンに特異的な抗体の使用に基づいた、当該技術分野に周知の他の方法を用いることもできる（例えば免疫沈降法又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））。使用可能なキトサン抗体の非限定的な例は、Ｓｏｒｌｉｅｒら（２００３）（抗キトサン抗体の調製及び開発。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７Ａ：７６６−７７４）に提供されている。
【００３８】
カオトロピックという用語はカオス形成性を意味し、生化学では、通常、水中の整然とした水素結合構造を崩壊させる化合物の能力を意味する。この水素結合は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び多糖（例えばキトサン）のような生体高分子の２次構造、及び水性媒体でのそれらの溶解性に大いに影響を及ぼす。カオトロピック塩は、水素結合及び疎水性相互作用を破壊することによって構造を減少させる（カオスを増加させる）。カオトロピック塩（不安定化物質）の非限定的な例には、ＮａＣｌＯ４、ＮａＳＣＮ、ＮａＮＯ３及びＮａＢｒが含まれる。反対に、コスモトロピック塩（安定剤）は水分子と強力な相互作用を発揮する。したがって、水分子は、溶質周辺の正常な組織化が減少して溶質が固相で結合できる（即ち沈殿する）程度までコスモトロピック塩イオンの周辺で組織化する。コスモトロピック塩（安定剤）の非限定的な例には、Ｎａ２ＳＯ４、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム及びＮａＨ２ＰＯ４が含まれる。
【００３９】
「塩析」。「塩析」効果は、溶質に代わってイオン周辺で水分子の組織化が増加することによって、溶質の溶解性を低下させる。主として、添加した塩イオンと他の溶解した溶質とのあいだの分子回収のための競合の結果である。高塩濃度では、非常に多くの添加イオンが溶媒和するため、利用可能なバルク溶媒の量が、他の溶質（例えばキトサン）を溶解するには不十分になる。したがって、溶質−溶質相互作用は、溶質−溶媒相互作用よりも強力になる。この塩析効果は、溶質の脱水及び溶液からの沈殿をもたらす（Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ（１９８５）界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２；Ｃａｃａｃｅら（１９９７）ホフマイスター系列：界面現象に対する塩及び溶媒の効果。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３０：２４１−２７７；Ｋｕｎｚら（２００４）‘Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｒ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ’（塩の効果の科学について）：フランツ・ホフマイスターの歴史的論文。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９−３７）。このように、中性塩の濃度が高レベルである場合（例えば＞０．１Ｍ）、多くの場合、タンパク質は沈殿する。溶媒和の低下と反発力の中和はタンパク質を凝集及び沈殿させる。
【００４０】
塩析塩。本発明の塩析塩は、一般に、キトサンに代わってその周囲で水分子の組織化を増加させることにより、キトサンの溶解性を低下させる能力によって特徴付けられる（塩析効果）。したがって、本明細書において、「塩析塩」という用語は、キトサンの脱水及び水溶液からの沈殿を引き起こすあらゆる塩を含めることを意味する（例えば、コスモトロピック塩、その混合物、無機塩又は有機塩、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）。
【００４１】
本明細書において、「塩」という用語は、無機及び／又は有機の酸及び塩基とともに形成された酸性及び／又は塩基性の塩であると理解される。双性イオン（内塩）は、アルキルアンモニウム塩のような四級アンモニウム塩のように、本明細書における「塩」という用語の中に含まれると理解される。他の塩も例えば単離又は精製工程に有用であり得るが、非毒性の医薬的に許容可能な塩が好ましい。
【００４２】
酸付加塩の例としては、限定されるものではないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。
【００４３】
塩基性塩の例としては、限定されるものではないが、アンモニウム塩；ナトリウム塩、リチウム塩、及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アミン（例えば、ジシクロヘキシルアミン、ｔ−ブチルアミン及びｔ−アミルアミンのようなアルキルアミン、置換アルキルアミン、ベンジルアミンのようなアリール−アルキルアミン、ジアルキルアミン、Ｎ−メチル グルカミン（特にＮ−メチル Ｄ−グルカミン）のような置換ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、並びに置換トリアルキルアミン）のような有機塩基を含む塩が挙げられる。
【００４４】
本明細書において、「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、塩素、臭素、フッ素及びヨウ素として理解される。
本発明を以下の特定の実施例によって更に具体的に説明する。実施例は説明のためにのみ提供するものであり、如何なる場合も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００４５】
本発明を一般的に説明する上で、具体的態様を説明するためにのみ示す添付の図面が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
具体的態様の説明
本明細書において、酸性水溶液に溶解したキトサンの高収率で迅速な回収を可能にする簡便で再現性のよいプロトコールが記載される。このプロトコールは、塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）の添加により、キトサンポリマーの水和した殻が再組織化される原理に基づいている。塩析塩の非限定的な例には、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、マロン酸、酢酸、乳酸、コハク酸、プロピオン酸又はリン酸のナトリウム塩又はカリウム塩が含まれる。硫酸のアンモニウム塩、カリウム塩又はナトリウム塩、及び硝酸のナトリウム塩又はカリウム塩も本発明にしたがい有効に使用することができる。
【００４７】
本プロトコールは、高ｐＨ又は凝固物の処理を利用するこれまで使用された酸性溶液からのキトサンの回収法とは異なっている。本発明の方法は：ａ）非腐食性試薬の使用による操作の安全性；ｂ）キトサンの高回収率；及びｃ）残存するイオン電荷及び分子サイズなどのキトサンポリマーの物理特性の修飾の欠如、などの多くの利点を提供する。このプロトコールは広範な分子サイズのキトサンに適用可能である。更に、１つの態様では、本発明のキトサン調製品は、実質的にキトサナーゼを含まないという事実により安定性が増加した利点を有する。
【００４８】
キトサンは、甲殻類及び昆虫の外骨格のような天然キチンの限定塩基性加水分解により、通常商業的に調製されるポリカチオン性ポリマーである。キチンは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース）モノマー単位で構成されるポリマーであるが、市販のキトサンは、通常、さまざまな程度に脱アセチル化された、キチンの分子サイズの不均一な混合物で構成される。キチン及びキトサンの基本概略構造を以下に示す。
【００４９】
【化１】
【００５０】
したがって、本発明は、概して、先行技術の調製品及び方法の欠陥を克服するキトサン及びその製造方法を提供する。
１つの態様では、本発明は、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法に関する。より詳細には、本発明の目的は、塩（塩析塩、例えばコスモトロピック塩、その混合物、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物など）の添加により、キトサンを酸性水溶液から回収するための方法を提供することである。１つの具体的態様では、食品適合性の無機塩又は有機塩を用いてキトサンを酸性水溶液から沈殿させる。
【００５１】
キトサンは高分子電解質の性質を有する。したがって、水性媒体でのその溶解性は、水性媒体でのタンパク質の溶解性に適用される経験則に類似した法則に従うはずである。これらの要因には、溶解媒体のｐＨ、温度及びイオン強度が含まれる。本明細書に記載の革新的プロトコールは、選択されたホフマイスター系列（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ（１８８８）、Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．ＩＩ．Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ（Ｌｅｉｐｚｉｇ）２４：２４７−２６０；Ｋｕｎｚら（２００４）Ｚｕｒ Ｌｅｈｒｅ ｖｏｎ ｄｅｓ Ｗｉｒｋｕｎｇ ｄｅｓ Ｓａｌｚｅ．ＩＩ．（塩の効果の科学について）：フランツ・ホフマイスターの歴史的論文、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１９−３７；Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ（１９８５）界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２；Ｃａｃａｃｅら（１９９７）ホフマイスター系列：界面現象に対する塩及び溶媒の効果。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ３０：２４１−２７７）の電解質、又は食品適合性有機塩の添加によって引き起こされる塩析効果に対するキトサンの感受性に基づいている。塩析効果は、溶質に代わってイオン周辺で水分子の組織化を増加させることによって溶質の溶解性を減少させる。この塩析効果は、溶質の脱水及び溶液からの沈殿をもたらす（Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＷａｓｈａｂａｕｇｈ（１９８５）、界面でのホフマイスター効果及び水の挙動。Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ １８：３２３−４２２）。
【式１】
【００５２】
【００５３】
本発明の方法は、ホフマイスター系列の塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、コスモトロピック塩とカオトロピック塩との混合物など）を、キトサンの酸性水溶液へ添加することを含む。１つの具体的態様では、食品適合性塩又は食品適合性電解質をキトサンの酸性水溶液へ添加してキトサンを沈殿させる。本発明にしたがい使用し得る塩析塩の非限定的な例には以下が含まれる：
・硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム
・リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム
・クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム
・酒石酸ナトリウム
・リンゴ酸ナトリウム
・硝酸ナトリウム
・乳酸ナトリウム
・マロン酸ナトリウム
・コハク酸ナトリウム
・酢酸ナトリウム
・プロピオン酸ナトリウム
キトサンが溶解され、塩析塩が添加される希酸水溶液の非限定的な例には、酢酸、乳酸、リンゴ酸又は塩酸が含まれる。当然、本発明にしたがい、他の希酸性水溶液を使用することもできるであろう。キトサンを沈殿させるのに要する塩析塩又は有機塩の有効量は、温度、酸性水溶液中のキトサン濃度、用いた具体的な塩、周囲圧、具体的なキトサンの分子量、及びポリマーの脱アセチル化度を含めた多くの因子に依存する。本発明は、わずか１種類の塩（例えば有機又は無機の食品適合性塩）の添加に限定されるものではない。２種類以上の塩析塩の組み合わせ（例えば３、４、５、６種類など）も本発明にしたがい用いることができる。更に、異なる塩の組み合わせは、コスモトロピック塩の組み合わせに限定されるものではない。包括的効果が酸性水溶液からのキトサンの塩析である限り、本発明にしたがい、カオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物を用いることができる。
【００５４】
塩析したキトサンは、洗浄液の導電率を測定することによって例えば工業規模で容易にモニターできる塩析沈殿塩が取り除かれている。キトサンは、ろ過、遠心、蒸発、噴霧乾燥又はそれらの組み合わせを含めた当該技術分野に公知の手段によって酸水溶液から容易に回収することができる。
【００５５】
１つの態様では、塩水溶液中、具体的な温度で長時間（例えば１週間）、キトサンポリマーを撹拌又はかき混ぜたとき、特定のキトサンが溶解して透明な均一溶液を形成していない場合、特定のキトサンポリマーは具体的酸性水溶液から塩析されたとみなされる。
【００５６】
以上より、具体的酸性塩水溶液中の特定のキトサンポリマーの溶解性は温度依存性であり得るため、キトサンはより低温の水溶液では塩析され得るが、より高温では可溶性であり得、又はその逆であることが理解されるはずである。本明細書に記載のいくつかの実施例は、一連の有機塩及び無機塩によるキトサンの塩析に対する温度の効果について説明する。したがって、キトサンを具体的な酸性塩水溶液から回収するために、この特殊性を活用することができる。
【００５７】
具体的濃度の具体的キトサンポリマーを沈殿させる１以上の有効な塩析塩、及びそれらの組み合わせ（例えばヒトの食用に好適な有機塩）を同定するために用いられる通常の実験は、多くの方法で行なうことができる。１つの態様では、必要な塩の有効濃度の同定は、ポリリン酸の添加により、又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉの方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ（１９９８）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６０：２５５−２５７）にしたがって比色アッセイにより、溶液中に沈殿したキトサンの割合を測定することによって実施される。他の態様では、具体的なキトサンを沈殿させるための塩析塩又は有機塩の有効量を決定するために曇り点が測定される。これは単純な目視検査によって行なうことができ、具体的なキトサンの溶解性様式は、所定温度におけるそれぞれの塩の種類及び濃度に相関があり得る。
【００５８】
全て又はわずか一部のキトサンが沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。１つの態様では、少なくとも９０％（９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％）のキトサンが沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。他の態様では、少なくとも９５％（９５、９６、９７、９８、９９、１００％）が沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。更に他の態様では、少なくとも９８％（９８、９９、１００％）が沈殿する場合に、キトサンは沈殿したとみなすことができる。
【００５９】
本発明に使用する塩は、如何なる塩析無機塩又は有機塩でもよい。非限定的な例には、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、硝酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、及びリン酸水素塩が含まれる。対イオンは効果が小さく、アンモニア、又はナトリウム、マグネシウム、カルシウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属であり得る。包括的効果が酸性水溶液からのキトサンの塩析（即ち沈殿）である限り、無機塩又は有機塩の混合物、及びカオトロピック塩とコスモトロピック塩との混合物も本発明にしたがい使用することができる。
【００６０】
塩析塩を用いてキトサンを塩析するための一般手順
１つの態様では、キトサンを水溶液から回収するための一般手順は以下を含む。約１〜１０重量％、特に５重量％のキトサンを含有する溶液は、キトサンを希酸水溶液（例えば塩酸（約０．２Ｎ）、酢酸、乳酸、リンゴ酸（約５〜１０％））に溶解することによって調製する。沈殿塩を固体の形態で又は好ましくは濃溶液として、好ましくは少しずつ混合しながら加える。沈殿塩の比は、以下に示すさまざまな実施例、及び沈殿塩と溶解したキトサン量との比の関係を説明する図面にしたがい、重量を基準として調整することができる。更に、当業者は、キトサンの回収手順は、本発明の態様内で提示する実施例で説明するように、さまざまな温度で達成することができるという事実を理解するであろう（しかし限定されるものではない）。得られた塩析したキトサンの懸濁液を３０分間攪拌するか、又は回収すべきキトサン量に応じて長時間（例えば１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間など）撹拌する。沈殿物を回収し、洗浄し、そして乾燥する。当業者は、回収すべきキトサン量に最適なように上記方法のいずれか１つを選択するであろう。
【実施例１】
【００６１】
Ｎａ２ＳＯ４で塩析するキトサン（７０ｋＤａ、８４％脱アセチル化）
Ｆｌｕｋａ（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、ＵＳＡ）より入手した７０ｋＤａのキトサン２０ｇを５％酢酸（５００ｍｌ）に溶解する。７５ｇのＮａ２ＳＯ４（終濃度０．４７Ｍ）を攪拌しながら少しずつ加える。塩析したキトサンを４℃で約３０分間保ち、その後約２０分間遠心する（８０００×ｇ）。水性媒体に不溶性のキトサン塩を形成することが当該技術分野においてすでに知られている例として（Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９２）、キチンの化学、ＭａｃＭｉｌｌａｎ出版社、Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ、ハンプシャー、英国、第２８１頁）ポリリン酸の添加により定性的にアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。あるいは、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって記載された比色アッセイ（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）を用いて溶液に残留するキトサン量を定量的に測定する。このアッセイは、他の公開された技術よりも、水性媒体に溶解したキトサンを定量するための感受性が高く再現性のある方法であると報告されている（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）。塩析したキトサンを水で３〜５回洗浄し、遠心して回収する。
【実施例２】
【００６２】
クエン酸三ナトリウムで塩析するキトサン（７０ｋＤａ、８４％脱アセチル化）
Ｆｌｕｋａ（シグマ−アルドリッチ）より入手した７０ｋＤａのキトサン２０ｇを５％酢酸（５００ｍｌ）に溶解する。８０ｇのクエン酸三ナトリウム（終濃度０．３４Ｍ）を攪拌しながら少しずつ加える。塩析したキトサンを４℃で３０分間保ち、その後２０分間遠心する（８０００×ｇ）。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で３〜５回洗浄し、遠心して回収する。
【実施例３】
【００６３】
硫酸アンモニウムで塩析するキトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）
市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ、Ｒｉｖｉｅｒｅ−ａｕ−Ｒｅｎａｒｄ、Ｇａｓｐｅｓｉｅ、ケベック州、カナダ）の酵素加水分解によって得た、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社、ヒューストン、テキサス州、ＵＳＡ）で測定して分子量３０ｋＤａの９２％脱アセチル化キトサン１部を、５％酢酸水溶液に溶解する。濃硫酸アンモニウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を４℃で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で３〜５回洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例４】
【００６４】
リン酸一ナトリウムで塩析するキトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）
市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定して分子量３０ｋＤａの９２％脱アセチル化キトサン１部を、５％酢酸水溶液に溶解する。濃リン酸一ナトリウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例５】
【００６５】
硫酸ナトリウムで塩析するキトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）
Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ワシントン、ＵＳＡ）から入手した２４０ｋＤａの９２％脱アセチル化キトサン１部を１０％酢酸水溶液に溶解する。濃硫酸ナトリウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例６】
【００６６】
硫酸アンモニウムで塩析する高分子量キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）
Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ワシントン、ＵＳＡ）から入手した高分子量の（３００ｃｐｓ）９２％脱アセチル化キトサン１部を１０％酢酸水溶液に溶解する。濃硫酸アンモニウム水溶液４部を少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。ポリリン酸の添加によって（Ｒｏｂｅｒｔｓ １９９２；上記）又はＭｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイによってアッセイしても、上清は感知できるほどの量のキトサンを含有しない。塩析したキトサンを水で洗浄し、本発明の態様の中で記載した好適な方法で回収する。
【実施例７】
【００６７】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を４℃で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
図１は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサン加水分解産物のサンプルを４℃まで冷却する。クエン酸三ナトリウム水溶液５部を４℃で加え、処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を４℃で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図１は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率も表す。当業者は、加水分解産物の可溶性相にキトサナーゼ活性が残留することに留意することが重要である。
【実施例８】
【００６８】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を室温で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
図２は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサンのサンプルを室温に保つ。次に、クエン酸三ナトリウム水溶液５部を室温で加え、処理すべきキトサン量に応じて溶液を室温で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図２は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率も表す。当業者は、キトサナーゼ活性が可溶性相に残留することに留意することが重要である。
【実施例９】
【００６９】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を４℃で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
図３は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサン加水分解産物のサンプルを４℃まで冷却させる。４℃まで冷却した硫酸アンモニウム水溶液５部を少しずつ加え、処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を４℃で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図３は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率も表す。
【実施例１０】
【００７０】
さまざまな分子サイズのキトサン（９２％脱アセチル化）を室温で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
図４は、２４０ｋＤａのキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）で測定してさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率を表す。５％酢酸水溶液に溶解したキトサンのサンプルを室温に保つ。硫酸アンモニウム水溶液５部を室温で少しずつ加え、処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を室温で３０〜６０分間攪拌する。キトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。図４は、２４０ｋＤａ及び高分子量（ＨＭＷ）の未加水分解キトサンを塩析させる、硫酸アンモニウムの効率も表す。
【実施例１１】
【００７１】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、硫酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硫酸ナトリウム又は好ましくは濃硫酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図５に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１２】
【００７２】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
増加する量の固体クエン酸三ナトリウム又は好ましくは濃クエン酸三ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図６に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１３】
【００７３】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
増加する量の固体硫酸アンモニウム又は好ましくは濃硫酸アンモニウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図７に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１４】
【００７４】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、酒石酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体酒石酸二ナトリウム又は好ましくは濃酒石酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図８に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１５】
【００７５】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、リン酸一ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸一ナトリウム又は好ましくは濃リン酸一ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図９に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１６】
【００７６】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、リンゴ酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体リンゴ酸二ナトリウム又は好ましくは濃リンゴ酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１０に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１７】
【００７７】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、硝酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硝酸ナトリウム又は好ましくは濃硝酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１１に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１８】
【００７８】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、リン酸水素二ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸水素二ナトリウム又は好ましくは濃リン酸水素二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に少しずつ加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１２に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例１９】
【００７９】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、コハク酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体コハク酸二ナトリウム又は好ましくは濃コハク酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサンの３つのキトサン溶液１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１３に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２０】
【００８０】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、酢酸ナトリウムの効率
増加する量の固体酢酸ナトリウム又は好ましくは濃酢酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１４に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２１】
【００８１】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）で４℃及び室温で塩析させる、マロン酸二ナトリウムの効率
増加する量の固体マロン酸二ナトリウム又は好ましくは濃マロン酸二ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１５に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相中のキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２２】
【００８２】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、乳酸ナトリウムの効率
増加する量の固体乳酸ナトリウム又は好ましくは濃乳酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１６に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２３】
【００８３】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、プロピオン酸ナトリウムの効率
増加する量のプロピオン酸ナトリウム又は好ましくは濃プロピオン酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１７に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２４】
【００８４】
キトサン（３０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃、室温及び５０℃で塩析させる、溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の比で用いた塩析無機塩及び有機塩の相対効率
キトサンに対し１：１及び４：１の質量比の無機又は有機の塩析塩を、５％酢酸水溶液に溶解した市販のキトサン（Ｍａｒｉｎａｒｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｔｅｅ）の酵素加水分解によって得た分子量３０ｋＤａ（低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置で測定、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１８に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２５】
【００８５】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
増加する量の固体硫酸アンモニウム又は好ましくは濃硫酸アンモニウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図１９に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２６】
【００８６】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硫酸ナトリウム又は好ましくは濃硫酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２０に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２７】
【００８７】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
増加する量の固体クエン酸三ナトリウム又は好ましくは濃クエン酸三ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２１に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２８】
【００８８】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、リン酸一ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸一ナトリウム又は好ましくは濃リン酸一ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２２に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例２９】
【００８９】
キトサン（２４０ｋＤａ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の比で用いた塩析無機塩及び有機塩の相対効率
溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の質量比の無機又は有機の塩析塩を、５％酢酸水溶液に溶解した分子量２４０ｋＤａ（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２３に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３０】
【００９０】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸アンモニウムの効率
増加する量の固体硫酸アンモニウム又は好ましくは濃硫酸アンモニウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２４に示した温度で３０〜６０間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３１】
【００９１】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、硫酸ナトリウムの効率
増加する量の固体硫酸ナトリウム又は好ましくは濃硫酸ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量キトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２５に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３２】
【００９２】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、リン酸一ナトリウムの効率
増加する量の固体リン酸一ナトリウム又は好ましくは濃リン酸一ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量キトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２６に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３３】
【００９３】
高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、クエン酸三ナトリウムの効率
増加する量の固体クエン酸三ナトリウム又は好ましくは濃クエン酸三ナトリウム溶液を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量キトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２７に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３４】
【００９４】
キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化）を４℃及び室温で塩析させる、溶解したキトサンに対し１：１及び４：１の比で用いた塩析無機塩及び有機塩の相対効率
キトサンに対し１：１及び４：１の質量比の無機又は有機の塩析塩を、５％酢酸水溶液に溶解した高分子量（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の９２％脱アセチル化キトサン１部に加える。処理すべきキトサン量に応じて懸濁液を図２８に示した温度で３０〜６０分間攪拌する。懸濁したキトサンを可溶性相から分離し、可溶性相に残留するキトサン量を、Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉによって公開された方法（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ １９９８、上記）にしたがい比色アッセイで測定する。
【実施例３５】
【００９５】
有機又は無機の塩析塩による塩析によって水溶液から回収されたキトサンの溶解性。溶解性は希塩酸水溶液又は希酢酸水溶液中で定性的にアッセイされる。
表１は、本発明の態様内で記載した一連の塩析塩で塩析した（即ち沈殿した）さまざまな分子量のキトサンの溶解性の例について記載する。希酢酸水溶液（５％）及び胃に見出される濃度（０．２Ｎ）と類似の濃度で用いられる塩酸水溶液におけるサンプルの溶解性を定性的に示す。
【００９６】
【表１】
【００９７】
キトサンは、例示したクエン酸三ナトリウムと硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム又はリン酸一ナトリウムのような塩析塩の組み合わせ（例えばコスモトロピック塩、その混合物、コスモトロピック塩とカオトロピック塩との混合物など）の添加により、希酢酸水溶液から回収することもできる。
【００９８】
要約すれば、本明細書の開示に基づき、当業者は、塩析塩（例えばコスモトロピック塩、その混合物、又はカオトロピック塩とコスモトロピック塩との組み合わせ）の添加により、キトサンを酸性水溶液から精製することができる。本発明により精製したキトサンは、残存するイオン電荷や分子サイズなど、少なくともいくつかのキトサンポリマーの物理特性の修飾を妨げる（即ち、天然のキトサンの生理学的特性を保持している）。本明細書に記載の手法は、単純で、経費を削減し、簡便で、広範囲に及ぶものである。最低限の実施しやすい操作で、産物の完全性を維持しながら、酸性水溶液からのキトサンの迅速、効率的及び定量的回収を可能にする。この手法は、処理される必要がある溶解したキトサン量に関して制限なく適用することができ、本発明の方法を、商業生産のための小規模、大規模、又は極大規模の調製に発展させる。更に、本発明によって精製されたキトサン調製品は、食品適合性塩析塩を用いて溶液からキトサンを塩析する場合、ヒト又は動物の食用に好適である。更に、本発明は、１つの塩の添加又はわずか１種類の塩（例えばコスモトロピック塩）の使用に限定されない。包括的効果が酸性水溶液からのキトサンの塩析である限り、塩の混合物（例えばカオトロピック塩とコスモトロピック塩）を使用してもよい。これは、生体医学及び食品産業に関する応用のようなヒト及び動物へのキトサンの投与に関する応用の場合は考慮すべき重要事項である。
【００９９】
ある具体的態様を参照して本発明を記載しているが、当業者は、本発明の精神及び性質を逸脱することなくさまざまな修飾、改変、省略及び置換がなされ得ることを認識するであろう。例えば、特定のキトサンを塩析させるのに要する塩析塩又は有機塩の有効量は、酸性水溶液中のキトサン濃度、温度、用いた無機塩又は有機塩、特定のキトサンの分子量、１％未満から７０％を越えるまでさまざまであり得るそのアセチル化度、溶液のｐＨ及び周囲圧を含めた多くの因子に依存する。したがって、本発明は、開示した具体的態様に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の精神及び範囲内での修飾をカバーすることを意図することが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。実験は４℃で行なった。
【図２】図２は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社、ヒューストン、テキサス州、ＵＳＡ）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。実験は室温で行なった。
【図３】図３は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。実験は４℃で行なった。
【図４】図４は、２４０ｋＤａキトサン（Ｖａｎｓｏｎ ＨａｌｏＳｏｕｒｃｅ）の酵素加水分解産物に由来する、低角度光散乱器を備えたトリプル検出システム装置（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ社）による測定でさまざまな分子サイズの９２％脱アセチル化キトサンを塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。実験は室温で行なった。
【図５】図５ａ、５ｂ及び５ｃは、４℃（５ａ）、室温（５ｂ）及び５０℃（５ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸ナトリウムの効率を示す。
【図６】図６ａ、６ｂ及び６ｃは、４℃（６ａ）、室温（６ｂ）及び５０℃（６ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。
【図７】図７ａ、７ｂ及び７ｃは、４℃（７ａ）、室温（７ｂ）及び５０℃（７ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。
【図８】図８ａ、８ｂ及び８ｃは、４℃（８ａ）、室温（８ｂ）及び５０℃（８ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、酒石酸二ナトリウムの効率を示す。
【図９】図９ａ、９ｂ及び９ｃは、４℃（９ａ）、室温（９ｂ）及び５０℃（９ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸一ナトリウムの効率を示す。
【図１０】図１０ａ、１０ｂ及び１０ｃは、４℃（１０ａ）、室温（１０ｂ）及び５０℃（１０ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リンゴ酸二ナトリウムの効率を示す。
【図１１】図１１ａ、１１ｂ及び１１ｃは、４℃（１１ａ）、室温（１１ｂ）及び５０℃（１１ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硝酸ナトリウムの効率である。
【図１２】図１２ａ、１２ｂ及び１２ｃは、４℃（１２ａ）、室温（１２ｂ）及び５０℃（１２ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸水素二ナトリウムの効率を示す。
【図１３】図１３ａ、１３ｂ及び１３ｃは、４℃（１３ａ）、室温（１３ｂ）及び５０℃（１３ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、コハク酸二ナトリウムの効率を示す。
【図１４】図１４ａ、１４ｂ及び１４ｃは、４℃（１４ａ）、室温（１４ｂ）及び５０℃（１４ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、酢酸ナトリウムの効率を示す。
【図１５】図１５ａ及び１５ｂは、４℃（１５ａ）及び室温（１５ｂ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、マロン酸二ナトリウムの効率を示す。
【図１６】図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃは、４℃（１６ａ）、室温（１６ｂ）及び５０℃（１６ｃ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、乳酸ナトリウムの効率を示す。
【図１７】図１７ａ及び１７ｂは、４℃（１７ａ）及び室温（１７ｂ）でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、プロピオン酸ナトリウムの効率を示す。
【図１８】図１８ａ及び１８ｂは、４℃、室温及び５０℃でキトサン（３０ｋＤａ、酵素加水分解により調製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、溶解したキトサンに対して１：１（１８ａ）及び４：１（１８ｂ）の比で用いた無機及び有機の塩析塩の相対的な効率を示す。
【図１９】図１９ａ及び１９ｂは、４℃（１９ａ）及び室温（１９ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。
【図２０】図２０ａ及び２０ｂは、４℃（２０ａ）及び室温（２０ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸ナトリウムの効率を示す。
【図２１】図２１ａ及び２１ｂは、４℃（２１ａ）及び室温（２１ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。
【図２２】図２２ａ及び２２ｂは、４℃（２２ａ）及び室温（２２ｂ）でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸一ナトリウムの効率を示す。
【図２３】図２３ａ及び２３ｂは、４℃及び室温でキトサン（２４０ｋＤａ、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製、９２％脱アセチル化）を塩析させる（即ち沈殿させる）、溶解したキトサンに対して１：１（２３ａ）及び４：１（２３ｂ）の比で用いた無機及び有機の塩析塩の相対的な効率を示す。
【図２４】図２４ａ及び２４ｂは、４℃（２４ａ）及び室温（２４ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸アンモニウムの効率を示す。
【図２５】図２５ａ及び２５ｂは、４℃（２５ａ）及び室温（２５ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、硫酸ナトリウムの効率を示す。
【図２６】図２６ａ及び２６ｂは、４℃（２６ａ）及び室温（２６ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、リン酸一ナトリウムの効率を示す。
【図２７】図２７ａ及び２７ｂは、４℃（２７ａ）及び室温（２７ｂ）で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、クエン酸三ナトリウムの効率を示す。
【図２８】図２８ａ及び２８ｂは、４℃及び室温で高分子量（ＨＭＷ）キトサン（３００ｃｐｓ、９２％脱アセチル化、Ｖａｎｓｏｎ Ｈａｌｏｓｏｕｒｃｅ製）を塩析させる（即ち沈殿させる）、溶解したキトサンに対して１：１（２８ａ）及び４：１（２８ｂ）の比で用いた無機及び有機の塩析塩の相対的な効率を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサンを沈殿させる方法であって：キトサンポリマーを含有する酸性水溶液と少なくとも１種の無機塩又は有機塩とを任意の順序で混合することを含み、無機塩又は有機塩は、キトサンポリマーを塩析させて、少なくとも塩析したキトサンポリマーを含む水性組成物を形成するのに有効な量で存在する、前記方法。
【請求項２】
無機塩又は有機塩が食品適合性であるか又は生体医学的応用に好適である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性水溶液のｐＨが約２〜約６である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
沈殿が約４℃〜約５５℃で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
無機塩又は有機塩が、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及びプロピオン酸ナトリウムから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酸性水溶液が、酢酸、乳酸、リンゴ酸、及び塩酸から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２種の無機塩又は有機塩の組み合わせが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
塩の組み合わせがコスモトロピック塩とカオトロピック塩との組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
沈殿したキトサン量が溶液中のキトサン量の少なくとも９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
キトサンポリマーの分子量が約７ｋＤａ〜数百ｋＤａである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
キトサンポリマーのアセチル化度が約０％〜約５０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
塩析したキトサンを水で洗浄し、遠心によって酸性水溶液から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により得られたキトサン調製品。
【請求項１４】
ヒトの食用及び生体医学的応用に好適である、請求項１３に記載のキトサン調製品。
【請求項１５】
実質的にキトサナーゼを含まない、請求項１３に記載のキトサン調製品。
【請求項１６】
実質的に塩を含まない、請求項１３に記載のキトサン調製品。
【請求項１７】
キトサンが、沈殿後もその物理化学特性を保持している、請求項１２に記載のキトサン調製品。
【請求項１８】
胃の水性酸性環境に可溶性である、請求項１２に記載のキトサン調製品。
【請求項１９】
ｉ） 実質的にキトサナーゼを含まず；
ｉｉ） ヒトの食用に好適であり；
ｉｉｉ） 胃内のような水性酸性環境に可溶性であり；そして
ｉｖ） 実質的に沈殿塩を含まない、
キトサン調製品。
【請求項１】
キトサンを沈殿させる方法であって：キトサンポリマーを含有する酸性水溶液と少なくとも１種の無機塩又は有機塩とを任意の順序で混合することを含み、無機塩又は有機塩は、キトサンポリマーを塩析させて、少なくとも塩析したキトサンポリマーを含む水性組成物を形成するのに有効な量で存在する、前記方法。
【請求項２】
無機塩又は有機塩が食品適合性であるか又は生体医学的応用に好適である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性水溶液のｐＨが約２〜約６である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
沈殿が約４℃〜約５５℃で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
無機塩又は有機塩が、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及びプロピオン酸ナトリウムから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酸性水溶液が、酢酸、乳酸、リンゴ酸、及び塩酸から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２種の無機塩又は有機塩の組み合わせが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
塩の組み合わせがコスモトロピック塩とカオトロピック塩との組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
沈殿したキトサン量が溶液中のキトサン量の少なくとも９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
キトサンポリマーの分子量が約７ｋＤａ〜数百ｋＤａである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
キトサンポリマーのアセチル化度が約０％〜約５０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
塩析したキトサンを水で洗浄し、遠心によって酸性水溶液から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により得られたキトサン調製品。
【請求項１４】
ヒトの食用及び生体医学的応用に好適である、請求項１３に記載のキトサン調製品。
【請求項１５】
実質的にキトサナーゼを含まない、請求項１３に記載のキトサン調製品。
【請求項１６】
実質的に塩を含まない、請求項１３に記載のキトサン調製品。
【請求項１７】
キトサンが、沈殿後もその物理化学特性を保持している、請求項１２に記載のキトサン調製品。
【請求項１８】
胃の水性酸性環境に可溶性である、請求項１２に記載のキトサン調製品。
【請求項１９】
ｉ） 実質的にキトサナーゼを含まず；
ｉｉ） ヒトの食用に好適であり；
ｉｉｉ） 胃内のような水性酸性環境に可溶性であり；そして
ｉｖ） 実質的に沈殿塩を含まない、
キトサン調製品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公表番号】特表２００７−５１７９３９（Ｐ２００７−５１７９３９Ａ）
【公表日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４８０５０（Ｐ２００６−５４８０５０）
【出願日】平成１６年１２月２４日（２００４．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００２２０２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６６２１３
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（５０４１３３７７４）ユニヴェルシテ・ドゥ・シャーブルック (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２４日（２００４．１２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００２２０２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６６２１３
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【出願人】（５０４１３３７７４）ユニヴェルシテ・ドゥ・シャーブルック (1)
【Ｆターム（参考）】
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