【課題】対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間に形成される結合よりも安定なデハロゲナーゼ基質との結合を形成しかつキネティクス及び機能発現が高められた突然変異デハロゲナーゼを提供する。
【解決手段】対応する野生型デハロゲナーゼの配列中、５８、７８、１５５、１７２、２２４、２９１及び２９２の位置において、機能発現又は結合キネティクスを改善する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、突然変異デハロゲナーゼ。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数の官能基を有するデハロゲナーゼ基質と結合を形成できる突然変異デハロゲナーゼであって、前記結合が、対応する野生型デハロゲナーゼと該基質との間に形成される結合よりも安定であり、
前記突然変異デハロゲナーゼが、機能発現又は結合キネティクスを改善する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、更に、残基において少なくとも１つの置換を有し、該残基が、
(i) 対応する野生型デハロゲナーゼと基質との間で形成される結合を切断する水分子の活性化に関係するか、又は
(ii) 基質とエステル中間体を形成するものであり、
機能発現又は結合キネティクスを改善する少なくとも１つの置換が、配列番号１における５８、７８、１５５、１７２、２２４、２９１及び２９２の位置であることを特徴とする突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、以下にアミノ酸置換を有する突然変異デハロゲナーゼ。
(i) 配列番号１の１０６又は２７２の位置、及び
(ii) 配列番号１の５８、７８、１５５、１７２、２２４、２９１及び２９２の位置。
【請求項３】
１７５、１７６、２７２又は２７３、若しくはそれらの複数の位置に更に置換を有する請求項１又は２に記載の突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項４】
水分子の活性化又はエステル中間体の形成に関連する残基における前記アミノ酸置換が、配列番号１の１０６又は２７２である請求項１又は３に記載の突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項５】
配列番号１の４７、８７、８８、１２８、１６０、１６７、１９５、２２７、２５７及び２６４の位置に更に置換を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項６】
配列番号１の２９４及び２９５の位置に更に置換を有する請求項１〜５のいずれか１項に突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項７】
配列番号１において、２７２に対応する残基に置換を有し、更に、１７５、１７６又は２７３の位置に対応する１又は複数の置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸置換が、Ｓ５８Ｔ、Ｄ７８Ｇ、Ａ１５５Ｔ、Ａ１７２Ｔ、Ａ２２４Ｅ、F２７２Ｎ、Ｐ２９１Ｓ及びＡ２９２Ｔである請求項１〜４のいずれか１項に突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸置換が、以下のものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の突然変異デハロゲナーゼ。
L47V、S58T、D78G、Y87F、L88M、C128F、A155T、E160K、A167V、A172T、K195N、A224E、N227D、E257K、T264A、F272N、P291S及びA292T
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸置換が、以下の置換であり、かつ更に、294〜297の位置にGlu-Ile-Ser-Glyを有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の突然変異デハロゲナーゼ。
L47V、S58T、D78G、Y87F、L88M、C128F、A155T、E160K、A167V、A172T、K195N、A224E、N227D、E257K、T264A、F272N、P291S及びA292T
【請求項１１】
配列番号23、配列番号26、配列番号27、配列番号43、配列番号46又は配列番号47から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１〜１０のいずれかに記載の突然変異デハロゲナーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の突然変異デハロゲナーゼ及び注目のタンパク質を含む融合ポリペプチド。
【請求項１３】
変異体の存在を測定する方法であって、以下の工程、
１．請求項１〜１１のいずれかに記載の突然変異デハロゲナーゼを有する試料を、１又は複数の官能基を含むデハロゲナーゼ基質と接触する工程、及び
２．前記官能基の存在又は量を検出又は測定して、突然変異デハロゲナーゼの存在又は量を検出又は測定する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
細胞を標識する方法であって、以下の工程、
１．請求項１〜１１のいずれかに記載の突然変異デハロゲナーゼを含む細胞を有する試料を、１又は複数の官能基を含むデハロゲナーゼ基質と接触する工程、及び
２．前記試料における前記官能基の存在又は量を検出又は測定する工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
突然変異デハロゲナーゼが注目のタンパク質又は分子と融合される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
注目のタンパク質を単離する方法であって、以下の工程、
１．１又は複数の融合ポリペプチドであって、少なくとも１つの融合ポリペプチドが、請求項１２に記載の融合ポリペプチドを含む試料と、１又は複数のデハロゲナーゼ基質を有する固体支持体とを提供する工程、及び
２．前記試料及び固体支持体を接触させて、注目のタンパク質を単離する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記基質が、式（Ｉ）：Ｒ−リンカー−Ａ−Ｘの化合物であり、前記式中、該リンカーは、炭素原子数２〜３０の分枝状又は無分枝状炭素鎖であり、該鎖は任意には１又は複数の二重結合又は三重結合を含み、また該鎖は任意には、１又は複数のヒドロキシ又はオキソ（＝Ｏ）基で置換されており、該鎖内炭素原子の１つ又は２つ以上が任意に、非過酸化物−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−で置換されており、該リンカー−Ａは、炭素鎖内の少なくとも１１個の原子によってＲとＸとを分離し、Ａ−Ｘはデハロゲナーゼに対する基質であり、Ａは（ＣＨ₂）_nであり、そしてｎ＝２〜１０であり、Ｘはハロゲンである、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒが、１又は複数の官能基、光学的に検出可能な分子又は固体支持体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記鎖内炭素原子の１又は複数が、アリール又はヘテロアリール環で置換されている、請求項１７又は１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘが塩素又は臭素である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の第１突然変異デハロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１２に記載の融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記融合が、第１の突然変異デハロゲナーゼと、注目のタンパク質との間にプロテアーゼ認識配列を有するコネクタ配列を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図１Ｅ】

【図１Ｆ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３−１】

【図３−２】

【図４−１】

【図４−２】

【図４−３】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９−１】

【図１９−２】

【図１９−３】

【図１９−４】

【図１９−５】

【図１９−６】

【図１９−７】

【図１９−８】

【図１９−９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【公開番号】特開２０１３−７８３２９（Ｐ２０１３−７８３２９Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２６４７１３（Ｐ２０１２−２６４７１３）
【出願日】平成２４年１２月３日（２０１２．１２．３）
【分割の表示】特願２００９−５３４７１７（Ｐ２００９−５３４７１７）の分割
【原出願日】平成１９年１０月３０日（２００７．１０．３０）
【出願人】（５９３０８９１４９）プロメガ　コーポレイション (57)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】