キノコ由来の炎症性物質放出抑制剤の製造方法
【課題】キノコ由来の炎症性物質放出抑制剤を食品及び医薬品として利用するためにキノコから該炎症性物質放出抑制剤の有効成分を選択的に抽出する方法を開発すること。
【解決手段】キノコ組織を８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップ及び／又はキノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法と、該方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物及び医薬品組成物とを提供する。
【解決手段】キノコ組織を８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップ及び／又はキノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法と、該方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物及び医薬品組成物とを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ由来の炎症性物質放出抑制剤の製造方法と、該方法により製造される炎症性物質放出抑制剤を含む食品組成物及び医薬品組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
花粉やダニ、各種食品に対するアレルギー患者やアトピー性皮膚炎の患者数は年々増加しており、症状を緩和する治療法（減感作療法）、治療薬（抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、ステロイド剤）、食品の開発が行われている。
【０００３】
発明者らは花粉症や食物アレルギーなどＩ型アレルギーの代表的原因物質であるヒスタミンの放出抑制能を指標として各種食用キノコの抗アレルギー活性を調べ、ブナシメジに最も強い活性があることを確認した。しかし、従来の抽出法では抗アレルギー活性は十分ではない。
【０００４】
以下の特許文献１にはキノコの熱水抽出物がヒスタミンの放出抑制効果を有することが開示されるが、その効果は熱水抽出物の最終濃度を５０μｇ／ｍＬとしたときのものである。
【特許文献１】特開２００６−３４７９９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
キノコ由来の炎症性物質放出抑制剤を食品及び医薬品として利用するために、キノコから前記炎症性物質放出抑制剤の有効成分を選択的に抽出する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、キノコ組織を８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法は、前記浸漬するステップの前に、前記キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含む場合がある。
【０００８】
本発明は、キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法は、前記圧力を加えるステップの後に、８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含む場合がある。
【００１０】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法は、前記浸漬するステップの後に、前記抽出溶液を分画して高分子画分を得るステップを含む場合がある。
【００１１】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法において、前記キノコはブナシメジの場合がある。
【００１２】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法において、前記高分子画分は分子量１万ないしそれ以上の分子を含む場合がある。
【００１３】
本発明は、本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする医薬品組成物を提供する。
【００１５】
本明細書において、キノコは、ブナシメジの他に、ホンシメジ、ハタケシメジ、シイタケ、マツタケ、エノキ、エリンギ、マイタケ、ハナビラタケ、カバノアナタケ、ブナハリタケ、カラカサタケモドキ、シロアギタケ、ヤマブシタケ、カンゾウタケ、タモギタケ、アガリクス、メシマコブ等を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書において、キノコ組織は、キノコの菌糸体又は子実体と、該菌糸体又は子実体をせん断、開裂、粉砕その他の物理的処理を施して得られる断片とを含む。断片の大きさは、キノコの種類又は子実体全体の大きさに応じて異なるが、本発明の方法によりヒスタミン放出抑制剤を製造することができる程度に小さいことを条件として、いかなる大きさでもかまわない。約１０ｍｍ角ないし約２ｍｍ角の大きさのキノコ組織が好ましく、約５ｍｍ角ないし約３ｍｍ角の大きさのキノコ組織がより好ましい。
【００１７】
本明細書において、キノコ組織を浸漬する抽出溶液は酸又はアルカリを添加してｐＨを調整した液体であって、一般に沸騰状態又はそれに近い状態にある８０−１００°Ｃの温度のものをいう。前記抽出溶液は水を主成分とする。抽出溶液には、メタノール、エタノールその他のアルコールとアセトンとを含むがこれらに限定されない有機溶媒を含む場合がある。前記抽出溶液中の有機溶媒の濃度は５０％以下の場合がある。食品分析における多糖類の抽出方法では１０−２０％のメタノールを含む水溶液を用いる場合がある（真部孝明、フローチャートで見る食品分析の実際、幸書房、２００３年）。なお、特記のない場合には、本発明のキノコ組織は常温常圧の条件下で処理される。前記抽出溶液は、前記キノコ組織を浸漬した後で加熱されて８０−１００°Ｃの温度に達する場合の他、予め８０−１００°Ｃに加熱された前記抽出溶液に常温のキノコ組織が投入される場合もある。前記キノコ組織を８０−１００°Ｃの前記抽出溶液中で浸漬する時間は、本発明の方法によりヒスタミン放出抑制剤を製造することができることを条件として、いかなる長さでもかまわない。１５ないし１２０分間が好ましく、２０ないし６０分間がより好ましく、３０分間が最も好ましい。
【００１８】
本明細書において、２００−６００ＭＰａの圧力は、日機装株式会社、神戸製鋼所その他によって製造される食品用冷間等方圧プレス装置によって発生させることができる。２００−６００ＭＰａの圧力を加える時間は、本発明の方法によりヒスタミン放出抑制剤を製造することができることを条件として、いかなる長さでもかまわない。５ないし６０分間が好ましく、１０ないし３０分間がより好ましく、１５分間が最も好ましい。
【００１９】
本明細書において、抽出溶液から高分子画分を得るためには、ゲル濾過液体クロマトグラフィー法の他、限外濾過法、透析法、有機溶媒沈澱法及び塩析法を含むがこれらに限定されないさまざまな方法を用いることができる。
【００２０】
本明細書において、ヒスタミン放出抑制剤とは、マスト細胞や好塩基球などヒスタミンを産生する細胞からヒスタミンの放出を抑制する効果を奏する薬剤をいう。前記細胞は、ヒスタミンを細胞内に蓄積していて、ヒスタミン放出誘発剤により細胞外にヒスタミンを放出する能力があることを条件として、動物から回収された新鮮な細胞であっても、株化された培養細胞であってもよい。前記ヒスタミン放出誘発剤は、アレルギー反応と同じ機構でヒスタミン放出を誘発することができるいかなる物質でもかまわないが、ダニ、花粉、その他ヒトにおけるアレルゲンが好ましい。本明細書において、ヒスタミンの定量は当業者に周知のいずれかの方法によって定量される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明の実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
１．材料と方法
１．１熱水抽出物の調製
実験材料として用いたキノコは、白色ブナシメジ（ホクト白１号菌、ホクト株式会社）であった。約５ｍｍ角に包丁で切ったキノコ１２．５ｇを沸騰した超純水１００ｍＬに加え３０分間煮沸した。これをろ紙でろ過し、得られたろ液を凍結乾燥した。以下のｐＨ処理及び超高圧処理を両方とも行わないで熱水抽出物を得ることを以下では「従来法」という。
【００２３】
１．２さまざまなｐＨでの処理
酢酸又はＮａＯＨを用いて超純水のｐＨを３−１１に調整し、これらを用いて前記１．１に記載の方法で熱水抽出物を調製した。なお、熱水抽出で得られた各ｐＨの抽出液は中和後、凍結乾燥した。
【００２４】
１．３超高圧処理
約５ｍｍ角に包丁で切ったキノコ１２．５ｇをポリエチレン袋に入れて密封し、それをさらに水を入れたポリエチレン袋に入れて密封した。これに０°Ｃの静水圧中で１５分間、超高圧装置（ＮＢＩＰ４５−１２０−７０、日機装株式会社）にて２００、４００又は６００ＭＰａの圧力を加えた。超高圧処理の後、前記１．１又は１．２項に記載の方法で熱水抽出物を調製した。
【００２５】
１．４熱水抽出物の分子量による分画
熱水抽出物中の成分をＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー）を用いたゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ：島津製作所）により分子量の違いで分離した。熱水抽出物は１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、１回の分析に１００μＬを用いた。溶離液として超純水を流速１．０ｍＬ／分で流し、含有成分は示差屈折率検出器（ＲＩ−８０２０：東ソー）で検出した。高速液体クロマトグラフィーで分離した成分を分子量１万以上の高分子画分とそれ以下の低分子画分に分けて分取した後、各画分は凍結乾燥した。１ｍＬの熱水抽出物から得られた両画分を各々１ｍＬの超純水に溶解してヒスタミン放出抑制試験に用いた。
【００２６】
１．５ヒスタミン放出抑制試験の試料調製
凍結乾燥した熱水抽出物を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。これを１０，０００ｘｇで２０分間、室温で遠心し、得られた上清を熱水抽出物溶液としてヒスタミン放出抑制試験に用いた。
【００２７】
１．６ヒスタミン放出抑制試験
ヒト好塩基球様ＫＵ８１２Ｆ細胞０．５ｘ１０６個を１００μＬのＴｙｒｏｄｅ生理食塩水（ｐＨ７．３）に懸濁後、ダニアレルゲン（ＤＰ）に特異的なＩｇＥ抗体を含むダニアレルギー患者の血清１μＬを加え、３７°Ｃで９０分間インキュベートして細胞の表面にＩｇＥ抗体を結合させた。細胞をＴｙｒｏｄｅ生理食塩水で２回洗浄して結合していない抗体を除いた後、１００μＬのＴｙｒｏｄｅ生理食塩水に懸濁した。これにダニアレルゲン（ＤＰ）を終濃度１μｇ／ｍＬ、熱水抽出物溶液を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように加え、さらにＴｙｒｏｄｅ生理食塩水を加えて全量を６００μＬに合わせた。３７°Ｃで４５分間反応させた後、５分間氷冷して反応を停止した。反応液を１，５００ｘｇ、４分間、４°Ｃで遠心し、上清を分取してヒスタミン放出誘発反応により細胞から遊離したヒスタミンを定量した。
【００２８】
１．７ヒスタミンの定量
０．３８ｇのＮａＣｌを入れた１５ｍＬ容遠心管に２５０μＬの上清と、７５０μＬのＴｙｒｏｄｅ生理食塩水と、２．５ｍＬのブタノール／クロロホルム（３：２（ｖ／ｖ））を加えて４分間激しく振とうした。１，５００ｘｇ、４分間、室温で遠心し、上清を２ｍＬ分取した。これに７５０μＬの０．１Ｎ ＨＣｌと１ｍＬのヘプタンとを加えて再び４分間激しく振とうした後、１，５００ｘｇ、４分間、室温で遠心し、パスツールピペットで上層を除いて下層を５００μＬ分取した。これに７５μＬの１Ｎ ＮａＯＨと、５０μＬの０．２％ｏ−フタルアルデヒドを含むメタノールとを加え蛍光化反応を開始し、５分後に７５μＬの０．５Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止した。反応液の蛍光強度を蛍光光度計を用いて励起波長３６０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍで測定した。
【００２９】
１．８ヒスタミン放出率及びヒスタミン放出抑制率
ヒスタミン標準液を用いて作成した検量線によりヒスタミンの濃度を求め、以下の式によりヒスタミン放出率およびヒスタミン放出抑制率を算出した。
ヒスタミン放出率（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）ｘ１００
Ａ：熱水抽出物等の存在下又は非存在下でヒスタミン放出誘発剤を投与する際にＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
Ｂ：細胞に含まれる全ヒスタミン量
Ｃ：熱水抽出物等及びヒスタミン放出誘発剤を投与しないときにＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
ヒスタミン放出抑制率（％）＝｛（Ａ−Ｃ）−（Ｂ−Ｃ）｝／（Ａ−Ｃ）ｘ１００
Ａ：熱水抽出物等の非存在下でヒスタミン放出誘発剤を投与する際にＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
Ｂ：熱水抽出物等の存在下でヒスタミン放出誘発剤を投与する際にＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
Ｃ：熱水抽出物等及びヒスタミン放出誘発剤を投与しないときにＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
【実施例２】
【００３０】
２．結果
２．１超高圧処理の影響
図１に超高圧処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示す。図１からわかるとおり、ダニアレルゲン（ＤＰ）を加えると細胞内のヒスタミンが４２％放出されたが、これに熱水抽出物（従来法）を添加しておくと放出が３１％に抑えられた。さらに超高圧処理した白色ブナシメジを熱水抽出に用いることでヒスタミンの放出を大きく低減させることができた。特に６００ＭＰａ前処理ではヒスタミンの放出は約１／４に抑えられた。
【実施例３】
【００３１】
２．２ｐＨ処理の影響
図２に異なるｐＨ処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示す。図２からわかるとおり、各ｐＨで調製した熱水抽出物を加えることでアレルゲンによるヒスタミンの放出を抑制することができた。従来法の熱水抽出はｐＨ６での抽出であり、これよりも酸性側ではヒスタミン放出の抑制効果は低く、アルカリ側での抽出において高い放出抑制効果が見られた。
【実施例４】
【００３２】
２．３超高圧処理とアルカリ処理の相乗効果
図３−１に異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出率を示す。図３−１からわかるとおり、従来法で調製した白色ブナシメジ熱水抽出物よりもキノコを６００ＭＰａで前処理して調製した熱水抽出物の方がヒスタミン放出率は顕著に低くなった。また、ｐＨ１１でのアルカリ処理のほうが６００ＭＰａでの超高圧処理よりもヒスタミン放出率は低かった。さらに、これら２つの処理を組み合わせると各々単独の処理よりも低い放出率を示し、若干ではあるが相乗効果が見られた。
【００３３】
図３−２に異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出抑制率を示す。図３−１からわかるとおり、２つの処理を組み合わせた時のヒスタミン放出阻害率は９０％で、従来法である熱水抽出の３倍以上の高い阻害率を示した。
【実施例５】
【００３４】
２．４熱水抽出物中の分子量分画のヒスタミン放出抑制活性
図４は、熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにより高分子量画分（１万以上）と低分子量画分（１万未満）に分け、ヒスタミン放出抑制能を調べた結果を示す。図４からわかるとおり、ヒスタミン放出抑制活性は高分子画分で高く、ヒスタミン放出抑制活性物質は高分子化合物であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】超高圧処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示すグラフ。
【図２】異なるｐＨ処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示すグラフ。
【図３−１】異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出率を示すグラフ。
【図３−２】異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出抑制率を示すグラフ。
【図４】熱水抽出物中の分子量分画のヒスタミン放出抑制活性を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノコ由来の炎症性物質放出抑制剤の製造方法と、該方法により製造される炎症性物質放出抑制剤を含む食品組成物及び医薬品組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
花粉やダニ、各種食品に対するアレルギー患者やアトピー性皮膚炎の患者数は年々増加しており、症状を緩和する治療法（減感作療法）、治療薬（抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、ステロイド剤）、食品の開発が行われている。
【０００３】
発明者らは花粉症や食物アレルギーなどＩ型アレルギーの代表的原因物質であるヒスタミンの放出抑制能を指標として各種食用キノコの抗アレルギー活性を調べ、ブナシメジに最も強い活性があることを確認した。しかし、従来の抽出法では抗アレルギー活性は十分ではない。
【０００４】
以下の特許文献１にはキノコの熱水抽出物がヒスタミンの放出抑制効果を有することが開示されるが、その効果は熱水抽出物の最終濃度を５０μｇ／ｍＬとしたときのものである。
【特許文献１】特開２００６−３４７９９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
キノコ由来の炎症性物質放出抑制剤を食品及び医薬品として利用するために、キノコから前記炎症性物質放出抑制剤の有効成分を選択的に抽出する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、キノコ組織を８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法は、前記浸漬するステップの前に、前記キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含む場合がある。
【０００８】
本発明は、キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法は、前記圧力を加えるステップの後に、８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含む場合がある。
【００１０】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法は、前記浸漬するステップの後に、前記抽出溶液を分画して高分子画分を得るステップを含む場合がある。
【００１１】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法において、前記キノコはブナシメジの場合がある。
【００１２】
本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法において、前記高分子画分は分子量１万ないしそれ以上の分子を含む場合がある。
【００１３】
本発明は、本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明のヒスタミン放出抑制剤の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする医薬品組成物を提供する。
【００１５】
本明細書において、キノコは、ブナシメジの他に、ホンシメジ、ハタケシメジ、シイタケ、マツタケ、エノキ、エリンギ、マイタケ、ハナビラタケ、カバノアナタケ、ブナハリタケ、カラカサタケモドキ、シロアギタケ、ヤマブシタケ、カンゾウタケ、タモギタケ、アガリクス、メシマコブ等を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書において、キノコ組織は、キノコの菌糸体又は子実体と、該菌糸体又は子実体をせん断、開裂、粉砕その他の物理的処理を施して得られる断片とを含む。断片の大きさは、キノコの種類又は子実体全体の大きさに応じて異なるが、本発明の方法によりヒスタミン放出抑制剤を製造することができる程度に小さいことを条件として、いかなる大きさでもかまわない。約１０ｍｍ角ないし約２ｍｍ角の大きさのキノコ組織が好ましく、約５ｍｍ角ないし約３ｍｍ角の大きさのキノコ組織がより好ましい。
【００１７】
本明細書において、キノコ組織を浸漬する抽出溶液は酸又はアルカリを添加してｐＨを調整した液体であって、一般に沸騰状態又はそれに近い状態にある８０−１００°Ｃの温度のものをいう。前記抽出溶液は水を主成分とする。抽出溶液には、メタノール、エタノールその他のアルコールとアセトンとを含むがこれらに限定されない有機溶媒を含む場合がある。前記抽出溶液中の有機溶媒の濃度は５０％以下の場合がある。食品分析における多糖類の抽出方法では１０−２０％のメタノールを含む水溶液を用いる場合がある（真部孝明、フローチャートで見る食品分析の実際、幸書房、２００３年）。なお、特記のない場合には、本発明のキノコ組織は常温常圧の条件下で処理される。前記抽出溶液は、前記キノコ組織を浸漬した後で加熱されて８０−１００°Ｃの温度に達する場合の他、予め８０−１００°Ｃに加熱された前記抽出溶液に常温のキノコ組織が投入される場合もある。前記キノコ組織を８０−１００°Ｃの前記抽出溶液中で浸漬する時間は、本発明の方法によりヒスタミン放出抑制剤を製造することができることを条件として、いかなる長さでもかまわない。１５ないし１２０分間が好ましく、２０ないし６０分間がより好ましく、３０分間が最も好ましい。
【００１８】
本明細書において、２００−６００ＭＰａの圧力は、日機装株式会社、神戸製鋼所その他によって製造される食品用冷間等方圧プレス装置によって発生させることができる。２００−６００ＭＰａの圧力を加える時間は、本発明の方法によりヒスタミン放出抑制剤を製造することができることを条件として、いかなる長さでもかまわない。５ないし６０分間が好ましく、１０ないし３０分間がより好ましく、１５分間が最も好ましい。
【００１９】
本明細書において、抽出溶液から高分子画分を得るためには、ゲル濾過液体クロマトグラフィー法の他、限外濾過法、透析法、有機溶媒沈澱法及び塩析法を含むがこれらに限定されないさまざまな方法を用いることができる。
【００２０】
本明細書において、ヒスタミン放出抑制剤とは、マスト細胞や好塩基球などヒスタミンを産生する細胞からヒスタミンの放出を抑制する効果を奏する薬剤をいう。前記細胞は、ヒスタミンを細胞内に蓄積していて、ヒスタミン放出誘発剤により細胞外にヒスタミンを放出する能力があることを条件として、動物から回収された新鮮な細胞であっても、株化された培養細胞であってもよい。前記ヒスタミン放出誘発剤は、アレルギー反応と同じ機構でヒスタミン放出を誘発することができるいかなる物質でもかまわないが、ダニ、花粉、その他ヒトにおけるアレルゲンが好ましい。本明細書において、ヒスタミンの定量は当業者に周知のいずれかの方法によって定量される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明の実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
１．材料と方法
１．１熱水抽出物の調製
実験材料として用いたキノコは、白色ブナシメジ（ホクト白１号菌、ホクト株式会社）であった。約５ｍｍ角に包丁で切ったキノコ１２．５ｇを沸騰した超純水１００ｍＬに加え３０分間煮沸した。これをろ紙でろ過し、得られたろ液を凍結乾燥した。以下のｐＨ処理及び超高圧処理を両方とも行わないで熱水抽出物を得ることを以下では「従来法」という。
【００２３】
１．２さまざまなｐＨでの処理
酢酸又はＮａＯＨを用いて超純水のｐＨを３−１１に調整し、これらを用いて前記１．１に記載の方法で熱水抽出物を調製した。なお、熱水抽出で得られた各ｐＨの抽出液は中和後、凍結乾燥した。
【００２４】
１．３超高圧処理
約５ｍｍ角に包丁で切ったキノコ１２．５ｇをポリエチレン袋に入れて密封し、それをさらに水を入れたポリエチレン袋に入れて密封した。これに０°Ｃの静水圧中で１５分間、超高圧装置（ＮＢＩＰ４５−１２０−７０、日機装株式会社）にて２００、４００又は６００ＭＰａの圧力を加えた。超高圧処理の後、前記１．１又は１．２項に記載の方法で熱水抽出物を調製した。
【００２５】
１．４熱水抽出物の分子量による分画
熱水抽出物中の成分をＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー）を用いたゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ：島津製作所）により分子量の違いで分離した。熱水抽出物は１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、１回の分析に１００μＬを用いた。溶離液として超純水を流速１．０ｍＬ／分で流し、含有成分は示差屈折率検出器（ＲＩ−８０２０：東ソー）で検出した。高速液体クロマトグラフィーで分離した成分を分子量１万以上の高分子画分とそれ以下の低分子画分に分けて分取した後、各画分は凍結乾燥した。１ｍＬの熱水抽出物から得られた両画分を各々１ｍＬの超純水に溶解してヒスタミン放出抑制試験に用いた。
【００２６】
１．５ヒスタミン放出抑制試験の試料調製
凍結乾燥した熱水抽出物を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解した。これを１０，０００ｘｇで２０分間、室温で遠心し、得られた上清を熱水抽出物溶液としてヒスタミン放出抑制試験に用いた。
【００２７】
１．６ヒスタミン放出抑制試験
ヒト好塩基球様ＫＵ８１２Ｆ細胞０．５ｘ１０６個を１００μＬのＴｙｒｏｄｅ生理食塩水（ｐＨ７．３）に懸濁後、ダニアレルゲン（ＤＰ）に特異的なＩｇＥ抗体を含むダニアレルギー患者の血清１μＬを加え、３７°Ｃで９０分間インキュベートして細胞の表面にＩｇＥ抗体を結合させた。細胞をＴｙｒｏｄｅ生理食塩水で２回洗浄して結合していない抗体を除いた後、１００μＬのＴｙｒｏｄｅ生理食塩水に懸濁した。これにダニアレルゲン（ＤＰ）を終濃度１μｇ／ｍＬ、熱水抽出物溶液を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように加え、さらにＴｙｒｏｄｅ生理食塩水を加えて全量を６００μＬに合わせた。３７°Ｃで４５分間反応させた後、５分間氷冷して反応を停止した。反応液を１，５００ｘｇ、４分間、４°Ｃで遠心し、上清を分取してヒスタミン放出誘発反応により細胞から遊離したヒスタミンを定量した。
【００２８】
１．７ヒスタミンの定量
０．３８ｇのＮａＣｌを入れた１５ｍＬ容遠心管に２５０μＬの上清と、７５０μＬのＴｙｒｏｄｅ生理食塩水と、２．５ｍＬのブタノール／クロロホルム（３：２（ｖ／ｖ））を加えて４分間激しく振とうした。１，５００ｘｇ、４分間、室温で遠心し、上清を２ｍＬ分取した。これに７５０μＬの０．１Ｎ ＨＣｌと１ｍＬのヘプタンとを加えて再び４分間激しく振とうした後、１，５００ｘｇ、４分間、室温で遠心し、パスツールピペットで上層を除いて下層を５００μＬ分取した。これに７５μＬの１Ｎ ＮａＯＨと、５０μＬの０．２％ｏ−フタルアルデヒドを含むメタノールとを加え蛍光化反応を開始し、５分後に７５μＬの０．５Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止した。反応液の蛍光強度を蛍光光度計を用いて励起波長３６０ｎｍ、測定波長４４０ｎｍで測定した。
【００２９】
１．８ヒスタミン放出率及びヒスタミン放出抑制率
ヒスタミン標準液を用いて作成した検量線によりヒスタミンの濃度を求め、以下の式によりヒスタミン放出率およびヒスタミン放出抑制率を算出した。
ヒスタミン放出率（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）ｘ１００
Ａ：熱水抽出物等の存在下又は非存在下でヒスタミン放出誘発剤を投与する際にＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
Ｂ：細胞に含まれる全ヒスタミン量
Ｃ：熱水抽出物等及びヒスタミン放出誘発剤を投与しないときにＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
ヒスタミン放出抑制率（％）＝｛（Ａ−Ｃ）−（Ｂ−Ｃ）｝／（Ａ−Ｃ）ｘ１００
Ａ：熱水抽出物等の非存在下でヒスタミン放出誘発剤を投与する際にＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
Ｂ：熱水抽出物等の存在下でヒスタミン放出誘発剤を投与する際にＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
Ｃ：熱水抽出物等及びヒスタミン放出誘発剤を投与しないときにＴｙｒｏｄｅ生理食塩水中に放出されるヒスタミン量
【実施例２】
【００３０】
２．結果
２．１超高圧処理の影響
図１に超高圧処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示す。図１からわかるとおり、ダニアレルゲン（ＤＰ）を加えると細胞内のヒスタミンが４２％放出されたが、これに熱水抽出物（従来法）を添加しておくと放出が３１％に抑えられた。さらに超高圧処理した白色ブナシメジを熱水抽出に用いることでヒスタミンの放出を大きく低減させることができた。特に６００ＭＰａ前処理ではヒスタミンの放出は約１／４に抑えられた。
【実施例３】
【００３１】
２．２ｐＨ処理の影響
図２に異なるｐＨ処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示す。図２からわかるとおり、各ｐＨで調製した熱水抽出物を加えることでアレルゲンによるヒスタミンの放出を抑制することができた。従来法の熱水抽出はｐＨ６での抽出であり、これよりも酸性側ではヒスタミン放出の抑制効果は低く、アルカリ側での抽出において高い放出抑制効果が見られた。
【実施例４】
【００３２】
２．３超高圧処理とアルカリ処理の相乗効果
図３−１に異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出率を示す。図３−１からわかるとおり、従来法で調製した白色ブナシメジ熱水抽出物よりもキノコを６００ＭＰａで前処理して調製した熱水抽出物の方がヒスタミン放出率は顕著に低くなった。また、ｐＨ１１でのアルカリ処理のほうが６００ＭＰａでの超高圧処理よりもヒスタミン放出率は低かった。さらに、これら２つの処理を組み合わせると各々単独の処理よりも低い放出率を示し、若干ではあるが相乗効果が見られた。
【００３３】
図３−２に異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出抑制率を示す。図３−１からわかるとおり、２つの処理を組み合わせた時のヒスタミン放出阻害率は９０％で、従来法である熱水抽出の３倍以上の高い阻害率を示した。
【実施例５】
【００３４】
２．４熱水抽出物中の分子量分画のヒスタミン放出抑制活性
図４は、熱水抽出物をゲルろ過クロマトグラフィーにより高分子量画分（１万以上）と低分子量画分（１万未満）に分け、ヒスタミン放出抑制能を調べた結果を示す。図４からわかるとおり、ヒスタミン放出抑制活性は高分子画分で高く、ヒスタミン放出抑制活性物質は高分子化合物であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】超高圧処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示すグラフ。
【図２】異なるｐＨ処理で調製した熱水抽出物のヒスタミン放出率を示すグラフ。
【図３−１】異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出率を示すグラフ。
【図３−２】異なる処理で調製された熱水抽出物のヒスタミン放出抑制率を示すグラフ。
【図４】熱水抽出物中の分子量分画のヒスタミン放出抑制活性を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キノコ組織を８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法。
【請求項２】
前記浸漬するステップの前に、前記キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記浸漬するステップの後に、前記抽出溶液を分画して、分子量１万ないしそれ以上の分子を含む画分を得るステップを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記キノコはブナシメジであることを特徴とする請求項１−３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１−４のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物。
【請求項６】
請求項１−４のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
【請求項７】
キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法。
【請求項８】
前記圧力を加えるステップの後に、８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記浸漬するステップの後に、前記抽出溶液を分画して分子量１万ないしそれ以上の分子を含む画分を得るステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記キノコはブナシメジであることを特徴とする請求項７−９のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項７−１０のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物。
【請求項１２】
請求項７−１０のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１】
キノコ組織を８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法。
【請求項２】
前記浸漬するステップの前に、前記キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記浸漬するステップの後に、前記抽出溶液を分画して、分子量１万ないしそれ以上の分子を含む画分を得るステップを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記キノコはブナシメジであることを特徴とする請求項１−３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１−４のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物。
【請求項６】
請求項１−４のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
【請求項７】
キノコ組織に２００−６００ＭＰａの圧力を加えるステップを含むことを特徴とするヒスタミン放出抑制剤の製造方法。
【請求項８】
前記圧力を加えるステップの後に、８０−１００°Ｃ、ｐＨ９−１４の抽出溶液に浸漬するステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記浸漬するステップの後に、前記抽出溶液を分画して分子量１万ないしそれ以上の分子を含む画分を得るステップを含むことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記キノコはブナシメジであることを特徴とする請求項７−９のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項７−１０のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする食品組成物。
【請求項１２】
請求項７−１０のいずれか１つに記載の製造方法により製造されるヒスタミン放出抑制剤を含むことを特徴とする医薬品組成物。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【公開番号】特開２００９−９６７４６（Ｐ２００９−９６７４６Ａ）
【公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６８６０３（Ｐ２００７−２６８６０３）
【出願日】平成１９年１０月１６日（２００７．１０．１６）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１６日（２００７．１０．１６）
【出願人】（３０４０２７２７９）国立大学法人 新潟大学 (310)
【Ｆターム（参考）】
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