キノプロテイングルコース脱水素酵素およびその製造方法
【課題】耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、温度安定性およびｐＨ安定性に優れたキノプロテイングルコース脱水素酵素の提供。
【解決手段】ピロバキュラム由来の、下記の性質を有するキノプロテイングルコース脱水素酵素。（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）：３３±６ｋＤａ（２）一量体タンパク質（３）最適ｐＨ：ｐＨ７〜９（４）最適温度：７５℃以上（５）温度安定性：８０℃以下（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１および、該酵素の製造方法、この酵素と補酵素との複合体、グルコース測定キット、前記酵素遺伝子、前記酵素遺伝子を含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体。
【解決手段】ピロバキュラム由来の、下記の性質を有するキノプロテイングルコース脱水素酵素。（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）：３３±６ｋＤａ（２）一量体タンパク質（３）最適ｐＨ：ｐＨ７〜９（４）最適温度：７５℃以上（５）温度安定性：８０℃以下（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１および、該酵素の製造方法、この酵素と補酵素との複合体、グルコース測定キット、前記酵素遺伝子、前記酵素遺伝子を含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノプロテイングルコース脱水素酵素およびその製造方法、前記酵素と補酵素との複合体、グルコース測定キット、前記酵素遺伝子、前記酵素遺伝子を含むベクター、ならびに前記ベクターを含む形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノプロテイングルコース脱水素酵素（ＥＣ １．１．５．２、以下、「キノプロテインＧＤＨ」という場合もある）は、ピロールキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」という場合もある）を補酵素とし、Ｄ−グルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを産生する反応を触媒するグルコース脱水素酵素である。
【０００３】
グルコース脱水素酵素は、近年、その基質特異性を利用した、酵素電池、バイオセンサー等に応用されている。このような応用の場面では、電力供給、測定精度等の安定化の観点から、幅広い条件下で利用できる酵素が望まれる。このため、従来、温度、ｐＨ等の安定性に優れた酵素開発が行われている（例えば、特許文献１および２等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０３６６６７号公報
【特許文献２】特開２００６−２６２７６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来のグルコース脱水素酵素は、温度およびｐＨ共に、優れた耐性と安定性を実現するという点からは、未だ十分とはいえなかった。そこで、本発明は、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、かつ温度安定性およびｐＨ安定性に優れた、グルコース脱水素酵素の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（１）から（６）の性質を有することを特徴とする。
（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）：３３±６ｋＤａ
（２）一量体タンパク質
（３）最適ｐＨ：ｐＨ７〜９
（４）最適温度：７５℃以上
（５）温度安定性：８０℃以下
（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１
【０００７】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体は、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素と、ピロールキノリンキノンとを含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明のグルコース測定キットは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素および本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００１０】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子であることを特徴とする。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【００１１】
本発明の発現ベクターは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素の製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、温度安定性およびｐＨ安定性に優れるため、高温、高ｐＨおよび低ｐＨ条件下でも、高い酵素活性が維持される。このため、本発明の酵素によれば、幅広い温度またはｐＨ条件下において、化学反応を安定的に触媒可能である。また、本発明の酵素は、一般的な酵素と比べてその耐熱性および耐ｐＨ性に優れるため、製造工程で熱処理またはｐＨ処理を行うことにより、他の酵素と容易に分離できる。このため、本発明の酵素は、製造性にも優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の酵素の一例について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果を示す写真である。
【図２】図２は、本発明の酵素の一例について、最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の酵素の一例および本発明の酵素−補酵素複合体の一例について、温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の酵素の一例について、最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の酵素の一例について、ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の酵素の一例について、ＰＱＱ濃度と酵素活性との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の酵素の一例および本発明の酵素−補酵素複合体の一例について、２５０〜５５０ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、例えば、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体に由来するのが好ましい。前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体が好ましい。前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株であるのが好ましい。なお、前記ＩＭ２株のゲノムは公知であるが、ゲノム上にキノプロテイングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子があることを見出したのは、本発明者が初めてである。
【００１７】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。
【００１８】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質からなることが好ましい。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００１９】
また、別の局面では、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とする。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００２０】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。
【００２１】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（４）および（６）からなる群から選択される少なくとも一つの性質を有するのが好ましい。
（４）最適温度：７５℃以上
（５）温度安定性：８０℃以下
（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１
【００２２】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、例えば、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体に由来するのが好ましい。前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体が好ましい。前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株であるのが好ましい。
【００２３】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体は、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素と、ピロールキノリンキノンとを含むことを特徴とする。
【００２４】
前記別の局面において、本発明のグルコース測定キットは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素および本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【００２５】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００２６】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子であることを特徴とする。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【００２７】
前記別の局面において、本発明の発現ベクターは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子を含むことを特徴とする。
【００２８】
前記別の局面において、本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含むことを特徴とする。
【００２９】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素の製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。
【００３０】
以下に、本発明について、例をあげて説明する。なお、本発明は、これに限定されない。
【００３１】
＜本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素＞
（１）由来
本発明のキノプロテインＧＤＨの由来は、特に制限されないが、前述のように、例えば、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体が好ましい。前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体としては、特に制限されないが、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロバキュラム・アーセナティカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｒｓｅｎａｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム・カリディフォンティス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ）、ピロバキュラム・イスランディカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、ピロバキュラム・オギュニエンス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｏｇｕｎｉｅｎｓｅ）、ピロバキュラム・オルガノトロファム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｕｍ）種が挙げられ、好ましくは、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体である。前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株が好ましい。本発明のキノプロテインＧＤＨは、組換えタンパク質である場合、例えば、前述のピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体由来のＤＮＡ断片を導入した形質転換体から得られたものであってもよい。本発明では、このような形質転換体由来のキノプロテインＧＤＨも、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体由来のキノプロテインＧＤＨに含まれる。前記形質転換体の宿主としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞等が挙げられる。前記大腸菌としては、特に制限されないが、例えば、Ｓ１７−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）等の菌株が挙げられる。
【００３２】
（２）採取方法
前記キノプロテインＧＤＨは、特に制限されないが、例えば、前記キノプロテインＧＤＨを発現する微生物の菌体、動物細胞、植物細胞、形質転換体等の細胞を培養し、その培養物から回収してもよい。前記細胞は、特に制限されないが、例えば、前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体、前記キノプロテインＧＤＨをコードする遺伝子を導入した形質転換体等が挙げられ、好ましくは、前記キノプロテインＧＤＨをコードする遺伝子を導入した形質転換体である。前記細胞の培養方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法等を採用できる。
【００３３】
前記培養物は、特に制限されないが、例えば、培養上清、培養細胞、細胞抽出物等が挙げられる。前記培養物は、例えば、前記培養上清、前記培養細胞、前記細胞抽出物等の処理物であってもよい。前記培養物の処理としては、特に制限されないが、例えば、濃縮、乾燥、凍結乾燥、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質分画、超音波処理、磨砕処理等が挙げられる。また、前記培養物は、例えば、前記培養上清、前記培養細胞、前記細胞抽出物、前記処理物等の混合物であってもよい。前記混合物は、構成物を任意の組み合わせおよび比率で混合することができ、特に制限されない。前記培養物からの前記キノプロテインＧＤＨの回収方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法等を採用できる。
【００３４】
（３）精製方法
前記キノプロテインＧＤＨは、例えば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、または、適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物から精製可能である。前記生化学的方法としては、特に制限されないが、例えば、硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられる。前記生化学的方法を組み合わせて精製する場合、例えば、精製工程毎に、キノプロテインＧＤＨ活性を測定し、前記活性の検出された分画物を選抜してもよい。前記活性の測定方法としては、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。
【００３５】
（４）分子量
前記キノプロテインＧＤＨは、前述のように、分子量が３３±６ｋＤａの一量体タンパク質である。なお、本発明において、前記分子量は、例えば、熱変性還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定値である。前記熱変性還元条件下は、例えば、タンパク質を加熱変性させ、２−メルカプトエタノール等の還元剤により、そのＳ−Ｓ結合を切断する条件下である。本発明のキノプロテインＧＤＨの分子量の理論値は、例えば、３８４５２Ｄａであってもよい。
【００３６】
（５）最適温度
前記キノプロテインＧＤＨの最適温度は、前述のように、７５℃以上である。また、前記キノプロテインＧＤＨは、７５℃におけるキノプロテインＧＤＨ活性を１００％としたときに、５０℃における前記活性が、２０〜４０％、６０℃における前記活性が、４０〜６０％、７０℃における前記活性が、７０〜９０％であってもよい。
【００３７】
（６）最適ｐＨ
前記キノプロテインＧＤＨの最適ｐＨは、前述のように、ｐＨ７〜９であり、好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５であり、より好ましくは、ｐＨ８である。
【００３８】
（７）温度安定性
前記キノプロテインＧＤＨは、前述のように、８０℃以下で安定である。なお、本発明において、「酵素が８０℃以下で安定である」とは、例えば、ｐＨ８、８０℃以下の条件下で酵素を１０分間熱処理し、５０℃で酵素活性を測定した場合に、残存酵素活性率（熱処理前の酵素活性率を１００％としたときの、熱処理後の酵素活性率）が高いことをいう。高い残存酵素活性率とは、特に制限されないが。例えば、６０〜１３０％であり、好ましくは、７０〜１２０％であり、より好ましくは、８０〜１１０％である。また、前記キノプロテインＧＤＨは、ｐＨ８、９０℃以下の条件下で酵素を１０分間熱処理し、５０℃で酵素活性を測定した場合に、例えば、残存酵素活性率が５０％以上であってもよい。
【００３９】
（８）ｐＨ安定性
前記キノプロテインＧＤＨは、前述のように、ｐＨ４〜１１で安定である。なお、本発明において、「酵素がｐＨ４〜１１で安定である」とは、例えば、ｐＨ４〜１１、７０℃の条件下で酵素を３０分間維持し、５０℃で酵素活性を測定した場合に、比活性（酵素活性が最も高いｐＨにおける酵素活性率を１００％としたときの酵素活性率）が高いことをいう。高い比活性とは、特に制限されないが、例えば、例えば、６０〜１００％であり、好ましくは、７０〜１００％であり、より好ましくは、８０〜１００％である。
【００４０】
このように、本発明のキノプロテインＧＤＨは、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、温度安定性およびｐＨ安定性にも優れる。なお、本発明において、「耐熱性に優れる」とは、例えば、高温条件下において、酵素活性を有することをいい、「耐ｐＨ性に優れる」とは、例えば、低ｐＨ条件および高ｐＨ条件下において、酵素活性を有することをいう。
【００４１】
（９）基質特異性
前記キノプロテインＧＤＨは、Ｄ−グルコースを基質とする。また、前記キノプロテインＧＤＨは、例えば、Ｄ−グルコース以外の、他の基質に対する酵素活性を有してもよい。前記他の基質としては、特に制限されないが、例えば、単糖、二糖、アミノ糖、ウロン酸等が挙げられる。前記単糖としては、例えば、エリトロース、トレオース、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、アピオース、アロース、ガラクトース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース等のアルドース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、タガロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、セドヘプツロース、コリオース等のケトースが挙げられる。前記二糖としては、例えば、トレハロース、マルトース、ラクトース、スクロース等が挙げられる。前記アミノ糖としては、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン等が挙げられる。前記ウロン酸としては、例えば、グルクロン酸、ガラクツロン酸等が挙げられる。
【００４２】
（１０）補酵素
前記キノプロテインＧＤＨは、ピロールキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とする。前記キノプロテインＧＤＨとＰＱＱとは、例えば、カルシウムイオン存在下で結合可能であってもよく、カルシウムイオン不在下で結合可能であってもよい。
【００４３】
（１１）アミノ酸配列
本発明のキノプロテインＧＤＨは、前記（１）〜（６）の特徴に加えて、例えば、さらに、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするのが好ましい。なお、配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端１番目〜１７番目のアミノ酸残基を欠失したアミノ酸配列である。本発明のキノプロテインＧＤＨは、下記（ａ）から（ｃ）において、配列番号２のものが好ましい。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００４４】
前記（ｂ）における配列番号１のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失した前記アミノ酸残基の数は、例えば、１個以上２２２個以下、好ましくは、１個以上１８５個以下、より好ましくは、１個以上１４８個以下、さらに好ましくは、１個以上１１１個以下、さらに好ましくは、１個以上９２個以下、さらに好ましくは、１個以上７４個以下、さらに好ましくは、１個以上５５個以下、さらに好ましくは、１個以上３７個以下、さらに好ましくは、１個以上１８個以下、さらに好ましくは、１個以上９個以下、さらに好ましくは、１個以上５個以下である。
【００４５】
前記（ｂ）における配列番号２のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失した前記アミノ酸残基の数は、例えば、１個以上２１２個以下、好ましくは、１個以上１７７個以下、より好ましくは、１個以上１４１個以下、さらに好ましくは、１個以上１０６個以下、さらに好ましくは、１個以上８８個以下、さらに好ましくは、１個以上７０個以下、さらに好ましくは、１個以上５３個以下、さらに好ましくは、１個以上３５個以下、さらに好ましくは、１個以上１７個以下、さらに好ましくは、１個以上９個以下、さらに好ましくは、１個以上５個以下である。
【００４６】
前記（ｃ）において、配列番号１または２に対する相同性は、好ましくは、４０％以上、より好ましくは、５０％以上、さらに好ましくは、６０％以上、さらに好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは、７５％以上、さらに好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表すことができ、一般に、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Ａｌｔｓｃｈｕ ＳＦ、外４名、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年１０月５日、第２１５巻、第３号、ｐ．４０３−４１０）。
【００４７】
また、本発明のキノプロテインＧＤＨは、前記（１）〜（６）の特徴に加えて、例えば、さらに、配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。前記キノプロテインＧＤＨは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。置換、付加、挿入もしくは欠失した前記アミノ酸残基の数は、例えば、１個以上３５４個以下、より好ましくは、１個以上３００個以下、さらに好ましくは、１個以上２５０個以下、さらに好ましくは、１個以上２００個以下、さらに好ましくは、１個以上１５０個以下、さらに好ましくは、１個以上１００個以下、さらに好ましくは、１個以上７５個以下、さらに好ましくは、１個以上５０個以下、さらに好ましくは、１個以上２５個以下、さらに好ましくは、１個以上１０個以下である。
【００４８】
配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列は、本発明の酵素の機能を発現するために必須の配列である。配列番号３のアミノ酸配列（Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）において、ヒスチジン残基は、基質との反応に関与し、残りの４アミノ酸残基は、前記ヒスチジン残基を適切な位置に配置するための足場を形成している。配列番号４のアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）において、アルギニン残基およびアスパラギン残基は、補酵素との結合に関与し、残りの５アミノ酸残基は、前記両残基を適切な位置に配置するための足場を形成している。前記ヒスチジン残基、アルギニン残基およびアスパラギン残基が、本発明のキノプロテインＧＤＨの酵素活性中心の一部を形成している。
【００４９】
例えば、前記基質がグルコースの場合、前記ヒスチジン残基の側鎖のアミノ基（−ＮＨ２）は、グルコースの１位の炭素原子に結合する水酸基からプロトンを引き抜き、これと同時に、グルコースの１位の炭素原子からＰＱＱの５位の炭素原子へのヒドリド移動が起こり、グルコノラクトンが生成する。また、前記アルギニン残基の側鎖末端のイミノ基（＝ＮＨ）およびアミノ基（−ＮＨ２）は、ＰＱＱの５位の酸素原子と水素結合し、前記アスパラギン残基の側鎖末端のアミノ基（−ＮＨ２）は、ＰＱＱの４位の酸素原子と水素結合する。なお、前記アルギニン残基およびアスパラギン残基と前記補酵素との結合は、本発明のキノプロテインＧＤＨのＸ線結晶構造解析により確認した。また、前記酵素活性中心は、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）のＧＤＨ（プロテインデータバンク ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＱ１）との構造比較から推定した。
【００５０】
配列番号３のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１５２番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から１５６番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号３のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１３５番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から１３９番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号３において、Ｘａａで表されるＮ末端から２番目のアミノ酸残基（Ｘ）は、特に制限されず、任意である。例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、前記アミノ酸残基（Ｘ）は、アスパラギン（Ｎ）である。
【００５１】
配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２１２番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２１８番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１９５番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２０１番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号４において、Ｘａａで表されるＮ末端から２番目のアミノ酸残基（Ｙ）は、特に制限されず、任意である。例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、前記アミノ酸残基（Ｙ）は、ヒスチジン（Ｈ）である。
【００５２】
前記キノプロテインＧＤＨは、さらに、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。配列番号６のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２４６番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２５３番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号６のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２２９番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２３６番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号６において、Ｘａａで表されるＮ末端から３番目のアミノ酸残基（Ｚ）は、特に制限されず、任意である。例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、前記アミノ酸残基（Ｚ）は、グリシン（Ｇ）である。
【００５３】
＜本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子＞
本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子は、その発現により、本発明のキノプロテインＧＤＨを合成可能であれば制限されないが、前述のように、前記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。また、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子は、別の態様においては、前述のように、下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子である。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【００５４】
前記（ｅ）において、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、１個以上６３６個以下、好ましくは、１個以上５３１個以下、より好ましくは、１個以上４２３個以下、さらに好ましくは、１個以上３１８個以下、さらに好ましくは、１個以上２６４個以下、さらに好ましくは、１個以上２１０個以下、さらに好ましくは、１個以上１５９個以下、さらに好ましくは、１個以上１０５個以下、さらに好ましくは、１個以上５１個以下、さらに好ましくは、１個以上２５個以下、１個以上９個以下、さらに好ましくは、１個以上５個以下である。
【００５５】
前記（ｆ）において、配列番号５に対する相同性は、好ましくは、４０％以上、より好ましくは、５０％以上、好ましくは、６０％以上、より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは、７５％以上、さらに好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、求めることができる。また、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子は、配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列からなる遺伝子も含む。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子は、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨのみをコードするものでもよいし、ペプチドおよび他のタンパク質等との融合タンパク質をコードするものでもよい。融合させる前記ペプチドおよび他のタンパク質等としては、特に制限されないが、例えば、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタンパク質等が挙げられる。このような、酵素の融合タンパク質化により、酵素精製における手順の簡略化および低廉化、酵素の安定性向上および可溶化等が可能である。
【００５６】
前記（ｇ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験技術である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１倍のＳＳＣ溶液は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウムからなる。
【００５７】
本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子の製造方法としては、特に制限されないが、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨのアミノ酸配列、または本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子の塩基配列に基づいて、従来公知の遺伝子工学的手法、化学合成法等により製造できる。前記遺伝子工学的手法としては、特に制限されないが、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子の塩基配列を基に設計したプライマーを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅を行う方法が挙げられる。前記ゲノムＤＮＡの由来生物としては、特に制限されないが、例えば、前述のピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体等が挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子は、本発明のキノプロテインＧＤＨを発現可能な遺伝子であれば制限されず、例えば、変異導入により改変したものも含む。前記変異導入方法としては、特に制限されないが、例えば、Ｋｕｎｌｅｌ法またはギャップ二重鎖法等の公知手法、これに準じる方法等が挙げられる。前記変異導入方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キット等を利用してもよい。
【００５９】
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子を含む。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子を挿入するベクターは、特に制限されず、例えば、大腸菌、放線菌、枯草菌、酵母由来のプラスミド、λファージ等が挙げられる。前記挿入用のベクターは、具体的には、例えば、ｐＥＴ１１ａ、ｐＩＪ７０２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ３６７、ｐＮＵＴ４、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、λｇｔ１０、ｐＴＯＮＡ５ａ、ｐＥＴ２８等が挙げられる。前記発現ベクターに、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子を挿入する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子の挿入方法は、具体的には、例えば、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子の精製ＤＮＡを、適当な制限酵素で切断後、適当な挿入用ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法等が挙げられる。このような方法により、前記挿入用ベクターに前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子が連結した、本発明の発現ベクターを得ることができる。
【００６０】
また、前記発現ベクターは、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子を発現し得るものであればよく、例えば、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子以外の構造は制限されない。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子以外の構造としては、例えば、発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等が挙げられる。前記発現を制御する塩基配列としては、特に制限されないが、例えば、プロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等が挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、特に制限されないが、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００６１】
＜本発明の形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のように、本発明の発現ベクターを含む。本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含むため、前記キノプロテインＧＤＨを産生可能である。前記形質転換体は、例えば、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子を発現可能な発現ベクターを、宿主に導入して得られる。前記宿主としては、例えば、導入する発現ベクターに応じて選択すればよく、特に限定されないが、例えば、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞等の細胞が挙げられ、好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。前記大腸菌としては、特に制限されないが、例えば、前述の、Ｓ１７−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）等の菌株が挙げられる。前記宿主への前記発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト−ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、Ｌｉ法、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ法、パーティクル・ガン法等の従来公知の方法を適宜用いることができる。
【００６２】
前記形質転換体の培養により得られた培養物から、本発明のキノプロテインＧＤＨを採取できる。前記培養の方法、培養条件および培地等は、特に限定されず、前述の宿主に応じた方法、培養条件および培地等を適宜採用できる。
【００６３】
＜本発明のキノプロテインＧＤＨの製造方法＞
本発明のキノプロテインＧＤＨの製造方法は、前述のように、本発明のキノプロテインＧＤＨを産生する形質転換体を培養する工程を含む。前記培養工程としては、特に制限されず、前述の宿主に応じた方法、培養条件および培地等を適宜採用できる。また、前記製造方法は、前記培養工程以外に、さらに他の工程を含んでいてもよい。前記他の工程としては、特に制限されないが、例えば、培養工程により得られる培養物を採取する工程、採取した培養物を精製する工程等が挙げられる。前記培養物としては、特に制限されないが、例えば、前述の培養物等が挙げられる。また、前記精製方法としては、特に制限されないが、例えば、前述の精製方法等が挙げられる。
【００６４】
＜本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体＞
本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体は、前述のように、アポ酵素である前記キノプロテインＧＤＨと、前記ＰＱＱとを含む。前記キノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体は、例えば、アポ酵素である前記キノプロテインＧＤＨに、ＰＱＱを結合（再構成）させたホロ酵素であってもよい。前記キノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体は、前記キノプロテインＧＤＨとＰＱＱを含む以外は制限されず、例えば、さらに他の物質を含んでいてもよい。前記キノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体に含まれる他の成分としては、特に制限されない。
【００６５】
本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体の製造方法は、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨの製造工程と、前記キノプロテインＧＤＨに、ＰＱＱを結合する結合工程（再構成工程）とを含んでいてもよい。前記結合工程は、特に制限されないが、例えば、前記キノプロテインＧＤＨと前記ＰＱＱとを、緩衝液中で反応させてもよい。前記緩衝液は、特に制限されないが、例えば、緩衝剤、無機塩類等を含んでもよい。前記緩衝剤としては、特に制限されないが、例えば、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液、Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４）等が挙げられる。前記無機塩類としては、特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。前記ナトリウム塩は、特に制限されないが、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記カルシウム塩は、特に制限されないが、例えば、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、酢酸カルシウム等が挙げられる。前記反応温度は、特に制限されないが、例えば、４℃以上であり、好ましくは、４℃である。前記反応時間は、特に制限されないが、例えば、１６〜２０時間であり、好ましくは、１６時間である。
【００６６】
＜本発明のグルコース測定キット＞
本発明のグルコース測定キットは、前述のように、本発明のキノプロテインＧＤＨおよび本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体の少なくとも一方を含む。前記グルコース測定キットは、本発明のキノプロテインＧＤＨおよび本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体の少なくとも一方が含まれていればよく、その他の構成物は特に制限されない。前記その他の構成物は、特に制限されないが、例えば、緩衝剤、発色剤、ＰＱＱ、カルシウム塩等が挙げられる。前記緩衝剤としては、特に制限されず、例えば、前述の緩衝剤等が挙げられる。前記発色剤としては、特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ）、２−（４−イオドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１−メトキシ−ＰＭＳ）、２−（４−イオドフェニル)−３−（４−ニトロフェニル)−５−（２，４−ジサルフォフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）等が挙げられる。
【実施例】
【００６７】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、以下の実施例により制限されない。
【００６８】
本例のキノプロテインＧＤＨは、以下のようにして、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株のゲノムＤＮＡから、キノプロテインＧＤＨ遺伝子をクローニングし、この遺伝子を導入した形質転換体の培養上清から精製した。
【００６９】
［キノプロテインＧＤＨ遺伝子］
以下のようにして、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株のゲノムＤＮＡから、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をクローニングした。なお、配列番号５で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【００７０】
［発現ベクターの作製］
まず、以下のようにして、前記ＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製した。
【００７１】
チューブ内に、下記組成のＰＣＲ反応液５０μＬを添加し、プログラムテンプコントロールシステム ＰＣ−８１６Ｓ（アステック社製）を用いてＰＣＲを行った。前記ＰＣＲは、９８℃で１５秒、６５℃で２秒および７４℃で３０秒を１サイクルとして２５サイクル繰り返した。
【００７２】
（ＰＣＲ反応液の組成）
成分 配合量 最終濃度
ゲノムＤＮＡ ０．５μＬ（５００ｎｇ）
センスプライマー １．０μＬ（１００ｐｍｏｌ） ２μｍｏｌ／Ｌ
アンチセンスプライマー １．０μＬ（１００ｐｍｏｌ） ２μｍｏｌ／Ｌ
Ｂｕｆｆｅｒ＃１※ ５．０μＬ
塩化マグネシウム ２．０μＬ（５０ｎｍｏｌ） １ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰｓ ５．０μＬ（１０ｎｍｏｌ） ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ １．０μＬ（２．５Ｕ）
水 ３４．５μＬ
計 ５０．０μＬ
※Ｂｕｆｆｅｒ＃１の組成
成分 濃度
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １．２ｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００ １ｗ／ｖ％
ＢＳＡ ０．０１ｗ／ｖ％
【００７３】
なお、前記ＰＣＲ反応液における前記センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしては、以下のプライマーセットを用いた。
【００７４】
センスプライマー（配列番号７）
５’−ｃａｔａｔｇａｇｔｃｔｇｇｇｃｔｔｇｔｔｇａｃｃ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号８）
５’−ａｇｇａｔｃｃｔｔａａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｔｃａｇａｔａｃｇ−３’
【００７５】
プラスミドｐＥＴ１１ａと増幅した前記ＤＮＡ断片とを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、混合して連結し、発現ベクターを得た。前記発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに導入した。この大腸菌を、下記組成のＳＢ培地中で、３７℃で６時間培養した。得られた培養液１Ｌを、１０分間、遠心分離（７０００×ｇ）して、菌体を回収した。前記菌体を、０．８５ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液を用いて懸濁した。この懸濁液を、１０分間、再度遠心分離（７０００×ｇ）して、前記菌体を回収した。この菌体（菌体湿重量１０ｇ）を、０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５０ｍＬに懸濁し、氷冷しながら、超音波破砕機を用いて破砕した。得られた破砕液を、２０分間、遠心分離（１５０００×ｇ）し、上清（粗酵素液）を回収した。ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）により、この粗酵素液のタンパク質量を測定した。
【００７６】
（ＳＢ培地の組成）
成分 濃度
バクトトリプトン １２．０ｇ／Ｌ
酵母エキス ２４．０ｇ／Ｌ
グリセロール ５ｍＬ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４ １２．５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ３．８ｇ／Ｌ
【００７７】
［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］
前記粗酵素液の酵素活性は、以下のようにして測定した。まず、所定濃度（１０、２０および３０μｇ／ｍＬ）の前記粗酵素液を含む下記組成の測定試薬１ｍＬに、１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるようにＤ−グルコースを添加し、５０℃で１０分間反応させた。５０℃の条件下、各反応液の測定波長６００ｎｍにおける吸光度を、分光光度計（セルの光路長０．４ｃｍ）を用いて測定した。なお、コントロールとして、前記粗酵素液を無添加とした以外は同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度変化量を下記式１に代入し、キノプロテインＧＤＨ活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）を算出した。なお、本例において、キノプロテインＧＤＨ活性 １単位（１ ｕｎｉｔ）とは、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素活性である。また、前記粗酵素液の前記タンパク質量とキノプロテインＧＤＨ活性から、前記タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ））および全タンパク質の酵素活性（総活性（ｕｎｉｔ））を算出した。
【００７８】
（測定試薬の組成）
成分 濃度
１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン
（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ、ｐＨ８） ５０ｍｍｏｌ／ｍＬ
ピロールキノリンキノン（ＰＱＱ） １．２μｍｏｌ／ｍＬ
２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ） ０．１ｍｍｏｌ／ｍＬ
粗酵素液 １０〜３０μｇ／ｍＬ
【００７９】
【数１】
【００８０】
［キノプロテインＧＤＨの精製］
前記粗酵素液を、８０℃で１０分間熱処理した。この処理酵素液を、ＨｉＰｒｅｐ ＳＰ強陽イオンクロマトカラム（ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）を用いて精製した。この精製酵素および前記処理酵素液について、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、タンパク質量と酵素活性を測定し、比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）および総活性（ｕｎｉｔ）を算出した。前記粗酵素液の総活性を１００％としたときの、前記処理酵素液および前記精製酵素の総活性の割合を、収率（％）として算出した。前記粗酵素液の比活性を１としたときの、前記処理酵素液および前記精製酵素の比活性の倍率を、精製倍率として算出した。また、前記粗酵素液、処理酵素液および精製酵素と分子量マーカーとを、熱変性還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００８１】
下記表１に、前記粗酵素液、処理酵素液および精製酵素のタンパク質量（ｍｇ）、総活性（ｕｎｉｔ）、比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）、収率（％）および精製倍率の結果を示す。
【００８２】
（表１）
タンパク質量 総活性 比活性 収率 精製倍率
（ｍｇ） （ｕｎｉｔ） （ｕｎｉｔ/ｍｇ） （％）
粗酵素液 ５５４．８４ ２８．８９ ０．０５２ １００ １
処理酵素液 ４６．０４ ２９．１６ ０．０６３ １０１ １２．１６
精製酵素 ２９．５９ ２２．９１ ０．７７ ７９ １４．８１
【００８３】
図１の写真に、前記粗酵素液、処理酵素液および精製酵素を、熱変性還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した結果を示す。同図において、レーン１は分子量マーカー、レーン２は粗酵素液、レーン３は処理酵素液、レーン４は精製酵素の泳動結果である。同図に示すように、キノプロテインＧＤＨの分子量は、約３３ｋＤａであった。
【００８４】
［最適温度］
所定温度（５０、６０、７０および７５℃）に加温した前記測定試薬に、Ｄ−グルコースを添加し、直ちに吸光度を測定した以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定し、酵素活性を算出した。
【００８５】
図２のグラフに、前記精製酵素の最適温度の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定温度（℃）であり、縦軸は、酵素活性である。同図に示すように、前記精製酵素の酵素活性は、７５℃において最も高かった。なお、前記ＤＣＩＰの褪色のため、７５℃を超えた温度条件では、測定できなかった。
【００８６】
［温度安定性］
前記精製酵素（アポ酵素）、ＰＱＱを再構成させた前記精製酵素（ホロ酵素、酵素−補酵素複合体）の温度安定性を、それぞれ評価した。まず、以下のようにして、前記ホロ酵素を調製した。すなわち、前記アポ酵素を、０．０２８６ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、下記組成の再構成液に添加し、４℃で１６時間反応させた。この反応液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）に添加して、酵素に結合していないＰＱＱを除去し、ホロ酵素を回収した。その後、同じカラムで緩衝液を１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に置換して、前記ホロ酵素を調製した。前記両酵素を所定温度（６０、７０、８０、９０および１００℃）で１０分間熱処理した。前記アポ酵素は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。前記ホロ酵素は、前記粗酵素液の濃度を３．６７μｇ／ｍＬとし、前記ＰＱＱを無添加とした前記測定試薬を用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた各吸光度を下記式２に代入して、残存酵素活性率（％）を算出した。
【００８７】
（再構成液の組成）
成分 濃度
ピロールキノリンキノン（ＰＱＱ） ０．２８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００８８】
残存酵素活性率（％）＝Ａ／Ｂ×１００ ・・・（２）
Ａ＝熱処理後の各酵素を添加した反応液の吸光度
Ｂ＝熱処理なしの各酵素を添加した反応液の吸光度
【００８９】
図３のグラフに、各酵素の温度安定性の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定温度（℃）であり、縦軸は、残存酵素活性率（％）である。また、同図の各プロットは、前記アポ酵素が、黒丸（●）であり、前記ホロ酵素が、黒四角（■）である。同図に示すように、前記アポ酵素の残存酵素活性率は、６０〜８０℃において、約１００％であり、９０℃において、約６０％であった。前記ホロ酵素の残存酵素活性率は、６０〜１００℃において、約１００％であった。このように、ＰＱＱを再構築させていない前記精製酵素は、６０〜８０℃において、酵素活性が維持され、１００℃においても、約６０％の高い残存酵素活性率を有した。また、ＰＱＱを再構築させた前記精製酵素は、６０〜１００℃において、酵素活性が維持された。このように、前記精製酵素は、補酵素非結合の状態において、高い温度安定性を示し、補酵素が結合した状態では、さらに高い温度安定性を示した。
【００９０】
［最適ｐＨ］
前記精製酵素の最適ｐＨを、以下のようにして評価した。まず、前述のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ（ｐＨ８）に代えて、以下の、所定ｐＨに設定した５０ｍｍｏｌ／Ｌの各緩衝剤を用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度を下記式３に代入して、ｐＨ８．０２（ＨＥＰＥＳ）における酵素活性率を１００％としたときの比活性（％）を算出した。
【００９１】
（緩衝液）
緩衝剤 ｐＨ
リン酸緩衝液（ＫＰＢ） ６．３３、６．８２、７．３３
ＨＥＰＥＳ ６．９５、８．０２、８．４
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ７．４８、８．０５、８．５、８．９１
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ８、８．５、９
Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ ８．９３、９．４９
【００９２】
比活性（％）＝Ｃ／Ｄ×１００ ・・・（３）
Ｃ＝各ｐＨの反応液の吸光度
Ｄ＝ｐＨ８．０２（ＨＥＰＥＳ）の反応液の吸光度
【００９３】
図４および下記表２に、前記精製酵素の最適ｐＨの測定結果を示す。同図において、横軸は、測定ｐＨ（ｐＨ）であり、縦軸は、比活性（％）である。同図および同表に示すように、前記精製酵素の比活性は、ｐＨ８．０２において最も高かった。このように、前記精製酵素の酵素活性は、ｐＨ約８において最も高いことが示された。
【００９４】
（表２）
ｐＨ 緩衝剤 比活性（％）
６．３３ ＫＰＢ １０
６．８２ ＫＰＢ ２２．５
６．９５ ＨＥＰＥＳ ３７．５
７．３３ ＫＰＢ ４２．５
７．４８ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ６８．７５
８ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ８７．５
８．０２ ＨＥＰＥＳ １００
８．０５ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ８７．５
８．４ ＨＥＰＥＳ ６３．７５
８．５ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ８１．２５
８．５ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ８２．５
８．９１ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ７５
８．９３ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ ５０
９ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ７７．５
９．４９ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ ３０
【００９５】
［ｐＨ安定性］
前記精製酵素のｐＨ安定性を、以下のようにして評価した。まず、前述の［最適ｐＨ］測定に用いた各緩衝剤を１００ｍｍｏｌ／Ｌに調整した各緩衝液０．１ｍＬに、前記精製酵素４９．５μｇを添加し、７０℃で３０分間前処理した。この前処理液を、前記精製酵素量が１１μｇとなるように、前記測定試薬に添加した以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度を下記式４に代入して、ｐＨ１１における酵素活性を１００％としたときの比活性（％）を算出した。
【００９６】
比活性（％）＝Ｅ／Ｆ×１００ ・・・（４）
Ｅ＝各ｐＨの反応液の吸光度
Ｆ＝ｐＨ１１の反応液の吸光度
【００９７】
図５のグラフに、前記精製酵素のｐＨ安定性の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定ｐＨ（ｐＨ）であり、縦軸は、比活性（％）である。同図に示すように、前記精製酵素の比活性は、ｐＨ４〜１１において、８５％以上であった。このように、前記精製酵素は、幅広いｐＨ範囲で酵素活性が維持され、高いｐＨ安定性を示した。
【００９８】
［基質特異性］
前記精製酵素の基質特異性を、以下のようにして評価した。まず、前記Ｄ−グルコースに代えて、以下の各基質を用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度を下記式５に代入して、前記Ｄ−グルコースを基質としたときの酵素活性を１００％としたときの、比活性（％）を算出した。
【００９９】
比活性（％）＝Ｇ／Ｈ×１００ ・・・（５）
Ｇ＝各基質を含む反応液の吸光度
Ｈ＝Ｄ−グルコースを含む反応液の吸光度
【０１００】
下記表３に、基質特異性の測定結果を示す。同表に示すように、前記精製酵素は、種々のアルドースおよびケトースの基質に対する酵素活性を有した。
【０１０１】
（表３）
基質 比活性（％）
Ｄ−グルコース １００
Ｄ−マンノース ８４
Ｄ−キシロース ８６
Ｄ−リボース ８６
Ｄ−アロース １６０
Ｌ−アラビノース １６４
Ｄ−ガラクトース １８６
Ｄ−フルクトース １０
Ｄ−タガトース ３４
Ｌ−タガトース ４１
Ｄ−プシコース ２７
Ｌ−プシコース １４
Ｌ−フルクトース ２０
Ｄ−ソルボース １６
【０１０２】
［ＰＱＱ結合性］
前記精製酵素のＰＱＱ結合性を、以下のようにして評価した。すなわち、ＰＱＱ濃度を、１．２μｍｏｌ／Ｌに代えて、所定濃度（１、０．３３３、０．１１１、０．０３７および０μｍｏｌ／Ｌ）とした以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、各ＰＱＱ濃度におけるキノプロテインＧＤＨ活性を測定した。
【０１０３】
図６のグラフに、前記精製酵素のＰＱＱ結合性の測定結果を示す。同図において、横軸は、ＰＱＱ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、縦軸は、酵素活性（Ｕ／ｍｇ）である。同図に示すように、前記精製酵素の活性は、ＰＱＱ ０．１１〜０．３３３μｍｏｌ／Ｌ間で直線的に増加し、１μｍｏｌ／Ｌのときに、最も高い活性（０．７７Ｕ／ｍｇ）を示した。
【０１０４】
［ＰＱＱ結合におけるカルシウムイオンの影響］
前記精製酵素のＰＱＱ結合（ＰＱＱ再構成）における、カルシウムイオンの影響を評価した。まず、以下のようにして、カルシウムイオン存在下で再構成させたホロ酵素（以下、「ホロ酵素（Ｃａ＋）」という）と、カルシウムイオン不在下で再構成させたホロ酵素（以下、「ホロ酵素（Ｃａ−）」という）とを調製した。前記ホロ酵素（Ｃａ−）は、前述の［温度安定性］と同様にして調製した。前記ホロ酵素（Ｃａ＋）は、１ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カルシウムを添加した前記再構成液を用いた以外は、前述の［温度安定性］と同様にして調製した。前記精製酵素（アポ酵素）に代えて、これらのホロ酵素を用い、前記測定試薬として、ＰＱＱを含まない前記測定試薬とＰＱＱを含む前記測定試薬とを用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、各ホロ酵素の酵素活性を測定した。また、分光光度計を用いて、２５０〜５５０ｎｍにおける各ホロ酵素および前記精製酵素（アポ酵素）の反応液の吸光度を測定した。
【０１０５】
図７のグラフに、各ホロ酵素および前記精製酵素（アポ酵素）について、吸光度の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定波長（ｎｍ）であり、縦軸は、吸光度である。同図に示すように、前記ホロ酵素（Ｃａ＋）およびホロ酵素（Ｃａ−）は、共に、３５０ｎｍ付近にＰＱＱの吸収を示すピークが認められた。他方、アポ酵素は、同じ波長領域にピークが認められなかった。したがって、ホロ酵素（Ｃａ＋）およびホロ酵素（Ｃａ−）共に、ＰＱＱの結合が確認された。また、ホロ酵素（Ｃａ＋）およびホロ酵素（Ｃａ−）の酵素活性は、前記測定試薬中にＰＱＱを含む場合と、ＰＱＱを含まない場合とで、変化しなかった。このため、アポ酵素からホロ酵素への転換において、カルシウムイオンは不要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上のように、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、温度安定性およびｐＨ安定性に優れる。したがって、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、幅広い温度およびｐＨ条件下で安定的に利用可能である。このため、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素の用途は、例えば、その基質特異性を利用した様々な用途が挙げられ、広い分野に適用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノプロテイングルコース脱水素酵素およびその製造方法、前記酵素と補酵素との複合体、グルコース測定キット、前記酵素遺伝子、前記酵素遺伝子を含むベクター、ならびに前記ベクターを含む形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノプロテイングルコース脱水素酵素（ＥＣ １．１．５．２、以下、「キノプロテインＧＤＨ」という場合もある）は、ピロールキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」という場合もある）を補酵素とし、Ｄ−グルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンを産生する反応を触媒するグルコース脱水素酵素である。
【０００３】
グルコース脱水素酵素は、近年、その基質特異性を利用した、酵素電池、バイオセンサー等に応用されている。このような応用の場面では、電力供給、測定精度等の安定化の観点から、幅広い条件下で利用できる酵素が望まれる。このため、従来、温度、ｐＨ等の安定性に優れた酵素開発が行われている（例えば、特許文献１および２等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４０３６６６７号公報
【特許文献２】特開２００６−２６２７６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来のグルコース脱水素酵素は、温度およびｐＨ共に、優れた耐性と安定性を実現するという点からは、未だ十分とはいえなかった。そこで、本発明は、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、かつ温度安定性およびｐＨ安定性に優れた、グルコース脱水素酵素の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（１）から（６）の性質を有することを特徴とする。
（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）：３３±６ｋＤａ
（２）一量体タンパク質
（３）最適ｐＨ：ｐＨ７〜９
（４）最適温度：７５℃以上
（５）温度安定性：８０℃以下
（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１
【０００７】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体は、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素と、ピロールキノリンキノンとを含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明のグルコース測定キットは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素および本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００１０】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子であることを特徴とする。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【００１１】
本発明の発現ベクターは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素の製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、温度安定性およびｐＨ安定性に優れるため、高温、高ｐＨおよび低ｐＨ条件下でも、高い酵素活性が維持される。このため、本発明の酵素によれば、幅広い温度またはｐＨ条件下において、化学反応を安定的に触媒可能である。また、本発明の酵素は、一般的な酵素と比べてその耐熱性および耐ｐＨ性に優れるため、製造工程で熱処理またはｐＨ処理を行うことにより、他の酵素と容易に分離できる。このため、本発明の酵素は、製造性にも優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の酵素の一例について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果を示す写真である。
【図２】図２は、本発明の酵素の一例について、最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の酵素の一例および本発明の酵素−補酵素複合体の一例について、温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の酵素の一例について、最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の酵素の一例について、ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の酵素の一例について、ＰＱＱ濃度と酵素活性との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の酵素の一例および本発明の酵素−補酵素複合体の一例について、２５０〜５５０ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、例えば、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体に由来するのが好ましい。前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体が好ましい。前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株であるのが好ましい。なお、前記ＩＭ２株のゲノムは公知であるが、ゲノム上にキノプロテイングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子があることを見出したのは、本発明者が初めてである。
【００１７】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。
【００１８】
本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質からなることが好ましい。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００１９】
また、別の局面では、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とする。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００２０】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。
【００２１】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、下記（４）および（６）からなる群から選択される少なくとも一つの性質を有するのが好ましい。
（４）最適温度：７５℃以上
（５）温度安定性：８０℃以下
（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１
【００２２】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、例えば、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体に由来するのが好ましい。前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体が好ましい。前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株であるのが好ましい。
【００２３】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体は、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素と、ピロールキノリンキノンとを含むことを特徴とする。
【００２４】
前記別の局面において、本発明のグルコース測定キットは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素および本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体の少なくとも一方を含むことを特徴とする。
【００２５】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００２６】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子は、下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子であることを特徴とする。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【００２７】
前記別の局面において、本発明の発現ベクターは、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子を含むことを特徴とする。
【００２８】
前記別の局面において、本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含むことを特徴とする。
【００２９】
前記別の局面において、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素の製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。
【００３０】
以下に、本発明について、例をあげて説明する。なお、本発明は、これに限定されない。
【００３１】
＜本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素＞
（１）由来
本発明のキノプロテインＧＤＨの由来は、特に制限されないが、前述のように、例えば、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体が好ましい。前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体としては、特に制限されないが、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロバキュラム・アーセナティカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｒｓｅｎａｔｉｃｕｍ）、ピロバキュラム・カリディフォンティス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ）、ピロバキュラム・イスランディカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、ピロバキュラム・オギュニエンス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｏｇｕｎｉｅｎｓｅ）、ピロバキュラム・オルガノトロファム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｈｕｍ）種が挙げられ、好ましくは、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体である。前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体としては、例えば、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株が好ましい。本発明のキノプロテインＧＤＨは、組換えタンパク質である場合、例えば、前述のピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体由来のＤＮＡ断片を導入した形質転換体から得られたものであってもよい。本発明では、このような形質転換体由来のキノプロテインＧＤＨも、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体由来のキノプロテインＧＤＨに含まれる。前記形質転換体の宿主としては、特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞等が挙げられる。前記大腸菌としては、特に制限されないが、例えば、Ｓ１７−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）等の菌株が挙げられる。
【００３２】
（２）採取方法
前記キノプロテインＧＤＨは、特に制限されないが、例えば、前記キノプロテインＧＤＨを発現する微生物の菌体、動物細胞、植物細胞、形質転換体等の細胞を培養し、その培養物から回収してもよい。前記細胞は、特に制限されないが、例えば、前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体、前記キノプロテインＧＤＨをコードする遺伝子を導入した形質転換体等が挙げられ、好ましくは、前記キノプロテインＧＤＨをコードする遺伝子を導入した形質転換体である。前記細胞の培養方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法等を採用できる。
【００３３】
前記培養物は、特に制限されないが、例えば、培養上清、培養細胞、細胞抽出物等が挙げられる。前記培養物は、例えば、前記培養上清、前記培養細胞、前記細胞抽出物等の処理物であってもよい。前記培養物の処理としては、特に制限されないが、例えば、濃縮、乾燥、凍結乾燥、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理、タンパク質分画、超音波処理、磨砕処理等が挙げられる。また、前記培養物は、例えば、前記培養上清、前記培養細胞、前記細胞抽出物、前記処理物等の混合物であってもよい。前記混合物は、構成物を任意の組み合わせおよび比率で混合することができ、特に制限されない。前記培養物からの前記キノプロテインＧＤＨの回収方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法等を採用できる。
【００３４】
（３）精製方法
前記キノプロテインＧＤＨは、例えば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、または、適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物から精製可能である。前記生化学的方法としては、特に制限されないが、例えば、硫安沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられる。前記生化学的方法を組み合わせて精製する場合、例えば、精製工程毎に、キノプロテインＧＤＨ活性を測定し、前記活性の検出された分画物を選抜してもよい。前記活性の測定方法としては、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。
【００３５】
（４）分子量
前記キノプロテインＧＤＨは、前述のように、分子量が３３±６ｋＤａの一量体タンパク質である。なお、本発明において、前記分子量は、例えば、熱変性還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定値である。前記熱変性還元条件下は、例えば、タンパク質を加熱変性させ、２−メルカプトエタノール等の還元剤により、そのＳ−Ｓ結合を切断する条件下である。本発明のキノプロテインＧＤＨの分子量の理論値は、例えば、３８４５２Ｄａであってもよい。
【００３６】
（５）最適温度
前記キノプロテインＧＤＨの最適温度は、前述のように、７５℃以上である。また、前記キノプロテインＧＤＨは、７５℃におけるキノプロテインＧＤＨ活性を１００％としたときに、５０℃における前記活性が、２０〜４０％、６０℃における前記活性が、４０〜６０％、７０℃における前記活性が、７０〜９０％であってもよい。
【００３７】
（６）最適ｐＨ
前記キノプロテインＧＤＨの最適ｐＨは、前述のように、ｐＨ７〜９であり、好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５であり、より好ましくは、ｐＨ８である。
【００３８】
（７）温度安定性
前記キノプロテインＧＤＨは、前述のように、８０℃以下で安定である。なお、本発明において、「酵素が８０℃以下で安定である」とは、例えば、ｐＨ８、８０℃以下の条件下で酵素を１０分間熱処理し、５０℃で酵素活性を測定した場合に、残存酵素活性率（熱処理前の酵素活性率を１００％としたときの、熱処理後の酵素活性率）が高いことをいう。高い残存酵素活性率とは、特に制限されないが。例えば、６０〜１３０％であり、好ましくは、７０〜１２０％であり、より好ましくは、８０〜１１０％である。また、前記キノプロテインＧＤＨは、ｐＨ８、９０℃以下の条件下で酵素を１０分間熱処理し、５０℃で酵素活性を測定した場合に、例えば、残存酵素活性率が５０％以上であってもよい。
【００３９】
（８）ｐＨ安定性
前記キノプロテインＧＤＨは、前述のように、ｐＨ４〜１１で安定である。なお、本発明において、「酵素がｐＨ４〜１１で安定である」とは、例えば、ｐＨ４〜１１、７０℃の条件下で酵素を３０分間維持し、５０℃で酵素活性を測定した場合に、比活性（酵素活性が最も高いｐＨにおける酵素活性率を１００％としたときの酵素活性率）が高いことをいう。高い比活性とは、特に制限されないが、例えば、例えば、６０〜１００％であり、好ましくは、７０〜１００％であり、より好ましくは、８０〜１００％である。
【００４０】
このように、本発明のキノプロテインＧＤＨは、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、温度安定性およびｐＨ安定性にも優れる。なお、本発明において、「耐熱性に優れる」とは、例えば、高温条件下において、酵素活性を有することをいい、「耐ｐＨ性に優れる」とは、例えば、低ｐＨ条件および高ｐＨ条件下において、酵素活性を有することをいう。
【００４１】
（９）基質特異性
前記キノプロテインＧＤＨは、Ｄ−グルコースを基質とする。また、前記キノプロテインＧＤＨは、例えば、Ｄ−グルコース以外の、他の基質に対する酵素活性を有してもよい。前記他の基質としては、特に制限されないが、例えば、単糖、二糖、アミノ糖、ウロン酸等が挙げられる。前記単糖としては、例えば、エリトロース、トレオース、キシロース、リボース、アラビノース、リキソース、アピオース、アロース、ガラクトース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース等のアルドース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、タガロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、セドヘプツロース、コリオース等のケトースが挙げられる。前記二糖としては、例えば、トレハロース、マルトース、ラクトース、スクロース等が挙げられる。前記アミノ糖としては、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン等が挙げられる。前記ウロン酸としては、例えば、グルクロン酸、ガラクツロン酸等が挙げられる。
【００４２】
（１０）補酵素
前記キノプロテインＧＤＨは、ピロールキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とする。前記キノプロテインＧＤＨとＰＱＱとは、例えば、カルシウムイオン存在下で結合可能であってもよく、カルシウムイオン不在下で結合可能であってもよい。
【００４３】
（１１）アミノ酸配列
本発明のキノプロテインＧＤＨは、前記（１）〜（６）の特徴に加えて、例えば、さらに、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするのが好ましい。なお、配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端１番目〜１７番目のアミノ酸残基を欠失したアミノ酸配列である。本発明のキノプロテインＧＤＨは、下記（ａ）から（ｃ）において、配列番号２のものが好ましい。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【００４４】
前記（ｂ）における配列番号１のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失した前記アミノ酸残基の数は、例えば、１個以上２２２個以下、好ましくは、１個以上１８５個以下、より好ましくは、１個以上１４８個以下、さらに好ましくは、１個以上１１１個以下、さらに好ましくは、１個以上９２個以下、さらに好ましくは、１個以上７４個以下、さらに好ましくは、１個以上５５個以下、さらに好ましくは、１個以上３７個以下、さらに好ましくは、１個以上１８個以下、さらに好ましくは、１個以上９個以下、さらに好ましくは、１個以上５個以下である。
【００４５】
前記（ｂ）における配列番号２のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失した前記アミノ酸残基の数は、例えば、１個以上２１２個以下、好ましくは、１個以上１７７個以下、より好ましくは、１個以上１４１個以下、さらに好ましくは、１個以上１０６個以下、さらに好ましくは、１個以上８８個以下、さらに好ましくは、１個以上７０個以下、さらに好ましくは、１個以上５３個以下、さらに好ましくは、１個以上３５個以下、さらに好ましくは、１個以上１７個以下、さらに好ましくは、１個以上９個以下、さらに好ましくは、１個以上５個以下である。
【００４６】
前記（ｃ）において、配列番号１または２に対する相同性は、好ましくは、４０％以上、より好ましくは、５０％以上、さらに好ましくは、６０％以上、さらに好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは、７５％以上、さらに好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上である。前記タンパク質の相同性（ホモロジー）は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表すことができ、一般に、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Ａｌｔｓｃｈｕ ＳＦ、外４名、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年１０月５日、第２１５巻、第３号、ｐ．４０３−４１０）。
【００４７】
また、本発明のキノプロテインＧＤＨは、前記（１）〜（６）の特徴に加えて、例えば、さらに、配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。前記キノプロテインＧＤＨは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなることが好ましい。置換、付加、挿入もしくは欠失した前記アミノ酸残基の数は、例えば、１個以上３５４個以下、より好ましくは、１個以上３００個以下、さらに好ましくは、１個以上２５０個以下、さらに好ましくは、１個以上２００個以下、さらに好ましくは、１個以上１５０個以下、さらに好ましくは、１個以上１００個以下、さらに好ましくは、１個以上７５個以下、さらに好ましくは、１個以上５０個以下、さらに好ましくは、１個以上２５個以下、さらに好ましくは、１個以上１０個以下である。
【００４８】
配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列は、本発明の酵素の機能を発現するために必須の配列である。配列番号３のアミノ酸配列（Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）において、ヒスチジン残基は、基質との反応に関与し、残りの４アミノ酸残基は、前記ヒスチジン残基を適切な位置に配置するための足場を形成している。配列番号４のアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）において、アルギニン残基およびアスパラギン残基は、補酵素との結合に関与し、残りの５アミノ酸残基は、前記両残基を適切な位置に配置するための足場を形成している。前記ヒスチジン残基、アルギニン残基およびアスパラギン残基が、本発明のキノプロテインＧＤＨの酵素活性中心の一部を形成している。
【００４９】
例えば、前記基質がグルコースの場合、前記ヒスチジン残基の側鎖のアミノ基（−ＮＨ２）は、グルコースの１位の炭素原子に結合する水酸基からプロトンを引き抜き、これと同時に、グルコースの１位の炭素原子からＰＱＱの５位の炭素原子へのヒドリド移動が起こり、グルコノラクトンが生成する。また、前記アルギニン残基の側鎖末端のイミノ基（＝ＮＨ）およびアミノ基（−ＮＨ２）は、ＰＱＱの５位の酸素原子と水素結合し、前記アスパラギン残基の側鎖末端のアミノ基（−ＮＨ２）は、ＰＱＱの４位の酸素原子と水素結合する。なお、前記アルギニン残基およびアスパラギン残基と前記補酵素との結合は、本発明のキノプロテインＧＤＨのＸ線結晶構造解析により確認した。また、前記酵素活性中心は、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）のＧＤＨ（プロテインデータバンク ＰＤＢ ＩＤ：１ＣＱ１）との構造比較から推定した。
【００５０】
配列番号３のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１５２番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から１５６番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号３のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１３５番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から１３９番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号３において、Ｘａａで表されるＮ末端から２番目のアミノ酸残基（Ｘ）は、特に制限されず、任意である。例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、前記アミノ酸残基（Ｘ）は、アスパラギン（Ｎ）である。
【００５１】
配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２１２番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２１８番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｎ末端から１９５番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２０１番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号４において、Ｘａａで表されるＮ末端から２番目のアミノ酸残基（Ｙ）は、特に制限されず、任意である。例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、前記アミノ酸残基（Ｙ）は、ヒスチジン（Ｈ）である。
【００５２】
前記キノプロテインＧＤＨは、さらに、配列番号６のアミノ酸配列を含んでもよい。配列番号６のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２４６番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２５３番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号６のアミノ酸配列は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２２９番目のアミノ酸残基から、Ｎ末端から２３６番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に該当する。配列番号６において、Ｘａａで表されるＮ末端から３番目のアミノ酸残基（Ｚ）は、特に制限されず、任意である。例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、前記アミノ酸残基（Ｚ）は、グリシン（Ｇ）である。
【００５３】
＜本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子＞
本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子は、その発現により、本発明のキノプロテインＧＤＨを合成可能であれば制限されないが、前述のように、前記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。また、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子は、別の態様においては、前述のように、下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子である。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【００５４】
前記（ｅ）において、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、１個以上６３６個以下、好ましくは、１個以上５３１個以下、より好ましくは、１個以上４２３個以下、さらに好ましくは、１個以上３１８個以下、さらに好ましくは、１個以上２６４個以下、さらに好ましくは、１個以上２１０個以下、さらに好ましくは、１個以上１５９個以下、さらに好ましくは、１個以上１０５個以下、さらに好ましくは、１個以上５１個以下、さらに好ましくは、１個以上２５個以下、１個以上９個以下、さらに好ましくは、１個以上５個以下である。
【００５５】
前記（ｆ）において、配列番号５に対する相同性は、好ましくは、４０％以上、より好ましくは、５０％以上、好ましくは、６０％以上、より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは、７５％以上、さらに好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、求めることができる。また、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子は、配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列からなる遺伝子も含む。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子は、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨのみをコードするものでもよいし、ペプチドおよび他のタンパク質等との融合タンパク質をコードするものでもよい。融合させる前記ペプチドおよび他のタンパク質等としては、特に制限されないが、例えば、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタンパク質等が挙げられる。このような、酵素の融合タンパク質化により、酵素精製における手順の簡略化および低廉化、酵素の安定性向上および可溶化等が可能である。
【００５６】
前記（ｇ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験技術である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１倍のＳＳＣ溶液は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌおよび１５ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウムからなる。
【００５７】
本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子の製造方法としては、特に制限されないが、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨのアミノ酸配列、または本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子の塩基配列に基づいて、従来公知の遺伝子工学的手法、化学合成法等により製造できる。前記遺伝子工学的手法としては、特に制限されないが、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子の塩基配列を基に設計したプライマーを用い、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅を行う方法が挙げられる。前記ゲノムＤＮＡの由来生物としては、特に制限されないが、例えば、前述のピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体等が挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子は、本発明のキノプロテインＧＤＨを発現可能な遺伝子であれば制限されず、例えば、変異導入により改変したものも含む。前記変異導入方法としては、特に制限されないが、例えば、Ｋｕｎｌｅｌ法またはギャップ二重鎖法等の公知手法、これに準じる方法等が挙げられる。前記変異導入方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キット等を利用してもよい。
【００５９】
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子を含む。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子を挿入するベクターは、特に制限されず、例えば、大腸菌、放線菌、枯草菌、酵母由来のプラスミド、λファージ等が挙げられる。前記挿入用のベクターは、具体的には、例えば、ｐＥＴ１１ａ、ｐＩＪ７０２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ３６７、ｐＮＵＴ４、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、λｇｔ１０、ｐＴＯＮＡ５ａ、ｐＥＴ２８等が挙げられる。前記発現ベクターに、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子を挿入する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子の挿入方法は、具体的には、例えば、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子の精製ＤＮＡを、適当な制限酵素で切断後、適当な挿入用ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法等が挙げられる。このような方法により、前記挿入用ベクターに前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子が連結した、本発明の発現ベクターを得ることができる。
【００６０】
また、前記発現ベクターは、本発明のキノプロテインＧＤＨ遺伝子を発現し得るものであればよく、例えば、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子以外の構造は制限されない。前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子以外の構造としては、例えば、発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等が挙げられる。前記発現を制御する塩基配列としては、特に制限されないが、例えば、プロモーター、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等が挙げられる。前記遺伝子マーカーとしては、特に制限されないが、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００６１】
＜本発明の形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のように、本発明の発現ベクターを含む。本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを含むため、前記キノプロテインＧＤＨを産生可能である。前記形質転換体は、例えば、前記キノプロテインＧＤＨ遺伝子を発現可能な発現ベクターを、宿主に導入して得られる。前記宿主としては、例えば、導入する発現ベクターに応じて選択すればよく、特に限定されないが、例えば、大腸菌、酵母、糸状菌、放線菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞等の細胞が挙げられ、好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。前記大腸菌としては、特に制限されないが、例えば、前述の、Ｓ１７−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）等の菌株が挙げられる。前記宿主への前記発現ベクターの導入方法は、特に制限されず、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト−ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、Ｌｉ法、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ法、パーティクル・ガン法等の従来公知の方法を適宜用いることができる。
【００６２】
前記形質転換体の培養により得られた培養物から、本発明のキノプロテインＧＤＨを採取できる。前記培養の方法、培養条件および培地等は、特に限定されず、前述の宿主に応じた方法、培養条件および培地等を適宜採用できる。
【００６３】
＜本発明のキノプロテインＧＤＨの製造方法＞
本発明のキノプロテインＧＤＨの製造方法は、前述のように、本発明のキノプロテインＧＤＨを産生する形質転換体を培養する工程を含む。前記培養工程としては、特に制限されず、前述の宿主に応じた方法、培養条件および培地等を適宜採用できる。また、前記製造方法は、前記培養工程以外に、さらに他の工程を含んでいてもよい。前記他の工程としては、特に制限されないが、例えば、培養工程により得られる培養物を採取する工程、採取した培養物を精製する工程等が挙げられる。前記培養物としては、特に制限されないが、例えば、前述の培養物等が挙げられる。また、前記精製方法としては、特に制限されないが、例えば、前述の精製方法等が挙げられる。
【００６４】
＜本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体＞
本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体は、前述のように、アポ酵素である前記キノプロテインＧＤＨと、前記ＰＱＱとを含む。前記キノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体は、例えば、アポ酵素である前記キノプロテインＧＤＨに、ＰＱＱを結合（再構成）させたホロ酵素であってもよい。前記キノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体は、前記キノプロテインＧＤＨとＰＱＱを含む以外は制限されず、例えば、さらに他の物質を含んでいてもよい。前記キノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体に含まれる他の成分としては、特に制限されない。
【００６５】
本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体の製造方法は、例えば、本発明のキノプロテインＧＤＨの製造工程と、前記キノプロテインＧＤＨに、ＰＱＱを結合する結合工程（再構成工程）とを含んでいてもよい。前記結合工程は、特に制限されないが、例えば、前記キノプロテインＧＤＨと前記ＰＱＱとを、緩衝液中で反応させてもよい。前記緩衝液は、特に制限されないが、例えば、緩衝剤、無機塩類等を含んでもよい。前記緩衝剤としては、特に制限されないが、例えば、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液、Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４）等が挙げられる。前記無機塩類としては、特に制限されないが、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。前記ナトリウム塩は、特に制限されないが、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記カルシウム塩は、特に制限されないが、例えば、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、酢酸カルシウム等が挙げられる。前記反応温度は、特に制限されないが、例えば、４℃以上であり、好ましくは、４℃である。前記反応時間は、特に制限されないが、例えば、１６〜２０時間であり、好ましくは、１６時間である。
【００６６】
＜本発明のグルコース測定キット＞
本発明のグルコース測定キットは、前述のように、本発明のキノプロテインＧＤＨおよび本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体の少なくとも一方を含む。前記グルコース測定キットは、本発明のキノプロテインＧＤＨおよび本発明のキノプロテインＧＤＨ−補酵素複合体の少なくとも一方が含まれていればよく、その他の構成物は特に制限されない。前記その他の構成物は、特に制限されないが、例えば、緩衝剤、発色剤、ＰＱＱ、カルシウム塩等が挙げられる。前記緩衝剤としては、特に制限されず、例えば、前述の緩衝剤等が挙げられる。前記発色剤としては、特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ）、２−（４−イオドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１−メトキシ−ＰＭＳ）、２−（４−イオドフェニル)−３−（４−ニトロフェニル)−５−（２，４−ジサルフォフェニル)−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）等が挙げられる。
【実施例】
【００６７】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、以下の実施例により制限されない。
【００６８】
本例のキノプロテインＧＤＨは、以下のようにして、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株のゲノムＤＮＡから、キノプロテインＧＤＨ遺伝子をクローニングし、この遺伝子を導入した形質転換体の培養上清から精製した。
【００６９】
［キノプロテインＧＤＨ遺伝子］
以下のようにして、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株のゲノムＤＮＡから、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片をクローニングした。なお、配列番号５で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【００７０】
［発現ベクターの作製］
まず、以下のようにして、前記ＤＮＡ断片を含む発現ベクターを作製した。
【００７１】
チューブ内に、下記組成のＰＣＲ反応液５０μＬを添加し、プログラムテンプコントロールシステム ＰＣ−８１６Ｓ（アステック社製）を用いてＰＣＲを行った。前記ＰＣＲは、９８℃で１５秒、６５℃で２秒および７４℃で３０秒を１サイクルとして２５サイクル繰り返した。
【００７２】
（ＰＣＲ反応液の組成）
成分 配合量 最終濃度
ゲノムＤＮＡ ０．５μＬ（５００ｎｇ）
センスプライマー １．０μＬ（１００ｐｍｏｌ） ２μｍｏｌ／Ｌ
アンチセンスプライマー １．０μＬ（１００ｐｍｏｌ） ２μｍｏｌ／Ｌ
Ｂｕｆｆｅｒ＃１※ ５．０μＬ
塩化マグネシウム ２．０μＬ（５０ｎｍｏｌ） １ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰｓ ５．０μＬ（１０ｎｍｏｌ） ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ １．０μＬ（２．５Ｕ）
水 ３４．５μＬ
計 ５０．０μＬ
※Ｂｕｆｆｅｒ＃１の組成
成分 濃度
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ６０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ １００ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） １．２ｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００ １ｗ／ｖ％
ＢＳＡ ０．０１ｗ／ｖ％
【００７３】
なお、前記ＰＣＲ反応液における前記センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしては、以下のプライマーセットを用いた。
【００７４】
センスプライマー（配列番号７）
５’−ｃａｔａｔｇａｇｔｃｔｇｇｇｃｔｔｇｔｔｇａｃｃ−３’
アンチセンスプライマー（配列番号８）
５’−ａｇｇａｔｃｃｔｔａａｇｔｇｔｇｔｔｇｃｔｃａｇａｔａｃｇ−３’
【００７５】
プラスミドｐＥＴ１１ａと増幅した前記ＤＮＡ断片とを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理後、混合して連結し、発現ベクターを得た。前記発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに導入した。この大腸菌を、下記組成のＳＢ培地中で、３７℃で６時間培養した。得られた培養液１Ｌを、１０分間、遠心分離（７０００×ｇ）して、菌体を回収した。前記菌体を、０．８５ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液を用いて懸濁した。この懸濁液を、１０分間、再度遠心分離（７０００×ｇ）して、前記菌体を回収した。この菌体（菌体湿重量１０ｇ）を、０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）５０ｍＬに懸濁し、氷冷しながら、超音波破砕機を用いて破砕した。得られた破砕液を、２０分間、遠心分離（１５０００×ｇ）し、上清（粗酵素液）を回収した。ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）により、この粗酵素液のタンパク質量を測定した。
【００７６】
（ＳＢ培地の組成）
成分 濃度
バクトトリプトン １２．０ｇ／Ｌ
酵母エキス ２４．０ｇ／Ｌ
グリセロール ５ｍＬ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４ １２．５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ３．８ｇ／Ｌ
【００７７】
［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］
前記粗酵素液の酵素活性は、以下のようにして測定した。まず、所定濃度（１０、２０および３０μｇ／ｍＬ）の前記粗酵素液を含む下記組成の測定試薬１ｍＬに、１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度となるようにＤ−グルコースを添加し、５０℃で１０分間反応させた。５０℃の条件下、各反応液の測定波長６００ｎｍにおける吸光度を、分光光度計（セルの光路長０．４ｃｍ）を用いて測定した。なお、コントロールとして、前記粗酵素液を無添加とした以外は同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度変化量を下記式１に代入し、キノプロテインＧＤＨ活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）を算出した。なお、本例において、キノプロテインＧＤＨ活性 １単位（１ ｕｎｉｔ）とは、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素活性である。また、前記粗酵素液の前記タンパク質量とキノプロテインＧＤＨ活性から、前記タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性（比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ））および全タンパク質の酵素活性（総活性（ｕｎｉｔ））を算出した。
【００７８】
（測定試薬の組成）
成分 濃度
１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン
（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ、ｐＨ８） ５０ｍｍｏｌ／ｍＬ
ピロールキノリンキノン（ＰＱＱ） １．２μｍｏｌ／ｍＬ
２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ） ０．１ｍｍｏｌ／ｍＬ
粗酵素液 １０〜３０μｇ／ｍＬ
【００７９】
【数１】
【００８０】
［キノプロテインＧＤＨの精製］
前記粗酵素液を、８０℃で１０分間熱処理した。この処理酵素液を、ＨｉＰｒｅｐ ＳＰ強陽イオンクロマトカラム（ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）を用いて精製した。この精製酵素および前記処理酵素液について、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、タンパク質量と酵素活性を測定し、比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）および総活性（ｕｎｉｔ）を算出した。前記粗酵素液の総活性を１００％としたときの、前記処理酵素液および前記精製酵素の総活性の割合を、収率（％）として算出した。前記粗酵素液の比活性を１としたときの、前記処理酵素液および前記精製酵素の比活性の倍率を、精製倍率として算出した。また、前記粗酵素液、処理酵素液および精製酵素と分子量マーカーとを、熱変性還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００８１】
下記表１に、前記粗酵素液、処理酵素液および精製酵素のタンパク質量（ｍｇ）、総活性（ｕｎｉｔ）、比活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ）、収率（％）および精製倍率の結果を示す。
【００８２】
（表１）
タンパク質量 総活性 比活性 収率 精製倍率
（ｍｇ） （ｕｎｉｔ） （ｕｎｉｔ/ｍｇ） （％）
粗酵素液 ５５４．８４ ２８．８９ ０．０５２ １００ １
処理酵素液 ４６．０４ ２９．１６ ０．０６３ １０１ １２．１６
精製酵素 ２９．５９ ２２．９１ ０．７７ ７９ １４．８１
【００８３】
図１の写真に、前記粗酵素液、処理酵素液および精製酵素を、熱変性還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した結果を示す。同図において、レーン１は分子量マーカー、レーン２は粗酵素液、レーン３は処理酵素液、レーン４は精製酵素の泳動結果である。同図に示すように、キノプロテインＧＤＨの分子量は、約３３ｋＤａであった。
【００８４】
［最適温度］
所定温度（５０、６０、７０および７５℃）に加温した前記測定試薬に、Ｄ−グルコースを添加し、直ちに吸光度を測定した以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定し、酵素活性を算出した。
【００８５】
図２のグラフに、前記精製酵素の最適温度の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定温度（℃）であり、縦軸は、酵素活性である。同図に示すように、前記精製酵素の酵素活性は、７５℃において最も高かった。なお、前記ＤＣＩＰの褪色のため、７５℃を超えた温度条件では、測定できなかった。
【００８６】
［温度安定性］
前記精製酵素（アポ酵素）、ＰＱＱを再構成させた前記精製酵素（ホロ酵素、酵素−補酵素複合体）の温度安定性を、それぞれ評価した。まず、以下のようにして、前記ホロ酵素を調製した。すなわち、前記アポ酵素を、０．０２８６ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、下記組成の再構成液に添加し、４℃で１６時間反応させた。この反応液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５（ＰＤ−１０、ＧＥヘルスサイエンス・ジャパン社製）に添加して、酵素に結合していないＰＱＱを除去し、ホロ酵素を回収した。その後、同じカラムで緩衝液を１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に置換して、前記ホロ酵素を調製した。前記両酵素を所定温度（６０、７０、８０、９０および１００℃）で１０分間熱処理した。前記アポ酵素は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。前記ホロ酵素は、前記粗酵素液の濃度を３．６７μｇ／ｍＬとし、前記ＰＱＱを無添加とした前記測定試薬を用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた各吸光度を下記式２に代入して、残存酵素活性率（％）を算出した。
【００８７】
（再構成液の組成）
成分 濃度
ピロールキノリンキノン（ＰＱＱ） ０．２８ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００８８】
残存酵素活性率（％）＝Ａ／Ｂ×１００ ・・・（２）
Ａ＝熱処理後の各酵素を添加した反応液の吸光度
Ｂ＝熱処理なしの各酵素を添加した反応液の吸光度
【００８９】
図３のグラフに、各酵素の温度安定性の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定温度（℃）であり、縦軸は、残存酵素活性率（％）である。また、同図の各プロットは、前記アポ酵素が、黒丸（●）であり、前記ホロ酵素が、黒四角（■）である。同図に示すように、前記アポ酵素の残存酵素活性率は、６０〜８０℃において、約１００％であり、９０℃において、約６０％であった。前記ホロ酵素の残存酵素活性率は、６０〜１００℃において、約１００％であった。このように、ＰＱＱを再構築させていない前記精製酵素は、６０〜８０℃において、酵素活性が維持され、１００℃においても、約６０％の高い残存酵素活性率を有した。また、ＰＱＱを再構築させた前記精製酵素は、６０〜１００℃において、酵素活性が維持された。このように、前記精製酵素は、補酵素非結合の状態において、高い温度安定性を示し、補酵素が結合した状態では、さらに高い温度安定性を示した。
【００９０】
［最適ｐＨ］
前記精製酵素の最適ｐＨを、以下のようにして評価した。まず、前述のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ（ｐＨ８）に代えて、以下の、所定ｐＨに設定した５０ｍｍｏｌ／Ｌの各緩衝剤を用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度を下記式３に代入して、ｐＨ８．０２（ＨＥＰＥＳ）における酵素活性率を１００％としたときの比活性（％）を算出した。
【００９１】
（緩衝液）
緩衝剤 ｐＨ
リン酸緩衝液（ＫＰＢ） ６．３３、６．８２、７．３３
ＨＥＰＥＳ ６．９５、８．０２、８．４
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ７．４８、８．０５、８．５、８．９１
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ８、８．５、９
Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ ８．９３、９．４９
【００９２】
比活性（％）＝Ｃ／Ｄ×１００ ・・・（３）
Ｃ＝各ｐＨの反応液の吸光度
Ｄ＝ｐＨ８．０２（ＨＥＰＥＳ）の反応液の吸光度
【００９３】
図４および下記表２に、前記精製酵素の最適ｐＨの測定結果を示す。同図において、横軸は、測定ｐＨ（ｐＨ）であり、縦軸は、比活性（％）である。同図および同表に示すように、前記精製酵素の比活性は、ｐＨ８．０２において最も高かった。このように、前記精製酵素の酵素活性は、ｐＨ約８において最も高いことが示された。
【００９４】
（表２）
ｐＨ 緩衝剤 比活性（％）
６．３３ ＫＰＢ １０
６．８２ ＫＰＢ ２２．５
６．９５ ＨＥＰＥＳ ３７．５
７．３３ ＫＰＢ ４２．５
７．４８ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ６８．７５
８ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ８７．５
８．０２ ＨＥＰＥＳ １００
８．０５ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ８７．５
８．４ ＨＥＰＥＳ ６３．７５
８．５ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ８１．２５
８．５ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ８２．５
８．９１ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ７５
８．９３ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ ５０
９ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ ７７．５
９．４９ Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ ３０
【００９５】
［ｐＨ安定性］
前記精製酵素のｐＨ安定性を、以下のようにして評価した。まず、前述の［最適ｐＨ］測定に用いた各緩衝剤を１００ｍｍｏｌ／Ｌに調整した各緩衝液０．１ｍＬに、前記精製酵素４９．５μｇを添加し、７０℃で３０分間前処理した。この前処理液を、前記精製酵素量が１１μｇとなるように、前記測定試薬に添加した以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度を下記式４に代入して、ｐＨ１１における酵素活性を１００％としたときの比活性（％）を算出した。
【００９６】
比活性（％）＝Ｅ／Ｆ×１００ ・・・（４）
Ｅ＝各ｐＨの反応液の吸光度
Ｆ＝ｐＨ１１の反応液の吸光度
【００９７】
図５のグラフに、前記精製酵素のｐＨ安定性の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定ｐＨ（ｐＨ）であり、縦軸は、比活性（％）である。同図に示すように、前記精製酵素の比活性は、ｐＨ４〜１１において、８５％以上であった。このように、前記精製酵素は、幅広いｐＨ範囲で酵素活性が維持され、高いｐＨ安定性を示した。
【００９８】
［基質特異性］
前記精製酵素の基質特異性を、以下のようにして評価した。まず、前記Ｄ−グルコースに代えて、以下の各基質を用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、吸光度を測定した。得られた吸光度を下記式５に代入して、前記Ｄ−グルコースを基質としたときの酵素活性を１００％としたときの、比活性（％）を算出した。
【００９９】
比活性（％）＝Ｇ／Ｈ×１００ ・・・（５）
Ｇ＝各基質を含む反応液の吸光度
Ｈ＝Ｄ−グルコースを含む反応液の吸光度
【０１００】
下記表３に、基質特異性の測定結果を示す。同表に示すように、前記精製酵素は、種々のアルドースおよびケトースの基質に対する酵素活性を有した。
【０１０１】
（表３）
基質 比活性（％）
Ｄ−グルコース １００
Ｄ−マンノース ８４
Ｄ−キシロース ８６
Ｄ−リボース ８６
Ｄ−アロース １６０
Ｌ−アラビノース １６４
Ｄ−ガラクトース １８６
Ｄ−フルクトース １０
Ｄ−タガトース ３４
Ｌ−タガトース ４１
Ｄ−プシコース ２７
Ｌ−プシコース １４
Ｌ−フルクトース ２０
Ｄ−ソルボース １６
【０１０２】
［ＰＱＱ結合性］
前記精製酵素のＰＱＱ結合性を、以下のようにして評価した。すなわち、ＰＱＱ濃度を、１．２μｍｏｌ／Ｌに代えて、所定濃度（１、０．３３３、０．１１１、０．０３７および０μｍｏｌ／Ｌ）とした以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、各ＰＱＱ濃度におけるキノプロテインＧＤＨ活性を測定した。
【０１０３】
図６のグラフに、前記精製酵素のＰＱＱ結合性の測定結果を示す。同図において、横軸は、ＰＱＱ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、縦軸は、酵素活性（Ｕ／ｍｇ）である。同図に示すように、前記精製酵素の活性は、ＰＱＱ ０．１１〜０．３３３μｍｏｌ／Ｌ間で直線的に増加し、１μｍｏｌ／Ｌのときに、最も高い活性（０．７７Ｕ／ｍｇ）を示した。
【０１０４】
［ＰＱＱ結合におけるカルシウムイオンの影響］
前記精製酵素のＰＱＱ結合（ＰＱＱ再構成）における、カルシウムイオンの影響を評価した。まず、以下のようにして、カルシウムイオン存在下で再構成させたホロ酵素（以下、「ホロ酵素（Ｃａ＋）」という）と、カルシウムイオン不在下で再構成させたホロ酵素（以下、「ホロ酵素（Ｃａ−）」という）とを調製した。前記ホロ酵素（Ｃａ−）は、前述の［温度安定性］と同様にして調製した。前記ホロ酵素（Ｃａ＋）は、１ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カルシウムを添加した前記再構成液を用いた以外は、前述の［温度安定性］と同様にして調製した。前記精製酵素（アポ酵素）に代えて、これらのホロ酵素を用い、前記測定試薬として、ＰＱＱを含まない前記測定試薬とＰＱＱを含む前記測定試薬とを用いた以外は、前述の［キノプロテインＧＤＨ活性の測定］と同様にして、各ホロ酵素の酵素活性を測定した。また、分光光度計を用いて、２５０〜５５０ｎｍにおける各ホロ酵素および前記精製酵素（アポ酵素）の反応液の吸光度を測定した。
【０１０５】
図７のグラフに、各ホロ酵素および前記精製酵素（アポ酵素）について、吸光度の測定結果を示す。同図において、横軸は、測定波長（ｎｍ）であり、縦軸は、吸光度である。同図に示すように、前記ホロ酵素（Ｃａ＋）およびホロ酵素（Ｃａ−）は、共に、３５０ｎｍ付近にＰＱＱの吸収を示すピークが認められた。他方、アポ酵素は、同じ波長領域にピークが認められなかった。したがって、ホロ酵素（Ｃａ＋）およびホロ酵素（Ｃａ−）共に、ＰＱＱの結合が確認された。また、ホロ酵素（Ｃａ＋）およびホロ酵素（Ｃａ−）の酵素活性は、前記測定試薬中にＰＱＱを含む場合と、ＰＱＱを含まない場合とで、変化しなかった。このため、アポ酵素からホロ酵素への転換において、カルシウムイオンは不要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上のように、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、耐熱性および耐ｐＨ性に優れ、温度安定性およびｐＨ安定性に優れる。したがって、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素は、幅広い温度およびｐＨ条件下で安定的に利用可能である。このため、本発明のキノプロテイングルコース脱水素酵素の用途は、例えば、その基質特異性を利用した様々な用途が挙げられ、広い分野に適用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）から（６）の性質を有する、キノプロテイングルコース脱水素酵素。
（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）：３３±６ｋＤａ
（２）一量体タンパク質
（３）最適ｐＨ：ｐＨ７〜９
（４）最適温度：７５℃以上
（５）温度安定性：８０℃以下
（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１
【請求項２】
ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体に由来する請求項１記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項３】
前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体が、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体である請求項２記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項４】
前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体が、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株である、請求項３記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項５】
配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなる、請求項１から４のいずれか一項に記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項６】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質からなる、キノプロテイングルコース脱水素酵素。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素と、ピロールキノリンキノンとを含む、キノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素および請求項７記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体の少なくとも一方を含むグルコース測定キット。
【請求項９】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とするキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項１０】
下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子である、キノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【請求項１１】
請求項９または１０記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換体を培養する工程を含む、キノプロテイングルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１】
下記（１）から（６）の性質を有する、キノプロテイングルコース脱水素酵素。
（１）分子量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）：３３±６ｋＤａ
（２）一量体タンパク質
（３）最適ｐＨ：ｐＨ７〜９
（４）最適温度：７５℃以上
（５）温度安定性：８０℃以下
（６）ｐＨ安定性：ｐＨ４〜１１
【請求項２】
ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体に由来する請求項１記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項３】
前記ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属の菌体が、ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体である請求項２記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項４】
前記ピロバキュラム・エアロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）種の菌体が、ピロバキュラム・エアロフィラム・エスティーアール（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ ｓｔｒ．）ＩＭ２株である、請求項３記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項５】
配列番号１または２のアミノ酸配列における配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列以外の配列において、１以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質からなる、請求項１から４のいずれか一項に記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素。
【請求項６】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質からなる、キノプロテイングルコース脱水素酵素。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素と、ピロールキノリンキノンとを含む、キノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素および請求項７記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素−補酵素複合体の少なくとも一方を含むグルコース測定キット。
【請求項９】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードすることを特徴とするキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子。
（ａ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１または２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入または欠失したアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１または２のアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、キノプロテイングルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質
【請求項１０】
下記（ｄ）から（ｇ）のいずれかの遺伝子である、キノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子。
（ｄ）配列番号５の塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｅ）配列番号５の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｆ）配列番号５の塩基配列と４０％以上の相同性を有する塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
（ｇ）配列番号５の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子
【請求項１１】
請求項９または１０記載のキノプロテイングルコース脱水素酵素遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換体を培養する工程を含む、キノプロテイングルコース脱水素酵素の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−８３２５１（Ｐ２０１１−８３２５１Ａ）
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３９９０２（Ｐ２００９−２３９９０２）
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【Ｆターム（参考）】
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