キメラポリペプチドおよびその使用
【課題】ＤＮＡ修復活性を制御する細胞システムおよび細胞周期制御の研究に係る分子および方法の提供。
【解決手段】特定のＤＮＡ配列と結合する特定のアフィニティーを有するポリペプチド領域、およびＤＮＡ修飾活性を有するポリペプチド領域を優先的に含むキメラ分子であって、輸送能力を有する領域が存在するため、生体膜を通過することができるキメラ分子。さらに、該キメラ分子をコードする単離されたポリヌクレオチド、および、該ＤＮＡを導入することで、細胞周期調節および細胞チェックポイントを阻害すると共に、該ポリペプチドを使用して細胞中のＤＮＡの特定部位を修飾する。また、新規輸送活性または輸送活性の組み合わせをスクリーニング、抗増殖性物質、抗腫瘍性物質、抗生物質、駆虫物質または抗ウイルス物質として、該ペプチドを使用する。
【解決手段】特定のＤＮＡ配列と結合する特定のアフィニティーを有するポリペプチド領域、およびＤＮＡ修飾活性を有するポリペプチド領域を優先的に含むキメラ分子であって、輸送能力を有する領域が存在するため、生体膜を通過することができるキメラ分子。さらに、該キメラ分子をコードする単離されたポリヌクレオチド、および、該ＤＮＡを導入することで、細胞周期調節および細胞チェックポイントを阻害すると共に、該ポリペプチドを使用して細胞中のＤＮＡの特定部位を修飾する。また、新規輸送活性または輸送活性の組み合わせをスクリーニング、抗増殖性物質、抗腫瘍性物質、抗生物質、駆虫物質または抗ウイルス物質として、該ペプチドを使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ修復活性を制御する細胞システムおよび細胞周期制御の研究に係る分子および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物のゲノムは、自発的な内因性の化学的または生化学的損傷によって生じる化学損傷、あるいは外因的なゲノム損傷物質に曝されることによって生じる化学的損傷に常に曝されている。
【０００３】
ゲノムの安定性に必要な進度を保障する一方で、すべての生物種にとって必要不可欠な進化および適応に必須のゲノムの不安定性を供給するため、非常に複雑なＤＮＡ修復およびＤＮＡ組換え装置に関するシステムが細胞内で進化してきた。一方でゲノムの厳密性のため、他方で分子の多様性を生み出すための２つのシステムの間にある平衡は、正確性および精密性を保障する制御機構によって調節されている。その制御のレベルは、いわゆる「チェックポイント」または「サーベイランス制御」によって実現され、すべての生物においてゲノムの厳密性を保障している。関係する機構および既知遺伝子についての報文、並びに参考文献の目録に関しては、Zhou B.およびS,Elledge、Nature、2000、408:433-439を参照のこと。
【０００４】
近年、ＤＮＡ修復に関与する機構を分析するための分子ツール、およびさらに重要なものとして、それらの機構を制御および調節するための分子ツールが数多く開発された。例えば、米国特許第６，３０７，０１５号では、プロテインＣｈｋ１に基づく製品および方法が記載されており、それらは、Ｃｈｋ１プロテインによって、細胞チェックポイントおよびＤＮＡ修復の制御に重要な機構および遺伝子産物を同定できる、と規定されている。
【０００５】
さらに、細胞のゲノムでの組換え導入方法が開発された：一例として、Peitz等は、Proc. Natl. Acad. Sci.、2002、99: 4489-4494にて、以前は５０％の導入効率でゲノムに導入されていたｌｏｘ−Ｐ部位と組み換えることのできるキメラＣｒｅ組換え酵素の翻訳物を得た。さらに、国際公開第００／４６３８６号には、メガヌクレアーゼ(meganuclease)ＳｃｅＩを発現するベクターを組み合わせて、特異的に導入されたＳｃｅＩ部位での染色体組換え導入法が記載されている。
【０００６】
遺伝毒性のある物質を用いて誘導をかけた後にＤＮＡ損傷の修復を分析することが困難なのは、そのすべてのＤＮＡ損傷物質が様々なタイプのＤＮＡ病変を広範囲にわたって同時に引き起こすことから、単一特異的様式でＤＮＡに作用するシステムの導入には非常に関心がある。それは、細胞周期を制御する経路および特にＤＮＡ修復に関与する遺伝産物を詳細に規定することを可能にし得る。これらの経路の効率は、正確な細胞複製に必須であり、それらを詳細に理解することで、より選択的な医薬およびより方向性をもった治療介入をスクリーニングするシステムの開発が可能となる。
【０００７】
広範な身体的および遺伝的疾患は、ＤＮＡ修復機構における、またはより一般的にはＤＮＡにコードされた遺伝情報の制御における欠陥と関連している。これら欠陥の多くが、腫瘍病理学の根本原因であるが（例えば、ｐ５３、ＡＲＦ、１４−３−３シグマ、ｐ１６、Ｒｂなどの遺伝子の突然変異）、さらにこれらの欠陥は、「身体的突然変異（somatic mutations）」または「遺伝的疾病素質（genetic preposition）」として単純に分類されており、これまでの特徴付けがなされていない多くの病状に関与するかもしれない。既に特定された１つの経路における突然変異があるが、それは遺伝的疾病の遺伝的根拠を構成し、それら遺伝子疾病には、毛細血管拡張性運動失調症（Ａ−Ｔ）、運動失調（atassia）と関係のある疾患（毛細血管拡張性運動失調様疾病ＡＴＬＤ、Ｍｒｅｌｌ）、ネイメーヘン染色体不安定症候群（Nijmegen breakage syndrome）（ＮＢＳ）、ファンコーニ貧血、ロトムンド・トムソン症候群、非ホジキンリンパ腫(Non Hodgkin lymphomas)（ＮＨＬ）、ウェルナー症候群、ブルームズ症候群、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）症候群、色素性乾皮症、ＢＲＣＡ１がある。
【０００８】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ゲノムの最も危険な損傷である。これは、例えば電離放射線、外的原因や内的条件（例えば細胞ストレス）から生じ得る活性酸素種（ＲＯＳ）により導入され得る。また、ＲＯＳは、腫瘍治療に使用される化学療法剤、例えばＤＮＡ挿入剤またはＤＮＡ架橋剤により誘導される。ＤＳＢの修復は、他のＤＮＡ損傷よりも困難で、ＤＳＢ末端の修復イベントおよび連結反応により、遺伝物質の喪失、増幅または修飾が生じるため遺伝的に不安定となり、また腫瘍化する可能性がある。
【０００９】
これらの事象が修復経路およびその細胞制御を誘起することから、それらを理解することは、次の治療への使用の可能性を提供するために、基本的に興味深いことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，３０７，０１５号
【特許文献２】国際公開第００／４６３８６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Zhou B.およびS,Elledge、Nature、2000、408:433-439
【非特許文献２】Peitz等は、Proc. Natl. Acad. Sci.、2002、99: 4489-4494
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ修復機構または遺伝情報の制御における欠陥を治療するための有効物質を供給することである。好ましくは、これらの物質は、提供すべき場所でその活性を提供するために、細胞または特に核に輸送されなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、
ａ．特定のヌクレオチド配列に対してアフィニティーを示すポリヌクレオチド
ｂ．ＤＮＡ修飾酵素
ｃ．細胞内輸送活性を有する領域
を含むキメラポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明は、本発明のキメラ分子を用いて、ゲノム中の同種の特定部位を示す、ＤＳＢを導入することによって細胞ゲノムを修飾するシステムを提供する。本発明のキメラ分子の有利なことには、直線的な反応速度活性、単一特異的活性、および該分子が受容体非依存的な形式で全ての細胞集団に浸透することが可能である事実がある。好都合なことに、これらのイベントは、選択的に試薬を選ぶことなく誘導できるので、これらの使用は非常に単純である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】大腸菌からのＳＣＰＶＵＴＡＴ精製を示す図。
【図２】タンパク質形質導入後にＵ２ＯＳ細胞から抽出したタンパク質の免疫学的分析を示す図。
【図３】共焦点顕微鏡による免疫蛍光分析を示す図。
【図４】単一細胞レベルでＤＳＢを検出するためのＴＵＮＥＬ分析を示す図。
【図５】ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるヌクレアーゼ依存的細胞周期の遅延を示す図。
【図６】ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるキナーゼ活性を示す図。
【図７】ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期停止に対する生化学的マーカーを示す図。
【図８】ＡＴＭ突然変異細胞（ＡＴ-５）のＳＣＰＶＵＴＡＴによる細胞周期阻害誘導およびコロニー形成活性を、非突然変異細胞（ＭＲＣ-５）と比較する図。
【図９】ＮＨＥＪ経路に関与する単一タンパク質における、選択された突然変異体を有する細胞のコロニー形成活性の比較に関する図。
【図１０】ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の神経芽腫細胞における種々のアポトーシス誘導に関する図。
【図１１】低濃度のＳＣＰＶＵＴＡＴと亜致死濃度のＨ２Ｏ２との相乗効果を示す図。
【図１２】ヒストン２ＡＸＳｅｒ-１３９のリン酸化効果、およびＰＩ３／ＡＴＭキナーゼ阻害剤であるウォルトマンニン（Wortmanin）によるこの効果の阻害作用の顕微鏡分析を示す図。
【図１３】自動分析によるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ）の突然変異細胞についての感受性の決定に関する図。
【図１４】ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期制御タンパク質の細胞内分布を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第一の実施形態は、特異的ＤＮＡ結合活性を有する、好都合にはクラスＩＩ制限酵素から由来のポリペプチド特性の好ましい領域；好都合にはエンドヌクレアーゼ活性からなる触媒ＤＮＡ修飾活性を示すポリペプチド特性の好ましい領域；ならびに細胞膜および／または核膜を通過する輸送活性を有する領域から成るキメラ分子に関する。上記機能性領域が、好ましくは相互に共有結合している。
【００１７】
本発明の他の重要な実施形態は、本発明のキメラ分子が完全に、または部分的にポリヌクレオチドの性質を有している場合には、それらをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１８】
本発明のその他の実施形態については、ＤＮＡ二本鎖切断を導入することで細胞周期制御およびチェックポイントの制御の重要なポイントを阻害する本発明ポリペプチドの活性から導かれるものとして、本発明には、インビボ(in vivo)で細胞において本発明キメラ分子を使用することにより特徴づけられる様々な方法が含まれる。特に、本発明に係る方法には、細胞周期およびＤＮＡ修復の制御に関与する生成物をコードする遺伝子の遺伝的損傷を評価する診断方法が含まれ、かかる制御活性を調節できる生物学的活性有する組成物を選択する方法も含まれる。
【００１９】
また、本発明には、新規輸送活性または輸送活性の組み合わせをスクリーニングするために、本発明のキメラ分子を使用する方法も含まれる。
【００２０】
さらに、本発明は、抗増殖物質、抗腫瘍性物質、抗生物質、駆虫物質または抗ウイルス物質として前記組成物を治療上使用すること提供する。
【００２１】
本発明の様々な態様は、単一特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）をインビボで細胞のゲノムに導入することができ、そのＤＳＢが細胞周期の制御ポイント（チェックポイント）を活性化するのに十分なシグナルを示すという、本発明者らにより得られた実験結果に基づいている。これらの活性化は、そのほとんどが酵母からヒトへの進化を通じて保存されており、同様のメカニズムは原核生物や原始細菌中にも存在する。
【００２２】
真核生物において、これらの活性化は、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症突然変異タンパク質)、ＡＴＲ(毛細血管拡張性運動失調症関連)、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ(ＤＮＡ依存性プロテイン−キナーゼ−触媒サブユニット)およびこれらの直接的または間接的な基質、例えばＣｈｋ１（チェックポイント−キナーゼ１）、Ｃｈｋ２（チェックポイント−キナーゼ２）、Ｂｒｃａ１（乳癌感受性−１）、Ｂｒｃａ２（乳癌感受性−２）、Ｍｒｅ１１（減数分裂性組換え１１）、Ｒａｄ５０（放射線５０二本鎖切断修復）、Ｎｂｓ１（ネイメーヘン染色体不安定症候群）、Ｒａｄ５１（放射線５１二本鎖切断修復）、ＦＡＮＣＤ２（ファンコーニ貧血相補Ｄ２）、ヒストン、ＢＬＭ（ブルーム症候群突然変異）などのヘリカーゼ、ＷＲＮ（ウェルナー症候群突然変異）、ｐ５３、ｐ５３の直接的または間接的な転写標的、例えばｐ２１および１４−３−３シグマなど、に由来する遺伝産物によって媒介されるが、このリストは完全なものではなく、またその他の多くの標的は既知のものや未だ発見されていないものがある。
【００２３】
特に、この遺伝子産物の幾つかの活性化によって、ＤＮＡ修復、アポトーシスまたは細胞周期阻害において、ゲノム完全性（integrity）に対するホメオスタシスの維持を調整し得ることが分かった。
【００２４】
本発明は、細胞膜を通過でき、真核生物細胞の場合には核に、または細胞中の寄生体に進入して、ＤＮＡ二本鎖の特定部位に結合して、理想的には一次速度則でＤＮＡを修飾するキメラ分子を提供する。
【００２５】
明らかに、この知見およびその使用形式は、医薬はもとより科学的目的のために広く実用化の道を開き、さらに、一般的なＤＮＡ修復、ＤＮＡ修復の制御および細胞周期の制御のメカニズムを研究する独特の方法に、並びに選択的な形態で全ての細胞のゲノムを修飾することができる生成物に応用される。
【００２６】
第一の実施形態において、本発明キメラ分子には、以下の３つの機能的構成要素：
−特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対してアフィニティーを示す領域であって、好ましくはポリペプチドからなる領域。この領域は、ＤＮＡ中のパリンドローム配列を認識することができる、クラスＩＩ制限酵素、そのサブユニットまたは機能性フラグメントであることが好ましい；
−ＤＮＡまたはＲＮＡ触媒活性を示す領域であって、好ましくはポリペプチドから構成される領域であり、この活性には、限定するわけではないが、例えば、メチル化酵素、アセチル化酵素、ＣＡＤ阻害物質（ＩＣＡＤ）および活性剤ＥｎｄｏＧを有するまたは有しないカスパーゼ活性化ＤＮＡｓｅｓ（ＣＡＤ）、Ｒｎａｓｅ、ＤＮＡまたはＲＮＡ−リガーゼ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼおよびトポイソマーゼ、あるいはこれらのサブユニットもしくは機能性フラグメントが含まれるが、好ましくは酵素および好ましくは制限酵素、さらにより好ましくはクラスＩＩ制限酵素のエンドヌクレアーゼ活性が含まれる；
−細胞膜および／または核膜を通過でき、異種分子を細胞内および細胞小器官に運搬できる輸送活性を有する領域；この活性は「デリバラー」と称するが、「デリバラー」としては、細胞の生体膜を貫通でき、真核生物の場合には、さらに細胞膜および核膜もしくは、ミトコンドリアまたは色素体を含む他の細胞小器官の膜を貫通できる、好ましくはポリペプチドまたはペプチド、さらに脂質、リポソーム、有機または無機化合物もしくはナノ粒子からなる化学構造を意味する。特に、核内に運搬できるデリバラーが好ましい
が、含まれる。
【００２７】
上記の機能性ドメインは好ましくは共有結合している。本発明のキメラ分子は、化学合成して得ることができ、あるいはその機能性領域がペプチド性質の領域である場合には、組換えＤＮＡ技術により好ましくは合成して得ることができる。この実施形態では、および本発明では、上記の３つの機能性領域を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、好ましくは原核生物起源の宿主系において組換えポリペプチドを発現するのに役立つ。
【００２８】
本発明のキメラ分子は化学的方法または組換え法によるなどの混合技術によって生成することもできるが、少なくとも１つの領域は組換えＤＮＡ技術により産生された他の２つの産物と化学的方法によって結合されるものである。
【００２９】
本発明のキメラ分子の好ましい実施形態において、特異的ＤＮＡ結合活性を有する領域はクラスＩＩエンドヌクレアーゼ由来である。エンドヌクレアーゼの中から、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｆＩまたはそれらのサブユニットもしくは機能性フラグメントが優先的に選択される。本発明の以下の記載において、機能性フラグメントとしては、アミノ酸配列として、天然酵素の少なくとも１つの機能を含む、完全型タンパク質の１つの配列から部分的に派生した配列を含むポリペプチドを意味する。
【００３０】
別の好ましい実施形態においてもまた、ＤＮＡ修飾活性の領域は、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼであり、また特異的ＤＮＡ結合活性を含む同じエンドヌクレアーゼ、特にＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｆＩ、またはそれらの機能性サブユニットもしくは機能性フラグメントから選択される。この好ましい実施形態においては、単一のホモ二量化タンパク質中にＤＮＡ認識およびＤＮＡ修飾活性が連結されている。
【００３１】
この最後のケースでの好ましい実施形態において、制限酵素が一本鎖の分子として含まれていることが有利であるが、野生型酵素と比較して結合と切断の特性を維持している、Simoncsits A.等、J. Mol. Biol、2001、309:89-97にて酵素ＰｖｕＩＩについて記載されているように、酵素のすべてのサブユニットが共有結合されており、一本鎖ポリペプチドとして発現される。
【００３２】
発明者らは、さらに、本発明の範囲内において、制限酵素を一本鎖のタンパク質として有しており、制限酵素の修飾活性領域、サブユニットまたは触媒ドメインが点突然変異、欠失またはその他の構造変化によって、その修飾活性が変化または欠如し、且つ、同種ＤＮＡの認識能および結合能に関して、天然酵素と同等のアフィニティーを維持している、キメラ分子を開発した。特に好ましい突然変異体には、核酸に対する結合活性を実質的に維持（または増強）しているが、酵素（切断）活性を（相当部分（例えば＞５０％）またはほとんど（＞８０％））失っている突然変異体が含まれる。
【００３３】
本発明の最後の態様として、少なくとも、形質導入、細胞内輸送またはデリバラーに関する領域と、上記のようにアミノ酸配列が特定のＤＮＡ配列に対するアフィニティーを示す事実によって特徴付けられるＤＮＡ結合領域とを含むことがあるのは、好ましくはエンドヌクレアーゼの性質であり、少なくともクラスＩＩ制限酵素と９５％の相同性を有するものである。このようなキメラ分子については、その酵素活性は失われているため、修飾能力を発揮することなく、ゲノム中の特定のＤＮＡ配列に輸送するためにベクターとして使用される。本発明のこの態様の好ましい実施形態としては、Nastri等、1997、J. Biol. Chem. 272:25761-25767に開示されているように、ＰｖｕＩＩ酵素（例えばＳＣＰＶＵＴＡＴ中）の天然配列の代わりに、酵素ＰｖｕＩＩの３４位における置換突然変異（Ａｓｐ３４／Ｇｌｙ３４）によって得られる触媒部位の突然変異体Ｄ３４Ｇを用いることで得られるキメラ酵素が挙げられる。この変異型酵素（ＳＣ３４）では、ＤＮＡ認識活性は野生型酵素と同等であるが、エンドヌクレアーゼ活性を失っている。このような分子は、修飾活性を示すキメラ分子と並行して用いる、コントロールとして有用である。
【００３４】
細胞膜および／または核膜を通過するデリバラーまたは輸送領域は、好都合には、ペプチドである。これらは、ＨＳＶのタンパク質ＶＰ２２、アンテナペディアプロテインのホメオドメインの第３番目のアルファ−へリックス、ＨＩＶ−１のプロテインＴａｔおよびＲｅｖ、またはそのフラグメントもしくは機能性突然変異体の中から選択されることが好都合である。機能突然変異の例としては、Ho等、2001、Cancer Res.、61:474-577に記載されているものがある。好ましい実施形態は、Ｔａｔ由来のペプチド、およびペプチドＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳのＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列（Ｔａｔ領域の４７−５７に相当する）を有する機能ドメインを含むペプチドがある。ＨＯ等の文献に記載されているペプチド内のこのペプチドの機能性突然変異体が互換使用される。他の実施形態において、デリバラー配列は、いかなる種類のいかなる細胞型、およびウイルスを含む寄生体に対して特異性を有し得る。例えば、配列は、原核生物中にキメラ分子を特異的に導入させる細菌デリバラー配列から選択される。実施形態として、限定するものではないが、細菌デリバラーは、Rajarao等、2002、FEMS Microbiology Letters;215:267-272に記載および概説されているオリゴペプチド配列から選択することができる。これらのペプチドには、配列ＣＦＦＫＤＥＬのような大腸菌の膜を通過して運搬するためのＦＫＤＥモチーフおよびその機能的誘導体が含まれ得る。Ｓ.ａｕｒｅｕｓの場合には、例えばＶＬＴＮＥＮＰＦＳＤＰのようなＰＦＳを含むモチーフを用いてもよく、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの場合にはＰＦＳを含むモチーフとしてＹＫＫＳＮＮＰＦＳＤを用いてもよい。その他の例において、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファの相同体など酵母中に進入するための当分野で既知の配列および／または核導入配列と組み合わせた要素を含む本発明の分子は、酵母細胞特異的な輸送に使用できる。様々な酵母株に輸送するための配列の例としては、Riezman等、1997;Cell 91, 731-738、およびRajarao等、2002、FEMS Microbiology Letters;215:267-272に記載されおり、特にＰＦＳ−、ＹＱＲ−、ＰＦＲ−、ＰＭＦ−またはＤＣＭＤ−を含むモチーフが挙げられる。
【００３５】
本発明のこの態様の好ましい実施形態は、細菌膜を通過でき、またそのＤＮＡを標的にして切断することができる、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼの使用である。制限酵素は、原核生物界において最も有効で、高度に発展した自然発生的なキラーシステムである。酵素ヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ損傷活性の膨大な増幅と共通点があり、ごく僅かの酵素だけが細菌成長を阻止するために必要とされる。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、これらキメラ分子を抗生物質活性のために使用してもよく、また有利には、非常に選択的な方法で細菌の増殖を阻止するために使用してもよい。細菌性デリバラーはヒト細胞のような他種の細胞型に侵入せず、逆に、ＴＡＴ配列のようなデリバラーは細菌細胞に侵入しないと考えられる。
【００３６】
抗生物質、抗腫瘍物質（例えば、細胞増殖抑制剤）および他のさらなる活性物質は、本発明による物質により特異的に輸送され、好ましくはそのようなさらなる活性物質に本発明のポリペプチドを共有結合させることにより、特異的に輸送されてもよい。
【００３７】
特に有利な実施形態において、デリバラーあるいは細胞膜および／または核膜もしくは細胞小器官膜を通過して運搬するための領域には、付加的な修飾成分または「補助」領域、好ましくはポリペプチドまたは化合物が含まれていてもよい。このドメインを、デリバラー配列と結合させるか、また本発明のキメラ分子の任意の部位に配置させることができる。この分子の付加は、当分野に周知の技術、例えば組換え技術または化学カップリングなどを用いて行うことができる。実施形態として、限定するものではないが、本発明のキメラ分子を細胞型特異的（cell type specific）にするため、細胞型特異的結合部位、例えば腫瘍特異的増殖受容体に対して結合する部位を有する補助ドメインを付加する。その例として、Ｈｅｒ２、ＴＧＦβ ＲＩまたはＣＤ２０受容体がある。これは、ＥＧＦの結合フラグメントおよび、ＴＧＦβまたはＦｖもしくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン断片を補助ドメインに付加することにより得ることができる。詳細な実施形態において、制限酵素はその天然二量体型で用いられるが、Ｎ末端の１番目のタンパク質には、機能性ＣＤＲＬ領域を含む特定の軽鎖免疫グロブリン断片が結合され、また、ホモ二量体の他のタンパク質のＮ末端には、機能的ＣＤＲ１−３Ｈ領域を含む種々の重鎖免疫グロブリンタンパク質が連結されている。キメラタンパク質は、軽鎖重鎖の二量化により、また、制限酵素のドメインの二量化により、二量体化することができる。それゆえ、これにより、特定の細胞型に特異的な選択的結合を実現でき、選択された細胞への本発明のキメラタンパク質の優先的な取り込み吸収を著しく増加させ得る。これは、かかる補助ドメインが複合的であることの証拠となる。付加配列、例えば、細胞内のミトコンドリアまたは寄生ＤＮＡ（例えば、ウイルス、無脊椎動物および細菌感染細胞）などの非染色体ＤＮＡを特異的に標的とする配列、を付加することができる。その他の実施形態として、デリバラーを増強する要素を付加することもできる。
【００３８】
特に好都合な実施形態において、キメラ分子は、ＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｆＩが、好ましくは２個またはそれ以上のグリシン、さらにより好ましくは配列ＧＳＧＧまたはＧＳＧＧＳＧＳＧＧを優先的に含むペプチドリンカーにより連結されたサブユニットを有するクラスＩＩ制限酵素からなる。この他に、当該分野で既知の同様のペプチドリンカーを、活性機能を維持させたままホモ二量体サブユニットを共有結合させる目的で使用してもよい。
【００３９】
キメラ分子には、例えばポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ−タグまたはプロテインＡ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、ビオチンのような当分野で周知の精製に有用なポリペプチド配列を任意に含ませることができる。
【００４０】
本発明のキメラ分子の特に好ましい実施形態としては、配列番号：２により表され、それは、一本鎖タンパク質（ＳＣＰＶＵ）として、連結された２つのサブユニットを有する制限酵素ＰｖｕＩＩがＤＮＡ結合アフィニティーおよびエンドヌクレアーゼ活性によるＤＮＡ修飾活性についてのドメインまたは領域を担い、さらにＴａｔのペプチドＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳが細胞質間デリバリーサブユニットを担っている。
【００４１】
本発明のキメラタンパク質の有利な実施形態の１つは、血清存在下での細胞培養培地中においても安定なことである。当分野において技術的に可能な範囲で、Ｌ型配置を有するアミノ酸をＤアミノ酸または非天然アミノ酸で置き換えることにより、その安定性を最終的に増大させることができる。かかるキメラタンパク質の変異体は、点突然変異の場合のように、好ましくは制限酵素と同じ酵素活性を示し、または分子中で同じヌクレオチド活性を失っている場合にはコントロールとして用いられ、こうしてこれらの変異体は本発明に含まれる。
【００４２】
本発明にさらに含まれるものとして、本発明のキメラ分子、およびその組換え体の性質の全部または一部である分子をコードする単離されたポリヌクレオチドがある。このポリヌクレオチド配列の好ましい実施形態は、配列番号：１によって表され、それには、化学的一本鎖型のＰｖｕＩＩ酵素がコードされており、またヌクレオチド配列番号：３によりコードされている配列番号：４に対応したタンパク質デリバリー領域がコードされている。この好ましい実施形態は、ニッケルＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーによりキメラタンパク質を容易に精製できる、ポリヒスチジンタグがさらに含まれている。
【００４３】
さらに本発明には、キメラ分子がポリペプチドであって、例えばSambrookおよびManiatis, 1989, CSH edに記載されているような当業者に周知の方法による組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができるキメラ分子を含み、理解し得る全てをコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。これらの方法との一致において、また例えば他の制限酵素について、合成リンカーとして用いられるペプチドについて、あるいはアフィニティー精製に用いられるペプチドについて記載されるように、当該分野における技法は本発明の理解と本質的に異なるところのない理解を生み出すことができ、かくしてそれらの理解も本発明に含まれる。
【００４４】
さらに、本発明に含まれるものとして、本発明のキメラ分子について特に有利な実施形態であって、特にヌクレアーゼ活性を損なっているが、ＤＮＡに結合するキメラ分子、またＲＮＡに結合するキメラ分子が含まれる。この実施形態において、キメラ分子のＤＮＡまたはＲＮＡ結合活性は、細胞中で特定の核酸を標的とする分子として使用できる。これにより、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに積荷として化合物を運搬できるようになる。この場合、特定の化合物は、組換え技術または化学カップリングにより、このキメラ分子と共有的にまたは非共有的に結合されている。そのような化合物の例として、限定するものではないが、ナノ粒子、無機または有機化合物およびそれらの組み合わせであるか、例えば、限定するものではないが、放射性化合物、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、エトポシド、シスプラチンのような化学治療剤、および他の放射性模倣物、またＤＳＢ含有物質、抗体および抗体断片、蛍光分子のような色素化合物、天然または非天然核酸、酵素活性を有するかまたは有しないペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。化学カップリングは、例えばキメラ分子中の還元されたシステインとマレイミド活性化化合物をカップリングする当分野にて周知の方法を用いて達成できる。例えばＰｖｕＩＩのように、天然にシステインを含まない本発明のキメラ分子の場合には、システインを当分野に周知の組換えまたは合成技術により導入することができる。さらなる例として、遊離アミノ基へのブロモシアンカップリングを用いてもよい。特に好適なカップリング法には、選択された化合物を用いて、タンパク質をスプライシングし、そしてタンパク質を再結合することにより達成することができる。分子は、精製のためにタンパク質に融合された様々なタグ、例えばポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ‐タグまたはプロテインＡタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡ−タグ、ビオチンなどにカップリングすることもでき、さらに、例えば限定するものではないが、抗体、抗体断片またはグルタチオン含有化合物にカップリングすることもできる。このような方法で本発明タンパク質と結合された分子を、化学試薬およびＵＶを用いて随意に架橋結合させることができる。限定するものではないが、これらのカップリング方法については、例えば、特にキメラ分子中の標的部位はＮまたはＣ末端部位に存在する。一本鎖型の場合にも、２つのサブユニット間にリンカーを好適に用いることができる。
【００４５】
さらに、上記のポリヌクレオチド配列を含むベクター、特に、一般的に組換えタンパク質を大量に発現できる、原核生物における発現用ベクターが含まれる。
【００４６】
本発明の好ましいキメラ分子（ＤＮＡ修飾酵素はクラスＩＩ制限酵素である）を使用することで、既定の酵素に認識される部位、好都合には、配列ＣＡＧ／ＣＴＧ（ＰｖｕＩＩ）、ＧＡＴ／ＡＴＣ（ＥｃｏＲＶ）またはＧ／ＡＮＴＣ（ＨｉｎｆＩ）（これらは、およそ６０００ｂｐ（ＥｃｏＲＶまたはＰｖｕＩＩ）または４００−６００ｂｐ（ＨｉｎｆＩ）統計学的頻度でゲノム上にランダムに存在する）のパリンドローム部位で、ＤＮＡ二本鎖切断を誘発、導入または生成する工程からなる、本発明の主要な態様に応用することができる。
【００４７】
培地中の細胞を本発明のキメラタンパク質を用いて処理することで誘起された結果は、ＦＡＣＳ分析による細胞周期分布の分析によって、またはサザンブロット法、ＴＵＮＥＬ検定、ブロモデオキシウリジン標識（ＢｒｄＵ）による直接的なゲノムの分析によって検出され、また、特定の抗体または緑色蛍光タンパク質誘導体およびその色素誘導体を用いた免疫蛍光検査法、並びに通常用いられる方法の全てによって検出される。また、本発明のタンパク質を用いて処理された細胞のコロニー形成活性および増殖能を決定することは、増殖制御、細胞周期制御およびＤＮＡ修復の機能性についての指標となる。
【００４８】
例えばＴＵＮＥＬ検定により測定したところ、本発明のタンパク質の好ましい実施形態の活性反応速度は、０．００１ｎＭおよび１００μＭの間で直線的であり、より好ましくは、０．１ｎＭおよび１μＭの間、さらに好ましくは１ｎＭおよび５００ｎＭの間で直線的であった。この直線性は、単一特異的活性および任意の細胞に浸透する特性に加えて、本発明のキメラ分子、特にＳＣＰＶＵＴＡＴが有する利点の１つである。さらに、キメラ分子によって引き起こされるイベントにより、特定の選択物質を用いて選択する必要がないため、注目すべきは、また有利な点には、今後の使用を単純化できることがある。
【００４９】
本発明のキメラタンパク質、および特に好ましい本発明の理解の範囲内で処理した後に得られる効果は、制限するものではないが、以下の形式が想定される：
−細胞周期中の特定の時期、例えばＧ０−Ｇ１／Ｓ−Ｓ−Ｇ２−Ｇ２／Ｍ−Ｍまたはアポトーシスもしくは倍数体における、細胞の割合の増加。これらの変化の特性は細胞型に特異的であり、この特異性は、本発明の前記方法による将来における診断上の認識を提供し、また、１つまたはそれ以上のコントロール、例えば周知の遺伝的欠陥を含む細胞系または正常な細胞と比較して、未知のサンプル中で生じる変化および／または遺伝的突然変異もしくは後成的／身体的変化の検出を可能にする。例えば、Ｇ１／Ｓを決定する細胞周期の制御に特定の欠陥が細胞、例えばｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１遺伝子中の突然変異体を、本発明の前記タンパク質を用いて処理することにより、本発明の前記タンパク質で正常細胞を処理した際に見られる分布に対して、Ｇ２期の細胞数が増加する。ｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１細胞の場合、Ｇ１／Ｓで停止しなかったが、Ｇ２／Ｍ制御ポイント（チェックポイント）の機能をなおも部分的に示すため、ＤＮＡ量の分布をＦＡＣＳにより分析する実験において見られるように、正常対照細胞と比較して、Ｇ２／Ｍ期のピークに相対的な増加が見られる。同様の結果は、ＡＴＭおよびＮｂｓのようなＤＮＡ修復のチェックポイント制御に関与する遺伝産物の遺伝子についての突然変異体を用いた実験から得ることができる。
【００５０】
上記のように、該方法の重要なことには、コントロール細胞（正常またはコントロール細胞）と比べて細胞の分布を比較することまたは挙動を比較することがある。
【００５１】
−細胞周期の調節および修復に関与する重要なタンパク質の定常状態レベルでの変化。タンパク質の定常状態レベルでの変化として、タンパク質量の変動を測定するが、それは、例えば発現レベルの変動、またはｍＲＮＡ安定性の変化、あるいはタンパク質修飾の変化、例えばタンパク質分解、リン酸化、ユビキチン化もしくはその他の翻訳後修正の変化に起因する。
【００５２】
−ＡＴＭ／ＡＴＲ／ＤＮＡ‐ＰＫｃｓ制御経路の中心にあるタンパク質のリン酸化レベルについては、前記の本発明タンパク質で処理した後に変化が現れる。リン酸化において変化を示すタンパク質は、後の実施例部分に詳細に記載するが、本明細書中に例示として示すがこれに制限されない。該タンパク質としては：ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調突然変異プロテイン）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症関連タンパク質）、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット）、およびそれらの直接または間接的基質、例えばＣｈｋ１（チェックポイントキナーゼ１）、Ｃｈｋ２（チェックポイントキナーゼ２）、Ｂｒｃａ−１（乳癌罹患性１）、Ｂｒｃａ２（乳癌罹患性２）、Ｍｒｅ１１（基質組換えプロテイン１１）、Ｒａｄ５０（放射性５０二本鎖切断修復プロテイン）、Ｎｂｓ（ナイメーヘン染色体不安定症候群）、Ｒａｄ５１（放射性５１二本鎖切断修復プロテイン）、ＦＡＮＣ−Ａ、Ｃ、Ｄ２、Ｅ、ＦおよびＧ（ファンコーニ貧血相補性プロテイン）、ヒストン、ヘリカーゼ、ＢＬＭ（ブルームズ症候群突然変異）、ＷＲＮ（ウェルナー症候群突然変異）、ｐ５３などが挙げられる。特に好ましくは、分子および生化学的マーカーは、Ｎｂｓ、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５１、ｐ５３、Ｃｈｋ２、Ｂｒｃａ１である。
【００５３】
特に詳細な実施形態として、ｐ５３において派生した変異体(variations)およびｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１、１４−３−３シグマなど、ｐ５３の直接または間接転写標的がある。本発明のタンパク質で処理した後の、上記タンパク質レベルの変化、または該タンパク質の活性および／またはリン酸化の状態変化の分析は、本発明の重要な態様であり、特に診断学的に興味深い。測定には、当分野で周知の方法、例えば、ｐ５３リン酸化型の増加の場合には、抗ｐ５３−Ｓ１５Ｐを用いて検出するように、タンパク質のリン酸化型に特異的な抗体を用いる免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法）を適用できる。後述の実施例部分において詳細に実証するが、本発明タンパク質を用いて種々の細胞株を処理することで、ｐ５３タンパク質および／またはリン酸化レベルに増加が見られた。
【００５４】
−細胞周期制御またはＤＮＡ修復におけるストレス応答に重要な制御に関する重要なタンパク質である、複合体の細胞分布の変化。これらの変化は、Ｒａｄ／Ｍｒｅ１１／Ｎｂｓ複合体が局在している（Zhong Q.等、1999、Science 285:747-750）核に焦点を当て、細胞応答、Ｃｈｋ２のＴｈｒ６８のリン酸化、ＡＴＭのリン酸化、ヒストン２ＡＸ−Ｓｅｒ１３５のリン酸化を、免疫学的に分析して観察することができる。
【００５５】
−選択的に、本発明タンパク質を用いた処理に対して、突然変異体と正常細胞の変化を比較することにより、Ｃｄｃ２／サイクリンＢ１、Ｃｄｃ２５Ｃ、ｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１および１４−３−３シグマ複合体の細胞質／核分布における変化を追跡することができる。これは、例えば実験実施例１２に記載のように、上記成分の１つを特異的に蛍光標識して、顕微鏡で分析することにより実施できる。
【００５６】
−当分野において周知の方法、例えばＦＡＣＳ分析、シトクロームＣ放出またはカスパーゼ活性、もしくはアネキシンＶ特異的抗体を用いた標識化によって測定できるアポトーシス。アポトーシスの増加は、例えば、神経芽腫細胞を本発明のタンパク質を用いて処理した後に、その細胞におけるｓｕｂＧ１ ＤＮＡ量の増加として、ＦＡＣＳ分析により検出できる。
【００５７】
−本発明タンパク質の処理により誘起された効果は、当分野で周知の着色反応を用いて、コロニー形成活性または増殖能を測定することによって分析できる。選択的に、本タンパク質の長期効果は、例えば動物モデル系において腫瘍形成活性または腫瘍侵襲性により決定することができる。
【００５８】
本発明タンパク質による遺伝的損傷を調節することができる組成物を選択するのに、姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）、倍数性分析法、遺伝的増幅法、ヘテロ接合度の損失および他の当分野に周知の検査法により分析することができる。
【００５９】
最終的に、本発明は、未知のサンプル（例えば生検）から得られた細胞を、必須工程として本発明タンパク質を用いて処理し、好ましくはコントロール細胞を並行して処理し、いずれかの腫瘍遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒａｓもしくは癌抑制遺伝子（例えばＡＲＦ、ｐ１６、ｐ５３、Ｂｒｃａ１）の発現レベルまたは活性レベルを、免疫酵素法を含む、特定の検定用試薬による継続した測定をして分析することによる、腫瘍または遺伝毒性感受性（例えば、放射線または挿入剤に対する感受性）の進行に関する遺伝的疾病素質の測定法に応用される。
【００６０】
細胞周期制御システム（チェックポイント）における成分の突然変異が、腫瘍罹病性を増大させるのに対し、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する因子をコードする遺伝子における遺伝的欠陥の浸透度は低いが、これらの欠陥と、他の危険因子、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）レベルの増加、慢性的な炎症由来の因子との組み合わせによって、腫瘍における発病率が大きく左右される。
【００６１】
総合して、本発明は、その全てがインビボで細胞に、エクスビボ(ex vivo)またはインビトロ（in vitro）において、本発明ポリペプチドを使用する事実により特徴付けられる、種々の方法に関する。特に、本発明に関する方法には、細胞周期制御およびＤＮＡ修復に共通して関係する遺伝的損傷を評価する診断方法、および、上記制御活性を調節できる生物学的活性を有する化合物の選択方法が含まれる。本発明の多様な態様の幾つかは、上述の特異性を持ったＤＮＡ二本鎖切断の導入による、細胞周期およびＤＮＡ修復（チェックポイント）の制御経路を活性化する、本発明のキメラポリペプチドの生物学的活性に基づいている。
【００６２】
実施例部分により詳しく見られおよび記載されるように、単一特異的ＤＮＡ二本鎖切断の導入の結果、本発明のポリペプチドは治療的活性、特に抗増殖性および抗腫瘍性を示す。それゆえ、この活性は本発明のさらなる対象である。このように、本発明には、本明細書中に記載のポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを活性物質として含有する、医薬組成物が含まれる。さらに、本発明には、腫瘍性疾病またはその疾病に対する疾病素質の予防、治療または診断のための医薬を調製するための、本発明キメラポリペプチドおよび／またはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が包含される。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態には、実施例部分に詳細に記載するように、腫瘍病理学の診断またはその疾病の疾病素質の診断のため、本発明由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの診断上の使用が挙げられる。
【００６４】
より好ましい実施形態としては、本発明タンパク質を用いた細胞の処理を、例えば診断上の使用として、また上述のように用いて、試験サンプルおよび想定される突然変異を含んでない細胞系（コントロール）に並行して適用する。この検定のさらに好ましい実施形態としては、さらにコントロール処置を加えた検定であり、それは、例えば本発明のキメラタンパク質を用いた実験において、ＤＮＡ修復経路の選択された過程に突然変異体を含む試験細胞系を使用するものであり、その比較によって、それぞれの遺伝子変化を精細マッピングすることができる。
【００６５】
本発明タンパク質の投与後、長時間、例えば２４時間経過後に、細胞が本発明タンパク質により導入された遺伝的損傷（ＤＮＡ二本鎖切断、ＤＳＢ）を修復できるかどうか、および、細胞周期のさまざまな時期にある細胞集団の分布が正常に戻るか戻らないか、に依存した種々の変化を検出することができる。ＡＴＭをコードする遺伝子に、または例えばＮＨＥＪ（非相同末端結合）ＤＮＡ修復経路に関与する産物をコードする別の遺伝子に突然変異を有する細胞において、アポトーシスは直ぐには観察できないが、低い発生率で間接的な影響を示す。逆に、神経芽腫細胞の場合には、アポトーシスは迅速且つ直接的な様式で誘導される。本発明は包括的に、さらなる実施形態において、神経起源（origin）細胞、より好ましくは神経芽腫においてアポトーシス誘導するための、さらに、神経起源の腫瘍を処置するための医薬を調製するための、キメラタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を包含する。
【００６６】
神経芽腫におけるアポトーシスの導入は、二重微小（ＤＭ）ｍｙｃ-Ｎ癌遺伝子増幅と組み合わさった１ｐ３６欠失と相関がある。この強い感受性は１７ｐ１５転移の存在とは相関がない。ＤＭ ｍｙｃ-Ｎ増幅は、ｍｙｃ−Ｎ増幅ＮＢの極めて強い侵攻型として知られるエピソーム ｍｙｃ-Ｎ クラスターであり、極めて予後が悪い。侵攻性悪性ＮＢの重要な部分は、このタイプの癌遺伝子増幅を示すことである。その他の特定の実施形態において、発癌性のＤＭ増幅を含む他の腫瘍、例えば限定するものではないが、前立腺または乳房腫瘍の処置も含まれる。一般に、前記化合物とカップリングされたキメラ分子を、特定の腫瘍を処置する医薬を調製するために使用することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質を用いた処理に対する細胞応答は、ＤＮＡ修復経路中に突然変異を有する細胞であるか、または細胞周期および／または修復（チェックポイント）に関する経路の制御に関係する成分に変化を有する細胞であるかによって異なっている。このように、本発明には一連の方法が含まれ、その方法はすべて、本発明に係る好ましい実施形態のキメラ分子を適用して、試験細胞のゲノムにＤＳＢを導入するために使用すること、および上記の検定によりその応答を分析すること、好ましくは可能な限り同質遺伝子型の性質を有する標準的な細胞を用いた試験サンプルから得られた結果と比較すること、により実質的に特徴付けられる。
【００６８】
細胞周期およびＤＮＡ修復機構における本発明のタンパク質の効果は、フリー・ラジカル（ＲＯＳ）の誘導物質の存在下で相乗効果を及ぼし、そのような誘導物質は例えばＨ２Ｏ２であり得る。この相乗効果は、キメラタンパク質濃度が非常に低い場合、好ましくはＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質が１０ｎＭ以下で、Ｈ２Ｏ２が１０μＭ以下でも観察される。従って、本発明には、本発明タンパク質を活性酸素産物（ＲＯＳ）、例えばＨ２Ｏ２と組み合わせて使用する事実により特徴付けられる、ゲノムにＤＳＢを導入する方法が含まれる。この方法は、拮抗作用または相乗作用化合物を選択するためにも使用される。
【００６９】
インビボで細胞にＤＳＢを導入することにより、抗腫瘍療法に頻繁に用いられる電離放射線によって誘導される細胞応答および分子応答と同様にそれらの応答を活性化するが、電離放射線と比較して副作用は小さい。従って、本発明のさらなる実施形態には、
抗腫瘍活性を有する医薬の調製のための、または、
後の細胞の増殖活性の開放に起因する疾病を発症する個体の疾病素質を規定する遺伝的疾病、および特にＤＮＡ修復の制御機構に必須の遺伝子産物を含む腫瘍性疾病、を治療、診断または予防するための、
本発明のキメラポリペプチドの使用が含まれる。
【００７０】
この態様に基づき、本発明は、本発明の上記キメラポリペプチド（ここでは、増殖抑制効果、好ましくは抗腫瘍性が要求される）をインビボまたエクスビボ投与することに基本的に基づく治療法を包含する。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態には、生物学的サンプルから得られた単離された細胞のＤＮＡ修復における遺伝的または身体的欠陥、または細胞周期の調節の欠陥についてのインビトロ診断する方法であって、基本的に以下の工程：
ａ）ＤＮＡ修復経路または細胞周期経路における影響または損傷を測定するための培地での単離された細胞の生育；
ｂ）本発明の好ましい分子、ここで、修飾酵素がクラスＩＩエンドヌクレアーゼであり、より好ましくはＰｖｕＩＩ酵素の一本鎖型（ＳＣＰＶＵ）である分子を用いた細胞のインキュベート。好適には、例えばＳＣ３４のような、特異的ＤＮＡ結合活性を示すが、ヌクレアーゼ活性が損なわれているコントロール・ポリペプチドを用いて、細胞を並行して処理する。所望により、ＤＮＡ修復に、ＤＮＡ修復および／または細胞周期の制御に突然変異および/または欠損がある好適な細胞系、ここで、好ましくはほご同質遺伝子型の性質を有している細胞系の並行処理；
ｃ）細胞応答の特徴づけおよび測定；
ｄ）コントロール細胞系と任意に比較、
から構成される方法が含まれる。
【００７２】
同質遺伝子型とは、２つまたはそれ以上の細胞系が、可能な限り類似の遺伝的背景を示すことを意味し、例えば、以下の実施例部分において記載および使用するように、細胞系：ＭＲＣ−５およびＡＴ−５；ＣＨＯ−Ｋ１およびＫＵ７０、またはＭＯ５９ＫおよびＭＯ５９Ｊがある。標準−コントロール細胞系とは、細胞周期およびＤＮＡ修復の制御経路に変化を有しない正常細胞系であってもよく、試験サンプルに可能な限り同質遺伝子型であるか、または遺伝的変化が詳しく特徴付けられた細胞系であってもよい。
【００７３】
本発明方法の好ましい実施形態において、試験細胞およびコントロール細胞を同一条件下で共に生育させる。これにより、細胞は保持され、直接的な形式で培養マーカーの相違を比較できる。そのマーカーの例としては：コロニー形成活性、アポトーシスまたは無活動細胞の百分率（％）があり、これらは、例えば生きた細胞着色を用いた増殖能の決定により、または上記生化学マーカーの測定により測定される。このタイプの検定の例は、Torrance C. J.等、2001、Nature Biotechnology、19、940-945に記載されている。
【００７４】
ｃ）に記載の細胞応答の特徴づけの好ましい実施形態については、当分野において周知のコロニー形成活性の測定法、例えば、培地中で細胞を生育させる、または軟寒天中で生育させてコロニー形成活性を測定する、あるいはＤＮＡ染色後にＦＡＣＳ分析する、方法を用いることができる。
【００７５】
本発明に記載の特に有用な実施形態であって、腫瘍性疾患の発症に関する遺伝的疾病素質、腫瘍治療の感受性、特に放射性または化学療法の抗腫瘍治療に対する患者の耐性、または予後判断のため健常組織と比較した腫瘍組織の感受性を評価するための診断および／または予後診断が、特に有効な実施形態である。
【００７６】
加えて、本発明には、本発明の方法を実施するためのキットが含まれるため、好ましい診断キットまたは調査用キットも含まれる。
【００７７】
かかるキットの好ましい実施形態には：
１）キメラポリペプチド、好ましくは、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩまたはＨｉｎｆＩの中から選択され、Ｔａｔ輸送ペプチドと融合した状態の一本鎖型キメラエンドヌクレアーゼ、または、該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含有するチューブ、併用される、特異的ＤＮＡ結合性タンパク質であるがエンドヌクレアーゼ活性が損なわれているコントロール・ポリペプチドである、キメラタンパク質、または、該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含有するチューブ。好ましい実施形態においては、キメラタンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴを含むチューブ、および、キメラタンパク質ＳＣ３４を凍結乾燥状態または水溶液で含むことが有利な別のチューブで構成されるキット
２）キメラタンパク質の全部または一部に対する抗体、好ましくは抗ＳＣＰＶＵＴＡＴ抗体を含有するチューブを任意に含むキット
３）前記のコントロール細胞、例えばＤＳＢに対して過敏な細胞、または、ＤＮＡ修復および細胞周期経路およびその制御（チェックポイント）に関与するタンパク質をコードする遺伝子に詳しく特徴付けられた突然変異体を含む細胞を含有するチューブまたはフラスコを任意の含むキット。かかる細胞を、運搬に適するように凍結保存またはフラスコ中に含ませてよい
４）挿入剤のような化学療法試薬、放射線類似作用化学物質、または質的および量的効果を決定し、そして比較するための医薬を含有するその他のタイプの化学物質を任意の含むキット
が含まれる。
【００７８】
好ましいキメラポリペプチドの活性に基づくさらに重要な実施形態として、本発明には、細胞に基づくハイスループットスクリーニングを用いた、ゲノムのＤＮＡ修復活性および／または制御を調節し、相乗作用を示し、拮抗作用を示し、あるいはそれらを変化させない、並びに、細胞システムの遺伝的安定性のための組成物を選択する方法が含まれ、基本的に以下の工程が含まれる：
ａ）優先的に本発明のキメラタンパク質を用いた、適当なコントロール・ポリペプチド（特に、特定のＤＮＡ結合活性を有するが、キメラポリペプチドＳＣ３４のようにエンドヌクレアーゼ活性を損なっているキメラ分子が含まれる）の存在下での、また、所望により例えばＨ２Ｏ２または他のラジカル生成物質(producers)および／または他の調節物質もしくは拮抗作用物質の存在下での、試験細胞のインキュベート；
ｂ）所望により、並行して、試験細胞と可能な限り同質遺伝子型の別のコントロール細胞、例えばレポーター遺伝子を含む同一細胞を用いてインキュベートする。様々なレポーター遺伝子が当分野で周知であり、その中でも例えば、ＥＧＦＰタンパク質およびその変異体（例えば、Torrance等、2001、Nature Biotetechnology、19、940-945に記載されている）、または検定の自動読み取りに有効である別のタイプのレポーター遺伝子がある；
ｃ）潜在的な活性を有するか、または活性を有しないかを試験し得る組成物の付加。それらには、例えば、単分子または化学ライブラリーまたは化合物、ペプチド若しくはその他のコレクション、または生物学的サンプルのコレクションがある；
ｄ）細胞応答の読み取りは、優先して自動的に行われ、好ましくはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）装置を用いて行われる。この例として、コントロール物質および細胞中で生物学的活性を示すポジティブ試験物質に対する応答として誘導される蛍光シグナルなどの、形態学的表現型の変化の測定に基づくシステムが挙げられる。この細胞応答は、細胞シグナルまたは誘導された生化学的マーカー由来のシグナルから成り、細胞パラメーター、例えばカルシウム流動、ラジカルフロー、シトクロームＣの変化なども検出されるが、それらを組み合わせると自動検出可能なシステムとなる。
【００７９】
本発明のこの方法では、工程ｂ）およびｃ）の順番は逆でもよい。
この検定により、細胞周期の制御、ＤＮＡ修復経路、アポトーシスの誘導、老化の誘導または、別の経路の活性化を順番に起こさせる経路の１つを阻害すること、について重要な生物学的活性を含む、組成物の選択が可能となる。
【００８０】
スクリーニングの最初のラウンドから単離した化合物を有利に修飾した後に、さらに選択サイクルを行うことで、最終的には、医薬により適した組成物を得ることができ、また、さらに有利な特徴、例えば生物学的適合性または生成物安定性について選択することができる。
【００８１】
さらに上記から導かれる態様に加えて、本発明には、優先的にはクラスＩＩ制限ヌクレアーゼ、さらにより好ましくは一本鎖型であるか、もしくはさらにより好ましくは酵素ＳＣＰＶＵＴＡＴにより表される本発明キメラ分子、並びに、これらの分子をコードするポリヌクレオチドの使用に基づいた、細胞周期阻害を導入する方法、または選択的に好ましくは神経起源の細胞にアポトーシスを誘導する方法、または選択的に単離した細胞にＤＮＡ修復を誘起する方法が含まれ、ここで、これらの導かれる効果は、例えばフリー・ラジカル生成物などの組成物の存在下で相乗作用が与らえる。これらの方法は基本的に、本発明のキメラポリペプチドよってＤＮＡ二本鎖切断が導入される原理に基づいている。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態には、新規の貫通配列（penetration sequence）および補助配列を選択する方法が含まれる。この実施形態において、貫通配列または補助配列は、単独化合物から構成されるものではなく、化合物ライブラリー分子が想定される貫通ドメインまたは補助ドメインを選択するために使用される。これらの工程には、多数の異なるサンプルを分析できるハイスループットスクリーニングの使用が非常に適している。診断についての本発明に記載の原理は、基本的にすべての細胞型または生物に対する新規な貫通配列および補助配列を見つけだすことのできるスクリーニング方法にも基づいている。自動またはロボット利用の装置により、ハイスループットの能力を用いて後述の工程を実行することができる。これは、当分野に周知のピペッティングおよび読み出し装置を用いて実行できる。限定するものではないが、例示として、特定の補助配列または貫通配列のスクリーニングは、基本的に以下の工程からなる：
１．特定の補助配列の場合、貫通配列は一定であり、本発明のキメラタンパク質のライブラリーは当分野の方法で構成される。例えば、本発明のキメラタンパク質のＮ末端には、様々な軽鎖および機能的ＣＤＲＬフラグメントが融合されており、ついで機能的ＣＤＲ１−３Ｈ領域を含む種々の重鎖免疫グロブリンタンパク質に融合された本発明の同じタンパク質と混合される。これは、選択的に大腸菌での２つのプラスミド発現システムにおける組換え技術により得られる。一般に、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンのフラグメントのライブラリー、または受容体結合タンパク質、あるいは合成または天然源から生成されたランダムライブラリーは、上記の組換え技術またはその他のカップリング法により本発明のタンパク質に結合することができる。例えば、例示すると、抗体断片ライブラリーを、プロテインＡに結合させることによって、本発明のタンパク質に連結することができる。
２．貫通配列の場合、スクリーニングライブラリーは当分野に周知の技術により得ることができる。例えば、かかるライブラリーは天然源またはすべてのクラスの化合物を含む合成源から入手できる。特に有利な実施形態として、細菌の貫通配列は、同種または異種からのランダムＤＮＡフラグメントからスクリーニングされる。
３．ライブラリータンパク質発現大腸菌を増殖させ、タンパク質産生のために誘導する。タンパク質は、分泌システム由来して上清から、さらに細胞溶解液から、例えば様々なアフィニティータグ、具体的には、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ−タグ、プロテインＡタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡ−タグまたはビオチンを用いた、キメラタンパク質のハイスループットアフィニティー調製によって、単離される。
４．これらのタンパク質を用いて、ライブラリー由来の所定の分子の機能または異なる機能を分析する。配列が機能的である場合、キメラタンパク質は機能的である。これは、それらが細胞膜さらに最終的には核膜を通過し、ＤＮＡに結合し、場合によってはＤＳＢを導入することができる。もしくは、補助スクリーニングの場合、機能は規定の細胞中で検出され得る。検出は上記のように実施し得る。
５．試験細胞または組織は、
本発明のキメラタンパク質の機能は、例えば上述の形式で検出することができる、原生生物細胞を含むあらゆる起源由来のものであってよい。
６．特に有用な実施形態において、試験細胞を、容易な読み出しのためにＥＧＦＰ（増強した緑色蛍光タンパク質）を用いて安定的にトランスフェクトする；
７．もう１つ別の有用な実施形態において、コントロール細胞を、区別をつけて、例えばＥＹＦＰ（増強した黄色蛍光タンパク質）を用いて安定的にトランスフェクトする；
８．試験およびコントロール細胞を、個別に生育するか、またはマルチ−ウェル装置または特定の膜上で混合する。細胞は、単一の変化を有して酷似しているか（すなわち、同一の起源由来である腫瘍細胞または非腫瘍細胞のように、補助配列を検出するために用いる）、または非常に多様化していてもよい（例えば、試験細胞では、輸送が生じるが、コントロール細胞では輸送されない；これには、異なる種由来の細胞、例えば試験細胞が細菌細胞であって、コントロール細胞がヒト由来の場合も含まれる）。細胞の選択には、すべての技術的に可能な組み合わせが可能である。
９．タンパク質を細胞の上清に加え、インキュベートする。
１０．読み出しは、上記実施形態に記載のようにキメラ分子の機能について行われる。特に有利な実施形態において、上記調製の緑色および黄色細胞について検出される。緑細胞よりも有意に黄色細胞を生産するタンパク質は、当分野に周知のバック・スクリーニングおよび組換えもしくは質量分析法を用いた分析により、単一クローンとしてさらに単離される。好ましい適用例においては、キメラ分子が細胞に侵入後にＤＮＡ損傷を導入することで、この検定の感受性を非常に高め得る。試験細胞（例えば、腫瘍細胞）およびコントロール細胞（すなわち、比較可能な非腫瘍細胞）を、遺伝子破壊または遺伝子抑制、あるいはドミナントネガティブまたは優勢の機能獲得性突然変異の導入によって、ＤＳＢ導入に対して高い感受性を与える。これは、当分野で周知の方法、例えば、ｓｉＲＮＡを用いた同時形質変換、ＤＮＡ修復における重要な機能を阻害し、ＤＳＢ、化学阻害剤または活性剤に対して高い感受性を示すようになる、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、遺伝子破壊または突然変異のための標的ベクター、突然変異体の発現もしくはタンパク質を過剰発現させるためのベクターによって行われる。これにより、低濃度でより迅速に詳しく識別された読み出しが可能になる。たとえば、ｓｉＲＮＡ阻害剤であるＫｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡＰＫｃｓ、ＡＴＭ、ＸＲＣＣ４およびリガーゼＩＶ、Ｂｃ１２である。一方で、カフェインなどの化合物によってＡＴＭも阻害される。Ｐ５３または他のアポトーシス調節因子が導入される。
１１．スクリーニングから得た配列をさらなる最終確認のために、もう一度、選択的に、自動工程を用いる：
・クローンを精製タンパク質により確認する。
・濃度を滴定する。
・ヌクレアーゼ欠失型で選択された配列をテストする。
・別の細胞を試験する。
・マウスにおける毒性を試験する。
【００８３】
本発明は、以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、これに制限されない。
図１ 大腸菌からのＳＣＰＶＵＴＡＴ精製
ＳＣＰＶＵＴＡＴの発現および精製。
ＳＣＰＶＵＴＡＴの発現プラスミドを含む大腸菌細胞を誘導してタンパク質を発現させ、実施例に記載のように精製を行った。ＮＩおよびＩは、大腸菌由来の全細胞性抽出液を示しており、誘導しておらず、また個別の誘導産物を示すものではない。Ｈ１およびＨ２は、Ｈｉトラップ・キレートＮｉ＋＋アガロースカラム上で精製して得られたピーク画分である；Ｓ１およびＳ２はＳＰ-セファロースカラム上で精製して得られたピーク画分である；Ｍは分子量マーカーを表す（上から下へ：９４、６７、４３、３３、２０、１４ｋＤａである）；ＳＣＰＶＵは、ＴＡＴ配列を含んでいない、同様の方法で精製したタンパク質を表す。
【００８４】
図２ タンパク質形質導入後にＵ２ＯＳ細胞から抽出したタンパク質の免疫学的分析
分析したタンパク質は：濃度調整したＳＣＰＶＵＴＡＴ（１、１９、５０、１００、２００ｎＭ; レーン２-６）、ＳＣＰＶＵ(２００ｎＭ、ＴＡＴ配列を含まない、レーン７)、ＳＣ３４(２００ｎＭ、酵素活性を示さないＳＣＰＶＵＴＡＴ誘導体、レーン８)、コントロール(細胞へのタンパク質添加を行っていない、レーン１)であった。細胞培養上清にタンパク質を添加した１０分後に、ＰＢＳで丁寧に洗浄して抽出物を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて分離した後にＰｖｕＩＩに対する単一特異的抗体を用いて免疫ブロット法により分析した（下のパネル、導入）。比較のために、抽出物調製の前に取得した細胞培養液上清の一部をこの分析に含ませた（上のパネル、上清)。
【００８５】
図３ 共焦点顕微鏡による免疫蛍光分析
ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いてタンパク質形質導入した３０分後に、細胞を洗浄し、３％ＰＦＡを用いて固定化し、ＰｖｕＩＩ単一特異的抗体によりマークした後、ＦＩＴＣ結合２次抗体を用いて共焦点免疫蛍光分析のために染色した（緑色、下のパネル）。さらに、ＲＮＡａｓｅ Ａ消化した後にプロピジウムＪ-を用いてＤＮＡ共染色を得た（赤色、上のパネル）。
【００８６】
図４ 単一細胞レベルでＤＳＢを検出するためのＴＵＮＥＬ分析
Ｕ２ＯＳ細胞をＳＣＰＶＵＴＡＴで処理し、ｄＵＴＰ-ＦＩＴＣの存在下でＴｄＴを用いて標識化した後に、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いてＤＳＢ分析を行った（ＴＵＮＥＬ）。処理は、表示した時間、１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて行った。
【００８７】
図５ ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるヌクレアーゼ依存的細胞周期の遅延
本タンパク質を形質導入した細胞の細胞周期について、種々の時期の分布をＦＡＣＳ分析により分析した。細胞集団のＤＮＡ量分布を検出した。２ｎは２倍体のＤＮＡ当量を示し（複製されたものではない；Ｇ１期）、４ｎは４倍体のＤＮＡ当量を示す（複製されている；Ｇ２／Ｍ期）。ＦＡＣＳ分析については、単一細胞あたりのＤＮＡ量を評価できるＤＤＭモードを用いて、細胞を分離した。表示の調整量のＳＣＰＶＵＴＡＴ（１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）を一度だけ添加して存在させたＵ２ＯＳ細胞；未処理の細胞（コントロール）；ＳＣＰＶＵＴＡＴのヌクレアーゼ欠損誘導体（ＳＣ３４、１００ｎＭ）で処理した細胞を、２４時間（上の行）または４８時間（下の行）生育させた。示したヒストグラムはすべて、右上のパネルにだけ示すように細胞数に対する相対的なＤＮＡ量の尺度を表す。
【００８８】
図６ ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるキナーゼ活性
基質としてのヒストンＨ１と、未処理またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ）もしくはノコダゾール（０．２μｇ／ｍｌ）で３０時間処理した生育Ｕ２ＯＳ細胞から得られたタンパク質抽出液由来のサイクリンＢ１特異的免疫沈降物とを用いて、サイクリンＢ１キナーゼ活性を決定する。サイクリンＢ１特異的免疫沈降物を、γ３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でヒストンＨ１と共にインキュベートし、その反抗混合物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。下にある数字は、リン酸−撮像装置（phospho-imager）分析により決定した比活性を示す。
【００８９】
図７ ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期停止に対する生化学的マーカー
Ａ)平滑末端ＤＳＢを含む３’−ＯＨおよび５’−リン酸（phospate）によるｐ５３の誘導。Ｕ２ＯＳ細胞（レーン１−７）およびＨＣＴ１１６（レーン８−１４）を、ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ、ＳＣ）またはアドリアマイシン（ドキソルビシン、０．０２μｇ／ｍｌ、ＡＤ）を用いて表示の時間処理し；コントロールとして未処理の細胞（レーン０）を用いた。抽出物を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離した後、ｐ５３（上のパネル、ｐ５３）またはＰＡＲＰ（下のパネル、ＰＡＲＰ）に特異的な抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。
Ｂ)ＳＣＰＶＵＴＡＴに対する毛細血管拡張性運動失調症突然変異（ＡＴＭ）タンパク質の修復応答。ｐ５３のＳＣＰＶＵＴＡＴ依存的Ｓｅｒ１５のリン酸化。ＡＴＭポジティブ細胞系 ＭＲＣ５を、ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ、ＳＣ）またはヒドロキシウレア（１ｍＭ、ＨＵ）を用いて表示の時間処理した；未処理の細胞をコントロールとして用いた（０）。抽出液を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離した後、ｐ５３ Ｓｅｒ１５（上のパネル、Ｓｅｒ１５、ｐ５３）、またはアクチン（下のパネル、アクチン）に対する特異的抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。
Ｃ)ＳＣＰＶＵＴＡＴに対する毛細血管拡張性運動失調症突然変異（ＡＴＭ）タンパク質の修復応答。
ｐ５３のＳＣＰＶＵＴＡＴ依存的Ｓｅｒ１５のリン酸化におけるカフェイン感受性。ＡＴＭネガティブのＡＴ-５細胞を、カフェイン（２ｍＭ）の存在下で、ＳＣＰＶＵＴＡＴ(１００ｎＭ、ＳＣ)またはヒドロキシウレア（１ｍＭ、ＨＵ）を用いて４時間処理した；コントロールとして、未処理の細胞とカフェイン処理のみ行った細胞を用いた。抽出液を調製し、ＳＥＳ-ＰＡＧＥにより分離した後、ｐ５３、ｐ５３ Ｓｅｒ１５（上のパネル、Ｓｅｒ１５、ｐ５３）またはアクチン（下のパネル、アクチン）のいずれかに対する特異的抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。
【００９０】
図８ ＡＴＭ突然変異細胞（ＡＴ-５）のＳＣＰＶＵＴＡＴによる細胞周期阻害誘導およびコロニー形成活性を、非突然変異細胞（ＭＲＣ-５）と比較する
Ａ)ＳＣＰＶＵＴＡＴ（２５ｎＭ、１００ｎＭ）、またはアドリアマイシン(０．０２μｇ／ｍｌ; アドリアマイシン)、またはＳＣ３４（１００ｎＭ）を用いて処理し、３６時間後にＡＴ-５細胞およびコントロールとして未処理細胞をＦＡＣＳ分析して細胞周期中のＤＮＡ量分布を決定した。ヒストグラムは細胞数に対する相対的なＤＮＡ量を表し、右側のパネルは、ＭＯＤＦＩＴＴＭ プログラム・パッケージを用いて計算した種々の細胞周期の時期に対応する分布の百分率を示す。
Ｂ)ＡＴＭ突然変異細胞系であって、ＳＣＰＶＵＴＡＴによりＤＮＡ損傷を導入された細胞系によるコロニー形成能検定。ＡＴ-５またはＭＲＣ-５（ＡＴＭポジティブコントロールとして提供する）の種々の希釈液を、未処理（白色棒）またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（２５ｎＭ、灰色棒；１００ｎＭ、黒色棒）を用いて６０分間処理した；これらの細胞を洗浄した後、７−１０日間生育させ、ギムザ（ＧＩＥＭＳＡ）染色してコロニー数を計測した。この結果をヒストグラムにまとめ、独立して行った３回の実験の平均値と１０％〜１５％の範囲の標準偏差を表示する。未処理の細胞を１００％に設定したところ、ＡＴ-５細胞を表示する黒色棒はほぼ０％となり表示できなかった。
【００９１】
図９ ＮＨＥＪ経路に関与する単一タンパク質における、選択された突然変異体を有する細胞のコロニー形成活性の比較
ＮＨＥＪ修復経路に関与するタンパク質に変異を導入したＣＨＯ細胞を、ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理してコロニー形成能を検定する。細胞系としては、ＡＡ８(親株)、Ｖ３（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ（−/−）)、ｘｒｓｓ５(ＫＵ８０(-/-))およびＸＲ-１(ＸＲＣＣ４(-/-))、ＨＩＳ Ｐ１．１３-１１(ＫＵ７０(-/-))、ならびに対応する親細胞系 ＣＨＯ-Ｋ１を用いた。表示のＮＨＥＪ突然変異を有するＣＨＯ細胞を種々希釈して、未処理（白色棒）またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（２５ｎＭ、灰色棒；１００ｎＭ、黒色棒）を用いて２４時間処理した；これらの細胞を洗浄した後、７-１０日間生育させ、ギムザ染色してコロニー数を計測した。この結果をヒストグラムにまとめ、独立して行った３回の実験の平均値と１０％〜１５％の範囲の標準偏差を表示する。未処理の細胞を100％に設定したところ、Ｖ３（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ（−/−））を表示する黒色棒は1％未満となり表示できなかった。
【００９２】
図１０ ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の神経芽腫細胞における種々のアポトーシス誘導
ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理（１０ｎＭ、パネルＣ；１００ｎＭ、パネルＢ）後に、神経芽腫細胞ＧＩ-ＬＩＮをプロピジウムＪ-染色してＤＮＡ量をＦＡＣＳ分析した。これらサンプルは３０時間処理した。コントロールとして、未処理（パネルＡ）またはＳＣ３４の処理サンプル（１００ｎＭ、パネルＤ）を用いた。各パネルの下には、得られた細胞周期の時期の分布を示す百分率を示す（Ｇ１/Ｓ/Ｇ２-Ｍ）。（Ａ）はアポトーシスを起こした細胞を示す。
【００９３】
図１１ 低濃度のＳＣＰＶＵＴＡＴと亜致死濃度のＨ２Ｏ２との相乗効果
ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１０ｎＭ、パネルＢ）もしくはＨ２Ｏ２（１０μＭ、パネルＣ）又はその両方（ＳＣＰＶＵＴＡＴ、１０ｎＭ；Ｈ２Ｏ２、１０μＭ；パネルＤ）と共に、あるいはコントロールとして試薬を用いず（パネルＡ）、Ｕ２ＯＳ細胞をインキュベートした。さらに、ＦＡＣＳにより、ＤＮＡ量について処理細胞を分析した；種々の細胞周期の時期を百分率で各ヒストグラムの下に表示した。
【００９４】
図１２ ヒストン２ＡＸＳｅｒ-１３９のリン酸化効果、およびＰＩ３／ＡＴＭキナーゼ阻害剤であるウォルトマンニン（Wortmanin）によるこの効果の阻害作用の顕微鏡分析
ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ、中央の列）を用いて、Ｕ２ＯＳ細胞を６０分間処理し、さらにウォルトマンニン（５０μＭ、ＷＭ、右の列）を用いて、またはコントロールとして試薬を用いずに（左の列）、この処理を行った。リン酸化されたＨ２ＡＸ-Ｓｅｒ-１３９に対する特異抗体（赤）またはヒストン２Ｂについての特異抗体（コントロールとして提供、緑）を用いて、処理細胞を染色し、蛍光顕微鏡により単一細胞レベルで分析した。
【００９５】
図１３ 自動分析によるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ）の突然変異細胞についての感受性の決定
Ａ) 染色した細胞を用いて、突然変異細胞と比較用の正常細胞との増殖能（proliverative capacity）をＶｅｒｓａｄｏｃ４（バイオラッド）イメージング装置により評価した。その結果を統計分析してヒストグラムで表示する。ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の、ヒト神経芽腫細胞系ＭＯ５９Ｊ(ＤＮＡ-ＰＫＣＳ(-/-))のコロニー形成能をＭＯ５９Ｋ細胞(ＤＮＡ-ＰＫＣＳ(+/+))のコロニー形成能と比較する。コロニー形成能検定の実施例を示す。この検定は、順に３段階の様々な濃度の細胞（上から下の行、１×１０４、２×１０３、４×１０２、８×１０）を用いて実施した。右のＢ）では、ＭＯ５９Ｋと比較して、細胞系ＭＯ５９Ｊのコロニー形成能検定の結果をヒストグラムで示す。この検定は、Ｖｅｒｓａｄｏｃ４（バイオラッド）システムを用いて分析することを除けば、図９と同様に実施した。白棒：未処理サンプル；灰色棒：２５ｎＭ ＳＣＰＶＵＴＡＴ；黒棒：１００ｎＭ ＳＣＰＶＵＴＡＴである。
【００９６】
図１４ ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期制御タンパク質の細胞内分布
未処理、又はＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ）もしくはタキソール（０．２μｇ／ｍｌ）で３０時間処理した、ＨＣＴ１１６ (ｐ５３(+/+))細胞の顕微鏡分析。１次抗体にサイクロンＢ１特異抗体またはＣｄｃ２５ｃ特異抗体を用い、２次抗体にＦＩＴＣ標識化抗体（緑、サイクリンＢ１）またはＴＲＩＴＣ標識化抗体（赤、Ｃｄｃ２５ｃ）を用いて、免疫蛍光分析を行った。
【００９７】
実施例
実施例１
組換えタンパク質発現用ベクターの構築
以下の実施例に記載の実験のために、次の組換えタンパク質を当業者に周知の方法を用いて作製した：ＳＣＰＶＵは、ホモ２量体エンドヌクレアーゼ酵素ＰｖｕＩＩの一本鎖変異体であって、２００１年にSimoncsits等により既に明らかとなっている。ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の一部分に続いて６個のヒスチジンを有するＧＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳＨＨＨＨＨＨをコードする配列を、この構築物のＣ-末端に付加した。このような方法で得られた組換え融合タンパク質をＳＣＰＶＵＴＡＴと称する。その結果、酵素ＰｖｕＩＩの１-１５７アミノ酸の次にリンカー配列−ＧＳＧＧがあり、それが酵素ＰｖｕＩＩ の１番目のサブユニットと２番目のサブユニット（アミノ酸２−１５７）とを連結し、その後ろにＧＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳ-ＨＨＨＨＨＨ配列（ｔａｔ-ペプチド＋６ヒスチジン-タグ）を有するポリペプチドとなる。さらに、エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩの変異体ＳＣ３４（Simoncsits等、2001）を一本鎖ポリペプチドとして作製した。この変異体は、ＰｖｕＩＩの特定のＤＮＡ結合活性を示すが、ＰｖｕＩＩ酵素の両方のサブユニットの３４位に突然変異（Ａｓｐ３４／Ｇｌｙ３４）があるため、エンドヌクレアーゼ活性が損なわれている。
【００９８】
実施例２
組み替えタンパク質の発現および精製
ＳＣＰＶＵＴＡＴの発現は、大腸菌株ＸＬ１ ＭＲＦ’を用いて行い (Simoncsits等、2001)、Ｈｉトラップ・キレート・アフィニティーカラム（５ｍｌ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いて第一回目の精製を行い、次いでＳＰセファロース（５ｍｌ ＨｉトラップＳＰ ＨＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いてさらに精製した。ＳＰ-セファロース上のタンパク質を０．６３Ｍ〜０．６７ＭのＮａＣｌを用いて溶出した。１．５Ｌの培地から約１０ｍｇの精製タンパク質を得た。ＴＡＴ配列を融合した天然のＰｖｕＩＩタンパク質（一本鎖変異体としてではない）を同様の方法で調製した。この場合のＳＰ-セファロースからの溶出には０．８１Ｍ〜０．８５ＭのＮａＣｌを用いた。発現タンパク質をすべて精製して均一にし、それを１５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いてゲル電気泳動により判断し、ＡＰＩ１５０ＥＸ(パーキンエルマー)を用いて質量分析して理論的な質量を確認した。得られたエンドヌクレアーゼ誘導体の酵素活性は、基質にλＤＮＡを用いて検査し、天然酵素と比較した。
【００９９】
実施例３
抗体産生および免疫学的分析
組換えタンパク質に対する抗体を、例えば、「Using Antibodies: ラボラトリーマニュアル」、HarlowおよびDavid Lane著; CSHプレスニューヨーク、1999、ISBN 0-87969-544-7、「Ｃｅｌｌｓ: ラボラトリーマニュアル」、David L Spector、RobertD. Goldman; Leslie A. Leinwand; ＣＳＨプレス・ニューヨーク、1998、ISBN 0-87969-521-8に記載の標準的な方法により、産生および使用した。抗体は、適当な抗原でニュージランド白ウサギ（New Zealand white rabbit）を免疫し、対応する抗原を固定化したBrCN-セファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いて血清から精製して得た。プロテアーゼ阻害剤、例えば２０μＭ ＴＰＣＫ、２０μＭ ＴＬＣＫ、ホスファターゼ阻害剤６０ｍＭ ４-ニトロフェニルリン酸塩を含有する２０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で細胞を溶菌させるか、またはＳＤＳサンプル・ローディング・バッファー中で細胞を直接溶菌して、免疫ブロット用の細胞抽出液を得た。当分野で周知の方法、例えば、３％パラフォルムアルデヒドまたはアセトンとメタノールの１:１混合液を用いて細胞を固定化して、免疫蛍光分析を行った。分析は、抗体染色後にＬＳＭ５１０共焦点ユニットに付属のツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ顕微鏡を用いて行った。
【０１００】
実施例４
真核細胞系へのキメラタンパク質のタンパク質形質導入
実施例４‐１１では次の細胞系を用いた：ＮＨＥＪ修復経路に欠損のある細胞系：ＣＨＯ細胞系: Ｘｒｓｓ５(ＫＵ８０(-/-))、Ｘｒ−１(ＸＲＣＣ４(-/-))、Ｖ３(ＤＮＡ-ＰＫｃｓ(-/-))及び対応する親細胞系ＡＡ８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１８５９）、並びに細胞系：ＨＩＳ Ｐ１.１３-１１（ＫＵ７０（-/-））及び対応する親細胞系 ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）。これらの細胞系を、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地中で生育させた。さらに、ヒト・グリオーマ細胞系ＭＯ５９Ｊ（ＤＮＡ-ＰＫｃｓ(-/-)）および対応する親細胞系ＭＯ５９Ｋ（野生型のＤＮＡ-ＰＫｃｓ） (Lees-Miller SP,等、 Science 1995、267 (5201):1183-5）を用い、それらを、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ/ＮＵＴ.ＭＩＸ-Ｆ１２ １:１培地中で生育させた。
【０１０１】
ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症突然変異タンパク質）欠損個体から得た細胞系ＡＴ-５、及び対応する親細胞系、ＭＣＲＣ-５(Raj K,等、Nature. 2001、412 (6850): 914-7)を用い、その両方を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。
【０１０２】
神経芽腫細胞系ＩＭＲ３２(ＡＴＣＣ ＣＣＬ-１２７)、ＧＩ-ＬＩＮ及びＬＡＮ-５(Panarello C.等、Cancer Genet、Cytogenet.、 2000, 116:124-132)は、必須アミノ酸及び１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地＋Ｈｅｐｅｓ ２５ｍＭ中で生育させた。
【０１０３】
ヒト骨肉腫細胞系Ｕ２ＯＳ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ９６）；その初代繊維芽細胞ＩＭＲ９０（初代継代）を、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中で生育させた。
【０１０４】
結腸癌細胞系ＨＣＴ-１１６ (不適正塩基対修復遺伝子ヒトＭＬＨ１タンパク質の欠損体(Raj K,等、 Nature. 2001、412 (6850): 914-7))を、１０％ＦＣＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ培地中で生育させた。
【０１０５】
キメラタンパク質の形質導入許容量を、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞及びＩＭＲ９０初代繊維芽細胞において検査した。これらの細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で生育させ、抗生物質の存在下で、概ね同じ培地中で本発明タンパク質を用いて処理した。融合タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴの調製量（１、１０、５０、１００、２００ｎＭ）およびＳＣＰＶＵタンパク質(ＴＡＴを含まない一本鎖ＰｖｕＩＩ)、並びにコントロールとしてＳＣ３４（ＰｖｕＩＩ酵素の３４位に変異を有することを除いて、ＳＣＰＶＵＴＡＴに記載のとおりに調製した）と共に、細胞を１０分間培養した後、細胞抽出液を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離して、ＰｖｕＩＩに対する単一特異的抗体を用いた免疫ブロット分析により分析した。さらに、３０分間インキュベートして、ＰｖｕＩＩ特異抗体と、プロピジウムヨウ化物とを用いて核を共染色した免疫蛍光分析により、取り込みを分析した。データは共に、タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴが細胞内、特に核内に濃縮されており、その取り込みは図２で示すように分析した細胞ではほぼ１００％であったことを示している。これに対して、ｔａｔ配列を有しない融合タンパク質（ＳＣＰＶＵ）では導入されていなかった。これらの濃縮は、用いたタンパク質が可溶性で且つ通常環境下で調製が行われ変性条件を経ていないことから、タンパク質の変性とは無関係である。実際、記載の方法により通常環境下で調製されたタンパク質は、タンパク質形質導入において効率よく機能し、Ｄｏｗｄｙの米国特許第６，２２１，３３５号中の別のタンパク質について最近記載された変性法よりも優れていた。
【０１０６】
実施例５
インビボにおいて本発明の組換えタンパク質を用いて処理した後に、ＴＵＮＥＬ検査によりＤＳＢ導入を確認する。
ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて細胞を素早く処理した後に、インビボでＤＳＢを標識できる、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素(ＴｄＴ) ｄＵＴＰ-ＦＩＴＣによるＴＵＮＥＬ反応（インシトゥ細胞死検出キット(In Situ Cell Death Detection Kit)、ロッシュ・ダイノスティック、ドイツ・マンハイム）を用いて、このタンパク質の機能を検定した。この検定は、細胞をＰＢＳ中の４％ パラホルムアルデヒド、０．１％トライトンにより固定化した後に行った。ＴＵＮＥＬ反応後に、細胞をプロピジウムＪ−を用いて対比染色（counter-stained）を行った。ネガティブコントロールとしてＳＣ３４構築物などのヌクレアーゼ活性欠損誘導体を使用することで、バックグラウンドの活性を見積もることができる。ＳＣＰＶＵＴＡＴ融合タンパク質を用いて処理してから少なくとも１０分間は、試験したすべての細胞でＴＵＮＥＬ陽性反応を示した（９０-１００％)。試験した細胞の中には、上皮細胞(ＨＥＫ-２９３、ＭＣＦ-７、不適正塩基対修復遺伝子ｈＭＬＨ１に欠損を有する結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６)、初期繊維芽細胞(ＷＩ８３、ＩＭＲ９０、マウス胎児繊維芽細胞、ＭＥＦ）を含む、ヒトまたは齧歯類の細胞系があった。これにより、本発明の融合タンパク質が効率的に細胞核に輸送されることに加えて、検定した限りで、全ての細胞型でインビボ・エンドヌクレーゼ活性を示すことが確認された。実際に、ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理した数分間は、細胞培養上清中の本タンパク質の濃度が少なくとも１０ｎＭであっても、ほとんどの細胞で有意なＴＵＮＥＬ活性を示したことから、本キメラタンパク質がインビボで直接的かつ迅速に機能することが実証された。この態様により、本発明のシステムが、転写ユニットにより誘導されるエンドヌクレアーゼと比較しても、あるいは別のタイプのタンパク質導入法、例えばエレクトロポレーション法、またはリン酸カルシウムを用いる沈殿法、もしくはリポフェクションなどの脂質誘導法、のいずれと比較しても、もっとも効率が良いものなる。この活性は、細胞周期の時期とは無関係であり、また、ほんどの細胞でアポトーシスのポジティブマーカー（すなわち、シトクロームＣの放出、ポジティブアネキシン（Ａｎｅｘｉｎ）Ｖ染色）が見られないことからアポトーシスとも相関はない。
【０１０７】
図４には、ＳＣＰＶＵＴＡＴまたはＳＣ３４を用いてＵ２ＯＳ細胞を３０分間処理した後にＴＵＮＥＬ検定して得られた結果を示し、このタイプの検定によりＳＣＰＶＵＴＡＴ構築物の機能が実証される。
【０１０８】
実施例６
細胞周期における本発明タンパク質処理の効果の評価
最終的に、インビボで生じるＤＳＢが細胞周期にも影響を及ぼすかどうかを確かめるため、本発明タンパク質を形質導入した後に、様々な細胞周期の時期でのＤＮＡ量を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により分析した。種々の濃度で複数のタンパク質を用いて処理した後に様々な時点で、細胞を７０％エタノール中で固定化し、ＲＮＡｓｅＡで処理した後にプロピジウムＪ−を用いて染色した。
【０１０９】
ＦＡＣＳ分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ (ベクトン・デッキンソン)機器を用いて行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア・プログラム・パッケージを用いて、得られたデータを評価した。サンプル毎に単一の現象を少なくとも３×１０４回はＤＭモードで分析した。細胞周期におけるＤＮＡ量分布の統計解析は、ＭＯＤＦＩＴ ＬＴＴＭソフトウェア・プログラム・パッケージを用いて行った。２Ｎ ２倍体ＤＮＡ量は細胞周期のＧ１期にある細胞に対応し、４Ｎは４倍体相当のＤＮＡ量を表し、細胞周期のＧ２期および／またはＭ期に対応する。ＤＮＡ量がその中間にある場合には、ＤＮＡを活発に複製する時期に当たる細胞周期中のＳ期を表し、ＤＮＡ量が２倍体２Ｎ以下の場合にはアポトーシス細胞を表す。
【０１１０】
図５では、Ｕ２ＯＳ細胞を１０ｎＭのタンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴと共に２４時間インキュベートすれば、４倍体の集団を増加させるのに十分であることが示されている。ＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質を新鮮な培地を用いて希釈すると、細胞は２４時間で正常な細胞周期をする集団に戻ることができるのに対し、連続的に（例えば１２時間ごとに）ＳＣＰＶＵＴＡＴを加えると、分析したほとんどの細胞でアポトーシスは誘導されることなく、細胞周期の遅延が安定に誘発された。同様の処理を、タンパク質ＳＣ３４およびＳＣＰＶＵ（ＴＡＴドメインを有しない）を用いて行ったが、細胞周期の分布に変化は生じない。
【０１１１】
他の方法を用いれば、ＦＡＣＳ分析で４倍体（４Ｎ）として検出された集団をＧ２期とＭ期とに最終的に区別できる；すなわち、１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理した４ＮのＤＮＡを含むＨＣＴ１１６およびＵ２ＯＳ細胞において、その核が大きいままであり、有糸分裂構造や核膜の崩壊が全く見られないなら、それは細胞がＧ２期にあることを示しており、さらに細胞周期のＭ期に進む様子が全く見られないのであれば、Ｇ２細胞周期阻害を表している。さらに、生化学的分析を行って、Ｃｄｃ２‐サイクリンＢ複合体のキナーゼ活性を検証することができる。また、微小管阻害剤ノコダゾールまたはタキソールを用いて誘起される、分裂の開始をＣｄｃ２キナーゼの核活動によって、またはＣｄｃ２５Ｃの核局在によっても検出することができる。これらの検定により、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細かな細胞周期停止ポイントを詳細に分析することができ、これにより、ポジティブコントロールと比較して、細胞周期のこの時期の分布をさらに検出することができる。細胞周期の別の時期についての同様の実験が当分野で周知である。図７Ａに示した検定、および図１４で示した免疫蛍光分析が、このタイプの実験についての実施例である。実施例で示すように、融合タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴで処理することで、細胞系ＨＣＴ１１６にＤＳＢが導入され、次いで後期Ｓ／Ｇ２に相当する細胞周期の時期に可逆的に停止されることが示された。
【０１１２】
実施例７
ＡＴＭ／ＡＴＲに突然変異を有する細胞に対する本タンパク質の効果
毛細血管拡張性運動失調症突然変異タンパク質(ＡＴＭ)および毛細血管拡張性運動失調症関連突然変異タンパク質（ＡＴＲ）は、チェックポイント活性において、ＤＮＡ損傷に応答する中心的な信号伝達因子である。この経路により、細胞周期の進行およびＤＮＡ修復装置が調整されている。これらの制御により、細胞が損傷を受けた場合に、ＤＮＡが修復されるまで、細胞を細胞周期の次の時期に移行させないといった、適当な範囲のイベントが確保される。これは、細胞周期キナーゼが阻害され、同時に負の調節因子、この中にはｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子やその転写の標的として既知のもの（すなわちｐ２１、１４-３-３シグマ）、次いでＤＮＡ修復に関与するエフェクター・タンパク質の正確な機能や厳密な正確性に重要となる細胞周期阻害を惹起するタンパク質、が誘導されて、細胞周期装置の制御に影響を与えている。これら制御タンパク質における突然変異はガンに対する強い疾病素質であることには注意する必要がある。
【０１１３】
Ｕ２ＯＳ細胞を、２ｍＭのカフェイン、メチルキサンチン(metylxantin)誘導体（ＩＣ５０＜１ｍＭ）で処理すると、細胞周期のＧ１期に適度な遅延を誘起し、ＤＮＡ損傷に対して細胞が過敏になるのを阻止する効果をさらに誘起する(Sarkaria等、1999)。このことは、カフェインが、その全てが相同なセリン／スレオニンキナーゼ領域（ＰＩＫＫ）を有するホスホ−イノシトール３キナーゼ（ＰＩ３）クラスの少なくとも３種類のメンバー、ＡＴＭ、ＡＴＲおよびＴＯＲの触媒活性を阻害することを示している。１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴと２ｍＭのカフェインとを組み合わせた培地中で３０時間生育させたＵ２ＯＳ細胞では、ＳＣＰＶＵＴＡＴの特徴的な細胞周期の停止を示さないが、適度なＧ１期の遅延を誘起する。このことは、カフェインがインビボにおいてＳＣＰＶＵＴＡＴ効果に対する拮抗剤であることを示している。最後の実験で、カフェインはインビトロでもＳＣＰＶＵＴＡＴを阻害せず、また本タンパク質の形質導入許容量に影響も与えないことが示された。これらの実験に用いたのと同じ論拠を、「インビボ」で活性があり、かつＡＴＭおよび／またはＡＴＭ／ＡＴＲ経路の阻害物質として作用する一般な組成物またはリード化合物を構成する、ＳＣＰＶＵＴＡＴに対する拮抗組成物を選択するのに応用できる。そして、ＡＴＭ／ＡＴＲまたはこの経路に関与する他のタンパク質に対する特異性は、適当な突然変異細胞系を用いることによって最終的には詳細に分析することができる。ＳＣＰＶＵＴＡＴの迅速で詳細な特徴づけ及び単一特異的活性のために、これらの物質はこの検定に有効に使用できる。本発明の使用の簡便性により、このタイプの検定、さらに大規模、例えば組み合わせ化学（combinatorial chemistry）および／または組み合わせ分子生物学を有効に応用して組み合わせるハイスループットなどに応用できる。
【０１１４】
その他の実施形態において、ＳＣＰＶＵＴＡＴは、ＡＴＭ／ＡＴＲの活性化に依存するイベントをモニターするのに用いられる。ＡＴＭは、ＤＮＡ損傷により活性化され、チェックポイントに関与する多くの基質に対してセリン／スレオニンキナーゼとして機能する。それらの基質をリン酸化することで、チェックポイント応答の活性化に影響を及ぼしたり、しなかったりする。インビボで周知のＡＴＭまたはＡＴＭ依存性キナーゼの基質としては、Ｎｂｓ１、ＳＭＣ１(染色体の構造維持)、ＭＤＣ１（ＤＮＡ損傷の仲介物質)、Ｈ２ＡＸ（ヒストン２Ａｘ）、ｐ５３などが挙げられる。
【０１１５】
ＳＣＰＶＵＴＡＴに応答する、基質のｐ５３-Ｓｅｒ１５におけるＡＴＭ／ＡＴＲのインビボ誘導を分析した。ｐ５３のＳｅｒ１５におけるリン酸化は、タンパク質の安定性およびｐ５３の転写活性を制御するため、ｐ５３の転写応答に最も重要である。
【０１１６】
ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に応答したＳｅｒ１５におけるｐ５３のリン酸化は、ＡＴＭポジティブまたはネガティブ細胞系(それぞれＭＲＣ-５およびＡＴ-５)で検定した。比較のために、ヒドロキシウレア（ＨＵ）を用いた実験を並行して行った。ＨＵは、リボヌクレオチジル還元酵素として機能し、Ｓ期中にＤＮＡ複製フォークを停止させＤＳＢを惹起する。これについて、ｐ５３のリン酸化Ｓｅｒ１５を特異的に検出するために、これに対する特異抗体を用いて、処理後の抽出物について免疫ブロット実験を行った。図７で示したように、ＡＴＭプラス細胞系ＭＲＣ-５（図７Ｂ）と同様にＡＴＭマイナス細胞系ＡＴ-５でも、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後にｐ５３-Ｓｅｒ１５の特異的リン酸化が得られた。ＨＵを用いて処理した場合にも、ｐ５３‐Ｓｅｒ１５のリン酸化が誘導され、同一の結果が見られたが、一貫して強い傾向にあった。このインビボでのリン酸化は、ＡＴＭ／ＡＴＲ阻害物質であるカフェインに対して過敏である；ＡＴ-５細胞を２ｍＭカフェインと共にインキュベートして、ＳＣＰＶＵＴＡＴまたはＨＵ処理しても有意なｐ５３-Ｓｅｒ１５のリン酸化は示さない（図７Ｃ）。本発明の目的に応じて、ＡＴＭの基質をリン酸化する他の実施例として、ヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９リン酸化の分析を行った。それにより、細胞周期のＳ期およびＧ２期中の放射線照射によって惹起されたＤＮＡ損傷に迅速に応答して、ＡＴＭがヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９をリン酸化することが示された。Ｕ２ＯＳ細胞をＳＣＰＶＵＴＡＴで６０分間処理した後に、固定化してヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９のリン酸化を分析した。細胞を、ヒストンＨ２ＡＸにおけるリン酸化-Ｓｅｒ１３９に対する特異抗血清を用いて分析し、単一細胞レベルで顕微鏡観察して分析した。コントロールとしてヒストン２Ｂを分析した。その結果、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理によって、ヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９のリン酸化が迅速に誘導され、かつ、この活性が処理細胞の核内に特異的に局在する形で検出されるが、未処理細胞では検出されないことが示されている（図１２）。さらに、ＡＴＭキナーゼ阻害剤であるウォルトマンニン(５０μＭ)は、この反応の拮抗剤である。用いたウォルトマンニン濃度は、ＡＴＭに対して特異性を示したがＡＴＲを阻害しなかったため、これら２つのキナーゼを区別する簡便な検定法を表している。このタイプの実験では、ＡＴＭ経路の基質を分析して、ＳＣＰＶＵＴＡＴにより惹起されるＤＳＢによって誘導される生化学的分子ターゲットを明らかにできる。本発明により処理された細胞または細胞抽出物におけるウェスタン−ブロット法、免疫蛍光分析、または酵素学的検定によって、ＡＴＭキナーゼの基質を生化学的および／または免疫学的に分析することは、各経路における正常な誘導と比較して、特定の細胞についていの、インビボでのチェックポイント応答の状態を説明するのに有効である。
【０１１７】
さらに、これらの検定法は、本発明と併せて自動スクリーニングに用いるのに有効であり得る。本発明によりＤＮＡ中に生じた損傷の性質を正確且つより詳細に規定できるため、同様の検定タイプに従来から用いられている他の化合物に対して優れている。一回の検定またはハイスループットスクリーニングに本発明を使用すれば、副次的効果や多面的（pleotropic）効果を考慮する必要がほとんどなく、複合スクリーニングの成功に本質的な条件が必要なだけである。これらのタイプの実験で得られるデータは、ＤＳＢにより誘起される効果と同等と考えることができる。さらに、ＳＣ３４のようなヌクレアーゼ活性を示さない突然変異タンパク質誘導体を利用することで、これらの検定法に対する重要なコントロールが提供される。
【０１１８】
実施例８
ＳＣＰＶＵＴＡＴに誘起されるＡＴＭおよびｐ５３由来の効果の依存性
一般に、ＤＮＡ損傷において、制御機構（チェックポイント）に相当する成分における突然変異は、細胞周期を抑制する特徴に変化をきたし、多くの場合、これらの突然変異がガンの疾病素質を決定付ける。
【０１１９】
一方、ＤＮＡ修復にエフェクター分子として関与するタンパク質は、一般的に、細胞周期を正常に抑制するが、主にチェックポイント成分の欠陥と組み合わさった場合にのみ腫瘍進行を惹起し、腫瘍の疾病素質に対して相乗効果を頻繁に示す。エフェクター分子中の突然変異はＤＳＢに対して特に過敏であり、チェックポイントの突然変異の場合には見られない顕著な特徴を示す。本発明のタンパク質が単一特異性を有するため、ＤＳＢに対する感受性や細胞周期における影響を、導入された損傷に対する端的な結果として説明することができる。実際に、欠損が細胞周期機構（チェックポイント）の成分または修復装置に生じた場合には、それを評価することができる。
【０１２０】
ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理によって導入されたＤＳＢに対する細胞周期応答を、ｐ５３ポジティブまたはネガティブ細胞において分析した。ｐ５３ポジティブ細胞の場合は、Ｓ期の値が低くなり、Ｇ１およびＧ２期において細胞周期抑制の働きが見られるが、ｐ５３ネガティブ細胞の場合には細胞周期を抑制する特徴は見られない。さらに、このタイプの結果はｐ５３の下流因子についても得られた。ｐ２１中の突然変異はｐ５３マイナス細胞に相当する挙動を示し、また、１４-３-３シグマ中の突然変異についてはＧ１停止した。これにより、このタンパク質がｐ５３と部分的にオーバーラップしており、さらに、細胞周期のＧ２期のみ制御する働きを担っていることが分かる。最終的には図８Ａに示すように、ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理した後に突然変異体ＡＴ−５を分析した。ＡＴＭの突然変異細胞系（ＡＴ-５）をＳＣＰＶＵＴＡＴと共に３６時間インキュベートすることで細胞周期を過渡的に遅延させることができるが、これはＤＮＡ量のＦＡＣＳ分析により決定した。ＡＴ-５細胞では４Ｎ Ｇ２のＤＮＡ量に大きな増大が見られたが、Ｇ１遅延が全く見られなかったことから、Ｇ１チェックポイントにおける複合欠損が示された。重要なことに、ＡＴＭポジティブ細胞系と異なり、２４時間経過してもＧ２遅延が解消せず、細胞周期に再び戻ることはなかった（図５を参照のこと）。ＡＴ-５細胞に６０分間ＳＣＰＶＵＴＡＴを一回加えることで、２４時間後の細胞周期停止を誘起させるのに十分であり（図８Ａ）、最終的には、不正確なＤＮＡ連結によって細胞死が引き起こされ、その結果として、６０分間のＳＣＰＶＵＴＡＴ一回処理後のコロニー形成活性はＡＴ-５細胞の０．０２％以下となる。この検定において、ＡＴＭポジティブコントロール細胞系ＭＲＣ-５では、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に対して感受性は低かった（図８Ｂ）。加えて、コントロールとして、細胞をアドリアマイシンと共にインキュベートした。突然変異ヌクレアーゼ変異型で処理した場合に、未処理と同等の効率でコロニーが形成されたため、この効果はＳＣＰＶＵＴＡＴのエンドヌクレアーゼ活性によるものであった。これらの実施例で、種々の突然変異細胞がＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に応答して厳密な細胞周期プロファイルを示すことに加え、その特徴がＤＳＢによる細胞周期の欠損を診断するのに利用できることを実証している。
【０１２１】
実施例９
ＮＨＥＪ（非相同末端再結合）修復経路に欠陥のある細胞に対するＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質の診断能力を評価する。
ＮＨＥＪは、相同組換え修復が頻繁に見られる下等真核生物と異なり、高等真核生物における二本鎖ＤＮＡ切断修復に対する主要な機構を表す。このシステムに関与するタンパク質は、Ｖ（Ｄ）Ｊ免疫グロブリン組換えの最終段階にも関与する。本発明タンパク質が特定の様式でＮＨＥＪ酵素も活性化するかどうかを確かめるため、この経路に必須の要素の１つに個別に変異を有する齧歯細胞系を分析した。
【０１２２】
図９および図１３にまとめるコロニー形成分析において、本発明タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴによる１回の処理で、分析したＮＨＥＪ変異細胞系すべてにおいてコロニー形成活性を大きく低下させるのに十分であることが確認できる。
【０１２３】
本発明のＤＳＢ修復の特異性を実証するため、ＤＳＢのＮＨＥＪ修復に関与する必須要素の１つに機能性の変異を有する同型接合欠損を含む、齧歯類の細胞を用いた：ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの調節サブユニットを含むＰＩＫＫサブユニット触媒ドメイン（ＤＮＡ-ＰＫｃｓ； Ｖ３細胞系、相当する親細胞系ＡＡ８）、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼＫｕ７０の調節サブユニット（ＨＩＳ Ｐ１．１３‐１１；相当する親細胞系ＣＨＯ−Ｋ１）、サブユニットＫｕ８０（ｘｒｓｓ５；相当する親細胞系ＡＡ８）およびＤＮＡライゲースＩＶ調節サブユニットＸＲＣＣ４（ＸＲ-１細胞系；相当する親細胞系ＡＡ８）。これらの細胞系を、インビボでＳＣＰＶＵＴＡＴを用いたヌクレアーゼ活性検定で分析し、表示の親細胞系と比較した。さらに、これらＮＨＥＪ変異細胞をＳＣＰＶＵＴＡＴ用いてコロニー形成、コロニー−副産物（outgrowth）検定で試験したが、検定は濃度１０ｎＭ（灰色棒）または７５ｎＭ（黒棒）のＳＣＰＶＵＴＡＴを１回添加して、あるいはタンパク質処理を行わず（未処理、白棒）１２時間経過した後に行った。添加の７〜１０日後に、ギムザ−ブルーを用いて染色して細胞増殖を分析して、種々の細胞濃度を定量した。個々の実験で得られた結果を図９にまとめた。ＤＮＡライゲースＩＶのＸＲＣＣ４サブユニットに変異がある細胞は、ＳＣＰＶＵＴＡＴによって導入された平滑末端ＤＳＢに非常に敏感であり、さらに興味深いことに、検査したＤＮＡ-ＰＫに変異を有する細胞はすべて、触媒サブユニットに変異を有しているため、コロニー形成検定において同様に大きな低下を示す。親細胞と対照的に、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子にホモ接合変異を示すＨＣＴ１１６のような、不適合修復経路に既知の欠損を含む細胞については、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に対して同様の検定を行っても感受性に増加は全く見られない。
【０１２４】
さらなる実施例において、ＤＮＡ-ＰＫｃｓに欠損があるヒト膠芽腫細胞系（ＭＯ０５９J）をＳＣＰＶＵＴＡＴで処理し、親細胞系ＭＯ５９Ｋと比較した。同様に、ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１０ｎＭ、灰色棒；７５ｎＭ、黒棒；未処理、白棒）で１回処理して１２時間後に、細胞増殖を定量した。さらに、ヒトＤＮＡ-ＰＫｃｓ変異細胞もまたＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に応答して感受性に顕著で特異な増大を示す（図１３Ａ、Ｂ）。これらの細胞をマルチウェル−マイクロタイタープレートに種々の濃度で植え、表示のＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理してギムザ−ブルー染色を行った。マルチウェルーマイクロタイター−プレート（実施例については図１３Ａを参照のこと）をＶｅｒｓａＤＯＣＲ(バイオラッド)イメージングシステムを使用してスキャンし、その生育をマイクロタイター−プレート分析用のソフトウェア・パッケージ・Ｑｕａｎｔｉｆｙ ＯｎｅＲ（マイクロタイター−プレート・スキャニング・ソフトウェア）を用いて自動的に定量した。得られたデータをさらにヒストグラムにまとめ、その概要を図１３に示す。ＤＮＡ-ＰＫｃｓに変異のある齧歯類の細胞系と、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に対して過敏であると実証されたヒト細胞系から得られた結果とが一致していることから、ＤＳＢの導入にＳＣＰＶＵＴＡＴが高い特異性を有していることが認められる。これらの実施例で、半自動または完全自動検定への応用を含めて、使用したシステムの実行可能性が実証された。
【０１２５】
実施例１０
ＤＳＢ誘導ストレスに対する共同剤または拮抗剤の候補化合物のスクリーニングに関する検定
Ｕ２ＯＳ細胞を１０ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを単独で、また１０μＭのＨ２Ｏ２を単独で、あるいは組み合わせて用いてインキュベートし、細胞周期プロファイルをＦＡＣＳにより分析した。１０μＭのＨ２Ｏ２を単独で用いた場合にはＧ２期には増大は見られず、また１０ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを単独で用いた場合にはＧ２期にも２０％から２８％というわずかな増大しか得られなかったのに対して、細胞を２種類の成分を同時にインキュベートすることで、Ｇ２期に対応するピークを２０％から４５％に大きく増大させ、細胞周期プロファイルに特異で大きな増大変化をもたらした（図１１Ａ、図１１Ｄと比較して）。単一の成分をインキュベートして得られた結果に基づいて、両方の化合物を同時にインキュベートすることで、細胞周期の変動に相乗効果のあったことが明らかに示される。
【０１２６】
次に、同様の実験として、ＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質をアフィジコリン（ＤＮＡ挿入剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤）と一緒にインキュベートしたが、相乗効果は見られず、単に両成分の効果が加算されるだけであった。再度、本発明タンパク質により平滑末端ＤＳＢが導入された細胞系に対する相乗作用および拮抗作用の検出に使用できるこの検定の簡便性を実証した。上記のように、この検定の利点は、導入されるＤＮＡ損傷が単一特異的であることと、ヌクレアーゼ欠損ＳＣ３４タンパク質を用いた系でバックグラウンドを測定可能なこと、さらに、事実上全ての細胞およびどの細胞周期においてもこの検定は非常に迅速に且つ簡便に用いることができることである。このことは、インビボでＤＳＢを導入できる他の試薬については、これまで記載されていなかった。したがって、ラジカルおよびカフェインについて示したこのタイプの検定において、ＤＮＡ修復経路およびその制御を阻害する組成物をタイプごとにスクリーニングするのに用いることができる。
【０１２７】
実施例１１
神経芽腫おけるＳＣＰＶＵＴＡＴ処理によるアポトーシス誘導
分析した上皮細胞および間葉由来細胞の多くはＳＣＰＶＵＴＡＴで処理してもアポトーシスを起こさなかったが、いくつかの神経芽腫細胞系（ＩＭＲ３２、ＬＡＮ５、ＧＩ-ＬＩＮ）やクリニックから単離された種々の初代神経芽腫細胞で、顕著なアポトーシスが誘導された。図１０では、これらの細胞における、本発明タンパク質によるアポトーシス誘導の実施例を示す。この分析では、細胞をプロピジウムＪ−染色した後にＦＡＣＳを用いて、そのＤＮＡ量を分析した。アポトーシス細胞（Ａ）は、２Ｎ以下のＤＮＡ量を示す細胞として検出される。計算した領域は、各ヒストグラムの頂点にある矢印で示される対応範囲である。１０ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを添加した場合には３０時間内に素早くアポトーシス細胞が１８％誘導され（図１０Ｂ）、また、１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを添加した場合にも、同じ時間単位でアポトーシス細胞が２９％以上も誘導されたのに対し（図１０Ｃ）、ヌクレアーゼ欠損変異体ＳＣ３４はそのような影響は見られなかった。これらの実験で、神経芽腫細胞でアポトーシスが非常に特異的に誘導されることが実証され、本発明タンパク質がこのタイプの腫瘍の治療処置についての最有力候補として利用できることが実証された。
【０１２８】
さらに、組織特異的輸送システムと組み合わせることで、本発明の目的である配列に、神経芽腫治療についての候補物質として十分な特異性を含ませることができる。実際、本発明は組織特異的な輸送配列をスクリーニングするプラットフォーム技術として応用でき、今後に対して有効な含みを有している。
【０１２９】
加えて、既に上記の実施例（実施例８）で予想したように、本発明は、標的細胞において、特に腫瘍由来の悪性細胞またはそうでない細胞において、または同一個体の正常細胞の下層範囲において、別個に特定のアポトーシスを誘導することのできる特定のリード化合物または特定の混合物をスクリーニングするのに用いることもできる。
【０１３０】
実施例１２
免疫顕微鏡分析によるＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期タンパク質の細胞局在。
ＨＣＴ１１６（ｐ５３(+/+)）を未処理、またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ）もしくはタキソール（０．２μｇ／ｍｌ）で３０時間処理して、３％ ＰＦＡを用いて固定化した後、サイクリンＢ１またはＣｄｃ２５ｃに対する特異抗体を用いて処理した。サイクリンＢ１に特異的な１次抗体に結合するＦＩＴＣ標識化２次抗体（緑）か、またはＣｄｃ２５Ｃに特異的な１次抗体に結合するＴＲＩＴＣ標識化２次抗体（赤）を用いて、顕微鏡により免疫蛍光分析した（図１４を参照のこと）。ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の４Ｎ ＤＮＡ量の細胞から分かる細胞周期マーカー Ｃｄｃ２５ＣおよびサイクリンＢの細胞質分布により、Ｇ２期の停止と、処理した細胞が細胞周期のＭ期に進行しないことが実証された。
【０１３１】
この結果は、細胞周期のＭ期で停止したことを示す顕著な核分布を表す、タキソールを用いた場合に得られる結果と異なっている。
【０１３２】
２つのマーカータンパク質の特定の分布に変化、すなわち、不活性型サイクリンＢキナーゼの細胞質分布に対して、細胞周期を次の分裂後期に進行させる活性型サイクリンＢキナーゼの核内局在を示すといった変化が生じ、続いて、ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼはホスファターゼＣｄｃ２５Ｃ（Ｃｄｃ２５Ｃから１４-３-３タンパク質が放出されて、このホスファターゼは活性化する）によって脱リン酸化されて活性化されることが、Ｇ２期／Ｍ期移行の顕著な特徴である。実際に、この経路は細胞周期のこの時期における律速段階である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ修復活性を制御する細胞システムおよび細胞周期制御の研究に係る分子および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物のゲノムは、自発的な内因性の化学的または生化学的損傷によって生じる化学損傷、あるいは外因的なゲノム損傷物質に曝されることによって生じる化学的損傷に常に曝されている。
【０００３】
ゲノムの安定性に必要な進度を保障する一方で、すべての生物種にとって必要不可欠な進化および適応に必須のゲノムの不安定性を供給するため、非常に複雑なＤＮＡ修復およびＤＮＡ組換え装置に関するシステムが細胞内で進化してきた。一方でゲノムの厳密性のため、他方で分子の多様性を生み出すための２つのシステムの間にある平衡は、正確性および精密性を保障する制御機構によって調節されている。その制御のレベルは、いわゆる「チェックポイント」または「サーベイランス制御」によって実現され、すべての生物においてゲノムの厳密性を保障している。関係する機構および既知遺伝子についての報文、並びに参考文献の目録に関しては、Zhou B.およびS,Elledge、Nature、2000、408:433-439を参照のこと。
【０００４】
近年、ＤＮＡ修復に関与する機構を分析するための分子ツール、およびさらに重要なものとして、それらの機構を制御および調節するための分子ツールが数多く開発された。例えば、米国特許第６，３０７，０１５号では、プロテインＣｈｋ１に基づく製品および方法が記載されており、それらは、Ｃｈｋ１プロテインによって、細胞チェックポイントおよびＤＮＡ修復の制御に重要な機構および遺伝子産物を同定できる、と規定されている。
【０００５】
さらに、細胞のゲノムでの組換え導入方法が開発された：一例として、Peitz等は、Proc. Natl. Acad. Sci.、2002、99: 4489-4494にて、以前は５０％の導入効率でゲノムに導入されていたｌｏｘ−Ｐ部位と組み換えることのできるキメラＣｒｅ組換え酵素の翻訳物を得た。さらに、国際公開第００／４６３８６号には、メガヌクレアーゼ(meganuclease)ＳｃｅＩを発現するベクターを組み合わせて、特異的に導入されたＳｃｅＩ部位での染色体組換え導入法が記載されている。
【０００６】
遺伝毒性のある物質を用いて誘導をかけた後にＤＮＡ損傷の修復を分析することが困難なのは、そのすべてのＤＮＡ損傷物質が様々なタイプのＤＮＡ病変を広範囲にわたって同時に引き起こすことから、単一特異的様式でＤＮＡに作用するシステムの導入には非常に関心がある。それは、細胞周期を制御する経路および特にＤＮＡ修復に関与する遺伝産物を詳細に規定することを可能にし得る。これらの経路の効率は、正確な細胞複製に必須であり、それらを詳細に理解することで、より選択的な医薬およびより方向性をもった治療介入をスクリーニングするシステムの開発が可能となる。
【０００７】
広範な身体的および遺伝的疾患は、ＤＮＡ修復機構における、またはより一般的にはＤＮＡにコードされた遺伝情報の制御における欠陥と関連している。これら欠陥の多くが、腫瘍病理学の根本原因であるが（例えば、ｐ５３、ＡＲＦ、１４−３−３シグマ、ｐ１６、Ｒｂなどの遺伝子の突然変異）、さらにこれらの欠陥は、「身体的突然変異（somatic mutations）」または「遺伝的疾病素質（genetic preposition）」として単純に分類されており、これまでの特徴付けがなされていない多くの病状に関与するかもしれない。既に特定された１つの経路における突然変異があるが、それは遺伝的疾病の遺伝的根拠を構成し、それら遺伝子疾病には、毛細血管拡張性運動失調症（Ａ−Ｔ）、運動失調（atassia）と関係のある疾患（毛細血管拡張性運動失調様疾病ＡＴＬＤ、Ｍｒｅｌｌ）、ネイメーヘン染色体不安定症候群（Nijmegen breakage syndrome）（ＮＢＳ）、ファンコーニ貧血、ロトムンド・トムソン症候群、非ホジキンリンパ腫(Non Hodgkin lymphomas)（ＮＨＬ）、ウェルナー症候群、ブルームズ症候群、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）症候群、色素性乾皮症、ＢＲＣＡ１がある。
【０００８】
ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ゲノムの最も危険な損傷である。これは、例えば電離放射線、外的原因や内的条件（例えば細胞ストレス）から生じ得る活性酸素種（ＲＯＳ）により導入され得る。また、ＲＯＳは、腫瘍治療に使用される化学療法剤、例えばＤＮＡ挿入剤またはＤＮＡ架橋剤により誘導される。ＤＳＢの修復は、他のＤＮＡ損傷よりも困難で、ＤＳＢ末端の修復イベントおよび連結反応により、遺伝物質の喪失、増幅または修飾が生じるため遺伝的に不安定となり、また腫瘍化する可能性がある。
【０００９】
これらの事象が修復経路およびその細胞制御を誘起することから、それらを理解することは、次の治療への使用の可能性を提供するために、基本的に興味深いことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，３０７，０１５号
【特許文献２】国際公開第００／４６３８６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Zhou B.およびS,Elledge、Nature、2000、408:433-439
【非特許文献２】Peitz等は、Proc. Natl. Acad. Sci.、2002、99: 4489-4494
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ修復機構または遺伝情報の制御における欠陥を治療するための有効物質を供給することである。好ましくは、これらの物質は、提供すべき場所でその活性を提供するために、細胞または特に核に輸送されなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、
ａ．特定のヌクレオチド配列に対してアフィニティーを示すポリヌクレオチド
ｂ．ＤＮＡ修飾酵素
ｃ．細胞内輸送活性を有する領域
を含むキメラポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明は、本発明のキメラ分子を用いて、ゲノム中の同種の特定部位を示す、ＤＳＢを導入することによって細胞ゲノムを修飾するシステムを提供する。本発明のキメラ分子の有利なことには、直線的な反応速度活性、単一特異的活性、および該分子が受容体非依存的な形式で全ての細胞集団に浸透することが可能である事実がある。好都合なことに、これらのイベントは、選択的に試薬を選ぶことなく誘導できるので、これらの使用は非常に単純である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】大腸菌からのＳＣＰＶＵＴＡＴ精製を示す図。
【図２】タンパク質形質導入後にＵ２ＯＳ細胞から抽出したタンパク質の免疫学的分析を示す図。
【図３】共焦点顕微鏡による免疫蛍光分析を示す図。
【図４】単一細胞レベルでＤＳＢを検出するためのＴＵＮＥＬ分析を示す図。
【図５】ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるヌクレアーゼ依存的細胞周期の遅延を示す図。
【図６】ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるキナーゼ活性を示す図。
【図７】ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期停止に対する生化学的マーカーを示す図。
【図８】ＡＴＭ突然変異細胞（ＡＴ-５）のＳＣＰＶＵＴＡＴによる細胞周期阻害誘導およびコロニー形成活性を、非突然変異細胞（ＭＲＣ-５）と比較する図。
【図９】ＮＨＥＪ経路に関与する単一タンパク質における、選択された突然変異体を有する細胞のコロニー形成活性の比較に関する図。
【図１０】ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の神経芽腫細胞における種々のアポトーシス誘導に関する図。
【図１１】低濃度のＳＣＰＶＵＴＡＴと亜致死濃度のＨ２Ｏ２との相乗効果を示す図。
【図１２】ヒストン２ＡＸＳｅｒ-１３９のリン酸化効果、およびＰＩ３／ＡＴＭキナーゼ阻害剤であるウォルトマンニン（Wortmanin）によるこの効果の阻害作用の顕微鏡分析を示す図。
【図１３】自動分析によるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ）の突然変異細胞についての感受性の決定に関する図。
【図１４】ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期制御タンパク質の細胞内分布を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第一の実施形態は、特異的ＤＮＡ結合活性を有する、好都合にはクラスＩＩ制限酵素から由来のポリペプチド特性の好ましい領域；好都合にはエンドヌクレアーゼ活性からなる触媒ＤＮＡ修飾活性を示すポリペプチド特性の好ましい領域；ならびに細胞膜および／または核膜を通過する輸送活性を有する領域から成るキメラ分子に関する。上記機能性領域が、好ましくは相互に共有結合している。
【００１７】
本発明の他の重要な実施形態は、本発明のキメラ分子が完全に、または部分的にポリヌクレオチドの性質を有している場合には、それらをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１８】
本発明のその他の実施形態については、ＤＮＡ二本鎖切断を導入することで細胞周期制御およびチェックポイントの制御の重要なポイントを阻害する本発明ポリペプチドの活性から導かれるものとして、本発明には、インビボ(in vivo)で細胞において本発明キメラ分子を使用することにより特徴づけられる様々な方法が含まれる。特に、本発明に係る方法には、細胞周期およびＤＮＡ修復の制御に関与する生成物をコードする遺伝子の遺伝的損傷を評価する診断方法が含まれ、かかる制御活性を調節できる生物学的活性有する組成物を選択する方法も含まれる。
【００１９】
また、本発明には、新規輸送活性または輸送活性の組み合わせをスクリーニングするために、本発明のキメラ分子を使用する方法も含まれる。
【００２０】
さらに、本発明は、抗増殖物質、抗腫瘍性物質、抗生物質、駆虫物質または抗ウイルス物質として前記組成物を治療上使用すること提供する。
【００２１】
本発明の様々な態様は、単一特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）をインビボで細胞のゲノムに導入することができ、そのＤＳＢが細胞周期の制御ポイント（チェックポイント）を活性化するのに十分なシグナルを示すという、本発明者らにより得られた実験結果に基づいている。これらの活性化は、そのほとんどが酵母からヒトへの進化を通じて保存されており、同様のメカニズムは原核生物や原始細菌中にも存在する。
【００２２】
真核生物において、これらの活性化は、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症突然変異タンパク質)、ＡＴＲ(毛細血管拡張性運動失調症関連)、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ(ＤＮＡ依存性プロテイン−キナーゼ−触媒サブユニット)およびこれらの直接的または間接的な基質、例えばＣｈｋ１（チェックポイント−キナーゼ１）、Ｃｈｋ２（チェックポイント−キナーゼ２）、Ｂｒｃａ１（乳癌感受性−１）、Ｂｒｃａ２（乳癌感受性−２）、Ｍｒｅ１１（減数分裂性組換え１１）、Ｒａｄ５０（放射線５０二本鎖切断修復）、Ｎｂｓ１（ネイメーヘン染色体不安定症候群）、Ｒａｄ５１（放射線５１二本鎖切断修復）、ＦＡＮＣＤ２（ファンコーニ貧血相補Ｄ２）、ヒストン、ＢＬＭ（ブルーム症候群突然変異）などのヘリカーゼ、ＷＲＮ（ウェルナー症候群突然変異）、ｐ５３、ｐ５３の直接的または間接的な転写標的、例えばｐ２１および１４−３−３シグマなど、に由来する遺伝産物によって媒介されるが、このリストは完全なものではなく、またその他の多くの標的は既知のものや未だ発見されていないものがある。
【００２３】
特に、この遺伝子産物の幾つかの活性化によって、ＤＮＡ修復、アポトーシスまたは細胞周期阻害において、ゲノム完全性（integrity）に対するホメオスタシスの維持を調整し得ることが分かった。
【００２４】
本発明は、細胞膜を通過でき、真核生物細胞の場合には核に、または細胞中の寄生体に進入して、ＤＮＡ二本鎖の特定部位に結合して、理想的には一次速度則でＤＮＡを修飾するキメラ分子を提供する。
【００２５】
明らかに、この知見およびその使用形式は、医薬はもとより科学的目的のために広く実用化の道を開き、さらに、一般的なＤＮＡ修復、ＤＮＡ修復の制御および細胞周期の制御のメカニズムを研究する独特の方法に、並びに選択的な形態で全ての細胞のゲノムを修飾することができる生成物に応用される。
【００２６】
第一の実施形態において、本発明キメラ分子には、以下の３つの機能的構成要素：
−特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対してアフィニティーを示す領域であって、好ましくはポリペプチドからなる領域。この領域は、ＤＮＡ中のパリンドローム配列を認識することができる、クラスＩＩ制限酵素、そのサブユニットまたは機能性フラグメントであることが好ましい；
−ＤＮＡまたはＲＮＡ触媒活性を示す領域であって、好ましくはポリペプチドから構成される領域であり、この活性には、限定するわけではないが、例えば、メチル化酵素、アセチル化酵素、ＣＡＤ阻害物質（ＩＣＡＤ）および活性剤ＥｎｄｏＧを有するまたは有しないカスパーゼ活性化ＤＮＡｓｅｓ（ＣＡＤ）、Ｒｎａｓｅ、ＤＮＡまたはＲＮＡ−リガーゼ、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼおよびトポイソマーゼ、あるいはこれらのサブユニットもしくは機能性フラグメントが含まれるが、好ましくは酵素および好ましくは制限酵素、さらにより好ましくはクラスＩＩ制限酵素のエンドヌクレアーゼ活性が含まれる；
−細胞膜および／または核膜を通過でき、異種分子を細胞内および細胞小器官に運搬できる輸送活性を有する領域；この活性は「デリバラー」と称するが、「デリバラー」としては、細胞の生体膜を貫通でき、真核生物の場合には、さらに細胞膜および核膜もしくは、ミトコンドリアまたは色素体を含む他の細胞小器官の膜を貫通できる、好ましくはポリペプチドまたはペプチド、さらに脂質、リポソーム、有機または無機化合物もしくはナノ粒子からなる化学構造を意味する。特に、核内に運搬できるデリバラーが好ましい
が、含まれる。
【００２７】
上記の機能性ドメインは好ましくは共有結合している。本発明のキメラ分子は、化学合成して得ることができ、あるいはその機能性領域がペプチド性質の領域である場合には、組換えＤＮＡ技術により好ましくは合成して得ることができる。この実施形態では、および本発明では、上記の３つの機能性領域を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、好ましくは原核生物起源の宿主系において組換えポリペプチドを発現するのに役立つ。
【００２８】
本発明のキメラ分子は化学的方法または組換え法によるなどの混合技術によって生成することもできるが、少なくとも１つの領域は組換えＤＮＡ技術により産生された他の２つの産物と化学的方法によって結合されるものである。
【００２９】
本発明のキメラ分子の好ましい実施形態において、特異的ＤＮＡ結合活性を有する領域はクラスＩＩエンドヌクレアーゼ由来である。エンドヌクレアーゼの中から、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｆＩまたはそれらのサブユニットもしくは機能性フラグメントが優先的に選択される。本発明の以下の記載において、機能性フラグメントとしては、アミノ酸配列として、天然酵素の少なくとも１つの機能を含む、完全型タンパク質の１つの配列から部分的に派生した配列を含むポリペプチドを意味する。
【００３０】
別の好ましい実施形態においてもまた、ＤＮＡ修飾活性の領域は、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼであり、また特異的ＤＮＡ結合活性を含む同じエンドヌクレアーゼ、特にＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｆＩ、またはそれらの機能性サブユニットもしくは機能性フラグメントから選択される。この好ましい実施形態においては、単一のホモ二量化タンパク質中にＤＮＡ認識およびＤＮＡ修飾活性が連結されている。
【００３１】
この最後のケースでの好ましい実施形態において、制限酵素が一本鎖の分子として含まれていることが有利であるが、野生型酵素と比較して結合と切断の特性を維持している、Simoncsits A.等、J. Mol. Biol、2001、309:89-97にて酵素ＰｖｕＩＩについて記載されているように、酵素のすべてのサブユニットが共有結合されており、一本鎖ポリペプチドとして発現される。
【００３２】
発明者らは、さらに、本発明の範囲内において、制限酵素を一本鎖のタンパク質として有しており、制限酵素の修飾活性領域、サブユニットまたは触媒ドメインが点突然変異、欠失またはその他の構造変化によって、その修飾活性が変化または欠如し、且つ、同種ＤＮＡの認識能および結合能に関して、天然酵素と同等のアフィニティーを維持している、キメラ分子を開発した。特に好ましい突然変異体には、核酸に対する結合活性を実質的に維持（または増強）しているが、酵素（切断）活性を（相当部分（例えば＞５０％）またはほとんど（＞８０％））失っている突然変異体が含まれる。
【００３３】
本発明の最後の態様として、少なくとも、形質導入、細胞内輸送またはデリバラーに関する領域と、上記のようにアミノ酸配列が特定のＤＮＡ配列に対するアフィニティーを示す事実によって特徴付けられるＤＮＡ結合領域とを含むことがあるのは、好ましくはエンドヌクレアーゼの性質であり、少なくともクラスＩＩ制限酵素と９５％の相同性を有するものである。このようなキメラ分子については、その酵素活性は失われているため、修飾能力を発揮することなく、ゲノム中の特定のＤＮＡ配列に輸送するためにベクターとして使用される。本発明のこの態様の好ましい実施形態としては、Nastri等、1997、J. Biol. Chem. 272:25761-25767に開示されているように、ＰｖｕＩＩ酵素（例えばＳＣＰＶＵＴＡＴ中）の天然配列の代わりに、酵素ＰｖｕＩＩの３４位における置換突然変異（Ａｓｐ３４／Ｇｌｙ３４）によって得られる触媒部位の突然変異体Ｄ３４Ｇを用いることで得られるキメラ酵素が挙げられる。この変異型酵素（ＳＣ３４）では、ＤＮＡ認識活性は野生型酵素と同等であるが、エンドヌクレアーゼ活性を失っている。このような分子は、修飾活性を示すキメラ分子と並行して用いる、コントロールとして有用である。
【００３４】
細胞膜および／または核膜を通過するデリバラーまたは輸送領域は、好都合には、ペプチドである。これらは、ＨＳＶのタンパク質ＶＰ２２、アンテナペディアプロテインのホメオドメインの第３番目のアルファ−へリックス、ＨＩＶ−１のプロテインＴａｔおよびＲｅｖ、またはそのフラグメントもしくは機能性突然変異体の中から選択されることが好都合である。機能突然変異の例としては、Ho等、2001、Cancer Res.、61:474-577に記載されているものがある。好ましい実施形態は、Ｔａｔ由来のペプチド、およびペプチドＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳのＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列（Ｔａｔ領域の４７−５７に相当する）を有する機能ドメインを含むペプチドがある。ＨＯ等の文献に記載されているペプチド内のこのペプチドの機能性突然変異体が互換使用される。他の実施形態において、デリバラー配列は、いかなる種類のいかなる細胞型、およびウイルスを含む寄生体に対して特異性を有し得る。例えば、配列は、原核生物中にキメラ分子を特異的に導入させる細菌デリバラー配列から選択される。実施形態として、限定するものではないが、細菌デリバラーは、Rajarao等、2002、FEMS Microbiology Letters;215:267-272に記載および概説されているオリゴペプチド配列から選択することができる。これらのペプチドには、配列ＣＦＦＫＤＥＬのような大腸菌の膜を通過して運搬するためのＦＫＤＥモチーフおよびその機能的誘導体が含まれ得る。Ｓ.ａｕｒｅｕｓの場合には、例えばＶＬＴＮＥＮＰＦＳＤＰのようなＰＦＳを含むモチーフを用いてもよく、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの場合にはＰＦＳを含むモチーフとしてＹＫＫＳＮＮＰＦＳＤを用いてもよい。その他の例において、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファの相同体など酵母中に進入するための当分野で既知の配列および／または核導入配列と組み合わせた要素を含む本発明の分子は、酵母細胞特異的な輸送に使用できる。様々な酵母株に輸送するための配列の例としては、Riezman等、1997;Cell 91, 731-738、およびRajarao等、2002、FEMS Microbiology Letters;215:267-272に記載されおり、特にＰＦＳ−、ＹＱＲ−、ＰＦＲ−、ＰＭＦ−またはＤＣＭＤ−を含むモチーフが挙げられる。
【００３５】
本発明のこの態様の好ましい実施形態は、細菌膜を通過でき、またそのＤＮＡを標的にして切断することができる、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼの使用である。制限酵素は、原核生物界において最も有効で、高度に発展した自然発生的なキラーシステムである。酵素ヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ損傷活性の膨大な増幅と共通点があり、ごく僅かの酵素だけが細菌成長を阻止するために必要とされる。本発明のこの態様の好ましい実施形態において、これらキメラ分子を抗生物質活性のために使用してもよく、また有利には、非常に選択的な方法で細菌の増殖を阻止するために使用してもよい。細菌性デリバラーはヒト細胞のような他種の細胞型に侵入せず、逆に、ＴＡＴ配列のようなデリバラーは細菌細胞に侵入しないと考えられる。
【００３６】
抗生物質、抗腫瘍物質（例えば、細胞増殖抑制剤）および他のさらなる活性物質は、本発明による物質により特異的に輸送され、好ましくはそのようなさらなる活性物質に本発明のポリペプチドを共有結合させることにより、特異的に輸送されてもよい。
【００３７】
特に有利な実施形態において、デリバラーあるいは細胞膜および／または核膜もしくは細胞小器官膜を通過して運搬するための領域には、付加的な修飾成分または「補助」領域、好ましくはポリペプチドまたは化合物が含まれていてもよい。このドメインを、デリバラー配列と結合させるか、また本発明のキメラ分子の任意の部位に配置させることができる。この分子の付加は、当分野に周知の技術、例えば組換え技術または化学カップリングなどを用いて行うことができる。実施形態として、限定するものではないが、本発明のキメラ分子を細胞型特異的（cell type specific）にするため、細胞型特異的結合部位、例えば腫瘍特異的増殖受容体に対して結合する部位を有する補助ドメインを付加する。その例として、Ｈｅｒ２、ＴＧＦβ ＲＩまたはＣＤ２０受容体がある。これは、ＥＧＦの結合フラグメントおよび、ＴＧＦβまたはＦｖもしくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）免疫グロブリン断片を補助ドメインに付加することにより得ることができる。詳細な実施形態において、制限酵素はその天然二量体型で用いられるが、Ｎ末端の１番目のタンパク質には、機能性ＣＤＲＬ領域を含む特定の軽鎖免疫グロブリン断片が結合され、また、ホモ二量体の他のタンパク質のＮ末端には、機能的ＣＤＲ１−３Ｈ領域を含む種々の重鎖免疫グロブリンタンパク質が連結されている。キメラタンパク質は、軽鎖重鎖の二量化により、また、制限酵素のドメインの二量化により、二量体化することができる。それゆえ、これにより、特定の細胞型に特異的な選択的結合を実現でき、選択された細胞への本発明のキメラタンパク質の優先的な取り込み吸収を著しく増加させ得る。これは、かかる補助ドメインが複合的であることの証拠となる。付加配列、例えば、細胞内のミトコンドリアまたは寄生ＤＮＡ（例えば、ウイルス、無脊椎動物および細菌感染細胞）などの非染色体ＤＮＡを特異的に標的とする配列、を付加することができる。その他の実施形態として、デリバラーを増強する要素を付加することもできる。
【００３８】
特に好都合な実施形態において、キメラ分子は、ＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｆＩが、好ましくは２個またはそれ以上のグリシン、さらにより好ましくは配列ＧＳＧＧまたはＧＳＧＧＳＧＳＧＧを優先的に含むペプチドリンカーにより連結されたサブユニットを有するクラスＩＩ制限酵素からなる。この他に、当該分野で既知の同様のペプチドリンカーを、活性機能を維持させたままホモ二量体サブユニットを共有結合させる目的で使用してもよい。
【００３９】
キメラ分子には、例えばポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ−タグまたはプロテインＡ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、ビオチンのような当分野で周知の精製に有用なポリペプチド配列を任意に含ませることができる。
【００４０】
本発明のキメラ分子の特に好ましい実施形態としては、配列番号：２により表され、それは、一本鎖タンパク質（ＳＣＰＶＵ）として、連結された２つのサブユニットを有する制限酵素ＰｖｕＩＩがＤＮＡ結合アフィニティーおよびエンドヌクレアーゼ活性によるＤＮＡ修飾活性についてのドメインまたは領域を担い、さらにＴａｔのペプチドＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳが細胞質間デリバリーサブユニットを担っている。
【００４１】
本発明のキメラタンパク質の有利な実施形態の１つは、血清存在下での細胞培養培地中においても安定なことである。当分野において技術的に可能な範囲で、Ｌ型配置を有するアミノ酸をＤアミノ酸または非天然アミノ酸で置き換えることにより、その安定性を最終的に増大させることができる。かかるキメラタンパク質の変異体は、点突然変異の場合のように、好ましくは制限酵素と同じ酵素活性を示し、または分子中で同じヌクレオチド活性を失っている場合にはコントロールとして用いられ、こうしてこれらの変異体は本発明に含まれる。
【００４２】
本発明にさらに含まれるものとして、本発明のキメラ分子、およびその組換え体の性質の全部または一部である分子をコードする単離されたポリヌクレオチドがある。このポリヌクレオチド配列の好ましい実施形態は、配列番号：１によって表され、それには、化学的一本鎖型のＰｖｕＩＩ酵素がコードされており、またヌクレオチド配列番号：３によりコードされている配列番号：４に対応したタンパク質デリバリー領域がコードされている。この好ましい実施形態は、ニッケルＮＴＡアフィニティー・クロマトグラフィーによりキメラタンパク質を容易に精製できる、ポリヒスチジンタグがさらに含まれている。
【００４３】
さらに本発明には、キメラ分子がポリペプチドであって、例えばSambrookおよびManiatis, 1989, CSH edに記載されているような当業者に周知の方法による組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができるキメラ分子を含み、理解し得る全てをコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。これらの方法との一致において、また例えば他の制限酵素について、合成リンカーとして用いられるペプチドについて、あるいはアフィニティー精製に用いられるペプチドについて記載されるように、当該分野における技法は本発明の理解と本質的に異なるところのない理解を生み出すことができ、かくしてそれらの理解も本発明に含まれる。
【００４４】
さらに、本発明に含まれるものとして、本発明のキメラ分子について特に有利な実施形態であって、特にヌクレアーゼ活性を損なっているが、ＤＮＡに結合するキメラ分子、またＲＮＡに結合するキメラ分子が含まれる。この実施形態において、キメラ分子のＤＮＡまたはＲＮＡ結合活性は、細胞中で特定の核酸を標的とする分子として使用できる。これにより、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに積荷として化合物を運搬できるようになる。この場合、特定の化合物は、組換え技術または化学カップリングにより、このキメラ分子と共有的にまたは非共有的に結合されている。そのような化合物の例として、限定するものではないが、ナノ粒子、無機または有機化合物およびそれらの組み合わせであるか、例えば、限定するものではないが、放射性化合物、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、エトポシド、シスプラチンのような化学治療剤、および他の放射性模倣物、またＤＳＢ含有物質、抗体および抗体断片、蛍光分子のような色素化合物、天然または非天然核酸、酵素活性を有するかまたは有しないペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。化学カップリングは、例えばキメラ分子中の還元されたシステインとマレイミド活性化化合物をカップリングする当分野にて周知の方法を用いて達成できる。例えばＰｖｕＩＩのように、天然にシステインを含まない本発明のキメラ分子の場合には、システインを当分野に周知の組換えまたは合成技術により導入することができる。さらなる例として、遊離アミノ基へのブロモシアンカップリングを用いてもよい。特に好適なカップリング法には、選択された化合物を用いて、タンパク質をスプライシングし、そしてタンパク質を再結合することにより達成することができる。分子は、精製のためにタンパク質に融合された様々なタグ、例えばポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ‐タグまたはプロテインＡタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡ−タグ、ビオチンなどにカップリングすることもでき、さらに、例えば限定するものではないが、抗体、抗体断片またはグルタチオン含有化合物にカップリングすることもできる。このような方法で本発明タンパク質と結合された分子を、化学試薬およびＵＶを用いて随意に架橋結合させることができる。限定するものではないが、これらのカップリング方法については、例えば、特にキメラ分子中の標的部位はＮまたはＣ末端部位に存在する。一本鎖型の場合にも、２つのサブユニット間にリンカーを好適に用いることができる。
【００４５】
さらに、上記のポリヌクレオチド配列を含むベクター、特に、一般的に組換えタンパク質を大量に発現できる、原核生物における発現用ベクターが含まれる。
【００４６】
本発明の好ましいキメラ分子（ＤＮＡ修飾酵素はクラスＩＩ制限酵素である）を使用することで、既定の酵素に認識される部位、好都合には、配列ＣＡＧ／ＣＴＧ（ＰｖｕＩＩ）、ＧＡＴ／ＡＴＣ（ＥｃｏＲＶ）またはＧ／ＡＮＴＣ（ＨｉｎｆＩ）（これらは、およそ６０００ｂｐ（ＥｃｏＲＶまたはＰｖｕＩＩ）または４００−６００ｂｐ（ＨｉｎｆＩ）統計学的頻度でゲノム上にランダムに存在する）のパリンドローム部位で、ＤＮＡ二本鎖切断を誘発、導入または生成する工程からなる、本発明の主要な態様に応用することができる。
【００４７】
培地中の細胞を本発明のキメラタンパク質を用いて処理することで誘起された結果は、ＦＡＣＳ分析による細胞周期分布の分析によって、またはサザンブロット法、ＴＵＮＥＬ検定、ブロモデオキシウリジン標識（ＢｒｄＵ）による直接的なゲノムの分析によって検出され、また、特定の抗体または緑色蛍光タンパク質誘導体およびその色素誘導体を用いた免疫蛍光検査法、並びに通常用いられる方法の全てによって検出される。また、本発明のタンパク質を用いて処理された細胞のコロニー形成活性および増殖能を決定することは、増殖制御、細胞周期制御およびＤＮＡ修復の機能性についての指標となる。
【００４８】
例えばＴＵＮＥＬ検定により測定したところ、本発明のタンパク質の好ましい実施形態の活性反応速度は、０．００１ｎＭおよび１００μＭの間で直線的であり、より好ましくは、０．１ｎＭおよび１μＭの間、さらに好ましくは１ｎＭおよび５００ｎＭの間で直線的であった。この直線性は、単一特異的活性および任意の細胞に浸透する特性に加えて、本発明のキメラ分子、特にＳＣＰＶＵＴＡＴが有する利点の１つである。さらに、キメラ分子によって引き起こされるイベントにより、特定の選択物質を用いて選択する必要がないため、注目すべきは、また有利な点には、今後の使用を単純化できることがある。
【００４９】
本発明のキメラタンパク質、および特に好ましい本発明の理解の範囲内で処理した後に得られる効果は、制限するものではないが、以下の形式が想定される：
−細胞周期中の特定の時期、例えばＧ０−Ｇ１／Ｓ−Ｓ−Ｇ２−Ｇ２／Ｍ−Ｍまたはアポトーシスもしくは倍数体における、細胞の割合の増加。これらの変化の特性は細胞型に特異的であり、この特異性は、本発明の前記方法による将来における診断上の認識を提供し、また、１つまたはそれ以上のコントロール、例えば周知の遺伝的欠陥を含む細胞系または正常な細胞と比較して、未知のサンプル中で生じる変化および／または遺伝的突然変異もしくは後成的／身体的変化の検出を可能にする。例えば、Ｇ１／Ｓを決定する細胞周期の制御に特定の欠陥が細胞、例えばｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１遺伝子中の突然変異体を、本発明の前記タンパク質を用いて処理することにより、本発明の前記タンパク質で正常細胞を処理した際に見られる分布に対して、Ｇ２期の細胞数が増加する。ｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１細胞の場合、Ｇ１／Ｓで停止しなかったが、Ｇ２／Ｍ制御ポイント（チェックポイント）の機能をなおも部分的に示すため、ＤＮＡ量の分布をＦＡＣＳにより分析する実験において見られるように、正常対照細胞と比較して、Ｇ２／Ｍ期のピークに相対的な増加が見られる。同様の結果は、ＡＴＭおよびＮｂｓのようなＤＮＡ修復のチェックポイント制御に関与する遺伝産物の遺伝子についての突然変異体を用いた実験から得ることができる。
【００５０】
上記のように、該方法の重要なことには、コントロール細胞（正常またはコントロール細胞）と比べて細胞の分布を比較することまたは挙動を比較することがある。
【００５１】
−細胞周期の調節および修復に関与する重要なタンパク質の定常状態レベルでの変化。タンパク質の定常状態レベルでの変化として、タンパク質量の変動を測定するが、それは、例えば発現レベルの変動、またはｍＲＮＡ安定性の変化、あるいはタンパク質修飾の変化、例えばタンパク質分解、リン酸化、ユビキチン化もしくはその他の翻訳後修正の変化に起因する。
【００５２】
−ＡＴＭ／ＡＴＲ／ＤＮＡ‐ＰＫｃｓ制御経路の中心にあるタンパク質のリン酸化レベルについては、前記の本発明タンパク質で処理した後に変化が現れる。リン酸化において変化を示すタンパク質は、後の実施例部分に詳細に記載するが、本明細書中に例示として示すがこれに制限されない。該タンパク質としては：ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調突然変異プロテイン）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症関連タンパク質）、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット）、およびそれらの直接または間接的基質、例えばＣｈｋ１（チェックポイントキナーゼ１）、Ｃｈｋ２（チェックポイントキナーゼ２）、Ｂｒｃａ−１（乳癌罹患性１）、Ｂｒｃａ２（乳癌罹患性２）、Ｍｒｅ１１（基質組換えプロテイン１１）、Ｒａｄ５０（放射性５０二本鎖切断修復プロテイン）、Ｎｂｓ（ナイメーヘン染色体不安定症候群）、Ｒａｄ５１（放射性５１二本鎖切断修復プロテイン）、ＦＡＮＣ−Ａ、Ｃ、Ｄ２、Ｅ、ＦおよびＧ（ファンコーニ貧血相補性プロテイン）、ヒストン、ヘリカーゼ、ＢＬＭ（ブルームズ症候群突然変異）、ＷＲＮ（ウェルナー症候群突然変異）、ｐ５３などが挙げられる。特に好ましくは、分子および生化学的マーカーは、Ｎｂｓ、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５１、ｐ５３、Ｃｈｋ２、Ｂｒｃａ１である。
【００５３】
特に詳細な実施形態として、ｐ５３において派生した変異体(variations)およびｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１、１４−３−３シグマなど、ｐ５３の直接または間接転写標的がある。本発明のタンパク質で処理した後の、上記タンパク質レベルの変化、または該タンパク質の活性および／またはリン酸化の状態変化の分析は、本発明の重要な態様であり、特に診断学的に興味深い。測定には、当分野で周知の方法、例えば、ｐ５３リン酸化型の増加の場合には、抗ｐ５３−Ｓ１５Ｐを用いて検出するように、タンパク質のリン酸化型に特異的な抗体を用いる免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロット法）を適用できる。後述の実施例部分において詳細に実証するが、本発明タンパク質を用いて種々の細胞株を処理することで、ｐ５３タンパク質および／またはリン酸化レベルに増加が見られた。
【００５４】
−細胞周期制御またはＤＮＡ修復におけるストレス応答に重要な制御に関する重要なタンパク質である、複合体の細胞分布の変化。これらの変化は、Ｒａｄ／Ｍｒｅ１１／Ｎｂｓ複合体が局在している（Zhong Q.等、1999、Science 285:747-750）核に焦点を当て、細胞応答、Ｃｈｋ２のＴｈｒ６８のリン酸化、ＡＴＭのリン酸化、ヒストン２ＡＸ−Ｓｅｒ１３５のリン酸化を、免疫学的に分析して観察することができる。
【００５５】
−選択的に、本発明タンパク質を用いた処理に対して、突然変異体と正常細胞の変化を比較することにより、Ｃｄｃ２／サイクリンＢ１、Ｃｄｃ２５Ｃ、ｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ１および１４−３−３シグマ複合体の細胞質／核分布における変化を追跡することができる。これは、例えば実験実施例１２に記載のように、上記成分の１つを特異的に蛍光標識して、顕微鏡で分析することにより実施できる。
【００５６】
−当分野において周知の方法、例えばＦＡＣＳ分析、シトクロームＣ放出またはカスパーゼ活性、もしくはアネキシンＶ特異的抗体を用いた標識化によって測定できるアポトーシス。アポトーシスの増加は、例えば、神経芽腫細胞を本発明のタンパク質を用いて処理した後に、その細胞におけるｓｕｂＧ１ ＤＮＡ量の増加として、ＦＡＣＳ分析により検出できる。
【００５７】
−本発明タンパク質の処理により誘起された効果は、当分野で周知の着色反応を用いて、コロニー形成活性または増殖能を測定することによって分析できる。選択的に、本タンパク質の長期効果は、例えば動物モデル系において腫瘍形成活性または腫瘍侵襲性により決定することができる。
【００５８】
本発明タンパク質による遺伝的損傷を調節することができる組成物を選択するのに、姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）、倍数性分析法、遺伝的増幅法、ヘテロ接合度の損失および他の当分野に周知の検査法により分析することができる。
【００５９】
最終的に、本発明は、未知のサンプル（例えば生検）から得られた細胞を、必須工程として本発明タンパク質を用いて処理し、好ましくはコントロール細胞を並行して処理し、いずれかの腫瘍遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒａｓもしくは癌抑制遺伝子（例えばＡＲＦ、ｐ１６、ｐ５３、Ｂｒｃａ１）の発現レベルまたは活性レベルを、免疫酵素法を含む、特定の検定用試薬による継続した測定をして分析することによる、腫瘍または遺伝毒性感受性（例えば、放射線または挿入剤に対する感受性）の進行に関する遺伝的疾病素質の測定法に応用される。
【００６０】
細胞周期制御システム（チェックポイント）における成分の突然変異が、腫瘍罹病性を増大させるのに対し、ＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する因子をコードする遺伝子における遺伝的欠陥の浸透度は低いが、これらの欠陥と、他の危険因子、例えば活性酸素種（ＲＯＳ）レベルの増加、慢性的な炎症由来の因子との組み合わせによって、腫瘍における発病率が大きく左右される。
【００６１】
総合して、本発明は、その全てがインビボで細胞に、エクスビボ(ex vivo)またはインビトロ（in vitro）において、本発明ポリペプチドを使用する事実により特徴付けられる、種々の方法に関する。特に、本発明に関する方法には、細胞周期制御およびＤＮＡ修復に共通して関係する遺伝的損傷を評価する診断方法、および、上記制御活性を調節できる生物学的活性を有する化合物の選択方法が含まれる。本発明の多様な態様の幾つかは、上述の特異性を持ったＤＮＡ二本鎖切断の導入による、細胞周期およびＤＮＡ修復（チェックポイント）の制御経路を活性化する、本発明のキメラポリペプチドの生物学的活性に基づいている。
【００６２】
実施例部分により詳しく見られおよび記載されるように、単一特異的ＤＮＡ二本鎖切断の導入の結果、本発明のポリペプチドは治療的活性、特に抗増殖性および抗腫瘍性を示す。それゆえ、この活性は本発明のさらなる対象である。このように、本発明には、本明細書中に記載のポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを活性物質として含有する、医薬組成物が含まれる。さらに、本発明には、腫瘍性疾病またはその疾病に対する疾病素質の予防、治療または診断のための医薬を調製するための、本発明キメラポリペプチドおよび／またはこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が包含される。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態には、実施例部分に詳細に記載するように、腫瘍病理学の診断またはその疾病の疾病素質の診断のため、本発明由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの診断上の使用が挙げられる。
【００６４】
より好ましい実施形態としては、本発明タンパク質を用いた細胞の処理を、例えば診断上の使用として、また上述のように用いて、試験サンプルおよび想定される突然変異を含んでない細胞系（コントロール）に並行して適用する。この検定のさらに好ましい実施形態としては、さらにコントロール処置を加えた検定であり、それは、例えば本発明のキメラタンパク質を用いた実験において、ＤＮＡ修復経路の選択された過程に突然変異体を含む試験細胞系を使用するものであり、その比較によって、それぞれの遺伝子変化を精細マッピングすることができる。
【００６５】
本発明タンパク質の投与後、長時間、例えば２４時間経過後に、細胞が本発明タンパク質により導入された遺伝的損傷（ＤＮＡ二本鎖切断、ＤＳＢ）を修復できるかどうか、および、細胞周期のさまざまな時期にある細胞集団の分布が正常に戻るか戻らないか、に依存した種々の変化を検出することができる。ＡＴＭをコードする遺伝子に、または例えばＮＨＥＪ（非相同末端結合）ＤＮＡ修復経路に関与する産物をコードする別の遺伝子に突然変異を有する細胞において、アポトーシスは直ぐには観察できないが、低い発生率で間接的な影響を示す。逆に、神経芽腫細胞の場合には、アポトーシスは迅速且つ直接的な様式で誘導される。本発明は包括的に、さらなる実施形態において、神経起源（origin）細胞、より好ましくは神経芽腫においてアポトーシス誘導するための、さらに、神経起源の腫瘍を処置するための医薬を調製するための、キメラタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を包含する。
【００６６】
神経芽腫におけるアポトーシスの導入は、二重微小（ＤＭ）ｍｙｃ-Ｎ癌遺伝子増幅と組み合わさった１ｐ３６欠失と相関がある。この強い感受性は１７ｐ１５転移の存在とは相関がない。ＤＭ ｍｙｃ-Ｎ増幅は、ｍｙｃ−Ｎ増幅ＮＢの極めて強い侵攻型として知られるエピソーム ｍｙｃ-Ｎ クラスターであり、極めて予後が悪い。侵攻性悪性ＮＢの重要な部分は、このタイプの癌遺伝子増幅を示すことである。その他の特定の実施形態において、発癌性のＤＭ増幅を含む他の腫瘍、例えば限定するものではないが、前立腺または乳房腫瘍の処置も含まれる。一般に、前記化合物とカップリングされたキメラ分子を、特定の腫瘍を処置する医薬を調製するために使用することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質を用いた処理に対する細胞応答は、ＤＮＡ修復経路中に突然変異を有する細胞であるか、または細胞周期および／または修復（チェックポイント）に関する経路の制御に関係する成分に変化を有する細胞であるかによって異なっている。このように、本発明には一連の方法が含まれ、その方法はすべて、本発明に係る好ましい実施形態のキメラ分子を適用して、試験細胞のゲノムにＤＳＢを導入するために使用すること、および上記の検定によりその応答を分析すること、好ましくは可能な限り同質遺伝子型の性質を有する標準的な細胞を用いた試験サンプルから得られた結果と比較すること、により実質的に特徴付けられる。
【００６８】
細胞周期およびＤＮＡ修復機構における本発明のタンパク質の効果は、フリー・ラジカル（ＲＯＳ）の誘導物質の存在下で相乗効果を及ぼし、そのような誘導物質は例えばＨ２Ｏ２であり得る。この相乗効果は、キメラタンパク質濃度が非常に低い場合、好ましくはＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質が１０ｎＭ以下で、Ｈ２Ｏ２が１０μＭ以下でも観察される。従って、本発明には、本発明タンパク質を活性酸素産物（ＲＯＳ）、例えばＨ２Ｏ２と組み合わせて使用する事実により特徴付けられる、ゲノムにＤＳＢを導入する方法が含まれる。この方法は、拮抗作用または相乗作用化合物を選択するためにも使用される。
【００６９】
インビボで細胞にＤＳＢを導入することにより、抗腫瘍療法に頻繁に用いられる電離放射線によって誘導される細胞応答および分子応答と同様にそれらの応答を活性化するが、電離放射線と比較して副作用は小さい。従って、本発明のさらなる実施形態には、
抗腫瘍活性を有する医薬の調製のための、または、
後の細胞の増殖活性の開放に起因する疾病を発症する個体の疾病素質を規定する遺伝的疾病、および特にＤＮＡ修復の制御機構に必須の遺伝子産物を含む腫瘍性疾病、を治療、診断または予防するための、
本発明のキメラポリペプチドの使用が含まれる。
【００７０】
この態様に基づき、本発明は、本発明の上記キメラポリペプチド（ここでは、増殖抑制効果、好ましくは抗腫瘍性が要求される）をインビボまたエクスビボ投与することに基本的に基づく治療法を包含する。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態には、生物学的サンプルから得られた単離された細胞のＤＮＡ修復における遺伝的または身体的欠陥、または細胞周期の調節の欠陥についてのインビトロ診断する方法であって、基本的に以下の工程：
ａ）ＤＮＡ修復経路または細胞周期経路における影響または損傷を測定するための培地での単離された細胞の生育；
ｂ）本発明の好ましい分子、ここで、修飾酵素がクラスＩＩエンドヌクレアーゼであり、より好ましくはＰｖｕＩＩ酵素の一本鎖型（ＳＣＰＶＵ）である分子を用いた細胞のインキュベート。好適には、例えばＳＣ３４のような、特異的ＤＮＡ結合活性を示すが、ヌクレアーゼ活性が損なわれているコントロール・ポリペプチドを用いて、細胞を並行して処理する。所望により、ＤＮＡ修復に、ＤＮＡ修復および／または細胞周期の制御に突然変異および/または欠損がある好適な細胞系、ここで、好ましくはほご同質遺伝子型の性質を有している細胞系の並行処理；
ｃ）細胞応答の特徴づけおよび測定；
ｄ）コントロール細胞系と任意に比較、
から構成される方法が含まれる。
【００７２】
同質遺伝子型とは、２つまたはそれ以上の細胞系が、可能な限り類似の遺伝的背景を示すことを意味し、例えば、以下の実施例部分において記載および使用するように、細胞系：ＭＲＣ−５およびＡＴ−５；ＣＨＯ−Ｋ１およびＫＵ７０、またはＭＯ５９ＫおよびＭＯ５９Ｊがある。標準−コントロール細胞系とは、細胞周期およびＤＮＡ修復の制御経路に変化を有しない正常細胞系であってもよく、試験サンプルに可能な限り同質遺伝子型であるか、または遺伝的変化が詳しく特徴付けられた細胞系であってもよい。
【００７３】
本発明方法の好ましい実施形態において、試験細胞およびコントロール細胞を同一条件下で共に生育させる。これにより、細胞は保持され、直接的な形式で培養マーカーの相違を比較できる。そのマーカーの例としては：コロニー形成活性、アポトーシスまたは無活動細胞の百分率（％）があり、これらは、例えば生きた細胞着色を用いた増殖能の決定により、または上記生化学マーカーの測定により測定される。このタイプの検定の例は、Torrance C. J.等、2001、Nature Biotechnology、19、940-945に記載されている。
【００７４】
ｃ）に記載の細胞応答の特徴づけの好ましい実施形態については、当分野において周知のコロニー形成活性の測定法、例えば、培地中で細胞を生育させる、または軟寒天中で生育させてコロニー形成活性を測定する、あるいはＤＮＡ染色後にＦＡＣＳ分析する、方法を用いることができる。
【００７５】
本発明に記載の特に有用な実施形態であって、腫瘍性疾患の発症に関する遺伝的疾病素質、腫瘍治療の感受性、特に放射性または化学療法の抗腫瘍治療に対する患者の耐性、または予後判断のため健常組織と比較した腫瘍組織の感受性を評価するための診断および／または予後診断が、特に有効な実施形態である。
【００７６】
加えて、本発明には、本発明の方法を実施するためのキットが含まれるため、好ましい診断キットまたは調査用キットも含まれる。
【００７７】
かかるキットの好ましい実施形態には：
１）キメラポリペプチド、好ましくは、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩまたはＨｉｎｆＩの中から選択され、Ｔａｔ輸送ペプチドと融合した状態の一本鎖型キメラエンドヌクレアーゼ、または、該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含有するチューブ、併用される、特異的ＤＮＡ結合性タンパク質であるがエンドヌクレアーゼ活性が損なわれているコントロール・ポリペプチドである、キメラタンパク質、または、該キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含有するチューブ。好ましい実施形態においては、キメラタンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴを含むチューブ、および、キメラタンパク質ＳＣ３４を凍結乾燥状態または水溶液で含むことが有利な別のチューブで構成されるキット
２）キメラタンパク質の全部または一部に対する抗体、好ましくは抗ＳＣＰＶＵＴＡＴ抗体を含有するチューブを任意に含むキット
３）前記のコントロール細胞、例えばＤＳＢに対して過敏な細胞、または、ＤＮＡ修復および細胞周期経路およびその制御（チェックポイント）に関与するタンパク質をコードする遺伝子に詳しく特徴付けられた突然変異体を含む細胞を含有するチューブまたはフラスコを任意の含むキット。かかる細胞を、運搬に適するように凍結保存またはフラスコ中に含ませてよい
４）挿入剤のような化学療法試薬、放射線類似作用化学物質、または質的および量的効果を決定し、そして比較するための医薬を含有するその他のタイプの化学物質を任意の含むキット
が含まれる。
【００７８】
好ましいキメラポリペプチドの活性に基づくさらに重要な実施形態として、本発明には、細胞に基づくハイスループットスクリーニングを用いた、ゲノムのＤＮＡ修復活性および／または制御を調節し、相乗作用を示し、拮抗作用を示し、あるいはそれらを変化させない、並びに、細胞システムの遺伝的安定性のための組成物を選択する方法が含まれ、基本的に以下の工程が含まれる：
ａ）優先的に本発明のキメラタンパク質を用いた、適当なコントロール・ポリペプチド（特に、特定のＤＮＡ結合活性を有するが、キメラポリペプチドＳＣ３４のようにエンドヌクレアーゼ活性を損なっているキメラ分子が含まれる）の存在下での、また、所望により例えばＨ２Ｏ２または他のラジカル生成物質(producers)および／または他の調節物質もしくは拮抗作用物質の存在下での、試験細胞のインキュベート；
ｂ）所望により、並行して、試験細胞と可能な限り同質遺伝子型の別のコントロール細胞、例えばレポーター遺伝子を含む同一細胞を用いてインキュベートする。様々なレポーター遺伝子が当分野で周知であり、その中でも例えば、ＥＧＦＰタンパク質およびその変異体（例えば、Torrance等、2001、Nature Biotetechnology、19、940-945に記載されている）、または検定の自動読み取りに有効である別のタイプのレポーター遺伝子がある；
ｃ）潜在的な活性を有するか、または活性を有しないかを試験し得る組成物の付加。それらには、例えば、単分子または化学ライブラリーまたは化合物、ペプチド若しくはその他のコレクション、または生物学的サンプルのコレクションがある；
ｄ）細胞応答の読み取りは、優先して自動的に行われ、好ましくはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）装置を用いて行われる。この例として、コントロール物質および細胞中で生物学的活性を示すポジティブ試験物質に対する応答として誘導される蛍光シグナルなどの、形態学的表現型の変化の測定に基づくシステムが挙げられる。この細胞応答は、細胞シグナルまたは誘導された生化学的マーカー由来のシグナルから成り、細胞パラメーター、例えばカルシウム流動、ラジカルフロー、シトクロームＣの変化なども検出されるが、それらを組み合わせると自動検出可能なシステムとなる。
【００７９】
本発明のこの方法では、工程ｂ）およびｃ）の順番は逆でもよい。
この検定により、細胞周期の制御、ＤＮＡ修復経路、アポトーシスの誘導、老化の誘導または、別の経路の活性化を順番に起こさせる経路の１つを阻害すること、について重要な生物学的活性を含む、組成物の選択が可能となる。
【００８０】
スクリーニングの最初のラウンドから単離した化合物を有利に修飾した後に、さらに選択サイクルを行うことで、最終的には、医薬により適した組成物を得ることができ、また、さらに有利な特徴、例えば生物学的適合性または生成物安定性について選択することができる。
【００８１】
さらに上記から導かれる態様に加えて、本発明には、優先的にはクラスＩＩ制限ヌクレアーゼ、さらにより好ましくは一本鎖型であるか、もしくはさらにより好ましくは酵素ＳＣＰＶＵＴＡＴにより表される本発明キメラ分子、並びに、これらの分子をコードするポリヌクレオチドの使用に基づいた、細胞周期阻害を導入する方法、または選択的に好ましくは神経起源の細胞にアポトーシスを誘導する方法、または選択的に単離した細胞にＤＮＡ修復を誘起する方法が含まれ、ここで、これらの導かれる効果は、例えばフリー・ラジカル生成物などの組成物の存在下で相乗作用が与らえる。これらの方法は基本的に、本発明のキメラポリペプチドよってＤＮＡ二本鎖切断が導入される原理に基づいている。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態には、新規の貫通配列（penetration sequence）および補助配列を選択する方法が含まれる。この実施形態において、貫通配列または補助配列は、単独化合物から構成されるものではなく、化合物ライブラリー分子が想定される貫通ドメインまたは補助ドメインを選択するために使用される。これらの工程には、多数の異なるサンプルを分析できるハイスループットスクリーニングの使用が非常に適している。診断についての本発明に記載の原理は、基本的にすべての細胞型または生物に対する新規な貫通配列および補助配列を見つけだすことのできるスクリーニング方法にも基づいている。自動またはロボット利用の装置により、ハイスループットの能力を用いて後述の工程を実行することができる。これは、当分野に周知のピペッティングおよび読み出し装置を用いて実行できる。限定するものではないが、例示として、特定の補助配列または貫通配列のスクリーニングは、基本的に以下の工程からなる：
１．特定の補助配列の場合、貫通配列は一定であり、本発明のキメラタンパク質のライブラリーは当分野の方法で構成される。例えば、本発明のキメラタンパク質のＮ末端には、様々な軽鎖および機能的ＣＤＲＬフラグメントが融合されており、ついで機能的ＣＤＲ１−３Ｈ領域を含む種々の重鎖免疫グロブリンタンパク質に融合された本発明の同じタンパク質と混合される。これは、選択的に大腸菌での２つのプラスミド発現システムにおける組換え技術により得られる。一般に、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンのフラグメントのライブラリー、または受容体結合タンパク質、あるいは合成または天然源から生成されたランダムライブラリーは、上記の組換え技術またはその他のカップリング法により本発明のタンパク質に結合することができる。例えば、例示すると、抗体断片ライブラリーを、プロテインＡに結合させることによって、本発明のタンパク質に連結することができる。
２．貫通配列の場合、スクリーニングライブラリーは当分野に周知の技術により得ることができる。例えば、かかるライブラリーは天然源またはすべてのクラスの化合物を含む合成源から入手できる。特に有利な実施形態として、細菌の貫通配列は、同種または異種からのランダムＤＮＡフラグメントからスクリーニングされる。
３．ライブラリータンパク質発現大腸菌を増殖させ、タンパク質産生のために誘導する。タンパク質は、分泌システム由来して上清から、さらに細胞溶解液から、例えば様々なアフィニティータグ、具体的には、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ−タグ、プロテインＡタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡ−タグまたはビオチンを用いた、キメラタンパク質のハイスループットアフィニティー調製によって、単離される。
４．これらのタンパク質を用いて、ライブラリー由来の所定の分子の機能または異なる機能を分析する。配列が機能的である場合、キメラタンパク質は機能的である。これは、それらが細胞膜さらに最終的には核膜を通過し、ＤＮＡに結合し、場合によってはＤＳＢを導入することができる。もしくは、補助スクリーニングの場合、機能は規定の細胞中で検出され得る。検出は上記のように実施し得る。
５．試験細胞または組織は、
本発明のキメラタンパク質の機能は、例えば上述の形式で検出することができる、原生生物細胞を含むあらゆる起源由来のものであってよい。
６．特に有用な実施形態において、試験細胞を、容易な読み出しのためにＥＧＦＰ（増強した緑色蛍光タンパク質）を用いて安定的にトランスフェクトする；
７．もう１つ別の有用な実施形態において、コントロール細胞を、区別をつけて、例えばＥＹＦＰ（増強した黄色蛍光タンパク質）を用いて安定的にトランスフェクトする；
８．試験およびコントロール細胞を、個別に生育するか、またはマルチ−ウェル装置または特定の膜上で混合する。細胞は、単一の変化を有して酷似しているか（すなわち、同一の起源由来である腫瘍細胞または非腫瘍細胞のように、補助配列を検出するために用いる）、または非常に多様化していてもよい（例えば、試験細胞では、輸送が生じるが、コントロール細胞では輸送されない；これには、異なる種由来の細胞、例えば試験細胞が細菌細胞であって、コントロール細胞がヒト由来の場合も含まれる）。細胞の選択には、すべての技術的に可能な組み合わせが可能である。
９．タンパク質を細胞の上清に加え、インキュベートする。
１０．読み出しは、上記実施形態に記載のようにキメラ分子の機能について行われる。特に有利な実施形態において、上記調製の緑色および黄色細胞について検出される。緑細胞よりも有意に黄色細胞を生産するタンパク質は、当分野に周知のバック・スクリーニングおよび組換えもしくは質量分析法を用いた分析により、単一クローンとしてさらに単離される。好ましい適用例においては、キメラ分子が細胞に侵入後にＤＮＡ損傷を導入することで、この検定の感受性を非常に高め得る。試験細胞（例えば、腫瘍細胞）およびコントロール細胞（すなわち、比較可能な非腫瘍細胞）を、遺伝子破壊または遺伝子抑制、あるいはドミナントネガティブまたは優勢の機能獲得性突然変異の導入によって、ＤＳＢ導入に対して高い感受性を与える。これは、当分野で周知の方法、例えば、ｓｉＲＮＡを用いた同時形質変換、ＤＮＡ修復における重要な機能を阻害し、ＤＳＢ、化学阻害剤または活性剤に対して高い感受性を示すようになる、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、遺伝子破壊または突然変異のための標的ベクター、突然変異体の発現もしくはタンパク質を過剰発現させるためのベクターによって行われる。これにより、低濃度でより迅速に詳しく識別された読み出しが可能になる。たとえば、ｓｉＲＮＡ阻害剤であるＫｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡＰＫｃｓ、ＡＴＭ、ＸＲＣＣ４およびリガーゼＩＶ、Ｂｃ１２である。一方で、カフェインなどの化合物によってＡＴＭも阻害される。Ｐ５３または他のアポトーシス調節因子が導入される。
１１．スクリーニングから得た配列をさらなる最終確認のために、もう一度、選択的に、自動工程を用いる：
・クローンを精製タンパク質により確認する。
・濃度を滴定する。
・ヌクレアーゼ欠失型で選択された配列をテストする。
・別の細胞を試験する。
・マウスにおける毒性を試験する。
【００８３】
本発明は、以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、これに制限されない。
図１ 大腸菌からのＳＣＰＶＵＴＡＴ精製
ＳＣＰＶＵＴＡＴの発現および精製。
ＳＣＰＶＵＴＡＴの発現プラスミドを含む大腸菌細胞を誘導してタンパク質を発現させ、実施例に記載のように精製を行った。ＮＩおよびＩは、大腸菌由来の全細胞性抽出液を示しており、誘導しておらず、また個別の誘導産物を示すものではない。Ｈ１およびＨ２は、Ｈｉトラップ・キレートＮｉ＋＋アガロースカラム上で精製して得られたピーク画分である；Ｓ１およびＳ２はＳＰ-セファロースカラム上で精製して得られたピーク画分である；Ｍは分子量マーカーを表す（上から下へ：９４、６７、４３、３３、２０、１４ｋＤａである）；ＳＣＰＶＵは、ＴＡＴ配列を含んでいない、同様の方法で精製したタンパク質を表す。
【００８４】
図２ タンパク質形質導入後にＵ２ＯＳ細胞から抽出したタンパク質の免疫学的分析
分析したタンパク質は：濃度調整したＳＣＰＶＵＴＡＴ（１、１９、５０、１００、２００ｎＭ; レーン２-６）、ＳＣＰＶＵ(２００ｎＭ、ＴＡＴ配列を含まない、レーン７)、ＳＣ３４(２００ｎＭ、酵素活性を示さないＳＣＰＶＵＴＡＴ誘導体、レーン８)、コントロール(細胞へのタンパク質添加を行っていない、レーン１)であった。細胞培養上清にタンパク質を添加した１０分後に、ＰＢＳで丁寧に洗浄して抽出物を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて分離した後にＰｖｕＩＩに対する単一特異的抗体を用いて免疫ブロット法により分析した（下のパネル、導入）。比較のために、抽出物調製の前に取得した細胞培養液上清の一部をこの分析に含ませた（上のパネル、上清)。
【００８５】
図３ 共焦点顕微鏡による免疫蛍光分析
ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いてタンパク質形質導入した３０分後に、細胞を洗浄し、３％ＰＦＡを用いて固定化し、ＰｖｕＩＩ単一特異的抗体によりマークした後、ＦＩＴＣ結合２次抗体を用いて共焦点免疫蛍光分析のために染色した（緑色、下のパネル）。さらに、ＲＮＡａｓｅ Ａ消化した後にプロピジウムＪ-を用いてＤＮＡ共染色を得た（赤色、上のパネル）。
【００８６】
図４ 単一細胞レベルでＤＳＢを検出するためのＴＵＮＥＬ分析
Ｕ２ＯＳ細胞をＳＣＰＶＵＴＡＴで処理し、ｄＵＴＰ-ＦＩＴＣの存在下でＴｄＴを用いて標識化した後に、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いてＤＳＢ分析を行った（ＴＵＮＥＬ）。処理は、表示した時間、１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて行った。
【００８７】
図５ ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるヌクレアーゼ依存的細胞周期の遅延
本タンパク質を形質導入した細胞の細胞周期について、種々の時期の分布をＦＡＣＳ分析により分析した。細胞集団のＤＮＡ量分布を検出した。２ｎは２倍体のＤＮＡ当量を示し（複製されたものではない；Ｇ１期）、４ｎは４倍体のＤＮＡ当量を示す（複製されている；Ｇ２／Ｍ期）。ＦＡＣＳ分析については、単一細胞あたりのＤＮＡ量を評価できるＤＤＭモードを用いて、細胞を分離した。表示の調整量のＳＣＰＶＵＴＡＴ（１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）を一度だけ添加して存在させたＵ２ＯＳ細胞；未処理の細胞（コントロール）；ＳＣＰＶＵＴＡＴのヌクレアーゼ欠損誘導体（ＳＣ３４、１００ｎＭ）で処理した細胞を、２４時間（上の行）または４８時間（下の行）生育させた。示したヒストグラムはすべて、右上のパネルにだけ示すように細胞数に対する相対的なＤＮＡ量の尺度を表す。
【００８８】
図６ ＳＣＰＶＵＴＡＴにより誘導されるキナーゼ活性
基質としてのヒストンＨ１と、未処理またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ）もしくはノコダゾール（０．２μｇ／ｍｌ）で３０時間処理した生育Ｕ２ＯＳ細胞から得られたタンパク質抽出液由来のサイクリンＢ１特異的免疫沈降物とを用いて、サイクリンＢ１キナーゼ活性を決定する。サイクリンＢ１特異的免疫沈降物を、γ３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でヒストンＨ１と共にインキュベートし、その反抗混合物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。下にある数字は、リン酸−撮像装置（phospho-imager）分析により決定した比活性を示す。
【００８９】
図７ ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期停止に対する生化学的マーカー
Ａ)平滑末端ＤＳＢを含む３’−ＯＨおよび５’−リン酸（phospate）によるｐ５３の誘導。Ｕ２ＯＳ細胞（レーン１−７）およびＨＣＴ１１６（レーン８−１４）を、ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ、ＳＣ）またはアドリアマイシン（ドキソルビシン、０．０２μｇ／ｍｌ、ＡＤ）を用いて表示の時間処理し；コントロールとして未処理の細胞（レーン０）を用いた。抽出物を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離した後、ｐ５３（上のパネル、ｐ５３）またはＰＡＲＰ（下のパネル、ＰＡＲＰ）に特異的な抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。
Ｂ)ＳＣＰＶＵＴＡＴに対する毛細血管拡張性運動失調症突然変異（ＡＴＭ）タンパク質の修復応答。ｐ５３のＳＣＰＶＵＴＡＴ依存的Ｓｅｒ１５のリン酸化。ＡＴＭポジティブ細胞系 ＭＲＣ５を、ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ、ＳＣ）またはヒドロキシウレア（１ｍＭ、ＨＵ）を用いて表示の時間処理した；未処理の細胞をコントロールとして用いた（０）。抽出液を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離した後、ｐ５３ Ｓｅｒ１５（上のパネル、Ｓｅｒ１５、ｐ５３）、またはアクチン（下のパネル、アクチン）に対する特異的抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。
Ｃ)ＳＣＰＶＵＴＡＴに対する毛細血管拡張性運動失調症突然変異（ＡＴＭ）タンパク質の修復応答。
ｐ５３のＳＣＰＶＵＴＡＴ依存的Ｓｅｒ１５のリン酸化におけるカフェイン感受性。ＡＴＭネガティブのＡＴ-５細胞を、カフェイン（２ｍＭ）の存在下で、ＳＣＰＶＵＴＡＴ(１００ｎＭ、ＳＣ)またはヒドロキシウレア（１ｍＭ、ＨＵ）を用いて４時間処理した；コントロールとして、未処理の細胞とカフェイン処理のみ行った細胞を用いた。抽出液を調製し、ＳＥＳ-ＰＡＧＥにより分離した後、ｐ５３、ｐ５３ Ｓｅｒ１５（上のパネル、Ｓｅｒ１５、ｐ５３）またはアクチン（下のパネル、アクチン）のいずれかに対する特異的抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。
【００９０】
図８ ＡＴＭ突然変異細胞（ＡＴ-５）のＳＣＰＶＵＴＡＴによる細胞周期阻害誘導およびコロニー形成活性を、非突然変異細胞（ＭＲＣ-５）と比較する
Ａ)ＳＣＰＶＵＴＡＴ（２５ｎＭ、１００ｎＭ）、またはアドリアマイシン(０．０２μｇ／ｍｌ; アドリアマイシン)、またはＳＣ３４（１００ｎＭ）を用いて処理し、３６時間後にＡＴ-５細胞およびコントロールとして未処理細胞をＦＡＣＳ分析して細胞周期中のＤＮＡ量分布を決定した。ヒストグラムは細胞数に対する相対的なＤＮＡ量を表し、右側のパネルは、ＭＯＤＦＩＴＴＭ プログラム・パッケージを用いて計算した種々の細胞周期の時期に対応する分布の百分率を示す。
Ｂ)ＡＴＭ突然変異細胞系であって、ＳＣＰＶＵＴＡＴによりＤＮＡ損傷を導入された細胞系によるコロニー形成能検定。ＡＴ-５またはＭＲＣ-５（ＡＴＭポジティブコントロールとして提供する）の種々の希釈液を、未処理（白色棒）またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（２５ｎＭ、灰色棒；１００ｎＭ、黒色棒）を用いて６０分間処理した；これらの細胞を洗浄した後、７−１０日間生育させ、ギムザ（ＧＩＥＭＳＡ）染色してコロニー数を計測した。この結果をヒストグラムにまとめ、独立して行った３回の実験の平均値と１０％〜１５％の範囲の標準偏差を表示する。未処理の細胞を１００％に設定したところ、ＡＴ-５細胞を表示する黒色棒はほぼ０％となり表示できなかった。
【００９１】
図９ ＮＨＥＪ経路に関与する単一タンパク質における、選択された突然変異体を有する細胞のコロニー形成活性の比較
ＮＨＥＪ修復経路に関与するタンパク質に変異を導入したＣＨＯ細胞を、ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理してコロニー形成能を検定する。細胞系としては、ＡＡ８(親株)、Ｖ３（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ（−/−）)、ｘｒｓｓ５(ＫＵ８０(-/-))およびＸＲ-１(ＸＲＣＣ４(-/-))、ＨＩＳ Ｐ１．１３-１１(ＫＵ７０(-/-))、ならびに対応する親細胞系 ＣＨＯ-Ｋ１を用いた。表示のＮＨＥＪ突然変異を有するＣＨＯ細胞を種々希釈して、未処理（白色棒）またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（２５ｎＭ、灰色棒；１００ｎＭ、黒色棒）を用いて２４時間処理した；これらの細胞を洗浄した後、７-１０日間生育させ、ギムザ染色してコロニー数を計測した。この結果をヒストグラムにまとめ、独立して行った３回の実験の平均値と１０％〜１５％の範囲の標準偏差を表示する。未処理の細胞を100％に設定したところ、Ｖ３（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ（−/−））を表示する黒色棒は1％未満となり表示できなかった。
【００９２】
図１０ ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の神経芽腫細胞における種々のアポトーシス誘導
ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理（１０ｎＭ、パネルＣ；１００ｎＭ、パネルＢ）後に、神経芽腫細胞ＧＩ-ＬＩＮをプロピジウムＪ-染色してＤＮＡ量をＦＡＣＳ分析した。これらサンプルは３０時間処理した。コントロールとして、未処理（パネルＡ）またはＳＣ３４の処理サンプル（１００ｎＭ、パネルＤ）を用いた。各パネルの下には、得られた細胞周期の時期の分布を示す百分率を示す（Ｇ１/Ｓ/Ｇ２-Ｍ）。（Ａ）はアポトーシスを起こした細胞を示す。
【００９３】
図１１ 低濃度のＳＣＰＶＵＴＡＴと亜致死濃度のＨ２Ｏ２との相乗効果
ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１０ｎＭ、パネルＢ）もしくはＨ２Ｏ２（１０μＭ、パネルＣ）又はその両方（ＳＣＰＶＵＴＡＴ、１０ｎＭ；Ｈ２Ｏ２、１０μＭ；パネルＤ）と共に、あるいはコントロールとして試薬を用いず（パネルＡ）、Ｕ２ＯＳ細胞をインキュベートした。さらに、ＦＡＣＳにより、ＤＮＡ量について処理細胞を分析した；種々の細胞周期の時期を百分率で各ヒストグラムの下に表示した。
【００９４】
図１２ ヒストン２ＡＸＳｅｒ-１３９のリン酸化効果、およびＰＩ３／ＡＴＭキナーゼ阻害剤であるウォルトマンニン（Wortmanin）によるこの効果の阻害作用の顕微鏡分析
ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ、中央の列）を用いて、Ｕ２ＯＳ細胞を６０分間処理し、さらにウォルトマンニン（５０μＭ、ＷＭ、右の列）を用いて、またはコントロールとして試薬を用いずに（左の列）、この処理を行った。リン酸化されたＨ２ＡＸ-Ｓｅｒ-１３９に対する特異抗体（赤）またはヒストン２Ｂについての特異抗体（コントロールとして提供、緑）を用いて、処理細胞を染色し、蛍光顕微鏡により単一細胞レベルで分析した。
【００９５】
図１３ 自動分析によるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ-ＰＫＣＳ）の突然変異細胞についての感受性の決定
Ａ) 染色した細胞を用いて、突然変異細胞と比較用の正常細胞との増殖能（proliverative capacity）をＶｅｒｓａｄｏｃ４（バイオラッド）イメージング装置により評価した。その結果を統計分析してヒストグラムで表示する。ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の、ヒト神経芽腫細胞系ＭＯ５９Ｊ(ＤＮＡ-ＰＫＣＳ(-/-))のコロニー形成能をＭＯ５９Ｋ細胞(ＤＮＡ-ＰＫＣＳ(+/+))のコロニー形成能と比較する。コロニー形成能検定の実施例を示す。この検定は、順に３段階の様々な濃度の細胞（上から下の行、１×１０４、２×１０３、４×１０２、８×１０）を用いて実施した。右のＢ）では、ＭＯ５９Ｋと比較して、細胞系ＭＯ５９Ｊのコロニー形成能検定の結果をヒストグラムで示す。この検定は、Ｖｅｒｓａｄｏｃ４（バイオラッド）システムを用いて分析することを除けば、図９と同様に実施した。白棒：未処理サンプル；灰色棒：２５ｎＭ ＳＣＰＶＵＴＡＴ；黒棒：１００ｎＭ ＳＣＰＶＵＴＡＴである。
【００９６】
図１４ ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期制御タンパク質の細胞内分布
未処理、又はＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ）もしくはタキソール（０．２μｇ／ｍｌ）で３０時間処理した、ＨＣＴ１１６ (ｐ５３(+/+))細胞の顕微鏡分析。１次抗体にサイクロンＢ１特異抗体またはＣｄｃ２５ｃ特異抗体を用い、２次抗体にＦＩＴＣ標識化抗体（緑、サイクリンＢ１）またはＴＲＩＴＣ標識化抗体（赤、Ｃｄｃ２５ｃ）を用いて、免疫蛍光分析を行った。
【００９７】
実施例
実施例１
組換えタンパク質発現用ベクターの構築
以下の実施例に記載の実験のために、次の組換えタンパク質を当業者に周知の方法を用いて作製した：ＳＣＰＶＵは、ホモ２量体エンドヌクレアーゼ酵素ＰｖｕＩＩの一本鎖変異体であって、２００１年にSimoncsits等により既に明らかとなっている。ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の一部分に続いて６個のヒスチジンを有するＧＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳＨＨＨＨＨＨをコードする配列を、この構築物のＣ-末端に付加した。このような方法で得られた組換え融合タンパク質をＳＣＰＶＵＴＡＴと称する。その結果、酵素ＰｖｕＩＩの１-１５７アミノ酸の次にリンカー配列−ＧＳＧＧがあり、それが酵素ＰｖｕＩＩ の１番目のサブユニットと２番目のサブユニット（アミノ酸２−１５７）とを連結し、その後ろにＧＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＳ-ＨＨＨＨＨＨ配列（ｔａｔ-ペプチド＋６ヒスチジン-タグ）を有するポリペプチドとなる。さらに、エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩの変異体ＳＣ３４（Simoncsits等、2001）を一本鎖ポリペプチドとして作製した。この変異体は、ＰｖｕＩＩの特定のＤＮＡ結合活性を示すが、ＰｖｕＩＩ酵素の両方のサブユニットの３４位に突然変異（Ａｓｐ３４／Ｇｌｙ３４）があるため、エンドヌクレアーゼ活性が損なわれている。
【００９８】
実施例２
組み替えタンパク質の発現および精製
ＳＣＰＶＵＴＡＴの発現は、大腸菌株ＸＬ１ ＭＲＦ’を用いて行い (Simoncsits等、2001)、Ｈｉトラップ・キレート・アフィニティーカラム（５ｍｌ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いて第一回目の精製を行い、次いでＳＰセファロース（５ｍｌ ＨｉトラップＳＰ ＨＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いてさらに精製した。ＳＰ-セファロース上のタンパク質を０．６３Ｍ〜０．６７ＭのＮａＣｌを用いて溶出した。１．５Ｌの培地から約１０ｍｇの精製タンパク質を得た。ＴＡＴ配列を融合した天然のＰｖｕＩＩタンパク質（一本鎖変異体としてではない）を同様の方法で調製した。この場合のＳＰ-セファロースからの溶出には０．８１Ｍ〜０．８５ＭのＮａＣｌを用いた。発現タンパク質をすべて精製して均一にし、それを１５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いてゲル電気泳動により判断し、ＡＰＩ１５０ＥＸ(パーキンエルマー)を用いて質量分析して理論的な質量を確認した。得られたエンドヌクレアーゼ誘導体の酵素活性は、基質にλＤＮＡを用いて検査し、天然酵素と比較した。
【００９９】
実施例３
抗体産生および免疫学的分析
組換えタンパク質に対する抗体を、例えば、「Using Antibodies: ラボラトリーマニュアル」、HarlowおよびDavid Lane著; CSHプレスニューヨーク、1999、ISBN 0-87969-544-7、「Ｃｅｌｌｓ: ラボラトリーマニュアル」、David L Spector、RobertD. Goldman; Leslie A. Leinwand; ＣＳＨプレス・ニューヨーク、1998、ISBN 0-87969-521-8に記載の標準的な方法により、産生および使用した。抗体は、適当な抗原でニュージランド白ウサギ（New Zealand white rabbit）を免疫し、対応する抗原を固定化したBrCN-セファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いて血清から精製して得た。プロテアーゼ阻害剤、例えば２０μＭ ＴＰＣＫ、２０μＭ ＴＬＣＫ、ホスファターゼ阻害剤６０ｍＭ ４-ニトロフェニルリン酸塩を含有する２０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で細胞を溶菌させるか、またはＳＤＳサンプル・ローディング・バッファー中で細胞を直接溶菌して、免疫ブロット用の細胞抽出液を得た。当分野で周知の方法、例えば、３％パラフォルムアルデヒドまたはアセトンとメタノールの１:１混合液を用いて細胞を固定化して、免疫蛍光分析を行った。分析は、抗体染色後にＬＳＭ５１０共焦点ユニットに付属のツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ顕微鏡を用いて行った。
【０１００】
実施例４
真核細胞系へのキメラタンパク質のタンパク質形質導入
実施例４‐１１では次の細胞系を用いた：ＮＨＥＪ修復経路に欠損のある細胞系：ＣＨＯ細胞系: Ｘｒｓｓ５(ＫＵ８０(-/-))、Ｘｒ−１(ＸＲＣＣ４(-/-))、Ｖ３(ＤＮＡ-ＰＫｃｓ(-/-))及び対応する親細胞系ＡＡ８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１８５９）、並びに細胞系：ＨＩＳ Ｐ１.１３-１１（ＫＵ７０（-/-））及び対応する親細胞系 ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）。これらの細胞系を、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ培地中で生育させた。さらに、ヒト・グリオーマ細胞系ＭＯ５９Ｊ（ＤＮＡ-ＰＫｃｓ(-/-)）および対応する親細胞系ＭＯ５９Ｋ（野生型のＤＮＡ-ＰＫｃｓ） (Lees-Miller SP,等、 Science 1995、267 (5201):1183-5）を用い、それらを、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ/ＮＵＴ.ＭＩＸ-Ｆ１２ １:１培地中で生育させた。
【０１０１】
ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症突然変異タンパク質）欠損個体から得た細胞系ＡＴ-５、及び対応する親細胞系、ＭＣＲＣ-５(Raj K,等、Nature. 2001、412 (6850): 914-7)を用い、その両方を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。
【０１０２】
神経芽腫細胞系ＩＭＲ３２(ＡＴＣＣ ＣＣＬ-１２７)、ＧＩ-ＬＩＮ及びＬＡＮ-５(Panarello C.等、Cancer Genet、Cytogenet.、 2000, 116:124-132)は、必須アミノ酸及び１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地＋Ｈｅｐｅｓ ２５ｍＭ中で生育させた。
【０１０３】
ヒト骨肉腫細胞系Ｕ２ＯＳ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ９６）；その初代繊維芽細胞ＩＭＲ９０（初代継代）を、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地中で生育させた。
【０１０４】
結腸癌細胞系ＨＣＴ-１１６ (不適正塩基対修復遺伝子ヒトＭＬＨ１タンパク質の欠損体(Raj K,等、 Nature. 2001、412 (6850): 914-7))を、１０％ＦＣＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ培地中で生育させた。
【０１０５】
キメラタンパク質の形質導入許容量を、Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞及びＩＭＲ９０初代繊維芽細胞において検査した。これらの細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で生育させ、抗生物質の存在下で、概ね同じ培地中で本発明タンパク質を用いて処理した。融合タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴの調製量（１、１０、５０、１００、２００ｎＭ）およびＳＣＰＶＵタンパク質(ＴＡＴを含まない一本鎖ＰｖｕＩＩ)、並びにコントロールとしてＳＣ３４（ＰｖｕＩＩ酵素の３４位に変異を有することを除いて、ＳＣＰＶＵＴＡＴに記載のとおりに調製した）と共に、細胞を１０分間培養した後、細胞抽出液を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離して、ＰｖｕＩＩに対する単一特異的抗体を用いた免疫ブロット分析により分析した。さらに、３０分間インキュベートして、ＰｖｕＩＩ特異抗体と、プロピジウムヨウ化物とを用いて核を共染色した免疫蛍光分析により、取り込みを分析した。データは共に、タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴが細胞内、特に核内に濃縮されており、その取り込みは図２で示すように分析した細胞ではほぼ１００％であったことを示している。これに対して、ｔａｔ配列を有しない融合タンパク質（ＳＣＰＶＵ）では導入されていなかった。これらの濃縮は、用いたタンパク質が可溶性で且つ通常環境下で調製が行われ変性条件を経ていないことから、タンパク質の変性とは無関係である。実際、記載の方法により通常環境下で調製されたタンパク質は、タンパク質形質導入において効率よく機能し、Ｄｏｗｄｙの米国特許第６，２２１，３３５号中の別のタンパク質について最近記載された変性法よりも優れていた。
【０１０６】
実施例５
インビボにおいて本発明の組換えタンパク質を用いて処理した後に、ＴＵＮＥＬ検査によりＤＳＢ導入を確認する。
ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて細胞を素早く処理した後に、インビボでＤＳＢを標識できる、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素(ＴｄＴ) ｄＵＴＰ-ＦＩＴＣによるＴＵＮＥＬ反応（インシトゥ細胞死検出キット(In Situ Cell Death Detection Kit)、ロッシュ・ダイノスティック、ドイツ・マンハイム）を用いて、このタンパク質の機能を検定した。この検定は、細胞をＰＢＳ中の４％ パラホルムアルデヒド、０．１％トライトンにより固定化した後に行った。ＴＵＮＥＬ反応後に、細胞をプロピジウムＪ−を用いて対比染色（counter-stained）を行った。ネガティブコントロールとしてＳＣ３４構築物などのヌクレアーゼ活性欠損誘導体を使用することで、バックグラウンドの活性を見積もることができる。ＳＣＰＶＵＴＡＴ融合タンパク質を用いて処理してから少なくとも１０分間は、試験したすべての細胞でＴＵＮＥＬ陽性反応を示した（９０-１００％)。試験した細胞の中には、上皮細胞(ＨＥＫ-２９３、ＭＣＦ-７、不適正塩基対修復遺伝子ｈＭＬＨ１に欠損を有する結腸癌細胞系ＨＣＴ１１６)、初期繊維芽細胞(ＷＩ８３、ＩＭＲ９０、マウス胎児繊維芽細胞、ＭＥＦ）を含む、ヒトまたは齧歯類の細胞系があった。これにより、本発明の融合タンパク質が効率的に細胞核に輸送されることに加えて、検定した限りで、全ての細胞型でインビボ・エンドヌクレーゼ活性を示すことが確認された。実際に、ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理した数分間は、細胞培養上清中の本タンパク質の濃度が少なくとも１０ｎＭであっても、ほとんどの細胞で有意なＴＵＮＥＬ活性を示したことから、本キメラタンパク質がインビボで直接的かつ迅速に機能することが実証された。この態様により、本発明のシステムが、転写ユニットにより誘導されるエンドヌクレアーゼと比較しても、あるいは別のタイプのタンパク質導入法、例えばエレクトロポレーション法、またはリン酸カルシウムを用いる沈殿法、もしくはリポフェクションなどの脂質誘導法、のいずれと比較しても、もっとも効率が良いものなる。この活性は、細胞周期の時期とは無関係であり、また、ほんどの細胞でアポトーシスのポジティブマーカー（すなわち、シトクロームＣの放出、ポジティブアネキシン（Ａｎｅｘｉｎ）Ｖ染色）が見られないことからアポトーシスとも相関はない。
【０１０７】
図４には、ＳＣＰＶＵＴＡＴまたはＳＣ３４を用いてＵ２ＯＳ細胞を３０分間処理した後にＴＵＮＥＬ検定して得られた結果を示し、このタイプの検定によりＳＣＰＶＵＴＡＴ構築物の機能が実証される。
【０１０８】
実施例６
細胞周期における本発明タンパク質処理の効果の評価
最終的に、インビボで生じるＤＳＢが細胞周期にも影響を及ぼすかどうかを確かめるため、本発明タンパク質を形質導入した後に、様々な細胞周期の時期でのＤＮＡ量を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により分析した。種々の濃度で複数のタンパク質を用いて処理した後に様々な時点で、細胞を７０％エタノール中で固定化し、ＲＮＡｓｅＡで処理した後にプロピジウムＪ−を用いて染色した。
【０１０９】
ＦＡＣＳ分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ (ベクトン・デッキンソン)機器を用いて行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア・プログラム・パッケージを用いて、得られたデータを評価した。サンプル毎に単一の現象を少なくとも３×１０４回はＤＭモードで分析した。細胞周期におけるＤＮＡ量分布の統計解析は、ＭＯＤＦＩＴ ＬＴＴＭソフトウェア・プログラム・パッケージを用いて行った。２Ｎ ２倍体ＤＮＡ量は細胞周期のＧ１期にある細胞に対応し、４Ｎは４倍体相当のＤＮＡ量を表し、細胞周期のＧ２期および／またはＭ期に対応する。ＤＮＡ量がその中間にある場合には、ＤＮＡを活発に複製する時期に当たる細胞周期中のＳ期を表し、ＤＮＡ量が２倍体２Ｎ以下の場合にはアポトーシス細胞を表す。
【０１１０】
図５では、Ｕ２ＯＳ細胞を１０ｎＭのタンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴと共に２４時間インキュベートすれば、４倍体の集団を増加させるのに十分であることが示されている。ＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質を新鮮な培地を用いて希釈すると、細胞は２４時間で正常な細胞周期をする集団に戻ることができるのに対し、連続的に（例えば１２時間ごとに）ＳＣＰＶＵＴＡＴを加えると、分析したほとんどの細胞でアポトーシスは誘導されることなく、細胞周期の遅延が安定に誘発された。同様の処理を、タンパク質ＳＣ３４およびＳＣＰＶＵ（ＴＡＴドメインを有しない）を用いて行ったが、細胞周期の分布に変化は生じない。
【０１１１】
他の方法を用いれば、ＦＡＣＳ分析で４倍体（４Ｎ）として検出された集団をＧ２期とＭ期とに最終的に区別できる；すなわち、１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理した４ＮのＤＮＡを含むＨＣＴ１１６およびＵ２ＯＳ細胞において、その核が大きいままであり、有糸分裂構造や核膜の崩壊が全く見られないなら、それは細胞がＧ２期にあることを示しており、さらに細胞周期のＭ期に進む様子が全く見られないのであれば、Ｇ２細胞周期阻害を表している。さらに、生化学的分析を行って、Ｃｄｃ２‐サイクリンＢ複合体のキナーゼ活性を検証することができる。また、微小管阻害剤ノコダゾールまたはタキソールを用いて誘起される、分裂の開始をＣｄｃ２キナーゼの核活動によって、またはＣｄｃ２５Ｃの核局在によっても検出することができる。これらの検定により、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細かな細胞周期停止ポイントを詳細に分析することができ、これにより、ポジティブコントロールと比較して、細胞周期のこの時期の分布をさらに検出することができる。細胞周期の別の時期についての同様の実験が当分野で周知である。図７Ａに示した検定、および図１４で示した免疫蛍光分析が、このタイプの実験についての実施例である。実施例で示すように、融合タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴで処理することで、細胞系ＨＣＴ１１６にＤＳＢが導入され、次いで後期Ｓ／Ｇ２に相当する細胞周期の時期に可逆的に停止されることが示された。
【０１１２】
実施例７
ＡＴＭ／ＡＴＲに突然変異を有する細胞に対する本タンパク質の効果
毛細血管拡張性運動失調症突然変異タンパク質(ＡＴＭ)および毛細血管拡張性運動失調症関連突然変異タンパク質（ＡＴＲ）は、チェックポイント活性において、ＤＮＡ損傷に応答する中心的な信号伝達因子である。この経路により、細胞周期の進行およびＤＮＡ修復装置が調整されている。これらの制御により、細胞が損傷を受けた場合に、ＤＮＡが修復されるまで、細胞を細胞周期の次の時期に移行させないといった、適当な範囲のイベントが確保される。これは、細胞周期キナーゼが阻害され、同時に負の調節因子、この中にはｐ５３のような腫瘍抑制遺伝子やその転写の標的として既知のもの（すなわちｐ２１、１４-３-３シグマ）、次いでＤＮＡ修復に関与するエフェクター・タンパク質の正確な機能や厳密な正確性に重要となる細胞周期阻害を惹起するタンパク質、が誘導されて、細胞周期装置の制御に影響を与えている。これら制御タンパク質における突然変異はガンに対する強い疾病素質であることには注意する必要がある。
【０１１３】
Ｕ２ＯＳ細胞を、２ｍＭのカフェイン、メチルキサンチン(metylxantin)誘導体（ＩＣ５０＜１ｍＭ）で処理すると、細胞周期のＧ１期に適度な遅延を誘起し、ＤＮＡ損傷に対して細胞が過敏になるのを阻止する効果をさらに誘起する(Sarkaria等、1999)。このことは、カフェインが、その全てが相同なセリン／スレオニンキナーゼ領域（ＰＩＫＫ）を有するホスホ−イノシトール３キナーゼ（ＰＩ３）クラスの少なくとも３種類のメンバー、ＡＴＭ、ＡＴＲおよびＴＯＲの触媒活性を阻害することを示している。１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴと２ｍＭのカフェインとを組み合わせた培地中で３０時間生育させたＵ２ＯＳ細胞では、ＳＣＰＶＵＴＡＴの特徴的な細胞周期の停止を示さないが、適度なＧ１期の遅延を誘起する。このことは、カフェインがインビボにおいてＳＣＰＶＵＴＡＴ効果に対する拮抗剤であることを示している。最後の実験で、カフェインはインビトロでもＳＣＰＶＵＴＡＴを阻害せず、また本タンパク質の形質導入許容量に影響も与えないことが示された。これらの実験に用いたのと同じ論拠を、「インビボ」で活性があり、かつＡＴＭおよび／またはＡＴＭ／ＡＴＲ経路の阻害物質として作用する一般な組成物またはリード化合物を構成する、ＳＣＰＶＵＴＡＴに対する拮抗組成物を選択するのに応用できる。そして、ＡＴＭ／ＡＴＲまたはこの経路に関与する他のタンパク質に対する特異性は、適当な突然変異細胞系を用いることによって最終的には詳細に分析することができる。ＳＣＰＶＵＴＡＴの迅速で詳細な特徴づけ及び単一特異的活性のために、これらの物質はこの検定に有効に使用できる。本発明の使用の簡便性により、このタイプの検定、さらに大規模、例えば組み合わせ化学（combinatorial chemistry）および／または組み合わせ分子生物学を有効に応用して組み合わせるハイスループットなどに応用できる。
【０１１４】
その他の実施形態において、ＳＣＰＶＵＴＡＴは、ＡＴＭ／ＡＴＲの活性化に依存するイベントをモニターするのに用いられる。ＡＴＭは、ＤＮＡ損傷により活性化され、チェックポイントに関与する多くの基質に対してセリン／スレオニンキナーゼとして機能する。それらの基質をリン酸化することで、チェックポイント応答の活性化に影響を及ぼしたり、しなかったりする。インビボで周知のＡＴＭまたはＡＴＭ依存性キナーゼの基質としては、Ｎｂｓ１、ＳＭＣ１(染色体の構造維持)、ＭＤＣ１（ＤＮＡ損傷の仲介物質)、Ｈ２ＡＸ（ヒストン２Ａｘ）、ｐ５３などが挙げられる。
【０１１５】
ＳＣＰＶＵＴＡＴに応答する、基質のｐ５３-Ｓｅｒ１５におけるＡＴＭ／ＡＴＲのインビボ誘導を分析した。ｐ５３のＳｅｒ１５におけるリン酸化は、タンパク質の安定性およびｐ５３の転写活性を制御するため、ｐ５３の転写応答に最も重要である。
【０１１６】
ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に応答したＳｅｒ１５におけるｐ５３のリン酸化は、ＡＴＭポジティブまたはネガティブ細胞系(それぞれＭＲＣ-５およびＡＴ-５)で検定した。比較のために、ヒドロキシウレア（ＨＵ）を用いた実験を並行して行った。ＨＵは、リボヌクレオチジル還元酵素として機能し、Ｓ期中にＤＮＡ複製フォークを停止させＤＳＢを惹起する。これについて、ｐ５３のリン酸化Ｓｅｒ１５を特異的に検出するために、これに対する特異抗体を用いて、処理後の抽出物について免疫ブロット実験を行った。図７で示したように、ＡＴＭプラス細胞系ＭＲＣ-５（図７Ｂ）と同様にＡＴＭマイナス細胞系ＡＴ-５でも、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後にｐ５３-Ｓｅｒ１５の特異的リン酸化が得られた。ＨＵを用いて処理した場合にも、ｐ５３‐Ｓｅｒ１５のリン酸化が誘導され、同一の結果が見られたが、一貫して強い傾向にあった。このインビボでのリン酸化は、ＡＴＭ／ＡＴＲ阻害物質であるカフェインに対して過敏である；ＡＴ-５細胞を２ｍＭカフェインと共にインキュベートして、ＳＣＰＶＵＴＡＴまたはＨＵ処理しても有意なｐ５３-Ｓｅｒ１５のリン酸化は示さない（図７Ｃ）。本発明の目的に応じて、ＡＴＭの基質をリン酸化する他の実施例として、ヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９リン酸化の分析を行った。それにより、細胞周期のＳ期およびＧ２期中の放射線照射によって惹起されたＤＮＡ損傷に迅速に応答して、ＡＴＭがヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９をリン酸化することが示された。Ｕ２ＯＳ細胞をＳＣＰＶＵＴＡＴで６０分間処理した後に、固定化してヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９のリン酸化を分析した。細胞を、ヒストンＨ２ＡＸにおけるリン酸化-Ｓｅｒ１３９に対する特異抗血清を用いて分析し、単一細胞レベルで顕微鏡観察して分析した。コントロールとしてヒストン２Ｂを分析した。その結果、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理によって、ヒストンＨ２ＡＸ Ｓｅｒ１３９のリン酸化が迅速に誘導され、かつ、この活性が処理細胞の核内に特異的に局在する形で検出されるが、未処理細胞では検出されないことが示されている（図１２）。さらに、ＡＴＭキナーゼ阻害剤であるウォルトマンニン(５０μＭ)は、この反応の拮抗剤である。用いたウォルトマンニン濃度は、ＡＴＭに対して特異性を示したがＡＴＲを阻害しなかったため、これら２つのキナーゼを区別する簡便な検定法を表している。このタイプの実験では、ＡＴＭ経路の基質を分析して、ＳＣＰＶＵＴＡＴにより惹起されるＤＳＢによって誘導される生化学的分子ターゲットを明らかにできる。本発明により処理された細胞または細胞抽出物におけるウェスタン−ブロット法、免疫蛍光分析、または酵素学的検定によって、ＡＴＭキナーゼの基質を生化学的および／または免疫学的に分析することは、各経路における正常な誘導と比較して、特定の細胞についていの、インビボでのチェックポイント応答の状態を説明するのに有効である。
【０１１７】
さらに、これらの検定法は、本発明と併せて自動スクリーニングに用いるのに有効であり得る。本発明によりＤＮＡ中に生じた損傷の性質を正確且つより詳細に規定できるため、同様の検定タイプに従来から用いられている他の化合物に対して優れている。一回の検定またはハイスループットスクリーニングに本発明を使用すれば、副次的効果や多面的（pleotropic）効果を考慮する必要がほとんどなく、複合スクリーニングの成功に本質的な条件が必要なだけである。これらのタイプの実験で得られるデータは、ＤＳＢにより誘起される効果と同等と考えることができる。さらに、ＳＣ３４のようなヌクレアーゼ活性を示さない突然変異タンパク質誘導体を利用することで、これらの検定法に対する重要なコントロールが提供される。
【０１１８】
実施例８
ＳＣＰＶＵＴＡＴに誘起されるＡＴＭおよびｐ５３由来の効果の依存性
一般に、ＤＮＡ損傷において、制御機構（チェックポイント）に相当する成分における突然変異は、細胞周期を抑制する特徴に変化をきたし、多くの場合、これらの突然変異がガンの疾病素質を決定付ける。
【０１１９】
一方、ＤＮＡ修復にエフェクター分子として関与するタンパク質は、一般的に、細胞周期を正常に抑制するが、主にチェックポイント成分の欠陥と組み合わさった場合にのみ腫瘍進行を惹起し、腫瘍の疾病素質に対して相乗効果を頻繁に示す。エフェクター分子中の突然変異はＤＳＢに対して特に過敏であり、チェックポイントの突然変異の場合には見られない顕著な特徴を示す。本発明のタンパク質が単一特異性を有するため、ＤＳＢに対する感受性や細胞周期における影響を、導入された損傷に対する端的な結果として説明することができる。実際に、欠損が細胞周期機構（チェックポイント）の成分または修復装置に生じた場合には、それを評価することができる。
【０１２０】
ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理によって導入されたＤＳＢに対する細胞周期応答を、ｐ５３ポジティブまたはネガティブ細胞において分析した。ｐ５３ポジティブ細胞の場合は、Ｓ期の値が低くなり、Ｇ１およびＧ２期において細胞周期抑制の働きが見られるが、ｐ５３ネガティブ細胞の場合には細胞周期を抑制する特徴は見られない。さらに、このタイプの結果はｐ５３の下流因子についても得られた。ｐ２１中の突然変異はｐ５３マイナス細胞に相当する挙動を示し、また、１４-３-３シグマ中の突然変異についてはＧ１停止した。これにより、このタンパク質がｐ５３と部分的にオーバーラップしており、さらに、細胞周期のＧ２期のみ制御する働きを担っていることが分かる。最終的には図８Ａに示すように、ＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理した後に突然変異体ＡＴ−５を分析した。ＡＴＭの突然変異細胞系（ＡＴ-５）をＳＣＰＶＵＴＡＴと共に３６時間インキュベートすることで細胞周期を過渡的に遅延させることができるが、これはＤＮＡ量のＦＡＣＳ分析により決定した。ＡＴ-５細胞では４Ｎ Ｇ２のＤＮＡ量に大きな増大が見られたが、Ｇ１遅延が全く見られなかったことから、Ｇ１チェックポイントにおける複合欠損が示された。重要なことに、ＡＴＭポジティブ細胞系と異なり、２４時間経過してもＧ２遅延が解消せず、細胞周期に再び戻ることはなかった（図５を参照のこと）。ＡＴ-５細胞に６０分間ＳＣＰＶＵＴＡＴを一回加えることで、２４時間後の細胞周期停止を誘起させるのに十分であり（図８Ａ）、最終的には、不正確なＤＮＡ連結によって細胞死が引き起こされ、その結果として、６０分間のＳＣＰＶＵＴＡＴ一回処理後のコロニー形成活性はＡＴ-５細胞の０．０２％以下となる。この検定において、ＡＴＭポジティブコントロール細胞系ＭＲＣ-５では、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に対して感受性は低かった（図８Ｂ）。加えて、コントロールとして、細胞をアドリアマイシンと共にインキュベートした。突然変異ヌクレアーゼ変異型で処理した場合に、未処理と同等の効率でコロニーが形成されたため、この効果はＳＣＰＶＵＴＡＴのエンドヌクレアーゼ活性によるものであった。これらの実施例で、種々の突然変異細胞がＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に応答して厳密な細胞周期プロファイルを示すことに加え、その特徴がＤＳＢによる細胞周期の欠損を診断するのに利用できることを実証している。
【０１２１】
実施例９
ＮＨＥＪ（非相同末端再結合）修復経路に欠陥のある細胞に対するＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質の診断能力を評価する。
ＮＨＥＪは、相同組換え修復が頻繁に見られる下等真核生物と異なり、高等真核生物における二本鎖ＤＮＡ切断修復に対する主要な機構を表す。このシステムに関与するタンパク質は、Ｖ（Ｄ）Ｊ免疫グロブリン組換えの最終段階にも関与する。本発明タンパク質が特定の様式でＮＨＥＪ酵素も活性化するかどうかを確かめるため、この経路に必須の要素の１つに個別に変異を有する齧歯細胞系を分析した。
【０１２２】
図９および図１３にまとめるコロニー形成分析において、本発明タンパク質ＳＣＰＶＵＴＡＴによる１回の処理で、分析したＮＨＥＪ変異細胞系すべてにおいてコロニー形成活性を大きく低下させるのに十分であることが確認できる。
【０１２３】
本発明のＤＳＢ修復の特異性を実証するため、ＤＳＢのＮＨＥＪ修復に関与する必須要素の１つに機能性の変異を有する同型接合欠損を含む、齧歯類の細胞を用いた：ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの調節サブユニットを含むＰＩＫＫサブユニット触媒ドメイン（ＤＮＡ-ＰＫｃｓ； Ｖ３細胞系、相当する親細胞系ＡＡ８）、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼＫｕ７０の調節サブユニット（ＨＩＳ Ｐ１．１３‐１１；相当する親細胞系ＣＨＯ−Ｋ１）、サブユニットＫｕ８０（ｘｒｓｓ５；相当する親細胞系ＡＡ８）およびＤＮＡライゲースＩＶ調節サブユニットＸＲＣＣ４（ＸＲ-１細胞系；相当する親細胞系ＡＡ８）。これらの細胞系を、インビボでＳＣＰＶＵＴＡＴを用いたヌクレアーゼ活性検定で分析し、表示の親細胞系と比較した。さらに、これらＮＨＥＪ変異細胞をＳＣＰＶＵＴＡＴ用いてコロニー形成、コロニー−副産物（outgrowth）検定で試験したが、検定は濃度１０ｎＭ（灰色棒）または７５ｎＭ（黒棒）のＳＣＰＶＵＴＡＴを１回添加して、あるいはタンパク質処理を行わず（未処理、白棒）１２時間経過した後に行った。添加の７〜１０日後に、ギムザ−ブルーを用いて染色して細胞増殖を分析して、種々の細胞濃度を定量した。個々の実験で得られた結果を図９にまとめた。ＤＮＡライゲースＩＶのＸＲＣＣ４サブユニットに変異がある細胞は、ＳＣＰＶＵＴＡＴによって導入された平滑末端ＤＳＢに非常に敏感であり、さらに興味深いことに、検査したＤＮＡ-ＰＫに変異を有する細胞はすべて、触媒サブユニットに変異を有しているため、コロニー形成検定において同様に大きな低下を示す。親細胞と対照的に、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子にホモ接合変異を示すＨＣＴ１１６のような、不適合修復経路に既知の欠損を含む細胞については、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に対して同様の検定を行っても感受性に増加は全く見られない。
【０１２４】
さらなる実施例において、ＤＮＡ-ＰＫｃｓに欠損があるヒト膠芽腫細胞系（ＭＯ０５９J）をＳＣＰＶＵＴＡＴで処理し、親細胞系ＭＯ５９Ｋと比較した。同様に、ＳＣＰＶＵＴＡＴ（１０ｎＭ、灰色棒；７５ｎＭ、黒棒；未処理、白棒）で１回処理して１２時間後に、細胞増殖を定量した。さらに、ヒトＤＮＡ-ＰＫｃｓ変異細胞もまたＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に応答して感受性に顕著で特異な増大を示す（図１３Ａ、Ｂ）。これらの細胞をマルチウェル−マイクロタイタープレートに種々の濃度で植え、表示のＳＣＰＶＵＴＡＴを用いて処理してギムザ−ブルー染色を行った。マルチウェルーマイクロタイター−プレート（実施例については図１３Ａを参照のこと）をＶｅｒｓａＤＯＣＲ(バイオラッド)イメージングシステムを使用してスキャンし、その生育をマイクロタイター−プレート分析用のソフトウェア・パッケージ・Ｑｕａｎｔｉｆｙ ＯｎｅＲ（マイクロタイター−プレート・スキャニング・ソフトウェア）を用いて自動的に定量した。得られたデータをさらにヒストグラムにまとめ、その概要を図１３に示す。ＤＮＡ-ＰＫｃｓに変異のある齧歯類の細胞系と、ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理に対して過敏であると実証されたヒト細胞系から得られた結果とが一致していることから、ＤＳＢの導入にＳＣＰＶＵＴＡＴが高い特異性を有していることが認められる。これらの実施例で、半自動または完全自動検定への応用を含めて、使用したシステムの実行可能性が実証された。
【０１２５】
実施例１０
ＤＳＢ誘導ストレスに対する共同剤または拮抗剤の候補化合物のスクリーニングに関する検定
Ｕ２ＯＳ細胞を１０ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを単独で、また１０μＭのＨ２Ｏ２を単独で、あるいは組み合わせて用いてインキュベートし、細胞周期プロファイルをＦＡＣＳにより分析した。１０μＭのＨ２Ｏ２を単独で用いた場合にはＧ２期には増大は見られず、また１０ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを単独で用いた場合にはＧ２期にも２０％から２８％というわずかな増大しか得られなかったのに対して、細胞を２種類の成分を同時にインキュベートすることで、Ｇ２期に対応するピークを２０％から４５％に大きく増大させ、細胞周期プロファイルに特異で大きな増大変化をもたらした（図１１Ａ、図１１Ｄと比較して）。単一の成分をインキュベートして得られた結果に基づいて、両方の化合物を同時にインキュベートすることで、細胞周期の変動に相乗効果のあったことが明らかに示される。
【０１２６】
次に、同様の実験として、ＳＣＰＶＵＴＡＴタンパク質をアフィジコリン（ＤＮＡ挿入剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤）と一緒にインキュベートしたが、相乗効果は見られず、単に両成分の効果が加算されるだけであった。再度、本発明タンパク質により平滑末端ＤＳＢが導入された細胞系に対する相乗作用および拮抗作用の検出に使用できるこの検定の簡便性を実証した。上記のように、この検定の利点は、導入されるＤＮＡ損傷が単一特異的であることと、ヌクレアーゼ欠損ＳＣ３４タンパク質を用いた系でバックグラウンドを測定可能なこと、さらに、事実上全ての細胞およびどの細胞周期においてもこの検定は非常に迅速に且つ簡便に用いることができることである。このことは、インビボでＤＳＢを導入できる他の試薬については、これまで記載されていなかった。したがって、ラジカルおよびカフェインについて示したこのタイプの検定において、ＤＮＡ修復経路およびその制御を阻害する組成物をタイプごとにスクリーニングするのに用いることができる。
【０１２７】
実施例１１
神経芽腫おけるＳＣＰＶＵＴＡＴ処理によるアポトーシス誘導
分析した上皮細胞および間葉由来細胞の多くはＳＣＰＶＵＴＡＴで処理してもアポトーシスを起こさなかったが、いくつかの神経芽腫細胞系（ＩＭＲ３２、ＬＡＮ５、ＧＩ-ＬＩＮ）やクリニックから単離された種々の初代神経芽腫細胞で、顕著なアポトーシスが誘導された。図１０では、これらの細胞における、本発明タンパク質によるアポトーシス誘導の実施例を示す。この分析では、細胞をプロピジウムＪ−染色した後にＦＡＣＳを用いて、そのＤＮＡ量を分析した。アポトーシス細胞（Ａ）は、２Ｎ以下のＤＮＡ量を示す細胞として検出される。計算した領域は、各ヒストグラムの頂点にある矢印で示される対応範囲である。１０ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを添加した場合には３０時間内に素早くアポトーシス細胞が１８％誘導され（図１０Ｂ）、また、１００ｎＭのＳＣＰＶＵＴＡＴを添加した場合にも、同じ時間単位でアポトーシス細胞が２９％以上も誘導されたのに対し（図１０Ｃ）、ヌクレアーゼ欠損変異体ＳＣ３４はそのような影響は見られなかった。これらの実験で、神経芽腫細胞でアポトーシスが非常に特異的に誘導されることが実証され、本発明タンパク質がこのタイプの腫瘍の治療処置についての最有力候補として利用できることが実証された。
【０１２８】
さらに、組織特異的輸送システムと組み合わせることで、本発明の目的である配列に、神経芽腫治療についての候補物質として十分な特異性を含ませることができる。実際、本発明は組織特異的な輸送配列をスクリーニングするプラットフォーム技術として応用でき、今後に対して有効な含みを有している。
【０１２９】
加えて、既に上記の実施例（実施例８）で予想したように、本発明は、標的細胞において、特に腫瘍由来の悪性細胞またはそうでない細胞において、または同一個体の正常細胞の下層範囲において、別個に特定のアポトーシスを誘導することのできる特定のリード化合物または特定の混合物をスクリーニングするのに用いることもできる。
【０１３０】
実施例１２
免疫顕微鏡分析によるＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の細胞周期タンパク質の細胞局在。
ＨＣＴ１１６（ｐ５３(+/+)）を未処理、またはＳＣＰＶＵＴＡＴ（１００ｎＭ）もしくはタキソール（０．２μｇ／ｍｌ）で３０時間処理して、３％ ＰＦＡを用いて固定化した後、サイクリンＢ１またはＣｄｃ２５ｃに対する特異抗体を用いて処理した。サイクリンＢ１に特異的な１次抗体に結合するＦＩＴＣ標識化２次抗体（緑）か、またはＣｄｃ２５Ｃに特異的な１次抗体に結合するＴＲＩＴＣ標識化２次抗体（赤）を用いて、顕微鏡により免疫蛍光分析した（図１４を参照のこと）。ＳＣＰＶＵＴＡＴ処理後の４Ｎ ＤＮＡ量の細胞から分かる細胞周期マーカー Ｃｄｃ２５ＣおよびサイクリンＢの細胞質分布により、Ｇ２期の停止と、処理した細胞が細胞周期のＭ期に進行しないことが実証された。
【０１３１】
この結果は、細胞周期のＭ期で停止したことを示す顕著な核分布を表す、タキソールを用いた場合に得られる結果と異なっている。
【０１３２】
２つのマーカータンパク質の特定の分布に変化、すなわち、不活性型サイクリンＢキナーゼの細胞質分布に対して、細胞周期を次の分裂後期に進行させる活性型サイクリンＢキナーゼの核内局在を示すといった変化が生じ、続いて、ｃｄｃ２／サイクリンＢキナーゼはホスファターゼＣｄｃ２５Ｃ（Ｃｄｃ２５Ｃから１４-３-３タンパク質が放出されて、このホスファターゼは活性化する）によって脱リン酸化されて活性化されることが、Ｇ２期／Ｍ期移行の顕著な特徴である。実際に、この経路は細胞周期のこの時期における律速段階である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．特定のヌクレオチド配列に対してアフィニティーを示すポリペプチド
ｂ．ＤＮＡ修飾酵素
ｃ．細胞内輸送活性を有する領域
を含むキメラポリペプチド。
【請求項２】
領域ａ．、ｂ．およびｃ．が互いに共有結合されている請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
細胞内輸送活性がペプチド、ポリペプチド、脂質および炭水化物からなる群から選択される請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＤＮＡ修飾酵素がメチラーゼ、アセチラーゼ、エンドヌクレアーゼおよびトポイソメラーゼからなる群から選択される請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＤＮＡ修飾酵素が制限エンドヌクレアーゼである請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
制限エンドヌクレアーゼが、クラスＩＩ型またはそのサブユニットもしくは機能性フラグメント由来である請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドａ．およびポリペプチドｂ．の活性が同一分子内にある請求項５および６記載のポリペプチド。
【請求項８】
特定のヌクレオチド結合活性を有するポリペプチド、および酵素的ＤＮＡ修飾活性を含むポリペプチドが、制限エンドヌクレアーゼまたはそのサブユニットもしくは機能性フラグメントである、請求項６および７記載のポリペプチド。
【請求項９】
制限エンドヌクレアーゼが、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｆＩおよびそれらのサブユニットおよび機能性フラグメントからなる群より選択される、請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
エンドヌクレアーゼ活性は修飾されているが、核酸結合の特異性は天然酵素と同等である請求項５〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
細胞内輸送領域が、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２、ＨＩＶ−１のＴａｔ、Ｈｉｖ−１のＲｅｖ、アンテナペディアホメオドメイン、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるペプチドを少なくとも１つ含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、またはその点突然変異体もしくは機能性突然変異体を含むＨＩＶ−１ Ｔａｔプロテインから派生した請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
特定のヌクレオチド結合アフィニティーを備えたポリペプチドであって、そのＤＮＡ修飾酵素がＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩおよびＨｉｎｆＩ、またはそれらのサブユニットもしくは機能性フラグメントから選択されるクラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする一本鎖ポリペプチドにより表わされ、その細胞内輸送機能がＨＩＶ−１ ｔａｔのアミノ酸配列に含まれるペプチドである、請求項８〜１２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
制限エンドヌクレアーゼのサブユニットが、一本鎖のタンパク質として共有結合している請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号：２（ＳＣＰＶＵＴＡＴ）を含む請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
非天然アミノ酸を含む請求項１〜１５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
請求項５〜１５のいずれかに含まれるポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号：１を含む請求項１７記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項２１】
治療上使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１７または１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９記載のベクター、請求項２０記載の細胞。
【請求項２２】
適当な賦形剤、乳化剤または希釈剤と組み合わせた、有効成分として請求項１〜１６のいずれかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２３】
腫瘍性疾病または該疾病の疾病素質の予防用、治療用または診断用医薬の調製のための、請求項２１記載のキメラ分子、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを用いて単離された細胞を処理することを本質的に含む、単離された細胞のゲノム中の特定部位を修飾する方法。
【請求項２５】
請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用に基づく方法であって、単離された細胞のゲノム中の特定部位に導入される修飾がＤＮＡ二本鎖切断である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｉ）請求項６〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドと共に単離された細胞をインキュベートする
ｉｉ）任意にラジカル生成基質を存在させて、組成物を添加または組成物を回収する（ライブラリー）
ｉｉｉ）細胞応答を特徴づけおよび／または測定する
ことを本質的に含む、細胞システムにおけるゲノム修復活性を調節でき、または細胞周期の制御およびチェックポイントの活性を調節できる組成物のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項２４および２５記載の方法を使用し、または請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを使用し、インビトロでＤＮＡ修復およびチェックポイント機構を活性化する方法。
【請求項２８】
以下の工程：
ａ）試験サンプルの単離された細胞の任意培養、
ｂ）適当なリファレンス細胞系を並行して用いることある、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを用いる単離された細胞のインキュベート、
ｃ）細胞応答の特徴づけおよび／または測定、
を本質的に含む、インビトロでのＤＮＡ修復および細胞周期の制御およびチェックポイント経路における遺伝的欠陥を診断する方法。
【請求項２９】
細胞応答が、コロニー形成活性、リン酸化の状態、または細胞内タンパク質から成る生化学マーカーの発現レベル、それらタンパク質の核もしくは細胞質レベルの局在、細胞集団の総ＤＮＡ量、細胞増殖から選択される、請求項２６および２８のそれぞれポイントｉｉｉ）およびｃ）に記載の方法。
【請求項３０】
細胞内タンパク質が、ｐ５３、ＡＴＭ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、Ｎｂｓ１、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、Ｒａｄ５１およびヒストンからなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍に対する遺伝的疾病素質のインビトロ診断、または放射線感受性に対する診断のための請求項２９および３０記載の方法。
【請求項３２】
単離された細胞において細胞周期の停止を誘導するための、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラ分子の使用。
【請求項３３】
神経芽腫由来の単離された細胞においてアポトーシスを誘導するための、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラ分子の使用。
【請求項３４】
特異的ＤＮＡ結合活性を示すがヌクレアーゼ活性が損なわれているコントロール用のキメラポリペプチドを含むチューブと併用する、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含む、離された細胞でのＤＮＡ修復システムまたは細胞周期の制御システム（チェックポイント）における遺伝的欠陥の診断用キット。
【請求項３５】
請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドが配列番号：２を有し、コントロール用のキメラポリペプチドがポリペプチドＳＣ３４である、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
単離された細胞において腫瘍に対する疾病素質を決定する、遺伝的欠陥をインビトロ診断するための請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
腫瘍の放射線感受性を診断するための請求項３５記載のキット。
【請求項１】
ａ．特定のヌクレオチド配列に対してアフィニティーを示すポリペプチド
ｂ．ＤＮＡ修飾酵素
ｃ．細胞内輸送活性を有する領域
を含むキメラポリペプチド。
【請求項２】
領域ａ．、ｂ．およびｃ．が互いに共有結合されている請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
細胞内輸送活性がペプチド、ポリペプチド、脂質および炭水化物からなる群から選択される請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＤＮＡ修飾酵素がメチラーゼ、アセチラーゼ、エンドヌクレアーゼおよびトポイソメラーゼからなる群から選択される請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＤＮＡ修飾酵素が制限エンドヌクレアーゼである請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
制限エンドヌクレアーゼが、クラスＩＩ型またはそのサブユニットもしくは機能性フラグメント由来である請求項５記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドａ．およびポリペプチドｂ．の活性が同一分子内にある請求項５および６記載のポリペプチド。
【請求項８】
特定のヌクレオチド結合活性を有するポリペプチド、および酵素的ＤＮＡ修飾活性を含むポリペプチドが、制限エンドヌクレアーゼまたはそのサブユニットもしくは機能性フラグメントである、請求項６および７記載のポリペプチド。
【請求項９】
制限エンドヌクレアーゼが、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＨｉｎｆＩおよびそれらのサブユニットおよび機能性フラグメントからなる群より選択される、請求項５〜８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
エンドヌクレアーゼ活性は修飾されているが、核酸結合の特異性は天然酵素と同等である請求項５〜９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
細胞内輸送領域が、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２、ＨＩＶ−１のＴａｔ、Ｈｉｖ−１のＲｅｖ、アンテナペディアホメオドメイン、およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるペプチドを少なくとも１つ含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、またはその点突然変異体もしくは機能性突然変異体を含むＨＩＶ−１ Ｔａｔプロテインから派生した請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
特定のヌクレオチド結合アフィニティーを備えたポリペプチドであって、そのＤＮＡ修飾酵素がＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩおよびＨｉｎｆＩ、またはそれらのサブユニットもしくは機能性フラグメントから選択されるクラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする一本鎖ポリペプチドにより表わされ、その細胞内輸送機能がＨＩＶ−１ ｔａｔのアミノ酸配列に含まれるペプチドである、請求項８〜１２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
制限エンドヌクレアーゼのサブユニットが、一本鎖のタンパク質として共有結合している請求項１３記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号：２（ＳＣＰＶＵＴＡＴ）を含む請求項１４記載のポリペプチド。
【請求項１６】
非天然アミノ酸を含む請求項１〜１５のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
請求項５〜１５のいずれかに含まれるポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号：１を含む請求項１７記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７〜１８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項２１】
治療上使用するための、請求項１〜１６のいずれかに記載のポリペプチド、請求項１７または１８記載のポリヌクレオチド、請求項１９記載のベクター、請求項２０記載の細胞。
【請求項２２】
適当な賦形剤、乳化剤または希釈剤と組み合わせた、有効成分として請求項１〜１６のいずれかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２３】
腫瘍性疾病または該疾病の疾病素質の予防用、治療用または診断用医薬の調製のための、請求項２１記載のキメラ分子、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを用いて単離された細胞を処理することを本質的に含む、単離された細胞のゲノム中の特定部位を修飾する方法。
【請求項２５】
請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドの使用に基づく方法であって、単離された細胞のゲノム中の特定部位に導入される修飾がＤＮＡ二本鎖切断である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｉ）請求項６〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドと共に単離された細胞をインキュベートする
ｉｉ）任意にラジカル生成基質を存在させて、組成物を添加または組成物を回収する（ライブラリー）
ｉｉｉ）細胞応答を特徴づけおよび／または測定する
ことを本質的に含む、細胞システムにおけるゲノム修復活性を調節でき、または細胞周期の制御およびチェックポイントの活性を調節できる組成物のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項２４および２５記載の方法を使用し、または請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを使用し、インビトロでＤＮＡ修復およびチェックポイント機構を活性化する方法。
【請求項２８】
以下の工程：
ａ）試験サンプルの単離された細胞の任意培養、
ｂ）適当なリファレンス細胞系を並行して用いることある、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを用いる単離された細胞のインキュベート、
ｃ）細胞応答の特徴づけおよび／または測定、
を本質的に含む、インビトロでのＤＮＡ修復および細胞周期の制御およびチェックポイント経路における遺伝的欠陥を診断する方法。
【請求項２９】
細胞応答が、コロニー形成活性、リン酸化の状態、または細胞内タンパク質から成る生化学マーカーの発現レベル、それらタンパク質の核もしくは細胞質レベルの局在、細胞集団の総ＤＮＡ量、細胞増殖から選択される、請求項２６および２８のそれぞれポイントｉｉｉ）およびｃ）に記載の方法。
【請求項３０】
細胞内タンパク質が、ｐ５３、ＡＴＭ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、Ｎｂｓ１、Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０、Ｒａｄ５１およびヒストンからなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍に対する遺伝的疾病素質のインビトロ診断、または放射線感受性に対する診断のための請求項２９および３０記載の方法。
【請求項３２】
単離された細胞において細胞周期の停止を誘導するための、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラ分子の使用。
【請求項３３】
神経芽腫由来の単離された細胞においてアポトーシスを誘導するための、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラ分子の使用。
【請求項３４】
特異的ＤＮＡ結合活性を示すがヌクレアーゼ活性が損なわれているコントロール用のキメラポリペプチドを含むチューブと併用する、請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含む、離された細胞でのＤＮＡ修復システムまたは細胞周期の制御システム（チェックポイント）における遺伝的欠陥の診断用キット。
【請求項３５】
請求項５〜１６のいずれかに記載のキメラポリペプチドが配列番号：２を有し、コントロール用のキメラポリペプチドがポリペプチドＳＣ３４である、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
単離された細胞において腫瘍に対する疾病素質を決定する、遺伝的欠陥をインビトロ診断するための請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
腫瘍の放射線感受性を診断するための請求項３５記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図１１】
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【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１８２７９２（Ｐ２０１１−１８２７９２Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７８４（Ｐ２０１１−５１７８４）
【出願日】平成２３年３月９日（２０１１．３．９）
【分割の表示】特願２００６−５０５１６９（Ｐ２００６−５０５１６９）の分割
【原出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（５１００３２４２７）アドリアセル・ソシエタ・ペル・アチオニ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＲＩＡＣＥＬＬ Ｓ．ｐ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月９日（２０１１．３．９）
【分割の表示】特願２００６−５０５１６９（Ｐ２００６−５０５１６９）の分割
【原出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【出願人】（５１００３２４２７）アドリアセル・ソシエタ・ペル・アチオニ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＤＲＩＡＣＥＬＬ Ｓ．ｐ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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