クラゲタンパク質由来の新規ペプチドとその用途
【課題】クラゲタンパク質由来の新規ＡＣＥ阻害物質を単離精製し、その構造を決定すると共に、当該ＡＣＥ阻害物質さらにはそれを利用した食品、または医薬等を提供する。
【解決手段】クラゲタンパク質由来の３種類の新規ＡＣＥ阻害ペプチド。このうち２種類のペプチドは３個のアミノ酸からなり、残り１種類のペプチドは１１個のアミノ酸からなる。いずれのペプチドもＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防に有効な機能性食品等として、また降圧剤等の医薬として利用することができる。
【解決手段】クラゲタンパク質由来の３種類の新規ＡＣＥ阻害ペプチド。このうち２種類のペプチドは３個のアミノ酸からなり、残り１種類のペプチドは１１個のアミノ酸からなる。いずれのペプチドもＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防に有効な機能性食品等として、また降圧剤等の医薬として利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラゲより見出された新規ペプチドとその用途に関し、より詳細には、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を示す複数の新規ペプチド、これらペプチドを含有するペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末、その製造方法、これらペプチド又はそれらの濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤、これらペプチド又はそれらの濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を包含する機能性食品などの食品やサプルメント、および降圧剤や血圧調整剤などの医薬、その他健康食品組成物、降圧用又は血圧調整用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アンギオテンシン変換酵素（以下、「ＡＣＥ」という。）は、前駆体ペプチドアンギオテンシンＩから活性な昇圧ペプチド、アンギオテンシンIIの生成反応を触媒する。したがって、ＡＣＥの活性を阻害する物質は、降圧剤として高血圧症の予防および／または治療に用いることができる。実際に、ＡＣＥ阻害剤であるカプトプリル等が高血圧症の治療薬として使用されている。また、ＡＣＥ阻害剤は、心臓病（心不全など）や腎臓病（腎硬化症、糖尿病性腎症など）にも効果があると云われており、高血圧症以外の疾患治療薬としても利用可能性を有する。
【０００３】
下記の特許文献１〜３には、豚肉や大豆蛋白に由来するＡＣＥ阻害活性を有するペプチドが開示されている。また、下記の特許文献４には、クラゲにタンパク質分解酵素を作用させてクラゲを熟成させることによって、ＡＣＥ阻害活性（血圧調整機能）を有するクラゲ加工食品およびＡＣＥ阻害物質含有液を製造する方法などが開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２１７５８８号公報
【特許文献２】特開２００４−６７５５３号公報
【特許文献３】特開平７−７０１８０号公報
【特許文献４】特開２００２−３７０９９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、クラゲを熟成させることによって、ＡＣＥ阻害活性（血圧調整機能）を有するクラゲ加工食品およびＡＣＥ阻害物質含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を製造することが可能であり、ＡＣＥ阻害剤は高血圧の予防、改善、及び／又は治療などに有効である。
【０００６】
高血圧に悩む人にとって、薬は有効な働きを持つと共に副作用も心配される。しかし、食品を由来として血圧調整に有効な物質が得られれば、安心して利用することができる。本発明者らは、高血圧に悩む人に、古くから食品として利用されてきたクラゲを由来とした、血圧調整に有効な物質を提供しようと考えた。
【０００７】
また、クラゲは高価な食材とされ、血圧調整に有効なことが証明されても利用する側にとっては、費用面で大きな負担となる。そこで、その有効成分の物質構造を決定し、化学的に合成した安価で優れた医薬が提供されれば、その治療に大きく貢献できるといえよう。
【０００８】
このような観点から、本発明者らは以前より、クラゲを材料に新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定する研究を進めており、既にその研究成果を特開２００６−２６５２４１号公報などにおいて開示している。
本発明は、さらなる新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定すべく上記研究をさらに進めたものであって、その目的は、クラゲタンパク質由来の新規ＡＣＥ阻害物質を単離精製し、その構造を決定すると共に、当該ＡＣＥ阻害物質さらにはそれを利用した食品、又は医薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（１）クラゲタンパク質をペプシン及び／又はパンクレアチンで所定時間加水分解し、その後カラムクロマトグラフィーにより活性画分を分離することによって、強いＡＣＥ阻害活性を有する画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）が得られること、（２）当該画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）にはＡＣＥ阻害活性を有する複数種類のペプチドが含まれ、これらのうち３種類のペプチドを単離精製し、その構造を決定したところ、２種類は３個のアミノ酸、残り１種類は１１個のアミノ酸からなり、いずれも新規のＡＣＥ阻害ペプチドであること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、産業上および医療上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｏ）の発明を包含するものである。
【００１１】
Ａ） 配列表の配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドおよびそのいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドからなる群から選ばれたペプチド。
【００１２】
Ｂ） ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドである、上記Ａ）記載のペプチド。
【００１３】
Ｃ） ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドである、上記Ａ）記載のペプチド。
【００１４】
Ｄ） 以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド（本明細書では、これら（１）〜（３）のペプチドをそれぞれ「ペプチド１〜３」と称する）。
（１）Ｌｅｕ―Ａｌａ―Ｌｅｕ「以下、ペプチド１」
（２）Ｉｌｅ―Ｃｙｓ―Ａｌａ「以下、ペプチド２」
（３）Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ―Ａｓｐ―Ｇｌｙ―Ｈｉｓ―Ａｌａ―Ｔｈｒ―Ｓｅｒ―Ｇｌｎ―Ａｒｇ「以下、ペプチド３」
【００１５】
Ｅ） 上記ペプチド１〜３のいずれかのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
【００１６】
Ｆ） クラゲを原料とし、上記ペプチド１〜３のいずれかのペプチド及び／又は上記Ｅ）記載のいずれかのペプチドを含むペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末。
【００１７】
Ｇ） ペプシンおよびパンクレアチンなどのタンパク質分解酵素によってクラゲタンパク質を加水分解後、ゲルろ過クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いて、加水分解産物からアンギオテンシン変換酵素阻害活性の高い活性画分を分離する工程を含む、上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末の製造方法。
【００１８】
Ｈ） 酵素による加水分解を２０〜６０時間行う、上記Ｇ）記載の製造方法。
【００１９】
Ｉ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
【００２０】
Ｊ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を含有する食品。
【００２１】
Ｋ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する医薬。
【００２２】
Ｌ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する降圧剤。
【００２３】
Ｍ） 上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する健康食品組成物。
【００２４】
Ｎ） 上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有するサプルメント。
【００２５】
Ｏ） 上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する降圧用又は血圧調整用医薬組成物。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のペプチド又は当該ペプチドを含有する濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、ＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防、改善、及び／または治療に有効な機能性食品等の食品、降圧剤等の医薬として利用することができる。ペプチドは化学合成でき、安価に製造可能である。濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、精製工程を省略できるので、天然物から簡便な操作で効率よく得られ、しかも複数のＡＣＥ阻害ペプチドが混合され高収量であるので、機能性食品等の食品に好適に利用することができる。特に、乾燥粉末とすることで、クラゲの特有臭がなくなり、良好な風味が得られるので、調味料などの食品又は食品組成物として好適に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面において、アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。また、アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合、特に明示しなければＬ体を表すものとする。
【００２８】
上述のように、本発明者らは、クラゲタンパク質を加水分解後、カラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分の中から３種類の新規ＡＣＥ阻害ペプチド、即ち下記アミノ酸配列からなるペプチド１〜３を単離精製した。
ペプチド１：ロイシン−アラニン−ロイシン（配列番号１に示される配列）
ペプチド２：イソロイシン−システイン−アラニン（配列番号２に示される配列）
ペプチド３：バリン−プロリン−バリン−アスパラギン酸−グリシン−ヒスチジン−アラニン−スレオニン−セリン−グルタミン−アルギニン（配列番号３に示される配列）
【００２９】
本発明に係るペプチド１〜３は、上記配列情報に基づき市販のペプチド合成機等を使用して簡易かつ安価に化学合成可能であるが、上記ペプチド１〜３を天然物から抽出し、精製することとしてもよい。例えば、クラゲから抽出し、精製する方法の一例について以下説明する。
【００３０】
原料とするクラゲは特に限定されるものではないが、エチゼンクラゲ（Stomolophus nomurai）、ビゼンクラゲ（Rhopilema esculenta）、あるいは東南アジア産又は中国産の食用クラゲ等（例えば、ホワイトタイプ（Lobonema smithi又はLobonema gracilis）、プリギタイプ（Crambione mastigophora）、セミチャイナタイプ（Rhopilema esculentaの近縁種）、チラチャップタイプ（Crambionella属の一種）、キャノンボール（Stomolophus meleagris））が好適なものとして挙げられる。
【００３１】
クラゲを原料に用いてペプチド１〜３を抽出し、精製する工程は、（１）クラゲにタンパク質分解酵素を作用させてクラゲを熟成させる工程、より具体的には、クラゲタンパク質をペプシン及び／又はパンクレアチン等の酵素で所定時間加水分解することによって、ＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製する工程と、（２）カラムクロマトグラフィーを用いて活性画分を分離することによって、ＡＣＥ阻害ペプチドを高濃度に含む画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）を調製し、さらにＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を抽出し、精製する工程とに大別される。
【００３２】
図１を参照して上記（１）の工程例について説明すると、まず、塩漬けされた又は塩漬けされていない生の原料か、乾燥原料を水で戻したクラゲ１ｋｇをギロチンカッターによって適当な大きさに裁断する（ａ１）。次に、ミンチ機で原料クラゲを細かくすりつぶす（ａ２）。これは、後述する熟成工程を均等、且つ、十分に行うために有用な工程である。そして、塩分や特有の臭いを除くために、前記原料クラゲを洗浄機を用いて流水に１晩さらしたり、又は、何度か（例えば８回程度）もみ洗いする（ａ３）。
【００３３】
余分な水分を水切りにて自然落下させて除き（ａ４）、前記ミンチ状のクラゲを小分けして耐熱性のポリ袋に収納する。各ポリ袋に収納されたミンチ状のクラゲの約１．５倍重量の水をそれぞれのポリ袋に加える（ａ５）。次に、ｐＨ調整剤を用いてｐＨを１以上４以下に調整する（ａ６）。ｐＨ調整剤としては、塩酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、等、食品添加物として認められている酸性物質の他、醸造酢等が挙げられる。この工程は、使用する酵素の種類により、中性付近での熟成のため、ｐＨ調整を行わないか、あるいはアルカリ側での処理のため、後のアルカリ性のｐＨ調整剤と順序を逆にして処理することとしてもよい。
【００３４】
タンパク質分解酵素を前記それぞれのポリ袋に収納されたクラゲに対して約１％ずつ添加する（ａ７）。クラゲの分解に用いるタンパク質分解酵素としては、手に入り易く、且つ、人体に悪影響を与えない酵素という意味で、ペプシンおよびパンクレアチン等の動物を由来原料とする動物性タンパク質分解酵素、パパイヤ等の植物を由来原料とする植物性タンパク質分解酵素、ブロメライン等の細菌を由来原料とする細菌性タンパク質分解酵素が挙げられる。このようなタンパク質分解酵素ならば、量の多少はあるもののクラゲを分解してＡＣＥ阻害ペプチドを作り出すことができる。また、複数のタンパク質分解酵素を組み合わせてもよく、たとえばペプシンとパンクレアチン（膵臓からの消化酵素）とを併用することで、より小さなペプチドに分解することができる。
【００３５】
前記タンパク質分解酵素が加えられたクラゲを恒温機内に、温度３０〜５０℃、２時間超（より好ましくは後述のように２０〜６０時間）、保管して熟成させる（ａ８）。この熟成中に、クラゲタンパク質が加水分解されてＡＣＥ阻害ペプチドが生成される。所定時間熟成後、恒温機から熟成クラゲを耐熱性のポリ袋に収納したままの状態で取り出す。熟成クラゲは、液状物と固形物とが混じりあった状態にあり、熟成時間が長くなるほど液状物の割合が増加し、固形物の割合が減少する。
【００３６】
そして、前記熟成クラゲを収納したポリ袋中のタンパク質分解酵素を失活させるために、ポリ袋を沸騰水中で約１０分間加熱する（ａ９）。その後、氷水で強制冷却する（ａ１０）。なお、タンパク質分解酵素の働きを止める方法としては、恒温機内の温度を約１０℃以下にして低温保管することによっても行える。ペプシンには、ｐＨ７付近にすることも有効である。その後、前記ポリ袋内の熟成クラゲを濾過して沈殿物を濾し採り（ａ１１）、あるいは遠心分離後、上澄み液を回収することによりＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製する。
【００３７】
さらに必要に応じて、ｐＨを中性付近に調整するために、この溶液にｐＨ調整剤を加えてもよい（ａ１２）。ｐＨ調整剤としては、苛性ソーダ（ＮａＯＨ）、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム等、食品添加物として認められているアルカリ性の物質が挙げられる。
【００３８】
勿論、上述の工程は種々の改変が可能であり、例えば特開２００２−３７０９９１号公報および特開２００６−２６５２４１号公報に記載される他の方法や、後述の実施例に記載される方法によって、ＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製してもよい。また、ＡＣＥ阻害率およびペプチド濃度ともに高い溶液を調製するため、ペプシン及び／又はパンクレアチンによる加水分解時間は合計で１〜７５時間程度が好ましく、より好ましくは８〜７０時間、さらに好ましくは２０〜６０時間である。後述の実施例においては、反応時間４８〜５８時間の加水分解産物からＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を良好に単離・精製することができたので、加水分解時間は４０〜６０時間程度に設定することが最適と考えられる。
【００３９】
次に、上述の工程により得られたＡＣＥ阻害ペプチド含有液から、カラムクロマトグラフィーを用いてＡＣＥ阻害ペプチドを高濃度に含む画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）を分離し、さらにＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を抽出し、精製する。ペプチド含有組成物およびペプチド１〜３を抽出し、精製する工程は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、又はこれらのＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）システム等を用いたカラムクロマトグラフィーによって行うことが可能であり、複数のカラムを組み合わせて多段階の分画・抽出を行うことが望ましい。
【００４０】
後述の実施例においては、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量の大きさで分離することによって、まずＡＣＥ阻害ペプチドを高濃度に含む画分Ｆ３（ペプチド含有組成物）を分離した。得られたペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末はＡＣＥ阻害活性が高く、そのＡＣＥ５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は０．４８ｍｇ／ｍｌ（ペプチド濃度）であった。このペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末には、本発明の複数のＡＣＥ阻害ペプチドが含まれ、ペプチド濃度が高く不純物が少ないため、機能性食品などに特に有用である。このようなペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末も本発明に含まれる。
【００４１】
なお、ＡＣＥ５０％阻害濃度を算出するためのＡＣＥ阻害活性試験は、例えば以下のような試験手順で行うことができる。出典は「食品中の生体機能調整物質研究法、川岸舜朗編著、学会出版センター、東京（１９９６）」である。
１．基質（Bz-Gly-His-LeuやHip-His-Leu）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）をそれぞれ所定の緩衝液に溶解する。
２．最初に、試料液とアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を混合し放置した後、基質溶液を添加して、３７℃で３０分間作用させる。酵素作用は塩酸を添加して停止する。
３．所定の抽出処理を経て、基質から遊離してくる馬尿酸量を波長２２８ｎｍの吸光度で測定し、試験値とする。
４．試料液の代わりに蒸留水で同様の処理を行った吸光度を、対照値とする。
５．先に塩酸液を添加して酵素の作用をゼロにしたときの吸光度を無作用値とする。
６．ＡＣＥ阻害率は次の式で得られる。
阻害率（％）＝｛（対照値−試験値）／（対照値−無作用値）｝×１００
【００４２】
後述の実施例では、逆相ＨＰＬＣを用いて、上記ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末等から濃度勾配（グラジエント）溶出、さらに必要に応じて一定濃度（アイソクラティック）溶出を行い、ＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を単離精製した。
【００４３】
なお、本発明には、上記ペプチド１〜３のみならず、ペプチド１〜３のアミノ酸配列中の１又は複数（２，３個程度）のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数（２，３個程度）のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＡＣＥ阻害活性を有するペプチドも含まれる。このような改変ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド１〜３のアミノ酸配列と７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の相同性を有していることが好ましい。
【００４４】
また、本発明には上記ペプチド１〜３、又は上述したこれら改変ペプチドの薬理学的に許容される塩も含まれる。このような薬理学的に許容される塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、スルホン酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、などを例示することができる。
【００４５】
本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、ＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防、改善、及び／又は治療に有効な機能性食品等の食品、降圧剤等の医薬あるいはそのリード化合物として利用することができる。また、ＡＣＥ阻害剤は、心臓病（心不全、狭心症、心筋梗塞など）や腎臓病（腎硬化症、糖尿病性腎症など）にも効果があるといわれており、高血圧症以外の疾患治療薬、機能性食品としても利用可能である。
【００４６】
なお、後述の実施例では、アミノ酸配列が既知である他のＡＣＥ阻害ペプチド（下記ペプチド４〜７）もあわせて単離した。
ペプチド４：ＬＡＹ、即ち、ロイシン−アラニン−チロシン（配列番号４）
ペプチド５：ＳＴＫＡＳＧＫＬ、即ち、セリン−スレオニン−リジン−アラニン−セリン−グリシン−リジン−ロイシン（配列番号５）
ペプチド６：ＦＴＡＰＭＮ、即ち、フェニルアラニン−スレオニン−アラニン−プロリン−メチオニン−アスパラギン（配列番号６）
ペプチド７：ＦＧＶＮＰＫＹＴ、即ち、フェニルアラニン−グリシン−バリン−アスパラギン−プロリン−リジン−チロシン−スレオニン（配列番号７）
このうち、ペプチド４（ＬＡＹ）は、クラゲ由来のものとしては新規であった。また、少なくともペプチド１（ＬＡＬ）、ペプチド２（ＩＣＡ）、ペプチド５（ＳＴＫＡＳＧＫＬ）、ペプチド６（ＦＴＡＰＭＮ）は、昇圧ペプチド、アンギオテンシン２の受容体（ＡＴ１受容体）に対し、アンギオテンシン２と拮抗し、拮抗阻害を示した。したがって、これらのペプチドは、アンギオテンシン２受容体拮抗薬としての機能特性を有する可能性がある。このアンギオテンシン２受容体拮抗薬は、降圧剤として副作用が比較的少ないことで注目されている。
【００４７】
本発明のペプチド等を医薬品に用いる場合の一例について説明する。本発明のペプチド等は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、ヒト（または動物）に投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。
【００４８】
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、トレハロース、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明のペプチド等の配合量は特に限定されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００４９】
非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度などに応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明のペプチド等の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００５０】
なお、公知のＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）を利用し、例えば、本発明のペプチド等をリポソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよい。このとき標的部位の細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明のペプチド等を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００５１】
本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を食品（食用組成物）に用いる場合は、各種飲料や各種加工食品の原材料として本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、小麦粉でんぷん、コーンスターチ等の賦形剤や香料、色素等を混合し、ペレット、錠剤、顆粒等に成型加工したり、またゼラチン等でカプセルに充填して健康食品、保健食品やサプリメント等として利用できる。
【００５２】
［製剤例１］カプセル剤
ペプチド１ １０ｍｇ
乳糖 ３５ｍｇ
小麦粉でんぷん ５５ｍｇ
合計 １００ｍｇ
以上の成分を混合し、カプセルに充填し、１００mgのカプセル剤とする。
【００５３】
［製剤例２］錠剤
ペプチド２ ５ｍｇ
乳糖 １５ｍｇ
小麦粉でんぷん ８０ｍｇ
合計 １００ｍｇ
以上の成分を混合し、１００mgの錠剤に成型する。
【００５４】
［製剤例３］顆粒
ペプチド含有濃縮液 ３０ｍｇ
乳糖 ５０ｍｇ
小麦粉でんぷん ５０ｍｇ
コーンスターチ ２０ｍｇ
合計 １５０ｍｇ
以上の成分を混合し、１５０mgの顆粒とする。
【００５５】
［製剤例４］カプセル剤
ペプチド含有濃縮液を凍結乾燥した粉末 ３０ｍｇ
乳糖 ４５ｍｇ
小麦粉でんぷん ２５ｍｇ
合計 １００ｍｇ
以上の成分を混合し、１００mgのカプセル剤とする。
【実施例】
【００５６】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５７】
クラゲタンパク質からＡＣＥ阻害作用を示す新規ペプチド等を、以下のような手順で調製および単離し、抽出して、その構造を決定した。
【００５８】
［１］実験材料と方法
［1-1］クラゲタンパク質の加水分解
材料には、東南アジア近海産のクラゲ（Lobonema Smithii.又は、Lobonemoides Gracilisと推定されるもの）を使用した。このクラゲ２００ｇを包丁で裁断し、２Ｌの蒸留水中に４℃で一晩攪拌し脱塩した。脱塩したクラゲに１Ｌの酢酸バッファー（ｐＨ４．５）を加えた。ワーリングブレンダーで８０００ｒｐｍ、１５分間で破砕した。さらに、ポリトロンで３０分破砕した。試料のロスを防ぐため、酢酸バッファー１００ｍｌで付着した試料を洗浄した。防腐剤として最終濃度０．０２％となるアジ化ナトリウムを加えた。こうして得られたクラゲ懸濁液の１／５００のペプシンを加え３７℃で加水分解反応を行った。
【００５９】
加水分解反応において、０，０．５，１，３，８，２４，４８，７２時間ごとに１５０ｍｌの反応液を取り出し、沸騰水浴で１０分間煮沸して反応をとめた。各反応液について、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上澄みを回収した。この上澄みを液体窒素で凍結して、凍結乾燥させた（東京理化器械株式会社製の凍結乾燥機（ＦＤＵ−８１０型）を使用）。こうして得られた各粉末試料は、加水分解産物として−２０℃で保存された。
【００６０】
また、他の実験では、上記ペプシンによる４８時間の加水分解産物を、パンクレアチンでさらに加水分解した。まず、上記加水分解産物０．３ｇを１２ｍｌのリン酸緩衝液に溶かした。反応中の腐敗を防ぐためにアジ化ナトリウムを０．００３ｇ加え、膵臓破砕物であるパンクレアチン０．３ｇを入れ、反応をスタートさせた。０，２，４，６，８，１０時間ごとに２ｍｌの反応液を取り出し、沸騰水で１０分間煮沸して反応をとめた。各反応液について、１００００ｇで１０分間遠心分離を行い、上澄みを回収した。
【００６１】
［1-2］加水分解産物のゲルろ過
ゲルろ過は、Sephadex G-25（アマシャム バイオサイエンス社製）を充填したカラム（５×９０ｃｍ）を用いた。移動相は０．０５Ｍ酢酸を用い、各粉末試料から調製したサンプル１０ｍｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）をカラムに添加し流速は１０ｍｌ／ｈで溶出した。溶出液は１０ｍｌずつ回収し、２１０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。溶出ピークごとに分けて集め凍結乾燥した。さらに、各ピークのＡＣＥ阻害率を測定し、ＡＣＥ阻害活性を示すピークのＩＣ５０（５０％阻害濃度）を求めた。
【００６２】
パンクレアチン加水分解産物については、Sephadex G-15を充填したカラム（１×１０ｃｍ）を用いてゲルろ過を行った。０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で０．５ｍｌずつ４５本のチューブに溶出液を回収し、２１０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６３】
［1-3］ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いたペプチドの単離精製
カラムは、ナカライテスク社製の5C18-AR-II（４．６×２５０ｍｍ）を使用し、試料は２００μｌ（パンクレアチン加水分解産物の場合は４０μｌ）を注入した。検出波長は２２０ｎｍ、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎであった。移動相としてＡ相を０．１％ＴＦＡを含む１０％アセトニトリル、Ｂ相を０．１％ＴＦＡを含む４５％アセトニトリルとした。３０分でＢの濃度勾配を例えば０〜８５％としたが、他の濃度勾配でもグラジエント溶出を行い、さらに必要に応じてアイソクラティック溶出により単一のペプチドとなるまで精製を繰り返した。また、カラムについても5C18-AR-IIのほかに、5PE-MSを使用した。溶出液を画分ごとに回収して凍結乾燥した。凍結乾燥後、各画分を超純水で溶解し、ＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００６４】
［1-4］ペプチドの配列決定
精製したペプチドをメタノールで処理したＰＶＤＦ膜にプロットし乾燥させ、分析用サンプルを作成した。エドマンによって考案されたフェニルイソシアナート法（ＰＩＴＣ法、エドマン分解）に基づく自動ペプチドシーケンサー（ABI 490 Procise System）を用いて、Ｎ末端からアミノ酸配列を決定した。
【００６５】
［1-5］ＡＣＥ阻害活性およびペプチド濃度の測定方法
（１）ＡＣＥ粗酵素液の調製
ウサギ肺アセトンパウダー（シグマ社製）５ｇに１２０ｍｌの0.1M Na2B4O7バッファー（pH 8.3,0.1M NaCl含有）を加え、４℃で３０分間攪拌した。これを１００００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上澄みをＡＣＥ粗酵素抽出液とした。Bz-Gly-His-Leu（ペプチド研究所製）を基質として用いたＡＣＥ活性測定によって、粗酵素液のＡＣＥ活性の測定のための最適濃度を決定した。１ｍｌ単位で小分けして−２０℃で保存した。
【００６６】
（２）ＡＣＥ阻害活性の測定
試験管に0.1M Na2B4O7バッファー（pH 8.3, 0.1M NaCl）で溶かした基質Bz-Gly-His-Leu（５．８３ｍＭ）１５０μｌを正確にとり、同バッファーで溶かしたペプチド試料（２ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＡＣＥ粗酵素液５０μｌを加え、３７℃で４０分間反応させた。反応は２５０μｌの１Ｎ ＨＣｌを加えて停止させた。次に、正確に１．０ｍｌの酢酸エチルを加えて十分に攪拌後、遠心分離し（３５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、分解物Bz-Glyを抽出した酢酸エチル層を正確に０．３ｍｌ回収した。遠心エバポレーターで酢酸エチルを蒸発除去後、０．３ｍｌ Ｈ2Ｏを加え、攪拌後、２２８ｎｍの吸光度を測定した。同じ手順で試料抜きの対照も同時に測定した。試料の吸光度と対照の吸光度の差のパーセンテージをＡＣＥ活性の阻害率とした。
【００６７】
（３）ペプチド濃度の測定（ＴＮＢＳ法）
試験管にペプチド試料液０．５ｍｌをとり、0.1M Na2B4O7バッファー（pH 9.2, 0.1M NaCl含有）２．０ｍｌ、０．０１Ｍ Na2SO3液０．５ｍｌ、０．１％ ＴＮＢＳ０．５ｍｌを加え、３７℃で１時間反応させた。４２０ｎｍの吸光度を測定した。同時に同じ手順で０〜３５０μＭのリジンおよびアラニンで作成した検量線からペプチド濃度を求めた。
【００６８】
［２］結果
クラゲタンパク質はペプシンによる加水分解で、時間の経過に伴い、ＡＣＥ阻害活性とペプチド濃度とともに増加した。しかし、ＡＣＥ阻害率は４８時間で最高値に達し、それ以降はペプチド濃度の増加に伴い、ＡＣＥ阻害活性が減少した。最も高いＡＣＥ阻害活性を示したのは４８時間の加水分解産物であり、その活性はＩＣ５０＝０．３４ｍｇ／ｍｌであった。そこで以下、この加水分解産物からＡＣＥ阻害率を指標にＡＣＥ阻害ペプチドの単離精製を行った。
【００６９】
ペプシンによる加水分解開始後４８時間の加水分解産物についてSephadex G-25ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。カラムは５×９０ｃｍを用い、移動相は０．０５Ｍ酢酸で、１００ｍｇ／ｍｌの試料を１０ｍｌ添加し流速は１０ｍｌ／ｈで溶出した。溶出液は１画分１０ｍｌずつで回収した。各画分の２１０および２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５つのピーク（Ｆ１〜Ｆ５）に分離した。これら各ピークにおける画分のうち、Ｆ３において高いＡＣＥ阻害活性が認められ、その阻害活性はＩＣ５０＝０．４８ｍｇ／ｍｌであった。この結果から、ピーク画分Ｆ３において、ＡＣＥ阻害活性が高くペプチドを大量に含むペプチド含有濃縮液が調製された。この濃縮液を上記凍結乾燥機を使用して凍結乾燥すると、粉末が得られた。
【００７０】
上記ピーク画分Ｆ３について、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製を進めた。その結果、最終的に画分Ｆ３-７-５-２-１およびＦ３-１５-３-２において、単一のＡＣＥ阻害ペプチドを得ることに成功した。
【００７１】
また、ペプシンで４８時間加水分解後、さらにパンクレアチンで８時間または１０時間加水分解した加水分解産物について、Sephadex G-15ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離の結果、１１本目のチューブにＡＣＥ阻害活性が高く、比活性の高い画分が得られたので、さらにＨＰＬＣによる分離・精製を進めた結果、最終的に画分Ｆ１１-３-３-２において、単一のＡＣＥ阻害ペプチドを得ることに成功した。
【００７２】
上記の画分Ｆ３-７-５-２-１，Ｆ３-１５-３-２，Ｆ１１-３-３-２にそれぞれ単離されたペプチドについて、エドマン分解法によりアミノ酸配列の決定を行った。
【００７３】
その結果、画分Ｆ３-７-５-２-１に含まれるペプチド１のアミノ酸配列は、
「ＬＡＬ」即ち、ロイシン−アラニン−ロイシン（配列番号１）
と決定され、画分１１-３-３-２に含まれるペプチド２のアミノ酸配列は、
「ＩＣＡ」即ち、イソロイシン−システイン−アラニン（配列番号２）
と決定された。
【００７４】
また、画分Ｆ３-１５-３-２に含まれるペプチド３のアミノ酸配列は、
「ＶＰＶＤＧＨＡＴＳＱＲ」即ち、バリン−プロリン−バリン−アスパラギン酸−グリシン−ヒスチジン−アラニン−スレオニン−セリン−グルタミン−アルギニン（配列番号３）
と決定された。
【００７５】
データベースを検索したところ、上記ペプチド１〜３は、ペプチド配列としていずれも新規なものであった。また、ペプチド１（ＬＡＬ）、ペプチド２（ＩＣＡ）のＡＣＥ阻害活性は、それぞれ、ＩＣ５０＝３７μＭ、ＩＣ５０＝１６μＭであった。
【００７６】
さらに、同様の方法でＡＣＥ阻害活性を有すると認められた他のペプチドについて、上記と同様に配列解析を行った結果、アミノ酸配列が既知である他のＡＣＥ阻害ペプチドとして、下記ペプチド４〜７をあわせて単離同定した。
ペプチド４：ＬＡＹ、即ち、ロイシン−アラニン−チロシン（配列番号４）
ペプチド５：ＳＴＫＡＳＧＫＬ、即ち、セリン−スレオニン−リジン−アラニン−セリン−グリシン−リジン−ロイシン（配列番号５）
ペプチド６：ＦＴＡＰＭＮ、即ち、フェニルアラニン−スレオニン−アラニン−プロリン−メチオニン−アスパラギン（配列番号６）
ペプチド７：ＦＧＶＮＰＫＹＴ、即ち、フェニルアラニン−グリシン−バリン−アスパラギン−プロリン−リジン−チロシン−スレオニン（配列番号７）
このうち、ペプチド４（ＬＡＹ）は、クラゲ由来のものとしては新規であった。また、ペプチド４（ＬＡＹ）、ペプチド５（ＳＴＫＡＳＧＫＬ）、ペプチド６（ＦＴＡＰＭＮ）のＡＣＥ阻害活性は、それぞれ、ＩＣ５０＝３．５μＭ、ＩＣ５０＝４４３μＭ、ＩＣ５０＝２４３μＭであった。
【００７７】
さらに解析の結果、少なくともペプチド１（ＬＡＬ）、ペプチド２（ＩＣＡ）、ペプチド５（ＳＴＫＡＳＧＫＬ）、ペプチド６（ＦＴＡＰＭＮ）は、昇圧ペプチド、アンギオテンシン２の受容体（ＡＴ１受容体）に対し、アンギオテンシン２と拮抗し、拮抗阻害を示した。したがって、これらのペプチドは、アンギオテンシン２受容体拮抗薬として作用する可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上のように、本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、ＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防、改善、および／または治療に有効な機能性食品等の食品、降圧剤等の医薬として好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】原料クラゲからＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製する工程を示すフローチャートである。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１：クラゲタンパク質由来新規ペプチド１のアミノ酸配列
配列番号２：クラゲタンパク質由来新規ペプチド２のアミノ酸配列
配列番号３：クラゲタンパク質由来新規ペプチド３のアミノ酸配列
配列番号４：クラゲタンパク質由来ペプチド４のアミノ酸配列
配列番号５：クラゲタンパク質由来ペプチド５のアミノ酸配列
配列番号６：クラゲタンパク質由来ペプチド６のアミノ酸配列
配列番号７：クラゲタンパク質由来ペプチド７のアミノ酸配列
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラゲより見出された新規ペプチドとその用途に関し、より詳細には、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を示す複数の新規ペプチド、これらペプチドを含有するペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末、その製造方法、これらペプチド又はそれらの濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤、これらペプチド又はそれらの濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を包含する機能性食品などの食品やサプルメント、および降圧剤や血圧調整剤などの医薬、その他健康食品組成物、降圧用又は血圧調整用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アンギオテンシン変換酵素（以下、「ＡＣＥ」という。）は、前駆体ペプチドアンギオテンシンＩから活性な昇圧ペプチド、アンギオテンシンIIの生成反応を触媒する。したがって、ＡＣＥの活性を阻害する物質は、降圧剤として高血圧症の予防および／または治療に用いることができる。実際に、ＡＣＥ阻害剤であるカプトプリル等が高血圧症の治療薬として使用されている。また、ＡＣＥ阻害剤は、心臓病（心不全など）や腎臓病（腎硬化症、糖尿病性腎症など）にも効果があると云われており、高血圧症以外の疾患治療薬としても利用可能性を有する。
【０００３】
下記の特許文献１〜３には、豚肉や大豆蛋白に由来するＡＣＥ阻害活性を有するペプチドが開示されている。また、下記の特許文献４には、クラゲにタンパク質分解酵素を作用させてクラゲを熟成させることによって、ＡＣＥ阻害活性（血圧調整機能）を有するクラゲ加工食品およびＡＣＥ阻害物質含有液を製造する方法などが開示されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２１７５８８号公報
【特許文献２】特開２００４−６７５５３号公報
【特許文献３】特開平７−７０１８０号公報
【特許文献４】特開２００２−３７０９９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、クラゲを熟成させることによって、ＡＣＥ阻害活性（血圧調整機能）を有するクラゲ加工食品およびＡＣＥ阻害物質含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を製造することが可能であり、ＡＣＥ阻害剤は高血圧の予防、改善、及び／又は治療などに有効である。
【０００６】
高血圧に悩む人にとって、薬は有効な働きを持つと共に副作用も心配される。しかし、食品を由来として血圧調整に有効な物質が得られれば、安心して利用することができる。本発明者らは、高血圧に悩む人に、古くから食品として利用されてきたクラゲを由来とした、血圧調整に有効な物質を提供しようと考えた。
【０００７】
また、クラゲは高価な食材とされ、血圧調整に有効なことが証明されても利用する側にとっては、費用面で大きな負担となる。そこで、その有効成分の物質構造を決定し、化学的に合成した安価で優れた医薬が提供されれば、その治療に大きく貢献できるといえよう。
【０００８】
このような観点から、本発明者らは以前より、クラゲを材料に新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定する研究を進めており、既にその研究成果を特開２００６−２６５２４１号公報などにおいて開示している。
本発明は、さらなる新規ＡＣＥ阻害ペプチドを同定すべく上記研究をさらに進めたものであって、その目的は、クラゲタンパク質由来の新規ＡＣＥ阻害物質を単離精製し、その構造を決定すると共に、当該ＡＣＥ阻害物質さらにはそれを利用した食品、又は医薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（１）クラゲタンパク質をペプシン及び／又はパンクレアチンで所定時間加水分解し、その後カラムクロマトグラフィーにより活性画分を分離することによって、強いＡＣＥ阻害活性を有する画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）が得られること、（２）当該画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）にはＡＣＥ阻害活性を有する複数種類のペプチドが含まれ、これらのうち３種類のペプチドを単離精製し、その構造を決定したところ、２種類は３個のアミノ酸、残り１種類は１１個のアミノ酸からなり、いずれも新規のＡＣＥ阻害ペプチドであること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、産業上および医療上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｏ）の発明を包含するものである。
【００１１】
Ａ） 配列表の配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドおよびそのいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドからなる群から選ばれたペプチド。
【００１２】
Ｂ） ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドである、上記Ａ）記載のペプチド。
【００１３】
Ｃ） ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドである、上記Ａ）記載のペプチド。
【００１４】
Ｄ） 以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド（本明細書では、これら（１）〜（３）のペプチドをそれぞれ「ペプチド１〜３」と称する）。
（１）Ｌｅｕ―Ａｌａ―Ｌｅｕ「以下、ペプチド１」
（２）Ｉｌｅ―Ｃｙｓ―Ａｌａ「以下、ペプチド２」
（３）Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ―Ａｓｐ―Ｇｌｙ―Ｈｉｓ―Ａｌａ―Ｔｈｒ―Ｓｅｒ―Ｇｌｎ―Ａｒｇ「以下、ペプチド３」
【００１５】
Ｅ） 上記ペプチド１〜３のいずれかのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
【００１６】
Ｆ） クラゲを原料とし、上記ペプチド１〜３のいずれかのペプチド及び／又は上記Ｅ）記載のいずれかのペプチドを含むペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末。
【００１７】
Ｇ） ペプシンおよびパンクレアチンなどのタンパク質分解酵素によってクラゲタンパク質を加水分解後、ゲルろ過クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いて、加水分解産物からアンギオテンシン変換酵素阻害活性の高い活性画分を分離する工程を含む、上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末の製造方法。
【００１８】
Ｈ） 酵素による加水分解を２０〜６０時間行う、上記Ｇ）記載の製造方法。
【００１９】
Ｉ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有するアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
【００２０】
Ｊ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を含有する食品。
【００２１】
Ｋ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する医薬。
【００２２】
Ｌ） 上記Ｄ）又はＥ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する降圧剤。
【００２３】
Ｍ） 上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する健康食品組成物。
【００２４】
Ｎ） 上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有するサプルメント。
【００２５】
Ｏ） 上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載のペプチド、又は上記Ｆ）記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として含有する降圧用又は血圧調整用医薬組成物。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のペプチド又は当該ペプチドを含有する濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、ＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防、改善、及び／または治療に有効な機能性食品等の食品、降圧剤等の医薬として利用することができる。ペプチドは化学合成でき、安価に製造可能である。濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、精製工程を省略できるので、天然物から簡便な操作で効率よく得られ、しかも複数のＡＣＥ阻害ペプチドが混合され高収量であるので、機能性食品等の食品に好適に利用することができる。特に、乾燥粉末とすることで、クラゲの特有臭がなくなり、良好な風味が得られるので、調味料などの食品又は食品組成物として好適に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の好ましい態様について説明する。なお、本明細書および図面において、アミノ酸等を略号で表記する場合、その表記はIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。また、アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合、特に明示しなければＬ体を表すものとする。
【００２８】
上述のように、本発明者らは、クラゲタンパク質を加水分解後、カラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分の中から３種類の新規ＡＣＥ阻害ペプチド、即ち下記アミノ酸配列からなるペプチド１〜３を単離精製した。
ペプチド１：ロイシン−アラニン−ロイシン（配列番号１に示される配列）
ペプチド２：イソロイシン−システイン−アラニン（配列番号２に示される配列）
ペプチド３：バリン−プロリン−バリン−アスパラギン酸−グリシン−ヒスチジン−アラニン−スレオニン−セリン−グルタミン−アルギニン（配列番号３に示される配列）
【００２９】
本発明に係るペプチド１〜３は、上記配列情報に基づき市販のペプチド合成機等を使用して簡易かつ安価に化学合成可能であるが、上記ペプチド１〜３を天然物から抽出し、精製することとしてもよい。例えば、クラゲから抽出し、精製する方法の一例について以下説明する。
【００３０】
原料とするクラゲは特に限定されるものではないが、エチゼンクラゲ（Stomolophus nomurai）、ビゼンクラゲ（Rhopilema esculenta）、あるいは東南アジア産又は中国産の食用クラゲ等（例えば、ホワイトタイプ（Lobonema smithi又はLobonema gracilis）、プリギタイプ（Crambione mastigophora）、セミチャイナタイプ（Rhopilema esculentaの近縁種）、チラチャップタイプ（Crambionella属の一種）、キャノンボール（Stomolophus meleagris））が好適なものとして挙げられる。
【００３１】
クラゲを原料に用いてペプチド１〜３を抽出し、精製する工程は、（１）クラゲにタンパク質分解酵素を作用させてクラゲを熟成させる工程、より具体的には、クラゲタンパク質をペプシン及び／又はパンクレアチン等の酵素で所定時間加水分解することによって、ＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製する工程と、（２）カラムクロマトグラフィーを用いて活性画分を分離することによって、ＡＣＥ阻害ペプチドを高濃度に含む画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）を調製し、さらにＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を抽出し、精製する工程とに大別される。
【００３２】
図１を参照して上記（１）の工程例について説明すると、まず、塩漬けされた又は塩漬けされていない生の原料か、乾燥原料を水で戻したクラゲ１ｋｇをギロチンカッターによって適当な大きさに裁断する（ａ１）。次に、ミンチ機で原料クラゲを細かくすりつぶす（ａ２）。これは、後述する熟成工程を均等、且つ、十分に行うために有用な工程である。そして、塩分や特有の臭いを除くために、前記原料クラゲを洗浄機を用いて流水に１晩さらしたり、又は、何度か（例えば８回程度）もみ洗いする（ａ３）。
【００３３】
余分な水分を水切りにて自然落下させて除き（ａ４）、前記ミンチ状のクラゲを小分けして耐熱性のポリ袋に収納する。各ポリ袋に収納されたミンチ状のクラゲの約１．５倍重量の水をそれぞれのポリ袋に加える（ａ５）。次に、ｐＨ調整剤を用いてｐＨを１以上４以下に調整する（ａ６）。ｐＨ調整剤としては、塩酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、等、食品添加物として認められている酸性物質の他、醸造酢等が挙げられる。この工程は、使用する酵素の種類により、中性付近での熟成のため、ｐＨ調整を行わないか、あるいはアルカリ側での処理のため、後のアルカリ性のｐＨ調整剤と順序を逆にして処理することとしてもよい。
【００３４】
タンパク質分解酵素を前記それぞれのポリ袋に収納されたクラゲに対して約１％ずつ添加する（ａ７）。クラゲの分解に用いるタンパク質分解酵素としては、手に入り易く、且つ、人体に悪影響を与えない酵素という意味で、ペプシンおよびパンクレアチン等の動物を由来原料とする動物性タンパク質分解酵素、パパイヤ等の植物を由来原料とする植物性タンパク質分解酵素、ブロメライン等の細菌を由来原料とする細菌性タンパク質分解酵素が挙げられる。このようなタンパク質分解酵素ならば、量の多少はあるもののクラゲを分解してＡＣＥ阻害ペプチドを作り出すことができる。また、複数のタンパク質分解酵素を組み合わせてもよく、たとえばペプシンとパンクレアチン（膵臓からの消化酵素）とを併用することで、より小さなペプチドに分解することができる。
【００３５】
前記タンパク質分解酵素が加えられたクラゲを恒温機内に、温度３０〜５０℃、２時間超（より好ましくは後述のように２０〜６０時間）、保管して熟成させる（ａ８）。この熟成中に、クラゲタンパク質が加水分解されてＡＣＥ阻害ペプチドが生成される。所定時間熟成後、恒温機から熟成クラゲを耐熱性のポリ袋に収納したままの状態で取り出す。熟成クラゲは、液状物と固形物とが混じりあった状態にあり、熟成時間が長くなるほど液状物の割合が増加し、固形物の割合が減少する。
【００３６】
そして、前記熟成クラゲを収納したポリ袋中のタンパク質分解酵素を失活させるために、ポリ袋を沸騰水中で約１０分間加熱する（ａ９）。その後、氷水で強制冷却する（ａ１０）。なお、タンパク質分解酵素の働きを止める方法としては、恒温機内の温度を約１０℃以下にして低温保管することによっても行える。ペプシンには、ｐＨ７付近にすることも有効である。その後、前記ポリ袋内の熟成クラゲを濾過して沈殿物を濾し採り（ａ１１）、あるいは遠心分離後、上澄み液を回収することによりＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製する。
【００３７】
さらに必要に応じて、ｐＨを中性付近に調整するために、この溶液にｐＨ調整剤を加えてもよい（ａ１２）。ｐＨ調整剤としては、苛性ソーダ（ＮａＯＨ）、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム等、食品添加物として認められているアルカリ性の物質が挙げられる。
【００３８】
勿論、上述の工程は種々の改変が可能であり、例えば特開２００２−３７０９９１号公報および特開２００６−２６５２４１号公報に記載される他の方法や、後述の実施例に記載される方法によって、ＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製してもよい。また、ＡＣＥ阻害率およびペプチド濃度ともに高い溶液を調製するため、ペプシン及び／又はパンクレアチンによる加水分解時間は合計で１〜７５時間程度が好ましく、より好ましくは８〜７０時間、さらに好ましくは２０〜６０時間である。後述の実施例においては、反応時間４８〜５８時間の加水分解産物からＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を良好に単離・精製することができたので、加水分解時間は４０〜６０時間程度に設定することが最適と考えられる。
【００３９】
次に、上述の工程により得られたＡＣＥ阻害ペプチド含有液から、カラムクロマトグラフィーを用いてＡＣＥ阻害ペプチドを高濃度に含む画分（ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末）を分離し、さらにＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を抽出し、精製する。ペプチド含有組成物およびペプチド１〜３を抽出し、精製する工程は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、又はこれらのＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）システム等を用いたカラムクロマトグラフィーによって行うことが可能であり、複数のカラムを組み合わせて多段階の分画・抽出を行うことが望ましい。
【００４０】
後述の実施例においては、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量の大きさで分離することによって、まずＡＣＥ阻害ペプチドを高濃度に含む画分Ｆ３（ペプチド含有組成物）を分離した。得られたペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末はＡＣＥ阻害活性が高く、そのＡＣＥ５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は０．４８ｍｇ／ｍｌ（ペプチド濃度）であった。このペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末には、本発明の複数のＡＣＥ阻害ペプチドが含まれ、ペプチド濃度が高く不純物が少ないため、機能性食品などに特に有用である。このようなペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末も本発明に含まれる。
【００４１】
なお、ＡＣＥ５０％阻害濃度を算出するためのＡＣＥ阻害活性試験は、例えば以下のような試験手順で行うことができる。出典は「食品中の生体機能調整物質研究法、川岸舜朗編著、学会出版センター、東京（１９９６）」である。
１．基質（Bz-Gly-His-LeuやHip-His-Leu）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）をそれぞれ所定の緩衝液に溶解する。
２．最初に、試料液とアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を混合し放置した後、基質溶液を添加して、３７℃で３０分間作用させる。酵素作用は塩酸を添加して停止する。
３．所定の抽出処理を経て、基質から遊離してくる馬尿酸量を波長２２８ｎｍの吸光度で測定し、試験値とする。
４．試料液の代わりに蒸留水で同様の処理を行った吸光度を、対照値とする。
５．先に塩酸液を添加して酵素の作用をゼロにしたときの吸光度を無作用値とする。
６．ＡＣＥ阻害率は次の式で得られる。
阻害率（％）＝｛（対照値−試験値）／（対照値−無作用値）｝×１００
【００４２】
後述の実施例では、逆相ＨＰＬＣを用いて、上記ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末等から濃度勾配（グラジエント）溶出、さらに必要に応じて一定濃度（アイソクラティック）溶出を行い、ＡＣＥ阻害ペプチド１〜３を単離精製した。
【００４３】
なお、本発明には、上記ペプチド１〜３のみならず、ペプチド１〜３のアミノ酸配列中の１又は複数（２，３個程度）のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数（２，３個程度）のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつＡＣＥ阻害活性を有するペプチドも含まれる。このような改変ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド１〜３のアミノ酸配列と７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の相同性を有していることが好ましい。
【００４４】
また、本発明には上記ペプチド１〜３、又は上述したこれら改変ペプチドの薬理学的に許容される塩も含まれる。このような薬理学的に許容される塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、スルホン酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、などを例示することができる。
【００４５】
本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、ＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防、改善、及び／又は治療に有効な機能性食品等の食品、降圧剤等の医薬あるいはそのリード化合物として利用することができる。また、ＡＣＥ阻害剤は、心臓病（心不全、狭心症、心筋梗塞など）や腎臓病（腎硬化症、糖尿病性腎症など）にも効果があるといわれており、高血圧症以外の疾患治療薬、機能性食品としても利用可能である。
【００４６】
なお、後述の実施例では、アミノ酸配列が既知である他のＡＣＥ阻害ペプチド（下記ペプチド４〜７）もあわせて単離した。
ペプチド４：ＬＡＹ、即ち、ロイシン−アラニン−チロシン（配列番号４）
ペプチド５：ＳＴＫＡＳＧＫＬ、即ち、セリン−スレオニン−リジン−アラニン−セリン−グリシン−リジン−ロイシン（配列番号５）
ペプチド６：ＦＴＡＰＭＮ、即ち、フェニルアラニン−スレオニン−アラニン−プロリン−メチオニン−アスパラギン（配列番号６）
ペプチド７：ＦＧＶＮＰＫＹＴ、即ち、フェニルアラニン−グリシン−バリン−アスパラギン−プロリン−リジン−チロシン−スレオニン（配列番号７）
このうち、ペプチド４（ＬＡＹ）は、クラゲ由来のものとしては新規であった。また、少なくともペプチド１（ＬＡＬ）、ペプチド２（ＩＣＡ）、ペプチド５（ＳＴＫＡＳＧＫＬ）、ペプチド６（ＦＴＡＰＭＮ）は、昇圧ペプチド、アンギオテンシン２の受容体（ＡＴ１受容体）に対し、アンギオテンシン２と拮抗し、拮抗阻害を示した。したがって、これらのペプチドは、アンギオテンシン２受容体拮抗薬としての機能特性を有する可能性がある。このアンギオテンシン２受容体拮抗薬は、降圧剤として副作用が比較的少ないことで注目されている。
【００４７】
本発明のペプチド等を医薬品に用いる場合の一例について説明する。本発明のペプチド等は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、ヒト（または動物）に投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤、塗布剤等の非経口剤が挙げられる。
【００４８】
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、トレハロース、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明のペプチド等の配合量は特に限定されるものではなく適宜設定できる。この種の製剤には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００４９】
非経口剤の場合、患者の年齢、体重、疾患の程度などに応じて用量を調節し、例えば、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射などによって投与する。この非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明のペプチド等の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。
【００５０】
なお、公知のＤＤＳ（ドラッグ・デリバリー・システム）を利用し、例えば、本発明のペプチド等をリポソームなどの運搬体に封入して体内投与してもよい。このとき標的部位の細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位に本発明のペプチド等を効率よく運ぶことができ効果的である。
【００５１】
本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を食品（食用組成物）に用いる場合は、各種飲料や各種加工食品の原材料として本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を飲食品に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、小麦粉でんぷん、コーンスターチ等の賦形剤や香料、色素等を混合し、ペレット、錠剤、顆粒等に成型加工したり、またゼラチン等でカプセルに充填して健康食品、保健食品やサプリメント等として利用できる。
【００５２】
［製剤例１］カプセル剤
ペプチド１ １０ｍｇ
乳糖 ３５ｍｇ
小麦粉でんぷん ５５ｍｇ
合計 １００ｍｇ
以上の成分を混合し、カプセルに充填し、１００mgのカプセル剤とする。
【００５３】
［製剤例２］錠剤
ペプチド２ ５ｍｇ
乳糖 １５ｍｇ
小麦粉でんぷん ８０ｍｇ
合計 １００ｍｇ
以上の成分を混合し、１００mgの錠剤に成型する。
【００５４】
［製剤例３］顆粒
ペプチド含有濃縮液 ３０ｍｇ
乳糖 ５０ｍｇ
小麦粉でんぷん ５０ｍｇ
コーンスターチ ２０ｍｇ
合計 １５０ｍｇ
以上の成分を混合し、１５０mgの顆粒とする。
【００５５】
［製剤例４］カプセル剤
ペプチド含有濃縮液を凍結乾燥した粉末 ３０ｍｇ
乳糖 ４５ｍｇ
小麦粉でんぷん ２５ｍｇ
合計 １００ｍｇ
以上の成分を混合し、１００mgのカプセル剤とする。
【実施例】
【００５６】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５７】
クラゲタンパク質からＡＣＥ阻害作用を示す新規ペプチド等を、以下のような手順で調製および単離し、抽出して、その構造を決定した。
【００５８】
［１］実験材料と方法
［1-1］クラゲタンパク質の加水分解
材料には、東南アジア近海産のクラゲ（Lobonema Smithii.又は、Lobonemoides Gracilisと推定されるもの）を使用した。このクラゲ２００ｇを包丁で裁断し、２Ｌの蒸留水中に４℃で一晩攪拌し脱塩した。脱塩したクラゲに１Ｌの酢酸バッファー（ｐＨ４．５）を加えた。ワーリングブレンダーで８０００ｒｐｍ、１５分間で破砕した。さらに、ポリトロンで３０分破砕した。試料のロスを防ぐため、酢酸バッファー１００ｍｌで付着した試料を洗浄した。防腐剤として最終濃度０．０２％となるアジ化ナトリウムを加えた。こうして得られたクラゲ懸濁液の１／５００のペプシンを加え３７℃で加水分解反応を行った。
【００５９】
加水分解反応において、０，０．５，１，３，８，２４，４８，７２時間ごとに１５０ｍｌの反応液を取り出し、沸騰水浴で１０分間煮沸して反応をとめた。各反応液について、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、上澄みを回収した。この上澄みを液体窒素で凍結して、凍結乾燥させた（東京理化器械株式会社製の凍結乾燥機（ＦＤＵ−８１０型）を使用）。こうして得られた各粉末試料は、加水分解産物として−２０℃で保存された。
【００６０】
また、他の実験では、上記ペプシンによる４８時間の加水分解産物を、パンクレアチンでさらに加水分解した。まず、上記加水分解産物０．３ｇを１２ｍｌのリン酸緩衝液に溶かした。反応中の腐敗を防ぐためにアジ化ナトリウムを０．００３ｇ加え、膵臓破砕物であるパンクレアチン０．３ｇを入れ、反応をスタートさせた。０，２，４，６，８，１０時間ごとに２ｍｌの反応液を取り出し、沸騰水で１０分間煮沸して反応をとめた。各反応液について、１００００ｇで１０分間遠心分離を行い、上澄みを回収した。
【００６１】
［1-2］加水分解産物のゲルろ過
ゲルろ過は、Sephadex G-25（アマシャム バイオサイエンス社製）を充填したカラム（５×９０ｃｍ）を用いた。移動相は０．０５Ｍ酢酸を用い、各粉末試料から調製したサンプル１０ｍｌ（１００ｍｇ／ｍｌ）をカラムに添加し流速は１０ｍｌ／ｈで溶出した。溶出液は１０ｍｌずつ回収し、２１０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。溶出ピークごとに分けて集め凍結乾燥した。さらに、各ピークのＡＣＥ阻害率を測定し、ＡＣＥ阻害活性を示すピークのＩＣ５０（５０％阻害濃度）を求めた。
【００６２】
パンクレアチン加水分解産物については、Sephadex G-15を充填したカラム（１×１０ｃｍ）を用いてゲルろ過を行った。０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で０．５ｍｌずつ４５本のチューブに溶出液を回収し、２１０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６３】
［1-3］ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いたペプチドの単離精製
カラムは、ナカライテスク社製の5C18-AR-II（４．６×２５０ｍｍ）を使用し、試料は２００μｌ（パンクレアチン加水分解産物の場合は４０μｌ）を注入した。検出波長は２２０ｎｍ、流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎであった。移動相としてＡ相を０．１％ＴＦＡを含む１０％アセトニトリル、Ｂ相を０．１％ＴＦＡを含む４５％アセトニトリルとした。３０分でＢの濃度勾配を例えば０〜８５％としたが、他の濃度勾配でもグラジエント溶出を行い、さらに必要に応じてアイソクラティック溶出により単一のペプチドとなるまで精製を繰り返した。また、カラムについても5C18-AR-IIのほかに、5PE-MSを使用した。溶出液を画分ごとに回収して凍結乾燥した。凍結乾燥後、各画分を超純水で溶解し、ＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００６４】
［1-4］ペプチドの配列決定
精製したペプチドをメタノールで処理したＰＶＤＦ膜にプロットし乾燥させ、分析用サンプルを作成した。エドマンによって考案されたフェニルイソシアナート法（ＰＩＴＣ法、エドマン分解）に基づく自動ペプチドシーケンサー（ABI 490 Procise System）を用いて、Ｎ末端からアミノ酸配列を決定した。
【００６５】
［1-5］ＡＣＥ阻害活性およびペプチド濃度の測定方法
（１）ＡＣＥ粗酵素液の調製
ウサギ肺アセトンパウダー（シグマ社製）５ｇに１２０ｍｌの0.1M Na2B4O7バッファー（pH 8.3,0.1M NaCl含有）を加え、４℃で３０分間攪拌した。これを１００００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上澄みをＡＣＥ粗酵素抽出液とした。Bz-Gly-His-Leu（ペプチド研究所製）を基質として用いたＡＣＥ活性測定によって、粗酵素液のＡＣＥ活性の測定のための最適濃度を決定した。１ｍｌ単位で小分けして−２０℃で保存した。
【００６６】
（２）ＡＣＥ阻害活性の測定
試験管に0.1M Na2B4O7バッファー（pH 8.3, 0.1M NaCl）で溶かした基質Bz-Gly-His-Leu（５．８３ｍＭ）１５０μｌを正確にとり、同バッファーで溶かしたペプチド試料（２ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＡＣＥ粗酵素液５０μｌを加え、３７℃で４０分間反応させた。反応は２５０μｌの１Ｎ ＨＣｌを加えて停止させた。次に、正確に１．０ｍｌの酢酸エチルを加えて十分に攪拌後、遠心分離し（３５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、分解物Bz-Glyを抽出した酢酸エチル層を正確に０．３ｍｌ回収した。遠心エバポレーターで酢酸エチルを蒸発除去後、０．３ｍｌ Ｈ2Ｏを加え、攪拌後、２２８ｎｍの吸光度を測定した。同じ手順で試料抜きの対照も同時に測定した。試料の吸光度と対照の吸光度の差のパーセンテージをＡＣＥ活性の阻害率とした。
【００６７】
（３）ペプチド濃度の測定（ＴＮＢＳ法）
試験管にペプチド試料液０．５ｍｌをとり、0.1M Na2B4O7バッファー（pH 9.2, 0.1M NaCl含有）２．０ｍｌ、０．０１Ｍ Na2SO3液０．５ｍｌ、０．１％ ＴＮＢＳ０．５ｍｌを加え、３７℃で１時間反応させた。４２０ｎｍの吸光度を測定した。同時に同じ手順で０〜３５０μＭのリジンおよびアラニンで作成した検量線からペプチド濃度を求めた。
【００６８】
［２］結果
クラゲタンパク質はペプシンによる加水分解で、時間の経過に伴い、ＡＣＥ阻害活性とペプチド濃度とともに増加した。しかし、ＡＣＥ阻害率は４８時間で最高値に達し、それ以降はペプチド濃度の増加に伴い、ＡＣＥ阻害活性が減少した。最も高いＡＣＥ阻害活性を示したのは４８時間の加水分解産物であり、その活性はＩＣ５０＝０．３４ｍｇ／ｍｌであった。そこで以下、この加水分解産物からＡＣＥ阻害率を指標にＡＣＥ阻害ペプチドの単離精製を行った。
【００６９】
ペプシンによる加水分解開始後４８時間の加水分解産物についてSephadex G-25ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。カラムは５×９０ｃｍを用い、移動相は０．０５Ｍ酢酸で、１００ｍｇ／ｍｌの試料を１０ｍｌ添加し流速は１０ｍｌ／ｈで溶出した。溶出液は１画分１０ｍｌずつで回収した。各画分の２１０および２８０ｎｍの吸光度を測定した結果、５つのピーク（Ｆ１〜Ｆ５）に分離した。これら各ピークにおける画分のうち、Ｆ３において高いＡＣＥ阻害活性が認められ、その阻害活性はＩＣ５０＝０．４８ｍｇ／ｍｌであった。この結果から、ピーク画分Ｆ３において、ＡＣＥ阻害活性が高くペプチドを大量に含むペプチド含有濃縮液が調製された。この濃縮液を上記凍結乾燥機を使用して凍結乾燥すると、粉末が得られた。
【００７０】
上記ピーク画分Ｆ３について、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製を進めた。その結果、最終的に画分Ｆ３-７-５-２-１およびＦ３-１５-３-２において、単一のＡＣＥ阻害ペプチドを得ることに成功した。
【００７１】
また、ペプシンで４８時間加水分解後、さらにパンクレアチンで８時間または１０時間加水分解した加水分解産物について、Sephadex G-15ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離の結果、１１本目のチューブにＡＣＥ阻害活性が高く、比活性の高い画分が得られたので、さらにＨＰＬＣによる分離・精製を進めた結果、最終的に画分Ｆ１１-３-３-２において、単一のＡＣＥ阻害ペプチドを得ることに成功した。
【００７２】
上記の画分Ｆ３-７-５-２-１，Ｆ３-１５-３-２，Ｆ１１-３-３-２にそれぞれ単離されたペプチドについて、エドマン分解法によりアミノ酸配列の決定を行った。
【００７３】
その結果、画分Ｆ３-７-５-２-１に含まれるペプチド１のアミノ酸配列は、
「ＬＡＬ」即ち、ロイシン−アラニン−ロイシン（配列番号１）
と決定され、画分１１-３-３-２に含まれるペプチド２のアミノ酸配列は、
「ＩＣＡ」即ち、イソロイシン−システイン−アラニン（配列番号２）
と決定された。
【００７４】
また、画分Ｆ３-１５-３-２に含まれるペプチド３のアミノ酸配列は、
「ＶＰＶＤＧＨＡＴＳＱＲ」即ち、バリン−プロリン−バリン−アスパラギン酸−グリシン−ヒスチジン−アラニン−スレオニン−セリン−グルタミン−アルギニン（配列番号３）
と決定された。
【００７５】
データベースを検索したところ、上記ペプチド１〜３は、ペプチド配列としていずれも新規なものであった。また、ペプチド１（ＬＡＬ）、ペプチド２（ＩＣＡ）のＡＣＥ阻害活性は、それぞれ、ＩＣ５０＝３７μＭ、ＩＣ５０＝１６μＭであった。
【００７６】
さらに、同様の方法でＡＣＥ阻害活性を有すると認められた他のペプチドについて、上記と同様に配列解析を行った結果、アミノ酸配列が既知である他のＡＣＥ阻害ペプチドとして、下記ペプチド４〜７をあわせて単離同定した。
ペプチド４：ＬＡＹ、即ち、ロイシン−アラニン−チロシン（配列番号４）
ペプチド５：ＳＴＫＡＳＧＫＬ、即ち、セリン−スレオニン−リジン−アラニン−セリン−グリシン−リジン−ロイシン（配列番号５）
ペプチド６：ＦＴＡＰＭＮ、即ち、フェニルアラニン−スレオニン−アラニン−プロリン−メチオニン−アスパラギン（配列番号６）
ペプチド７：ＦＧＶＮＰＫＹＴ、即ち、フェニルアラニン−グリシン−バリン−アスパラギン−プロリン−リジン−チロシン−スレオニン（配列番号７）
このうち、ペプチド４（ＬＡＹ）は、クラゲ由来のものとしては新規であった。また、ペプチド４（ＬＡＹ）、ペプチド５（ＳＴＫＡＳＧＫＬ）、ペプチド６（ＦＴＡＰＭＮ）のＡＣＥ阻害活性は、それぞれ、ＩＣ５０＝３．５μＭ、ＩＣ５０＝４４３μＭ、ＩＣ５０＝２４３μＭであった。
【００７７】
さらに解析の結果、少なくともペプチド１（ＬＡＬ）、ペプチド２（ＩＣＡ）、ペプチド５（ＳＴＫＡＳＧＫＬ）、ペプチド６（ＦＴＡＰＭＮ）は、昇圧ペプチド、アンギオテンシン２の受容体（ＡＴ１受容体）に対し、アンギオテンシン２と拮抗し、拮抗阻害を示した。したがって、これらのペプチドは、アンギオテンシン２受容体拮抗薬として作用する可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上のように、本発明のペプチド又はその含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末は、ＡＣＥ阻害活性を有するため、高血圧の予防、改善、および／または治療に有効な機能性食品等の食品、降圧剤等の医薬として好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】原料クラゲからＡＣＥ阻害ペプチド含有液を調製する工程を示すフローチャートである。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１：クラゲタンパク質由来新規ペプチド１のアミノ酸配列
配列番号２：クラゲタンパク質由来新規ペプチド２のアミノ酸配列
配列番号３：クラゲタンパク質由来新規ペプチド３のアミノ酸配列
配列番号４：クラゲタンパク質由来ペプチド４のアミノ酸配列
配列番号５：クラゲタンパク質由来ペプチド５のアミノ酸配列
配列番号６：クラゲタンパク質由来ペプチド６のアミノ酸配列
配列番号７：クラゲタンパク質由来ペプチド７のアミノ酸配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドおよびそのいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドからなる群から選ばれたペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
（１）Ｌｅｕ―Ａｌａ―Ｌｅｕ
（２）Ｉｌｅ―Ｃｙｓ―Ａｌａ
（３）Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ―Ａｓｐ―Ｇｌｙ―Ｈｉｓ―Ａｌａ―Ｔｈｒ―Ｓｅｒ―Ｇｌｎ―Ａｒｇ
【請求項５】
請求項４記載のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
【請求項６】
クラゲを原料とし、請求項４記載のいずれかのペプチド及び／又は請求項５記載のいずれかのペプチドを含む、ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末。
【請求項７】
ペプシンおよびパンクレアチンなどのタンパク質分解酵素によってクラゲタンパク質を加水分解後、ゲルろ過クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いて、加水分解産物からアンギオテンシン変換酵素阻害活性の高い活性画分を分離し、得られる濃縮液を凍結乾燥する工程を含む、請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末の製造方法。
【請求項８】
酵素による加水分解を２０〜６０時間行う、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含するアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項１０】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を包含する食品。
【請求項１１】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する医薬。
【請求項１２】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する降圧剤。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する健康食品組成物。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含するサプルメント。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する降圧用又は血圧調整用医薬組成物。
【請求項１】
配列表の配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドおよびそのいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドからなる群から選ばれたペプチド。
【請求項２】
ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに示されるペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、配列番号１〜３のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
以下の（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
（１）Ｌｅｕ―Ａｌａ―Ｌｅｕ
（２）Ｉｌｅ―Ｃｙｓ―Ａｌａ
（３）Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ｖａｌ―Ａｓｐ―Ｇｌｙ―Ｈｉｓ―Ａｌａ―Ｔｈｒ―Ｓｅｒ―Ｇｌｎ―Ａｒｇ
【請求項５】
請求項４記載のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に１又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
【請求項６】
クラゲを原料とし、請求項４記載のいずれかのペプチド及び／又は請求項５記載のいずれかのペプチドを含む、ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末。
【請求項７】
ペプシンおよびパンクレアチンなどのタンパク質分解酵素によってクラゲタンパク質を加水分解後、ゲルろ過クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いて、加水分解産物からアンギオテンシン変換酵素阻害活性の高い活性画分を分離し、得られる濃縮液を凍結乾燥する工程を含む、請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末の製造方法。
【請求項８】
酵素による加水分解を２０〜６０時間行う、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含するアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項１０】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を包含する食品。
【請求項１１】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する医薬。
【請求項１２】
請求項４又は５に記載のいずれかのペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する降圧剤。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する健康食品組成物。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含するサプルメント。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項６記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する降圧用又は血圧調整用医薬組成物。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２０８０９６（Ｐ２００８−２０８０９６Ａ）
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４８２９４（Ｐ２００７−４８２９４）
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【出願人】（５０００９８４５９）株式会社かね徳 (2)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２８日（２００７．２．２８）
【出願人】（５０００９８４５９）株式会社かね徳 (2)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【Ｆターム（参考）】
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