本明細書は、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び増大したクロストリジウム毒素の結合ドメインを含む修飾クロストリジウム毒素、かかる修飾クロストリジウム毒素をコードするポリヌクレオチド分子及びかかる修飾クロストリジウム毒素の生産方法を開示している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ） クロストリジウム毒素の中毒過程の酵素標的修飾段階を行うことができるクロストリジウム毒素の酵素ドメイン、
ｂ） クロストリジウム毒素の中毒過程の転座段階を実行する能力をもつクロストリジウム毒素の転座ドメイン、
ｃ） グルカゴン様ホルモン、神経ホルモン、神経調節サイトカイン、ニューロトロフィン、成長因子、軸索ガイダンスシグナル伝達分子、糖結合タンパク質、ニューレキシンに選択的に結合するリガンド、ニューレキシン−２αのためのリガンド、ニューレキシン−２βのためのリガンド、ニューレキシン−３αのためのリガンド、ニューレキシン−３βのためのリガンド、ＷＮＴ、Ｎｇ−ＣＡＭ（Ｌ１）、ＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、アグリン−ＭＵＳＫ、基底膜ポリペプチド、及び上述のポリペプチドのいずれかの変異体からなる群から選択されたポリペプチドを含み、クロストリジウム毒素の中毒過程の細胞結合段階を行うことができる、標的ドメイン、
ｄ） プロテアーゼ切断部位、
を含む修飾クロストリジウム毒素であって、
プロテアーゼ切断部位が修飾クロストリジウム毒素の単鎖形態を二重鎖形態へと転換させている、修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の転座ドメイン及び標的ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項３】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位、標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項４】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、標的ドメイン、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項５】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、標的ドメイン、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン、プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素の転座ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項６】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位、クロストリジウム毒素の酵素ドメイン及び標的ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項７】
アミノからカルボキシルまでの単一ポリペプチドの線形順序で、クロストリジウム毒素の転座ドメイン、プロテアーゼ切断部位、標的ドメイン及びクロストリジウム毒素の酵素ドメインを含む、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項８】
クロストリジウム毒素の酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン及びＴｅＮＴ酵素ドメインからなる群から選択されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項９】
クロストリジウム毒素の転座ドメインがＢｏＮＴ／Ａ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ転座ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ転座ドメイン、及びＴｅＮＴ転座ドメインからなる群から選択されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１０】
プロテアーゼ切断部位が内因性クロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位又は外因性切断部位である、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１１】
内因性クロストリジウム毒素の二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位が、ＢｏＮＴ／Ａ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位及びＴｅＮＴ二重鎖ループのプロテアーゼ切断部位からなる群から選択されている、請求項１に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１２】
外因性プロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼ切断部位、トロンビン切断部位、Ｘａ因子切断部位、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、タバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位、ジペプチジルアミノペプチダーゼ切断部位、低分子量のユビキチン類似因子（ＳＵＭＯ）／ユビキチン様タンパク質−１（ＵＬＰ−１）プロテアーゼ切断部位及びクロストリジウム毒素基質切断部位からなる群から選択されている、請求項１０に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１３】
クロストリジウム毒素基質切断部位が、ＢｏＮＴ／Ａ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｂ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｃ１基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｄ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｅ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｆ基質切断部位、ＢｏＮＴ／Ｇ基質切断部位及びＴｅＮＴ基質切断部位からなる群から選択されている、請求項１２に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１４】
標的ドメインが、セクレチン、グルカゴン様ペプチド、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、グリセンチン、グリセンチン関連ポリペプチド、オキシントモジュリン、血管活性腸管ペプチド、胃抑制ポリペプチド、カルシトニン関連ペプチド内臓消化管ペプチド、及び上述のグルカゴン様ホルモンのいずれかの変異体からなる群から選択されたグルカゴン様ホルモンを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１５】
標的ドメインが、コルチコトロピン−放出ホルモン（ＣＣＲＨ）及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）及び上述の神経ホルモンのいずれかの変異体からなる群から選択された神経ホルモンを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１６】
標的ドメインが、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリコホリン−Ａ（ＧＰＡ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、オノスタチンＭ、カルディオトロフィン-１（ＣＴ−１）、カルディオトロフィン様サイトカイン（ＣＬＣ）、ニューロロイキン、ＶＥＧＦ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び上述の神経調節サイトカインのいずれかの変異体からなる群から選択された神経調節サイトカインを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１７】
標的ドメインが、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４／５（ＮＴ４／５）及び上述のニューロトロフィンのいずれかの変異体からなる群から選択されたニューロトロフィンを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１８】
標的ドメインが、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、パーセフリン、アルテミン、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）ポリペプチド、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長及び分化因子（ＧＤＦ）、アクチビン、及び上述の成長因子のいずれかの変異体からなる群から選択された成長因子を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項１９】
標的ドメインが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ４及び上述のＴＧＦβのいずれかの変異体からなる群から選択されたＴＧＦβポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２０】
標的ドメインが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ１０及び上述のＢＭＰのいずれかの変異体からなる群から選択されたＢＭＰを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２１】
標的ドメインが、ＧＤＦ１、ＧＤＦ２、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５及び上述のＧＤＦのいずれかの変異体からなる群から選択されたＧＤＦを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２２】
標的ドメインが、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、インヒビンＡ、及び上述のポリペプチドのいずれかの変異体からなる群から選択されたポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２３】
標的ドメインが、血清アミロイドＰ、β−グルカナーゼ、シアリダーゼ、レクチン、クライア（ｃｒｙｉａ）、殺虫性デルタ内毒素、アグルチニン、アブリン、リシン、及び上述の糖結合タンパク質のいずれかの変異体からなる群から選択された糖結合タンパク質を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２４】
標的ドメインが、ニューレキシン−１α、ニューレキシン−１β、ニューレキシン−２α、ニューレキシン−２β、ニューレキシン−３α、ニューレキシン−３β及び上述のニューレキシンのいずれかの変異体からなる群から選択されたポリペプチドを結合するリガンドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２５】
標的ドメインが、ラミニンβ−２及びその変異体からなる群から選択されたポリペプチドを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾クロストリジウム毒素。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリヌクレオチドを１つの細胞内で発現させる段階を含む修飾クロストリジウム毒素の生産方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】


【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【公表番号】特表２００８−５３５４８６（Ｐ２００８−５３５４８６Ａ）
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０２１１４（Ｐ２００８−５０２１１４）
【出願日】平成１８年３月１４日（２００６．３．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００９８３１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９９５９０
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５９１０１８２６８）アラーガン、インコーポレイテッド (293)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＬＥＲＧＡＮ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】