クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法
【課題】高いウイルス吸着性能と高流速性能とを満足するクロマトグラフィー用充填剤、および当該クロマトグラフィー用充填剤を用いたウイルス用ワクチンの製造方法の提供。
【解決手段】移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖が結合しているクロマトグラフィー用充填剤。
【解決手段】移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖が結合しているクロマトグラフィー用充填剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の動物、昆虫細胞や微生物を宿主として製造されるバイオ製剤の伸張が近年著しい。バイオ製剤の生産性は、大容量発酵、高力価発酵により向上しており、それに伴い精製工程も効率化が求められている。特に、クロマトグラフィーを用いたバイオ製剤の製造は、細胞培養法による製造の精製プロセスとして注目されており、精製に使用されるクロマトグラフィー用充填剤には、コスト削減につながる高流速化や高吸着化が望まれている。
【０００３】
ウイルス疾病予防に対するワクチンの製造分野においても、従来法に代わる新しい製造法が検討されている。例えば、インフルエンザワクチンの製造分野では、従来の鶏卵法に比べ短期に製品提供ができる利点をもつ細胞培養法が鋭意検討されている。このようなウイルス培養のプロセスの変更に伴い、精製プロセスについても新しい検討が行われている。特に、クロマトグラフィー法は、高純度の製剤を簡便に製造できる手法として注目されている。
例えば、非特許文献１（Biotechnology and Bioengineering 96 (2006)、932-944）は、ＭＤＣＫ細胞培養由来のインフルエンザウイルスの陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製について報告している。非特許文献２（J. Biotechnology 13 (2007)、309-317）は、レクチンのアフィニティー特性を利用したＭＤＣＫ細胞培養由来のインフルエンザウイルスのクロマトグラフィーによる吸着について報告している。また、特許文献１（特表平１１−５１０５１号公報）は、Ｖｅｒｏ細胞由来の日本脳炎ウイルスクロマトグラフィー法による工業的製造法の例を開示している。
【０００４】
ウイルスの吸着や精製の分野において、硫酸化多糖を利用する試みが鋭意検討されている。例えば、特許文献２（特開昭６１−４７１８６号公報）ではインフルエンザウイルスの精製に、特許文献３（特開昭６１−４７１８５号公報）では日本脳炎ウイルスの精製に、クロロスルホン酸を用いてセルロース粒子を硫酸エステル化（以下「硫酸化」と言うことがある）した硫酸化セルロースをクロマトグラフィー用ゲルとして利用することが開示されている。
このような硫酸化セルロースは、特許文献４（欧州特許出願公開第１８０８６９７号パンフレット）においてもクロマトグラフィー用充填剤として、細胞培養由来のインフルエンザウイルス粒子の濃縮に利用されている。この文献においては、排除限界分子量が２０００〜４０００Ｄａの細孔性をもつセルロース粒子として硫酸エステル基を活性基にもつチッソ社製セルファインサルフェートが用いられている。
さらに、特許文献５（国際公開第２００８−１２５３６１号パンフレット）では、セルロース膜の一部をクロロスルホン酸にて硫酸エステル化した膜を用いて、細胞培養由来のインフルエンザウイルス粒子を精製した例が開示されている。また、特許文献６（特表平９−５０３１２３号公報）は、硫酸化多糖の硫酸基導入量が１ｇあたり６μモル程度に制御された、エンベロープ型ウイルスの吸着に好適なゲルの製造法について開示している。
【０００５】
また、粒子の表面に多糖を担持させることによりウイルス吸着に好適な材料の開発も進められている。例えば、特許文献７（特開平７−２８９８９１号公報）では、デキストラン硫酸を多孔性のポリプロピレン膜に結合させることで、ＨＩＶを好適に吸着する材料の例が開示されている。
また、特許文献８（米国特許第６５３７７９３号公報）では、アガロース粒子に柔軟なデキストランアームを付与し、さらにイオン交換基を導入したクロマトグラフィー用充填剤によるアデノウイルスの分離例が開示されている。
また、特許文献９（国際公開第２００８−０３９１３６号公報）においても、硫酸化されたデキストラン繊維をアガロース粒子に付与させたインフルエンザウイルス精製用のクロマトグラフィー用充填剤の開発が報告されている。さらに、該充填剤を用いると、ワクチンの製剤化の際に問題となる宿主細胞由来の核酸とインフルエンザウイルス用ウイルスの分離性を高めることできるとしている。
さらに、特許文献１０（特開２００１−１９０２７３号報）においては、ポリスチレン粒子に水不溶性硫酸化多糖を結合させたウイルス濃縮用粒子が報告されている。
【０００６】
上記の引用例のように、硫酸化多糖、特に硫酸化セルロースはＨＩＶやインフルエンザウイルスなどのエンベロップ保有型ウイルスの精製、濃縮分野において利用価値が高い。例えば、クロロスルホン酸などの適当な硫酸化試薬を用いてセルロース粒子に硫酸を導入して得られる硫酸化セルロース粒子は、チッソ株式会社から商標名セルファインサルフェートとして販売されている。このセルファインサルフェートはクロマトグラフィー用充填剤として有用であり、参考文献３において種々のウイルスへの吸着性能が評価されており、また、実際にインフルエンザウイルスの精製分野で実用化されている。
【０００７】
しかしながら、セルロース粒子への直接的な硫酸基の導入は、硫酸基による親水化のためにセルロース粒子の軟化を伴うことから、クロマトグラフィーにおいて最も重要な特性の１つである流速特性の低下をもたらす。従って、硫酸基の導入については上限があった。
また、特許文献５の比較例でも示されているように、インフルエンザウイルスの株によっては十分な吸着能力が得られない可能性が指摘されている。インフルエンザウイルスはＨ型、Ｎ型の違いとその組合せにより多種多様なウイルス株が存在する。したがって、インフルエンザワクチンの製造においては、ウイルスの培養状態が株毎に異なり、ワクチンの精製プロセスや条件も株毎に検討する必要に迫られると予想される。ウイルス吸着性能が改善されたクロマトグラフィー用充填剤であれば一定レベルの吸着を担保できることから、個別のプロセス検討といった煩雑性の低減につながることが予想される。
さらに、近年、従来の発育鶏卵にかわる新しい培養細胞を用いたワクチン製造方法が実施されており、ワクチンメーカーからは、宿主細胞由来のタンパク質や核酸を除去した、より純度の高い目的物の取得が望まれている。このように、ワクチン製造に利用されるクロマトグラフィー用充填剤についても、より高い選択性が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１１−５１０５１号公報
【特許文献２】特開昭６１−４７１８６号公報
【特許文献３】特開昭６１−４７１８５号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第１８０８６９７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００８−１２５３６１号パンフレット
【特許文献６】特表平９−５０３１２３号公報
【特許文献７】特開平７−２８９８９１号公報
【特許文献８】米国特許第６５３７７９３号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００８−０３９１３６号パンフレット
【特許文献１０】特開２００１−１９０２７３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biotechnology and Bioengineering 96 (2006)、932-944
【非特許文献２】J. Biotechnology 13 (2007)、309-317
【非特許文献３】Bio/technology11（1993）、173-178
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、硫酸エステル基をリガントとし、吸着性能や流速性能が改善されたウイルス吸着用クロマトグラフィー用充填剤を提供することである。本発明のもう一つの目的は、本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いたウイルス用ワクチン、特にインフルエンザウイルス用ワクチンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記従来技術の課題について鋭意研究を重ねた。その結果、移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖を結合させることにより、吸着性能や流速性能が改善されたクロマトグラフィー用充填剤が得られることを見出した。また、このクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製する工程を含むウイルス用ワクチンの製造方法であれば、宿主由来の核酸（ＤＮＡ）等の不純物の、クロマトグラフィー用充填剤への吸着を低減させることが可能となり、非常に効率よくインフルエンザウイルス用ワクチンが得られることを知見した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下に示したとおりのクロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法等を提供するものである。
【００１３】
本発明は以下の構成を有する。
［１］移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖が結合しているクロマトグラフィー用充填剤。
［２］多孔性粒子と硫酸化多糖が２以上の官能基を有する架橋剤により架橋されている、前記第１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［３］多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、前記第１項または第２項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［４］多孔性粒子がセルロース粒子である、前記第１項〜第３項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［５］硫酸化多糖の極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、前記第１項〜第４項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［６］硫酸化多糖が硫酸化セルロース、硫酸化デキストラン、および硫酸化プルランから選ばれた１種以上である、前記第１項〜第５項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
「７」２以上の官能基を有する架橋剤が少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤である、前記第２項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［８］少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤がエピクロロヒドリンである、前記第７項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［９］硫黄含有割合が０．２〜６重量％の範囲である、前記第１項〜第８項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤
［１０］下記工程を有することを特徴とする前記第２項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
工程１：多孔性粒子と多糖を２以上の官能基を有する架橋剤により架橋し多糖結合多孔性粒子を得る。
工程２：工程１で得られた多糖結合多孔性粒子を硫酸化試薬と反応させて多糖を硫酸化する。
［１１］多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、前記第１０項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１２］多孔性粒子がセルロース粒子である、前記第１０項または第１１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１３］多糖が水溶性多糖であり、その極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、前記第１０項〜第１２項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１４］多糖がデキストランおよびプルランから選ばれた１種以上である、前記第１０項〜第１３項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１５］下記一般式（１）で表される前記第１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｚ 式（１）
（式（１）において、Ｘは平均粒子径が４０〜１２０μｍの範囲であるセルロース粒子であり、Ｘに結合しているＯはセルロースの水酸基由来の酸素であり、Ｚは硫酸化セルロースであり、Ｚに結合しているＣは硫酸化セルロース還元末端のアルデヒド由来の炭素である。）
［１６］硫酸化セルロースが、その硫黄含有割合が１５重量％以上であり、１重量％水溶液の粘度が１５〜３００ＭＰａ／ｓｅｃ・２０℃の範囲である、前記第１５項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１７］前記第１項〜第９項、前記第１５項および前記第１６項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製することを特徴とする、ウイルス用ワクチンの製造方法。
［１８］ＤＮＡのクロマトグラフィー用充填剤への吸着が抑制された、前記第１７項に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
［１９］ウイルス粒子がインフルエンザウイルスである、前記第１７項または第１８項に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、高いウイルス吸着性能と高流速性能とを満足するクロマトグラフィー用充填剤が得られる。さらには、本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製する工程を含む、ウイルス用ワクチンの製造方法であれば、非常に効率よくウイルス用ワクチンが得られ、インフルエンザウイルス用ワクチンにおいては特に高い分離精製効率が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ワクチンの製造プロセスを示す図である。
【図２】図２は、標準ポリエチレングリコールと市販セルロース粒子ＧＨ２５とのＫａｖの関係を示す図である。
【図３】図３は、結合反応２Ａの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、硫酸化多糖と所定の粒径と細孔径をもつ多孔性粒子とが結合した複合体である。
硫酸化多糖は、多孔性粒子の何れの部位に結合していてもよいが、より高いウイルス分離精製能を求める場合、多孔性粒子の細孔内ではなく、粒子表面において結合していることが好ましい。
多孔性粒子における細孔径や硫酸化多糖の分子量や極限粘度の選択によって硫酸化多糖を多孔性粒子表面に効率よく配置できる。その結果、ウイルス粒子の結合に必要な硫酸基を粒子表面に効率よく導入することができる。本発明者らは、このようにしてリガンドとなる硫酸エステル基の密度を高めた結果、インフルエンザウイルスに代表されるウイルスを好適に吸着することができると考えている。
すなわち、本発明においては、多孔性粒子とその排除限界以上の分子量または極限粘度をもつ硫酸化多糖とを組み合わせることが好ましく、さらには、細孔の小さい多孔性粒子と分子量または極限粘度の大きい硫酸化多糖を組み合わせることが一層好ましい。また、硫酸基の導入量の制御によってもウイルス、特にインフルエンザウイルスの吸着性能を改善することができる。また、宿主由来の核酸やタンパク質などの不純物の影響を受けにくくするためには、リガンドである硫酸基の密度を高めることが効果的である。
【００１７】
本発明において多孔性粒子と硫酸化多糖との結合反応は特に限定されるものではない。まず、硫酸化セルロース（硫酸化多糖）の還元末端を利用してセルロース粒子（多孔性粒子）に結合させる場合（以下「結合反応１」と言うことがある）を例にとって以下に詳述する。
硫酸化セルロースのセルロース粒子への付加反応では、セルロース粒子にアミノ基を導入した後、中性もしくは弱アルカリ性の水溶液中で硫酸化セルロースと混合し、シッフ塩基を形成させ、ついでジメチルアミンボランなどの還元剤で還元させる方法が好適である。
【００１８】
セルロース粒子へのアミノ基の導入は、例えば、セルロース粒子をエピクロロヒドリンなどとアルカリ条件下で反応させた後、これとアンモニア水を反応させることで可能である。これらの方法は、Hermasonら著のImmobilized Affinity Ligand Techniques (Academic Press Inc.1992年) などに記載されている。
【００１９】
これらの方法によって得られる、本発明において特に好ましいクロマトグラフィー用充填剤の一態様は、下記一般式（１）で表されるものである。
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｚ 式（１）
式（１）において、Ｘは平均粒子径が４０〜１２０μｍの範囲であるセルロース粒子であり、Ｘに結合しているＯはセルロースの水酸基由来の酸素であり、Ｚは硫酸化セルロースであり、Ｚに結合しているＣは硫酸化セルロース還元末端のアルデヒド由来の炭素である。
【００２０】
Ｘと結合しているＯ（酸素）は、下記反応式（１）の通りエピクロロヒドリンの付加反応を経てアンモニア水によってアミノ化される。その後、アミノ基と硫酸化セルロースの還元末端Ｘと反応させ、シッフ塩基を形成させた後、例えば、ジメチルアミノボランなどの還元剤で安定化することができる。
反応式（１）
一般式（１）で表されるクロマトグラフィー用充填剤は、ウイルス粒子と結合できる性質を有する硫酸化セルロースが、セルロース粒子の表面から還元末端を基点としブラシ状に結合していると推定できる。このように結合した硫酸化セルロース繊維は末端固定のため、自由度が高く、ウイルス粒子、特にインフルエンザウイルス粒子との結合（認識）に優れた効果が期待できる。
【００２１】
次いで、本発明において好ましいもう一つの結合反応について説明する。それは２以上の官能基を有する架橋剤による多孔性粒子と硫酸化多糖との結合である（以下「結合反応２」と言うことがある）。この結合は、多孔性粒子と多糖とを結合させ複合体とした後、この複合体を硫酸化剤を用いて硫酸化すること（以下「結合反応２Ａ」と言うことがある）により達成されてもよく、多孔性粒子と硫酸化多糖を結合させること（以下「結合反応２Ｂ」と言うことがある）により達成されてもよい。本発明においては硫酸化多糖が高価なものであるため、より安価な製造が期待できることから結合反応２Ａが好ましい。さらに、結合反応２Ａにおいては、担体となる多孔性粒子が硫酸化される粒子である場合、多孔性粒子にも硫酸基を導入できる。本発明においては、結合反応２Ｂに較べ硫酸エステル基導入の制御が容易できることからも結合反応２Ａが好ましい。
【００２２】
なお、多孔性粒子と多糖あるいは硫酸化多糖との結合においては、グリシジル基の反応性を利用するため、溶媒中、アルカリの存在下において行うことが好ましい。特に、多糖が水溶性である場合は、アルカリの存在下において行うことが好ましい。
【００２３】
以下結合反応２Ａについて、多糖が水溶性多糖であり多孔性粒子がセルロースである場合を例に詳しく説明する。架橋剤は２以上の官能基を有する架橋剤であれば何れの架橋剤を用いてもよく、アルカリ水溶液中でセルロース粒子に活性基を導入し、その後導入された活性基と水溶性多糖を反応させることで水溶性多糖結合セルロース粒子（複合体）を得ることができる。アルカリとしては水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどが安価で使いやすく、残留しにくい点において好適であり、特に、水酸化ナトリウムが好適である。その際溶媒は水を用いることが好ましい。
【００２４】
本発明に用いる架橋剤は、多官能のものであれば何れの架橋剤であっても用いることができるが、セルロースとの結合が化学的に安定である点、あるいは非特異的吸着防止の観点から、窒素や硫黄などのヘテロ原子をもたないものや、疎水性を示す２重結合や中長鎖アルキル基などを持たないものが好ましい。このような架橋剤の例として、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンなどのハロゲンとグリシジル基をもつ多官能型架橋剤や、アリルグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテルなどのグリシジルエーテル系架橋剤があげられる。そのなかでもエピクロロヒドリンは分子量も小さく、安価で、反応性が高いことから特に好ましく用いることができる。なお、反応効率を上げるために反応混合物中に硫酸ナトリウムなどの無機塩を共存させてもよい。
【００２５】
また、特開昭６０−７７７６９号公報には、多孔性セルロース粒子に水溶性多糖を結合させる方法として、架橋セルロース粒子にエピクロロヒドリンを反応させてエポキシ基を導入し、これにデキストランやプルランなどの多糖を反応させることにより、セルロース粒子にそれら多糖を結合させることが開示されており、本発明においてはこの方法を採用することができる。
【００２６】
上記のようにして得られた水溶性多糖結合セルロース粒子の多糖への硫酸エステル基の付与は、クロロスルホン酸−ピリジン錯体、無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体などの硫酸化試薬と水溶性多糖結合セルロース粒子とを反応させることにより達成される。具体的には、米国特許第４，４８０，０９１号パンフレットや特開２００６−２７４２４５号公報などに開示の通常知られた方法、即ち、ジメチルホルムアミドやピリジンなどの溶媒中で無水硫酸やクロルスルホン酸を反応させ錯体を形成させて、水溶性多糖結合セルロース粒子を硫酸化させる方法が利用できる。
【００２７】
硫酸化試薬の使用割合は、目的とする粒子の硫黄含有率や反応条件に従って異なるが、硫酸化試薬の比率（重量）は、セルロース粒子を１００とした場合、１０〜１００の範囲であることが好ましく、より好ましくは１０〜５０の範囲である。反応は、溶媒、硫酸化試薬の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、０〜１００℃、好ましくは２０〜８５℃にて、０．５〜２４時間である。実施例において用いたクロロスルホン酸−ピリジン錯体を硫酸化試薬に用いる場合は、反応性が高いため反応時間は０．５〜１０時間の範囲であることが好ましい。
【００２８】
反応終了後、ろ過等により反応液と硫酸基が導入された水溶性多糖結合セルロース粒子を分けることができる。その際、一旦、ＮａＯＨなどによる中和処理を経由させても構わない。さらに、硫酸基が導入された水溶性多糖結合セルロース粒子分を純水にて複数回洗浄することで本発明に使用するクロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。
【００２９】
セルロース粒子としてチッソ株式会社製セルファイン（ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ）ＧＨ２５（登録商標）を用いた場合を例とし、結合反応２Ａについてさらに詳しく説明する（図３）
水溶性多糖のＧＨ２５への結合には、ＧＨ２５にエポキシ基を導入した後、一旦洗浄回収し、再びアルカリ性の水溶液中で水溶性多糖と混合させる方法が簡便で好適である。この際、予め水溶性多糖は水に溶解したものを調整しておくと操作性と均一な反応の観点から好ましい。
【００３０】
ＧＨ２５へのエポキシ基の導入は、ＧＨ２５とエピクロロヒドリンをアルカリ条件下で反応させることで可能である。これらの方法は、Hermasonら著のImmobilized Affinity Ligand Techniques のｐ181-183、(Academic Press Inc.1992年) などに記載されている。
【００３１】
ＧＨ２５への結合量は、使用する水溶性多糖の仕込み濃度とエポキシ基の導入量を、それぞれにあるいは同時に調整することにより制御することができる。ＧＨ２５は１５〜２０重量％に溶解したものを用いることが好ましく、エポキシ基の導入量はＧＨ２５の乾燥重量あたり１００〜３００μｍｏｌ/乾燥ｇの範囲であることが好ましい。エポキシ基の導入量はエピクロロヒドリンの反応系への仕込み量により制御できる。上記の導入量とするためには、例えば、反応温度３０℃、アルカリ濃度３重量％の条件の下、ＧＨ２５とエピクロロヒドリンの仕込み比を３〜１０ｍｏｌ／ｍｏｌの範囲にすればよい。
【００３２】
上記のようにして得られた水溶性多糖が表面に結合したＧＨ２５への硫酸基の導入は、例えば、特開昭６１−４７１８５号公報や特開平７−１９６７０２などに記載の方法に従って実施することができる。特に、ピリジン中で硫酸化剤としてクロロスルホン酸を用いる反応は、クロロスルホン酸の仕込み比率の調製により硫酸基導入量を容易に変えることができ好ましい。
硫酸基の多孔性セルロース粒子への導入量は、培養条件や目的精製物に対する親和度や電荷量に応じて適宜選択すればよい。インフルエンザウイルスの吸着・精製の場合、例えば、得られるクロマトグラフィー用充填剤に対して０．２〜６重量％の硫黄含量割合が好適である。
【００３３】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、前述の結合反応１および結合反応２に限定されるものではないが、大別して、多孔性粒子に結合させる多糖が、１）硫酸化多糖である場合（結合反応１および結合反応２Ｂ、以下この２つを併せて「製造方法Ｉ」と言うことがある）と、２）先ず多糖を結合させその後硫酸化する場合（結合反応２Ａ、以下「製造方法ＩＩ」と言うことがある）とがある。
【００３４】
本発明に用いる多孔性粒子は、クロマトグラフィー用充填剤として実績のあるものであれば種類を問わず、例えば、シリカゲル、メタクリルゲル、アガロースゲル、セルロースゲルなどが利用できる。特に、ウイルス精製のクロマトグラフィー用充填剤として実績があり、さらに、アルカリ耐性などの点で化学的に安定性の高いセルロースを造粒して得られたセルロース粒子は本発明の多孔性粒子に好適である。
【００３５】
本発明に用いる多孔性粒子の平均粒子径は３０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは４０〜１２０μｍの範囲であり、より好ましくは５０〜１００μｍの範囲である。
粒子径は、例えば、ＪＩＳ標準ふるいなどを用いての分級操作により所望の範囲に調整することができる。特に、目開き４５μｍ（線径０．０３ｍｍ）と目開き１０６μｍ（線径０．０７５ｍｍ）の篩を用いて分級操作を行うことが好ましい。
多孔性粒子の平均粒子径は、走査電子顕微鏡又は光学顕微鏡を用いて撮影した任意の２００個の粒子についてその長径を測定し、その平均を算出したものである。
【００３６】
なお、本発明に用いる多孔性粒子の真球度（短径／長径）は特に制限されないが、０．８〜１．０の球状の形態を有するものが好ましい。
【００３７】
本発明に好適に用いられる多孔性セルロース粒子の製造方法は特に限定されず、例えば、特公昭５５−３９５６５号公報や特公昭５５−４０６１８号公報などに開示の酢酸セルロースからセルロース粒子を製造する方法、あるいは特公昭６３−６２２５２号公報などに開示のチオシアン酸カルシウム塩を用いた溶液からセルロースを造粒する方法などを挙げることができる。
さらに、セルロース粒子の物理的安定性を高めるため、架橋剤を用いて粒子を構成するセルロースの間を架橋することが好ましい。架橋方法は、通常、セルロースの架橋に用いられる方法であれば特に限定されない。架橋剤としては、エピクロロヒドリンなど多官能化合物を例示することができる。
【００３８】
本発明に用いる多孔性粒子は、移動相として純水を使用し、標準ポリエチレングリコールを用いて測定した排除限界分子量が６０００Ｄａ以下である。排除限界分子量は、多孔性粒子に開いている穴（以下「細孔」と言うことがある。）の大きさを表す指標である。６０００Ｄａ以下である理由について確定的なことは言えないものの、この値以下であれば、リガンドとして結合させる硫酸化多糖が、多孔性粒子内に進入し難く、多孔性粒子表面に確実に留まることができるためであると考えている。
【００３９】
排除限界分子量は、より詳しくは、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない分子のうち最も小さい分子量を言い、種々の分子量の化合物を用いて溶出体積との関係を調べることにより測定することができる。排除限界分子量の測定方法として、具体的には、L.Fischer著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版、７−１７頁（東京化学同人）などに記載されている方法を挙げることができる。本発明における具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
なお、本発明において、排除限界分子量の測定に使用するポリエチレングリコールは、例えば、ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の標準ポリエチレングリコール、ＰＥＧ−１９０００、ＰＥＧ−８６５０、ＰＥＧ−４１２０、ＰＥＧ−５９０、ＰＥＧ−２２０など（何れも商品名）が好ましく用いられる。
【００４０】
本発明において多孔性粒子として好ましく用いられるセルロース粒子は、市販品を用いることができる。例えば、前述のチッソ社製非架橋球状セルファインＧＨ２５（商品名）は、上記排除限界分子量に関する要件、更には平均粒子径に関する要件を満たしており、特に好ましく本発明に使用することができる。さらに、該ＧＨ−２５を架橋反応により硬化させ、上記要件を満たすようにしてもかまわない。
【００４１】
本発明において排除限界分子量は、多孔性粒子が本来的に有するものでなくても構わない。例えば、上記特公昭６３−６２２５２号公報に記載された方法で得られる細孔径の大きい（排除限界分子量の大きい）セルロース粒子に、エピクロロヒドリンなどの多価架橋剤を介してデキストランやプルランなどの水溶性高分子を付加することにより、細孔内をゲル状化させ、その結果として本発明で特定する排除限界分子量の値を示すに至ったものでも本発明に使用することができる。
【００４２】
なお、前述の製造方法ＩＩの場合であって、多孔性粒子が硫酸化試薬と反応するものである場合には、多孔性粒子も多糖と共に硫酸化され得る。また、製造方法Ｉの場合であっても、硫酸化多糖との結合反応に供する多孔性粒子は硫酸化された多孔性粒子であってもよい。本発明において硫酸化された多孔性粒子は、硫酸化されたセルロースやアガロース粒子であることが好ましい。
【００４３】
硫酸化多糖は、多糖の水酸基を硫酸化したものであり、多糖の種類や硫酸化の方法は特に限定されるものではない。
製造方法Ｉに使用する硫酸化多糖は還元末端を持ち、所定の粘度に調製可能なものであれば限定されるものではなく、セルロース、デキストラン、プルラン、ジェラン、カードランなどを硫酸化することで入手できる。特に、粘度調整が容易で安価なデキストランやセルロースを硫酸化したものが好ましい。
製造方法ＩＩに使用する多糖は、安価で、所定の粘度に調製できるものであれば種類は問わないが、水溶性の高いものが安価で安全な水溶媒を利用できる点でさらに好ましく、これに従えばデキストランやプルランが特に好ましい。
さらに、製造方法Ｉのうち、結合反応２Ｂに使用することができる硫酸化多糖は硫酸化されていればその多糖の種類を問わない。安価に調達できる点で、特に、デキストラン、プルランおよびセルロースを硫酸化したものが好ましい。
また、セルロースの起源は限定されるものではなく、綿花やパルプや酢酸菌発酵由来などの何れのセルロースであっても、本発明に使用することができる。デキストランは乳酸菌醗酵由来のものなどが使用でき、プルランは黒色酵母由来のものなどが使用できる。さらに、多糖の精製度を高めたものや、低分子化するため硫酸などの酸加水分解をして用いても構わない。
【００４４】
多糖の硫酸化には、例えば、米国特許第４，４８０，０９１号パンフレットや特開２００６−２７４２４５号公報などに開示の通常知られた方法、即ち、ジメチルホルムアミドやピリジンなどの溶媒中で硫酸化剤にクロロスルホン酸を作用させる方法が利用できる。
【００４５】
特に、低粘度型の硫酸化セルロースの合成には、特開２００６−２７４２４５号公報、段落番号００２６〜００２８に記載された方法、即ち、セルロースをピリジン、ジメチルスルホキシド、あるいはジメチルホルムアミド等の溶媒で膨潤させ、硫酸化剤としてクロルスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−硫酸、無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体、三酸化硫黄−ピリジン錯体、三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体、あるいは硫酸−トリメチルアミン複合体等を滴下する方法が好ましい。
【００４６】
その際の硫酸化剤の使用量は、目的とする硫酸化多糖の硫酸化率（または硫黄含有率）及び反応条件に従って異なるが、多糖の水酸基１に対し１．２〜３当量の割合で用いるのが適当である。反応は、溶媒、硫酸化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは２０〜８５℃にて、好ましくは０．５〜２４時間、より好ましくは０．５〜１０時間行う。
【００４７】
反応後、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等を反応液に加え、上記反応により生成した硫酸化多糖を沈殿させる。または、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等の中に反応液を滴下し、当該硫酸化多糖を沈殿させてもよい。
はたまた、反応液に蒸留水を加えて反応を停止し、次いで、水酸化ナトリウム等のアルカリで中和し、これをろ過または遠心分離し、固形分を蒸留水に溶解し、この溶解液にエタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等を加えて、当該硫酸化多糖を沈殿させてもよく、前述の溶解液をエタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等の中に滴下し、当該硫酸化多糖を沈殿させてもよい。
前述のようにして沈殿させた硫酸化多糖を回収し、乾燥することによって本発明に使用する硫酸化多糖を得ることができる。
【００４８】
硫酸化多糖は、上記のような方法により製造してもよく、あるいは、市販品を使用してもよい。例えば、硫酸化セルロースの市販品として、関東化学社より販売されているアクロス社製セルロースサルフェート（商品名、高粘度型）や和光純薬社より販売されているデキストラン硫酸ナトリウムなどを挙げることができる。
【００４９】
前述のように、硫酸基の多孔性粒子表面への効率的な導入には、多孔性粒子の細孔径、および多糖あるいは硫酸化多糖の分子量、または分子量に依存する粘度や極限粘度の影響を受ける。本願発明に必須の多孔性粒子は、移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下のものである。この多孔性粒子に好ましい多糖または硫酸化多糖は、その分子量が多孔性粒子の排除限界分子量以上のものであることが好ましい。結合反応１に用いる硫酸化多糖の粘度（硫酸化多糖を１重量％水溶液とした際の粘度）は特に限定されるものではないが、硫酸化多糖が硫酸化セルロースである場合には、１５〜３００Ｍｐａ／ｓｅｃ・２０℃の範囲であることが好ましい。また、結合反応２に用いる多糖あるいは硫酸化多糖における粘度も特に限定されるものではないが、その極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．４０〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である。粘度（硫酸化多糖を１重量％水溶液とした際の粘度）または極限粘度がこの範囲であれば、多糖または硫酸化多糖を多孔性粒子表面に効率よく配置でき、その結果、ウイルス粒子の結合に必要な硫酸エステル基を粒子表面に効率よく導入することができる。
【００５０】
結合反応１に用いる硫酸化多糖の粘度は、ＪＩＳ Ｚ ８８０３「液体の粘度−測定方法」単一円筒型回転粘度計の方法に準じて実施することができる。純水で硫酸化多糖の１重量％水溶液を調整し、この水溶液の粘度を、２０℃にてＢ型粘度計（東機産業社）の円盤に働く液体の粘性抵抗トルクを測ることによって求めることが可能である。
また、結合反応２に用いる多糖および硫酸化多糖の極限粘度は、日本薬局方１４版に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」にしたがって、数個の異なる濃度の高分子溶液の粘度を求めて粘度の濃度依存性を測定し、得られた直線の濃度を０に外挿することにより求めることができる。本発明において極限粘度は、この日本薬局方１４版に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」で求めた値である。
【００５１】
なお、デキストランの極限粘度は、重量平均分子量と下記の関係式を満たすことが知られていることから、デキストランの極限粘度を、重量平均分子量から求めることもできる。
極限粘度（η）＝９×１０−４×重量平均分子量（Ｍｗ）０．５
【００５２】
重量平均分子量を目安にする場合、本発明に使用する多糖または硫酸化多糖の重量平均分子量は、７０ｋＤａ以上がより好ましく、１５０ｋＤａ以上がさらに好ましい。また、多糖または硫酸化多糖の重量平均分子量は、５００ｋＤａ以下がより好ましい。
【００５３】
本発明において多孔性粒子に結合される硫酸化多糖の硫黄含有割合は特に限定されるものではない。前述の製造方法Ｉの場合においては、結合法が安価なアルカリ水系のために硫酸化多糖も水溶性が高いほど結合が容易となる。セルロースなどの水に溶けにくい多糖を用いる場合、水に易溶化させるには１５重量％以上の硫酸化が必要である。また、多糖の水酸基に導入された硫酸基は本発明のクロマトグラフィー用充填剤のリガンドとして機能することから、リガンド密度をあげることで効果的にウイルス粒子などの目的物質を吸着することができる。さらに、リガンドである硫酸エステル基を増やすことで、逆の負の電荷をもつ宿主由来の核酸の吸着を電気的な反発により低減させる効果も期待される。多糖を構成する単糖一つあたりに１分子の硫酸基が導入されていることが好ましい。従って、結合反応の操作性と性能の観点から、当該硫黄含有割合は１２重量％以上であることが好ましく、より好ましくは１５重量％以上である。この場合、多孔性粒子に結合させた時の、即ち、クロマトグラフィー用充填剤とした時の当該硫黄含有割合は、本発明のクロマトグラフィー用充填剤に対して０．２〜６重量％範囲であることが、吸着性能の発揮の点で好ましい。
製造方法ＩＩ場合においては、硫酸基を高導入していくことは、前述のクロマトグラフィー用充填剤における吸着性能の点で好ましいが、多孔性粒子が硫酸化されるものである場合、硫酸基のあまりの高導入化は充填剤の軟化をもたらす。実用的な、流速性能を維持する必要があることから、当該硫黄含有割合は本発明のクロマトグラフィー用充填剤に対して０．２〜６重量％の範囲であることが好ましい。
【００５４】
硫酸化多糖中の硫黄含有割合は、イオンクロマトグラフィー法により求めることができる。具体的な測定条件等は、後述の実施例に記載したとおりである。
【００５５】
本発明において硫酸化多糖は、塩の形態であってもよい。特に、硫酸化セルロースの場合を例に取れば、保存安定性が高い点、製造工程上安価にできる点で、ナトリウム塩やカリウム塩が好ましい。
【００５６】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、具体的には上記の製造方法Ｉあるいは製造方法ＩＩにより得ることができるものの、硫酸化多糖の多孔性粒子への結合率は比較的低くさらに硫酸化多糖は高価であることから、製造方法Ｉに較べ製造方法ＩＩの方が安価にできる。さらに、製造方法ＩＩでは多孔性粒子が多糖の場合、粒子側にも硫酸エステル基を導入することができることから、リガンドの分布を広くあるいは密にしたクロマトグラフィー用充填剤をより容易に得ることができる。
製造方法ＩＩの具体的態様は特に限定されるものではないが、本発明においては、下記の２工程を有するものであることが好ましい。
工程１：多孔性粒子と多糖を２以上の官能基を有する架橋剤により架橋し、
多糖結合多孔性粒子を得る。
工程２：工程１で得られた多糖結合性多孔性粒子を硫酸化試薬と反応させて
多糖を硫酸化する。
【００５７】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は硫酸化多糖を含むためインフルエンザウイルスやＨＩＶ、日本脳炎ウイルス、肝炎ウイルスなどエンベロップを有すウイルスの吸着、回収に好適に利用することができる。
【００５８】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤のインフルエンザウイルスに対する吸着性能は、例えば、特開昭６１−４７１６８号公報や欧州特許出願公開第１８０８６９７号パンフレットに記載の方法で評価できる。評価に用いるインフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ型、発育鶏卵由来、ＭＤＣＫ細胞などの培養細胞由来のインフルエンザウイルスが利用でき、利用されるインフルエンザウイルスはホルマリンやβプロピオンラクトンを用いた不活化処理の有無を問わない。但し、精製度や回収度の改善のためには、インフルエンザウイルス溶液をフィルトレーションや除核酸処理などの前処理をすることが好ましい。
特に宿主細胞由来の核酸のワクチン製剤からの除去は重要である。一般に核酸はその構造により負電荷を帯びている。よって、本発明のクロマトグラフィー用充填剤のリガンドである硫酸基と電気的に反発する関係にある。こういった理由から宿主細胞由来の核酸の、本発明のクロマトグラフィー用充填剤への非特異的な吸着を低減させるためには、リガンド密度を上げることが効果的である。当該目的に有効な硫黄含有割合は０．２重量％以上であることが好ましい。
【００５９】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤に吸着されたインフルエンザウイルスは、高濃度のＮａＣｌなどの塩溶液を用いることで、イオン交換的に溶出回収が可能である。回収されたインフルエンザウイルスは、赤血球凝集試験など通常の方法でヘマグルチニンタイター（ＨＡ価）として評価できる。ウイルス評価法は国立予防衛生研究所学友会編 改定二版 ウイルス実験学各論（丸善）などに記載されている。
【００６０】
インフルエンザウイルスのクロマトグラフィーを用いた精製方法は、例えば、特開昭６１−４７１８６号公報や欧州特許出願公開第1 808 697号パンフレットなどに記載されており、当該分野では周知である。本発明のクロマトグラフィー用充填剤も、図１のプロセスフローの如く特開昭６１−４７１８６号公報や欧州特許出願公開第1 808 697号パンフレット記載の方法と同様にして、鶏卵あるいは細胞培養を宿主として増幅されたいずれかのインフルエンザウイルスの精製に用いることができる。
特に、本発明のクロマトグラフィー用充填剤にインフルエンザウイルスが効率よく吸着するよう、塩や宿主由来の核酸やタンパク質などの不純物を除去する工程を必要に応じて追加してもかまわない。このような方法は、一般的なクロマトグラフィーでタンパク質を精製する周知の方法に従うことが可能である。
また、インフルエンザウイルスをワクチン成分にする方法は、国際公開０１／２１１５１パンフレットや国際公開０２／２８４２２パンフレットなどにおいて公知である。このようにして得られたインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを含むタンパク質成分の精製にも、本発明のクロマトグラフィー用充填剤は利用できる。例えば、図１の工程で得られた精製ウイルス液から、エーテルや界面活性剤を用いて、ウイルス粒子を破壊する。その可溶化画分から、通常のクロマトグラフィーでタンパク質を精製する周知の方法に従い、且つ本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用い、ワクチン成分を精製することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに制限されるものではない。また、以下の実施例において「％」は、特段の説明が無い限り「重量％」を意味する。
１．測定方法
実施例において使用する測定方法は以下の通りである。
＜排除限界分子量＞
ゲル分配係数Ｋａｖの測定
（１）使用機器及び試薬
カラム ： エンプティカラム１／４×４．０ｍｍ
Ｉ．Ｄ×３００ｍｍ、１０Ｆ（東ソー）
リザーバー ： パッカ・３/８（東ソー）
ポンプ ： ＰＯＭＰ Ｐ−５００ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
圧力計 ： ＡＰ−５３Ａ（ＫＥＹＥＮＣＥ）
【００６２】
（２）カラム充填法
カラムとリザーバーを接続しカラム下部にエンドフィッティングを接続する。Ｋａｖを測定するゲルを減圧濾過した湿ゲルの状態で１５ｇ計りとり、５０ｍLビーカーへ入れた。そこへ超純水２０ｍＬ加え軽く攪拌し、ゲルが超純水中に分散した状態でリザーバーの壁を伝わらせるようにカラムへゆっくり加えた。ビーカーに残ったゲルは少量の超純水ですすぎゆっくりとカラムへ加えた。その後リザーバーの上部ぎりぎりまで超純水を加えリザーバーの蓋をした。リザーバー上部へアダプターを接続しポンプで超純水を送液した。送液ラインの途中に圧力計を接続しておき圧力をモニターした。圧力が０．３ＭＰａになるまで流速を上げ、その後３０分超純水を流しながら充填した。充填が終わったらポンプを止めアダプターとリザーバーの蓋を外した。次にリザーバーの中の超純水をピペットで吸いだした後リザーバーを外し、カラムからはみ出したゲルを除きエンドフィッティングを接続した。
【００６３】
（３）Ｋａｖ測定装置
システム ： ＳＣＬ−１０ＡＰＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ワークステーション ： ＣＬＡＳＳ−ＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ＲＩ検出器 ： ＲＩＤ−１０Ａ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ポンプ ： ＬＣ−１０ＡＴ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
オートインジェクター ： ＳＩＬ−１０ＡＤＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
【００６４】
（４）Ｋａｖ測定サンプル
１．PEG-19000 （ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＰＯＬＹＭＥＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ）分子量19700
２．PEG-8650（ＰＯＬＹＭＥＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量8650
３．PEG-4120（ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量4120
４．PEG-590（ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量590
５．PEG-220（ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量220
【００６５】
（５）Ｋａｖ導出式
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍL）、Ｖｔは空カラム体積（ｍL）、Ｖ０はデキストランＴ２０００保持容量（ｍL）である。］
【００６６】
（６）測定結果
本実施例において用いた多孔性粒子セルファインＧＨ２５のゲル分配係数Ｋａｖの結果を図２に示した。図２の結果から、本発明に用いたＧＨ２５の標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量は３０００Ｄａであった。
【００６７】
＜平均粒子径＞
スライドグラスに湿潤セルロース粒子を取り、光学顕微鏡を用いて倍率１００倍で撮影した写真から任意に２００粒子の長径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
【００６８】
＜粘度＞
ＪＩＳ Ｚ ８８０３「液体の粘度−測定方法」単一円筒型回転粘度計の方法に準じて実施した。即ち、硫酸化セルロースを純水で１％水溶液を調整し、この水溶液の粘度を、２０℃にてＢ型粘度計（東機産業社）の円盤に働く液体の粘性抵抗トルクを測ることによって求めた。
＜極限粘度＞
多糖の極限粘度は、日本薬局方１４版に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」にしたがって、数個の異なる濃度の高分子溶液の粘度を求めて粘度の濃度依存性を測定し、得られた直線の濃度を０に外挿することにより求めた。
【００６９】
＜硫黄含有割合＞
硫黄含有割合は、イオンクロマトグラフィー法にしたがい、次に記載の方法によって求めた。６０℃で１６〜２０時間真空乾燥したサンプルを乳鉢ですりつぶし、更に、１０５℃にて２時間乾燥した。この乾燥試料０．０５ｇに２Ｍの塩酸２．５ｍｌを加え、１１０℃にて１６時間加水分解した。氷冷後、上澄液を１ｍｌ採取し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で中和し、２５ｍｌにメスアップした。カラムに横河電機社製ＩＣＳ−Ａ−２３を用い、オーブン温度４０℃、溶離液に３ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３溶液、除去液に１５ｍＭ 硫酸をそれぞれ１ｍｌ／ｍｉｎの流量の条件で使用し、横河電機社製ＩＣ７０００イオンクロマトアナライザーを用いて分析し、さらに後述の標準溶液から作成した検量線を基にＳＯ４濃度を求めた。ブランク値は乾燥試料を加えずに同様に操作し時の値とした。ＳＯ４標準液（関東化学社製 陰イオン混合標準液IV）より２μｇ／ｍｌ液を本測定法の標準溶液とし、更に段階希釈し、同様の条件でイオンクロマトアナライザーにて分析し、検量線を作成した。硫黄含有割合は下記式にて求めた。なお、Ｘ試料、ＸブランクはＳＯ４標準液による検量線から求めた濃度（ｘ１０−４％）である。
硫黄含量（ｘ１０−４％）
＝（Ｘ試料−Ｘブランク）ｘ２５ｘ２．５ｘ０．３３３３／０．０５
【００７０】
＜リゾチーム溶出量＞
クロマトグラフィー用充填剤を吸着バッファー（０．０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)−０．１５Ｍ ＮａＣｌ）でけん濁、平衡化した後、けん濁液２ｍＬを内径０．５ｃｍのカラムに充填し、同吸着バッファー４０ｍＬを流速４０ｍＬ／ｈで通液した。続いて、この充填カラムに吸着バッファーを溶媒として３．３３ｍｇ／ｍＬに調整したリゾチーム（生化学工業社製）溶液３０ｍＬを、流速６０ｍＬ／ｈの流速で１時間、循環通液した後、吸着バッファー２０ｍＬで洗浄した。次いで、５０ｍＬの溶出バッファー（０．０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)−０．６Ｍ ＮａＣｌ）を用い、流速５０ｍＬ／ｈの条件でリゾチームを溶出させた。溶出バッファーを対照として、２８０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。標準液には、前述のリゾチーム溶液を溶出バッファーで１０倍希釈したものを用いた。
溶出量(ｍｇ／ｍＬ−ゲル)
＝０．３３３×２５×（２８０ｎｍ溶出液の吸光度／２８０ｎｍ標準液の吸光度）
【００７１】
＜ＨＡ価＞
丸底９６穴（縦８×横１２列）プレートに生理食塩水５０μLを加え、サンプル５０μLを１番目のウェルに加えて混合して２倍希釈した後、希釈液５０μLを横隣のウェルに加えよく混合した。同様にして２倍希釈系列を１２番目のウェルまで調整した。コントロールとしては、１から１２番目のウェルを生理食塩水のみとした。サンプル及びコントロールに０．５％鶏赤血球浮遊液５０μLを加え混合した後、室温で３０分以上静置し、放置後赤血球の凝集状態を判定した。判定はプレートを傾斜させた際、底に沈んだ赤血球が容易に流れ出す時を凝集陰性とし、流れでない時を凝集陽性とし、凝集陽性を示すウイルスの最大希釈倍率をＨＡ価とした。
【００７２】
＜流速性能＞
内径２．２ｃｍｘ高さ２０ｃｍのポリカーボネート製カラム（東京理化製）にクロマトグラフィー用充填剤を２０ｃｍ高さで充填した。このカラムに２４℃の純水を通液し、その際のカラム入口とカラム出口の圧力を測定した。なお、通液は初期においては、２０ｍＬ／分以下の流速から始めて、その後流量を段階毎に増加させ、３分から５分通液を継続した後、圧力を測定した。圧力はカラム入口の圧力からカラム出口の圧力を差し引いて求めた。線速度は、下記の式により算出した。
線速（ｃｍ／時間）＝測定時の流量（ｍＬ／時間）／カラム断面積（ｃｍ２）
【００７３】
＜エポキシ基量＞
エポキシ基量は、特開２０００−３２１２６７に記載の方法に準じて測定した。まず、測定するゲル約１０ｇを５００ｍｌの純水で１５分間洗浄後、吸引ろ過して水を良く切り、測定サンプルを得た。ここで、本サンプル約１ｇを赤外水分計を用いて含水率を測定しておく。次いで、５０ｍｌ蓋付三角フラスコ３本に測定サンプルを１．００ｇずつ分取した。これに１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム３ｍｌを加え、３０℃で１時間振盪させた。ここにフェノールフタレイン溶液を１〜２滴加え、０．０１Ｍ塩酸で滴定し、エポキシ基量を算出した。
エポキシ基量（μｍｏｌ／ｇ−ｗｅｔ）＝０．０１×ｆ×Ａ×１０３
ｆ：塩酸のファクター
Ａ：０．０１Ｍ塩酸の滴定量（ｍｌ）
エポキシ基量（μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙ）
＝エポキシ基量（μｍｏｌ／ｇ−ｗｅｔ）×含水率
【００７４】
＜ＨＡ価を指標とする１０％ＤＢＣ量の測定＞
試作した各充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ３×５０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液１１ｍＬを、カラムへの通液を開始すると同時にカラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。この流出液の１ｍＬ画分の５０μＬを使用し、ＨＡ価を測定した。さらに、試験ウイルス液50μＬのＨＡ価の１／１０に到達する直前の画分までの総液量（μＬ）を求めた。本測定系に於ける１０％ＤＢＣは以下のようにして求めた。
１０％ＤＢＣ（ＨＡ価／ml-gel）
＝（総液量 ｘ １／５０ ｘ 試験ウイルス液５０μＬのＨＡ価）／カラム容量（ml-gel）
【００７５】
２．試験インフルエンザウイルスの作製
接種ウイルスとして、Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株、および、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−２／０４（Ｈ７Ｎ７）株を選び、それぞれの保存ウイルス原液を、滅菌ブイヨン培地（日水製薬製、１０００Ｕ／ｍＬのペニシリンと１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む）で１０００倍に希釈して接種用の希釈ウイルス液を２種類得た。
上記のＨ１Ｎ１およびＨ７Ｎ７のウイルス株毎に、１０日齢発育鶏卵の腹膜腔内に希釈ウイルス液を接種し、３７℃、２日間培養した後、４℃で１６時間放置した。鶏卵より漿尿液を回収し、不活化のため０．１％のβプロピオンラクトンを添加し、２種類の試験ウイルス液を作成した。Ｈ１Ｎ１は１ロットの、Ｈ７Ｎ７株は単位体積当たりのＨＡ価の異なる３ロットをそれぞれ作製し、本実施例ウイルス吸着試験に使用した。
【００７６】
３．クロマトグラフィー用充填剤の製造＜結合反応１＞
（１）硫酸化多糖Ａの合成
温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた３Ｌのセパラブルフラスコ（反応容器）に、結晶セルロース（旭化成株式会社製 商品名 セオラスＰＨ１０１）、平均重合度２４２）１８０ｇ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１６０ｍＬを投入し、一晩攪拌した。次いで、これに、氷冷下１８％−無水硫酸−ＤＭＦ錯体１２２１ｇを３５分かけて投入した後、この反応容器を２０℃の恒温槽に浸け、２０分かけて昇温させ２０℃で６時間反応させた。
反応終了後、反応液を５℃まで氷冷し、氷冷しながら超純粋水１２２０ｍＬを７５分かけて徐々に投入し、続いて、1Ｎの水酸化ナトリウム溶液を反応液のｐＨが７になるまで徐々に投入した。生じた沈殿をろ別し、ろ液を２０Ｌのイソプロピルアルコール中に投入して沈殿物を得た。さらに沈殿物をろ別し、４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースナトリウム塩（硫酸化多糖Ａ）を得た。得られた硫酸化セルロースナトリウム塩の収量は１３０ｇであり、２０℃の純水に対する溶解度は１５ｇ／Ｌ、硫黄含量は１４．０％、粘度は１８．４ｍＰａ・ｓであった。
【００７７】
（２）硫酸化多糖Ｂの合成
温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた２Ｌ（リットル）のセパラブルフラスコ（反応容器）に、日本薬局方脱脂綿（発売元：ピップトウキョウ株式会社）５．０ｇ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３５０ｍＬを投入し、一晩攪拌し充分にＤＭＦを浸潤させた。次に、この反応容器を１０℃の恒温槽に浸け、１８％−無水硫酸−ＤＭＦ錯体１２３ｇを1時間かけて投入し、さらに１０℃の恒温槽に浸けたまま、４日間反応させた。
反応終了後、反応液を５℃まで氷冷し、氷冷しながら水１０００ｍＬを７５分かけて徐々に投入し、続いて、1Ｎの水酸化ナトリウム溶液を反応液のｐＨが７になるまで徐々に投入した。生じた沈殿物をろ別し、ろ液を１０００ｍＬのイソプロピルアルコール中に投入して沈殿物を得た。さらに沈殿物をろ別後、４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースナトリウム塩（硫酸化多糖Ｂ）を得た。得られた硫酸化セルロースナトリウム塩の収量は１３ｇであった。硫黄含量は１６．０％であった。粘度は４５．７ｍＰａ・ｓであった。
【００７８】
（３）製造例１（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）多孔性粒子のエポキシ化
出発原料の多孔性粒子としてセルファインＧＨ２５（チッソ社製、セルロース粒子）を使用した。この多孔性粒子は、粒子径が４４〜１０５μｍで、平均粒子径が６７μｍであった。また、標準ポリエチレングリコールとＫａｖの関係は図２であり、これより求めた排除限界分子量は約３０００Ｄａであった。
７５０ｇ（含水率２．８９）のセルファインＧＨ２５を、６４１５ｍＬの水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液１３４４ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン１４８２ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）７５７ｇを得た。エポキシ活性化湿潤ゲル１．０ｇを１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液３．０ｍＬとともに３０℃に温度設定した振騰機で１時間振騰し、０．１ｍｏｌ・Ｌ塩酸で滴定することによりエポキシ量を定量した。その結果、エポキシ量は３０８．６ｍｏｌ／ｇ（乾燥）であった。
【００７９】
２）エポキシ活性化湿潤ゲルのアミノ化
上記で得られたエポキシ活性化湿潤ゲル６５０ｇを、９７５ｍＬの２５％アンモニア水とともに攪拌機付き反応器に仕込んだ。よく攪拌を行いながら、内部温度を３５〜４０℃に調製し、２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、アミノ化したエポキシ活性化湿潤ゲル（アミノ化湿潤ゲル）６５３ｇを得た。このアミノ化湿潤ゲルの含水率を、５０℃の真空乾燥機で一晩乾燥した粒子の重量減より求めた結果、当該含水率は３．２８％であった。また、ケルダール法により求めた窒素含有割合は４５００ｐｐｍであった。
【００８０】
３）硫酸化多糖Ａの結合
アミノ化湿潤ゲル８０ｇを、１６０ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した。次いで、これに硫酸化多糖Ａを０．６１ｇ添加し、５０℃で４８時間反応を行った。その後、ジメチルアミンボラン２．４４ｇを添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル８０ｇを得た。
【００８１】
４）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル８０ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液４００ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を１００ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、無水酢酸をさらに１００ｍＬ滴下し３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤７７ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．２３％であり、リゾチーム溶出量は０．９ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【００８２】
（４）製造例２（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）硫酸化多糖Ｂの結合
製造例１で得られたアミノ化湿潤ゲル１２ｇを、２４ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した後、硫酸化多糖Ｂを０．４２１ｇ添加し、５０℃で４８時間反応を行った。これに、ジメチルアミンボランを０．４２ｇ添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル１２．５ｇを得た。
【００８３】
２）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル１２．５ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液６２．５ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０ ℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を１５．６ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、無水酢酸さらに１５．６ｍＬを滴下し、３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、残った白色固体を水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１２．０ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．１３％であった。また、リゾチーム溶出量は１．８ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【００８４】
（５）製造例３（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）アクロス社製硫酸化セルロースの結合
製造例１で得られたアミノ化湿潤ゲル２０ｇを、４０ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した。市販の硫酸化セルロース（アクロス社製、粘度２４１．０ｍＰａ・ｓ）２．１１ｇを添加し、５０℃で４８時間反応を行った。これにジメチルアミンボラン０．７ｇを添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル１８．５ｇを得た。
【００８５】
２）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル１８．５ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液６２．５ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０ ℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を２３ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、さらに無水酢酸２３ｍＬを滴下し、３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１８．４ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．２３％であった。また、リゾチーム溶出量は２．８０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【００８６】
（６）製造例４（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）アクロス社製硫酸化セルロースの結合
製造例１で得られたアミノ化湿潤ゲル８０．０ｇを、１６０ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した。市販の硫酸化セルロース（アクロス社製、粘度２４１．０ｍＰａ・ｓ）７．０ｇを添加し、５０℃で４８時間反応を行った。これにジメチルアミンボラン２．８ｇを添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル８３．３ｇを得た。
【００８７】
２）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル８３．３ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液４１６ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０ ℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を１０４ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、さらに無水酢酸１０４ｍＬを滴下し、３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤８３．３ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．０３％であった。
【００８８】
４．ウイルス吸着試験１
（１）製造例１のクロマトグラフィー用充填剤と製造例３のクロマトグラフィー用充填剤との比較
充填剤として、製造例１のクロマトグラフィー用充填剤と製造例３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた。
各充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ３×５０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液８ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：４０９６０）のカラムへの通液を開始すると共に、カラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。
上記試験ウイルス液の通液終了後、０．０１Ｍリン酸バッファー、０．１９ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２の通液を開始し、非吸着画分を洗い流した。非吸着画分の洗浄が終了した後、０．０１Ｍリン酸バッファー，３ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０の通液を開始し、カラムに吸着しているウイルスが完全に溶出されるまで通液を実施した。溶出終了後、回収した流出液のＨＡ価を測定し吸着量を求めた。その結果、ウイルス吸着量は、製造例１のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には２１０００ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであり、製造例３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には２５７２０ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。吸着量（ＨＡ価）は、下記の式から求めた。
吸着量 ＝ 通液した総ＨＡ価 − 非吸着画分の総ＨＡ価
【００８９】
（２）製造例３のクロマトグラフィー用充填剤と市販セルファインサルフェートとの比較
充填剤として、製造例３のクロマトグラフィー用充填剤と市販セルファインサルフェート（チッソ社製、硫黄含有割合：０．０９％）を用い、試験ウイルスとして、試験ウイルスをＨ１Ｎ１株とし、試験ウイルス液を２ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：８１９２０）とした以外は、前述のウイルス吸着試験に準じて試験を実施した。その結果、製造例３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には６４８４０ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであり、市販セルファインサルフェート（チッソ社製）を用いた場合には６４８００ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌと同じ吸着性能を有す結果であった。
【００９０】
５．流速性能の比較
ほぼ同じ硫黄含有割合のセルファインサルフェートと製造例４で得られたクロマトグラフィー用充填剤の流速性能を比較した。
製造例４で得られたクロマトグラフィー用充填剤（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．０３％）の流速性能を前述の測定方法に従って測定した。この充填剤のカラム入口の圧力からカラム出口の圧力を差し引いた値が０．３ＭＰａとなった時の流速性能は、線速２２００ｃｍ／ｈであった。一方、セルファインＧＨ２５に対し、乾燥ゲルにおける硫黄含有割合が０．０２％となるように直接硫酸化したセルロース粒子の同条件での流速性能は、線速７００ｃｍ／ｈであった。同等の硫黄含量に対し、本発明によって製造されたクロマトグラフィー用充填剤は約３倍の流速性能を示した。尚、前述の０．０２％硫酸化ゲルは次のようにして製造した。
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２９５ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸３．００ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいたＧＨ２５の乾燥重量４５ｇ（含水率０．３８％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４３．６ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１１０ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．０２％）を得た。
【００９１】
表1に上記試験の結果をまとめた。製造例３のクロマトグラフィー用充填剤は市販硫酸化セルファインと同等の吸着性能を示していた。また、本発明によって製造されたクロマトグラフィー用充填剤は同硫黄含量では、市販硫酸化セルファインの３倍の流速性能を示したことから、発明の硫酸化セルロースをリガンドとするセルロース粒子は、効率よくウイルスを吸着し、かつ高流速で使用できるものであった。
【００９２】
【表１】
【００９３】
６．クロマトグラフィー用充填剤の製造＜結合反応２Ａ＞
（１）エポキシ活性化湿潤ゲルの製造（参考例１−３）、および当該ゲルと多糖との複合体の製造（参考例４−１２）
１）参考例１
出発原料の多孔性粒子としてセルファインＧＨ２５（チッソ社製、セルロース粒子）を使用した。８５０ｇ（含水率３．６８）のセルファインＧＨ２５を、５７５０ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液１２２５ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン１３１９ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）８４７ｇを得た。このエポキシ基量は３１３μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙであった。
【００９４】
２）参考例２
１０００ｇ（含水率５．３８）のセルファインＧＨ２５を、４３２０ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液９８７．５ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン３１８ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）７５５ｇを得た。このエポキシ基量は１０５μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙであった。
【００９５】
３）参考例３
１０００ｇ（含水率５．３８）のセルファインＧＨ２５を、４３２０ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液９８７．５ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン１０６ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）７２０ｇを得た。このエポキシ基量は１７．３μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙであった。
【００９６】
４）参考例４
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）２８．０ｇを、１５５．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．６１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．３ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１２１ｇを得た。
【００９７】
５）参考例５
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）４４．４ｇを、１５５．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．６１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．３ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１１７ｇを得た。
【００９８】
６）参考例６
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）６３．０ｇを、１５５．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．６１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．３ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１１６ｇを得た。
【００９９】
７）参考例７
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）２９．０ｇを、１３５．８ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例２で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１５０ｇ（含水率４．３１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．９ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１４７ｇ（含水率３．９０）を得た。
【０１００】
８）参考例８
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）４６．０ｇを、１３５．８ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例２で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１５０ｇ（含水率４．３１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．９ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１４５ｇ（含水率４．９９）を得た。
【０１０１】
９）参考例９
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）６５．２ｇを、１３５．８ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例２で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１５０ｇ（含水率４．３１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．９ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１４２ｇ（含水率４．８３）を得た。
【０１０２】
１０）参考例１０
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）５４．４８ｇを、１１８．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例３で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率４．１６）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１５．０ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１１４．６ｇ（含水率４．１０）を得た。
【０１０３】
１１）参考例１１
高分子デキストランＥＨ（名糖産業株式会社製、分子量２０万相当、極限粘度０．４２ｄＬ／ｇ）６０．０ｇを、１４２．９ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込み高分子デキストランＥＨが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１と同様に製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．７５、エポキシ基量２９７μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙ）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１６．５ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、デキストラン化された多孔性粒子１１６．７ｇを得た。
【０１０４】
１２）参考例１２
高分子デキストランＥＨ（名糖産業株式会社製、分子量２０万相当、極限粘度０．４２ｄＬ／ｇ）４２．４ｇを、１４２．９ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込み高分子デキストランＥＨが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１と同様に製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．７５、エポキシ基量２９７μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙ）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１６．５ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、デキストラン化された多孔性粒子１１7．8ｇを得た。
【０１０５】
（２）参考例４〜１２の硫酸化
１）製造例５
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２００ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．９９ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例４で製造したプルラン化された多孔性粒子３０．５ｇ（含水率０．４８％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４０．９ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１１０．８ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：２．４％）を得た。
【０１０６】
２）製造例６
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２０１ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．０２ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例５で製造したプルラン化された多孔性粒子３０．６ｇ（含水率０．４５％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４１．１ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１０５．３ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．１％）を得た。
【０１０７】
３）製造例７
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２０６ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．１７ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例６で製造したプルラン化された多孔性粒子３１．４ｇ（含水率０．７０％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４２．１ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１０２．６２ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．８％）を得た。
【０１０８】
４）製造例８
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２１８ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．５４ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例７で製造したプルラン化された多孔性粒子３３．４ｇ（含水率０．５６％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４４．７ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１３５．１ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：２．１％）を得た。
【０１０９】
５）製造例９
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２０５ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．１４ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例８で製造したプルラン化された多孔性粒子３１．２ｇ（含水率０．５６％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４１．９ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１３２．９ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：２．１％）を得た。
【０１１０】
６）製造例１０
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２１３ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．３９ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例９で製造したプルラン化された多孔性粒子３２．５ｇ（含水率０．４８％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４３．６ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１２７．４ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．４％）を得た。
【０１１１】
７）製造例１１
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン１７２ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．１７ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例１０で製造したプルラン化された多孔性粒子２６．３ｇ（含水率０．４０％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液３５．３ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤９８．８ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．０％）を得た。
【０１１２】
８）製造例１２
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン１８３ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．４８ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例１１で製造したデキストラン化された多孔性粒子２７．８７ｇ（含水率０．６３％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液３７．４ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤９９．８ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．９％）を得た。
【０１１３】
９）製造例１３
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン１８０ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．３９ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例１２で製造したデキストラン化された多孔性粒子２７．４０ｇ（含水率０．５２％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液３６．８ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１０２．６ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．６％）を得た。
【０１１４】
７．ウイルス吸着試験２
（１）ウイルス吸着試験：製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を用いたウイルス吸着試験
充填剤として、製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を用いた。
製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ３×５０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液１０ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：５１２００）を、カラムへの通液を開始すると同時にカラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。
上記試験ウイルス液の通液が終了後、０．０１Ｍリン酸バッファー、０．１９ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２の通液を開始し、非吸着画分を洗い流した。非吸着画分の洗浄が終了した後、０．０１Ｍリン酸バッファー，３ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０の通液を開始し、カラムに吸着しているウイルスが完全に溶出されるまで通液を実施した。溶出終了後、回収した流出液のＨＡ価を測定し、１０％ＤＢＣ量を求めた。その結果、１０％ＤＢＣ量は３８６０８ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【０１１５】
（２）製造例５〜８、および１０〜１２のクロマトグラフィー用充填剤を用いたウイルス吸着試験
充填剤として製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を製造例５〜１２のクロマトグラフィー用充填剤にそれぞれ替えた以外は前述のウイルス吸着試験に準じて試験を実施した。その結果、製造例５、６、７、１１および１２のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合の１０％ＤＢＣ量は４１５１４ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌ、製造例８および１０を用いた場合は５５３５２ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【０１１６】
（３）対照実験１（市販セルファインサルフェート）
製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を市販セルファインサルフェート（対照充填剤、チッソ社製、乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．０９％）に替えた以外は前述のウイルス吸着試験に準じて試験を実施した。その結果、市販セルファインサルフェートのクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合の１０％ＤＢＣ量は２７６７６ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
製造例５〜１２の本発明のクロマト用充填剤は表２に示した通りいずれも１０％ＤＢＣの比較においてインフルエンザウイルスを効率よく吸着し、さらに市販のセルファインサルフェートに比べ１０％ＤＢＣ ＨＡ価/ｍｌで表されるウイルス吸着比で１．４〜２倍の値を示した。
【０１１７】
８．ウイルス精製に伴う核酸吸着評価
本実施例の核酸量はｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されているＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｋｉｔｓを用いて行った。
核酸吸着実験
充填剤として、製造例１３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた。
試作した充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ８×２０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液８ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：９２１６０、総核酸量１１２１０ｎｇ）を、カラムへの通液を開始すると同時にカラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。ウイルス液の通液が終了後、０．０１Ｍリン酸バッファー、０．１９ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２の３５ｍｌ通液をし、非吸着画分を洗い流した。非吸着画分の洗浄が終了した後、０．０１Ｍリン酸バッファー，３ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０の２５ｍｌにてウイルスを溶出させた。溶出終了後、回収した流出液の核酸量を定量した。その結果、溶出画分中に含まれる核酸総量は９３５ｎｇで、総ＨＡ価は７７４４０であった。
【０１１８】
（２）対照実験２（市販セルファインサルフェート）
製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を市販セルファインサルフェート（チッソ社製、硫黄含有割合：０．０９％）に替えた以外は前述の核酸吸着実験に準じて試験を実施した。その結果、市販セルファインサルフェートの溶出画分中の核酸総量は１４７４ｎｇであり、総ＨＡ価は８００８０であった。
本結果から、本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いることで、対照とする市販セルファインサルフェートに対し、ウイルス吸着はほぼ同等を示しているが、約６３％の核酸の低減化を図ることができた。
【０１１９】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の動物、昆虫細胞や微生物を宿主として製造されるバイオ製剤の伸張が近年著しい。バイオ製剤の生産性は、大容量発酵、高力価発酵により向上しており、それに伴い精製工程も効率化が求められている。特に、クロマトグラフィーを用いたバイオ製剤の製造は、細胞培養法による製造の精製プロセスとして注目されており、精製に使用されるクロマトグラフィー用充填剤には、コスト削減につながる高流速化や高吸着化が望まれている。
【０００３】
ウイルス疾病予防に対するワクチンの製造分野においても、従来法に代わる新しい製造法が検討されている。例えば、インフルエンザワクチンの製造分野では、従来の鶏卵法に比べ短期に製品提供ができる利点をもつ細胞培養法が鋭意検討されている。このようなウイルス培養のプロセスの変更に伴い、精製プロセスについても新しい検討が行われている。特に、クロマトグラフィー法は、高純度の製剤を簡便に製造できる手法として注目されている。
例えば、非特許文献１（Biotechnology and Bioengineering 96 (2006)、932-944）は、ＭＤＣＫ細胞培養由来のインフルエンザウイルスの陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた精製について報告している。非特許文献２（J. Biotechnology 13 (2007)、309-317）は、レクチンのアフィニティー特性を利用したＭＤＣＫ細胞培養由来のインフルエンザウイルスのクロマトグラフィーによる吸着について報告している。また、特許文献１（特表平１１−５１０５１号公報）は、Ｖｅｒｏ細胞由来の日本脳炎ウイルスクロマトグラフィー法による工業的製造法の例を開示している。
【０００４】
ウイルスの吸着や精製の分野において、硫酸化多糖を利用する試みが鋭意検討されている。例えば、特許文献２（特開昭６１−４７１８６号公報）ではインフルエンザウイルスの精製に、特許文献３（特開昭６１−４７１８５号公報）では日本脳炎ウイルスの精製に、クロロスルホン酸を用いてセルロース粒子を硫酸エステル化（以下「硫酸化」と言うことがある）した硫酸化セルロースをクロマトグラフィー用ゲルとして利用することが開示されている。
このような硫酸化セルロースは、特許文献４（欧州特許出願公開第１８０８６９７号パンフレット）においてもクロマトグラフィー用充填剤として、細胞培養由来のインフルエンザウイルス粒子の濃縮に利用されている。この文献においては、排除限界分子量が２０００〜４０００Ｄａの細孔性をもつセルロース粒子として硫酸エステル基を活性基にもつチッソ社製セルファインサルフェートが用いられている。
さらに、特許文献５（国際公開第２００８−１２５３６１号パンフレット）では、セルロース膜の一部をクロロスルホン酸にて硫酸エステル化した膜を用いて、細胞培養由来のインフルエンザウイルス粒子を精製した例が開示されている。また、特許文献６（特表平９−５０３１２３号公報）は、硫酸化多糖の硫酸基導入量が１ｇあたり６μモル程度に制御された、エンベロープ型ウイルスの吸着に好適なゲルの製造法について開示している。
【０００５】
また、粒子の表面に多糖を担持させることによりウイルス吸着に好適な材料の開発も進められている。例えば、特許文献７（特開平７−２８９８９１号公報）では、デキストラン硫酸を多孔性のポリプロピレン膜に結合させることで、ＨＩＶを好適に吸着する材料の例が開示されている。
また、特許文献８（米国特許第６５３７７９３号公報）では、アガロース粒子に柔軟なデキストランアームを付与し、さらにイオン交換基を導入したクロマトグラフィー用充填剤によるアデノウイルスの分離例が開示されている。
また、特許文献９（国際公開第２００８−０３９１３６号公報）においても、硫酸化されたデキストラン繊維をアガロース粒子に付与させたインフルエンザウイルス精製用のクロマトグラフィー用充填剤の開発が報告されている。さらに、該充填剤を用いると、ワクチンの製剤化の際に問題となる宿主細胞由来の核酸とインフルエンザウイルス用ウイルスの分離性を高めることできるとしている。
さらに、特許文献１０（特開２００１−１９０２７３号報）においては、ポリスチレン粒子に水不溶性硫酸化多糖を結合させたウイルス濃縮用粒子が報告されている。
【０００６】
上記の引用例のように、硫酸化多糖、特に硫酸化セルロースはＨＩＶやインフルエンザウイルスなどのエンベロップ保有型ウイルスの精製、濃縮分野において利用価値が高い。例えば、クロロスルホン酸などの適当な硫酸化試薬を用いてセルロース粒子に硫酸を導入して得られる硫酸化セルロース粒子は、チッソ株式会社から商標名セルファインサルフェートとして販売されている。このセルファインサルフェートはクロマトグラフィー用充填剤として有用であり、参考文献３において種々のウイルスへの吸着性能が評価されており、また、実際にインフルエンザウイルスの精製分野で実用化されている。
【０００７】
しかしながら、セルロース粒子への直接的な硫酸基の導入は、硫酸基による親水化のためにセルロース粒子の軟化を伴うことから、クロマトグラフィーにおいて最も重要な特性の１つである流速特性の低下をもたらす。従って、硫酸基の導入については上限があった。
また、特許文献５の比較例でも示されているように、インフルエンザウイルスの株によっては十分な吸着能力が得られない可能性が指摘されている。インフルエンザウイルスはＨ型、Ｎ型の違いとその組合せにより多種多様なウイルス株が存在する。したがって、インフルエンザワクチンの製造においては、ウイルスの培養状態が株毎に異なり、ワクチンの精製プロセスや条件も株毎に検討する必要に迫られると予想される。ウイルス吸着性能が改善されたクロマトグラフィー用充填剤であれば一定レベルの吸着を担保できることから、個別のプロセス検討といった煩雑性の低減につながることが予想される。
さらに、近年、従来の発育鶏卵にかわる新しい培養細胞を用いたワクチン製造方法が実施されており、ワクチンメーカーからは、宿主細胞由来のタンパク質や核酸を除去した、より純度の高い目的物の取得が望まれている。このように、ワクチン製造に利用されるクロマトグラフィー用充填剤についても、より高い選択性が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１１−５１０５１号公報
【特許文献２】特開昭６１−４７１８６号公報
【特許文献３】特開昭６１−４７１８５号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開第１８０８６９７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００８−１２５３６１号パンフレット
【特許文献６】特表平９−５０３１２３号公報
【特許文献７】特開平７−２８９８９１号公報
【特許文献８】米国特許第６５３７７９３号パンフレット
【特許文献９】国際公開第２００８−０３９１３６号パンフレット
【特許文献１０】特開２００１−１９０２７３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biotechnology and Bioengineering 96 (2006)、932-944
【非特許文献２】J. Biotechnology 13 (2007)、309-317
【非特許文献３】Bio/technology11（1993）、173-178
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、硫酸エステル基をリガントとし、吸着性能や流速性能が改善されたウイルス吸着用クロマトグラフィー用充填剤を提供することである。本発明のもう一つの目的は、本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いたウイルス用ワクチン、特にインフルエンザウイルス用ワクチンの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記従来技術の課題について鋭意研究を重ねた。その結果、移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖を結合させることにより、吸着性能や流速性能が改善されたクロマトグラフィー用充填剤が得られることを見出した。また、このクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製する工程を含むウイルス用ワクチンの製造方法であれば、宿主由来の核酸（ＤＮＡ）等の不純物の、クロマトグラフィー用充填剤への吸着を低減させることが可能となり、非常に効率よくインフルエンザウイルス用ワクチンが得られることを知見した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下に示したとおりのクロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法等を提供するものである。
【００１３】
本発明は以下の構成を有する。
［１］移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖が結合しているクロマトグラフィー用充填剤。
［２］多孔性粒子と硫酸化多糖が２以上の官能基を有する架橋剤により架橋されている、前記第１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［３］多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、前記第１項または第２項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［４］多孔性粒子がセルロース粒子である、前記第１項〜第３項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［５］硫酸化多糖の極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、前記第１項〜第４項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［６］硫酸化多糖が硫酸化セルロース、硫酸化デキストラン、および硫酸化プルランから選ばれた１種以上である、前記第１項〜第５項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
「７」２以上の官能基を有する架橋剤が少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤である、前記第２項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［８］少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤がエピクロロヒドリンである、前記第７項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［９］硫黄含有割合が０．２〜６重量％の範囲である、前記第１項〜第８項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤
［１０］下記工程を有することを特徴とする前記第２項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
工程１：多孔性粒子と多糖を２以上の官能基を有する架橋剤により架橋し多糖結合多孔性粒子を得る。
工程２：工程１で得られた多糖結合多孔性粒子を硫酸化試薬と反応させて多糖を硫酸化する。
［１１］多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、前記第１０項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１２］多孔性粒子がセルロース粒子である、前記第１０項または第１１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１３］多糖が水溶性多糖であり、その極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、前記第１０項〜第１２項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１４］多糖がデキストランおよびプルランから選ばれた１種以上である、前記第１０項〜第１３項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
［１５］下記一般式（１）で表される前記第１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｚ 式（１）
（式（１）において、Ｘは平均粒子径が４０〜１２０μｍの範囲であるセルロース粒子であり、Ｘに結合しているＯはセルロースの水酸基由来の酸素であり、Ｚは硫酸化セルロースであり、Ｚに結合しているＣは硫酸化セルロース還元末端のアルデヒド由来の炭素である。）
［１６］硫酸化セルロースが、その硫黄含有割合が１５重量％以上であり、１重量％水溶液の粘度が１５〜３００ＭＰａ／ｓｅｃ・２０℃の範囲である、前記第１５項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
［１７］前記第１項〜第９項、前記第１５項および前記第１６項の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製することを特徴とする、ウイルス用ワクチンの製造方法。
［１８］ＤＮＡのクロマトグラフィー用充填剤への吸着が抑制された、前記第１７項に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
［１９］ウイルス粒子がインフルエンザウイルスである、前記第１７項または第１８項に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、高いウイルス吸着性能と高流速性能とを満足するクロマトグラフィー用充填剤が得られる。さらには、本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製する工程を含む、ウイルス用ワクチンの製造方法であれば、非常に効率よくウイルス用ワクチンが得られ、インフルエンザウイルス用ワクチンにおいては特に高い分離精製効率が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ワクチンの製造プロセスを示す図である。
【図２】図２は、標準ポリエチレングリコールと市販セルロース粒子ＧＨ２５とのＫａｖの関係を示す図である。
【図３】図３は、結合反応２Ａの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、硫酸化多糖と所定の粒径と細孔径をもつ多孔性粒子とが結合した複合体である。
硫酸化多糖は、多孔性粒子の何れの部位に結合していてもよいが、より高いウイルス分離精製能を求める場合、多孔性粒子の細孔内ではなく、粒子表面において結合していることが好ましい。
多孔性粒子における細孔径や硫酸化多糖の分子量や極限粘度の選択によって硫酸化多糖を多孔性粒子表面に効率よく配置できる。その結果、ウイルス粒子の結合に必要な硫酸基を粒子表面に効率よく導入することができる。本発明者らは、このようにしてリガンドとなる硫酸エステル基の密度を高めた結果、インフルエンザウイルスに代表されるウイルスを好適に吸着することができると考えている。
すなわち、本発明においては、多孔性粒子とその排除限界以上の分子量または極限粘度をもつ硫酸化多糖とを組み合わせることが好ましく、さらには、細孔の小さい多孔性粒子と分子量または極限粘度の大きい硫酸化多糖を組み合わせることが一層好ましい。また、硫酸基の導入量の制御によってもウイルス、特にインフルエンザウイルスの吸着性能を改善することができる。また、宿主由来の核酸やタンパク質などの不純物の影響を受けにくくするためには、リガンドである硫酸基の密度を高めることが効果的である。
【００１７】
本発明において多孔性粒子と硫酸化多糖との結合反応は特に限定されるものではない。まず、硫酸化セルロース（硫酸化多糖）の還元末端を利用してセルロース粒子（多孔性粒子）に結合させる場合（以下「結合反応１」と言うことがある）を例にとって以下に詳述する。
硫酸化セルロースのセルロース粒子への付加反応では、セルロース粒子にアミノ基を導入した後、中性もしくは弱アルカリ性の水溶液中で硫酸化セルロースと混合し、シッフ塩基を形成させ、ついでジメチルアミンボランなどの還元剤で還元させる方法が好適である。
【００１８】
セルロース粒子へのアミノ基の導入は、例えば、セルロース粒子をエピクロロヒドリンなどとアルカリ条件下で反応させた後、これとアンモニア水を反応させることで可能である。これらの方法は、Hermasonら著のImmobilized Affinity Ligand Techniques (Academic Press Inc.1992年) などに記載されている。
【００１９】
これらの方法によって得られる、本発明において特に好ましいクロマトグラフィー用充填剤の一態様は、下記一般式（１）で表されるものである。
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｚ 式（１）
式（１）において、Ｘは平均粒子径が４０〜１２０μｍの範囲であるセルロース粒子であり、Ｘに結合しているＯはセルロースの水酸基由来の酸素であり、Ｚは硫酸化セルロースであり、Ｚに結合しているＣは硫酸化セルロース還元末端のアルデヒド由来の炭素である。
【００２０】
Ｘと結合しているＯ（酸素）は、下記反応式（１）の通りエピクロロヒドリンの付加反応を経てアンモニア水によってアミノ化される。その後、アミノ基と硫酸化セルロースの還元末端Ｘと反応させ、シッフ塩基を形成させた後、例えば、ジメチルアミノボランなどの還元剤で安定化することができる。
反応式（１）
一般式（１）で表されるクロマトグラフィー用充填剤は、ウイルス粒子と結合できる性質を有する硫酸化セルロースが、セルロース粒子の表面から還元末端を基点としブラシ状に結合していると推定できる。このように結合した硫酸化セルロース繊維は末端固定のため、自由度が高く、ウイルス粒子、特にインフルエンザウイルス粒子との結合（認識）に優れた効果が期待できる。
【００２１】
次いで、本発明において好ましいもう一つの結合反応について説明する。それは２以上の官能基を有する架橋剤による多孔性粒子と硫酸化多糖との結合である（以下「結合反応２」と言うことがある）。この結合は、多孔性粒子と多糖とを結合させ複合体とした後、この複合体を硫酸化剤を用いて硫酸化すること（以下「結合反応２Ａ」と言うことがある）により達成されてもよく、多孔性粒子と硫酸化多糖を結合させること（以下「結合反応２Ｂ」と言うことがある）により達成されてもよい。本発明においては硫酸化多糖が高価なものであるため、より安価な製造が期待できることから結合反応２Ａが好ましい。さらに、結合反応２Ａにおいては、担体となる多孔性粒子が硫酸化される粒子である場合、多孔性粒子にも硫酸基を導入できる。本発明においては、結合反応２Ｂに較べ硫酸エステル基導入の制御が容易できることからも結合反応２Ａが好ましい。
【００２２】
なお、多孔性粒子と多糖あるいは硫酸化多糖との結合においては、グリシジル基の反応性を利用するため、溶媒中、アルカリの存在下において行うことが好ましい。特に、多糖が水溶性である場合は、アルカリの存在下において行うことが好ましい。
【００２３】
以下結合反応２Ａについて、多糖が水溶性多糖であり多孔性粒子がセルロースである場合を例に詳しく説明する。架橋剤は２以上の官能基を有する架橋剤であれば何れの架橋剤を用いてもよく、アルカリ水溶液中でセルロース粒子に活性基を導入し、その後導入された活性基と水溶性多糖を反応させることで水溶性多糖結合セルロース粒子（複合体）を得ることができる。アルカリとしては水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどが安価で使いやすく、残留しにくい点において好適であり、特に、水酸化ナトリウムが好適である。その際溶媒は水を用いることが好ましい。
【００２４】
本発明に用いる架橋剤は、多官能のものであれば何れの架橋剤であっても用いることができるが、セルロースとの結合が化学的に安定である点、あるいは非特異的吸着防止の観点から、窒素や硫黄などのヘテロ原子をもたないものや、疎水性を示す２重結合や中長鎖アルキル基などを持たないものが好ましい。このような架橋剤の例として、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンなどのハロゲンとグリシジル基をもつ多官能型架橋剤や、アリルグリシジルエーテル、グリセロールトリグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテルなどのグリシジルエーテル系架橋剤があげられる。そのなかでもエピクロロヒドリンは分子量も小さく、安価で、反応性が高いことから特に好ましく用いることができる。なお、反応効率を上げるために反応混合物中に硫酸ナトリウムなどの無機塩を共存させてもよい。
【００２５】
また、特開昭６０−７７７６９号公報には、多孔性セルロース粒子に水溶性多糖を結合させる方法として、架橋セルロース粒子にエピクロロヒドリンを反応させてエポキシ基を導入し、これにデキストランやプルランなどの多糖を反応させることにより、セルロース粒子にそれら多糖を結合させることが開示されており、本発明においてはこの方法を採用することができる。
【００２６】
上記のようにして得られた水溶性多糖結合セルロース粒子の多糖への硫酸エステル基の付与は、クロロスルホン酸−ピリジン錯体、無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体などの硫酸化試薬と水溶性多糖結合セルロース粒子とを反応させることにより達成される。具体的には、米国特許第４，４８０，０９１号パンフレットや特開２００６−２７４２４５号公報などに開示の通常知られた方法、即ち、ジメチルホルムアミドやピリジンなどの溶媒中で無水硫酸やクロルスルホン酸を反応させ錯体を形成させて、水溶性多糖結合セルロース粒子を硫酸化させる方法が利用できる。
【００２７】
硫酸化試薬の使用割合は、目的とする粒子の硫黄含有率や反応条件に従って異なるが、硫酸化試薬の比率（重量）は、セルロース粒子を１００とした場合、１０〜１００の範囲であることが好ましく、より好ましくは１０〜５０の範囲である。反応は、溶媒、硫酸化試薬の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、０〜１００℃、好ましくは２０〜８５℃にて、０．５〜２４時間である。実施例において用いたクロロスルホン酸−ピリジン錯体を硫酸化試薬に用いる場合は、反応性が高いため反応時間は０．５〜１０時間の範囲であることが好ましい。
【００２８】
反応終了後、ろ過等により反応液と硫酸基が導入された水溶性多糖結合セルロース粒子を分けることができる。その際、一旦、ＮａＯＨなどによる中和処理を経由させても構わない。さらに、硫酸基が導入された水溶性多糖結合セルロース粒子分を純水にて複数回洗浄することで本発明に使用するクロマトグラフィー用充填剤を得ることができる。
【００２９】
セルロース粒子としてチッソ株式会社製セルファイン（ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ）ＧＨ２５（登録商標）を用いた場合を例とし、結合反応２Ａについてさらに詳しく説明する（図３）
水溶性多糖のＧＨ２５への結合には、ＧＨ２５にエポキシ基を導入した後、一旦洗浄回収し、再びアルカリ性の水溶液中で水溶性多糖と混合させる方法が簡便で好適である。この際、予め水溶性多糖は水に溶解したものを調整しておくと操作性と均一な反応の観点から好ましい。
【００３０】
ＧＨ２５へのエポキシ基の導入は、ＧＨ２５とエピクロロヒドリンをアルカリ条件下で反応させることで可能である。これらの方法は、Hermasonら著のImmobilized Affinity Ligand Techniques のｐ181-183、(Academic Press Inc.1992年) などに記載されている。
【００３１】
ＧＨ２５への結合量は、使用する水溶性多糖の仕込み濃度とエポキシ基の導入量を、それぞれにあるいは同時に調整することにより制御することができる。ＧＨ２５は１５〜２０重量％に溶解したものを用いることが好ましく、エポキシ基の導入量はＧＨ２５の乾燥重量あたり１００〜３００μｍｏｌ/乾燥ｇの範囲であることが好ましい。エポキシ基の導入量はエピクロロヒドリンの反応系への仕込み量により制御できる。上記の導入量とするためには、例えば、反応温度３０℃、アルカリ濃度３重量％の条件の下、ＧＨ２５とエピクロロヒドリンの仕込み比を３〜１０ｍｏｌ／ｍｏｌの範囲にすればよい。
【００３２】
上記のようにして得られた水溶性多糖が表面に結合したＧＨ２５への硫酸基の導入は、例えば、特開昭６１−４７１８５号公報や特開平７−１９６７０２などに記載の方法に従って実施することができる。特に、ピリジン中で硫酸化剤としてクロロスルホン酸を用いる反応は、クロロスルホン酸の仕込み比率の調製により硫酸基導入量を容易に変えることができ好ましい。
硫酸基の多孔性セルロース粒子への導入量は、培養条件や目的精製物に対する親和度や電荷量に応じて適宜選択すればよい。インフルエンザウイルスの吸着・精製の場合、例えば、得られるクロマトグラフィー用充填剤に対して０．２〜６重量％の硫黄含量割合が好適である。
【００３３】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法は、前述の結合反応１および結合反応２に限定されるものではないが、大別して、多孔性粒子に結合させる多糖が、１）硫酸化多糖である場合（結合反応１および結合反応２Ｂ、以下この２つを併せて「製造方法Ｉ」と言うことがある）と、２）先ず多糖を結合させその後硫酸化する場合（結合反応２Ａ、以下「製造方法ＩＩ」と言うことがある）とがある。
【００３４】
本発明に用いる多孔性粒子は、クロマトグラフィー用充填剤として実績のあるものであれば種類を問わず、例えば、シリカゲル、メタクリルゲル、アガロースゲル、セルロースゲルなどが利用できる。特に、ウイルス精製のクロマトグラフィー用充填剤として実績があり、さらに、アルカリ耐性などの点で化学的に安定性の高いセルロースを造粒して得られたセルロース粒子は本発明の多孔性粒子に好適である。
【００３５】
本発明に用いる多孔性粒子の平均粒子径は３０〜２００μｍの範囲であり、好ましくは４０〜１２０μｍの範囲であり、より好ましくは５０〜１００μｍの範囲である。
粒子径は、例えば、ＪＩＳ標準ふるいなどを用いての分級操作により所望の範囲に調整することができる。特に、目開き４５μｍ（線径０．０３ｍｍ）と目開き１０６μｍ（線径０．０７５ｍｍ）の篩を用いて分級操作を行うことが好ましい。
多孔性粒子の平均粒子径は、走査電子顕微鏡又は光学顕微鏡を用いて撮影した任意の２００個の粒子についてその長径を測定し、その平均を算出したものである。
【００３６】
なお、本発明に用いる多孔性粒子の真球度（短径／長径）は特に制限されないが、０．８〜１．０の球状の形態を有するものが好ましい。
【００３７】
本発明に好適に用いられる多孔性セルロース粒子の製造方法は特に限定されず、例えば、特公昭５５−３９５６５号公報や特公昭５５−４０６１８号公報などに開示の酢酸セルロースからセルロース粒子を製造する方法、あるいは特公昭６３−６２２５２号公報などに開示のチオシアン酸カルシウム塩を用いた溶液からセルロースを造粒する方法などを挙げることができる。
さらに、セルロース粒子の物理的安定性を高めるため、架橋剤を用いて粒子を構成するセルロースの間を架橋することが好ましい。架橋方法は、通常、セルロースの架橋に用いられる方法であれば特に限定されない。架橋剤としては、エピクロロヒドリンなど多官能化合物を例示することができる。
【００３８】
本発明に用いる多孔性粒子は、移動相として純水を使用し、標準ポリエチレングリコールを用いて測定した排除限界分子量が６０００Ｄａ以下である。排除限界分子量は、多孔性粒子に開いている穴（以下「細孔」と言うことがある。）の大きさを表す指標である。６０００Ｄａ以下である理由について確定的なことは言えないものの、この値以下であれば、リガンドとして結合させる硫酸化多糖が、多孔性粒子内に進入し難く、多孔性粒子表面に確実に留まることができるためであると考えている。
【００３９】
排除限界分子量は、より詳しくは、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない分子のうち最も小さい分子量を言い、種々の分子量の化合物を用いて溶出体積との関係を調べることにより測定することができる。排除限界分子量の測定方法として、具体的には、L.Fischer著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版、７−１７頁（東京化学同人）などに記載されている方法を挙げることができる。本発明における具体的な測定方法は、実施例にて示したとおりである。
なお、本発明において、排除限界分子量の測定に使用するポリエチレングリコールは、例えば、ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製の標準ポリエチレングリコール、ＰＥＧ−１９０００、ＰＥＧ−８６５０、ＰＥＧ−４１２０、ＰＥＧ−５９０、ＰＥＧ−２２０など（何れも商品名）が好ましく用いられる。
【００４０】
本発明において多孔性粒子として好ましく用いられるセルロース粒子は、市販品を用いることができる。例えば、前述のチッソ社製非架橋球状セルファインＧＨ２５（商品名）は、上記排除限界分子量に関する要件、更には平均粒子径に関する要件を満たしており、特に好ましく本発明に使用することができる。さらに、該ＧＨ−２５を架橋反応により硬化させ、上記要件を満たすようにしてもかまわない。
【００４１】
本発明において排除限界分子量は、多孔性粒子が本来的に有するものでなくても構わない。例えば、上記特公昭６３−６２２５２号公報に記載された方法で得られる細孔径の大きい（排除限界分子量の大きい）セルロース粒子に、エピクロロヒドリンなどの多価架橋剤を介してデキストランやプルランなどの水溶性高分子を付加することにより、細孔内をゲル状化させ、その結果として本発明で特定する排除限界分子量の値を示すに至ったものでも本発明に使用することができる。
【００４２】
なお、前述の製造方法ＩＩの場合であって、多孔性粒子が硫酸化試薬と反応するものである場合には、多孔性粒子も多糖と共に硫酸化され得る。また、製造方法Ｉの場合であっても、硫酸化多糖との結合反応に供する多孔性粒子は硫酸化された多孔性粒子であってもよい。本発明において硫酸化された多孔性粒子は、硫酸化されたセルロースやアガロース粒子であることが好ましい。
【００４３】
硫酸化多糖は、多糖の水酸基を硫酸化したものであり、多糖の種類や硫酸化の方法は特に限定されるものではない。
製造方法Ｉに使用する硫酸化多糖は還元末端を持ち、所定の粘度に調製可能なものであれば限定されるものではなく、セルロース、デキストラン、プルラン、ジェラン、カードランなどを硫酸化することで入手できる。特に、粘度調整が容易で安価なデキストランやセルロースを硫酸化したものが好ましい。
製造方法ＩＩに使用する多糖は、安価で、所定の粘度に調製できるものであれば種類は問わないが、水溶性の高いものが安価で安全な水溶媒を利用できる点でさらに好ましく、これに従えばデキストランやプルランが特に好ましい。
さらに、製造方法Ｉのうち、結合反応２Ｂに使用することができる硫酸化多糖は硫酸化されていればその多糖の種類を問わない。安価に調達できる点で、特に、デキストラン、プルランおよびセルロースを硫酸化したものが好ましい。
また、セルロースの起源は限定されるものではなく、綿花やパルプや酢酸菌発酵由来などの何れのセルロースであっても、本発明に使用することができる。デキストランは乳酸菌醗酵由来のものなどが使用でき、プルランは黒色酵母由来のものなどが使用できる。さらに、多糖の精製度を高めたものや、低分子化するため硫酸などの酸加水分解をして用いても構わない。
【００４４】
多糖の硫酸化には、例えば、米国特許第４，４８０，０９１号パンフレットや特開２００６−２７４２４５号公報などに開示の通常知られた方法、即ち、ジメチルホルムアミドやピリジンなどの溶媒中で硫酸化剤にクロロスルホン酸を作用させる方法が利用できる。
【００４５】
特に、低粘度型の硫酸化セルロースの合成には、特開２００６−２７４２４５号公報、段落番号００２６〜００２８に記載された方法、即ち、セルロースをピリジン、ジメチルスルホキシド、あるいはジメチルホルムアミド等の溶媒で膨潤させ、硫酸化剤としてクロルスルホン酸、ピペリジン−Ｎ−硫酸、無水硫酸−ジメチルホルムアミド錯体、三酸化硫黄−ピリジン錯体、三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体、あるいは硫酸−トリメチルアミン複合体等を滴下する方法が好ましい。
【００４６】
その際の硫酸化剤の使用量は、目的とする硫酸化多糖の硫酸化率（または硫黄含有率）及び反応条件に従って異なるが、多糖の水酸基１に対し１．２〜３当量の割合で用いるのが適当である。反応は、溶媒、硫酸化剤の種類によっても異なるが、不活性ガス中で、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは２０〜８５℃にて、好ましくは０．５〜２４時間、より好ましくは０．５〜１０時間行う。
【００４７】
反応後、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等を反応液に加え、上記反応により生成した硫酸化多糖を沈殿させる。または、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等の中に反応液を滴下し、当該硫酸化多糖を沈殿させてもよい。
はたまた、反応液に蒸留水を加えて反応を停止し、次いで、水酸化ナトリウム等のアルカリで中和し、これをろ過または遠心分離し、固形分を蒸留水に溶解し、この溶解液にエタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等を加えて、当該硫酸化多糖を沈殿させてもよく、前述の溶解液をエタノール、イソプロピルアルコール、あるいはアセトン等の中に滴下し、当該硫酸化多糖を沈殿させてもよい。
前述のようにして沈殿させた硫酸化多糖を回収し、乾燥することによって本発明に使用する硫酸化多糖を得ることができる。
【００４８】
硫酸化多糖は、上記のような方法により製造してもよく、あるいは、市販品を使用してもよい。例えば、硫酸化セルロースの市販品として、関東化学社より販売されているアクロス社製セルロースサルフェート（商品名、高粘度型）や和光純薬社より販売されているデキストラン硫酸ナトリウムなどを挙げることができる。
【００４９】
前述のように、硫酸基の多孔性粒子表面への効率的な導入には、多孔性粒子の細孔径、および多糖あるいは硫酸化多糖の分子量、または分子量に依存する粘度や極限粘度の影響を受ける。本願発明に必須の多孔性粒子は、移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下のものである。この多孔性粒子に好ましい多糖または硫酸化多糖は、その分子量が多孔性粒子の排除限界分子量以上のものであることが好ましい。結合反応１に用いる硫酸化多糖の粘度（硫酸化多糖を１重量％水溶液とした際の粘度）は特に限定されるものではないが、硫酸化多糖が硫酸化セルロースである場合には、１５〜３００Ｍｐａ／ｓｅｃ・２０℃の範囲であることが好ましい。また、結合反応２に用いる多糖あるいは硫酸化多糖における粘度も特に限定されるものではないが、その極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．４０〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である。粘度（硫酸化多糖を１重量％水溶液とした際の粘度）または極限粘度がこの範囲であれば、多糖または硫酸化多糖を多孔性粒子表面に効率よく配置でき、その結果、ウイルス粒子の結合に必要な硫酸エステル基を粒子表面に効率よく導入することができる。
【００５０】
結合反応１に用いる硫酸化多糖の粘度は、ＪＩＳ Ｚ ８８０３「液体の粘度−測定方法」単一円筒型回転粘度計の方法に準じて実施することができる。純水で硫酸化多糖の１重量％水溶液を調整し、この水溶液の粘度を、２０℃にてＢ型粘度計（東機産業社）の円盤に働く液体の粘性抵抗トルクを測ることによって求めることが可能である。
また、結合反応２に用いる多糖および硫酸化多糖の極限粘度は、日本薬局方１４版に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」にしたがって、数個の異なる濃度の高分子溶液の粘度を求めて粘度の濃度依存性を測定し、得られた直線の濃度を０に外挿することにより求めることができる。本発明において極限粘度は、この日本薬局方１４版に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」で求めた値である。
【００５１】
なお、デキストランの極限粘度は、重量平均分子量と下記の関係式を満たすことが知られていることから、デキストランの極限粘度を、重量平均分子量から求めることもできる。
極限粘度（η）＝９×１０−４×重量平均分子量（Ｍｗ）０．５
【００５２】
重量平均分子量を目安にする場合、本発明に使用する多糖または硫酸化多糖の重量平均分子量は、７０ｋＤａ以上がより好ましく、１５０ｋＤａ以上がさらに好ましい。また、多糖または硫酸化多糖の重量平均分子量は、５００ｋＤａ以下がより好ましい。
【００５３】
本発明において多孔性粒子に結合される硫酸化多糖の硫黄含有割合は特に限定されるものではない。前述の製造方法Ｉの場合においては、結合法が安価なアルカリ水系のために硫酸化多糖も水溶性が高いほど結合が容易となる。セルロースなどの水に溶けにくい多糖を用いる場合、水に易溶化させるには１５重量％以上の硫酸化が必要である。また、多糖の水酸基に導入された硫酸基は本発明のクロマトグラフィー用充填剤のリガンドとして機能することから、リガンド密度をあげることで効果的にウイルス粒子などの目的物質を吸着することができる。さらに、リガンドである硫酸エステル基を増やすことで、逆の負の電荷をもつ宿主由来の核酸の吸着を電気的な反発により低減させる効果も期待される。多糖を構成する単糖一つあたりに１分子の硫酸基が導入されていることが好ましい。従って、結合反応の操作性と性能の観点から、当該硫黄含有割合は１２重量％以上であることが好ましく、より好ましくは１５重量％以上である。この場合、多孔性粒子に結合させた時の、即ち、クロマトグラフィー用充填剤とした時の当該硫黄含有割合は、本発明のクロマトグラフィー用充填剤に対して０．２〜６重量％範囲であることが、吸着性能の発揮の点で好ましい。
製造方法ＩＩ場合においては、硫酸基を高導入していくことは、前述のクロマトグラフィー用充填剤における吸着性能の点で好ましいが、多孔性粒子が硫酸化されるものである場合、硫酸基のあまりの高導入化は充填剤の軟化をもたらす。実用的な、流速性能を維持する必要があることから、当該硫黄含有割合は本発明のクロマトグラフィー用充填剤に対して０．２〜６重量％の範囲であることが好ましい。
【００５４】
硫酸化多糖中の硫黄含有割合は、イオンクロマトグラフィー法により求めることができる。具体的な測定条件等は、後述の実施例に記載したとおりである。
【００５５】
本発明において硫酸化多糖は、塩の形態であってもよい。特に、硫酸化セルロースの場合を例に取れば、保存安定性が高い点、製造工程上安価にできる点で、ナトリウム塩やカリウム塩が好ましい。
【００５６】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は、具体的には上記の製造方法Ｉあるいは製造方法ＩＩにより得ることができるものの、硫酸化多糖の多孔性粒子への結合率は比較的低くさらに硫酸化多糖は高価であることから、製造方法Ｉに較べ製造方法ＩＩの方が安価にできる。さらに、製造方法ＩＩでは多孔性粒子が多糖の場合、粒子側にも硫酸エステル基を導入することができることから、リガンドの分布を広くあるいは密にしたクロマトグラフィー用充填剤をより容易に得ることができる。
製造方法ＩＩの具体的態様は特に限定されるものではないが、本発明においては、下記の２工程を有するものであることが好ましい。
工程１：多孔性粒子と多糖を２以上の官能基を有する架橋剤により架橋し、
多糖結合多孔性粒子を得る。
工程２：工程１で得られた多糖結合性多孔性粒子を硫酸化試薬と反応させて
多糖を硫酸化する。
【００５７】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤は硫酸化多糖を含むためインフルエンザウイルスやＨＩＶ、日本脳炎ウイルス、肝炎ウイルスなどエンベロップを有すウイルスの吸着、回収に好適に利用することができる。
【００５８】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤のインフルエンザウイルスに対する吸着性能は、例えば、特開昭６１−４７１６８号公報や欧州特許出願公開第１８０８６９７号パンフレットに記載の方法で評価できる。評価に用いるインフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ型、発育鶏卵由来、ＭＤＣＫ細胞などの培養細胞由来のインフルエンザウイルスが利用でき、利用されるインフルエンザウイルスはホルマリンやβプロピオンラクトンを用いた不活化処理の有無を問わない。但し、精製度や回収度の改善のためには、インフルエンザウイルス溶液をフィルトレーションや除核酸処理などの前処理をすることが好ましい。
特に宿主細胞由来の核酸のワクチン製剤からの除去は重要である。一般に核酸はその構造により負電荷を帯びている。よって、本発明のクロマトグラフィー用充填剤のリガンドである硫酸基と電気的に反発する関係にある。こういった理由から宿主細胞由来の核酸の、本発明のクロマトグラフィー用充填剤への非特異的な吸着を低減させるためには、リガンド密度を上げることが効果的である。当該目的に有効な硫黄含有割合は０．２重量％以上であることが好ましい。
【００５９】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤に吸着されたインフルエンザウイルスは、高濃度のＮａＣｌなどの塩溶液を用いることで、イオン交換的に溶出回収が可能である。回収されたインフルエンザウイルスは、赤血球凝集試験など通常の方法でヘマグルチニンタイター（ＨＡ価）として評価できる。ウイルス評価法は国立予防衛生研究所学友会編 改定二版 ウイルス実験学各論（丸善）などに記載されている。
【００６０】
インフルエンザウイルスのクロマトグラフィーを用いた精製方法は、例えば、特開昭６１−４７１８６号公報や欧州特許出願公開第1 808 697号パンフレットなどに記載されており、当該分野では周知である。本発明のクロマトグラフィー用充填剤も、図１のプロセスフローの如く特開昭６１−４７１８６号公報や欧州特許出願公開第1 808 697号パンフレット記載の方法と同様にして、鶏卵あるいは細胞培養を宿主として増幅されたいずれかのインフルエンザウイルスの精製に用いることができる。
特に、本発明のクロマトグラフィー用充填剤にインフルエンザウイルスが効率よく吸着するよう、塩や宿主由来の核酸やタンパク質などの不純物を除去する工程を必要に応じて追加してもかまわない。このような方法は、一般的なクロマトグラフィーでタンパク質を精製する周知の方法に従うことが可能である。
また、インフルエンザウイルスをワクチン成分にする方法は、国際公開０１／２１１５１パンフレットや国際公開０２／２８４２２パンフレットなどにおいて公知である。このようにして得られたインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを含むタンパク質成分の精製にも、本発明のクロマトグラフィー用充填剤は利用できる。例えば、図１の工程で得られた精製ウイルス液から、エーテルや界面活性剤を用いて、ウイルス粒子を破壊する。その可溶化画分から、通常のクロマトグラフィーでタンパク質を精製する周知の方法に従い、且つ本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用い、ワクチン成分を精製することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに制限されるものではない。また、以下の実施例において「％」は、特段の説明が無い限り「重量％」を意味する。
１．測定方法
実施例において使用する測定方法は以下の通りである。
＜排除限界分子量＞
ゲル分配係数Ｋａｖの測定
（１）使用機器及び試薬
カラム ： エンプティカラム１／４×４．０ｍｍ
Ｉ．Ｄ×３００ｍｍ、１０Ｆ（東ソー）
リザーバー ： パッカ・３/８（東ソー）
ポンプ ： ＰＯＭＰ Ｐ−５００ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
圧力計 ： ＡＰ−５３Ａ（ＫＥＹＥＮＣＥ）
【００６２】
（２）カラム充填法
カラムとリザーバーを接続しカラム下部にエンドフィッティングを接続する。Ｋａｖを測定するゲルを減圧濾過した湿ゲルの状態で１５ｇ計りとり、５０ｍLビーカーへ入れた。そこへ超純水２０ｍＬ加え軽く攪拌し、ゲルが超純水中に分散した状態でリザーバーの壁を伝わらせるようにカラムへゆっくり加えた。ビーカーに残ったゲルは少量の超純水ですすぎゆっくりとカラムへ加えた。その後リザーバーの上部ぎりぎりまで超純水を加えリザーバーの蓋をした。リザーバー上部へアダプターを接続しポンプで超純水を送液した。送液ラインの途中に圧力計を接続しておき圧力をモニターした。圧力が０．３ＭＰａになるまで流速を上げ、その後３０分超純水を流しながら充填した。充填が終わったらポンプを止めアダプターとリザーバーの蓋を外した。次にリザーバーの中の超純水をピペットで吸いだした後リザーバーを外し、カラムからはみ出したゲルを除きエンドフィッティングを接続した。
【００６３】
（３）Ｋａｖ測定装置
システム ： ＳＣＬ−１０ＡＰＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ワークステーション ： ＣＬＡＳＳ−ＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ＲＩ検出器 ： ＲＩＤ−１０Ａ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
ポンプ ： ＬＣ−１０ＡＴ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
オートインジェクター ： ＳＩＬ−１０ＡＤＶＰ（ＳＨＩＭＡＺＵ）
【００６４】
（４）Ｋａｖ測定サンプル
１．PEG-19000 （ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＰＯＬＹＭＥＲ ＰＲＯＤＵＣＴＳ）分子量19700
２．PEG-8650（ＰＯＬＹＭＥＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量8650
３．PEG-4120（ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量4120
４．PEG-590（ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量590
５．PEG-220（ＰＯＬＹＭＥＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）分子量220
【００６５】
（５）Ｋａｖ導出式
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ０）／（Ｖｔ−Ｖ０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍL）、Ｖｔは空カラム体積（ｍL）、Ｖ０はデキストランＴ２０００保持容量（ｍL）である。］
【００６６】
（６）測定結果
本実施例において用いた多孔性粒子セルファインＧＨ２５のゲル分配係数Ｋａｖの結果を図２に示した。図２の結果から、本発明に用いたＧＨ２５の標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量は３０００Ｄａであった。
【００６７】
＜平均粒子径＞
スライドグラスに湿潤セルロース粒子を取り、光学顕微鏡を用いて倍率１００倍で撮影した写真から任意に２００粒子の長径を測定し、その平均値を平均粒子径とした。
【００６８】
＜粘度＞
ＪＩＳ Ｚ ８８０３「液体の粘度−測定方法」単一円筒型回転粘度計の方法に準じて実施した。即ち、硫酸化セルロースを純水で１％水溶液を調整し、この水溶液の粘度を、２０℃にてＢ型粘度計（東機産業社）の円盤に働く液体の粘性抵抗トルクを測ることによって求めた。
＜極限粘度＞
多糖の極限粘度は、日本薬局方１４版に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」にしたがって、数個の異なる濃度の高分子溶液の粘度を求めて粘度の濃度依存性を測定し、得られた直線の濃度を０に外挿することにより求めた。
【００６９】
＜硫黄含有割合＞
硫黄含有割合は、イオンクロマトグラフィー法にしたがい、次に記載の方法によって求めた。６０℃で１６〜２０時間真空乾燥したサンプルを乳鉢ですりつぶし、更に、１０５℃にて２時間乾燥した。この乾燥試料０．０５ｇに２Ｍの塩酸２．５ｍｌを加え、１１０℃にて１６時間加水分解した。氷冷後、上澄液を１ｍｌ採取し、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液で中和し、２５ｍｌにメスアップした。カラムに横河電機社製ＩＣＳ−Ａ−２３を用い、オーブン温度４０℃、溶離液に３ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３溶液、除去液に１５ｍＭ 硫酸をそれぞれ１ｍｌ／ｍｉｎの流量の条件で使用し、横河電機社製ＩＣ７０００イオンクロマトアナライザーを用いて分析し、さらに後述の標準溶液から作成した検量線を基にＳＯ４濃度を求めた。ブランク値は乾燥試料を加えずに同様に操作し時の値とした。ＳＯ４標準液（関東化学社製 陰イオン混合標準液IV）より２μｇ／ｍｌ液を本測定法の標準溶液とし、更に段階希釈し、同様の条件でイオンクロマトアナライザーにて分析し、検量線を作成した。硫黄含有割合は下記式にて求めた。なお、Ｘ試料、ＸブランクはＳＯ４標準液による検量線から求めた濃度（ｘ１０−４％）である。
硫黄含量（ｘ１０−４％）
＝（Ｘ試料−Ｘブランク）ｘ２５ｘ２．５ｘ０．３３３３／０．０５
【００７０】
＜リゾチーム溶出量＞
クロマトグラフィー用充填剤を吸着バッファー（０．０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)−０．１５Ｍ ＮａＣｌ）でけん濁、平衡化した後、けん濁液２ｍＬを内径０．５ｃｍのカラムに充填し、同吸着バッファー４０ｍＬを流速４０ｍＬ／ｈで通液した。続いて、この充填カラムに吸着バッファーを溶媒として３．３３ｍｇ／ｍＬに調整したリゾチーム（生化学工業社製）溶液３０ｍＬを、流速６０ｍＬ／ｈの流速で１時間、循環通液した後、吸着バッファー２０ｍＬで洗浄した。次いで、５０ｍＬの溶出バッファー（０．０１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)−０．６Ｍ ＮａＣｌ）を用い、流速５０ｍＬ／ｈの条件でリゾチームを溶出させた。溶出バッファーを対照として、２８０ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。標準液には、前述のリゾチーム溶液を溶出バッファーで１０倍希釈したものを用いた。
溶出量(ｍｇ／ｍＬ−ゲル)
＝０．３３３×２５×（２８０ｎｍ溶出液の吸光度／２８０ｎｍ標準液の吸光度）
【００７１】
＜ＨＡ価＞
丸底９６穴（縦８×横１２列）プレートに生理食塩水５０μLを加え、サンプル５０μLを１番目のウェルに加えて混合して２倍希釈した後、希釈液５０μLを横隣のウェルに加えよく混合した。同様にして２倍希釈系列を１２番目のウェルまで調整した。コントロールとしては、１から１２番目のウェルを生理食塩水のみとした。サンプル及びコントロールに０．５％鶏赤血球浮遊液５０μLを加え混合した後、室温で３０分以上静置し、放置後赤血球の凝集状態を判定した。判定はプレートを傾斜させた際、底に沈んだ赤血球が容易に流れ出す時を凝集陰性とし、流れでない時を凝集陽性とし、凝集陽性を示すウイルスの最大希釈倍率をＨＡ価とした。
【００７２】
＜流速性能＞
内径２．２ｃｍｘ高さ２０ｃｍのポリカーボネート製カラム（東京理化製）にクロマトグラフィー用充填剤を２０ｃｍ高さで充填した。このカラムに２４℃の純水を通液し、その際のカラム入口とカラム出口の圧力を測定した。なお、通液は初期においては、２０ｍＬ／分以下の流速から始めて、その後流量を段階毎に増加させ、３分から５分通液を継続した後、圧力を測定した。圧力はカラム入口の圧力からカラム出口の圧力を差し引いて求めた。線速度は、下記の式により算出した。
線速（ｃｍ／時間）＝測定時の流量（ｍＬ／時間）／カラム断面積（ｃｍ２）
【００７３】
＜エポキシ基量＞
エポキシ基量は、特開２０００−３２１２６７に記載の方法に準じて測定した。まず、測定するゲル約１０ｇを５００ｍｌの純水で１５分間洗浄後、吸引ろ過して水を良く切り、測定サンプルを得た。ここで、本サンプル約１ｇを赤外水分計を用いて含水率を測定しておく。次いで、５０ｍｌ蓋付三角フラスコ３本に測定サンプルを１．００ｇずつ分取した。これに１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム３ｍｌを加え、３０℃で１時間振盪させた。ここにフェノールフタレイン溶液を１〜２滴加え、０．０１Ｍ塩酸で滴定し、エポキシ基量を算出した。
エポキシ基量（μｍｏｌ／ｇ−ｗｅｔ）＝０．０１×ｆ×Ａ×１０３
ｆ：塩酸のファクター
Ａ：０．０１Ｍ塩酸の滴定量（ｍｌ）
エポキシ基量（μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙ）
＝エポキシ基量（μｍｏｌ／ｇ−ｗｅｔ）×含水率
【００７４】
＜ＨＡ価を指標とする１０％ＤＢＣ量の測定＞
試作した各充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ３×５０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液１１ｍＬを、カラムへの通液を開始すると同時にカラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。この流出液の１ｍＬ画分の５０μＬを使用し、ＨＡ価を測定した。さらに、試験ウイルス液50μＬのＨＡ価の１／１０に到達する直前の画分までの総液量（μＬ）を求めた。本測定系に於ける１０％ＤＢＣは以下のようにして求めた。
１０％ＤＢＣ（ＨＡ価／ml-gel）
＝（総液量 ｘ １／５０ ｘ 試験ウイルス液５０μＬのＨＡ価）／カラム容量（ml-gel）
【００７５】
２．試験インフルエンザウイルスの作製
接種ウイルスとして、Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株、および、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｏｋｋａｉｄｏ／Ｖａｃ−２／０４（Ｈ７Ｎ７）株を選び、それぞれの保存ウイルス原液を、滅菌ブイヨン培地（日水製薬製、１０００Ｕ／ｍＬのペニシリンと１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む）で１０００倍に希釈して接種用の希釈ウイルス液を２種類得た。
上記のＨ１Ｎ１およびＨ７Ｎ７のウイルス株毎に、１０日齢発育鶏卵の腹膜腔内に希釈ウイルス液を接種し、３７℃、２日間培養した後、４℃で１６時間放置した。鶏卵より漿尿液を回収し、不活化のため０．１％のβプロピオンラクトンを添加し、２種類の試験ウイルス液を作成した。Ｈ１Ｎ１は１ロットの、Ｈ７Ｎ７株は単位体積当たりのＨＡ価の異なる３ロットをそれぞれ作製し、本実施例ウイルス吸着試験に使用した。
【００７６】
３．クロマトグラフィー用充填剤の製造＜結合反応１＞
（１）硫酸化多糖Ａの合成
温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた３Ｌのセパラブルフラスコ（反応容器）に、結晶セルロース（旭化成株式会社製 商品名 セオラスＰＨ１０１）、平均重合度２４２）１８０ｇ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１６０ｍＬを投入し、一晩攪拌した。次いで、これに、氷冷下１８％−無水硫酸−ＤＭＦ錯体１２２１ｇを３５分かけて投入した後、この反応容器を２０℃の恒温槽に浸け、２０分かけて昇温させ２０℃で６時間反応させた。
反応終了後、反応液を５℃まで氷冷し、氷冷しながら超純粋水１２２０ｍＬを７５分かけて徐々に投入し、続いて、1Ｎの水酸化ナトリウム溶液を反応液のｐＨが７になるまで徐々に投入した。生じた沈殿をろ別し、ろ液を２０Ｌのイソプロピルアルコール中に投入して沈殿物を得た。さらに沈殿物をろ別し、４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースナトリウム塩（硫酸化多糖Ａ）を得た。得られた硫酸化セルロースナトリウム塩の収量は１３０ｇであり、２０℃の純水に対する溶解度は１５ｇ／Ｌ、硫黄含量は１４．０％、粘度は１８．４ｍＰａ・ｓであった。
【００７７】
（２）硫酸化多糖Ｂの合成
温度計、滴下ロート、攪拌装置、及び窒素ガス導入管を備えた２Ｌ（リットル）のセパラブルフラスコ（反応容器）に、日本薬局方脱脂綿（発売元：ピップトウキョウ株式会社）５．０ｇ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３５０ｍＬを投入し、一晩攪拌し充分にＤＭＦを浸潤させた。次に、この反応容器を１０℃の恒温槽に浸け、１８％−無水硫酸−ＤＭＦ錯体１２３ｇを1時間かけて投入し、さらに１０℃の恒温槽に浸けたまま、４日間反応させた。
反応終了後、反応液を５℃まで氷冷し、氷冷しながら水１０００ｍＬを７５分かけて徐々に投入し、続いて、1Ｎの水酸化ナトリウム溶液を反応液のｐＨが７になるまで徐々に投入した。生じた沈殿物をろ別し、ろ液を１０００ｍＬのイソプロピルアルコール中に投入して沈殿物を得た。さらに沈殿物をろ別後、４０℃で８時間減圧乾燥し、硫酸化セルロースナトリウム塩（硫酸化多糖Ｂ）を得た。得られた硫酸化セルロースナトリウム塩の収量は１３ｇであった。硫黄含量は１６．０％であった。粘度は４５．７ｍＰａ・ｓであった。
【００７８】
（３）製造例１（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）多孔性粒子のエポキシ化
出発原料の多孔性粒子としてセルファインＧＨ２５（チッソ社製、セルロース粒子）を使用した。この多孔性粒子は、粒子径が４４〜１０５μｍで、平均粒子径が６７μｍであった。また、標準ポリエチレングリコールとＫａｖの関係は図２であり、これより求めた排除限界分子量は約３０００Ｄａであった。
７５０ｇ（含水率２．８９）のセルファインＧＨ２５を、６４１５ｍＬの水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液１３４４ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン１４８２ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）７５７ｇを得た。エポキシ活性化湿潤ゲル１．０ｇを１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液３．０ｍＬとともに３０℃に温度設定した振騰機で１時間振騰し、０．１ｍｏｌ・Ｌ塩酸で滴定することによりエポキシ量を定量した。その結果、エポキシ量は３０８．６ｍｏｌ／ｇ（乾燥）であった。
【００７９】
２）エポキシ活性化湿潤ゲルのアミノ化
上記で得られたエポキシ活性化湿潤ゲル６５０ｇを、９７５ｍＬの２５％アンモニア水とともに攪拌機付き反応器に仕込んだ。よく攪拌を行いながら、内部温度を３５〜４０℃に調製し、２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、アミノ化したエポキシ活性化湿潤ゲル（アミノ化湿潤ゲル）６５３ｇを得た。このアミノ化湿潤ゲルの含水率を、５０℃の真空乾燥機で一晩乾燥した粒子の重量減より求めた結果、当該含水率は３．２８％であった。また、ケルダール法により求めた窒素含有割合は４５００ｐｐｍであった。
【００８０】
３）硫酸化多糖Ａの結合
アミノ化湿潤ゲル８０ｇを、１６０ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した。次いで、これに硫酸化多糖Ａを０．６１ｇ添加し、５０℃で４８時間反応を行った。その後、ジメチルアミンボラン２．４４ｇを添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル８０ｇを得た。
【００８１】
４）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル８０ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液４００ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を１００ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、無水酢酸をさらに１００ｍＬ滴下し３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤７７ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．２３％であり、リゾチーム溶出量は０．９ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【００８２】
（４）製造例２（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）硫酸化多糖Ｂの結合
製造例１で得られたアミノ化湿潤ゲル１２ｇを、２４ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した後、硫酸化多糖Ｂを０．４２１ｇ添加し、５０℃で４８時間反応を行った。これに、ジメチルアミンボランを０．４２ｇ添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル１２．５ｇを得た。
【００８３】
２）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル１２．５ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液６２．５ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０ ℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を１５．６ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、無水酢酸さらに１５．６ｍＬを滴下し、３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、残った白色固体を水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１２．０ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．１３％であった。また、リゾチーム溶出量は１．８ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【００８４】
（５）製造例３（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）アクロス社製硫酸化セルロースの結合
製造例１で得られたアミノ化湿潤ゲル２０ｇを、４０ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した。市販の硫酸化セルロース（アクロス社製、粘度２４１．０ｍＰａ・ｓ）２．１１ｇを添加し、５０℃で４８時間反応を行った。これにジメチルアミンボラン０．７ｇを添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル１８．５ｇを得た。
【００８５】
２）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル１８．５ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液６２．５ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０ ℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を２３ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、さらに無水酢酸２３ｍＬを滴下し、３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１８．４ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．２３％であった。また、リゾチーム溶出量は２．８０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【００８６】
（６）製造例４（多孔性粒子と硫酸化多糖の結合）
１）アクロス社製硫酸化セルロースの結合
製造例１で得られたアミノ化湿潤ゲル８０．０ｇを、１６０ｍＬの０．０２Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を５０℃に調整し１時間撹拌した。市販の硫酸化セルロース（アクロス社製、粘度２４１．０ｍＰａ・ｓ）７．０ｇを添加し、５０℃で４８時間反応を行った。これにジメチルアミンボラン２．８ｇを添加し７２時間反応を行った後、反応液を濾過した。残った白色固体を水で十分に洗浄した後、１５分間吸引乾燥を行い、硫酸化多糖結合湿潤ゲル８３．３ｇを得た。
【００８７】
２）残アミノ基保護
その硫酸化多糖結合湿潤ゲル８３．３ｇを５．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液４１６ｍＬとともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。内部温度を０ ℃に調整し、よく撹拌を行いながら無水酢酸を１０４ｍＬ滴下した後３０分間反応を行った。内部温度を室温まで昇温した後、さらに無水酢酸１０４ｍＬを滴下し、３０分間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤８３．３ｇを得た。乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．０３％であった。
【００８８】
４．ウイルス吸着試験１
（１）製造例１のクロマトグラフィー用充填剤と製造例３のクロマトグラフィー用充填剤との比較
充填剤として、製造例１のクロマトグラフィー用充填剤と製造例３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた。
各充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ３×５０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液８ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：４０９６０）のカラムへの通液を開始すると共に、カラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。
上記試験ウイルス液の通液終了後、０．０１Ｍリン酸バッファー、０．１９ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２の通液を開始し、非吸着画分を洗い流した。非吸着画分の洗浄が終了した後、０．０１Ｍリン酸バッファー，３ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０の通液を開始し、カラムに吸着しているウイルスが完全に溶出されるまで通液を実施した。溶出終了後、回収した流出液のＨＡ価を測定し吸着量を求めた。その結果、ウイルス吸着量は、製造例１のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には２１０００ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであり、製造例３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には２５７２０ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。吸着量（ＨＡ価）は、下記の式から求めた。
吸着量 ＝ 通液した総ＨＡ価 − 非吸着画分の総ＨＡ価
【００８９】
（２）製造例３のクロマトグラフィー用充填剤と市販セルファインサルフェートとの比較
充填剤として、製造例３のクロマトグラフィー用充填剤と市販セルファインサルフェート（チッソ社製、硫黄含有割合：０．０９％）を用い、試験ウイルスとして、試験ウイルスをＨ１Ｎ１株とし、試験ウイルス液を２ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：８１９２０）とした以外は、前述のウイルス吸着試験に準じて試験を実施した。その結果、製造例３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合には６４８４０ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであり、市販セルファインサルフェート（チッソ社製）を用いた場合には６４８００ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌと同じ吸着性能を有す結果であった。
【００９０】
５．流速性能の比較
ほぼ同じ硫黄含有割合のセルファインサルフェートと製造例４で得られたクロマトグラフィー用充填剤の流速性能を比較した。
製造例４で得られたクロマトグラフィー用充填剤（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合は０．０３％）の流速性能を前述の測定方法に従って測定した。この充填剤のカラム入口の圧力からカラム出口の圧力を差し引いた値が０．３ＭＰａとなった時の流速性能は、線速２２００ｃｍ／ｈであった。一方、セルファインＧＨ２５に対し、乾燥ゲルにおける硫黄含有割合が０．０２％となるように直接硫酸化したセルロース粒子の同条件での流速性能は、線速７００ｃｍ／ｈであった。同等の硫黄含量に対し、本発明によって製造されたクロマトグラフィー用充填剤は約３倍の流速性能を示した。尚、前述の０．０２％硫酸化ゲルは次のようにして製造した。
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２９５ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸３．００ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいたＧＨ２５の乾燥重量４５ｇ（含水率０．３８％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４３．６ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１１０ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．０２％）を得た。
【００９１】
表1に上記試験の結果をまとめた。製造例３のクロマトグラフィー用充填剤は市販硫酸化セルファインと同等の吸着性能を示していた。また、本発明によって製造されたクロマトグラフィー用充填剤は同硫黄含量では、市販硫酸化セルファインの３倍の流速性能を示したことから、発明の硫酸化セルロースをリガンドとするセルロース粒子は、効率よくウイルスを吸着し、かつ高流速で使用できるものであった。
【００９２】
【表１】
【００９３】
６．クロマトグラフィー用充填剤の製造＜結合反応２Ａ＞
（１）エポキシ活性化湿潤ゲルの製造（参考例１−３）、および当該ゲルと多糖との複合体の製造（参考例４−１２）
１）参考例１
出発原料の多孔性粒子としてセルファインＧＨ２５（チッソ社製、セルロース粒子）を使用した。８５０ｇ（含水率３．６８）のセルファインＧＨ２５を、５７５０ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液１２２５ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン１３１９ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）８４７ｇを得た。このエポキシ基量は３１３μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙであった。
【００９４】
２）参考例２
１０００ｇ（含水率５．３８）のセルファインＧＨ２５を、４３２０ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液９８７．５ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン３１８ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）７５５ｇを得た。このエポキシ基量は１０５μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙであった。
【００９５】
３）参考例３
１０００ｇ（含水率５．３８）のセルファインＧＨ２５を、４３２０ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込んだ。よく撹拌を行いながら内部温度を３０℃に調整し、２０％ＮａＯＨ水溶液９８７．５ｇを添加した。１時間撹拌後、エピクロロヒドリン１０６ｇを添加して２時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、エポキシ化された多孔性粒子（エポキシ活性化湿潤ゲル）７２０ｇを得た。このエポキシ基量は１７．３μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙであった。
【００９６】
４）参考例４
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）２８．０ｇを、１５５．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．６１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．３ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１２１ｇを得た。
【００９７】
５）参考例５
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）４４．４ｇを、１５５．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．６１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．３ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１１７ｇを得た。
【００９８】
６）参考例６
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）６３．０ｇを、１５５．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．６１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．３ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１１６ｇを得た。
【００９９】
７）参考例７
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）２９．０ｇを、１３５．８ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例２で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１５０ｇ（含水率４．３１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．９ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１４７ｇ（含水率３．９０）を得た。
【０１００】
８）参考例８
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）４６．０ｇを、１３５．８ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例２で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１５０ｇ（含水率４．３１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．９ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１４５ｇ（含水率４．９９）を得た。
【０１０１】
９）参考例９
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）６５．２ｇを、１３５．８ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例２で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１５０ｇ（含水率４．３１）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１７．９ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１４２ｇ（含水率４．８３）を得た。
【０１０２】
１０）参考例１０
化粧品用プルラン（株式会社林原社製、極限粘度０．７３ｄＬ／ｇ）５４．４８ｇを、１１８．５ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込みプルランが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例３で製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率４．１６）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１５．０ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、プルラン化された多孔性粒子１１４．６ｇ（含水率４．１０）を得た。
【０１０３】
１１）参考例１１
高分子デキストランＥＨ（名糖産業株式会社製、分子量２０万相当、極限粘度０．４２ｄＬ／ｇ）６０．０ｇを、１４２．９ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込み高分子デキストランＥＨが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１と同様に製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．７５、エポキシ基量２９７μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙ）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１６．５ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、デキストラン化された多孔性粒子１１６．７ｇを得た。
【０１０４】
１２）参考例１２
高分子デキストランＥＨ（名糖産業株式会社製、分子量２０万相当、極限粘度０．４２ｄＬ／ｇ）４２．４ｇを、１４２．９ｍＬの純水とともに撹拌機付き反応器に仕込み高分子デキストランＥＨが完全に溶解するまで撹拌した後、参考例１と同様に製造したエポキシ活性化湿潤ゲル１２０ｇ（含水率３．７５、エポキシ基量２９７μｍｏｌ／ｇ−ｄｒｙ）を、反応器内に加えた。良く撹拌しながら内部温度を３０℃に調整し、１時間撹拌後、４５％ＮａＯＨ水溶液１６．５ｇを添加して１８時間反応を行った。反応終了後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。３０分間吸引乾燥を行い、デキストラン化された多孔性粒子１１7．8ｇを得た。
【０１０５】
（２）参考例４〜１２の硫酸化
１）製造例５
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２００ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．９９ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例４で製造したプルラン化された多孔性粒子３０．５ｇ（含水率０．４８％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４０．９ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１１０．８ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：２．４％）を得た。
【０１０６】
２）製造例６
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２０１ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．０２ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例５で製造したプルラン化された多孔性粒子３０．６ｇ（含水率０．４５％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４１．１ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１０５．３ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．１％）を得た。
【０１０７】
３）製造例７
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２０６ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．１７ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例６で製造したプルラン化された多孔性粒子３１．４ｇ（含水率０．７０％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４２．１ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１０２．６２ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．８％）を得た。
【０１０８】
４）製造例８
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２１８ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．５４ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例７で製造したプルラン化された多孔性粒子３３．４ｇ（含水率０．５６％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４４．７ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１３５．１ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：２．１％）を得た。
【０１０９】
５）製造例９
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２０５ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．１４ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例８で製造したプルラン化された多孔性粒子３１．２ｇ（含水率０．５６％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４１．９ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１３２．９ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：２．１％）を得た。
【０１１０】
６）製造例１０
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン２１３ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸６．３９ｇを滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例９で製造したプルラン化された多孔性粒子３２．５ｇ（含水率０．４８％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液４３．６ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１２７．４ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．４％）を得た。
【０１１１】
７）製造例１１
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン１７２ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．１７ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例１０で製造したプルラン化された多孔性粒子２６．３ｇ（含水率０．４０％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液３５．３ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤９８．８ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．０％）を得た。
【０１１２】
８）製造例１２
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン１８３ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．４８ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例１１で製造したデキストラン化された多孔性粒子２７．８７ｇ（含水率０．６３％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液３７．４ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤９９．８ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．９％）を得た。
【０１１３】
９）製造例１３
滴下ロート、冷却コンデンサー、撹拌子、温度計を取り付けた５００ｍｌセパラブルフラスコを十分に窒素置換した後、脱水ピリジン１８０ｇを反応器内に加え窒素シールし、５℃まで冷却した。次いで、クロロスルホン酸５．３９ｇを、滴下ロートを用いて５分かけて滴下し、５〜１０℃で１時間撹拌した後、反応器内の温度を６５±２℃まで昇温した。次に、予め真空減圧乾燥機にて８０℃、１３Ｐａで水分が１％以下になるまで減圧乾燥しておいた参考例１２で製造したデキストラン化された多孔性粒子２７．４０ｇ（含水率０．５２％）を反応器内に加え、４時間反応させた。次に、反応器内温度を２５℃に冷却し、２０％水酸化ナトリウム水溶液３６．８ｇを加え、３０分間攪拌後、反応を停止した。一晩静置後、反応液を濾過し、濾液が中性になるまで水で十分に洗浄した。１５分間吸引乾燥を行い、クロマトグラフィー用充填剤１０２．６ｇ（乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：１．６％）を得た。
【０１１４】
７．ウイルス吸着試験２
（１）ウイルス吸着試験：製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を用いたウイルス吸着試験
充填剤として、製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を用いた。
製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ３×５０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液１０ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：５１２００）を、カラムへの通液を開始すると同時にカラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。
上記試験ウイルス液の通液が終了後、０．０１Ｍリン酸バッファー、０．１９ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２の通液を開始し、非吸着画分を洗い流した。非吸着画分の洗浄が終了した後、０．０１Ｍリン酸バッファー，３ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０の通液を開始し、カラムに吸着しているウイルスが完全に溶出されるまで通液を実施した。溶出終了後、回収した流出液のＨＡ価を測定し、１０％ＤＢＣ量を求めた。その結果、１０％ＤＢＣ量は３８６０８ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【０１１５】
（２）製造例５〜８、および１０〜１２のクロマトグラフィー用充填剤を用いたウイルス吸着試験
充填剤として製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を製造例５〜１２のクロマトグラフィー用充填剤にそれぞれ替えた以外は前述のウイルス吸着試験に準じて試験を実施した。その結果、製造例５、６、７、１１および１２のクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合の１０％ＤＢＣ量は４１５１４ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌ、製造例８および１０を用いた場合は５５３５２ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
【０１１６】
（３）対照実験１（市販セルファインサルフェート）
製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を市販セルファインサルフェート（対照充填剤、チッソ社製、乾燥ゲルにおける硫黄含有割合：０．０９％）に替えた以外は前述のウイルス吸着試験に準じて試験を実施した。その結果、市販セルファインサルフェートのクロマトグラフィー用充填剤を用いた場合の１０％ＤＢＣ量は２７６７６ＨＡ／ｍＬ−ｇｅｌであった。
製造例５〜１２の本発明のクロマト用充填剤は表２に示した通りいずれも１０％ＤＢＣの比較においてインフルエンザウイルスを効率よく吸着し、さらに市販のセルファインサルフェートに比べ１０％ＤＢＣ ＨＡ価/ｍｌで表されるウイルス吸着比で１．４〜２倍の値を示した。
【０１１７】
８．ウイルス精製に伴う核酸吸着評価
本実施例の核酸量はｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から市販されているＱｕａｎｔ−ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｋｉｔｓを用いて行った。
核酸吸着実験
充填剤として、製造例１３のクロマトグラフィー用充填剤を用いた。
試作した充填剤を水に分散させ減圧下で攪拌しながら脱気した。脱気した後、φ８×２０ｍｍのカラムにクロマトグラフィー用充填剤を充填し、カラムをＢｉｏｌｏｇｉｃ ＬＰシステム（バイオ・ラッド社製）に取り付け、カラム容量の１０倍以上の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４を流し平衡化した。その後、アドバンテック社セルロースアセテート製のメンブレンフィルター(製品名 DISMIC-25cs)でろ過したＨ７Ｎ７株の試験ウイルス液８ｍＬ（使用時の総ＨＡ価：９２１６０、総核酸量１１２１０ｎｇ）を、カラムへの通液を開始すると同時にカラムからの流出液を１ｍＬずつ回収した。ウイルス液の通液が終了後、０．０１Ｍリン酸バッファー、０．１９ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．２の３５ｍｌ通液をし、非吸着画分を洗い流した。非吸着画分の洗浄が終了した後、０．０１Ｍリン酸バッファー，３ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０の２５ｍｌにてウイルスを溶出させた。溶出終了後、回収した流出液の核酸量を定量した。その結果、溶出画分中に含まれる核酸総量は９３５ｎｇで、総ＨＡ価は７７４４０であった。
【０１１８】
（２）対照実験２（市販セルファインサルフェート）
製造例９のクロマトグラフィー用充填剤を市販セルファインサルフェート（チッソ社製、硫黄含有割合：０．０９％）に替えた以外は前述の核酸吸着実験に準じて試験を実施した。その結果、市販セルファインサルフェートの溶出画分中の核酸総量は１４７４ｎｇであり、総ＨＡ価は８００８０であった。
本結果から、本発明のクロマトグラフィー用充填剤を用いることで、対照とする市販セルファインサルフェートに対し、ウイルス吸着はほぼ同等を示しているが、約６３％の核酸の低減化を図ることができた。
【０１１９】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖が結合しているクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
多孔性粒子と硫酸化多糖が２以上の官能基を有する架橋剤により架橋されている、請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、請求項１または２に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
多孔性粒子がセルロース粒子である、請求項１〜３の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
硫酸化多糖の極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、請求項１〜４の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
硫酸化多糖が硫酸化セルロース、硫酸化デキストラン、および硫酸化プルランから選ばれた１種以上である、請求項１〜５の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
２以上の官能基を有する架橋剤が少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤である、請求項２に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項８】
少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤がエピクロロヒドリンである、請求項７に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項９】
硫黄含有割合が０．２〜６重量％の範囲である、請求項１〜８の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤
【請求項１０】
下記工程を有することを特徴とする請求項２に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
工程１：多孔性粒子と多糖を２以上の官能基を有する架橋剤により架橋し多糖結合多孔性粒子を得る。
工程２：工程１で得られた多糖結合多孔性粒子を硫酸化試薬と反応させて多糖を硫酸化する。
【請求項１１】
多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、請求項１０に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１２】
多孔性粒子がセルロース粒子である、請求項１０または１１に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１３】
多糖が水溶性多糖であり、その極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、請求項１０〜１２の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１４】
多糖がデキストランおよびプルランから選ばれた１種以上である、請求項１０〜１３の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１５】
下記一般式（１）で表される請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｚ 式（１）
（式（１）において、Ｘは平均粒子径が４０〜１２０μｍの範囲であるセルロース粒子であり、Ｘに結合しているＯはセルロースの水酸基由来の酸素であり、Ｚは硫酸化セルロースであり、Ｚに結合しているＣは硫酸化セルロース還元末端のアルデヒド由来の炭素である。）
【請求項１６】
硫酸化セルロースが、その硫黄含有割合が１５重量％以上であり、１重量％水溶液の粘度が１５〜３００ＭＰａ／ｓｅｃ・２０℃の範囲である、請求項１５に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１７】
請求項１〜９、請求項１５および請求項１６の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製することを特徴とする、ウイルス用ワクチンの製造方法。
【請求項１８】
ＤＮＡのクロマトグラフィー用充填剤への吸着が抑制された、請求項１７に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
【請求項１９】
ウイルス粒子がインフルエンザウイルスである、請求項１７または１８に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
【請求項１】
移動相を純水とし、標準ポリエチレングリコールを用いた時の排除限界分子量が６０００Ｄａ以下であり、平均粒子径が３０〜２００μｍの範囲である多孔性粒子に、硫酸化多糖が結合しているクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
多孔性粒子と硫酸化多糖が２以上の官能基を有する架橋剤により架橋されている、請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、請求項１または２に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
多孔性粒子がセルロース粒子である、請求項１〜３の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
硫酸化多糖の極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、請求項１〜４の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
硫酸化多糖が硫酸化セルロース、硫酸化デキストラン、および硫酸化プルランから選ばれた１種以上である、請求項１〜５の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
２以上の官能基を有する架橋剤が少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤である、請求項２に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項８】
少なくとも１つ以上のグリシジル基を有する２価以上の架橋剤がエピクロロヒドリンである、請求項７に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項９】
硫黄含有割合が０．２〜６重量％の範囲である、請求項１〜８の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤
【請求項１０】
下記工程を有することを特徴とする請求項２に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
工程１：多孔性粒子と多糖を２以上の官能基を有する架橋剤により架橋し多糖結合多孔性粒子を得る。
工程２：工程１で得られた多糖結合多孔性粒子を硫酸化試薬と反応させて多糖を硫酸化する。
【請求項１１】
多孔性粒子が４０〜１２０μｍの範囲の平均粒子径を有する、請求項１０に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１２】
多孔性粒子がセルロース粒子である、請求項１０または１１に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１３】
多糖が水溶性多糖であり、その極限粘度が０．２１〜０．９０ｄＬ／ｇの範囲である、請求項１０〜１２の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１４】
多糖がデキストランおよびプルランから選ばれた１種以上である、請求項１０〜１３の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤の製造方法。
【請求項１５】
下記一般式（１）で表される請求項１に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
Ｘ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｚ 式（１）
（式（１）において、Ｘは平均粒子径が４０〜１２０μｍの範囲であるセルロース粒子であり、Ｘに結合しているＯはセルロースの水酸基由来の酸素であり、Ｚは硫酸化セルロースであり、Ｚに結合しているＣは硫酸化セルロース還元末端のアルデヒド由来の炭素である。）
【請求項１６】
硫酸化セルロースが、その硫黄含有割合が１５重量％以上であり、１重量％水溶液の粘度が１５〜３００ＭＰａ／ｓｅｃ・２０℃の範囲である、請求項１５に記載のクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項１７】
請求項１〜９、請求項１５および請求項１６の何れか１項に記載のクロマトグラフィー用充填剤を用いてウイルス粒子を分離精製することを特徴とする、ウイルス用ワクチンの製造方法。
【請求項１８】
ＤＮＡのクロマトグラフィー用充填剤への吸着が抑制された、請求項１７に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
【請求項１９】
ウイルス粒子がインフルエンザウイルスである、請求項１７または１８に記載のウイルス用ワクチンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２２０９９２（Ｐ２０１１−２２０９９２Ａ）
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４１４５１（Ｐ２０１０−１４１４５１）
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２２日（２０１０．６．２２）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
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