グリメピリド誘導及びインスリン誘導グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ制御
【課題】哺乳類ＧＰＩ−ＰＬＣ（グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ）の活性を調節する化合物を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は明細書中に定義されるとおりである）の化合物、全てのその立体異性体の形態、及び全ての比率のそれらの混合物並びに生理的に許容されるその塩を提供する。
【解決手段】本発明は、式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は明細書中に定義されるとおりである）の化合物、全てのその立体異性体の形態、及び全ての比率のそれらの混合物並びに生理的に許容されるその塩を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類ＧＰＩ−ＰＬＣ（グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ）の活性を調節する、異なる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類原形質膜ＧＰＩ−ＰＬＣに特異的な阻害剤、ＧＰＩ２３５０の合成は、細菌やトリパノソーマの（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの（結晶）構造、基質の必要条件、ＧＰＩ認識及び切断機構についての背景的知識や、更にこれまでそれらについて記載された阻害剤に基づいていた。トリパノソーマのＧＰＩ―ＰＬＣに対しては、ＧＰＩ及びＰＩは、それぞれ、効率的な及び貧弱な基質である一方で、細菌のＰＩ−ＰＬＣに対してはその反対である。後者は、８０残基のトリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣにタンパク質配列が類似した領域を有している（“Kuppe et al., (1989), J. Bacteriol. 171:6077-6083"）。ＧＰＩ認識の解析のために、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓからのＰＩ−ＰＬＣの三次元構造が、グルコサミニル（α１→６）−ミオ−イノシトール（ＧＭＩ）との複合体で２.２オングストロームの分解能で最近決定され、ＧＭＩのミオ−イノシトール部分は遊離のミオ−イノシトールと同じ位置を占有しているのに対して、グルコサミン部分は触媒部位の入り口で溶媒に露出した状態にあることが明らかにされた（“Heinz et al.,(1995), EMBO J. 14:3855-3863" 及び“Heinz et al., (1996), Biochemistry 35:9496-9504"）。コア四糖類の残りの部分は、殆んどＰＩ−ＰＬＣと接触がなく、このことはＧＰＩアンカー内に受入れられたコアグリカンの顕著な構造多様性を説明しているのであろう。これらをもとにして、現時点の実験データは、細菌のＰＩ−ＰＬＣによるＰＩ及びＧＰＩの、更に、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩの切断の触媒機構は全て類似していることを示唆している。しかしながら、哺乳類ＰＩ−ＰＬＣがセカンドメッセンジャー、イノシトール三リン酸、を生成して、ＧＰＩアンカーを受入れることができず、細菌のＰＩ−ＰＬＣがリン酸化ＰＩを切断することができないことを考慮すると、このことが脂肪細胞原形質膜ＧＰＩ−ＰＬＣに対して正しいかどうかは知られていなかった。
【０００３】
細菌及びトリパノソーマの（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの基質必要条件は、以前、ＰＩ類縁体及びＧＭＩ誘導体で試験されていた。触媒作用には、イノシトールの２位に遊離のＯＨ基が必要とされる。Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ由来のミリスチン酸エステル含有ＶＳＧを用いた研究で、（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣは、ＧＭＩの２−デオキシ−イノシトール類縁体によって競合的に阻止され、イノシトール−２−ＯＨは、触媒作用には必要であるが、基質認識に重要ではないことが示された。更に、基質認識には、イノシトールの１位に荷電したホスホリル基（即ち、ホスホネート又はホスホジエステル）が必要である（“Morris, J. C., et al.,
(1996), J. Biol. Chem. 271:15468-15477”）。それ故、イノシトール−１位及びイノシトール−２位の両方のＯＨ基は触媒作用に関与しているが、なお、ホスホリル基のみが基質認識に必要であるようにみえる。興味深いことに、グルコサミン（α１→６）−イノシトール−１，２−環状リン酸は、トリパノソーマＧＰＩ−ＰＬＣに対してＧＭＩ−１−リン酸よりも、よりよい阻害剤であるが、細菌のＰＩ−ＰＬＣに対してはそうでないことが判明したが、このことは環状型が前者に対して生成物類縁体として作用するのであろうことを示唆している。更に、ＧＭＩ−１−リン酸のホスホネート誘導体は、十中八九切断できない基質類縁体であるので、より強力な阻害剤であることが判った。これらのデータは、細菌のＰＩ−ＰＬＣ作用について提案された２ステップ・メカニズムに合致している。つまり、ＰＩは、先ず切断されて環状イノシトール−１，２−リン酸（ｃＩＰ）構造を産生し、次いで、これがイノシトール−１−リン酸に加水分解される。興味深いことに、ｃＩＰ構造は、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣ触媒作用で、第２ステップ（脱環化）で
はなく第１ステップ（環化）の作用を示す、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ由来のＧＰＩ−ＰＬＣへの暴露を受けて、トリパノソーマのＶＳＧのいわゆる交差反応決定基として免疫学的に同定することができる。一過性又は安定したｃＩＰ形成に必要な条件は、ヒト赤血球ＡＣｈＥでのように、イノシトール残基の１位又は２位がパルミトイル化されたＧＰＩアンカーはホスホリパーゼ切断に抵抗性である、という発見と一致している。
【０００４】
ＧＭＩ−１−ドデシルホスホネートは、やはり膜と会合しているトリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣに対して相当するヘキシル誘導体よりもかなり阻害的であることが判った（“Morris, J. C. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270: 2517-2524"）。興味深いことに、イノシトールに炭水化物の置換基（即ち、グルコサミン）がないと、つまりイノシトール−１−リン酸の切断されない類縁体では、ミオ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシルリン酸によって例示されるように、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣを阻害することが見出された。この型の阻害剤の効率は、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣを１０〜９０μＭのＩＣ50で競合的に阻害する、２−フルオロ置換体を有する２−デオキシ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシルホスホネートの２位の置換体でかなり増加した（“Morris, J. C. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 15468-15477"）。これまでに報告されたＧＰＩ−ＰＬＣの最も強力な阻害剤は、２−デオキシ−イノシトールの２位にフルオロ基を、１位にドデシルホスホネートの両者を有しており、ミオ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシル−ホスホン酸よりも少なくとも５倍より阻害的である（“Morris, J. C. et al. (1998), Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 873-867"）。興味深いことは、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及びＴ．ｂｒｕｃｅｉ由来の（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣのこれら化合物のいくつかによる差別的な阻害は、二つの酵素が（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの機械的なサブクラスを表すと論じていることである。
【０００５】
残念ながら、類似のデータが哺乳類のＧＰＩ−ＰＬＣについて未だに得られていない。驚くべきことに、新しく合成されたミオ−イノシトール−１，２−シクロ−ドデシルホスホン酸（ＧＰＩ−２３５０）は、細菌及び脂肪細胞のＧＰＩ−ＰＬＣの強力な阻害剤であることが判った。
【０００６】
アルカリ性ホスファターゼ（ａＰ）が細菌のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によって膜二重層から放出されるという最初の観察は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質への共有結合を含むタンパク質の別の型の膜付着の同定へと導いた。
【０００７】
ＧＰＩアンカーの最初の完全な構造は、トリパノソーマ・ブルセイ由来の変異体表面グリコプロテイン（ＶＳＧ）について明らかにされた。
【０００８】
コア四糖類は、３つのマンノース残基と非アセチル化グルコサミンからなり、後者の一末端はホスホエタノールアミン架橋を経てタンパク質部分にアミド結合しており、他の末端はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の６−ヒドロキシル基にグリコシド結合的に結合している。ＰＩは、それぞれジアシルグリセロール及びホスファチジン酸を放出する特異性Ｃ及びＤの（Ｇ）ＰＩ−特異的ホスホリパーゼ［Ｇ］ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄによって切断され、タンパク質部分の末端（ホスホノ）イノシトールグリカン（ＰＩＧ）構造を残す。
【０００９】
それ以来、種々の起源の細菌ＰＩ−ＰＬＣが、ＧＰＩアンカー型タンパク質（ＧＰＩ−タンパク質）を検出するのに一般的に使用されている。
【００１０】
ＧＰＩアンカー型ＶＳＧからなる防護的表面被膜のＧＰＩ−ＰＬＣによる脂肪分解放出は、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉにとっては、宿主の免疫系を逃れるために抗原変異を達成するために必要であろうと推測される。
【００１１】
殆んどの哺乳類細胞及び組織は、大多数が原形質膜の外小葉に埋め込まれているＧＰＩアンカーを有しているＧＰＩ−タンパク質を発現するので、内因性の（Ｇ）ＰＩ／ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄが、それら細胞の表面発現の特異的ダウン・レギュレーションを調節し、同時に循環における可溶性タンパク質部分の増加を調節することができる。
【００１２】
ＧＰＩ−タンパク質の可溶性型は、５−ヌクレオチダーゼ（５’−Ｎｕｃ）、Ｔｈｙ−１、アルカリ性ホスファターゼ（ａＰ）及びＣＤ１６受容体のように血流内を循環していることが検出された。ＧＰＩ−ＰＬＣは、又、ヒト好中球、ウシ脳、ラット腸及びヒト上皮性悪性腫瘍細胞株において同定することができた。ラット肝からのＧＰＩ−ＰＬＣは、均質性を示すまで精製された。内因性ＧＰＩ−ＰＬＣは、ブタの最大の小管から腎ジペプチダーゼを放出する能力を有していると記載されていた。しかしながら、ＧＰＩ−ＰＬＣの構造又は遺伝子の解明は未だされていない。哺乳類ＧＰＩ−ＰＬＣが膜依存性であるのに対して、哺乳類ＧＰＩ−ＰＬＤは、異なった種（ヒト、ラット、ウシ）及び器官（胎盤、脳、肝、血清）の組織材料の全ての型から回収することができる。
【００１３】
ＧＰＩ−ＰＬＤの主な役割は、多分、リソソームへのエンドサイトーシス及びトラフィッキングの後のＧＰＩタンパク質のＧＰＩアンカーの分解である。哺乳類の組織は、血清中及び細胞表面において、異なった機能性を持って活性である二つのはっきりと識別できるＧＰＩ−ＰＬＤを持っている。
【００１４】
酵母及び齧歯類脂肪細胞の５’−Ｎｕｃ及びａＰのようないくつかのＧＰＩタンパク質は、インビトロ及びインビボでＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩアンカーの脂肪分解により細胞表面から可溶性のものとして放出されているようにはみえない。
【００１５】
付加的な温和な塩及び／又はトリプシン切断が、顆粒画分／細胞から分離の後に、可溶性画分／培地中のいくつかの脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質のタンパク質部分の回収に必要とされるのは、受容体タンパク質の存在を示唆している。
【００１６】
これらの場合において、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性はＧＰＩ−タンパク質の局在又はトポロジーに影響しないが、代わりに、両親媒性から親水性の形態への変換の途中で機能的（触媒／結合）特性を変化する。無処置のＧＰＩアンカーの存在は、それに付いているタンパク質部分の立体構造及び挙動に影響している。
【００１７】
５’−Ｎｕｃ及びＧｃｅ１の場合には、触媒及び結合効率は、膜に包埋された又は界面活性剤ミセル又はリポソームに再構築された完全な形のものと比較すると、脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質において増加した。
【００１８】
ＧＰＩタンパク質の脂肪分解プロセシングが細胞壁の生合成の間ある役割を演じているような、酵母におけるグルコースのような栄養シグナルによって、及び齧歯類の脂肪細胞、ミオサイト及びヒト内皮細胞におけるグルコースやある種のホルモン、増殖因子及び薬物（例えば、インスリン、グリメピリド）によって、真核生物において、多くのＧＰＩ−ＰＬが、アップレギュレートされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
グリメピリド、抗糖尿病薬は、膵細胞からインスリン放出を刺激することによって、更に、少しの程度であるが、筋肉細胞におけるグルコース輸送の活性化及び脂肪細胞における脂肪分解の阻害のような、末梢組織での代謝的インスリン作用を模倣することによって、主に血糖を低下させる。
【００２０】
スルホニルウレア、グリメピリド、の血糖低下効果は、部分的には、ＩＲＳ−ＰＩ３Ｋ経路のインスリン受容体非依存性活性化を経た脂肪細胞及び筋肉細胞における非酸化的グルコース代謝の刺激によって引き起こされる。単離したラット脂肪細胞において、グリメピリドの作用の分子機構は、アシル化された非受容体チロシンキナーゼ、ｐｐ５９Lyn、
及びいくつかのＧＰＩタンパク質のような脂質ラフト関連シグナリング成分の再分配及びそれに伴っておこる活性化、並びに、インスリンによって中程度に活性化もされる原形質膜グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ＧＰＩ−ＰＬＣの促進に関与していることが明らかにされている。
【００２１】
グリメピリドは、膵臓β細胞からのインスリン放出を促進するスルホニルウレア剤であり、膵臓外の機構を経て作用するであろう。グリメピリドは、血糖症が食事及び運動だけではコントロールされない２型（非インスリン依存性）糖尿病患者に１日１回投与され、続発性スルホニルウレア障害の患者にインスリンと併用されることもある。
【００２２】
グリメピリドの最大の血糖低下効果は、投与後最初の４時間に起こる。グリメピリドは、グリベンクラミド（グリブリド）よりも心臓血管変動に対する重篤な影響はより少ない。薬物動態は高齢の患者又は腎疾患や肝臓疾患のそれら患者において主として不変である。グリメピリドの薬物相互作用は殆んど報告されていない。
【００２３】
２型糖尿病患者において、グリメピリドの有効投与範囲は、０.５から８ｍｇ／日であり、４ｍｇ／日と８ｍｇ／日の投与間に有効性の差が殆んどない。グリメピリドは、１年間の試験において、グリベンクラミド及びグリピジドの有効性と類似していた。しかしながら、グリメピリドは最初の数週間にわたる治療でグリピジドよりもより速く血糖を低下するようである。グリメピリド及びグリクラジドが、１４週間の試験で基準線に良好に血糖コントロールができている患者で比較され、効果に差がないことが指摘された。グリメピリドとインスリンの併用は、絶食時血糖標的レベルが≦７.８ｍｍｏｌ／Ｌに達する続発性スルホニルウレア障害の患者の治療において、インスリンとプラセボの併用と同程度の効果があったが、グリメピリドを用いることにより血糖症に対してより低いインスリン投与量とより速い効果が見られた。
【００２４】
グリメピリド単独療法は、一般的に良好な耐容性を有するが、治療期間１年以下（≦１年）の患者の１０から２０％、及び６ヶ月間同時にインスリンを投与された患者の５０％以下（≦５０％）において、低血糖症を発症した。集計した治験データは、グリメピリドは、グリベンクラミドよりも低血糖症の発生率が低く、特に治療第１ヵ月目において低いであろうことが示唆された。投与量は、通常１ｍｇ／日で開始され、１から２週間の間隔で血糖コントロールのために通常の投与範囲１から４ｍｇ／日に漸増する（英国では最大６ｍｇ／日又は米国では８ｍｇ／日）。
【００２５】
グリメピリドは、主に膵臓β細胞からのインスリンの放出の促進によって、及び僅かな程度で、筋肉細胞におけるグルコース輸送の活性化及び脂肪細胞における脂肪分解の阻害のような、末梢組織における代謝性インスリン作用を模倣することによって、グルコースを低下させる。
【００２６】
グリメピリドは、初代培養又は培養した齧歯類脂肪細胞を薬理学的濃度で処理すると、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性化によって、５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＧｃｅ１のようなＧＰＩタンパク質サブセットの両親媒性から親水性への変換を強力に誘導することが明らかにされた。
【００２７】
本発明において初めて開示されたイノシトール誘導体、ＧＰＩ−２３５０は、高力価（
ＩＣ50＝０.２〜１０μＭ）及び選択性で細菌、トリパノソーマ及び血清ＧＰＩ−ＰＬＣ及びＧＰＩ−ＰＬＤを阻害する。ＧＰＩ−２３５０は、無処置のラット脂肪細胞のＧＰＩ−ＰＬＣを殆んど完全にダウンレギュレートする。ＧＰＩ−ＰＬＣは、代謝性インスリンシグナリングでは役割を演じない一方で、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性化は、界面活性剤不溶性の糖脂質に富む脂質ラフト領域（ＤＩＧ）からインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）へのインスリン受容体非依存性クロストークを経由するグリメピリドのインスリン模倣効果には必須である。
【００２８】
脂肪細胞のような多くの最終分化細胞の原形質膜に多数発現しているＤＩＧは、シグナル伝達並びにタンパク質及び脂質のトラフィッキング及び選別を包含する膜媒介生物学的過程のためのプラットフォームとして役目を果たしている、特殊な膜ミクロドメインである。
【００２９】
それらは、外部原形質小葉中のコレステロール及びスフィンゴ（糖）脂質、及び内小葉の飽和アシル鎖を有するリン脂質及びコレステロールに濃縮されていて、二重層内に液状の秩序相を形成している。ＤＩＧは、冷状態で１％トライトンＸ−１００に不溶性であり、ショ糖勾配遠心分離法で低浮遊密度であることを特徴とする。これらの判断基準に基づいて、ある種のＧＰＩアンカーされ、アシル化した、膜貫通シグナリングタンパク質が、原形質膜のＤＩＧ対非ＤＩＧ領域に豊富にあることが見出された。更に、高コレステロール含有のＤＩＧ（ｈｃＤＩＧ）及び低コレステロール含有のＤＩＧ（ｌｃＤＩＧ）は、それぞれ、それらの低浮遊密度及び高浮遊密度に基いて互いに区別することができる。
【００３０】
ｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの、ＧＰＩアンカーされ、そしてアシル化されたある種のシグナリングタンパク質の刺激依存性再分配は、ＧＰＩ−２３５０によってブロックされた。
【００３１】
ＧＰＩ−２３５０は、脂質ラフト関連ＧＰＩ−ＰＬＣ（ＩＣ50＝５〜１０μＭ）による無処置のラット脂肪細胞由来の、Ｇｃｅ１及び５’−Ｎｕｃのような、ＧＰＩタンパク質の基本的及びグリメピリド／インスリン誘発脂肪分解放出を減少させた。ＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）によるＧＰＩ−ＰＬＣの阻害は、（ｉ）ｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１のカベオリンからの解離、（ｉｉ）ｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの再分配、（ｉｉｉ）ｐｐ５９Lyn及びＩＲＳ−１のチロシンリン酸化、（ｉｖ）グルコース輸送の促進及び（ｖ）グリメピリドに応答する脂肪分解の阻害、の殆んど完全な遮断を導く。
【００３２】
ＧＰＩ−ＰＬＣのインスリン活性化は、脂質ラフト分布に対する適度な効果を有し、及び、それ（例えば、ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化及び脂肪分解の阻害）が僅かに減少するだけであったので、あったとしても代謝性インスリンシグナリングにおける軽微な役割がＧＰＩ−２３５０のみの存在下で明らかにされた。
【００３３】
グリメピリドに誘導されたＧＰＩ−ＰＬＣによって生成する脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質は、それらの非切断両親媒性のもの及びｐｐ５９Lynのように、ｌｃＤＩＧに再分配するよりもむしろｈｃＤＩＧと会合して残っている。
【００３４】
ラット脂肪細胞において再分配され、活性化されたｐｐ５９LynによるＩＲＳのチロシンリン酸化を経るインスリンシグナリングカスケードへのグリメピリドのクロストークは、ｈｃＤＩＧが関与するＧＰＩ−ＰＬＣの活性化を必要とする。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本発明は、哺乳類のＧＰＩ−ＰＬＣの活性を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）哺乳類細胞をグリメピリドと共にインキュベートし；
ｂ）ａ）の細胞のｈｃＤＩＧを調製し；
ｃ）ｂ）からのｈｃＤＩＧを化合物と共にインキュベートし；そして
ｄ）ｃ）のｈｃＤＩＧからのＧＰＩ−ＰＬＣの活性を定量する；
ことを含む方法に関する。
【００３６】
方法のステップａ）に記載の哺乳類細胞は、齧歯類又はイヌの細胞に関する。齧歯類は、例えば、マウス、ラット又はモルモットである。本方法は、ヒト、又は例えばチンパンジー、ゴリラ又はボノボのような類人猿の細胞にも関する。そのような細胞は、例えば、膵臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、脳細胞、脂肪細胞である。哺乳類細胞は、細胞培養によっても提供することができる。細胞を取得し、処理し、収穫し、加工するために、通常の技術が使われる（例えば、Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons; 0-471-24108-3-Looseleaf; 0-471-24105-9-CD-ROM）。
【００３７】
本発明の方法のステップｃ）に記載のｈｃＤＩＧからのＧＰＩ−ＰＬＣの活性を定量するには、ｈｃＤＩＧからｐｐ５９Lynの解離を測定することによって、又はｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへのｐｐ５９Lyn及び／又はＧｃｅ１の再分配を測定することによって、又はｐｐ５９Lyn及び／又はＩＲＳ−１のリン酸化の変化を測定することによって、又はグルコース輸送の促進及び／又は脂質分解の阻害を測定することによって実行される。
【００３８】
本発明は、更に、前に開示したように本発明の方法によって同定することができる化合物に関する。そのような化合物は、例えば、本発明に開示されているような式Ｉを有する化合物又はその誘導体である。
【００３９】
本発明は、又、全ての立体異性体の形態における、および全ての比率のその混合物である式Ｉの化合物：
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立して、ＯＨ又はＦのいずれかであり、そしてＲ5は（Ｃ1−Ｃ20）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ20）−アルケニルである）及び生理的に耐容されるその塩に関する。
【００４０】
本発明は、又、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4のいずれか２つが互いに独立してＦである、前記に記載の式Ｉの化合物に関する。
【００４１】
本発明は、又、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4が各々の場合においてＯＨである、前記に記載の式Ｉの化合物に関する。
【００４２】
本発明は、又、Ｒ5がＣ12−アルキルである、前記に記載の式Ｉの化合物に関する。
【００４３】
本発明のそのような化合物は、例えば、全てのその立体異性体の形態を含む、以下の式を有する。
【化２】
【００４４】
又は、本発明のそのような化合物は、例えば、以下の式を有する。
【化３】
【００４５】
そのような本発明の化合物は、例えば、その全ての立体異性体の形態を含む、ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸であり得る。
【００４６】
本発明の記載において、用語（Ｃ1−Ｃ20）−アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、デュオデシル、トレデシル、クアトルデシル、クインデシル、セスデシル、セプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルの全ての立体異性体の立体構造を有する、全ての直鎖状又は分枝鎖状の化合物に関するものとする。
【００４７】
本発明の記載において、用語（Ｃ2−Ｃ20）−アルケニルは、エチレン、プロピレン、
ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、デシレン、ウンデシレン、デュオデシレン、トレデシレン、クアトルデシレン、クインデシレン、セスデシレン、セプタデシレン、オクタデシレン、ノナデシレン、エイコシレンの全ての立体異性体の立体構造を有する、全ての直鎖状又は分枝鎖状の化合物を包含するものとする。
【００４８】
本発明は、更に、ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸の製造方法であって、
ａ）ラセミ体の１，４，５，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトールをリン酸化してテトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を得ること；及び
ｂ）テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を接触水素化すること；
を含む方法に関する。
【００４９】
該製造方法は、前に特定したようなＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及び／又はＲ5を含む適切な出発物質を使用することによって、本発明の別のいずれかの化合物の製造に適用し得るものである。
【００５０】
本発明は、又、式Ｉを有する少なくとも１つの化合物及び／又は生理的に耐容される塩及び／又はそのプロドラッグ及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００５１】
本発明は、更に、糖尿病の治療のために使用される薬剤の副作用を変えるための、式Ｉの化合物及び／又は生理的に耐容されるその塩及び／又はそのプロドラッグの使用に関する。そのような薬剤は、例えば、グリメピリドである。副作用は、例えば、グリメピリドの誤った投与量に起因する低血糖である。
【００５２】
本発明は、又、糖尿病の治療のために使用される薬剤（例えば、グリメピリド）の副作用の治療用の医薬組成物を製造するための、式Ｉを有する化合物の使用に関する。
本発明は、又、脂肪細胞の原形質膜を横切るシグナル伝達の間にＤＩＧ中のシグナル伝達タンパク質を同定するための、又は、ＧＰＩ−ＰＬＣ及び／又は依存性のシグナル伝達因子の哺乳類の変異体を同定及び特性付けるための、式Ｉの化合物の使用に関する。
【００５３】
本発明は、又、グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）哺乳類細胞をグリメピリドと化合物との混合物と共にインキュベートし；
ｂ）ａ）の細胞のｈｃＤＩＧを調製し；そして
ｃ）ｂ）のｈｃＤＩＧからのＧＰＩ−ＰＬＣの活性を定量する；
ことを含む方法に関する。
【００５４】
本発明の記載における化合物は、化学合成によって製造されるものか、天然源から単離されるもののいずれかであって、５０と５０,０００ダルトンの間の分子量を有する、いずれかの有機及び／又は炭水化物化合物を意味するものとする。
【００５５】
グリメピリドの活性の調節とは、活性が、促進されるか、阻害されるか、活性をある一定のレベルに安定させるという意味で保持されるか、を意味するものとする。
【００５６】
グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップａ）における哺乳類細胞は、例えばラット又はマウスのような齧歯類の細胞、イヌの細胞又はヒトの細胞を包含するものとする。そのような細胞は、例えば、膵臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、脳細胞又は脂肪細胞であり得る。又、使用することができるのは、細胞培養（例えば、初代細胞培養）の細胞である。グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップｃ）に記載のＧＰＩ−ＰＬＣの活性の定量は、ｈｃＤＩＧからのｐｐ５９Lynの解離を測定することによって、又はｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧのｐｐ５９Lyn及び／又はＧｃｅ１再分配を測定することによって、又はｐｐ５９Lyn及び／又はＩＲＳ−１のリン酸化の変化を測定することによって、又はグルコース輸送の促進及び／又は脂質分解の阻害を測定することによって、達成することができる。
【００５７】
グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップｃ）に記載のｈｃＤＩＧか
らのＧＰＩ−ＰＬＣの活性が弱められている場合は、同定された化合物がグリメピリドの活性を不活化しているか又は減少させている。ＧＰＩ−ＰＬＣの活性が増強されている場合は、同定された化合物がグリメピリドの活性を促進しているか、又は支持している。
【００５８】
医薬として許容される陰イオンを有する式Ｉの化合物の塩は、医薬として許容される塩の製造又は精製のための、及び／又は非治療、例えばインビトロでの応用において使用するための有用な中間体として本発明の範囲内に、同様に包含される。
【００５９】
式Ｉの化合物の塩は、当業者によく知られている通常の方法を用いて製造することができる。塩は、例えば、式Ｉの化合物を、溶媒又は希釈剤中で、無機若しくは有機酸又は塩基と組み合わせることによって製造することができる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「生理的に活性な誘導体」は、例えば、ヒトのような哺乳類に投与されると、式Ｉの化合物又はその活性代謝物を（直接的に、又は間接的に）形成することができる、本発明の式Ｉの化合物の生理的に許容される誘導体のいずれか、例えばエステル、に関する。
【００６１】
生理的に活性な誘導体は、又、本発明の化合物のプロドラッグを包含する。そのようなプロドラッグは、本発明の化合物にインビボで代謝され得る。これらのプロドラッグはそれ自体活性又は不活性であることができる。
【００６２】
本発明の化合物は、種々の多形相、例えば、非晶性及び結晶性多形相として存在することができる。本発明の化合物の全ての多形相は、本発明の範囲内に包含され、本発明の更なる態様である。
【００６３】
以下、「式Ｉの化合物（類）」についての全ての言及は、上に記載した式Ｉの化合物／化合物類、並びに、本明細書に記載したそれらの塩、溶媒和物及び生理的に活性な誘導体を意味する。
【００６４】
所望の生物学的効果を達成するために必要な式Ｉの化合物の量は、多くの因子、例えば、選択された特異的化合物、目的とする使用、投与様式及び患者の臨床状態に依存している。一般的に、１日投与量は、体重１キログラム当たり１日につき０.３ｍｇから１００ｍｇ（典型的には３ｍｇから５０ｍｇ）の範囲内、例えば、３〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。静脈内投与量は、例えば、０.３ｍｇから１.０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これは１分当たり体重１キログラムにつき１０ｎｇから１００ｎｇの注入として適切に投与することができる。これらの目的のための適切な注入溶液は、例えば、１ミリリットル当たり０.１ｎｇから１０ｍｇ、典型的には１ｎｇから１０ｍｇを含有することができる。個々の投与量は、例えば、１ｍｇから１０ｇの活性化合物を含有することができる。それ故、注射用アンプルは、例えば、１ｍｇから１００ｍｇ、を含有することができ、そして、例えば、錠剤又はカプセルのような経口投与可能な個々の剤形は、例えば、１.０から１,０００ｍｇ、典型的には１０から６００ｍｇを含有することができる。医薬として許容される塩の場合、上記した重量の詳細は、塩から由来するジヒドロチアゾリウムイオンの重量と関連している。上に挙げた状態の予防又は治療のために、式Ｉの化合物は、化合物としてそれ自体使用することができるが、それらは耐容される賦形剤との医薬組成物の形態で存在するのが好ましい。賦形剤は、勿論、それが組成物の別の構成物と相性がいいこと、及び患者の健康に有害でないことという意味において、耐容性でなければならない。賦形剤は、固体又は液体又は両者であり得、好ましくは、例えば、活性化合物の０.０５質量％から９５質量％までを含有することができる錠剤として、個々の投与量として化合物と処方される。更に医薬として活性な物質も、式（Ｉ）の更なる化合物を包含して存在し得る。本発明による医薬組成物は、本質的に成分を薬理学的に許容される賦形剤及び／又は助剤
と混合することから成る、公知の薬学的方法の一つによって製造することができる。
【００６５】
本発明による医薬組成物は、個々の場合における最も適切な投与方法が、治療される状態の性質及び重症度、並びに各々の場合に使用される式（Ｉ）による化合物の性質に依存するものの、口腔、直腸、局所、経口（例えば、舌下）及び非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内又は静脈内）投与に適したものである。糖衣をかけた剤形及び糖衣をかけた遅延放出剤形も、又、本発明の範囲内に包含される。耐酸性及び腸溶性剤形が好ましい。好適な腸溶性コーティングとしては、酢酸フタル酸セルロース、ポリ酢酸ビニルフタル酸塩、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びメタクリル酸及びメタクリル酸メチルのアニオン性ポリマーが挙げられる。
【００６６】
経口投与用に好適な医薬化合物は、例えば、各々の場合において式（Ｉ）の化合物の一定量を含有する、カプセル、カシェ剤、トローチ剤又は錠剤のような分離された単位で存在することができ、粉剤又は顆粒剤として、水性又は非水性の溶液又は懸濁液として、又は水中油又は油中水エマルジョンとして、分離された単位で存在することができる。既に挙げたように、これらの組成物は、活性化合物と（１つ又はそれ以上の付加的成分からなり得る）賦形剤が接触されるステップを包含するいかなる好適な薬学的方法によっても製造することができる。一般的に、組成物は、活性化合物を液体及び／又は微細に分割した固体の賦形剤と均一及び均質に混合し、その後、必要により生成物を成形することにより、製造される。かくして、例えば、錠剤は、化合物の粉末又は顆粒を加圧又は成型によって、もし適切ならば、１つ又はそれ以上の追加の成分と共に、製造することができる。圧縮した錠剤は、化合物を、例えば粉末又は顆粒のような自由に流れる形態で、適切な場合は結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤及び／又は１つの（多くの）界面活性／分散剤と混合して、好適な装置で錠剤化することによって製造することができる。成形された錠剤は、粉体化合物を、不活性液体希釈剤でぬらし、好適な機械で成型することによって製造することができる。
【００６７】
経口（舌下）投与に好適な医薬組成物は、式Ｉの化合物と香味料、通常ショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムを含有するトローチ錠、及びゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性基剤中に化合物を含んだ芳香錠を包含する。
【００６８】
好適な非経口投与用医薬組成物は、好ましくは、意図した被投与者の血液と好ましくは等張である、式Ｉの化合物の滅菌水性製剤を包含する。これらの製剤は、投与は注射として皮下、筋肉内又は経皮で行うことができるが、好ましくは、静注で投与される。これらの製剤は、好ましくは、化合物を水と混合し、得られた溶液を滅菌し、血液と等張にすることによって製造することができる。本発明の注射できる組成物は、一般的に、活性化合物を０.１から５質量％含有している。
【００６９】
直腸投与に好適な医薬組成物は、好ましくは、個々の投与量の座薬として存在する。それらは、式（Ｉ）の化合物を１又はそれ以上の通常の固体賦形剤、例えば、カカオバターと混合し、得られた混合物を成形することによって製造することができる。
【００７０】
皮膚に局所適用する好適な医薬組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、スプレー、エーロゾル又はオイルとして存在する。使用することのできる賦形剤は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール及びこれらの物質の２つ又はそれ以上の組合せである。活性化合物は、一般的に、組成物の０.１から１５質量
％の濃度、例えば、０.５から２質量％の濃度で存在する。
【００７１】
経皮投与も、又、可能である。経皮投与用に好適な医薬組成物は、患者の表皮と長期間密接に接触するのに適している個々のパッチとして存在することができる。そのようなパ
ッチは、場合によっては緩衝性水性溶液中の活性化合物を、接着剤中に溶解及び／又は分散させて、又はポリマー中に分散させて、好適に含有している。適切な活性化合物濃度は、約１％から３５％、好ましくは約３％から１５％である。特別な可能性として、活性化合物は、例えば、Pharmaceutical Research, 2(6): 318 (1986) に記載されているように、エレクトロトランスポート又はイオントフォレーゼによって放出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ阻害剤の構造及び合成を示す。材料と方法を参照。
【図２】ＧＰＩ−２３５０の力価を示す。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ラット血清及びＴ．ｂｒｕｃｅｉ由来の精製（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄ、並びに単離したラット脂肪細胞由来の総原形質膜（ＰＭ）及びｈｃ／ｌｃＤＩＧをＧＰＩ−２３５０の濃度を増加しながらインキュベートし（１０分間、３０℃）、次いでＴＸ−１１４分配によってＡＣｈＥ及びａＰの両親媒性から親水性への変換につきアッセイした（材料と方法を参照）。脂肪分解活性は、ＧＰＩ−２３５０の非存在下における対照反応（１００％と設定）の％を計算した。少なくとも４回の独立したインキュベーションを行い、ＡＣｈＥ及びａｐ活性を各３回測定して、平均＋ＳＤを得た。
【図３】ＧＰＩ−２３５０の選択性を示す。記載したように異なる由来の種々の（部分的に）精製した又は組換えリパーゼ（ＨＳＬ、ホルモン感受性リパーゼ；ＰＬ、膵リパーゼ；ＬＰＬ、リポプロテインリパーゼ；ＰＣ−ＰＬＣ、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ；ＰＩ−ＰＬＣ、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ；ＰＬＤ、ホスホリパーゼＤ；ＰＬＡ2、ホスホリパーゼＡ2；ＧＰＩ−ＰＬＣ、グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ＰＬＣ／Ｄ及びＡＣｈＥ（アセチルコリンエステラーゼ））、及び単離したラット脂肪細胞由来の総原形質膜（ＰＭ）及びｈｃ／ｌｃＤＩＧを標準的なアッセイプロトコールに従ってＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）の非存在下又は存在下でアッセイした（材料と方法を参照）。少なくとも３回独立してインキュベーションを行い、各２回測定して、平均＋ＳＤを得た。
【図４】インスリン／グリメピリド誘導ＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩタンパク質の切断に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。パネルＡ及びＢ．ｈｃＤＩＧを、未処理ラット脂肪細胞から調製し、次いで、記載したようにして、ＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下でインキュベートし（５分間、３７℃）（パネルＡ、５０μＭ；パネルＢ、濃度を増加させる）、続いてインスリン（１０μＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の無し又は有りで処理した（１２０分間、３０℃）。パネルＣ及びＤ。単離したラット脂肪細胞を、記載したようにしてインスリン（１０μＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の非存在下又は存在下でインキュベートした（１５分間、３７℃）。ｈｃＤＩＧを調製し、次いでＧＰＩ−２３５０とインキュベート（１２０分間、３０℃）した（パネルＣ、５０μＭ；パネルＤ、濃度を増加させる）。パネルＥ、Ｆ及びＧ。単離したラット脂肪細胞を、記載したようにして、ＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下（パネルＥ及びＧ、５０μＭ；パネルＦ、濃度を増加させる）でインキュベートし（５分間、３７℃）、次いでインスリン（１０ｎＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の無し又は有りで処理した（９０分間、３７℃）。ｈｃＤＩＧを調製した。パネルＡ〜Ｄ。ｈｃＤＩＧのＧＰＩ−ＰＬＣ活性を、外因基質として５’−Ｎｕｃを用い、その親水性型への変換として測定した。パネルＥ〜Ｇ。ｈｃＤＩＧのＴＸ−１１４枯渇相で回収したタンパク質を、親水性５’−ＮｕｃおよびａＰにつき免疫ブロット処理し、又はフォトアフィニティ標識によって親水性Ｇｃｅ１を分析した。３回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ活性測定及びゲル・ランを２回（代表例１つを示す）行って、平均＋ＳＥを得た。
【図５】ＤＩＧ内のシグナル伝達タンパク質のグリメピリド誘発再分配に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、記載したようにして、ＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下（最終濃度、５０μＭ）で処理し（５分間、３７℃）、次いでグリメピリド（５０μＭ）の非存在下又は存在下でインキュベートした（１２０分間、３７℃）。ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧを調製し、それぞれ免疫ブロット法及びフォトアフィニティ標識によって、ｐｐ５９Lyn、５’−Ｎｕｃ、カベオリン１、インスリン受容体βサブユニット（ＩＲβ）、グルコーストランスポーター４（Ｇｌｕｔ４）、及びＧｃｅ１の存在についてアッセイした（ゲルの添付書類を参照）。ｈｃ／ｌｃＤＩＧと共に回収したｐｐ５９Lyn、Ｇｃｅ１及び５’−Ｎｕｃの量は、ＧＰＩ−２３５０の非存在下（１００と設定）における対照反応（基本）と比較して示した。少なくとも３回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれゲル・ラン２回（代表例１つを示す）を行って、平均＋ＳＤを得た。
【図６】カベオリン由来のシグナル伝達タンパク質のグリメピリド／インスリン誘発解離に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、ＧＰＩ−２３５０（左パネル、５０μＭ；右パネル、濃度増加）の無し又は有りで処理し（５分間、３７℃）、次いでインスリン（１０ｎＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の非存在又は存在下でインキュベート（１２０分間、３７℃）した。ｈｃＤＩＧを脂肪細胞から調製し、可溶化した。可溶化ｈｃＤＩＧから調製したカベオリン１免疫沈降物を、それぞれ免疫ブロット法及びフォトアフィニティ標識によってｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１の存在につきアッセイした。ｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１の量は、相同免疫ブロット法（ゲルの添付書類を参照）によって免疫沈降カベオリン１の回収につき補正した後に、対照反応において（パネルＡ、基本を１００に設定）、又はインスリン又はグリメピリド促進状態において（パネルＢ、１００に設定）ＧＰＩ−２３５０の非存在と比較して示した。少なくとも４回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれにつきゲル・ランを２回（代表例１つを示す）行って、平均＋ＳＤを得た。
【図７】シグナル伝達タンパク質のグリメピリド／インスリン誘導活性化に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、ＧＰＩ−２３５０（パネルＡ、５０μＭ；パネルＢ、濃度を増加）の無し又は有りで処理（５分間、３７℃）し、次いでインスリン（１０ｎＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の非存在下又は存在下でインキュベート（１２０分間、３７℃）した。ＩＲＳ−１及びｐｐ５９Lynは、脱脂した核の次にある下層（材料と方法を参照）から免疫沈降し、可溶化しｈｃ／ｌｃＤＩＧとそれぞれ結合し、次いでホスホチロシンにつき免疫ブロット法にかけた。チロシンリン酸化ＩＲＳ−１及びｐｐ５９Lynの量は、相同免疫ブロット法（ゲルの添付書類を参照）によって免疫沈降ＩＲＳ−１及びｐｐ５９Lynの回収につき補正した後に、対照反応において（パネルＡ、基本を１００に設定）、又はインスリン又はグリメピリド促進状態において（パネルＢ、それぞれの場合において１００に設定）、ＧＰＩ−２３５０の非存在のものと比較して示した。少なくとも４回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれにつきゲル・ラン２回（代表例１つを示す）を行って、平均＋ＳＤを得た。
【図８】グリメピリド／インスリン誘導代謝活性に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、記載されたように、ＧＰＩ−２３５０（パネルＡ、５０μＭ；パネルＢ、濃度を増加；パネルＣ、５μＭ、５０μＭ）の無し又は有りで処理（５分間、３７℃）し、次いでインスリン（Ｉｎｓ、１０ｎＭ）又はグリメピリド（Ｇｌｉ、２０μＭ又は濃度を増加）の非存在下又は存在下でインキュベート（１５分間、３７℃）した。次いで脂肪細胞を、グルコース輸送及びイソプロテレノール誘導脂肪分解についてアッセイした。活性は、対照反応において（パネルＡ、基本）、又はインスリン又はグリメピリド促進状態において（パネルＢ及びＣ、１００に設定）、ＧＰＩ−２３５０の非存在のものと比較して示した。少なくとも５回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれについて活性測定を３回行って、平均＋ＳＤを得た。
【図９】単離したラット脂肪細胞を０.５ｍＭ・ＮＢＤ−ＦＡで標識し（６０分間、３７℃）、洗滌し、次いでグリメピリド（パネルＡ、Ｂ）又はインスリン（パネルＣ、Ｄ）の濃度を増加して作用させる前に、ＧＰＩ−２３５０の非存在下（パネルＢ、Ｄ）又は存在下（５０μＭ；パネルＡ、Ｃ）でインキュベート（５分間、３７℃）した。記載したようにして、イソプロテレノール（１μＭ）の無し又は有りで、更にインキュベーション（１２０分間、３７℃）した後、総細胞懸濁液を、クロロホルム／ヘプタン／メタノール／０.１Ｎ・ＨＣｌ（３／３／２／１、容積比）で抽出した。有機層を、マーカーとしてＮＢＤ−ＦＡを同時に使用し、薄層クロマトグラフィー（ジエチルエーテル／石油エーテル／酢酸、７８／２２／１、容積比）及び蛍光イメージングにより分析した。２回の独立した標識化とインキュベーションを行った典型的な実験を示すが、同じような結果が繰り返された。ＴＡＧ：トリアシルグリセロール。
【図１０】ラット脂肪細胞原形質膜の非ＤＩＧ領域、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧの間のＧＰＩタンパク質の再分配の機構についてのワーキングモデル、インスリン、グリメピリド及びＧＰＩ−ＰＬＣ及び推定ＧＰＩタンパク質受容体、ｐ１１５、を包含するコレステロール枯渇による制御、並びにカベオリン、ｐｐ１２５Fak及びｐｐ５９Lynを経由するＩＲＳ−１への代謝シグナリングの下流へのカップリングを示す。ＧＰＩ−ＰＬＣ及びｐ１１５の膜貫通領域（ＴＭ）を経由するｈｃＤＩＧにおけるトポロジー、膜配向及び固定（anchorage）の型は、仮説に基づいたものである。しかし、ＤＩＧの細胞外小葉に面した活性部位及び結合部位のそれぞれは、大多数のＧＰＩタンパク質の明らかにされた細胞表面位置を基にして強く示唆されているものである。カベオリンは、カルボキシル末端におけるフック様ＴＭと３重のパルミトイル化の両者によってｈｃＤＩＧの、アミノ末端おける２重アシル化によってｐｐ５９Lynの、原形質膜小葉中に埋め込まれている。
【実施例】
【００７３】
材料及び方法：
ヒト組換えインスリン、ＰＩＧ４１（“Frick, W. et al., (1998), Biochemistry 37,
13421-13436" に開示されている）及びグリメピリド（商品名アマリール、Amaryl）は、Aventis Pharma Germany (Frankfurt, Germany)の薬化学・合成部から入手した。１２−（（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ドデカン酸（ＮＢＤ−ＦＡ）は、Mueller, et al., (1997), Biochem. Biophys. Acta 1347: 23-39の記載に従って合成された。コラゲナーゼ（Worthington, CLS, type Ｉ, ２５０単位／ｍｇ）は、Biochrom (Berlin, Germany)により提供された。牛乳由来リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、アフィニティ精製）、ホスホリパーゼＡ2（ミツバチ毒）、粗ブタ膵リパーゼ（ＰＬ）、組換えＰＣ及びＰＩ−ＰＬＣ（Bacillus cereus）、粗ＰＬＤ（キャベツ）及び脱脂ＢＳＡ（画分Ｖ）は、Sigma/Aldrich （Deisenhofen, Germany）から購入し、粗ＰＩ−ＰＬＣ（ラット肝）及びプロテイナーゼ阻害剤は、Roche Molecular Biochemicals （Mannheim, Germany）から購入した。組換えＧＰＩ−ＰＬＣ（Trypanosma brucei）は、Oxford Glycosystems （Oxford, UK）から得た。ＰＬＡ2（ＡＡＣＯＣＦ3）及びＰＬＣ（Ｕ７３１２２）の阻害剤は、Tocris (Avonmouth, UK)から入手した。Bisbodipy-C11-PCは、Molecular Probes （Eugene, OR）から購入した。脂質は、Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL)から購入した。カベオリン１（クローンＣ０６０）の免疫沈降用抗体及び、カベオリン１（ウサギ）及びｐｐ５９Lyn（クローン３２）の免疫ブロッティング用抗体はTransduction Laboratories (Lexington, KY)から入手した。ホスホチロシン（クローン４Ｇ１０）の免疫ブロッティング用抗体は、Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY)によって供された。（昆虫細胞で発現した総ヒト組換えタンパク質に対する）ＩＲＳ−１の免疫ブロッティング用抗体（ウサギ、アフィニティ精製）、５’−Ｎｕｃ（ラット）及びａＰ（ウシ）は、Biotrend (Cologne, Germany)によって製造された。ECL Renaissanceケミルミネッセンス検出キットは、NEN/DuPont (Bad Homburg, Germany)から得た。スプラーグドーリーラットは、Charles-River Laboratories (UK)から供給された。
【００７４】
ＧＰＩ−２３５０の合成（図１の図式も参照）：
出発物質として、ラセミ体１，４，５，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール（以下、化合物１）は、Zhai, H.-X. et al., (1995), Tetrahedron Lett. 36: 7403-7406に記載の方法によって製造された。化合物１は、次いで、トリエチルアミン及びジメチルアミノピリジンの存在下、ドデシルホスホン酸ジクロライドでリン酸化し、テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロ−ドデシルホスホン酸（以下、化合物２）を得た。１０％パラジウム炭で接触水素化することによって、化合物２を脱ベンジ
ル化し、ミオ−イノシトール−１，２−シクロ−ドデシルホスホン酸（以下、化合物３、又はＧＰＩ−２３５０）をジアステレオマーの混合物として得た。化合物２（図１）の合成のために、１ｇ（１.８ｍｍｏｌ）の化合物１を、メチレンクロリド６０ｍｌ及びトリエチルアミン１ｍｌに溶解し、ジメチルアミノピリジン２００ｍｇ及びドデシルホスホン酸ジクロライド１ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を４５分間室温で放置した。次いで、酢酸エチル５０ｍｌを加え、混合物をシリカゲルで濾過した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン：酢酸エチル＝１：１、ｖ／ｖ）で精製した。化合物２の収量（収率）：５８０ｍｇ（４３％）、白色非晶質固体。ＴＬＣ：ｎ−ヘプタン／酢酸エチル（１／１、ｖ／ｖ）、Ｒf＝０.７。ＭＳ：（Ｍ＋Ｌｉ）+＝７６１.４、計算値Ｃ60Ｈ59Ｏ7Ｐ、Ｍ＝７５４.９。化合物３（図１）の合成のために、５０５ｍｇ（０.６７ｍｍｏｌ）の化合物２を酢酸エチル５ｍｌとメタノール１５ｍｌの混合物に溶解した。パラジウム（１０％）炭７００ｍｇを加えた後、反応混合物を水素添加（６時間、１気圧Ｈ2）した。パラジウムをシリカゲルで濾過し、メタノール１００ｍｌで洗浄した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（メチレンクロリド／メタノール、５／１、ｖ／ｖ）によって精製した。化合物３の収量（収率）：１７９ｍｇ（６８％）、白色非晶質固体。ＴＬＣ：メチレンクロリド／メタノール（５／１、ｖ／ｖ）、Ｒf＝０.１５。ＭＳ：（Ｍ＋Ｌｉ）+＝４０１.２、計算値Ｃ18Ｈ35Ｏ7Ｐ、Ｍ＝３９４.４。化合物３は、塩基性溶媒よりも酸性溶媒下の方が不安定である。メタノール中では何日も安定であり、乾燥非晶質固体は４℃で何年も安定である。
【００７５】
ラット脂肪細胞の調製及びインキュベーション：
雄性ラット（１２０〜１４０ｇ、自由給餌、文献５３を参照）の精巣上体脂肪体から消化によって単離した脂肪細胞を、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＫＲＨ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ、ｐＨ７.４、１.２ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4、１４０ｍＭ・ＮａＣｌ、４.７ｍＭ・ＫＣｌ、２.５ｍＭ・ＣａＣｌ2、１.２ｍＭ・ＭｇＳＯ4）で２回洗浄し、次いで、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００ｎＭ・１−メチル−２−フェニルエチルアデノシン、０.５Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５ｍＭ・Ｄ−グルコースを補充した同じ培地中で、ＧＰＩ−２３５０（ＤＭＳＯ中に１０ｍＭ保存溶液として調製し、インビトロ及び脂肪細胞培養における最終ＤＭＳＯ濃度は、いずれの阻害剤濃度でも０.５％で一定に保たれた）、インスリン又はグリメピリド（“Mueller et al.,
(1994), J. Cell. Biol. 126:1267-1276" に記載されたようにして調製した）の存在下又は非存在下で、３７℃にて振とう水浴中で、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2で一定でバブリングしながら、インキュベーション容積１ｍｌ当たりパックした細胞容積１００μｌの最終力価（少量の一定量（アリコート）を毛細管ヘマトクリットチューブに吸引し、脂肪細胞による懸濁液の分画占有を定量するためにマイクロヘマトクリット遠心機で６０秒遠心して決定する；１０％サイトクリットは約１.５×１０6細胞／ｍｌに相当する）で、指定された期間インキュベートした。
【００７６】
原形質膜及びｌｃ／ｈｃＤＩＧの調製：
原形質膜及びＤＩＧを、溶解バッファー（２５ｍＭモルポリノエタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６.０、１４０ｍＭ・ＮａＣｌ、２ｍＭ・ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ・ＥＧＴＡ、０.２５Ｍショ糖、５０ｍＭ・ＮａＦ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭグリセロール−３−リン酸、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤）中、モーター駆動テフロン・イン・ガラス・ホモジナイザー（１０ストローク）を用いてホモジナイズし、前処理し洗浄した脂肪細胞のポストニュークレアー・インフラネイタント（postnuclear infranatant）から調製した。原形質膜を脱脂したポストニュークレアー・インフラネイタントの分画遠心法によって得、前に記載した（４８、５３）ようにしてショ糖及びパーコールクッションを通して２回逐次遠心によって精製し、最後に２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、０.２５Ｍショ糖、１ｍＭ・ＥＤＴＡに２ｍｇタンパク質／ｍｌで懸濁した。ｈｃ／ｌｃＤＩＧを、“Mueller, G. et al., (2002), Mol.
Med. 8: 120-136" に報告されたようにして界面活性剤法及び不連続ショ糖勾配遠心分離によって得た。１５〜２２％（画分４〜５）及び２８〜３５％（画分８〜９）ショ糖インターフェースの光散乱乳白色バンドを、屈折率を用いた濃度測定で、それぞれ、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧとして集めた。集めた勾配画分を２５ｍＭ・ＭＥＳ（ｐＨ６.５）、１％トライトンＸ−１００、１５０ｍＭ・ＮａＣｌで３倍希釈した後、遠心分離（５０,０００×ｇ、３０分、４℃）によりｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧを収集し、次いで、“Mueller, G. et al., (2002), Mol. Med. 8: 120-136" 及び／又は“Mueller, G. et al., (2001), Mol. Cell. Biol. 21: 4553-4587" に記載されているように適切なマーカーの豊富な部分／乏しい部分により特徴づけ（免疫ブロット法、酵素アッセイ法）、或いはトライトンＸ−１１４分画法（下記を参照）にかけた。カベオリンの免疫沈降のために、ＤＩＧを１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１％トライトンＸ−１００、６０ｍＭβ−オクチルグルコシド、０.３％デオキシコール酸、５ｍＭ・ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ・ＥＧＴＡ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭ・ＮａＦ、１μＭミクロシスチン及びプロテアーゼ阻害剤の溶液に可溶化し（１時間、４℃）、遠心分離した（５０,０００×ｇ、３０分間）。直接免疫ブロット法のために、ＤＩＧを２倍のＬａｅｍｍｌｉ試料バッファーに可溶化し遠心分離した（１０,０００×５、５分間）。上清を使用した。
【００７７】
ＧＰＩ−ＰＬＣ／Ｄアッセイ：
ＧＰＩ−ＰＬＤ（ラット血清）を、“Hari et al., (1997), Biochim. Biophys. Acta 1355: 293-302" に従って、２００ｍＭトリス／マレイン酸（ｐＨ７.０）及び１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０溶液１００μｌ中のヒト胎盤ａＰ溶液（１０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７.０、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ中１００単位／ｍｌ）１０μｌと１０分間、３７℃にてインキュベーションし、次いで０.４ｍｌの氷冷停止バッファー（１０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７.０、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、０.１ｍＭ・ＭｇＣｌ2及び０.０１ｍＭ酢酸亜鉛）を添加して反応を停止することによってアッセイした。ＧＰＩ−ＰＬＣ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）を、“Mensa-Wilmot et al., (1995), Methods Enzymol. 250: 641-655" の記載のようにして、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.２５％Ｎｏｎｉｄｅｔ／Ｐ−４０及び５ｍＭ・ＥＤＴＡ溶液５０μｌ中のひと胎盤ａＰ溶液（上記を参照）５μｌと、３０分間、３７℃にてインキュベーションし、次いで停止バッファー０.４５ｍｌを添加して反応を停止することによってアッセイした。ＰＩ−ＰＬＣ（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）及び脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣ（５〜２５μｇ原形質膜又はｈｃ／ｌｃＤＩＧ）を、２０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７.８）、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ、０.１％ＴＸ−１００、０.２ｍＭ・ＭｇＣｌ2溶液１００μｌ中のウシ赤血球アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）溶液１０μｌ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ、０.１％ＴＸ−１００中１２単位／ｍｌ）と１時間、２５℃にてインキュベーションし、次いで氷酢酸５μｌ及び次いで１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ、０.４ｍｌを加えて反応を停止することによってアッセイした。各反応混合物を、ＴＸ−１１４分配にかけた（以下を参照）。ＧＰＩ−ＰＬＣ／Ｄ活性は、ＴＸ−１１４消耗相中で測定された親水性ａＰ又はＡＣｈＥの活性と分配前に測定された総活性の比率から計算され、そして（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを欠いたブランクのインキュベーションで現れたＴＸ−１１４消耗相（総活性の１０〜２０％の割合を占める）中の非酵素バックグランドに対して補正された。
【００７８】
その他のリパーゼアッセイ：
ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）及びリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）は、“Vertesy et al., (2002), Journal Antibiotics 55:480-494" に記載されたようにして、放射能標識トリオレイン液滴エマルジョンを使用して測定された。膵リパーゼ（ＰＬ）は、５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ６.５）、６ｍＭタウロデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１ｍＭ・ＣａＣｌ2溶液２ｍｌ中の０.２５ｍｍｏｌのトリブチリンを、
記録ｐＨスタット（１,０００ｒｐｍ、２５℃で撹拌）を用いてｐＨを６.５に調節しつつ、同じバッファー中のブタＰＬ及びコリパーゼとインキュベーションすることによって定量した。ＰＣ−ＰＬＣは、１０ｍＭジパルミトイルレシチン０.２ｍｌ、１０ｍＭ・ＳＤＣ０.１ｍｌ及び０.０３Ｍ・ＣａＣｌ2０.１ｍｌをバクテリアＰＣ−ＰＬＣ（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.５、０.１％ＢＳＡ）と、１０分間、３７℃にてインキュベーションすることでアッセイした。反応は、５０％ＴＣＡを０.１ｍｌ、次いでクロロホルム／メタノール（６６／３３／１、容量比）を２.５ｍｌ加えることによって停止した。遠心分離（１,５００×ｇ、１５分）後、メタノール／水相（約１.３３ｍｌ）の上部０.２ｍｌ部を除き、６０％ＨＣＩＯ4０.５ｍｌを補充し、次に１７０℃で１時間加熱して、最終的に無機リン酸塩を分析した。哺乳類ＰＩ−ＰＬＣは、１０ｍＭ・ＰＩ０．１ｍｌ、０.８％デオキシコール酸ナトリウム０.１ｍｌ、０.１％ＢＳＡ、１００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ７.５）０.２ｍｌ、及びラット肝ＰＩ−ＰＬＣを２０分間、３７℃でインキュベーションすることによって測定した。反応を停止し、ＰＣ−ＰＬＣで記載したようにして更に処理した。ＰＬＤを４０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ６.０）、４ｍＭＣａＣｌ2及びキャベツＰＬＤ溶液２５０μｌ中１.６ｍＭ（Ｕ−14Ｃ）ホスファチジルコリン（約２,０００−４,０００ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）でアッセイした。３０分間、３７℃にてインキュベーションの後、反応を、キャリアーホスファチジン酸含有クロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）５ｍｌを加えて停止した。水可溶性物質を除去した後、最後の洗浄低クロロホルム相中に含有される脂質を、加熱活性化したシリカゲルプレートに転送し、第１次元方向にクロロホルム／メタノール／アンモニア（６５／３５／４、体積比）を使用し、第２次元方向にクロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸／水（５０／２０／１０／１０／５、体積比）で２次元的に分離した。放射性ホスファチジン酸を蛍光イメージングにより検出した。ＰＬＡ2を、１−パルミトイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン／ビスボジピ−Ｃ11−ＰＣ／ホスファチジル−グリセロール／コレステロール（１０／０.０５／２／３、体積比）からなる単層リポソーム基質で、“Kim, T.-S. et al., (1997), J. Biol. Chem. 272:2542-2550" に従って定量した。濃度−反応曲線を、Marquardt-Levenberg非線形最小二乗演算手法を使用してフィットさせた。対数・直線軸にプロットするとき、この式はシグモイド曲線となる（Sigma Plot Software,
Jandel Scientific）。
【００７９】
カベオリンの免疫沈降：
可溶性ＤＩＧ（上記を参照、５〜２０μｇタンパク質）は、プロテインＡ／Ｇ−セファロースでインキュベーションし、次いで遠心分離（１０,０００×ｇ、５分間）することにより事前に確かめた。上清を、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１％ＴＸ−１００の１ｍｌ中で、プロテインＡ／Ｇ−セファロースに前もって吸着させた抗カベオリン１抗体と４℃にて１時間インキュベートした。免疫複合体を、同じバッファーで２回、次いでＴＸ−１００不含のバッファーで２回洗浄し、最後にβ−メルカプトエタノールなしで行うＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。免疫沈降カベオリンの回収は、膜の細片化に次いで、同じブロットの抗カベオリン抗体による均一免疫ブロッティングを行うことによって正常化された。
【００８０】
免疫ブロット法：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたポリペプチドを、“Mueller, G. et al., (2001), Mol. Cell. Biol. 21: 4553-4567”に記載されたように半乾燥法を用いてポリビニリデンジフルオライド膜に移した。洗浄した膜を抗カベオリン１抗体（１：２,０００）、抗ｐｐ５９Lyn抗体（１：１,２５０）、抗ａＰ抗体（１：５００）、抗５’−Ｎｕｃ抗体（１：７５０）および抗ＩＲＳ−１抗体（１：２,０００）を１５℃にて４時間インキュベートした。洗浄した膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した、ヤギ抗マウスＩｇＧ２次抗体（１：２,０００）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ２次抗体（１：４,０００）とインキュベートした。標識したタンパク質を増強したケミルミネセンスによって可視化した。
【００８１】
ＴＸ−１１４分配：
ペレット化したｈｃ／ｌｃＤＩＧ（１０〜５０μｇタンパク質）又は（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ反応混合物（０.５ｍｌ）を、それぞれ氷冷ＴＸ−１１４（１％）、２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に懸濁することにより、又は氷冷ＴＸ−１１４（２％）０.５ｍｌと混合することにより、“Bordier, C., (1981), J.
Biol, Chem. 272: 2542-2550" に記載された、ＴＸ−１１４が豊富な相とＴＸ−１１４が枯渇した相との間の分配を使用して、両親媒性タンパク質及び親水性タンパク質に分離した。氷上で１時間インキュベーションした後、混合物を氷上で０.２５Ｍショ糖及び２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）溶液０.４ｍｌのクッション上に重層した。相分離を３７℃に暖め、次いで遠心分離（１０,０００×ｇ、１分間）することによって誘導した。下のＴＸ−１１４が豊富な相の再抽出後、集めた上のＴＸ−１１４が枯渇した相の一定量を５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＡＣｈＥ活性について測定するか、又は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に沈殿（１５％ポリエチレングリコール４,０００）させた。
【００８２】
グルコース輸送アッセイ：
グルコース輸送を、５０μｌ部分中、最終濃度５０μＭ（０.３３μＣｉ／ｍｌ）の２
−デオキシ−Ｄ−（２，６−3Ｈ）グルコースとともに、洗浄した１０,０００〜２０,０
００個の脂肪細胞を、２０μＭサイトカラシンＢの存在下又は非存在下において２０分間、３７℃でインキュベーションすることにより、“Mueller, G. et al., (1994), J. Cell Biol. 126: 1267-1276" に記載されたようにして定量した。
【００８３】
種々の手順：
電気せん孔法は、“Mueller, G. et al., (2000), Mol. Cell. Biol. 20: 4708-4723"
に記載されたようにして実施した。脂肪分解は、“Mueller, G. et al., (2003) ,Biochimie 85: 1245-1256" に記載されたようにして、前もって標識され、イソプロテレノール刺激をされた脂肪細胞からの、グリセロール又は蛍光ＮＢＤ−ＦＡの放出として測定した。Ｇｃｅ１は、“Mueller, G. et al., (1994), Biochemistry 33: 12149-12159" に記載されたようにして、可溶化原形質膜又はｈｃ／ｌｃＤＩＧ（１０〜５０μｇタンパク質）を８−Ｎ3−［32Ｐ］ｃＡＭＰで光標識化し、次いで蛍光イメージングすることによって検出した。５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＡＣｈＥ活性は、“Eliakim, R. et al., (1990), Biochim. Biophys. Acta 1355: 293-302"に従って測定した。タンパク質は、Pierce （Rockford, IL）のＢＣＡタンパク質測定キット、及び較正基準としてＢＳＡを使用して測定した。SDS−PAGEは、前もって成型されたゲル（Novex, San Diego, CA；１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分離ゲル、モルホリノプロパンスルホン酸−ＳＤＳランニングバッファー）を使用して実施された。ルミイメージ（lumiimage）は、ルミイメージャー（LumiImager）ソフトウエア（Roche Diagnostics）を使用したルミイメージャーで評価した。リン光イメージ及び蛍光イメージは、Storm 860 PhosphorImager system (Molecular Dynamics, Gelsenkirchen, Germany)を使用して処理し定量化した。図は、Adobe Photoshopソフトウエア（Adobe Systems, Mountain View, CA）を使用して構築した。
【００８４】
ＧＰＩ−２３５０は、高力価及び選択性を有する種々の起源の（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを阻害する：
（精製した、又は、未精製の）Ｂ．ｃｅｒｅｕｓＰＩ−ＰＬＣ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＧＰＩ−ＰＬＣ及びラット血清ＧＰＩ−ＰＬＤに対するＧＰＩ−２３５０の効果を、適切な条件下（低又は高界面活性剤濃度）で、ＧＰＩ−２３５０の濃度を増加しつつ、部分的に精製した可溶化ＧＰＩタンパク質と共にそれらをインキュベーションすることによって観察した。次いで、総ＧＰＩタンパク質に対する、消化混合物中に脂肪分解的に切断されたＧＰＩアンカーを内蔵する親水性ＧＰＩタンパク質の比率を、ＴＸ−１１４分配で界面活性剤が枯渇している相、及び分配前の総消化混合物、それぞれにおける酵素活性の測定によ
って定量した（図２）。ＧＰＩ−２３５０は、細菌、トリパノソーマ及び血清（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを、それぞれ１０、２及び１μＭのＩＣ50で、明らかに阻害した。ＧＰＩ−２３５０は、又、酵素源として可溶化原形質膜、ｌｃＤＩＧ又はｈｃＤＩＧを、及び基質としてＡＣｈＥを使用すると、ラット脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣを０.２〜０.５μＭのＩＣ50で遮断した。脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣの切断特異性を明らかにするため、本発明者らは、ミオ−[14Ｃ]−イノシトールで代謝的に標識されたサッカロマイセスセレヴィシエスフェロブラストから調製したＧＰＩタンパク質、Ｇｃｅ１を使用した。ｈｃＤＩＧとのインキュベーションで、親水性及び14Ｃ標識されたＧｃｅ１が生成され、それはｃＩＰに対して生じる抗ＣＲＤ抗体と濃度及び時間依存的に免疫沈降した（データは示さない）。脂肪酸アシル鎖を欠きｃＩＰを内蔵するＧＰＩタンパク質の、ｈｃＤＩＧ依存的な生成により、ラット脂肪細胞の原形質膜にＧＰＩ−ＰＬＣの発現が確認された。
【００８５】
次に、ＧＰＩ−２３５０の選択性を試験した。種々の起源からのいくつかの天然リパーゼ（ＨＳＬ、ＰＬ、ＬＰＬ）及び異なった特異性（Ａ2、Ｃ、Ｄ）のＰＣ／ＰＩ特異的ホ
スホリパーゼそしてウシＡＣｈＥ（これらは全ていわゆる触媒三点セットを経て作動することが知られている）は、細菌、トリパノソーマ、血清及びラット脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを６０から９５％遮断する濃度（５０μＭ）下では有意な影響は受けなかった（図３）。ｃＩＰの代わりにオープン（open）を内蔵するＧＰＩ−２３５０の二つの誘導体２−デオキシ−２−フルオロ−scyllo−イノシトール−１−Ｏ−ドデシル−ホスホン酸（ＧＰＩ−１７９３）及びミオ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシル−ホスホン酸メチルエステル（ＧＰＩ−２３４９）は、試験した最高濃度で脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣに対して、それぞれ温和から非常に温和な効果を有するだけであったが、しかし、細菌及びトリパノソーマ（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣを同程度の力価で阻害した（表１）。これらの知見は、安定した又は一過性の１，２−環状リン酸結合の生成を含む触媒機構における類似性を示しているが、しかしながら、細菌、トリパノソーマ及び脂肪細胞（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの間の基質認識における幾分かの相異も示している。後者がｃＩＰ中間体を経由して作動、予備的な動態試験に基づいていると仮定すると、ＧＰＩ−２３５０は拮抗阻害剤（Ｋi＝３〜２０μＭ）として作用することを仮定しなければならない。このことは、中性リパーゼ及び哺乳類ＰＣ／ＰＩ特異的ホスホリパーゼはＧＰＩ構造を認識しないので、その顕著な選択性を説明できるであろう。拮抗的作用機構に一致して、ＧＰＩ−２３５０による細菌及びトリパノソーマ（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの半値阻害は、過剰の新鮮なＧＰＩタンパク質基質との反応混合物の１０倍希釈において完全に逆転した。対照的に、再単離及び充分な洗浄に先立って５０μＭＧＰＩ−２３５０で処理した脂肪細胞ｈｃＤＩＧは、ＧＰＩ−２３５０非存在下でインキュベーションすると、精製した可溶化ＡＣｈＥに対しては、低い脂肪分解的切断のみを呈した（データは示さない）。このことは、両親媒性ＧＰＩ−２３５０のｈｃＤＩＧとの相互作用により説明することができるであろう。あるいは、ＧＰＩ−２３５０は、遷移状態類似体として作用し、脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣの活性部位への（一過性の）共有結合を受けるのであろう。ＧＰＩ−２３５０の環状リン酸結合が（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄによって開環されるかどうかを知ることは、興味あることであろう。
【００８６】
ＧＰＩ−２３５０は、単離されたＤＩＧ及び無処置の脂肪細胞においてＧＰＩタンパク質のインスリン誘導及びグリメピリド誘導切断をブロックする：
ＧＰＩ−２３５０及びＧＰＩ−ＰＬＣの両者が別々の複合体（それぞれ、界面活性剤ミセル及びＤＩＧ）で存在するとき、インビトロにおける脂肪細胞原形質膜ＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩタンパク質の切断に対するＧＰＩ−２３５０の介入の観察に基づいて、次に、基質としての内因性又は外因性ＧＰＩタンパク質の無処置の脂肪細胞及び単離されたＤＩＧにおける基本的及び促進されたＧＰＩ−ＰＬＣ活性に対するＧＰＩ−２３５０の効果について試験した（図４）。単離されたラット脂肪細胞において、ＧＰＩ−ＰＬＣ活性（内因性５’−Ｎｕｃ、Ｇｃｅ１及びａＰの切断として、それらの両親媒性から親水性への変換の観察が伴う）は、グリメピリド及びインスリンの両者によって（それぞれ、５倍及
び３倍まで）促進された（パネルＥ、Ｇ）。促進は、これらの前処置した脂肪細胞から調製されたｈｃＤＩＧにおいて部分的に保存されていた（パネルＣ）（それぞれ、３倍及び１.７倍）。ＧＰＩ−ＰＬＣは、グリメピリドで処理されなかった脂肪細胞から調製されたｈｃＤＩＧの直接インキュベーションにより際だって活性化されたが、インスリンではそうでなかった（パネルＡ）。ＧＰＩ−２３５０は、基本よりも低く、そして単離されたｈｃＤＩＧ及び未処理の脂肪細胞の両者において同じようなレベルで、濃度依存的に基本のＧＰＩ−ＰＬＣ活性を減少させ、同様にグリメピリド及びインスリン誘導ＧＰＩ−ＰＬＣ活性を減少させた（図４、全てのパネル）。阻害剤がインスリン又はグリメピリドとのインキュベーションより前に、及びインキュベーションの間に存在していたので、明らかにＧＰＩ−２３５０は、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性を妨害しない（パネルＣ、Ｅ）。未処理の脂肪細胞でアッセイする場合、ＧＰＩ−ＰＬＣの阻害のＩＣ50は（５〜１０μＭ、パネルＦ）は、単離された未処理のｈｃＤＩＧに比較してより高く（１μＭ、パネルＢ、Ｄ）、同様に可溶化ｈｃＤＩＧ及び原形質膜（０.２〜０.５μＭ、図２）に比較して、より高かった。このことは、単離されたＤＩＧと比較して未処理の脂肪細胞の原形質膜においてＤＩＧの中に埋め込まれた場合、ＧＰＩ−２３５０に対してＧＰＩ−ＰＬＣの触媒部位の接近し易さが損傷されたことを反映しているのであろう。しかし、ＧＰＩ−ＰＬＣの主要な基質、ＧＰＩ脂質及びタンパク質アンカーは原形質膜の外小葉に局在化しており、そしてＧＰＩ−２３５０はＧＰＩ−ＰＬＣの触媒部位の（拮抗）阻害剤として作用しているようであるので（上記を参照）、その両親媒性を基本として、むしろ高いと予測されている、ＧＰＩ−２３５０の細胞透過性の必要性は、多分除外することができる。むしろ、ＤＩＧの液体定序ドメインよりもむしろ非ＤＩＧ領域の無秩序ドメインへ選択的に分配される界面活性剤に類似している脂肪細胞原形質膜（総細胞表面の８０〜９０％を含む）の非ＤＩＧ領域に、ＧＰＩ−２３５０はそのドデシル鎖を経て自然に分配されることが考えられる。
【００８７】
ＤＩＧ及び原形質膜の単離に使用された実験的条件下で、単離された総原形質膜中のＧＰＩ−ＰＬＣ活性の６５〜８５％（外因性ＡＣｈＥの切断として測定）が、脂肪細胞の処理に関係なくＤＩＧ（即ち、ｈｃＤＩＧプラスｌｃＤＩＧ）により回復した。同様の回復が、典型的なＤＩＧマーカータンパク質、カベオリン１（７０〜９０％）（免疫ブロット法により定量した）、及びＤＩＧ常在性タンパク質、ｐ１１５（５５〜７５％）（合成ＰＩＧの結合により定量した）について観察された。更に、区別を付けて処理した脂肪細胞からＤＩＧ（ｈｃＤＩＧプラスｌｃＤＩＧ）で回復したａＰ、５’−Ｎｕｃ及びＧｃｅ１の総量（両親媒性プラス親水性のもの）は、おおよそ一定（基準を１００％と設定して９０〜１４０％）であって、このことは種々の条件下でＤＩＧの単離手順の再現性を明示している。単離されたｈｃＤＩＧは、ｌｃＤＩＧ及び非ＤＩＧ領域よりも比較的低いタンパク質含量により特徴づけられているので、ＧＰＩ−ＰＬＣは、残りの原形質膜に対してｈｃＤＩＧが非常に豊富であり、ＧＰＩタンパク質基質の局在化と一致している。
【００８８】
ＤＩＧ内にＧＰＩアンカーされた及びアシル化されたシグナル伝達タンパク質の再分配にはラット脂肪細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＣ作用を必要とする：
次に、ＧＰＩタンパク質の脂肪分解的切断の阻害が、脂肪細胞原形質膜のＤＩＧ内でＧＰＩアンカーされた及びアシル化されたシグナル伝達タンパク質の局在及び刺激依存性再分配に影響するかどうかを研究した。このために、グリメピリドで処理する前にＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下でインキュベートした脂肪細胞からｈｃ／ｌｃＤＩＧを調製し、次いでいくつかのＧＰＩアンカーされた又はアシル化されたシグナル伝達タンパク質の存在につき分析した（図５）。基本の脂肪細胞に比べてｈｃＤＩＧの量の７０から９０％の損失に相当する、ｌｃＤＩＧの量の３から５倍の増加に見られるように、グリメピリドに反応したｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへのｐｐ５９Lyn、Ｇｃｅ１及び５’−Ｎｕｃのしっかりした再分配は、ＧＰＩ−２３５０の最大有効濃度の存在下で殆んど完全に止められた。対照的に、ｌｃＤＩＧに対してｈｃＤＩＧにおいて、ｈｃＤＩＧ常駐タンパク質
であるカベオリン１及びＩＲβが比較的豊富であること、並びにｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧにおいてグルコース輸送体イソ型４（Ｇｌｕｔ４）が同様に多量であることの両者は、グリメピリドに影響されず、ＧＰＩ−２３５０の存在下で顕著には変化しなかった（図５）。このことはＧＰＩ−ＰＬＣの強力な阻害は、ＤＩＧの構造における一般的且つ非特異的変化をもたらすよりはむしろｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの、Ｇｃｅ１及びｐｐ５９Lynのような、ある種の脂質修飾シグナル伝達タンパク質の刺激依存性転移を、特異的に妨げることを明らかにしている。
【００８９】
次に、ＧＰＩ−ＰＬＣの作用とＧＰＩタンパク質の再分配の間の推定因果関係、即ち脂肪分解的切断及び／又は非切断ＧＰＩタンパク質は、刺激された単離ラット脂肪細胞において、実際にｌｃＤＩＧに転移するのか否か、の根底にあるメカニズムを研究した。このために、ラット脂肪細胞をＧＰＩ−２３５０と共に、又は、無しにインキュベートし、インスリン又はグリメピリドを作用させた。総原形質膜、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧから回収されたＧＰＩタンパク質、即ち５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＧｃｅ１の親水性型及び両親媒性型の量は、ＴＸ−１１４分配によって定量された（表２）。インスリン及びより強力なグリメピリドでの処理は、ＧＰＩ−２３５０によって完全にブロックされた原形質膜の親水性ＧＰＩタンパク質の増加をもたらし、効率的なＧＰＩ−ＰＬＣ阻害を示している。インスリン及びグリメピリドの両者に応じて、親水性ＧＰＩタンパク質の量の増加が、もっぱらｈｃＤＩＧにおいてのみ検出され、同じ位置での両親媒性型の減少を伴っていた。これらの変化は、ＧＰＩ−２３５０の存在下で更に低い基本値に逆転し、この両親媒性から親水性への変換という脂肪分解性を示していた。それ故、ｈｃＤＩＧでのインスリン／グリメピリド促進ＧＰＩ−ＰＬＣによって生成する親水性ＧＰＩタンパク質は、ＧＰＩアンカーによらない分子機構を経てｈｃＤＩＧに関連して残る（表２）。興味深いことに、ｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの５’−Ｎｕｃ、Ｇｃｅ１及びａＰのグリメピリド誘導再分配（図５参照）は非切断型に限定され、両親媒性においては３から４倍上昇したレベルであるが、ｌｃＤＩＧで回復した親水性ＧＰＩタンパク質では変らない低レベルであることを反映していたが、それにもかかわらず、ＧＰＩ−２３５０によって完全に除去されていた（表２）。対照的に、親水性５’−Ｎｕｃ、Ｇｃｅ１及びａＰのインスリン誘導生成は、ｌｃＤＩＧで両親媒性の対応物の非常にゆるやかな増加（有意差の限界）を伴ったのみであったが、それは再びＧＰＩ−２３５０の存在で排除された。試験した３つのＧＰＩタンパク質全てが、ほんの少しの量的差異だけで、もっぱら、刺激依存性脂肪分解的切断と両親媒性型の再分配との間に相関性を示した（表２）。総合すると、ｈｃＤＩＧで脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質の生成及び蓄積のためのＧＰＩ−ＰＬＣ活性化が必要である（グリメピリド）。
【００９０】
ＧＰＩ−ＰＬＣの阻害は、ＧＰＩアンカー型及びアシル化シグナル伝達タンパク質のカベオリンからの解離を妨げる：
ラット脂肪細胞におけるｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへのシグナル伝達タンパク質の再分配は、最近、カベオリン１からの解離と活性化を伴うことが示されている。次に、ＧＰＩ−ＰＬＣを阻害することによるラット脂肪細胞における、カベオリンからの解離／活性化と、ＧＰＩタンパク質の刺激依存性脂質分解的切断との間の推定因果関係、及び、それに続いて、Ｇｃｅ１とｐｐ５９Lynのカベオリン１との相互関係、及び後者のキナーゼ活性の解析が研究された（図６）。単離及び可溶化されたｈｃＤＩＧから調製されたカベオリン１免疫沈降物からのｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１の両者のインスリン誘発最大損失（３５〜４５％）及びグリメピリド誘発最大損失（７５〜８５％）最大損失は、５〜１０μＭのＩＣ50（図６、パネルＢ）を有するＧＰＩ−２３５０（５０μＭ：図６、パネルＡ）によって完全に妨げられた。この力価は、未処理の脂肪細胞におけるＧＰＩ−２３５０によるＧＰＩ−ＰＬＣ阻害に類似している（図３）。非受容体チロシンキナーゼのようなシグナル伝達タンパク質のカベオリン結合ドメイン（ＣＢＤ）へのカベオリン１の足場（scaffolding）ドメイン（ＣＳＤ）の結合、及び、逆に、ＣＢＤへの結合からのＣＳＤの除去は
、全ての場合ではないが多くの場合、インビトロアッセイにおけるシグナル伝達タンパク質の不活化及び活性化のそれぞれの引き金を引くことが示された。このことは、原形質膜ＤＩＧで作動しているシグナル伝達における、ＣＳＤ−ＣＢＤ相互関係の調節機能を暗示している。
【００９１】
ラット脂肪細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＣの阻害は、グリメピリドの代謝活性をダウンレギュレートするがインスリンはされない：
次いで、インスリン及びグリメピリドに反応したＩＲＳ−１チロシンリン酸化におけるＧＰＩ−ＰＬＣ阻害の差動効果が、インスリン標的細胞における代謝活性に反映するか否かを研究した。このために、単離したラット脂肪細胞を、どちらかの刺激で作用させる前にＧＰＩ−２３５０で前処理し、次いでグルコース輸送及びイソプロテレノール誘導脂肪分解についてアッセイした（図８）。グリメピリドによるグルコース輸送の促進及びイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害は、ＧＰＩ−２３５０の存在下、濃度依存的様式（ＩＣ50＝２〜５μＭ）で対照値（５０μＭで）よりも低く損なわれた。従って、グリメピリド濃度−反応曲線は右に移動し、阻害剤がない場合と比較してＧＰＩ−２３５０（５μＭ）によるＧＰＩ−ＰＬＣの最大半量阻害の途中で平坦になった。対照的に、グルコース輸送のインスリンによる促進及びイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害は、グリメピリドに比較して２から３倍、より顕著であるが、５０μＭで、ＧＰＩ−２３５０のみによってそれぞれ最大２５及び３３％減少した（図８）。これらのＧＰＩ−ＰＬＣ阻害の差動効果は、蛍光脂肪酸誘導体で前もって標識したラット脂肪細胞からのグリセロールに代わってＮＢＤ−ＦＡの放出として測定した場合、グリメピリド及びインスリンによるイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害に対するＧＰＩ−２３５０の効果の分析によって確認された（図９）。グリメピリド（ＩＣ50＝３μＭ）の濃度増加に反応してイソプロテレノール誘導脂肪細胞から放出された酸化分解産物を包含するＮＢＤ−ＦＡの量の減少は、５０μＭグリメピリドの存在で完全に消失された（パネルＡ、Ｂ）。対照的に、ＮＢＤ−ＦＡ（及び分解産物）放出のインスリン阻害は、インスリンに対する見かけのＩＣ50の少しの増加（０.１対０.３μＭ）を伴うＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）のみによって、最大２５〜３０％損なわれた。ＧＰＩ−ＰＬＣ阻害に対するこれらＧＰＩ−２３５０媒介効果の特異性は、ラット肝ＰＩ−ＰＬＣ及びハチ毒ＰＬＡ2の阻害剤の損傷によって、基本的な及びグリメピリド調節グルコース輸送及び脂肪分解に顕著に影響を与えることで確認された（図８）。
【００９２】
最後に、ＤＩＧ内でＧＰＩタンパク質の再分配に依存性であるか、無関係であるかのいずれかである、グリメピリド以外のインスリン模倣刺激のシグナル伝達におけるＧＰＩ−ＰＬＣの関与について調べた。ラット脂肪細胞において、ｍ−β−ＣＤを用いたコレステロール枯渇によるｈｃＤＩＧの崩壊、トリプシン／塩／ＮＥＭ処理によるＰＩＧ受容体ｐ１１５の不活化又は合成リガンドＰＩＧ４１でのｐ１１５の占拠は、ｌｃＤＩＧでの５’−Ｎｕｃの顕著な増加及びグルコース輸送活性化を導いた（表３）。対照的に、オルトバナジウム酸ナトリウム及び合成ＣＢＤＰはｌｃＤＩＧへの５’−Ｎｕｃ転位の同時誘導なしにグルコース輸送を促進した。このことは、よく知られている、チロシンホスファターゼ阻害剤、バナジウム酸塩によるインスリン受容体及びＩＲＳ−１脱リン酸化、及びＣＢＤＰによるｐｐ５９Lyn及びＩＲＳ−１チロシンリン酸化の直接促進といった作用機序に一致している。これらの刺激によるＩＲＳ−１チロシンリン酸化でもなくグルコース輸送でもない促進（表３）は、ＧＰＩ−２３５０の存在下で顕著に影響され、それらは全てＧＰＩ−ＰＬＣの下流の点でグルコース輸送システムにクロストークしていることを暗示している。
【００９３】
表の説明
表１：（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ阻害剤の特徴。
表２：ｈｃＤＩＧ、ｌｃＤＩＧ及び総原形質膜における脂肪分解的切断及び非切断ＧＰＩ
タンパク質の局在化に対する、インスリン、グリメピリド及びＧＰＩ−２３５０の効果。表３：ラット脂肪細胞における種々のインスリン模倣刺激によって誘導される５’−Ｎｕｃ転位及びグルコース輸送に対するＧＰＩ−２３５０の効果。
【００９４】
表についての説明
表１：ラット脂肪細胞由来のｈｃＤＩＧのＧＰＩ−ＰＬＣ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ由来ＧＰＩ−ＰＬＣ及びＢ．ｃｅｒｅｕｓ由来ＰＩ−ＰＬＣを、適切な条件下で指示した阻害剤の増加する濃度（０.０５μＭ〜１ｍＭ）のない場合とある場合における、可溶化した及び
部分精製ウシ赤血球ＡＣｈＥ又はヒト胎盤ａＰとインキュベートした（材料と方法を参照）。切断率は、親水性ＡＣｈＥの量及びＴＸ−１１４分配の際ＴＸ−１１４枯渇相で回復したａＰ活性から計算した。少なくとも３回の独立したインキュベーションと分配／４回の酵素アッセイ、から得られた平均＋ＳＤを記した。ｎ．ａ．：該当なし。
【００９５】
表２：単離したラット脂肪細胞を、ＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）なし又はありで処理し（５分間、３７℃）、次いで指示したように、グリメピリド（２０μＭ）又はインスリン（１０ｎＭ）の非存在下又は存在下にインキュベートした（１２０分間、３７℃）。総原形質膜（ＰＭ）、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧを調製し、次いでＴＸ−１１４分配にかけた。ＴＸ−１１４豊富相及び枯渇相を５’−Ｎｕｃ及びａＰ（活性測定）及びＧｃｅ１（光親和性標識）についてアッセイした。両親媒性及び親水性ＧＰＩタンパク質の量は、ＧＰＩ−２３５０の非存在下に基本の脂肪細胞から調製した、総原形質膜及びｈｃＤＩＧの両親媒性型のそれぞれに対して計算した（各１００ａｒｂ.単位に設定した）。ｈｃＤＩＧプラスｌｃＤＩＧからの親水性及び両親媒性ＧＰＩタンパク質の回収は、種々のインキュベーション条件下で同程度であった。少なくとも３回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ活性測定及びゲル・ランを２回行って、平均±ＳＤを得た。
【００９６】
表３：単離したラット脂肪細胞を、メチル−β−シクロデキストリン（ｍ−β−ＣＤ、１０ｍＭ、５０分間）、ＣＢＤＰ（３００μＭ、電気穿孔法、次いで、洗浄及びそれに続く３０分間のインキュベーション）、ＰＩＧ４１（１０μＭ、１５分間）、オルトバナジウム酸ナトリウム（１ｍＭ、１５分間）、トリプシン（１０μｇ／ｍｌ、１５分間、次いで０.５Ｍ・ＮａＣｌ処理及びそれに続く洗浄）及びＮ−エチルマレイミド（１ｍＭ、５
分間、次いでＤＴＴの添加）の存在下でインキュベートした。脂肪細胞懸濁液の半分にＧＰＩ−２３５０（最終濃度５０μＭ）を加え、更にインキュベーション（６０分間、３７℃）の後、細胞の一部分を、単離したｌｃＤＩＧ中の５’−Ｎｕｃ活性についてアッセイした。基本的なインキュベーション中の５’−Ｎｕｃの増加を１００ａｒｂ.単位に設定した。細胞の別の部分は（１５分間のインキュベーション後）、基本のインキュベーションについて１００ａｒｂ.単位に設定したグルコース輸送につきアッセイした。少なくとも３回独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ３回ずつ活性を測定して、平均＋ＳＤを得た。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類ＧＰＩ−ＰＬＣ（グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ）の活性を調節する、異なる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類原形質膜ＧＰＩ−ＰＬＣに特異的な阻害剤、ＧＰＩ２３５０の合成は、細菌やトリパノソーマの（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの（結晶）構造、基質の必要条件、ＧＰＩ認識及び切断機構についての背景的知識や、更にこれまでそれらについて記載された阻害剤に基づいていた。トリパノソーマのＧＰＩ―ＰＬＣに対しては、ＧＰＩ及びＰＩは、それぞれ、効率的な及び貧弱な基質である一方で、細菌のＰＩ−ＰＬＣに対してはその反対である。後者は、８０残基のトリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣにタンパク質配列が類似した領域を有している（“Kuppe et al., (1989), J. Bacteriol. 171:6077-6083"）。ＧＰＩ認識の解析のために、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓからのＰＩ−ＰＬＣの三次元構造が、グルコサミニル（α１→６）−ミオ−イノシトール（ＧＭＩ）との複合体で２.２オングストロームの分解能で最近決定され、ＧＭＩのミオ−イノシトール部分は遊離のミオ−イノシトールと同じ位置を占有しているのに対して、グルコサミン部分は触媒部位の入り口で溶媒に露出した状態にあることが明らかにされた（“Heinz et al.,(1995), EMBO J. 14:3855-3863" 及び“Heinz et al., (1996), Biochemistry 35:9496-9504"）。コア四糖類の残りの部分は、殆んどＰＩ−ＰＬＣと接触がなく、このことはＧＰＩアンカー内に受入れられたコアグリカンの顕著な構造多様性を説明しているのであろう。これらをもとにして、現時点の実験データは、細菌のＰＩ−ＰＬＣによるＰＩ及びＧＰＩの、更に、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩの切断の触媒機構は全て類似していることを示唆している。しかしながら、哺乳類ＰＩ−ＰＬＣがセカンドメッセンジャー、イノシトール三リン酸、を生成して、ＧＰＩアンカーを受入れることができず、細菌のＰＩ−ＰＬＣがリン酸化ＰＩを切断することができないことを考慮すると、このことが脂肪細胞原形質膜ＧＰＩ−ＰＬＣに対して正しいかどうかは知られていなかった。
【０００３】
細菌及びトリパノソーマの（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの基質必要条件は、以前、ＰＩ類縁体及びＧＭＩ誘導体で試験されていた。触媒作用には、イノシトールの２位に遊離のＯＨ基が必要とされる。Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ由来のミリスチン酸エステル含有ＶＳＧを用いた研究で、（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣは、ＧＭＩの２−デオキシ−イノシトール類縁体によって競合的に阻止され、イノシトール−２−ＯＨは、触媒作用には必要であるが、基質認識に重要ではないことが示された。更に、基質認識には、イノシトールの１位に荷電したホスホリル基（即ち、ホスホネート又はホスホジエステル）が必要である（“Morris, J. C., et al.,
(1996), J. Biol. Chem. 271:15468-15477”）。それ故、イノシトール−１位及びイノシトール−２位の両方のＯＨ基は触媒作用に関与しているが、なお、ホスホリル基のみが基質認識に必要であるようにみえる。興味深いことに、グルコサミン（α１→６）−イノシトール−１，２−環状リン酸は、トリパノソーマＧＰＩ−ＰＬＣに対してＧＭＩ−１−リン酸よりも、よりよい阻害剤であるが、細菌のＰＩ−ＰＬＣに対してはそうでないことが判明したが、このことは環状型が前者に対して生成物類縁体として作用するのであろうことを示唆している。更に、ＧＭＩ−１−リン酸のホスホネート誘導体は、十中八九切断できない基質類縁体であるので、より強力な阻害剤であることが判った。これらのデータは、細菌のＰＩ−ＰＬＣ作用について提案された２ステップ・メカニズムに合致している。つまり、ＰＩは、先ず切断されて環状イノシトール−１，２−リン酸（ｃＩＰ）構造を産生し、次いで、これがイノシトール−１−リン酸に加水分解される。興味深いことに、ｃＩＰ構造は、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣ触媒作用で、第２ステップ（脱環化）で
はなく第１ステップ（環化）の作用を示す、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ由来のＧＰＩ−ＰＬＣへの暴露を受けて、トリパノソーマのＶＳＧのいわゆる交差反応決定基として免疫学的に同定することができる。一過性又は安定したｃＩＰ形成に必要な条件は、ヒト赤血球ＡＣｈＥでのように、イノシトール残基の１位又は２位がパルミトイル化されたＧＰＩアンカーはホスホリパーゼ切断に抵抗性である、という発見と一致している。
【０００４】
ＧＭＩ−１−ドデシルホスホネートは、やはり膜と会合しているトリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣに対して相当するヘキシル誘導体よりもかなり阻害的であることが判った（“Morris, J. C. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270: 2517-2524"）。興味深いことに、イノシトールに炭水化物の置換基（即ち、グルコサミン）がないと、つまりイノシトール−１−リン酸の切断されない類縁体では、ミオ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシルリン酸によって例示されるように、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣを阻害することが見出された。この型の阻害剤の効率は、トリパノソーマのＧＰＩ−ＰＬＣを１０〜９０μＭのＩＣ50で競合的に阻害する、２−フルオロ置換体を有する２−デオキシ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシルホスホネートの２位の置換体でかなり増加した（“Morris, J. C. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 15468-15477"）。これまでに報告されたＧＰＩ−ＰＬＣの最も強力な阻害剤は、２−デオキシ−イノシトールの２位にフルオロ基を、１位にドデシルホスホネートの両者を有しており、ミオ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシル−ホスホン酸よりも少なくとも５倍より阻害的である（“Morris, J. C. et al. (1998), Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 873-867"）。興味深いことは、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ及びＴ．ｂｒｕｃｅｉ由来の（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣのこれら化合物のいくつかによる差別的な阻害は、二つの酵素が（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの機械的なサブクラスを表すと論じていることである。
【０００５】
残念ながら、類似のデータが哺乳類のＧＰＩ−ＰＬＣについて未だに得られていない。驚くべきことに、新しく合成されたミオ−イノシトール−１，２−シクロ−ドデシルホスホン酸（ＧＰＩ−２３５０）は、細菌及び脂肪細胞のＧＰＩ−ＰＬＣの強力な阻害剤であることが判った。
【０００６】
アルカリ性ホスファターゼ（ａＰ）が細菌のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によって膜二重層から放出されるという最初の観察は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質への共有結合を含むタンパク質の別の型の膜付着の同定へと導いた。
【０００７】
ＧＰＩアンカーの最初の完全な構造は、トリパノソーマ・ブルセイ由来の変異体表面グリコプロテイン（ＶＳＧ）について明らかにされた。
【０００８】
コア四糖類は、３つのマンノース残基と非アセチル化グルコサミンからなり、後者の一末端はホスホエタノールアミン架橋を経てタンパク質部分にアミド結合しており、他の末端はホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の６−ヒドロキシル基にグリコシド結合的に結合している。ＰＩは、それぞれジアシルグリセロール及びホスファチジン酸を放出する特異性Ｃ及びＤの（Ｇ）ＰＩ−特異的ホスホリパーゼ［Ｇ］ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄによって切断され、タンパク質部分の末端（ホスホノ）イノシトールグリカン（ＰＩＧ）構造を残す。
【０００９】
それ以来、種々の起源の細菌ＰＩ−ＰＬＣが、ＧＰＩアンカー型タンパク質（ＧＰＩ−タンパク質）を検出するのに一般的に使用されている。
【００１０】
ＧＰＩアンカー型ＶＳＧからなる防護的表面被膜のＧＰＩ−ＰＬＣによる脂肪分解放出は、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉにとっては、宿主の免疫系を逃れるために抗原変異を達成するために必要であろうと推測される。
【００１１】
殆んどの哺乳類細胞及び組織は、大多数が原形質膜の外小葉に埋め込まれているＧＰＩアンカーを有しているＧＰＩ−タンパク質を発現するので、内因性の（Ｇ）ＰＩ／ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄが、それら細胞の表面発現の特異的ダウン・レギュレーションを調節し、同時に循環における可溶性タンパク質部分の増加を調節することができる。
【００１２】
ＧＰＩ−タンパク質の可溶性型は、５−ヌクレオチダーゼ（５’−Ｎｕｃ）、Ｔｈｙ−１、アルカリ性ホスファターゼ（ａＰ）及びＣＤ１６受容体のように血流内を循環していることが検出された。ＧＰＩ−ＰＬＣは、又、ヒト好中球、ウシ脳、ラット腸及びヒト上皮性悪性腫瘍細胞株において同定することができた。ラット肝からのＧＰＩ−ＰＬＣは、均質性を示すまで精製された。内因性ＧＰＩ−ＰＬＣは、ブタの最大の小管から腎ジペプチダーゼを放出する能力を有していると記載されていた。しかしながら、ＧＰＩ−ＰＬＣの構造又は遺伝子の解明は未だされていない。哺乳類ＧＰＩ−ＰＬＣが膜依存性であるのに対して、哺乳類ＧＰＩ−ＰＬＤは、異なった種（ヒト、ラット、ウシ）及び器官（胎盤、脳、肝、血清）の組織材料の全ての型から回収することができる。
【００１３】
ＧＰＩ−ＰＬＤの主な役割は、多分、リソソームへのエンドサイトーシス及びトラフィッキングの後のＧＰＩタンパク質のＧＰＩアンカーの分解である。哺乳類の組織は、血清中及び細胞表面において、異なった機能性を持って活性である二つのはっきりと識別できるＧＰＩ−ＰＬＤを持っている。
【００１４】
酵母及び齧歯類脂肪細胞の５’−Ｎｕｃ及びａＰのようないくつかのＧＰＩタンパク質は、インビトロ及びインビボでＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩアンカーの脂肪分解により細胞表面から可溶性のものとして放出されているようにはみえない。
【００１５】
付加的な温和な塩及び／又はトリプシン切断が、顆粒画分／細胞から分離の後に、可溶性画分／培地中のいくつかの脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質のタンパク質部分の回収に必要とされるのは、受容体タンパク質の存在を示唆している。
【００１６】
これらの場合において、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性はＧＰＩ−タンパク質の局在又はトポロジーに影響しないが、代わりに、両親媒性から親水性の形態への変換の途中で機能的（触媒／結合）特性を変化する。無処置のＧＰＩアンカーの存在は、それに付いているタンパク質部分の立体構造及び挙動に影響している。
【００１７】
５’−Ｎｕｃ及びＧｃｅ１の場合には、触媒及び結合効率は、膜に包埋された又は界面活性剤ミセル又はリポソームに再構築された完全な形のものと比較すると、脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質において増加した。
【００１８】
ＧＰＩタンパク質の脂肪分解プロセシングが細胞壁の生合成の間ある役割を演じているような、酵母におけるグルコースのような栄養シグナルによって、及び齧歯類の脂肪細胞、ミオサイト及びヒト内皮細胞におけるグルコースやある種のホルモン、増殖因子及び薬物（例えば、インスリン、グリメピリド）によって、真核生物において、多くのＧＰＩ−ＰＬが、アップレギュレートされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
グリメピリド、抗糖尿病薬は、膵細胞からインスリン放出を刺激することによって、更に、少しの程度であるが、筋肉細胞におけるグルコース輸送の活性化及び脂肪細胞における脂肪分解の阻害のような、末梢組織での代謝的インスリン作用を模倣することによって、主に血糖を低下させる。
【００２０】
スルホニルウレア、グリメピリド、の血糖低下効果は、部分的には、ＩＲＳ−ＰＩ３Ｋ経路のインスリン受容体非依存性活性化を経た脂肪細胞及び筋肉細胞における非酸化的グルコース代謝の刺激によって引き起こされる。単離したラット脂肪細胞において、グリメピリドの作用の分子機構は、アシル化された非受容体チロシンキナーゼ、ｐｐ５９Lyn、
及びいくつかのＧＰＩタンパク質のような脂質ラフト関連シグナリング成分の再分配及びそれに伴っておこる活性化、並びに、インスリンによって中程度に活性化もされる原形質膜グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ＧＰＩ−ＰＬＣの促進に関与していることが明らかにされている。
【００２１】
グリメピリドは、膵臓β細胞からのインスリン放出を促進するスルホニルウレア剤であり、膵臓外の機構を経て作用するであろう。グリメピリドは、血糖症が食事及び運動だけではコントロールされない２型（非インスリン依存性）糖尿病患者に１日１回投与され、続発性スルホニルウレア障害の患者にインスリンと併用されることもある。
【００２２】
グリメピリドの最大の血糖低下効果は、投与後最初の４時間に起こる。グリメピリドは、グリベンクラミド（グリブリド）よりも心臓血管変動に対する重篤な影響はより少ない。薬物動態は高齢の患者又は腎疾患や肝臓疾患のそれら患者において主として不変である。グリメピリドの薬物相互作用は殆んど報告されていない。
【００２３】
２型糖尿病患者において、グリメピリドの有効投与範囲は、０.５から８ｍｇ／日であり、４ｍｇ／日と８ｍｇ／日の投与間に有効性の差が殆んどない。グリメピリドは、１年間の試験において、グリベンクラミド及びグリピジドの有効性と類似していた。しかしながら、グリメピリドは最初の数週間にわたる治療でグリピジドよりもより速く血糖を低下するようである。グリメピリド及びグリクラジドが、１４週間の試験で基準線に良好に血糖コントロールができている患者で比較され、効果に差がないことが指摘された。グリメピリドとインスリンの併用は、絶食時血糖標的レベルが≦７.８ｍｍｏｌ／Ｌに達する続発性スルホニルウレア障害の患者の治療において、インスリンとプラセボの併用と同程度の効果があったが、グリメピリドを用いることにより血糖症に対してより低いインスリン投与量とより速い効果が見られた。
【００２４】
グリメピリド単独療法は、一般的に良好な耐容性を有するが、治療期間１年以下（≦１年）の患者の１０から２０％、及び６ヶ月間同時にインスリンを投与された患者の５０％以下（≦５０％）において、低血糖症を発症した。集計した治験データは、グリメピリドは、グリベンクラミドよりも低血糖症の発生率が低く、特に治療第１ヵ月目において低いであろうことが示唆された。投与量は、通常１ｍｇ／日で開始され、１から２週間の間隔で血糖コントロールのために通常の投与範囲１から４ｍｇ／日に漸増する（英国では最大６ｍｇ／日又は米国では８ｍｇ／日）。
【００２５】
グリメピリドは、主に膵臓β細胞からのインスリンの放出の促進によって、及び僅かな程度で、筋肉細胞におけるグルコース輸送の活性化及び脂肪細胞における脂肪分解の阻害のような、末梢組織における代謝性インスリン作用を模倣することによって、グルコースを低下させる。
【００２６】
グリメピリドは、初代培養又は培養した齧歯類脂肪細胞を薬理学的濃度で処理すると、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性化によって、５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＧｃｅ１のようなＧＰＩタンパク質サブセットの両親媒性から親水性への変換を強力に誘導することが明らかにされた。
【００２７】
本発明において初めて開示されたイノシトール誘導体、ＧＰＩ−２３５０は、高力価（
ＩＣ50＝０.２〜１０μＭ）及び選択性で細菌、トリパノソーマ及び血清ＧＰＩ−ＰＬＣ及びＧＰＩ−ＰＬＤを阻害する。ＧＰＩ−２３５０は、無処置のラット脂肪細胞のＧＰＩ−ＰＬＣを殆んど完全にダウンレギュレートする。ＧＰＩ−ＰＬＣは、代謝性インスリンシグナリングでは役割を演じない一方で、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性化は、界面活性剤不溶性の糖脂質に富む脂質ラフト領域（ＤＩＧ）からインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）へのインスリン受容体非依存性クロストークを経由するグリメピリドのインスリン模倣効果には必須である。
【００２８】
脂肪細胞のような多くの最終分化細胞の原形質膜に多数発現しているＤＩＧは、シグナル伝達並びにタンパク質及び脂質のトラフィッキング及び選別を包含する膜媒介生物学的過程のためのプラットフォームとして役目を果たしている、特殊な膜ミクロドメインである。
【００２９】
それらは、外部原形質小葉中のコレステロール及びスフィンゴ（糖）脂質、及び内小葉の飽和アシル鎖を有するリン脂質及びコレステロールに濃縮されていて、二重層内に液状の秩序相を形成している。ＤＩＧは、冷状態で１％トライトンＸ−１００に不溶性であり、ショ糖勾配遠心分離法で低浮遊密度であることを特徴とする。これらの判断基準に基づいて、ある種のＧＰＩアンカーされ、アシル化した、膜貫通シグナリングタンパク質が、原形質膜のＤＩＧ対非ＤＩＧ領域に豊富にあることが見出された。更に、高コレステロール含有のＤＩＧ（ｈｃＤＩＧ）及び低コレステロール含有のＤＩＧ（ｌｃＤＩＧ）は、それぞれ、それらの低浮遊密度及び高浮遊密度に基いて互いに区別することができる。
【００３０】
ｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの、ＧＰＩアンカーされ、そしてアシル化されたある種のシグナリングタンパク質の刺激依存性再分配は、ＧＰＩ−２３５０によってブロックされた。
【００３１】
ＧＰＩ−２３５０は、脂質ラフト関連ＧＰＩ−ＰＬＣ（ＩＣ50＝５〜１０μＭ）による無処置のラット脂肪細胞由来の、Ｇｃｅ１及び５’−Ｎｕｃのような、ＧＰＩタンパク質の基本的及びグリメピリド／インスリン誘発脂肪分解放出を減少させた。ＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）によるＧＰＩ−ＰＬＣの阻害は、（ｉ）ｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１のカベオリンからの解離、（ｉｉ）ｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの再分配、（ｉｉｉ）ｐｐ５９Lyn及びＩＲＳ−１のチロシンリン酸化、（ｉｖ）グルコース輸送の促進及び（ｖ）グリメピリドに応答する脂肪分解の阻害、の殆んど完全な遮断を導く。
【００３２】
ＧＰＩ−ＰＬＣのインスリン活性化は、脂質ラフト分布に対する適度な効果を有し、及び、それ（例えば、ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化及び脂肪分解の阻害）が僅かに減少するだけであったので、あったとしても代謝性インスリンシグナリングにおける軽微な役割がＧＰＩ−２３５０のみの存在下で明らかにされた。
【００３３】
グリメピリドに誘導されたＧＰＩ−ＰＬＣによって生成する脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質は、それらの非切断両親媒性のもの及びｐｐ５９Lynのように、ｌｃＤＩＧに再分配するよりもむしろｈｃＤＩＧと会合して残っている。
【００３４】
ラット脂肪細胞において再分配され、活性化されたｐｐ５９LynによるＩＲＳのチロシンリン酸化を経るインスリンシグナリングカスケードへのグリメピリドのクロストークは、ｈｃＤＩＧが関与するＧＰＩ−ＰＬＣの活性化を必要とする。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本発明は、哺乳類のＧＰＩ−ＰＬＣの活性を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）哺乳類細胞をグリメピリドと共にインキュベートし；
ｂ）ａ）の細胞のｈｃＤＩＧを調製し；
ｃ）ｂ）からのｈｃＤＩＧを化合物と共にインキュベートし；そして
ｄ）ｃ）のｈｃＤＩＧからのＧＰＩ−ＰＬＣの活性を定量する；
ことを含む方法に関する。
【００３６】
方法のステップａ）に記載の哺乳類細胞は、齧歯類又はイヌの細胞に関する。齧歯類は、例えば、マウス、ラット又はモルモットである。本方法は、ヒト、又は例えばチンパンジー、ゴリラ又はボノボのような類人猿の細胞にも関する。そのような細胞は、例えば、膵臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、脳細胞、脂肪細胞である。哺乳類細胞は、細胞培養によっても提供することができる。細胞を取得し、処理し、収穫し、加工するために、通常の技術が使われる（例えば、Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons; 0-471-24108-3-Looseleaf; 0-471-24105-9-CD-ROM）。
【００３７】
本発明の方法のステップｃ）に記載のｈｃＤＩＧからのＧＰＩ−ＰＬＣの活性を定量するには、ｈｃＤＩＧからｐｐ５９Lynの解離を測定することによって、又はｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへのｐｐ５９Lyn及び／又はＧｃｅ１の再分配を測定することによって、又はｐｐ５９Lyn及び／又はＩＲＳ−１のリン酸化の変化を測定することによって、又はグルコース輸送の促進及び／又は脂質分解の阻害を測定することによって実行される。
【００３８】
本発明は、更に、前に開示したように本発明の方法によって同定することができる化合物に関する。そのような化合物は、例えば、本発明に開示されているような式Ｉを有する化合物又はその誘導体である。
【００３９】
本発明は、又、全ての立体異性体の形態における、および全ての比率のその混合物である式Ｉの化合物：
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立して、ＯＨ又はＦのいずれかであり、そしてＲ5は（Ｃ1−Ｃ20）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ20）−アルケニルである）及び生理的に耐容されるその塩に関する。
【００４０】
本発明は、又、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及び／又はＲ4のいずれか２つが互いに独立してＦである、前記に記載の式Ｉの化合物に関する。
【００４１】
本発明は、又、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4が各々の場合においてＯＨである、前記に記載の式Ｉの化合物に関する。
【００４２】
本発明は、又、Ｒ5がＣ12−アルキルである、前記に記載の式Ｉの化合物に関する。
【００４３】
本発明のそのような化合物は、例えば、全てのその立体異性体の形態を含む、以下の式を有する。
【化２】
【００４４】
又は、本発明のそのような化合物は、例えば、以下の式を有する。
【化３】
【００４５】
そのような本発明の化合物は、例えば、その全ての立体異性体の形態を含む、ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸であり得る。
【００４６】
本発明の記載において、用語（Ｃ1−Ｃ20）−アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、デュオデシル、トレデシル、クアトルデシル、クインデシル、セスデシル、セプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルの全ての立体異性体の立体構造を有する、全ての直鎖状又は分枝鎖状の化合物に関するものとする。
【００４７】
本発明の記載において、用語（Ｃ2−Ｃ20）−アルケニルは、エチレン、プロピレン、
ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、デシレン、ウンデシレン、デュオデシレン、トレデシレン、クアトルデシレン、クインデシレン、セスデシレン、セプタデシレン、オクタデシレン、ノナデシレン、エイコシレンの全ての立体異性体の立体構造を有する、全ての直鎖状又は分枝鎖状の化合物を包含するものとする。
【００４８】
本発明は、更に、ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸の製造方法であって、
ａ）ラセミ体の１，４，５，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトールをリン酸化してテトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を得ること；及び
ｂ）テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を接触水素化すること；
を含む方法に関する。
【００４９】
該製造方法は、前に特定したようなＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及び／又はＲ5を含む適切な出発物質を使用することによって、本発明の別のいずれかの化合物の製造に適用し得るものである。
【００５０】
本発明は、又、式Ｉを有する少なくとも１つの化合物及び／又は生理的に耐容される塩及び／又はそのプロドラッグ及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００５１】
本発明は、更に、糖尿病の治療のために使用される薬剤の副作用を変えるための、式Ｉの化合物及び／又は生理的に耐容されるその塩及び／又はそのプロドラッグの使用に関する。そのような薬剤は、例えば、グリメピリドである。副作用は、例えば、グリメピリドの誤った投与量に起因する低血糖である。
【００５２】
本発明は、又、糖尿病の治療のために使用される薬剤（例えば、グリメピリド）の副作用の治療用の医薬組成物を製造するための、式Ｉを有する化合物の使用に関する。
本発明は、又、脂肪細胞の原形質膜を横切るシグナル伝達の間にＤＩＧ中のシグナル伝達タンパク質を同定するための、又は、ＧＰＩ−ＰＬＣ及び／又は依存性のシグナル伝達因子の哺乳類の変異体を同定及び特性付けるための、式Ｉの化合物の使用に関する。
【００５３】
本発明は、又、グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）哺乳類細胞をグリメピリドと化合物との混合物と共にインキュベートし；
ｂ）ａ）の細胞のｈｃＤＩＧを調製し；そして
ｃ）ｂ）のｈｃＤＩＧからのＧＰＩ−ＰＬＣの活性を定量する；
ことを含む方法に関する。
【００５４】
本発明の記載における化合物は、化学合成によって製造されるものか、天然源から単離されるもののいずれかであって、５０と５０,０００ダルトンの間の分子量を有する、いずれかの有機及び／又は炭水化物化合物を意味するものとする。
【００５５】
グリメピリドの活性の調節とは、活性が、促進されるか、阻害されるか、活性をある一定のレベルに安定させるという意味で保持されるか、を意味するものとする。
【００５６】
グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップａ）における哺乳類細胞は、例えばラット又はマウスのような齧歯類の細胞、イヌの細胞又はヒトの細胞を包含するものとする。そのような細胞は、例えば、膵臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、脳細胞又は脂肪細胞であり得る。又、使用することができるのは、細胞培養（例えば、初代細胞培養）の細胞である。グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップｃ）に記載のＧＰＩ−ＰＬＣの活性の定量は、ｈｃＤＩＧからのｐｐ５９Lynの解離を測定することによって、又はｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧのｐｐ５９Lyn及び／又はＧｃｅ１再分配を測定することによって、又はｐｐ５９Lyn及び／又はＩＲＳ−１のリン酸化の変化を測定することによって、又はグルコース輸送の促進及び／又は脂質分解の阻害を測定することによって、達成することができる。
【００５７】
グリメピリドの活性を調節する化合物の同定方法のステップｃ）に記載のｈｃＤＩＧか
らのＧＰＩ−ＰＬＣの活性が弱められている場合は、同定された化合物がグリメピリドの活性を不活化しているか又は減少させている。ＧＰＩ−ＰＬＣの活性が増強されている場合は、同定された化合物がグリメピリドの活性を促進しているか、又は支持している。
【００５８】
医薬として許容される陰イオンを有する式Ｉの化合物の塩は、医薬として許容される塩の製造又は精製のための、及び／又は非治療、例えばインビトロでの応用において使用するための有用な中間体として本発明の範囲内に、同様に包含される。
【００５９】
式Ｉの化合物の塩は、当業者によく知られている通常の方法を用いて製造することができる。塩は、例えば、式Ｉの化合物を、溶媒又は希釈剤中で、無機若しくは有機酸又は塩基と組み合わせることによって製造することができる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「生理的に活性な誘導体」は、例えば、ヒトのような哺乳類に投与されると、式Ｉの化合物又はその活性代謝物を（直接的に、又は間接的に）形成することができる、本発明の式Ｉの化合物の生理的に許容される誘導体のいずれか、例えばエステル、に関する。
【００６１】
生理的に活性な誘導体は、又、本発明の化合物のプロドラッグを包含する。そのようなプロドラッグは、本発明の化合物にインビボで代謝され得る。これらのプロドラッグはそれ自体活性又は不活性であることができる。
【００６２】
本発明の化合物は、種々の多形相、例えば、非晶性及び結晶性多形相として存在することができる。本発明の化合物の全ての多形相は、本発明の範囲内に包含され、本発明の更なる態様である。
【００６３】
以下、「式Ｉの化合物（類）」についての全ての言及は、上に記載した式Ｉの化合物／化合物類、並びに、本明細書に記載したそれらの塩、溶媒和物及び生理的に活性な誘導体を意味する。
【００６４】
所望の生物学的効果を達成するために必要な式Ｉの化合物の量は、多くの因子、例えば、選択された特異的化合物、目的とする使用、投与様式及び患者の臨床状態に依存している。一般的に、１日投与量は、体重１キログラム当たり１日につき０.３ｍｇから１００ｍｇ（典型的には３ｍｇから５０ｍｇ）の範囲内、例えば、３〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。静脈内投与量は、例えば、０.３ｍｇから１.０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これは１分当たり体重１キログラムにつき１０ｎｇから１００ｎｇの注入として適切に投与することができる。これらの目的のための適切な注入溶液は、例えば、１ミリリットル当たり０.１ｎｇから１０ｍｇ、典型的には１ｎｇから１０ｍｇを含有することができる。個々の投与量は、例えば、１ｍｇから１０ｇの活性化合物を含有することができる。それ故、注射用アンプルは、例えば、１ｍｇから１００ｍｇ、を含有することができ、そして、例えば、錠剤又はカプセルのような経口投与可能な個々の剤形は、例えば、１.０から１,０００ｍｇ、典型的には１０から６００ｍｇを含有することができる。医薬として許容される塩の場合、上記した重量の詳細は、塩から由来するジヒドロチアゾリウムイオンの重量と関連している。上に挙げた状態の予防又は治療のために、式Ｉの化合物は、化合物としてそれ自体使用することができるが、それらは耐容される賦形剤との医薬組成物の形態で存在するのが好ましい。賦形剤は、勿論、それが組成物の別の構成物と相性がいいこと、及び患者の健康に有害でないことという意味において、耐容性でなければならない。賦形剤は、固体又は液体又は両者であり得、好ましくは、例えば、活性化合物の０.０５質量％から９５質量％までを含有することができる錠剤として、個々の投与量として化合物と処方される。更に医薬として活性な物質も、式（Ｉ）の更なる化合物を包含して存在し得る。本発明による医薬組成物は、本質的に成分を薬理学的に許容される賦形剤及び／又は助剤
と混合することから成る、公知の薬学的方法の一つによって製造することができる。
【００６５】
本発明による医薬組成物は、個々の場合における最も適切な投与方法が、治療される状態の性質及び重症度、並びに各々の場合に使用される式（Ｉ）による化合物の性質に依存するものの、口腔、直腸、局所、経口（例えば、舌下）及び非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内又は静脈内）投与に適したものである。糖衣をかけた剤形及び糖衣をかけた遅延放出剤形も、又、本発明の範囲内に包含される。耐酸性及び腸溶性剤形が好ましい。好適な腸溶性コーティングとしては、酢酸フタル酸セルロース、ポリ酢酸ビニルフタル酸塩、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びメタクリル酸及びメタクリル酸メチルのアニオン性ポリマーが挙げられる。
【００６６】
経口投与用に好適な医薬化合物は、例えば、各々の場合において式（Ｉ）の化合物の一定量を含有する、カプセル、カシェ剤、トローチ剤又は錠剤のような分離された単位で存在することができ、粉剤又は顆粒剤として、水性又は非水性の溶液又は懸濁液として、又は水中油又は油中水エマルジョンとして、分離された単位で存在することができる。既に挙げたように、これらの組成物は、活性化合物と（１つ又はそれ以上の付加的成分からなり得る）賦形剤が接触されるステップを包含するいかなる好適な薬学的方法によっても製造することができる。一般的に、組成物は、活性化合物を液体及び／又は微細に分割した固体の賦形剤と均一及び均質に混合し、その後、必要により生成物を成形することにより、製造される。かくして、例えば、錠剤は、化合物の粉末又は顆粒を加圧又は成型によって、もし適切ならば、１つ又はそれ以上の追加の成分と共に、製造することができる。圧縮した錠剤は、化合物を、例えば粉末又は顆粒のような自由に流れる形態で、適切な場合は結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤及び／又は１つの（多くの）界面活性／分散剤と混合して、好適な装置で錠剤化することによって製造することができる。成形された錠剤は、粉体化合物を、不活性液体希釈剤でぬらし、好適な機械で成型することによって製造することができる。
【００６７】
経口（舌下）投与に好適な医薬組成物は、式Ｉの化合物と香味料、通常ショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムを含有するトローチ錠、及びゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性基剤中に化合物を含んだ芳香錠を包含する。
【００６８】
好適な非経口投与用医薬組成物は、好ましくは、意図した被投与者の血液と好ましくは等張である、式Ｉの化合物の滅菌水性製剤を包含する。これらの製剤は、投与は注射として皮下、筋肉内又は経皮で行うことができるが、好ましくは、静注で投与される。これらの製剤は、好ましくは、化合物を水と混合し、得られた溶液を滅菌し、血液と等張にすることによって製造することができる。本発明の注射できる組成物は、一般的に、活性化合物を０.１から５質量％含有している。
【００６９】
直腸投与に好適な医薬組成物は、好ましくは、個々の投与量の座薬として存在する。それらは、式（Ｉ）の化合物を１又はそれ以上の通常の固体賦形剤、例えば、カカオバターと混合し、得られた混合物を成形することによって製造することができる。
【００７０】
皮膚に局所適用する好適な医薬組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、スプレー、エーロゾル又はオイルとして存在する。使用することのできる賦形剤は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール及びこれらの物質の２つ又はそれ以上の組合せである。活性化合物は、一般的に、組成物の０.１から１５質量
％の濃度、例えば、０.５から２質量％の濃度で存在する。
【００７１】
経皮投与も、又、可能である。経皮投与用に好適な医薬組成物は、患者の表皮と長期間密接に接触するのに適している個々のパッチとして存在することができる。そのようなパ
ッチは、場合によっては緩衝性水性溶液中の活性化合物を、接着剤中に溶解及び／又は分散させて、又はポリマー中に分散させて、好適に含有している。適切な活性化合物濃度は、約１％から３５％、好ましくは約３％から１５％である。特別な可能性として、活性化合物は、例えば、Pharmaceutical Research, 2(6): 318 (1986) に記載されているように、エレクトロトランスポート又はイオントフォレーゼによって放出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ阻害剤の構造及び合成を示す。材料と方法を参照。
【図２】ＧＰＩ−２３５０の力価を示す。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、ラット血清及びＴ．ｂｒｕｃｅｉ由来の精製（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄ、並びに単離したラット脂肪細胞由来の総原形質膜（ＰＭ）及びｈｃ／ｌｃＤＩＧをＧＰＩ−２３５０の濃度を増加しながらインキュベートし（１０分間、３０℃）、次いでＴＸ−１１４分配によってＡＣｈＥ及びａＰの両親媒性から親水性への変換につきアッセイした（材料と方法を参照）。脂肪分解活性は、ＧＰＩ−２３５０の非存在下における対照反応（１００％と設定）の％を計算した。少なくとも４回の独立したインキュベーションを行い、ＡＣｈＥ及びａｐ活性を各３回測定して、平均＋ＳＤを得た。
【図３】ＧＰＩ−２３５０の選択性を示す。記載したように異なる由来の種々の（部分的に）精製した又は組換えリパーゼ（ＨＳＬ、ホルモン感受性リパーゼ；ＰＬ、膵リパーゼ；ＬＰＬ、リポプロテインリパーゼ；ＰＣ−ＰＬＣ、ホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ；ＰＩ−ＰＬＣ、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ；ＰＬＤ、ホスホリパーゼＤ；ＰＬＡ2、ホスホリパーゼＡ2；ＧＰＩ−ＰＬＣ、グリコシルホスファチジルイノシトール特異的ＰＬＣ／Ｄ及びＡＣｈＥ（アセチルコリンエステラーゼ））、及び単離したラット脂肪細胞由来の総原形質膜（ＰＭ）及びｈｃ／ｌｃＤＩＧを標準的なアッセイプロトコールに従ってＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）の非存在下又は存在下でアッセイした（材料と方法を参照）。少なくとも３回独立してインキュベーションを行い、各２回測定して、平均＋ＳＤを得た。
【図４】インスリン／グリメピリド誘導ＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩタンパク質の切断に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。パネルＡ及びＢ．ｈｃＤＩＧを、未処理ラット脂肪細胞から調製し、次いで、記載したようにして、ＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下でインキュベートし（５分間、３７℃）（パネルＡ、５０μＭ；パネルＢ、濃度を増加させる）、続いてインスリン（１０μＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の無し又は有りで処理した（１２０分間、３０℃）。パネルＣ及びＤ。単離したラット脂肪細胞を、記載したようにしてインスリン（１０μＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の非存在下又は存在下でインキュベートした（１５分間、３７℃）。ｈｃＤＩＧを調製し、次いでＧＰＩ−２３５０とインキュベート（１２０分間、３０℃）した（パネルＣ、５０μＭ；パネルＤ、濃度を増加させる）。パネルＥ、Ｆ及びＧ。単離したラット脂肪細胞を、記載したようにして、ＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下（パネルＥ及びＧ、５０μＭ；パネルＦ、濃度を増加させる）でインキュベートし（５分間、３７℃）、次いでインスリン（１０ｎＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の無し又は有りで処理した（９０分間、３７℃）。ｈｃＤＩＧを調製した。パネルＡ〜Ｄ。ｈｃＤＩＧのＧＰＩ−ＰＬＣ活性を、外因基質として５’−Ｎｕｃを用い、その親水性型への変換として測定した。パネルＥ〜Ｇ。ｈｃＤＩＧのＴＸ−１１４枯渇相で回収したタンパク質を、親水性５’−ＮｕｃおよびａＰにつき免疫ブロット処理し、又はフォトアフィニティ標識によって親水性Ｇｃｅ１を分析した。３回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ活性測定及びゲル・ランを２回（代表例１つを示す）行って、平均＋ＳＥを得た。
【図５】ＤＩＧ内のシグナル伝達タンパク質のグリメピリド誘発再分配に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、記載したようにして、ＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下（最終濃度、５０μＭ）で処理し（５分間、３７℃）、次いでグリメピリド（５０μＭ）の非存在下又は存在下でインキュベートした（１２０分間、３７℃）。ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧを調製し、それぞれ免疫ブロット法及びフォトアフィニティ標識によって、ｐｐ５９Lyn、５’−Ｎｕｃ、カベオリン１、インスリン受容体βサブユニット（ＩＲβ）、グルコーストランスポーター４（Ｇｌｕｔ４）、及びＧｃｅ１の存在についてアッセイした（ゲルの添付書類を参照）。ｈｃ／ｌｃＤＩＧと共に回収したｐｐ５９Lyn、Ｇｃｅ１及び５’−Ｎｕｃの量は、ＧＰＩ−２３５０の非存在下（１００と設定）における対照反応（基本）と比較して示した。少なくとも３回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれゲル・ラン２回（代表例１つを示す）を行って、平均＋ＳＤを得た。
【図６】カベオリン由来のシグナル伝達タンパク質のグリメピリド／インスリン誘発解離に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、ＧＰＩ−２３５０（左パネル、５０μＭ；右パネル、濃度増加）の無し又は有りで処理し（５分間、３７℃）、次いでインスリン（１０ｎＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の非存在又は存在下でインキュベート（１２０分間、３７℃）した。ｈｃＤＩＧを脂肪細胞から調製し、可溶化した。可溶化ｈｃＤＩＧから調製したカベオリン１免疫沈降物を、それぞれ免疫ブロット法及びフォトアフィニティ標識によってｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１の存在につきアッセイした。ｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１の量は、相同免疫ブロット法（ゲルの添付書類を参照）によって免疫沈降カベオリン１の回収につき補正した後に、対照反応において（パネルＡ、基本を１００に設定）、又はインスリン又はグリメピリド促進状態において（パネルＢ、１００に設定）ＧＰＩ−２３５０の非存在と比較して示した。少なくとも４回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれにつきゲル・ランを２回（代表例１つを示す）行って、平均＋ＳＤを得た。
【図７】シグナル伝達タンパク質のグリメピリド／インスリン誘導活性化に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、ＧＰＩ−２３５０（パネルＡ、５０μＭ；パネルＢ、濃度を増加）の無し又は有りで処理（５分間、３７℃）し、次いでインスリン（１０ｎＭ）又はグリメピリド（２０μＭ）の非存在下又は存在下でインキュベート（１２０分間、３７℃）した。ＩＲＳ−１及びｐｐ５９Lynは、脱脂した核の次にある下層（材料と方法を参照）から免疫沈降し、可溶化しｈｃ／ｌｃＤＩＧとそれぞれ結合し、次いでホスホチロシンにつき免疫ブロット法にかけた。チロシンリン酸化ＩＲＳ−１及びｐｐ５９Lynの量は、相同免疫ブロット法（ゲルの添付書類を参照）によって免疫沈降ＩＲＳ−１及びｐｐ５９Lynの回収につき補正した後に、対照反応において（パネルＡ、基本を１００に設定）、又はインスリン又はグリメピリド促進状態において（パネルＢ、それぞれの場合において１００に設定）、ＧＰＩ−２３５０の非存在のものと比較して示した。少なくとも４回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれにつきゲル・ラン２回（代表例１つを示す）を行って、平均＋ＳＤを得た。
【図８】グリメピリド／インスリン誘導代謝活性に対するＧＰＩ−２３５０の効果を示す。単離したラット脂肪細胞を、記載されたように、ＧＰＩ−２３５０（パネルＡ、５０μＭ；パネルＢ、濃度を増加；パネルＣ、５μＭ、５０μＭ）の無し又は有りで処理（５分間、３７℃）し、次いでインスリン（Ｉｎｓ、１０ｎＭ）又はグリメピリド（Ｇｌｉ、２０μＭ又は濃度を増加）の非存在下又は存在下でインキュベート（１５分間、３７℃）した。次いで脂肪細胞を、グルコース輸送及びイソプロテレノール誘導脂肪分解についてアッセイした。活性は、対照反応において（パネルＡ、基本）、又はインスリン又はグリメピリド促進状態において（パネルＢ及びＣ、１００に設定）、ＧＰＩ−２３５０の非存在のものと比較して示した。少なくとも５回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれについて活性測定を３回行って、平均＋ＳＤを得た。
【図９】単離したラット脂肪細胞を０.５ｍＭ・ＮＢＤ−ＦＡで標識し（６０分間、３７℃）、洗滌し、次いでグリメピリド（パネルＡ、Ｂ）又はインスリン（パネルＣ、Ｄ）の濃度を増加して作用させる前に、ＧＰＩ−２３５０の非存在下（パネルＢ、Ｄ）又は存在下（５０μＭ；パネルＡ、Ｃ）でインキュベート（５分間、３７℃）した。記載したようにして、イソプロテレノール（１μＭ）の無し又は有りで、更にインキュベーション（１２０分間、３７℃）した後、総細胞懸濁液を、クロロホルム／ヘプタン／メタノール／０.１Ｎ・ＨＣｌ（３／３／２／１、容積比）で抽出した。有機層を、マーカーとしてＮＢＤ−ＦＡを同時に使用し、薄層クロマトグラフィー（ジエチルエーテル／石油エーテル／酢酸、７８／２２／１、容積比）及び蛍光イメージングにより分析した。２回の独立した標識化とインキュベーションを行った典型的な実験を示すが、同じような結果が繰り返された。ＴＡＧ：トリアシルグリセロール。
【図１０】ラット脂肪細胞原形質膜の非ＤＩＧ領域、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧの間のＧＰＩタンパク質の再分配の機構についてのワーキングモデル、インスリン、グリメピリド及びＧＰＩ−ＰＬＣ及び推定ＧＰＩタンパク質受容体、ｐ１１５、を包含するコレステロール枯渇による制御、並びにカベオリン、ｐｐ１２５Fak及びｐｐ５９Lynを経由するＩＲＳ−１への代謝シグナリングの下流へのカップリングを示す。ＧＰＩ−ＰＬＣ及びｐ１１５の膜貫通領域（ＴＭ）を経由するｈｃＤＩＧにおけるトポロジー、膜配向及び固定（anchorage）の型は、仮説に基づいたものである。しかし、ＤＩＧの細胞外小葉に面した活性部位及び結合部位のそれぞれは、大多数のＧＰＩタンパク質の明らかにされた細胞表面位置を基にして強く示唆されているものである。カベオリンは、カルボキシル末端におけるフック様ＴＭと３重のパルミトイル化の両者によってｈｃＤＩＧの、アミノ末端おける２重アシル化によってｐｐ５９Lynの、原形質膜小葉中に埋め込まれている。
【実施例】
【００７３】
材料及び方法：
ヒト組換えインスリン、ＰＩＧ４１（“Frick, W. et al., (1998), Biochemistry 37,
13421-13436" に開示されている）及びグリメピリド（商品名アマリール、Amaryl）は、Aventis Pharma Germany (Frankfurt, Germany)の薬化学・合成部から入手した。１２−（（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ドデカン酸（ＮＢＤ−ＦＡ）は、Mueller, et al., (1997), Biochem. Biophys. Acta 1347: 23-39の記載に従って合成された。コラゲナーゼ（Worthington, CLS, type Ｉ, ２５０単位／ｍｇ）は、Biochrom (Berlin, Germany)により提供された。牛乳由来リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、アフィニティ精製）、ホスホリパーゼＡ2（ミツバチ毒）、粗ブタ膵リパーゼ（ＰＬ）、組換えＰＣ及びＰＩ−ＰＬＣ（Bacillus cereus）、粗ＰＬＤ（キャベツ）及び脱脂ＢＳＡ（画分Ｖ）は、Sigma/Aldrich （Deisenhofen, Germany）から購入し、粗ＰＩ−ＰＬＣ（ラット肝）及びプロテイナーゼ阻害剤は、Roche Molecular Biochemicals （Mannheim, Germany）から購入した。組換えＧＰＩ−ＰＬＣ（Trypanosma brucei）は、Oxford Glycosystems （Oxford, UK）から得た。ＰＬＡ2（ＡＡＣＯＣＦ3）及びＰＬＣ（Ｕ７３１２２）の阻害剤は、Tocris (Avonmouth, UK)から入手した。Bisbodipy-C11-PCは、Molecular Probes （Eugene, OR）から購入した。脂質は、Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL)から購入した。カベオリン１（クローンＣ０６０）の免疫沈降用抗体及び、カベオリン１（ウサギ）及びｐｐ５９Lyn（クローン３２）の免疫ブロッティング用抗体はTransduction Laboratories (Lexington, KY)から入手した。ホスホチロシン（クローン４Ｇ１０）の免疫ブロッティング用抗体は、Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY)によって供された。（昆虫細胞で発現した総ヒト組換えタンパク質に対する）ＩＲＳ−１の免疫ブロッティング用抗体（ウサギ、アフィニティ精製）、５’−Ｎｕｃ（ラット）及びａＰ（ウシ）は、Biotrend (Cologne, Germany)によって製造された。ECL Renaissanceケミルミネッセンス検出キットは、NEN/DuPont (Bad Homburg, Germany)から得た。スプラーグドーリーラットは、Charles-River Laboratories (UK)から供給された。
【００７４】
ＧＰＩ−２３５０の合成（図１の図式も参照）：
出発物質として、ラセミ体１，４，５，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール（以下、化合物１）は、Zhai, H.-X. et al., (1995), Tetrahedron Lett. 36: 7403-7406に記載の方法によって製造された。化合物１は、次いで、トリエチルアミン及びジメチルアミノピリジンの存在下、ドデシルホスホン酸ジクロライドでリン酸化し、テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロ−ドデシルホスホン酸（以下、化合物２）を得た。１０％パラジウム炭で接触水素化することによって、化合物２を脱ベンジ
ル化し、ミオ−イノシトール−１，２−シクロ−ドデシルホスホン酸（以下、化合物３、又はＧＰＩ−２３５０）をジアステレオマーの混合物として得た。化合物２（図１）の合成のために、１ｇ（１.８ｍｍｏｌ）の化合物１を、メチレンクロリド６０ｍｌ及びトリエチルアミン１ｍｌに溶解し、ジメチルアミノピリジン２００ｍｇ及びドデシルホスホン酸ジクロライド１ｇ（１０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を４５分間室温で放置した。次いで、酢酸エチル５０ｍｌを加え、混合物をシリカゲルで濾過した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン：酢酸エチル＝１：１、ｖ／ｖ）で精製した。化合物２の収量（収率）：５８０ｍｇ（４３％）、白色非晶質固体。ＴＬＣ：ｎ−ヘプタン／酢酸エチル（１／１、ｖ／ｖ）、Ｒf＝０.７。ＭＳ：（Ｍ＋Ｌｉ）+＝７６１.４、計算値Ｃ60Ｈ59Ｏ7Ｐ、Ｍ＝７５４.９。化合物３（図１）の合成のために、５０５ｍｇ（０.６７ｍｍｏｌ）の化合物２を酢酸エチル５ｍｌとメタノール１５ｍｌの混合物に溶解した。パラジウム（１０％）炭７００ｍｇを加えた後、反応混合物を水素添加（６時間、１気圧Ｈ2）した。パラジウムをシリカゲルで濾過し、メタノール１００ｍｌで洗浄した。溶媒を濃縮後、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（メチレンクロリド／メタノール、５／１、ｖ／ｖ）によって精製した。化合物３の収量（収率）：１７９ｍｇ（６８％）、白色非晶質固体。ＴＬＣ：メチレンクロリド／メタノール（５／１、ｖ／ｖ）、Ｒf＝０.１５。ＭＳ：（Ｍ＋Ｌｉ）+＝４０１.２、計算値Ｃ18Ｈ35Ｏ7Ｐ、Ｍ＝３９４.４。化合物３は、塩基性溶媒よりも酸性溶媒下の方が不安定である。メタノール中では何日も安定であり、乾燥非晶質固体は４℃で何年も安定である。
【００７５】
ラット脂肪細胞の調製及びインキュベーション：
雄性ラット（１２０〜１４０ｇ、自由給餌、文献５３を参照）の精巣上体脂肪体から消化によって単離した脂肪細胞を、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＫＲＨ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ、ｐＨ７.４、１.２ｍＭ・ＫＨ2ＰＯ4、１４０ｍＭ・ＮａＣｌ、４.７ｍＭ・ＫＣｌ、２.５ｍＭ・ＣａＣｌ2、１.２ｍＭ・ＭｇＳＯ4）で２回洗浄し、次いで、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００ｎＭ・１−メチル−２−フェニルエチルアデノシン、０.５Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び５ｍＭ・Ｄ−グルコースを補充した同じ培地中で、ＧＰＩ−２３５０（ＤＭＳＯ中に１０ｍＭ保存溶液として調製し、インビトロ及び脂肪細胞培養における最終ＤＭＳＯ濃度は、いずれの阻害剤濃度でも０.５％で一定に保たれた）、インスリン又はグリメピリド（“Mueller et al.,
(1994), J. Cell. Biol. 126:1267-1276" に記載されたようにして調製した）の存在下又は非存在下で、３７℃にて振とう水浴中で、５％ＣＯ2／９５％Ｏ2で一定でバブリングしながら、インキュベーション容積１ｍｌ当たりパックした細胞容積１００μｌの最終力価（少量の一定量（アリコート）を毛細管ヘマトクリットチューブに吸引し、脂肪細胞による懸濁液の分画占有を定量するためにマイクロヘマトクリット遠心機で６０秒遠心して決定する；１０％サイトクリットは約１.５×１０6細胞／ｍｌに相当する）で、指定された期間インキュベートした。
【００７６】
原形質膜及びｌｃ／ｈｃＤＩＧの調製：
原形質膜及びＤＩＧを、溶解バッファー（２５ｍＭモルポリノエタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ６.０、１４０ｍＭ・ＮａＣｌ、２ｍＭ・ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ・ＥＧＴＡ、０.２５Ｍショ糖、５０ｍＭ・ＮａＦ、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭグリセロール−３−リン酸、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム及びプロテアーゼ阻害剤）中、モーター駆動テフロン・イン・ガラス・ホモジナイザー（１０ストローク）を用いてホモジナイズし、前処理し洗浄した脂肪細胞のポストニュークレアー・インフラネイタント（postnuclear infranatant）から調製した。原形質膜を脱脂したポストニュークレアー・インフラネイタントの分画遠心法によって得、前に記載した（４８、５３）ようにしてショ糖及びパーコールクッションを通して２回逐次遠心によって精製し、最後に２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、０.２５Ｍショ糖、１ｍＭ・ＥＤＴＡに２ｍｇタンパク質／ｍｌで懸濁した。ｈｃ／ｌｃＤＩＧを、“Mueller, G. et al., (2002), Mol.
Med. 8: 120-136" に報告されたようにして界面活性剤法及び不連続ショ糖勾配遠心分離によって得た。１５〜２２％（画分４〜５）及び２８〜３５％（画分８〜９）ショ糖インターフェースの光散乱乳白色バンドを、屈折率を用いた濃度測定で、それぞれ、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧとして集めた。集めた勾配画分を２５ｍＭ・ＭＥＳ（ｐＨ６.５）、１％トライトンＸ−１００、１５０ｍＭ・ＮａＣｌで３倍希釈した後、遠心分離（５０,０００×ｇ、３０分、４℃）によりｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧを収集し、次いで、“Mueller, G. et al., (2002), Mol. Med. 8: 120-136" 及び／又は“Mueller, G. et al., (2001), Mol. Cell. Biol. 21: 4553-4587" に記載されているように適切なマーカーの豊富な部分／乏しい部分により特徴づけ（免疫ブロット法、酵素アッセイ法）、或いはトライトンＸ−１１４分画法（下記を参照）にかけた。カベオリンの免疫沈降のために、ＤＩＧを１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１％トライトンＸ−１００、６０ｍＭβ−オクチルグルコシド、０.３％デオキシコール酸、５ｍＭ・ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ・ＥＧＴＡ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭ・ＮａＦ、１μＭミクロシスチン及びプロテアーゼ阻害剤の溶液に可溶化し（１時間、４℃）、遠心分離した（５０,０００×ｇ、３０分間）。直接免疫ブロット法のために、ＤＩＧを２倍のＬａｅｍｍｌｉ試料バッファーに可溶化し遠心分離した（１０,０００×５、５分間）。上清を使用した。
【００７７】
ＧＰＩ−ＰＬＣ／Ｄアッセイ：
ＧＰＩ−ＰＬＤ（ラット血清）を、“Hari et al., (1997), Biochim. Biophys. Acta 1355: 293-302" に従って、２００ｍＭトリス／マレイン酸（ｐＨ７.０）及び１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０溶液１００μｌ中のヒト胎盤ａＰ溶液（１０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７.０、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ中１００単位／ｍｌ）１０μｌと１０分間、３７℃にてインキュベーションし、次いで０.４ｍｌの氷冷停止バッファー（１０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７.０、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、０.１ｍＭ・ＭｇＣｌ2及び０.０１ｍＭ酢酸亜鉛）を添加して反応を停止することによってアッセイした。ＧＰＩ−ＰＬＣ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）を、“Mensa-Wilmot et al., (1995), Methods Enzymol. 250: 641-655" の記載のようにして、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、０.２５％Ｎｏｎｉｄｅｔ／Ｐ−４０及び５ｍＭ・ＥＤＴＡ溶液５０μｌ中のひと胎盤ａＰ溶液（上記を参照）５μｌと、３０分間、３７℃にてインキュベーションし、次いで停止バッファー０.４５ｍｌを添加して反応を停止することによってアッセイした。ＰＩ−ＰＬＣ（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）及び脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣ（５〜２５μｇ原形質膜又はｈｃ／ｌｃＤＩＧ）を、２０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７.８）、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ、０.１％ＴＸ−１００、０.２ｍＭ・ＭｇＣｌ2溶液１００μｌ中のウシ赤血球アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）溶液１０μｌ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ、０.１％ＴＸ−１００中１２単位／ｍｌ）と１時間、２５℃にてインキュベーションし、次いで氷酢酸５μｌ及び次いで１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ、０.４ｍｌを加えて反応を停止することによってアッセイした。各反応混合物を、ＴＸ−１１４分配にかけた（以下を参照）。ＧＰＩ−ＰＬＣ／Ｄ活性は、ＴＸ−１１４消耗相中で測定された親水性ａＰ又はＡＣｈＥの活性と分配前に測定された総活性の比率から計算され、そして（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを欠いたブランクのインキュベーションで現れたＴＸ−１１４消耗相（総活性の１０〜２０％の割合を占める）中の非酵素バックグランドに対して補正された。
【００７８】
その他のリパーゼアッセイ：
ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）及びリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）は、“Vertesy et al., (2002), Journal Antibiotics 55:480-494" に記載されたようにして、放射能標識トリオレイン液滴エマルジョンを使用して測定された。膵リパーゼ（ＰＬ）は、５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ６.５）、６ｍＭタウロデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１ｍＭ・ＣａＣｌ2溶液２ｍｌ中の０.２５ｍｍｏｌのトリブチリンを、
記録ｐＨスタット（１,０００ｒｐｍ、２５℃で撹拌）を用いてｐＨを６.５に調節しつつ、同じバッファー中のブタＰＬ及びコリパーゼとインキュベーションすることによって定量した。ＰＣ−ＰＬＣは、１０ｍＭジパルミトイルレシチン０.２ｍｌ、１０ｍＭ・ＳＤＣ０.１ｍｌ及び０.０３Ｍ・ＣａＣｌ2０.１ｍｌをバクテリアＰＣ−ＰＬＣ（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７.５、０.１％ＢＳＡ）と、１０分間、３７℃にてインキュベーションすることでアッセイした。反応は、５０％ＴＣＡを０.１ｍｌ、次いでクロロホルム／メタノール（６６／３３／１、容量比）を２.５ｍｌ加えることによって停止した。遠心分離（１,５００×ｇ、１５分）後、メタノール／水相（約１.３３ｍｌ）の上部０.２ｍｌ部を除き、６０％ＨＣＩＯ4０.５ｍｌを補充し、次に１７０℃で１時間加熱して、最終的に無機リン酸塩を分析した。哺乳類ＰＩ−ＰＬＣは、１０ｍＭ・ＰＩ０．１ｍｌ、０.８％デオキシコール酸ナトリウム０.１ｍｌ、０.１％ＢＳＡ、１００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ７.５）０.２ｍｌ、及びラット肝ＰＩ−ＰＬＣを２０分間、３７℃でインキュベーションすることによって測定した。反応を停止し、ＰＣ−ＰＬＣで記載したようにして更に処理した。ＰＬＤを４０ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ６.０）、４ｍＭＣａＣｌ2及びキャベツＰＬＤ溶液２５０μｌ中１.６ｍＭ（Ｕ−14Ｃ）ホスファチジルコリン（約２,０００−４,０００ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）でアッセイした。３０分間、３７℃にてインキュベーションの後、反応を、キャリアーホスファチジン酸含有クロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）５ｍｌを加えて停止した。水可溶性物質を除去した後、最後の洗浄低クロロホルム相中に含有される脂質を、加熱活性化したシリカゲルプレートに転送し、第１次元方向にクロロホルム／メタノール／アンモニア（６５／３５／４、体積比）を使用し、第２次元方向にクロロホルム／アセトン／メタノール／酢酸／水（５０／２０／１０／１０／５、体積比）で２次元的に分離した。放射性ホスファチジン酸を蛍光イメージングにより検出した。ＰＬＡ2を、１−パルミトイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン／ビスボジピ−Ｃ11−ＰＣ／ホスファチジル−グリセロール／コレステロール（１０／０.０５／２／３、体積比）からなる単層リポソーム基質で、“Kim, T.-S. et al., (1997), J. Biol. Chem. 272:2542-2550" に従って定量した。濃度−反応曲線を、Marquardt-Levenberg非線形最小二乗演算手法を使用してフィットさせた。対数・直線軸にプロットするとき、この式はシグモイド曲線となる（Sigma Plot Software,
Jandel Scientific）。
【００７９】
カベオリンの免疫沈降：
可溶性ＤＩＧ（上記を参照、５〜２０μｇタンパク質）は、プロテインＡ／Ｇ−セファロースでインキュベーションし、次いで遠心分離（１０,０００×ｇ、５分間）することにより事前に確かめた。上清を、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１％ＴＸ−１００の１ｍｌ中で、プロテインＡ／Ｇ−セファロースに前もって吸着させた抗カベオリン１抗体と４℃にて１時間インキュベートした。免疫複合体を、同じバッファーで２回、次いでＴＸ−１００不含のバッファーで２回洗浄し、最後にβ−メルカプトエタノールなしで行うＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。免疫沈降カベオリンの回収は、膜の細片化に次いで、同じブロットの抗カベオリン抗体による均一免疫ブロッティングを行うことによって正常化された。
【００８０】
免疫ブロット法：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたポリペプチドを、“Mueller, G. et al., (2001), Mol. Cell. Biol. 21: 4553-4567”に記載されたように半乾燥法を用いてポリビニリデンジフルオライド膜に移した。洗浄した膜を抗カベオリン１抗体（１：２,０００）、抗ｐｐ５９Lyn抗体（１：１,２５０）、抗ａＰ抗体（１：５００）、抗５’−Ｎｕｃ抗体（１：７５０）および抗ＩＲＳ−１抗体（１：２,０００）を１５℃にて４時間インキュベートした。洗浄した膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した、ヤギ抗マウスＩｇＧ２次抗体（１：２,０００）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ２次抗体（１：４,０００）とインキュベートした。標識したタンパク質を増強したケミルミネセンスによって可視化した。
【００８１】
ＴＸ−１１４分配：
ペレット化したｈｃ／ｌｃＤＩＧ（１０〜５０μｇタンパク質）又は（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ反応混合物（０.５ｍｌ）を、それぞれ氷冷ＴＸ−１１４（１％）、２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１４４ｍＭ・ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に懸濁することにより、又は氷冷ＴＸ−１１４（２％）０.５ｍｌと混合することにより、“Bordier, C., (1981), J.
Biol, Chem. 272: 2542-2550" に記載された、ＴＸ−１１４が豊富な相とＴＸ−１１４が枯渇した相との間の分配を使用して、両親媒性タンパク質及び親水性タンパク質に分離した。氷上で１時間インキュベーションした後、混合物を氷上で０.２５Ｍショ糖及び２５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.４）溶液０.４ｍｌのクッション上に重層した。相分離を３７℃に暖め、次いで遠心分離（１０,０００×ｇ、１分間）することによって誘導した。下のＴＸ−１１４が豊富な相の再抽出後、集めた上のＴＸ−１１４が枯渇した相の一定量を５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＡＣｈＥ活性について測定するか、又は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に沈殿（１５％ポリエチレングリコール４,０００）させた。
【００８２】
グルコース輸送アッセイ：
グルコース輸送を、５０μｌ部分中、最終濃度５０μＭ（０.３３μＣｉ／ｍｌ）の２
−デオキシ−Ｄ−（２，６−3Ｈ）グルコースとともに、洗浄した１０,０００〜２０,０
００個の脂肪細胞を、２０μＭサイトカラシンＢの存在下又は非存在下において２０分間、３７℃でインキュベーションすることにより、“Mueller, G. et al., (1994), J. Cell Biol. 126: 1267-1276" に記載されたようにして定量した。
【００８３】
種々の手順：
電気せん孔法は、“Mueller, G. et al., (2000), Mol. Cell. Biol. 20: 4708-4723"
に記載されたようにして実施した。脂肪分解は、“Mueller, G. et al., (2003) ,Biochimie 85: 1245-1256" に記載されたようにして、前もって標識され、イソプロテレノール刺激をされた脂肪細胞からの、グリセロール又は蛍光ＮＢＤ−ＦＡの放出として測定した。Ｇｃｅ１は、“Mueller, G. et al., (1994), Biochemistry 33: 12149-12159" に記載されたようにして、可溶化原形質膜又はｈｃ／ｌｃＤＩＧ（１０〜５０μｇタンパク質）を８−Ｎ3−［32Ｐ］ｃＡＭＰで光標識化し、次いで蛍光イメージングすることによって検出した。５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＡＣｈＥ活性は、“Eliakim, R. et al., (1990), Biochim. Biophys. Acta 1355: 293-302"に従って測定した。タンパク質は、Pierce （Rockford, IL）のＢＣＡタンパク質測定キット、及び較正基準としてＢＳＡを使用して測定した。SDS−PAGEは、前もって成型されたゲル（Novex, San Diego, CA；１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ分離ゲル、モルホリノプロパンスルホン酸−ＳＤＳランニングバッファー）を使用して実施された。ルミイメージ（lumiimage）は、ルミイメージャー（LumiImager）ソフトウエア（Roche Diagnostics）を使用したルミイメージャーで評価した。リン光イメージ及び蛍光イメージは、Storm 860 PhosphorImager system (Molecular Dynamics, Gelsenkirchen, Germany)を使用して処理し定量化した。図は、Adobe Photoshopソフトウエア（Adobe Systems, Mountain View, CA）を使用して構築した。
【００８４】
ＧＰＩ−２３５０は、高力価及び選択性を有する種々の起源の（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを阻害する：
（精製した、又は、未精製の）Ｂ．ｃｅｒｅｕｓＰＩ−ＰＬＣ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＧＰＩ−ＰＬＣ及びラット血清ＧＰＩ−ＰＬＤに対するＧＰＩ−２３５０の効果を、適切な条件下（低又は高界面活性剤濃度）で、ＧＰＩ−２３５０の濃度を増加しつつ、部分的に精製した可溶化ＧＰＩタンパク質と共にそれらをインキュベーションすることによって観察した。次いで、総ＧＰＩタンパク質に対する、消化混合物中に脂肪分解的に切断されたＧＰＩアンカーを内蔵する親水性ＧＰＩタンパク質の比率を、ＴＸ−１１４分配で界面活性剤が枯渇している相、及び分配前の総消化混合物、それぞれにおける酵素活性の測定によ
って定量した（図２）。ＧＰＩ−２３５０は、細菌、トリパノソーマ及び血清（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを、それぞれ１０、２及び１μＭのＩＣ50で、明らかに阻害した。ＧＰＩ−２３５０は、又、酵素源として可溶化原形質膜、ｌｃＤＩＧ又はｈｃＤＩＧを、及び基質としてＡＣｈＥを使用すると、ラット脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣを０.２〜０.５μＭのＩＣ50で遮断した。脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣの切断特異性を明らかにするため、本発明者らは、ミオ−[14Ｃ]−イノシトールで代謝的に標識されたサッカロマイセスセレヴィシエスフェロブラストから調製したＧＰＩタンパク質、Ｇｃｅ１を使用した。ｈｃＤＩＧとのインキュベーションで、親水性及び14Ｃ標識されたＧｃｅ１が生成され、それはｃＩＰに対して生じる抗ＣＲＤ抗体と濃度及び時間依存的に免疫沈降した（データは示さない）。脂肪酸アシル鎖を欠きｃＩＰを内蔵するＧＰＩタンパク質の、ｈｃＤＩＧ依存的な生成により、ラット脂肪細胞の原形質膜にＧＰＩ−ＰＬＣの発現が確認された。
【００８５】
次に、ＧＰＩ−２３５０の選択性を試験した。種々の起源からのいくつかの天然リパーゼ（ＨＳＬ、ＰＬ、ＬＰＬ）及び異なった特異性（Ａ2、Ｃ、Ｄ）のＰＣ／ＰＩ特異的ホ
スホリパーゼそしてウシＡＣｈＥ（これらは全ていわゆる触媒三点セットを経て作動することが知られている）は、細菌、トリパノソーマ、血清及びラット脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣ／Ｄを６０から９５％遮断する濃度（５０μＭ）下では有意な影響は受けなかった（図３）。ｃＩＰの代わりにオープン（open）を内蔵するＧＰＩ−２３５０の二つの誘導体２−デオキシ−２−フルオロ−scyllo−イノシトール−１−Ｏ−ドデシル−ホスホン酸（ＧＰＩ−１７９３）及びミオ−イノシトール−１−Ｏ−ドデシル−ホスホン酸メチルエステル（ＧＰＩ−２３４９）は、試験した最高濃度で脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣに対して、それぞれ温和から非常に温和な効果を有するだけであったが、しかし、細菌及びトリパノソーマ（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣを同程度の力価で阻害した（表１）。これらの知見は、安定した又は一過性の１，２−環状リン酸結合の生成を含む触媒機構における類似性を示しているが、しかしながら、細菌、トリパノソーマ及び脂肪細胞（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの間の基質認識における幾分かの相異も示している。後者がｃＩＰ中間体を経由して作動、予備的な動態試験に基づいていると仮定すると、ＧＰＩ−２３５０は拮抗阻害剤（Ｋi＝３〜２０μＭ）として作用することを仮定しなければならない。このことは、中性リパーゼ及び哺乳類ＰＣ／ＰＩ特異的ホスホリパーゼはＧＰＩ構造を認識しないので、その顕著な選択性を説明できるであろう。拮抗的作用機構に一致して、ＧＰＩ−２３５０による細菌及びトリパノソーマ（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣの半値阻害は、過剰の新鮮なＧＰＩタンパク質基質との反応混合物の１０倍希釈において完全に逆転した。対照的に、再単離及び充分な洗浄に先立って５０μＭＧＰＩ−２３５０で処理した脂肪細胞ｈｃＤＩＧは、ＧＰＩ−２３５０非存在下でインキュベーションすると、精製した可溶化ＡＣｈＥに対しては、低い脂肪分解的切断のみを呈した（データは示さない）。このことは、両親媒性ＧＰＩ−２３５０のｈｃＤＩＧとの相互作用により説明することができるであろう。あるいは、ＧＰＩ−２３５０は、遷移状態類似体として作用し、脂肪細胞ＧＰＩ−ＰＬＣの活性部位への（一過性の）共有結合を受けるのであろう。ＧＰＩ−２３５０の環状リン酸結合が（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ／Ｄによって開環されるかどうかを知ることは、興味あることであろう。
【００８６】
ＧＰＩ−２３５０は、単離されたＤＩＧ及び無処置の脂肪細胞においてＧＰＩタンパク質のインスリン誘導及びグリメピリド誘導切断をブロックする：
ＧＰＩ−２３５０及びＧＰＩ−ＰＬＣの両者が別々の複合体（それぞれ、界面活性剤ミセル及びＤＩＧ）で存在するとき、インビトロにおける脂肪細胞原形質膜ＧＰＩ−ＰＬＣによるＧＰＩタンパク質の切断に対するＧＰＩ−２３５０の介入の観察に基づいて、次に、基質としての内因性又は外因性ＧＰＩタンパク質の無処置の脂肪細胞及び単離されたＤＩＧにおける基本的及び促進されたＧＰＩ−ＰＬＣ活性に対するＧＰＩ−２３５０の効果について試験した（図４）。単離されたラット脂肪細胞において、ＧＰＩ−ＰＬＣ活性（内因性５’−Ｎｕｃ、Ｇｃｅ１及びａＰの切断として、それらの両親媒性から親水性への変換の観察が伴う）は、グリメピリド及びインスリンの両者によって（それぞれ、５倍及
び３倍まで）促進された（パネルＥ、Ｇ）。促進は、これらの前処置した脂肪細胞から調製されたｈｃＤＩＧにおいて部分的に保存されていた（パネルＣ）（それぞれ、３倍及び１.７倍）。ＧＰＩ−ＰＬＣは、グリメピリドで処理されなかった脂肪細胞から調製されたｈｃＤＩＧの直接インキュベーションにより際だって活性化されたが、インスリンではそうでなかった（パネルＡ）。ＧＰＩ−２３５０は、基本よりも低く、そして単離されたｈｃＤＩＧ及び未処理の脂肪細胞の両者において同じようなレベルで、濃度依存的に基本のＧＰＩ−ＰＬＣ活性を減少させ、同様にグリメピリド及びインスリン誘導ＧＰＩ−ＰＬＣ活性を減少させた（図４、全てのパネル）。阻害剤がインスリン又はグリメピリドとのインキュベーションより前に、及びインキュベーションの間に存在していたので、明らかにＧＰＩ−２３５０は、ＧＰＩ−ＰＬＣの活性を妨害しない（パネルＣ、Ｅ）。未処理の脂肪細胞でアッセイする場合、ＧＰＩ−ＰＬＣの阻害のＩＣ50は（５〜１０μＭ、パネルＦ）は、単離された未処理のｈｃＤＩＧに比較してより高く（１μＭ、パネルＢ、Ｄ）、同様に可溶化ｈｃＤＩＧ及び原形質膜（０.２〜０.５μＭ、図２）に比較して、より高かった。このことは、単離されたＤＩＧと比較して未処理の脂肪細胞の原形質膜においてＤＩＧの中に埋め込まれた場合、ＧＰＩ−２３５０に対してＧＰＩ−ＰＬＣの触媒部位の接近し易さが損傷されたことを反映しているのであろう。しかし、ＧＰＩ−ＰＬＣの主要な基質、ＧＰＩ脂質及びタンパク質アンカーは原形質膜の外小葉に局在化しており、そしてＧＰＩ−２３５０はＧＰＩ−ＰＬＣの触媒部位の（拮抗）阻害剤として作用しているようであるので（上記を参照）、その両親媒性を基本として、むしろ高いと予測されている、ＧＰＩ−２３５０の細胞透過性の必要性は、多分除外することができる。むしろ、ＤＩＧの液体定序ドメインよりもむしろ非ＤＩＧ領域の無秩序ドメインへ選択的に分配される界面活性剤に類似している脂肪細胞原形質膜（総細胞表面の８０〜９０％を含む）の非ＤＩＧ領域に、ＧＰＩ−２３５０はそのドデシル鎖を経て自然に分配されることが考えられる。
【００８７】
ＤＩＧ及び原形質膜の単離に使用された実験的条件下で、単離された総原形質膜中のＧＰＩ−ＰＬＣ活性の６５〜８５％（外因性ＡＣｈＥの切断として測定）が、脂肪細胞の処理に関係なくＤＩＧ（即ち、ｈｃＤＩＧプラスｌｃＤＩＧ）により回復した。同様の回復が、典型的なＤＩＧマーカータンパク質、カベオリン１（７０〜９０％）（免疫ブロット法により定量した）、及びＤＩＧ常在性タンパク質、ｐ１１５（５５〜７５％）（合成ＰＩＧの結合により定量した）について観察された。更に、区別を付けて処理した脂肪細胞からＤＩＧ（ｈｃＤＩＧプラスｌｃＤＩＧ）で回復したａＰ、５’−Ｎｕｃ及びＧｃｅ１の総量（両親媒性プラス親水性のもの）は、おおよそ一定（基準を１００％と設定して９０〜１４０％）であって、このことは種々の条件下でＤＩＧの単離手順の再現性を明示している。単離されたｈｃＤＩＧは、ｌｃＤＩＧ及び非ＤＩＧ領域よりも比較的低いタンパク質含量により特徴づけられているので、ＧＰＩ−ＰＬＣは、残りの原形質膜に対してｈｃＤＩＧが非常に豊富であり、ＧＰＩタンパク質基質の局在化と一致している。
【００８８】
ＤＩＧ内にＧＰＩアンカーされた及びアシル化されたシグナル伝達タンパク質の再分配にはラット脂肪細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＣ作用を必要とする：
次に、ＧＰＩタンパク質の脂肪分解的切断の阻害が、脂肪細胞原形質膜のＤＩＧ内でＧＰＩアンカーされた及びアシル化されたシグナル伝達タンパク質の局在及び刺激依存性再分配に影響するかどうかを研究した。このために、グリメピリドで処理する前にＧＰＩ−２３５０の非存在下又は存在下でインキュベートした脂肪細胞からｈｃ／ｌｃＤＩＧを調製し、次いでいくつかのＧＰＩアンカーされた又はアシル化されたシグナル伝達タンパク質の存在につき分析した（図５）。基本の脂肪細胞に比べてｈｃＤＩＧの量の７０から９０％の損失に相当する、ｌｃＤＩＧの量の３から５倍の増加に見られるように、グリメピリドに反応したｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへのｐｐ５９Lyn、Ｇｃｅ１及び５’−Ｎｕｃのしっかりした再分配は、ＧＰＩ−２３５０の最大有効濃度の存在下で殆んど完全に止められた。対照的に、ｌｃＤＩＧに対してｈｃＤＩＧにおいて、ｈｃＤＩＧ常駐タンパク質
であるカベオリン１及びＩＲβが比較的豊富であること、並びにｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧにおいてグルコース輸送体イソ型４（Ｇｌｕｔ４）が同様に多量であることの両者は、グリメピリドに影響されず、ＧＰＩ−２３５０の存在下で顕著には変化しなかった（図５）。このことはＧＰＩ−ＰＬＣの強力な阻害は、ＤＩＧの構造における一般的且つ非特異的変化をもたらすよりはむしろｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの、Ｇｃｅ１及びｐｐ５９Lynのような、ある種の脂質修飾シグナル伝達タンパク質の刺激依存性転移を、特異的に妨げることを明らかにしている。
【００８９】
次に、ＧＰＩ−ＰＬＣの作用とＧＰＩタンパク質の再分配の間の推定因果関係、即ち脂肪分解的切断及び／又は非切断ＧＰＩタンパク質は、刺激された単離ラット脂肪細胞において、実際にｌｃＤＩＧに転移するのか否か、の根底にあるメカニズムを研究した。このために、ラット脂肪細胞をＧＰＩ−２３５０と共に、又は、無しにインキュベートし、インスリン又はグリメピリドを作用させた。総原形質膜、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧから回収されたＧＰＩタンパク質、即ち５’−Ｎｕｃ、ａＰ及びＧｃｅ１の親水性型及び両親媒性型の量は、ＴＸ−１１４分配によって定量された（表２）。インスリン及びより強力なグリメピリドでの処理は、ＧＰＩ−２３５０によって完全にブロックされた原形質膜の親水性ＧＰＩタンパク質の増加をもたらし、効率的なＧＰＩ−ＰＬＣ阻害を示している。インスリン及びグリメピリドの両者に応じて、親水性ＧＰＩタンパク質の量の増加が、もっぱらｈｃＤＩＧにおいてのみ検出され、同じ位置での両親媒性型の減少を伴っていた。これらの変化は、ＧＰＩ−２３５０の存在下で更に低い基本値に逆転し、この両親媒性から親水性への変換という脂肪分解性を示していた。それ故、ｈｃＤＩＧでのインスリン／グリメピリド促進ＧＰＩ−ＰＬＣによって生成する親水性ＧＰＩタンパク質は、ＧＰＩアンカーによらない分子機構を経てｈｃＤＩＧに関連して残る（表２）。興味深いことに、ｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへの５’−Ｎｕｃ、Ｇｃｅ１及びａＰのグリメピリド誘導再分配（図５参照）は非切断型に限定され、両親媒性においては３から４倍上昇したレベルであるが、ｌｃＤＩＧで回復した親水性ＧＰＩタンパク質では変らない低レベルであることを反映していたが、それにもかかわらず、ＧＰＩ−２３５０によって完全に除去されていた（表２）。対照的に、親水性５’−Ｎｕｃ、Ｇｃｅ１及びａＰのインスリン誘導生成は、ｌｃＤＩＧで両親媒性の対応物の非常にゆるやかな増加（有意差の限界）を伴ったのみであったが、それは再びＧＰＩ−２３５０の存在で排除された。試験した３つのＧＰＩタンパク質全てが、ほんの少しの量的差異だけで、もっぱら、刺激依存性脂肪分解的切断と両親媒性型の再分配との間に相関性を示した（表２）。総合すると、ｈｃＤＩＧで脂肪分解的に切断されたＧＰＩタンパク質の生成及び蓄積のためのＧＰＩ−ＰＬＣ活性化が必要である（グリメピリド）。
【００９０】
ＧＰＩ−ＰＬＣの阻害は、ＧＰＩアンカー型及びアシル化シグナル伝達タンパク質のカベオリンからの解離を妨げる：
ラット脂肪細胞におけるｈｃＤＩＧからｌｃＤＩＧへのシグナル伝達タンパク質の再分配は、最近、カベオリン１からの解離と活性化を伴うことが示されている。次に、ＧＰＩ−ＰＬＣを阻害することによるラット脂肪細胞における、カベオリンからの解離／活性化と、ＧＰＩタンパク質の刺激依存性脂質分解的切断との間の推定因果関係、及び、それに続いて、Ｇｃｅ１とｐｐ５９Lynのカベオリン１との相互関係、及び後者のキナーゼ活性の解析が研究された（図６）。単離及び可溶化されたｈｃＤＩＧから調製されたカベオリン１免疫沈降物からのｐｐ５９Lyn及びＧｃｅ１の両者のインスリン誘発最大損失（３５〜４５％）及びグリメピリド誘発最大損失（７５〜８５％）最大損失は、５〜１０μＭのＩＣ50（図６、パネルＢ）を有するＧＰＩ−２３５０（５０μＭ：図６、パネルＡ）によって完全に妨げられた。この力価は、未処理の脂肪細胞におけるＧＰＩ−２３５０によるＧＰＩ−ＰＬＣ阻害に類似している（図３）。非受容体チロシンキナーゼのようなシグナル伝達タンパク質のカベオリン結合ドメイン（ＣＢＤ）へのカベオリン１の足場（scaffolding）ドメイン（ＣＳＤ）の結合、及び、逆に、ＣＢＤへの結合からのＣＳＤの除去は
、全ての場合ではないが多くの場合、インビトロアッセイにおけるシグナル伝達タンパク質の不活化及び活性化のそれぞれの引き金を引くことが示された。このことは、原形質膜ＤＩＧで作動しているシグナル伝達における、ＣＳＤ−ＣＢＤ相互関係の調節機能を暗示している。
【００９１】
ラット脂肪細胞におけるＧＰＩ−ＰＬＣの阻害は、グリメピリドの代謝活性をダウンレギュレートするがインスリンはされない：
次いで、インスリン及びグリメピリドに反応したＩＲＳ−１チロシンリン酸化におけるＧＰＩ−ＰＬＣ阻害の差動効果が、インスリン標的細胞における代謝活性に反映するか否かを研究した。このために、単離したラット脂肪細胞を、どちらかの刺激で作用させる前にＧＰＩ−２３５０で前処理し、次いでグルコース輸送及びイソプロテレノール誘導脂肪分解についてアッセイした（図８）。グリメピリドによるグルコース輸送の促進及びイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害は、ＧＰＩ−２３５０の存在下、濃度依存的様式（ＩＣ50＝２〜５μＭ）で対照値（５０μＭで）よりも低く損なわれた。従って、グリメピリド濃度−反応曲線は右に移動し、阻害剤がない場合と比較してＧＰＩ−２３５０（５μＭ）によるＧＰＩ−ＰＬＣの最大半量阻害の途中で平坦になった。対照的に、グルコース輸送のインスリンによる促進及びイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害は、グリメピリドに比較して２から３倍、より顕著であるが、５０μＭで、ＧＰＩ−２３５０のみによってそれぞれ最大２５及び３３％減少した（図８）。これらのＧＰＩ−ＰＬＣ阻害の差動効果は、蛍光脂肪酸誘導体で前もって標識したラット脂肪細胞からのグリセロールに代わってＮＢＤ−ＦＡの放出として測定した場合、グリメピリド及びインスリンによるイソプロテレノール誘導脂肪分解の阻害に対するＧＰＩ−２３５０の効果の分析によって確認された（図９）。グリメピリド（ＩＣ50＝３μＭ）の濃度増加に反応してイソプロテレノール誘導脂肪細胞から放出された酸化分解産物を包含するＮＢＤ−ＦＡの量の減少は、５０μＭグリメピリドの存在で完全に消失された（パネルＡ、Ｂ）。対照的に、ＮＢＤ−ＦＡ（及び分解産物）放出のインスリン阻害は、インスリンに対する見かけのＩＣ50の少しの増加（０.１対０.３μＭ）を伴うＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）のみによって、最大２５〜３０％損なわれた。ＧＰＩ−ＰＬＣ阻害に対するこれらＧＰＩ−２３５０媒介効果の特異性は、ラット肝ＰＩ−ＰＬＣ及びハチ毒ＰＬＡ2の阻害剤の損傷によって、基本的な及びグリメピリド調節グルコース輸送及び脂肪分解に顕著に影響を与えることで確認された（図８）。
【００９２】
最後に、ＤＩＧ内でＧＰＩタンパク質の再分配に依存性であるか、無関係であるかのいずれかである、グリメピリド以外のインスリン模倣刺激のシグナル伝達におけるＧＰＩ−ＰＬＣの関与について調べた。ラット脂肪細胞において、ｍ−β−ＣＤを用いたコレステロール枯渇によるｈｃＤＩＧの崩壊、トリプシン／塩／ＮＥＭ処理によるＰＩＧ受容体ｐ１１５の不活化又は合成リガンドＰＩＧ４１でのｐ１１５の占拠は、ｌｃＤＩＧでの５’−Ｎｕｃの顕著な増加及びグルコース輸送活性化を導いた（表３）。対照的に、オルトバナジウム酸ナトリウム及び合成ＣＢＤＰはｌｃＤＩＧへの５’−Ｎｕｃ転位の同時誘導なしにグルコース輸送を促進した。このことは、よく知られている、チロシンホスファターゼ阻害剤、バナジウム酸塩によるインスリン受容体及びＩＲＳ−１脱リン酸化、及びＣＢＤＰによるｐｐ５９Lyn及びＩＲＳ−１チロシンリン酸化の直接促進といった作用機序に一致している。これらの刺激によるＩＲＳ−１チロシンリン酸化でもなくグルコース輸送でもない促進（表３）は、ＧＰＩ−２３５０の存在下で顕著に影響され、それらは全てＧＰＩ−ＰＬＣの下流の点でグルコース輸送システムにクロストークしていることを暗示している。
【００９３】
表の説明
表１：（Ｇ）ＰＩ−ＰＬＣ阻害剤の特徴。
表２：ｈｃＤＩＧ、ｌｃＤＩＧ及び総原形質膜における脂肪分解的切断及び非切断ＧＰＩ
タンパク質の局在化に対する、インスリン、グリメピリド及びＧＰＩ−２３５０の効果。表３：ラット脂肪細胞における種々のインスリン模倣刺激によって誘導される５’−Ｎｕｃ転位及びグルコース輸送に対するＧＰＩ−２３５０の効果。
【００９４】
表についての説明
表１：ラット脂肪細胞由来のｈｃＤＩＧのＧＰＩ−ＰＬＣ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ由来ＧＰＩ−ＰＬＣ及びＢ．ｃｅｒｅｕｓ由来ＰＩ−ＰＬＣを、適切な条件下で指示した阻害剤の増加する濃度（０.０５μＭ〜１ｍＭ）のない場合とある場合における、可溶化した及び
部分精製ウシ赤血球ＡＣｈＥ又はヒト胎盤ａＰとインキュベートした（材料と方法を参照）。切断率は、親水性ＡＣｈＥの量及びＴＸ−１１４分配の際ＴＸ−１１４枯渇相で回復したａＰ活性から計算した。少なくとも３回の独立したインキュベーションと分配／４回の酵素アッセイ、から得られた平均＋ＳＤを記した。ｎ．ａ．：該当なし。
【００９５】
表２：単離したラット脂肪細胞を、ＧＰＩ−２３５０（５０μＭ）なし又はありで処理し（５分間、３７℃）、次いで指示したように、グリメピリド（２０μＭ）又はインスリン（１０ｎＭ）の非存在下又は存在下にインキュベートした（１２０分間、３７℃）。総原形質膜（ＰＭ）、ｈｃＤＩＧ及びｌｃＤＩＧを調製し、次いでＴＸ−１１４分配にかけた。ＴＸ−１１４豊富相及び枯渇相を５’−Ｎｕｃ及びａＰ（活性測定）及びＧｃｅ１（光親和性標識）についてアッセイした。両親媒性及び親水性ＧＰＩタンパク質の量は、ＧＰＩ−２３５０の非存在下に基本の脂肪細胞から調製した、総原形質膜及びｈｃＤＩＧの両親媒性型のそれぞれに対して計算した（各１００ａｒｂ.単位に設定した）。ｈｃＤＩＧプラスｌｃＤＩＧからの親水性及び両親媒性ＧＰＩタンパク質の回収は、種々のインキュベーション条件下で同程度であった。少なくとも３回の独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ活性測定及びゲル・ランを２回行って、平均±ＳＤを得た。
【００９６】
表３：単離したラット脂肪細胞を、メチル−β−シクロデキストリン（ｍ−β−ＣＤ、１０ｍＭ、５０分間）、ＣＢＤＰ（３００μＭ、電気穿孔法、次いで、洗浄及びそれに続く３０分間のインキュベーション）、ＰＩＧ４１（１０μＭ、１５分間）、オルトバナジウム酸ナトリウム（１ｍＭ、１５分間）、トリプシン（１０μｇ／ｍｌ、１５分間、次いで０.５Ｍ・ＮａＣｌ処理及びそれに続く洗浄）及びＮ−エチルマレイミド（１ｍＭ、５
分間、次いでＤＴＴの添加）の存在下でインキュベートした。脂肪細胞懸濁液の半分にＧＰＩ−２３５０（最終濃度５０μＭ）を加え、更にインキュベーション（６０分間、３７℃）の後、細胞の一部分を、単離したｌｃＤＩＧ中の５’−Ｎｕｃ活性についてアッセイした。基本的なインキュベーション中の５’−Ｎｕｃの増加を１００ａｒｂ.単位に設定した。細胞の別の部分は（１５分間のインキュベーション後）、基本のインキュベーションについて１００ａｒｂ.単位に設定したグルコース輸送につきアッセイした。少なくとも３回独立した細胞インキュベーションを行い、それぞれ３回ずつ活性を測定して、平均＋ＳＤを得た。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立して、Ｈ又はＯＨ又はＦのいずれかであり、そしてＲ5は、（Ｃ1−Ｃ20）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ20）−アルケニルである）の化
合物、全てのその立体異性体の形態、及び全ての比率のそれらの混合物並びに生理的に許容されるその塩。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のいずれか２つが互いに独立してＦである、請求項１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨである、請求項１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４】
Ｒ5がＣ12−アルキルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５】
ａ）ラセミ体の１，４，５，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトールをリン酸化してテトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を得；
ｂ）テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を接触水素化してそれぞれの化合物を得る；
ことを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの式Ｉの化合物及び／又は生理的に許容される塩及び／又はそのプロドラッグ、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
糖尿病の治療のために使用される薬剤の副作用を変えるか又はそれを治療するための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物及び／又は生理的に許容されるその塩及び／又はそのプロドラッグの使用。
【請求項８】
薬剤がグリメピリドである、請求項７に記載の式Ｉの化合物の使用。
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、互いに独立して、Ｈ又はＯＨ又はＦのいずれかであり、そしてＲ5は、（Ｃ1−Ｃ20）−アルキル又は（Ｃ1−Ｃ20）−アルケニルである）の化
合物、全てのその立体異性体の形態、及び全ての比率のそれらの混合物並びに生理的に許容されるその塩。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4のいずれか２つが互いに独立してＦである、請求項１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がＯＨである、請求項１に記載の式Ｉの化合物。
【請求項４】
Ｒ5がＣ12−アルキルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項５】
ａ）ラセミ体の１，４，５，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトールをリン酸化してテトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を得；
ｂ）テトラ−Ｏ−ベンジル−ミオ−イノシトール−１，２−シクロドデシルホスホン酸を接触水素化してそれぞれの化合物を得る；
ことを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの式Ｉの化合物及び／又は生理的に許容される塩及び／又はそのプロドラッグ、及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
糖尿病の治療のために使用される薬剤の副作用を変えるか又はそれを治療するための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物及び／又は生理的に許容されるその塩及び／又はそのプロドラッグの使用。
【請求項８】
薬剤がグリメピリドである、請求項７に記載の式Ｉの化合物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１４０４９２（Ｐ２０１１−１４０４９２Ａ）
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８７７７（Ｐ２０１１−８７７７）
【出願日】平成２３年１月１９日（２０１１．１．１９）
【分割の表示】特願２００６−５５３５２４（Ｐ２００６−５５３５２４）の分割
【原出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月１９日（２０１１．１．１９）
【分割の表示】特願２００６−５５３５２４（Ｐ２００６−５５３５２４）の分割
【原出願日】平成１７年２月１６日（２００５．２．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
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