グルコアミラーゼの変異体
本発明は、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるために改変された特性を有する、親グルコアミラーゼのコンビナトリアル変異体に関する。したがって、親グルコアミラーゼの変異体は、醸造およびグルコースシロップ生産内の使用になどのように適している。変異体をコードするＤＮＡコンストラクトおよび宿主細胞においてグルコアミラーゼ変異体を生産するための方法もまた、開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス１２に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用。
【請求項２】
その結晶形をしている場合に、主鎖原子の原子座標が、等価な主鎖原子のアライメント後に、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有する結晶構造を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメイン、および触媒ドメインを有し、デンプン結合ドメインの相互連結ループ２’中にならびに／または触媒ドメインのループ１中におよび／もしくはヘリックス２中におよび／もしくはループ１１中におよび／もしくはヘリックス１２中に、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用。
【請求項３】
前記２つ以上のアミノ酸置換は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列を有するヘリックス１２に対するものである、請求項１〜２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項４】
２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項５】
２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項６】
２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、ならびに／または２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、または２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、または２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換、ループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換、およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項７】
グルコアミラーゼ変異体は、相互連結ループ２’の５２０〜５４３位、５３０〜５４３位、もしくは５３４〜５４３位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ループ１の３０〜５０位、３５〜４８位、もしくは４０〜４６位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス２の５０〜６６位、５５〜６４位、もしくは５８〜６３位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ループ１１の４０５〜４２０位、４１０〜４２０位、もしくは４１５〜４２０位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス１２の４２１〜４３４位、４２５〜４３４位、もしくは４２８〜４３４位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項８】
グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４、６１、４１７、および４３１位から選択される位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１０】
アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４位にあり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応し、この配列は、親グルコアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｃではない、２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１１】
アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４Ｒであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１２】
６１位においてアミノ酸置換を含み、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１３】
グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１４】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１５】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１６】
５３９位におけるアミノ酸置換は、５３９Ｒであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１７】
４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｒであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１８】
６１位におけるアミノ酸置換は、６１Ｉであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１９】
以下のアミノ酸置換：
ａ．Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒ；または
ｂ．Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を含み、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２０】
配列番号２から成り、以下のアミノ酸置換：
ａ．Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒ；または
ｂ．Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置に対応する、請求項９〜１９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２１】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０のデンプン結合ドメインと、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、請求項９〜２０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２２】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９の触媒ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する、請求項９〜２１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２３】
親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、タラロミセス属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ ｓｐｐ．）、またはシゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）から得られるグルコアミラーゼから選択される、請求項９〜２２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２４】
親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）から得られる、請求項９〜２３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２５】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、発酵性の糖（複数可）の生産の増強を示す、請求項９〜２４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２６】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスのマッシング工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、請求項９〜２５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２７】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスの発酵工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、請求項９〜２６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２８】
発酵性の糖は、グルコースである、請求項２７に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２９】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を示す、請求項９〜２８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３０】
グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、デンプン加水分解活性の低下を示す、請求項９〜２９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３１】
グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵の実質的な程度の増強を示す、請求項９〜３０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３２】
グルコアミラーゼは精製されている、請求項９〜３１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３３】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む、または請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができる、ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載の変異グルコアミラーゼをコードする核酸を、染色体の中に安定して統合している宿主細胞。
【請求項３７】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができる細胞。
【請求項３８】
請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の宿主細胞、または細菌細胞、菌類細胞、もしくは酵母細胞である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｉｉ）などのようなトリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
プロテアーゼ欠損および／またはキシラナーゼ欠損および／または自然グルカナーゼ欠損宿主細胞である、請求項３８〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の宿主細胞または細胞を得ることと、細胞または宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることとを含み、グルコアミラーゼ変異体を精製することを含んでもよい、グルコアミラーゼ変異体を発現させる方法。
【請求項４２】
グルコアミラーゼ変異体を精製することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
酵素組成物の調製のための、請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項４４】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体を含む酵素組成物。
【請求項４５】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体を含む、請求項４４に記載の酵素組成物であって、デンプン加水分解組成物、糖化組成物、界面活性剤、アルコール発酵酵素組成物、および飼料の中から選択される、組成物。
【請求項４６】
アミラーゼ、プルラナーゼ、およびさらなるグルコアミラーゼの中から選択される少なくとも１つのさらなる酵素を含む、請求項４４〜４５のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項４７】
グリストからマッシュを形成することと、請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体または請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の酵素組成物とマッシュを接触させることとを含む、醸造用の麦芽汁を生産するための方法。
【請求項１】
配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列もしくは親グルコアミラーゼにおける等価な残基配列を有するヘリックス１２に対する２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用。
【請求項２】
その結晶形をしている場合に、主鎖原子の原子座標が、等価な主鎖原子のアライメント後に、ＴｒＧＡの等価な主鎖原子の原子座標（ＷＯ２００９／０６７２１８における表２０において定義される）から０．１３ｎｍ未満の平均二乗偏差を有する結晶構造を有し、リンカー領域、デンプン結合ドメイン、および触媒ドメインを有し、デンプン結合ドメインの相互連結ループ２’中にならびに／または触媒ドメインのループ１中におよび／もしくはヘリックス２中におよび／もしくはループ１１中におよび／もしくはヘリックス１２中に、親グルコアミラーゼのアミノ酸配列に対する２つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のグルコアミラーゼ変異体の、デンプンの加水分解中の縮合産物の合成を低下させるための使用。
【請求項３】
前記２つ以上のアミノ酸置換は、配列番号２の５１８位〜５４３位のアミノ酸配列を有する相互連結ループ２’、および／または配列番号２の２１位〜５１位のアミノ酸配列を有するループ１、および／または配列番号２の５２位〜６８位のアミノ酸配列を有するヘリックス２、および／または配列番号２の３９６位〜４２０位のアミノ酸配列を有するループ１１、および／または配列番号２の４２１位〜４３４位のアミノ酸配列を有するヘリックス１２に対するものである、請求項１〜２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項４】
２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換、ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項５】
２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換ならびにループ１および／またはヘリックス２および／またはループ１１および／またはヘリックス１２中の１、２、３、または４つのアミノ酸置換である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項６】
２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、ならびに／または２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、または２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびループ１１中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、または２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換およびヘリックス１２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、２つ以上のアミノ酸置換は、相互連結ループ２’中の少なくとも１つのアミノ酸置換、ループ１中の少なくとも１つのアミノ酸置換、およびヘリックス２中の少なくとも１つのアミノ酸置換である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項７】
グルコアミラーゼ変異体は、相互連結ループ２’の５２０〜５４３位、５３０〜５４３位、もしくは５３４〜５４３位内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ループ１の３０〜５０位、３５〜４８位、もしくは４０〜４６位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス２の５０〜６６位、５５〜６４位、もしくは５８〜６３位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ループ１１の４０５〜４２０位、４１０〜４２０位、もしくは４１５〜４２０位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、および／またはグルコアミラーゼ変異体は、ヘリックス１２の４２１〜４３４位、４２５〜４３４位、もしくは４２８〜４３４位のアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項８】
グルコアミラーゼ変異体は、５３９位にアミノ酸置換を有し、かつ４４、６１、４１７、および４３１位から選択される位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１０】
アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４位にあり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応し、この配列は、親グルコアミラーゼに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｃではない、２つ以上のアミノ酸置換を含むグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１１】
アミノ酸置換は、５３９位にあり、かつアミノ酸置換は、４４Ｒであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１２】
６１位においてアミノ酸置換を含み、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１３】
グルコアミラーゼ変異体は、親グルコアミラーゼに対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１４】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１５】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号２に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９．５％の配列同一性を有する、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１６】
５３９位におけるアミノ酸置換は、５３９Ｒであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１７】
４４位におけるアミノ酸置換は、４４Ｒであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１８】
６１位におけるアミノ酸置換は、６１Ｉであり、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項１９】
以下のアミノ酸置換：
ａ．Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒ；または
ｂ．Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を含み、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置または親グルコアミラーゼにおける等価な位置に対応する、請求項９〜１８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２０】
配列番号２から成り、以下のアミノ酸置換：
ａ．Ｄ４４ＲおよびＡ５３９Ｒ；または
ｂ．Ｄ４４Ｒ、Ｎ６１Ｉ、およびＡ５３９Ｒ
を有し、前記位置は、配列番号２におけるそれぞれの位置に対応する、請求項９〜１９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２１】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、１１、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、または３９０のデンプン結合ドメインと、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列同一性を有するデンプン結合ドメインを有する、請求項９〜２０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２２】
グルコアミラーゼ変異体は、配列番号１、２、３、５、６、７、８、または９の触媒ドメインと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．５％の配列同一性を有する触媒ドメインを有する、請求項９〜２１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２３】
親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、フミコラ属種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐｐ．）、ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、タラロミセス属種（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ ｓｐｐ．）、またはシゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）から得られるグルコアミラーゼから選択される、請求項９〜２２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２４】
親グルコアミラーゼは、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）またはアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）から得られる、請求項９〜２３のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２５】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、発酵性の糖（複数可）の生産の増強を示す、請求項９〜２４のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２６】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスのマッシング工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、請求項９〜２５のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２７】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、醸造プロセスの発酵工程において発酵性の糖の生産の増強を示す、請求項９〜２６のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２８】
発酵性の糖は、グルコースである、請求項２７に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２９】
グルコアミラーゼは、親グルコアミラーゼと比較して、イソマルトース合成およびデンプン加水分解活性の間の低下した比（ＩＳ／ＳＨ比）を示す、請求項９〜２８のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３０】
グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、５％以下で、１０％以下で、または１５％以下で低下した、デンプン加水分解活性の低下を示す、請求項９〜２９のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３１】
グルコアミラーゼは、ＴｒＧＡなどのような親グルコアミラーゼと比較して、発酵の実質的な程度の増強を示す、請求項９〜３０のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３２】
グルコアミラーゼは精製されている、請求項９〜３１のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３３】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリヌクレオチドを含む、または請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができる、ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載の変異グルコアミラーゼをコードする核酸を、染色体の中に安定して統合している宿主細胞。
【請求項３７】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体を発現することができる細胞。
【請求項３８】
請求項３５〜３６のいずれか一項に記載の宿主細胞、または細菌細胞、菌類細胞、もしくは酵母細胞である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｓｅｉｉ）などのようなトリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
プロテアーゼ欠損および／またはキシラナーゼ欠損および／または自然グルカナーゼ欠損宿主細胞である、請求項３８〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の宿主細胞または細胞を得ることと、細胞または宿主細胞からグルコアミラーゼ変異体を発現させることとを含み、グルコアミラーゼ変異体を精製することを含んでもよい、グルコアミラーゼ変異体を発現させる方法。
【請求項４２】
グルコアミラーゼ変異体を精製することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
酵素組成物の調製のための、請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体の使用。
【請求項４４】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体を含む酵素組成物。
【請求項４５】
請求項９〜３２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのグルコアミラーゼ変異体を含む、請求項４４に記載の酵素組成物であって、デンプン加水分解組成物、糖化組成物、界面活性剤、アルコール発酵酵素組成物、および飼料の中から選択される、組成物。
【請求項４６】
アミラーゼ、プルラナーゼ、およびさらなるグルコアミラーゼの中から選択される少なくとも１つのさらなる酵素を含む、請求項４４〜４５のいずれか一項に記載の酵素組成物。
【請求項４７】
グリストからマッシュを形成することと、請求項９〜３２のいずれか一項に記載のグルコアミラーゼ変異体または請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の酵素組成物とマッシュを接触させることとを含む、醸造用の麦芽汁を生産するための方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ−１】
【図５Ａ−２】
【図５Ａ−３】
【図５Ｂ−１】
【図５Ｂ−２】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ−１】
【図５Ｄ−２】
【図５Ｅ−１】
【図５Ｅ−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５Ａ−１】
【図５Ａ−２】
【図５Ａ−３】
【図５Ｂ−１】
【図５Ｂ−２】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ−１】
【図５Ｄ−２】
【図５Ｅ−１】
【図５Ｅ−２】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１３−５０２２１１（Ｐ２０１３−５０２２１１Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５１６４（Ｐ２０１２−５２５１６４）
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２０３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２０８５２
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０８１２２２７５）ダニスコ・アクティーゼルスカブ (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ
【出願人】（５９５１６３６３０）ダニスコ・ユーエス・インコーポレイテッド (12)
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２０３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２０８５２
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０８１２２２７５）ダニスコ・アクティーゼルスカブ (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ
【出願人】（５９５１６３６３０）ダニスコ・ユーエス・インコーポレイテッド (12)
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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