グルコースを主成分とする糖類の製造方法
【課題】少量の酵素により酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができるグルコースを主成分とする糖類の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法は、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、前記混合物を攪拌して混合しながら、セルロース分解酵素によって、セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行うことを特徴とする。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
【解決手段】本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法は、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、前記混合物を攪拌して混合しながら、セルロース分解酵素によって、セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行うことを特徴とする。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスに含まれるセルロースまたはヘミセルロースを酵素分解してグルコースを主成分とする糖類を生成する酵素糖化反応を用いたグルコースを主成分とする糖類の製造方法に関し、特に、少量の酵素により効率的な酵素糖化反応を行うことによってグルコースの生成量を増大することができるグルコースを主成分とする糖類の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界各国にて、セルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの製造技術が研究開発されている。セルロース系バイオマスとは、木や草、農作物の残渣、古紙、製紙スラッジ、あるいは、綿繊維などのことであり、具体的には、建築廃材や間伐材、稲藁やバガス（サトウキビの搾りかす）、トウモロコシの茎や葉などが挙げられる。
【０００３】
セルロース系バイオマスから生成した糖を発酵して生産するバイオエタノールの製造方法としては、濃硫酸法、希硫酸法、酵素法などの開発が行われている。
近年、これらの製造方法の中でも、特に、酵素法に注目が集まっている。
酵素法は、酵素によりバイオマスに含まれるセルロースとヘミセルロースを分解して糖類を生成し、その糖類を酵母菌などの発酵菌により発酵してエタノールを生成する方法である。
【０００４】
セルロースはグルコースが脱水縮合した単純多糖類であるから、セルロースが酵素により加水分解（酵素分解）されるとグルコースが生成される。
また、ヘミセルロースはグルコース、キシロース、マンノースなどが脱水縮合した複合多糖類であるから、ヘミセルロースが酵素により加水分解（酵素分解）されるとグルコース、キシロース、マンノースなどが生成される。
そして、このようなセルロースまたはヘミセルロースの酵素糖化反応によって得られた糖類を含む溶液に発酵菌を添加して、糖類を発酵することによりエタノールが生成される。
【０００５】
従来、セルロースまたはヘミセルロースの酵素糖化反応では、セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスと、酵素を含む水溶液（酵素水溶液）とを混合した混合溶液（スラリー）を調製し、撹拌あるいは振盪条件下でセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素分解を実施してきた。その際、使用する酵素量が少ないほど、この反応によるグルコースを主成分とする糖類の生成量が少なくなる傾向にあることが報告されている（例えば、非特許文献１〜４）。しかしながら、その原因や、それを改善するための対策方法は明らかにされていなかった。
酵素糖化プロセスを実用化させるためには、高価な酵素使用量を削減させることが絶対に必要な条件となり、それを実現させるために、従来は、酵素の活性を上げる研究開発や、バイオマスの構造やセルロースの結晶構造を変化させ、酵素が働きやすくする研究開発が行われてきた。
【０００６】
それに対し、我々は、酵素とセルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとを反応させる反応方法を最適化することで、酵素使用量の削減が達成可能であることを見出した。それは、従来、酵素とセルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとを反応させる際、撹拌あるいは振盪条件下で行われてきたのに対し、撹拌や振盪を行わない状態、すなわち、静置状態、間欠的な撹拌あるいは振盪条件で酵素反応を進めることにより、使用酵素量を削減できる事を見出した（特願２００９−２８７６７８）。
【０００７】
なぜ、撹拌や振盪を行わない場合、酵素使用量が削減できるか説明する。従来の知見では、撹拌や振盪操作条件では、反応槽内の温度や濃度が均一になるため、酵素分解の反応速度が促進されると信じられてきた。そのため、従来、セルロースまたはヘミセルロースの酵素糖化反応では、セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスと、酵素を含む水溶液（酵素水溶液）とを混合した混合溶液（スラリー）を調製し、反応を促進するために、このスラリーを撹拌しながら反応を行っていた。その際、反応に最適な撹拌や振盪条件を見出すため、スラリーの撹拌条件や撹拌装置の研究事例が多数報告されており、例えば、スラリーの撹拌速度の影響、撹拌翼の形状、撹拌装置の構造などに関する研究事例が報告されている（例えば、非特許文献５〜８参照）。
【０００８】
しかしながら、これら撹拌速度や撹拌装置構造に関する研究開発においては、酵素濃度の影響が考慮されていなかった。セルロースおよび／またはヘミセルロースを単糖に加水分解する酵素は、酵素に加わる撹拌や振盪などの物理的ストレスが大きくなると失活することは知られていた。しかし、酵素溶液濃度によって、失活に及ぼす撹拌や振盪などの物理的ストレスの影響度合いが大きく変化することは知られていなかった。我々は、今回、酵素濃度が高い場合、酵素溶液に撹拌等の物理的ストレスを加えても、酵素の失活割合は少なく、一方、酵素濃度が低い場合、同じ物理的ストレスを加えた場合でも、酵素失活割合が著しく多くなることを見出した（図４参照）。すなわち、従来方式では、酵素が失活しやすい低酵素濃度条件下でも、酵素濃度が高くて酵素が失活し難い条件下と同じ撹拌条件で撹拌操作を行っていた。そのため、低酵素濃度条件下では、酵素の著しい失活が起こり、酵素使用量を削減できなかった。なお、失活とは、加水分解機能を持つ酵素が、加水分解機能を失うこと、もっと具体的に言うと、セルロースやヘミセルロースを単糖に加水分解する機能を有する酵素が、その機能を失うことである。
【０００９】
ｐＨ５に調整した５０ｍＭ酢酸緩衝液１００ｍＬに酵素を混合し、酵素タンパク質濃度が、６ｇ／Ｌおよび０．６ｇ／Ｌになる酵素溶液をそれぞれ調整した。この酵素溶液を撹拌しない状態（静置状態）で保持した場合と、撹拌動力７３Ｗ／ｍ３で撹拌した場合とにおける、失活した酵素の割合の時間変化を調べた。どちらも操作温度は５０℃で一定とした。
その結果を図４に示す。図４の縦軸は、失活した酵素の割合を、横軸は操作時間を示している。この結果、酵素濃度が０．６ｇ／Ｌの場合、酵素濃度が６ｇ／Ｌの時に比較し、失活する割合が著しく高いことが分かる。また、同じ酵素濃度の場合、撹拌操作を行った場合には、静置状態の時よりも酵素の失活量が増大することが分かる。
【００１０】
従来の撹拌速度や撹拌装置構造に関する研究開発は、酵素濃度が高い条件で行われており、撹拌などの物理的ストレスの影響で酵素が失活する割合が少ない状態であった。一方、酵素使用量を削減するため、酵素濃度を低くした場合、撹拌などの物理的ストレスにより酵素が失活する割合が増大し、低酵素濃度条件になるほど、失活の影響が大きくなる。そのため、低酵素濃度条件下で、撹拌や振盪を行うと、酵素の失活割合が増加し、セルロースおよび／またはヘミセルロースの分解効率が低下するため、酵素使用量の削減ができない原因となっていた。
【００１１】
そのため特願２００９−２８７６７８では、この課題を解決する手法として、酵素とセルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとを反応させる際、従来は、撹拌あるいは振盪条件下で行われてきたのに対し、撹拌や振盪を行わない状態、すなわち、静置状態で酵素反応を進めることにより、使用酵素量を削減できることを見出した。
【００１２】
しかしながら、大型反応装置の実用化を考えた場合、撹拌や振盪を行わない場合、反応装置全体の温度や濃度を均一にすることが難しくなる。そのため、撹拌や振盪を行わないことによる利点である、酵素の失活を抑制するという効果に対して、温度や濃度が不均一になる負の効果が大きくなってしまう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗ．Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｈ．Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｏ．Ｇｌａｔｔｅｒ，Ｗ．Ｓｔｅｉｎｅｒ，“Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．１２２１−１２３４（１９８９）
【非特許文献２】Ｙａｎｐｉｎ Ｌｕ，Ｂｉｎ Ｙａｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｇｒｅｇｇ，Ｊｏｈｎ Ｎ．Ｓａｄｄｌｅｒ，Ｓｈａｗｎ Ｄ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，“Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎ Ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｃｙｃｌｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｅａｍ−Ｅｘｐｌｏｄｅｄ Ｓｏｆｔｗｏｏｄ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．９８−１００，２００２
【非特許文献３】Ｆａｒｚａｎｅｈ Ｔｅｙｍｏｕｒｉ，Ｌｉｚｂｅｔｈ Ｌａｕｒｅａｎｏ−Ｐｅｒｅｚ，Ｈａｓａｎ Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ｂｒｕｃｅ Ｅ．Ｄａｌｅ，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｍｏｎｉａ ｆｉｂｅｒ ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ（ＡＦＥＸ） ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｏｖｅｒ，”Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９６，ｐｐ．２０１４−２０１８，２００５
【非特許文献４】Ｍｉｎｇ Ｃｈｅｎ，Ｌｉｍｉｎｇ Ｘｉａ，Ｐｅｉｊｉａｎ Ｘｕｅ，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｎｃｏｂ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ＆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ５９（２００７）８５−８９
【非特許文献５】Ｍ．Ｓａｋａｔａ，Ｈ．Ｏｏｓｈｉｍａ，Ｙ．Ｈａｒａｎｏ，“ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ＡＧＩＴＡＴＩＯＮ ＯＮ ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ ＳＡＣＣＨＡＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．９，ｐｐ．６９８−６９４（１９８５）
【非特許文献６】Ｈａｎｎａ Ｉｎｇｅｓｓｏｎ，Ｇｕｉｄｏ Ｚａｃｃｈｉ，Ｂｉｎ Ｙａｎｇ，Ａｌｉ Ｒ．Ｅｓｔｅｇｈｌａｌｉａｎ，Ｊｏｈｎ Ｎ．Ｓａｄｄｌｅｒ，“Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｓｈａｋｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８８，ｐｐ．１７７−１８２（２００１）
【非特許文献７】Ｈｅｎｎｉｎｇ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｊａｋｏｂ Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊａｎ Ｌａｒｓｅｎ，Ｃｌａｕｓ Ｆｅｌｂｙ，“Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｔ Ｈｉｇｈ−Ｓｏｌｉｄｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９６，Ｎｏ．５，ｐｐ．８６２−８７０，Ａｐｒｉｌ １，２００７
【非特許文献８】櫻井督士、高畑保之、高橋幸司、「木質バイオマスの酵素糖化における撹拌操作」、ケミカル・エンジニヤリング、２００９年３月号、第６８−第７２ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素糖化反応に用いられる酵素は高価であるため、酵素を有効に活用して、より少量の酵素でグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大する方法が望まれていたが、従来の撹拌や振盪条件では、酵素濃度が低くなるほど酵素の失活割合が増大し、少ない酵素量で効率的な酵素分解を達成することができなかった。
【００１５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、少量の酵素により酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができるグルコースを主成分とする糖類の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、低酵素濃度条件下で、酵素の失活を抑制しながら、撹拌や振盪が可能となる限界条件を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法は、セルロースおよび／またはヘミセルロースを、セルロース分解酵素で分解してグルコースを主成分とする糖類の製造方法であって、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースと、前記酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、前記酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、前記混合物を攪拌して混合しながら、前記セルロース分解酵素によって、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行うことを特徴とする。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
【００１８】
前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとしては、前処理を施したものを用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法によれば、酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活しないように、セルロース原料と酵素水溶液の混合物を、その混合物に加える攪拌動力が、混合物に含まれる基質（セルロースおよび／またはヘミセルロース）の濃度を基準とし、その濃度において酵素が失活する攪拌動力以下の範囲で攪拌混合しながら、その混合物の温度を調節することにより、酵素水溶液に含まれる酵素によってセルロース原料を酵素分解させるので、混合物中において、混合物を激しく攪拌混合したことによる酵素劣化（酵素の失活）が抑制される。したがって、酵素水溶液に含まれていた酵素を有効に活用することができるから、少量の酵素により酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】セルロースおよび／またはヘミセルロース、並びに、酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）と、その混合物に加えることができる最大の攪拌動力ｙ（Ｗ／ｍ３）との関係を示すグラフである。
【図２】本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法の実験例１〜６において、酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および酵素水溶液と基質であるろ紙の混合物に加えた攪拌動力の関係を示すグラフである。
【図３】本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法の実験例１〜６において、最終的に得られるグルコース濃度と、酵素水溶液とろ紙の混合物に加えた攪拌動力との関係を示すグラフである。
【図４】攪拌操作時間と、酵素の失活割合との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法の実施の形態について説明する。
なお、この形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００２２】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法は、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、その混合物を攪拌して混合しながら、セルロース分解酵素によって、セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行う方法である。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
以下、セルロースおよびヘミセルロース、あるいは、セルロースを含むバイオマスを総称して、セルロース原料と言うこともある。
【００２３】
本発明のグルコースの製造方法では、まず、反応槽（酵素分解槽）に、セルロース原料と、このセルロース原料の分解に適量のセルロース分解酵素を含む水溶液（酵素水溶液）とを入れ、セルロース原料と酵素水溶液を混合する（調製工程）。
【００２４】
この調製工程において、使用する酵素に最も適したｐＨ条件になるように、酵素水溶液のｐＨを調節する。さらには、使用する酵素に最も適した温度条件になるように、酵素水溶液の温度を調節する。
この調製工程では、セルロース原料と酵素水溶液の混合物のｐＨを、上記の酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、酵素水溶液のｐＨを４〜６に調節することが好ましい。
また、この調製工程では、上記の混合物の温度を、上記の酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、酵素水溶液の温度を５０〜６０℃に昇温することが好ましい。
【００２５】
また、酵素水溶液に対してセルロース原料を添加する割合（酵素水溶液に対するセルロース原料の添加率）Ｘは、酵素水溶液１００ｍＬに対して、５ｇ〜５０ｇすなわち、５ｗ／ｖ％〜５０ｗ／ｖ％であることが好ましく、より好ましくは酵素水溶液１００ｍＬに対して、１０ｇ〜４０ｇすなわち、１０ｗ／ｖ％〜４０ｗ／ｖ％である。
【００２６】
セルロースを分解するための酵素としては、セルラーゼが用いられる。
セルロース原料中にヘミセルロースが多く含まれる場合、セルラーゼ以外にヘミセルロースを分解するための酵素として、キシラナーゼやマンナナーゼを添加することが好ましい。
【００２７】
セルロース原料としては、（１）バイオマス（木や草）に対して、これらに含まれるリグニンを破壊処理するとともに、セルロースの結晶構造を一部破壊する前処理を施して得られたもの、（２）古紙、段ボール、製紙スラッジなどのセルロースを主成分とする廃棄物系原料、（３）シャツやタオルなどの綿繊維廃棄物などが用いられる。
上記の前処理工程では、バイオマスにアルカリ処理、有機溶剤処理、希硫酸処理、熱水処理などを施す方法が用いられる。
なお、古紙、段ボール、製紙スラッジなどの廃棄物系原料や、シャツやタオルなどの綿繊維廃棄物は、前処理工程が不要となる場合もある。
【００２８】
また、前処理後のセルロース原料におけるリグニンの含有量（残存量）は、１５重量％以下であることが好ましく、より好ましくは５重量％以下である。
なお、本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法では、前処理後のセルロース原料におけるリグニンの含有量（残存量）を上記の範囲内とすることによって、セルロース原料と酵素水溶液の混合物を、過度に酵素が失活しない条件で攪拌することにより、セルロースおよびヘミセルロースに対する酵素の添加量が少量（酵素溶液のタンパク質濃度が０．６ｇ／Ｌ以下）であっても、酵素水溶液に含まれている酵素をより効率的に活用して、少量の酵素により、セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができ、酵素の使用量を大幅に削減可能となる。
【００２９】
また、混合物の攪拌には、攪拌翼などが用いられる。混合物の振盪には、振盪機などが用いられる。
すなわち、本発明では、反応槽内にて、酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活しない程度に緩やかに、混合物を攪拌混合することにより、基質（セルロースおよび／またはヘミセルロース）を効率的に酵素糖化する。
【００３０】
ここで、上記の酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）と、その混合物に加えることができる最大の攪拌動力との関係を調べた結果を図１に示す。なお、混合物に加えることができる最大の攪拌動力とは、酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活することなく、混合物に加えることができる最大の攪拌動力のことである。
図１の結果から、上記の酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）と、その混合物に加えることができる最大の攪拌動力ｙ（Ｗ／ｍ３）との関係は、下記の式（２）で表される。
ｙ＝−０．０１２５ｘ２＋１．１９５ｘ＋２３．２５ ・・・（２）
したがって、本発明では、最大の攪拌動力ｙ（Ｗ／ｍ３）を超えない範囲で混合物に攪拌動力を加える、すなわち、上記の式（１）の関係を満たすように、混合物を攪拌して混合することにより、酵素を失活することなく、酵素糖化反応を効率的に行うことができる。
【００３１】
混合物を攪拌する際、混合物に加えられる攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）が上記の式（１）の関係を満たさない、すなわち、その酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）において許容される攪拌動力の最大値を超えると、反応槽内で物理的ストレスにより酵素が失活し、糖化性能が大きく低下する。一方、攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）が上記の式（１）の関係を満たしていれば、酵素の失活は抑制されるため、攪拌動力の下限は特に限定されない。
【００３２】
また、この酵素糖化反応工程では、混合物の温度を、上記の酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、５０〜６０℃に保持することが好ましい。
【００３３】
酵素糖化反応工程は、酵素によるセルロース原料の糖化が十分に進行して、それ以上反応が進行しなくなるまで行われるが、例えば、セルロース原料の酵素分解を、５０〜６０℃にて２日〜６０日程度行う。
【００３４】
ここで、酵素糖化反応工程において、低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）で酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活しない程度に緩やかに、混合物を攪拌混合することにより、少量の酵素で効率的な酵素糖化が進行できる理由は、以下のように考えられる。
低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）では、通常の撹拌混合条件では、酵素の失活割合が増大し、少量の酵素で効率的な酵素糖化の実現ができなかった。一方、低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）で、セルロース原料と酵素水溶液の混合物を緩やかに攪拌混合することにより、混合物を激しく攪拌混合したことによる酵素劣化（酵素の失活）が抑制される。したがって、酵素水溶液に含まれていた酵素を有効に活用することができるから、少量の酵素により酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができる。また、反応槽内にて、混合物を緩やかに攪拌混合することにより、反応槽内の温度や濃度を均一化することができるので、大型反応装置においても、効率的に酵素糖化反応を行うことができる。
【００３５】
以下、実験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００３６】
「実験例１」
内径１３０ｍｍ×高さ３００ｍｍの円筒状の反応槽に、セルラーゼ溶液５ｍＬを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１Ｌを入れ、この酵素水溶液（セルラーゼのタンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ）中に、セルロースとして、ろ紙１００ｇを浸漬した（セルラーゼタンパク質添加量６ｍｇ／ｇ−ろ紙）。
この酵素水溶液に対するろ紙の添加率ｘは、１０（ｗ／ｖ％）であった。
この酵素水溶液とろ紙の混合物に対して、温度５０℃、撹拌をしない静置状態（撹拌動力０Ｗ／ｍ３）で酵素糖化反応を進行させ、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
【００３７】
「実験例２」
実施例１と同様の混合物を、攪拌動力４．６Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例２では、攪拌動力が４．６Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていた。
【００３８】
「実験例３」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力３４Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例３では、攪拌動力が３４Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていた。
【００３９】
「実験例４」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力７３Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例４では、攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていなかった。
【００４０】
「実験例５」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力２１４Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例５では、攪拌動力が２１４Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていなかった。
【００４１】
「実験例６」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力４５２Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、この実験例６では、攪拌動力が４５２Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていなかった。
【００４２】
図２および図３の結果から、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３以上の場合、混合物に加えた攪拌動力が３４Ｗ／ｍ３以下の場合と比較して、生成されるグルコース濃度が低いことが確認された。すなわち、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３以上の場合、強い攪拌動力によって、酵素糖化反応が阻害されていると言える。この反応を阻害する原因は、強い攪拌動力によって、酵素の一部が失活するためであると考えられる。
また、混合物に加えた攪拌動力が３４Ｗ／ｍ３以下の場合と、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３の場合とでは、生成されるグルコース濃度の差が大きいことから、上記の混合物にある一定以上の攪拌動力が加えられると、酵素の失活が急激に進み、糖化性能が大きく低下することが分かった。
さらに、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３の場合と、混合物に加えた攪拌動力が２１４Ｗ／ｍ３の場合とでは、生成されるグルコース濃度の差が小さい理由は、酵素はある攪拌動力（閾値）を超えると、急激に失活が進み、その後は、攪拌動力の増加に対して鈍感な反応を示すものと考えられる。
以上の結果から、低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）で効率的な酵素糖化反応を維持するためには、酵素水溶液とろ紙の混合物を攪拌混合する際、混合物に加える攪拌動力を３４Ｗ／ｍ３以下にする必要があることが分かった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスに含まれるセルロースまたはヘミセルロースを酵素分解してグルコースを主成分とする糖類を生成する酵素糖化反応を用いたグルコースを主成分とする糖類の製造方法に関し、特に、少量の酵素により効率的な酵素糖化反応を行うことによってグルコースの生成量を増大することができるグルコースを主成分とする糖類の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界各国にて、セルロース系バイオマスを原料とするバイオエタノールの製造技術が研究開発されている。セルロース系バイオマスとは、木や草、農作物の残渣、古紙、製紙スラッジ、あるいは、綿繊維などのことであり、具体的には、建築廃材や間伐材、稲藁やバガス（サトウキビの搾りかす）、トウモロコシの茎や葉などが挙げられる。
【０００３】
セルロース系バイオマスから生成した糖を発酵して生産するバイオエタノールの製造方法としては、濃硫酸法、希硫酸法、酵素法などの開発が行われている。
近年、これらの製造方法の中でも、特に、酵素法に注目が集まっている。
酵素法は、酵素によりバイオマスに含まれるセルロースとヘミセルロースを分解して糖類を生成し、その糖類を酵母菌などの発酵菌により発酵してエタノールを生成する方法である。
【０００４】
セルロースはグルコースが脱水縮合した単純多糖類であるから、セルロースが酵素により加水分解（酵素分解）されるとグルコースが生成される。
また、ヘミセルロースはグルコース、キシロース、マンノースなどが脱水縮合した複合多糖類であるから、ヘミセルロースが酵素により加水分解（酵素分解）されるとグルコース、キシロース、マンノースなどが生成される。
そして、このようなセルロースまたはヘミセルロースの酵素糖化反応によって得られた糖類を含む溶液に発酵菌を添加して、糖類を発酵することによりエタノールが生成される。
【０００５】
従来、セルロースまたはヘミセルロースの酵素糖化反応では、セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスと、酵素を含む水溶液（酵素水溶液）とを混合した混合溶液（スラリー）を調製し、撹拌あるいは振盪条件下でセルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素分解を実施してきた。その際、使用する酵素量が少ないほど、この反応によるグルコースを主成分とする糖類の生成量が少なくなる傾向にあることが報告されている（例えば、非特許文献１〜４）。しかしながら、その原因や、それを改善するための対策方法は明らかにされていなかった。
酵素糖化プロセスを実用化させるためには、高価な酵素使用量を削減させることが絶対に必要な条件となり、それを実現させるために、従来は、酵素の活性を上げる研究開発や、バイオマスの構造やセルロースの結晶構造を変化させ、酵素が働きやすくする研究開発が行われてきた。
【０００６】
それに対し、我々は、酵素とセルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとを反応させる反応方法を最適化することで、酵素使用量の削減が達成可能であることを見出した。それは、従来、酵素とセルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとを反応させる際、撹拌あるいは振盪条件下で行われてきたのに対し、撹拌や振盪を行わない状態、すなわち、静置状態、間欠的な撹拌あるいは振盪条件で酵素反応を進めることにより、使用酵素量を削減できる事を見出した（特願２００９−２８７６７８）。
【０００７】
なぜ、撹拌や振盪を行わない場合、酵素使用量が削減できるか説明する。従来の知見では、撹拌や振盪操作条件では、反応槽内の温度や濃度が均一になるため、酵素分解の反応速度が促進されると信じられてきた。そのため、従来、セルロースまたはヘミセルロースの酵素糖化反応では、セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスと、酵素を含む水溶液（酵素水溶液）とを混合した混合溶液（スラリー）を調製し、反応を促進するために、このスラリーを撹拌しながら反応を行っていた。その際、反応に最適な撹拌や振盪条件を見出すため、スラリーの撹拌条件や撹拌装置の研究事例が多数報告されており、例えば、スラリーの撹拌速度の影響、撹拌翼の形状、撹拌装置の構造などに関する研究事例が報告されている（例えば、非特許文献５〜８参照）。
【０００８】
しかしながら、これら撹拌速度や撹拌装置構造に関する研究開発においては、酵素濃度の影響が考慮されていなかった。セルロースおよび／またはヘミセルロースを単糖に加水分解する酵素は、酵素に加わる撹拌や振盪などの物理的ストレスが大きくなると失活することは知られていた。しかし、酵素溶液濃度によって、失活に及ぼす撹拌や振盪などの物理的ストレスの影響度合いが大きく変化することは知られていなかった。我々は、今回、酵素濃度が高い場合、酵素溶液に撹拌等の物理的ストレスを加えても、酵素の失活割合は少なく、一方、酵素濃度が低い場合、同じ物理的ストレスを加えた場合でも、酵素失活割合が著しく多くなることを見出した（図４参照）。すなわち、従来方式では、酵素が失活しやすい低酵素濃度条件下でも、酵素濃度が高くて酵素が失活し難い条件下と同じ撹拌条件で撹拌操作を行っていた。そのため、低酵素濃度条件下では、酵素の著しい失活が起こり、酵素使用量を削減できなかった。なお、失活とは、加水分解機能を持つ酵素が、加水分解機能を失うこと、もっと具体的に言うと、セルロースやヘミセルロースを単糖に加水分解する機能を有する酵素が、その機能を失うことである。
【０００９】
ｐＨ５に調整した５０ｍＭ酢酸緩衝液１００ｍＬに酵素を混合し、酵素タンパク質濃度が、６ｇ／Ｌおよび０．６ｇ／Ｌになる酵素溶液をそれぞれ調整した。この酵素溶液を撹拌しない状態（静置状態）で保持した場合と、撹拌動力７３Ｗ／ｍ３で撹拌した場合とにおける、失活した酵素の割合の時間変化を調べた。どちらも操作温度は５０℃で一定とした。
その結果を図４に示す。図４の縦軸は、失活した酵素の割合を、横軸は操作時間を示している。この結果、酵素濃度が０．６ｇ／Ｌの場合、酵素濃度が６ｇ／Ｌの時に比較し、失活する割合が著しく高いことが分かる。また、同じ酵素濃度の場合、撹拌操作を行った場合には、静置状態の時よりも酵素の失活量が増大することが分かる。
【００１０】
従来の撹拌速度や撹拌装置構造に関する研究開発は、酵素濃度が高い条件で行われており、撹拌などの物理的ストレスの影響で酵素が失活する割合が少ない状態であった。一方、酵素使用量を削減するため、酵素濃度を低くした場合、撹拌などの物理的ストレスにより酵素が失活する割合が増大し、低酵素濃度条件になるほど、失活の影響が大きくなる。そのため、低酵素濃度条件下で、撹拌や振盪を行うと、酵素の失活割合が増加し、セルロースおよび／またはヘミセルロースの分解効率が低下するため、酵素使用量の削減ができない原因となっていた。
【００１１】
そのため特願２００９−２８７６７８では、この課題を解決する手法として、酵素とセルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとを反応させる際、従来は、撹拌あるいは振盪条件下で行われてきたのに対し、撹拌や振盪を行わない状態、すなわち、静置状態で酵素反応を進めることにより、使用酵素量を削減できることを見出した。
【００１２】
しかしながら、大型反応装置の実用化を考えた場合、撹拌や振盪を行わない場合、反応装置全体の温度や濃度を均一にすることが難しくなる。そのため、撹拌や振盪を行わないことによる利点である、酵素の失活を抑制するという効果に対して、温度や濃度が不均一になる負の効果が大きくなってしまう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｗ．Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｈ．Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｏ．Ｇｌａｔｔｅｒ，Ｗ．Ｓｔｅｉｎｅｒ，“Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．１２２１−１２３４（１９８９）
【非特許文献２】Ｙａｎｐｉｎ Ｌｕ，Ｂｉｎ Ｙａｎｇ，Ｄａｖｉｄ Ｇｒｅｇｇ，Ｊｏｈｎ Ｎ．Ｓａｄｄｌｅｒ，Ｓｈａｗｎ Ｄ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，“Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎ Ｅｖａｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｃｙｃｌｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｔｅａｍ−Ｅｘｐｌｏｄｅｄ Ｓｏｆｔｗｏｏｄ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．９８−１００，２００２
【非特許文献３】Ｆａｒｚａｎｅｈ Ｔｅｙｍｏｕｒｉ，Ｌｉｚｂｅｔｈ Ｌａｕｒｅａｎｏ−Ｐｅｒｅｚ，Ｈａｓａｎ Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ｂｒｕｃｅ Ｅ．Ｄａｌｅ，“Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｍｏｎｉａ ｆｉｂｅｒ ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ（ＡＦＥＸ） ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｎ ｓｔｏｖｅｒ，”Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９６，ｐｐ．２０１４−２０１８，２００５
【非特許文献４】Ｍｉｎｇ Ｃｈｅｎ，Ｌｉｍｉｎｇ Ｘｉａ，Ｐｅｉｊｉａｎ Ｘｕｅ，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｎｃｏｂ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ＆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ５９（２００７）８５−８９
【非特許文献５】Ｍ．Ｓａｋａｔａ，Ｈ．Ｏｏｓｈｉｍａ，Ｙ．Ｈａｒａｎｏ，“ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ＡＧＩＴＡＴＩＯＮ ＯＮ ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ ＳＡＣＣＨＡＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．９，ｐｐ．６９８−６９４（１９８５）
【非特許文献６】Ｈａｎｎａ Ｉｎｇｅｓｓｏｎ，Ｇｕｉｄｏ Ｚａｃｃｈｉ，Ｂｉｎ Ｙａｎｇ，Ａｌｉ Ｒ．Ｅｓｔｅｇｈｌａｌｉａｎ，Ｊｏｈｎ Ｎ．Ｓａｄｄｌｅｒ，“Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｓｈａｋｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８８，ｐｐ．１７７−１８２（２００１）
【非特許文献７】Ｈｅｎｎｉｎｇ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｊａｋｏｂ Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｊａｎ Ｌａｒｓｅｎ，Ｃｌａｕｓ Ｆｅｌｂｙ，“Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｔ Ｈｉｇｈ−Ｓｏｌｉｄｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９６，Ｎｏ．５，ｐｐ．８６２−８７０，Ａｐｒｉｌ １，２００７
【非特許文献８】櫻井督士、高畑保之、高橋幸司、「木質バイオマスの酵素糖化における撹拌操作」、ケミカル・エンジニヤリング、２００９年３月号、第６８−第７２ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、セルロースおよび／またはヘミセルロースの酵素糖化反応に用いられる酵素は高価であるため、酵素を有効に活用して、より少量の酵素でグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大する方法が望まれていたが、従来の撹拌や振盪条件では、酵素濃度が低くなるほど酵素の失活割合が増大し、少ない酵素量で効率的な酵素分解を達成することができなかった。
【００１５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、少量の酵素により酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができるグルコースを主成分とする糖類の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、低酵素濃度条件下で、酵素の失活を抑制しながら、撹拌や振盪が可能となる限界条件を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法は、セルロースおよび／またはヘミセルロースを、セルロース分解酵素で分解してグルコースを主成分とする糖類の製造方法であって、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースと、前記酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、前記酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、前記混合物を攪拌して混合しながら、前記セルロース分解酵素によって、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行うことを特徴とする。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
【００１８】
前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとしては、前処理を施したものを用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法によれば、酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活しないように、セルロース原料と酵素水溶液の混合物を、その混合物に加える攪拌動力が、混合物に含まれる基質（セルロースおよび／またはヘミセルロース）の濃度を基準とし、その濃度において酵素が失活する攪拌動力以下の範囲で攪拌混合しながら、その混合物の温度を調節することにより、酵素水溶液に含まれる酵素によってセルロース原料を酵素分解させるので、混合物中において、混合物を激しく攪拌混合したことによる酵素劣化（酵素の失活）が抑制される。したがって、酵素水溶液に含まれていた酵素を有効に活用することができるから、少量の酵素により酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】セルロースおよび／またはヘミセルロース、並びに、酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）と、その混合物に加えることができる最大の攪拌動力ｙ（Ｗ／ｍ３）との関係を示すグラフである。
【図２】本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法の実験例１〜６において、酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および酵素水溶液と基質であるろ紙の混合物に加えた攪拌動力の関係を示すグラフである。
【図３】本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法の実験例１〜６において、最終的に得られるグルコース濃度と、酵素水溶液とろ紙の混合物に加えた攪拌動力との関係を示すグラフである。
【図４】攪拌操作時間と、酵素の失活割合との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法の実施の形態について説明する。
なお、この形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００２２】
本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法は、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、セルロースおよび／またはヘミセルロースと、酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、その混合物を攪拌して混合しながら、セルロース分解酵素によって、セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行う方法である。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
以下、セルロースおよびヘミセルロース、あるいは、セルロースを含むバイオマスを総称して、セルロース原料と言うこともある。
【００２３】
本発明のグルコースの製造方法では、まず、反応槽（酵素分解槽）に、セルロース原料と、このセルロース原料の分解に適量のセルロース分解酵素を含む水溶液（酵素水溶液）とを入れ、セルロース原料と酵素水溶液を混合する（調製工程）。
【００２４】
この調製工程において、使用する酵素に最も適したｐＨ条件になるように、酵素水溶液のｐＨを調節する。さらには、使用する酵素に最も適した温度条件になるように、酵素水溶液の温度を調節する。
この調製工程では、セルロース原料と酵素水溶液の混合物のｐＨを、上記の酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、酵素水溶液のｐＨを４〜６に調節することが好ましい。
また、この調製工程では、上記の混合物の温度を、上記の酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、酵素水溶液の温度を５０〜６０℃に昇温することが好ましい。
【００２５】
また、酵素水溶液に対してセルロース原料を添加する割合（酵素水溶液に対するセルロース原料の添加率）Ｘは、酵素水溶液１００ｍＬに対して、５ｇ〜５０ｇすなわち、５ｗ／ｖ％〜５０ｗ／ｖ％であることが好ましく、より好ましくは酵素水溶液１００ｍＬに対して、１０ｇ〜４０ｇすなわち、１０ｗ／ｖ％〜４０ｗ／ｖ％である。
【００２６】
セルロースを分解するための酵素としては、セルラーゼが用いられる。
セルロース原料中にヘミセルロースが多く含まれる場合、セルラーゼ以外にヘミセルロースを分解するための酵素として、キシラナーゼやマンナナーゼを添加することが好ましい。
【００２７】
セルロース原料としては、（１）バイオマス（木や草）に対して、これらに含まれるリグニンを破壊処理するとともに、セルロースの結晶構造を一部破壊する前処理を施して得られたもの、（２）古紙、段ボール、製紙スラッジなどのセルロースを主成分とする廃棄物系原料、（３）シャツやタオルなどの綿繊維廃棄物などが用いられる。
上記の前処理工程では、バイオマスにアルカリ処理、有機溶剤処理、希硫酸処理、熱水処理などを施す方法が用いられる。
なお、古紙、段ボール、製紙スラッジなどの廃棄物系原料や、シャツやタオルなどの綿繊維廃棄物は、前処理工程が不要となる場合もある。
【００２８】
また、前処理後のセルロース原料におけるリグニンの含有量（残存量）は、１５重量％以下であることが好ましく、より好ましくは５重量％以下である。
なお、本発明のグルコースを主成分とする糖類の製造方法では、前処理後のセルロース原料におけるリグニンの含有量（残存量）を上記の範囲内とすることによって、セルロース原料と酵素水溶液の混合物を、過度に酵素が失活しない条件で攪拌することにより、セルロースおよびヘミセルロースに対する酵素の添加量が少量（酵素溶液のタンパク質濃度が０．６ｇ／Ｌ以下）であっても、酵素水溶液に含まれている酵素をより効率的に活用して、少量の酵素により、セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができ、酵素の使用量を大幅に削減可能となる。
【００２９】
また、混合物の攪拌には、攪拌翼などが用いられる。混合物の振盪には、振盪機などが用いられる。
すなわち、本発明では、反応槽内にて、酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活しない程度に緩やかに、混合物を攪拌混合することにより、基質（セルロースおよび／またはヘミセルロース）を効率的に酵素糖化する。
【００３０】
ここで、上記の酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）と、その混合物に加えることができる最大の攪拌動力との関係を調べた結果を図１に示す。なお、混合物に加えることができる最大の攪拌動力とは、酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活することなく、混合物に加えることができる最大の攪拌動力のことである。
図１の結果から、上記の酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）と、その混合物に加えることができる最大の攪拌動力ｙ（Ｗ／ｍ３）との関係は、下記の式（２）で表される。
ｙ＝−０．０１２５ｘ２＋１．１９５ｘ＋２３．２５ ・・・（２）
したがって、本発明では、最大の攪拌動力ｙ（Ｗ／ｍ３）を超えない範囲で混合物に攪拌動力を加える、すなわち、上記の式（１）の関係を満たすように、混合物を攪拌して混合することにより、酵素を失活することなく、酵素糖化反応を効率的に行うことができる。
【００３１】
混合物を攪拌する際、混合物に加えられる攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）が上記の式（１）の関係を満たさない、すなわち、その酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率ｘ（ｗ／ｖ％）において許容される攪拌動力の最大値を超えると、反応槽内で物理的ストレスにより酵素が失活し、糖化性能が大きく低下する。一方、攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）が上記の式（１）の関係を満たしていれば、酵素の失活は抑制されるため、攪拌動力の下限は特に限定されない。
【００３２】
また、この酵素糖化反応工程では、混合物の温度を、上記の酵素が活発に機能するように調節することが好ましく、具体的には、５０〜６０℃に保持することが好ましい。
【００３３】
酵素糖化反応工程は、酵素によるセルロース原料の糖化が十分に進行して、それ以上反応が進行しなくなるまで行われるが、例えば、セルロース原料の酵素分解を、５０〜６０℃にて２日〜６０日程度行う。
【００３４】
ここで、酵素糖化反応工程において、低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）で酵素水溶液に含まれる酵素が過度に失活しない程度に緩やかに、混合物を攪拌混合することにより、少量の酵素で効率的な酵素糖化が進行できる理由は、以下のように考えられる。
低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）では、通常の撹拌混合条件では、酵素の失活割合が増大し、少量の酵素で効率的な酵素糖化の実現ができなかった。一方、低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）で、セルロース原料と酵素水溶液の混合物を緩やかに攪拌混合することにより、混合物を激しく攪拌混合したことによる酵素劣化（酵素の失活）が抑制される。したがって、酵素水溶液に含まれていた酵素を有効に活用することができるから、少量の酵素により酵素糖化反応を行ってもグルコースを主成分とする糖類の生成量を増大することができる。また、反応槽内にて、混合物を緩やかに攪拌混合することにより、反応槽内の温度や濃度を均一化することができるので、大型反応装置においても、効率的に酵素糖化反応を行うことができる。
【００３５】
以下、実験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００３６】
「実験例１」
内径１３０ｍｍ×高さ３００ｍｍの円筒状の反応槽に、セルラーゼ溶液５ｍＬを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）１Ｌを入れ、この酵素水溶液（セルラーゼのタンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ）中に、セルロースとして、ろ紙１００ｇを浸漬した（セルラーゼタンパク質添加量６ｍｇ／ｇ−ろ紙）。
この酵素水溶液に対するろ紙の添加率ｘは、１０（ｗ／ｖ％）であった。
この酵素水溶液とろ紙の混合物に対して、温度５０℃、撹拌をしない静置状態（撹拌動力０Ｗ／ｍ３）で酵素糖化反応を進行させ、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
【００３７】
「実験例２」
実施例１と同様の混合物を、攪拌動力４．６Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例２では、攪拌動力が４．６Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていた。
【００３８】
「実験例３」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力３４Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例３では、攪拌動力が３４Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていた。
【００３９】
「実験例４」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力７３Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例４では、攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていなかった。
【００４０】
「実験例５」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力２１４Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、最終的に得られるグルコース濃度と、上記の混合物に加えた攪拌動力との関係を図３に示す。
また、この実験例５では、攪拌動力が２１４Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていなかった。
【００４１】
「実験例６」
実施例１と同様の混合物を、攪拌翼により、攪拌動力４５２Ｗ／ｍ３で攪拌混合しながら、混合物の温度を５０℃に調節することにより、酵素水溶液に含まれるセルラーゼによってろ紙の酵素分解を行った。
実験例１と同様にして、酵素分解の反応時間と、生成されるグルコース濃度との関係を調べた。
酵素分解の反応時間、生成されるグルコース濃度および上記の混合物に加えた攪拌動力の関係を図２に示す。
また、この実験例６では、攪拌動力が４５２Ｗ／ｍ３であるので、上記の式（１）の関係を満たしていなかった。
【００４２】
図２および図３の結果から、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３以上の場合、混合物に加えた攪拌動力が３４Ｗ／ｍ３以下の場合と比較して、生成されるグルコース濃度が低いことが確認された。すなわち、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３以上の場合、強い攪拌動力によって、酵素糖化反応が阻害されていると言える。この反応を阻害する原因は、強い攪拌動力によって、酵素の一部が失活するためであると考えられる。
また、混合物に加えた攪拌動力が３４Ｗ／ｍ３以下の場合と、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３の場合とでは、生成されるグルコース濃度の差が大きいことから、上記の混合物にある一定以上の攪拌動力が加えられると、酵素の失活が急激に進み、糖化性能が大きく低下することが分かった。
さらに、混合物に加えた攪拌動力が７３Ｗ／ｍ３の場合と、混合物に加えた攪拌動力が２１４Ｗ／ｍ３の場合とでは、生成されるグルコース濃度の差が小さい理由は、酵素はある攪拌動力（閾値）を超えると、急激に失活が進み、その後は、攪拌動力の増加に対して鈍感な反応を示すものと考えられる。
以上の結果から、低酵素濃度条件下（タンパク質濃度０．６ｇ／Ｌ以下）で効率的な酵素糖化反応を維持するためには、酵素水溶液とろ紙の混合物を攪拌混合する際、混合物に加える攪拌動力を３４Ｗ／ｍ３以下にする必要があることが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースおよび／またはヘミセルロースを、セルロース分解酵素で分解してグルコースを主成分とする糖類の製造方法であって、
セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースと、前記酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、前記酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、前記混合物を攪拌して混合しながら、前記セルロース分解酵素によって、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行うことを特徴とするグルコースを主成分とする糖類の製造方法。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
【請求項２】
前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとしては、前処理を施したものを用いることを特徴とする請求項１に記載のグルコースを主成分とする糖類の製造方法。
【請求項１】
セルロースおよび／またはヘミセルロースを、セルロース分解酵素で分解してグルコースを主成分とする糖類の製造方法であって、
セルロースおよび／またはヘミセルロースと、セルロース分解酵素の酵素水溶液とを混合させた後、反応槽内にて、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースと、前記酵素水溶液の混合物に加える攪拌動力Ｙ（Ｗ／ｍ３）と、前記酵素水溶液に対するセルロースおよび／またはヘミセルロースの添加率Ｘ（ｗ／ｖ％）が下記の式（１）の関係を満たすように、前記混合物を攪拌して混合しながら、前記セルロース分解酵素によって、前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを糖化する酵素糖化反応を行うことを特徴とするグルコースを主成分とする糖類の製造方法。
Ｙ≦−０．０１２５Ｘ２＋１．１９５Ｘ＋２３．２５ ・・・（１）
【請求項２】
前記セルロースおよび／またはヘミセルロースを含むバイオマスとしては、前処理を施したものを用いることを特徴とする請求項１に記載のグルコースを主成分とする糖類の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１３９１４４（Ｐ２０１２−１３９１４４Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９３２７５（Ｐ２０１０−２９３２７５）
【出願日】平成２２年１２月２８日（２０１０．１２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００４４１１）日揮株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２８日（２０１０．１２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術開発機構「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００４４１１）日揮株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]