グルコース脱水素酵素
【課題】 グルコースに対する選択性が高い改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を提供すること。
【解決手段】配列番号１で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の９９番目のアミノ酸残基Ｇまたは配列番号３で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられている、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素が開示される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはさらに、Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；Ｌ１９３Ｘ；Ｅ２７７Ｘ；Ａ３１８Ｘ；Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；Ｇ４５１Ｃ；およびＮ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）からなる群より選択される１またはそれ以上の変異をさらに含んでいてもよい。
【解決手段】配列番号１で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の９９番目のアミノ酸残基Ｇまたは配列番号３で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられている、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素が開示される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはさらに、Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；Ｌ１９３Ｘ；Ｅ２７７Ｘ；Ａ３１８Ｘ；Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；Ｇ４５１Ｃ；およびＮ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）からなる群より選択される１またはそれ以上の変異をさらに含んでいてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は，日本特許出願２００７−１６３８５８（２００７年６月２１日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
【０００２】
本発明はピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。グルコース濃度の測定法の１つとして、ＰＱＱＧＤＨを用いる方法が既に実用化されている。
【０００４】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはAcinetobacter calcoaceticusのいくつかの株においてその存在が確認されており、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（GenBank 受託番号X15871; Mol. Gen. Genet. (1989), 217: 430-436）。Acinetobacter calcoaceticus由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨのX線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が明らかとなった。（A.Oubrie et al., J. Mol. Biol., 289, 319-333(1999);A. Oubrie et al., The EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999); A. Oubrie et al. PNAS, 96(21), 11787-11791 (1999)）。また、Acinetobacter baumannii由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨも同定されている（GenBank 受託番号E28183）。
【０００５】
ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。しかしながらＰＱＱＧＤＨはグルコースに対する選択性が低いことが問題であった。特に、マルトースを含有する輸液を投与中の患者では、マルトースに対しても高い活性を示すＰＱＱＧＤＨを用いると正確な測定ができない。この場合、みかけの血糖値は実際の血糖値より高くなるため、その測定値を基に患者にインスリンが投与されて低血糖を起こすという危険がある。したがって、血糖値の測定用に使用する酵素としては、マルトースと比較してグルコースに対する選択性が高いＰＱＱＧＤＨが望ましい。
【０００６】
本発明者は、これまでに、グルコースに対する選択性が高められているいくつかの改変型ＰＱＱＧＤＨを報告してきたが（WO00/66744、特開2001-346587、WO2004/005499など）、さらに高い選択性および／または高い酵素活性を有する改変型ＰＱＱＧＤＨが求められている。
【０００７】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO00/66744
【特許文献２】特開2001-346587
【特許文献３】WO2004/005499
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mol. Gen. Genet. (1989), 217:430-436
【非特許文献２】A. Oubrie, et al. (1999) J. Mol. Bio. , 289, 319-333
【非特許文献３】A. Oubrie, et al. (1999) The EMBO Journal, 18(19), 5187-5194
【非特許文献４】A. Oubrie, et al. (1999), PNAS 96(21), 11787-11791
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、グルコースに対する選択性が高い改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、水溶性ＰＱＱＧＤＨの特定の位置に所定の配列を有する４アミノ酸または５アミノ酸からなるペプチドフラグメントを挿入することにより、グルコースに対する選択性が高まることを見いだした。
【００１２】
本発明は、配列番号１で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の９９番目のアミノ酸残基Ｇ、または配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨの１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられており、かつ、配列番号１の１−９８番目のアミノ酸残基および１００−４７８番目のアミノ酸残基、または配列番号３の１−９９番目のアミノ酸残基および１０１−４８０番目のアミノ酸残基の１〜１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を提供する。本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素において、好ましくはＺはＳＸであり、特に好ましくはＺはＳＮである。
【００１３】
好ましくは、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素はさらに、以下のアミノ酸置換：
Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；
Ｌ１９３Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｅ２７７Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ａ３１８Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；
Ｇ４５１Ｃ；および
Ｎ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）
からなる群より選択される１またはそれ以上の変異をさらに含む。
【００１４】
別の観点においては、本発明は、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、ならびに該組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体を提供する。本発明はまた、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターで形質転換した形質転換体を培養して、該培養物からピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素の製造方法を提供する。
【００１５】
さらに別の観点においては、本発明は、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキットを提供する。本発明はまた、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素が装着されている酵素電極、ならびに該酵素電極を作用極として用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素は、グルコースに対して高い選択性を示し、かつグルコースに対して高い酸化活性を有していることから、グルコースの高選択的かつ高感度の測定に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
改変型ＰＱＱＧＤＨの構造
本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素は、配列番号１で示される水溶性ＰＱＱＧＤＨの９９番目のアミノ酸残基Ｇまたは配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨの１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられていることを特徴とする。なお、本明細書においては、水溶性ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号付けする。
【００１９】
配列番号１で表されるＰＱＱＧＤＨは、Acinetobacter calcoaceticus由来のＰＱＱＧＤＨ（GenBank 受託番号X15871）であり、配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨは、Acinetobacter baumannii由来のＰＱＱＧＤＨ（GenBank 受託番号E28183）であり、これらはアミノ酸配列レベルで約92%のホモロジーを有している。２つの配列のアラインメントを下記に示す。
【００２０】
【表１】
これらの２つのＰＱＱＧＤＨは、類似する二次構造を有しており、対応するアミノ酸残基の置換により酵素の性質、例えば熱安定性や基質特異性が同様に変化することが知られている。
【００２１】
本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素において、好ましくはＺはＳＸであり、特に好ましくはＺはＳＮである。すなわち、配列番号１の９９番目のアミノ酸残基Ｇまたは配列番号３の１００番目のアミノ酸残基Ｇの代わりに、アミノ酸配列：ＴＧＳＸＮ、好ましくはＴＧＳＮＮ、特に好ましくはＴＧＳＫＮ、ＴＧＳＲＮまたはＴＧＳＷＮが挿入されている。また好ましくは、このアミノ酸残基Ｇの代わりに、ＴＧＳＮまたはＴＧＮＮが挿入されている。
【００２２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨと比較してグルコースに対して高い選択性を有する。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する反応性と比べて、マルトースに対する反応性が野生型より低下している。より好ましくは、グルコースに対する反応性を１００％とした場合、マルトースに対する活性が５０％以下であり、より好ましくは３０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。
【００２３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１の９９番目または配列番号３の１００番目のアミノ酸残基の変異に加えて、さらに別の変異を有していてもよい。例えば、配列番号１の１−９８番目のアミノ酸残基および１００−４７８番目のアミノ酸残基の１またはそれ以上、または配列番号３の１−９９番目のアミノ酸残基および１０１−４８０番目のアミノ酸残基の１またはそれ以上、例えば１〜１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。
【００２４】
本発明の好ましい態様においては、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、
Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；
Ｌ１９３Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｅ２７７Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ａ３１８Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；
Ｇ４５１Ｃ；および
Ｎ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）
からなる群より選択される１またはそれ以上、好ましくは１〜１０個、例えば、１，２，３，４、５または６個の変異をさらに含む。なお、ここで例えば「Ｑ１９２Ｇ」との表記は、配列番号１の１９２番目のグルタミンまたはこれに対応する配列番号３の１９３番目のグルタミンがグリシンに置き換えられていることを表し、他の置換変異も同様にして表される。
【００２５】
本発明の特に好ましい態様は、以下のいずれかのアミノ酸の変異の組み合わせ：
G99(TGSXN)+Q192G+L193E；
G99(TGSXN)+Q192S+N452P；
G99(TGSXN)+Q192G+L193E+N452P；
G99(TGSXN)+Q192S+N452P；
G99(TGSNN)+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+N452P；
G99(TGSNN)+Q192S+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G+N452P；
G99(TGSNN)+L193E+N452P；
G99(TGSNN)+Q192S+L193M+N452P；
G99(TGSNN)+A318Y+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G；
G99(TGSNN)+Q192S；
G99(TGSNN)+Q192A；
G99(TGSNN)+Q192G+L193E；
G99(TGSNN)+Q192S+L193X；
G99(TGSNN)+Q192S+L193M；
G99(TGSNN)+Q192S+L193T；
G99(TGSNN)+Q192S+E277X；
G99(TGSNN)+Q192S+N452X；
G99(TGSNN)+Q192S+L193X+A318Y+N452P；
G99(TGSNN)+Q192S+A318X+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+A318X+N452P；
G99(TGSKN)+Q192S+N452P；
G99(TGSRN)+Q192S+N452P；
G99(TGSWN)+Q192S+N452P；
G99(TGSN)+Q192S+N452P；
G99(TGSN)+Q192G+L193E；
G99(TGSN)+Q192S+L193M；
G99(TGNN)+Q192S+N452P；
G99(TGNN)+Q192G+L193E；または
G99(TGNN)+Q192S+L193M
を含む改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素である。上記式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、例えば、G99(TGSXN)とは、配列番号１で表されるＰＱＱＧＤＨにおいて９９番目のＧがＴＧＳＸＮで置き換えられていることを示す。
【００２６】
本発明の別の好ましい態様は、以下のいずれかのアミノ酸の変異の組み合わせ：
G99(TGSXN)+Q192G+L193E;
G99(TGSXN)+Q192S+N452P;
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+N452P;
G99(TGSNN)+Q192S+L193M+N452P;
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+A318K+N452P;または
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+A318Q+N452P;
を含む改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素である。
【００２７】
１９２番目のグルタミン残基、１９３番目のロイシン残基および４５２番目のアスパラギン残基がＰＱＱＧＤＨによる基質の認識および結合に関与することは、WO04/005499に開示されている。しかし、一般的には、異なるドメインに存在するアミノ酸残基に同時に変異を導入することにより、基質の選択性や酵素活性がどのように変化するかについては、全く予測することができない。場合によっては、酵素活性が全く失われることもある。したがって、本発明において、これらのアミノ酸残基の置換と、配列番号１の９９番目のアミノ酸残基または配列番号３の１００番目のアミノ酸残基の挿入変異とを同時に導入することによりグルコースの選択性のさらなる向上が得られたことは、予測されないことであった。
【００２８】
改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法
Acinetobacter calcoaceticus 由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は配列番号２で、Acinetobacter baumannii由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は配列番号４で規定される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば下記の実施例に記載されるように、適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲを用いることができる。
【００２９】
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
【００３０】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨにおいては、所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野においてよく知られている。
【００３１】
上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、改変型ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した改変型ＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを調製することができる。
【００３２】
酵素活性の測定方法
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。
【００３３】
グルコースに対する選択性
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノース、アロース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
【００３４】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型酵素と比較して、グルコースに対する選択性が向上しており、特にマルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する反応性が高い。したがって、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、マルトースを含有する試料を用いた場合でも高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。
【００３５】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００３６】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨをが装着されている酵素電極、ならびにこの酵素電極を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００３７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ2、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００３８】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の構築
配列番号２に示されるAcinetobacter calcoaceticus由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、変異の導入を行った。簡単には、野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨ全長用のフォワード側のプライマーと変異導入領域のリバース側のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、一方で、全長用のリバース側のプライマーと変異導入領域のフォワード側のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、これらのＰＣＲ産物を混合して、全長用のフォワードプライマーおよびリバースのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、変異が導入された全長ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を作製した。次に、シークエンシングにより目的とする変異が正しく導入されていることを確認した。
【００４１】
全長増幅用プライマーの配列は以下のとおりである：
フォワード：AACAGACCATGGATAAACATTTATTGGC（配列番号５）
リバース：ACAGCCAAGCTTTTACTTAGCCTTATAGG（配列番号６）
【００４２】
また、変異導入用のプライマー（Ｆ：フォワード、Ｒ：リバース）の配列は下記の表に示されるとおりである。
【００４３】
【表２】
【００４４】
その他の置換変異、例えば、Ｑ１９２Ｇ、Ｌ１９３Ｅなどの変異の導入は、WO00/66744に記載されているようにして、慣用の部位特異的変異導入法を用いて行った。また、複数の部位の変異を組み合わせて有する改変型ＰＱＱＧＤＨは、それぞれの変異に対応した複数のプライマーを用いる部位特異的変異導入法により、または制限酵素を利用した組換え法により作製した。
【００４５】
実施例２
改変型ＰＱＱＧＤＨの調製
野生型または上記のようにして調製した改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿入し、構築されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ含有）で３７℃で一晩振とう培養し、１ｍＭ ＣａＣｌ2、５００μＭＰＱＱを含む７ｌのＬ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離（５０００×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）１５０μｌに懸濁した。体積の１／２〜２／３量のガラスビーズ（バクテリア用０．１０５〜０．１２５ｍｍ）を加え、４℃で２０分間ボルテックスした。各サンプルに１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）１ｍｌを加え、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）し、上清を回収した。これを粗精製酵素標品として以下の実施例において用いた。
【００４６】
実施例３
酵素活性の測定
実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素標品１００μｌに、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１ｍＭ ＰＱＱ＋１ｍＭ ＣａＣｌ2ホロ化液９００μｌを加え、静置（室温、暗所、３０分以上）してホロ化を行った。１０倍希釈したホロ化済み酵素試液１５０μｌに、各濃度の基質（グルコースまたはマルトース）、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）０．６ｍＭ、ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）０．３ｍＭ、いずれも終濃度）５０μｌを加え、計２００ｕｌで室温で反応させた。基質としては、グルコースおよびマルトースを、それぞれ終濃度０，１，２，４，１０，２０，４０ｍＭで用いた。ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ-1とした。蛋白質濃度は市販の蛋白質測定キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて測定した。
【００４７】
代表的な結果として、４ｍＭグルコースへの活性に対する４ｍＭマルトースへの活性の比（％）を以下の表に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
【表６】
【００５２】
【表７】
【００５３】
【表８】
【００５４】
【表９】
【００５５】
【表１０】
【００５６】
【表１１】
【００５７】
【表１２】
【００５８】
【表１３】
【００５９】
【表１４】
【００６０】
【表１５】
【００６１】
【表１６】
【００６２】
【表１７】
【００６３】
【表１８】
【００６４】
【表１９】
【００６５】
上記の表から明らかなように、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはいずれも、マルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する高い反応性を示した。
【００６６】
実施例４
酵素センサーの作製および評価
５ユニットの本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨにカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
【００６７】
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
【００６８】
実施例５
精製酵素標品を用いた酵素活性の測定
実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素を、それぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ蛋白質を得た。得られた精製酵素標品について、実施例４と同様にしてグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を測定した。代表的な結果を以下の表に示す。
【００６９】
【表２０】
【００７０】
また、ＴＧＳＮＮ＋Ｑ１９２Ｇ＋Ｌ１９３Ｅ＋Ｎ４５２Ｐの変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を図１に示す。
【００７１】
実施例６
従来技術の改変型ＰＱＱＧＤＨとの比較
実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素、ならびに対照としてＰＱＱＧＤＨの９９番目のアミノ酸残基Ｇには変異が導入されていないが、他の位置で１または２以上のアミノ酸置換を有する従来技術の改変型ＰＱＱＧＤＨの酵素活性について、実施例４と同様にしてグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を測定した。
【００７２】
代表的な結果として、９９ＧがＴＧＳＮＮで置き換えられている本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨと、９９Ｇの変異以外は同じ変異を有する対照ＰＱＱＧＤＨ、ならびに野生型ＰＱＱＧＤＨについて、４ｍＭまたは１０ｍＭグルコースに対する酵素活性、およびグルコースに対するマルトースの活性の比（％；マルトース４ｍＭ；グルコース４ｍＭあるいは１０ｍＭ：１０ｍＭ）を以下の表に示す。
【００７３】
【表２１】
【００７４】
上記の表に示されるように、本発明にしたがってＴＧＳＮＮの配列を挿入した改変型酵素の活性は、グルコースに対する酵素活性が上昇するかあるいは保たれていた。さらに、グルコースに対するマルトースの活性比は１／２から１／５の程度まで減少し、グルコースに対する選択性が向上した。例えば、Ｑ１９２ＧとＬ１９３Ｅとの二重変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨは、基質選択性が高まることがこれまでに報告されているが、この２つの変異だけでは、４ｍＭグルコースに対する活性は６．１Ｕ／ｍｇであり、４ｍＭグルコースに対する４ｍＭマルトースの活性比は９％であった。これに対して、さらにＴＧＳＮＮを挿入すると、４ｍＭグルコースに対する活性は１０．６３Ｕ／ｍｇと約１．７倍向上し、４ｍＭグルコースに対する４ｍＭマルトースの活性比は４．２％となり、２．１４倍基質特異性が向上した。
【００７５】
これらの結果から示されるように、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する高い酵素活性を有し、かつ、グルコースに対してマルトースと比較して高い基質選択性を有する。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、グルコース濃度の測定、特に血糖値の測定に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は，日本特許出願２００７−１６３８５８（２００７年６月２１日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
【０００２】
本発明はピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の製造、およびグルコースの定量におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。グルコース濃度の測定法の１つとして、ＰＱＱＧＤＨを用いる方法が既に実用化されている。
【０００４】
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する。ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であり、種々のグラム陰性菌において広く見いだされている。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはAcinetobacter calcoaceticusのいくつかの株においてその存在が確認されており、その構造遺伝子がクローニングされアミノ酸配列が明らかにされている（GenBank 受託番号X15871; Mol. Gen. Genet. (1989), 217: 430-436）。Acinetobacter calcoaceticus由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨのX線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が明らかとなった。（A.Oubrie et al., J. Mol. Biol., 289, 319-333(1999);A. Oubrie et al., The EMBO Journal, 18(19) 5187-5194 (1999); A. Oubrie et al. PNAS, 96(21), 11787-11791 (1999)）。また、Acinetobacter baumannii由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨも同定されている（GenBank 受託番号E28183）。
【０００５】
ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要としないことから、グルコースセンサーの認識素子をはじめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。しかしながらＰＱＱＧＤＨはグルコースに対する選択性が低いことが問題であった。特に、マルトースを含有する輸液を投与中の患者では、マルトースに対しても高い活性を示すＰＱＱＧＤＨを用いると正確な測定ができない。この場合、みかけの血糖値は実際の血糖値より高くなるため、その測定値を基に患者にインスリンが投与されて低血糖を起こすという危険がある。したがって、血糖値の測定用に使用する酵素としては、マルトースと比較してグルコースに対する選択性が高いＰＱＱＧＤＨが望ましい。
【０００６】
本発明者は、これまでに、グルコースに対する選択性が高められているいくつかの改変型ＰＱＱＧＤＨを報告してきたが（WO00/66744、特開2001-346587、WO2004/005499など）、さらに高い選択性および／または高い酵素活性を有する改変型ＰＱＱＧＤＨが求められている。
【０００７】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO00/66744
【特許文献２】特開2001-346587
【特許文献３】WO2004/005499
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Mol. Gen. Genet. (1989), 217:430-436
【非特許文献２】A. Oubrie, et al. (1999) J. Mol. Bio. , 289, 319-333
【非特許文献３】A. Oubrie, et al. (1999) The EMBO Journal, 18(19), 5187-5194
【非特許文献４】A. Oubrie, et al. (1999), PNAS 96(21), 11787-11791
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、グルコースに対する選択性が高い改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、水溶性ＰＱＱＧＤＨの特定の位置に所定の配列を有する４アミノ酸または５アミノ酸からなるペプチドフラグメントを挿入することにより、グルコースに対する選択性が高まることを見いだした。
【００１２】
本発明は、配列番号１で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の９９番目のアミノ酸残基Ｇ、または配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨの１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられており、かつ、配列番号１の１−９８番目のアミノ酸残基および１００−４７８番目のアミノ酸残基、または配列番号３の１−９９番目のアミノ酸残基および１０１−４８０番目のアミノ酸残基の１〜１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を提供する。本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素において、好ましくはＺはＳＸであり、特に好ましくはＺはＳＮである。
【００１３】
好ましくは、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素はさらに、以下のアミノ酸置換：
Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；
Ｌ１９３Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｅ２７７Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ａ３１８Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；
Ｇ４５１Ｃ；および
Ｎ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）
からなる群より選択される１またはそれ以上の変異をさらに含む。
【００１４】
別の観点においては、本発明は、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、ならびに該組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体を提供する。本発明はまた、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクターで形質転換した形質転換体を培養して、該培養物からピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素の製造方法を提供する。
【００１５】
さらに別の観点においては、本発明は、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキットを提供する。本発明はまた、本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素が装着されている酵素電極、ならびに該酵素電極を作用極として用いることを特徴とするグルコースセンサーを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素は、グルコースに対して高い選択性を示し、かつグルコースに対して高い酸化活性を有していることから、グルコースの高選択的かつ高感度の測定に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
改変型ＰＱＱＧＤＨの構造
本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素は、配列番号１で示される水溶性ＰＱＱＧＤＨの９９番目のアミノ酸残基Ｇまたは配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨの１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられていることを特徴とする。なお、本明細書においては、水溶性ＰＱＱＧＤＨのアミノ酸配列中のアミノ酸の位置は、開始メチオニンを１として番号付けする。
【００１９】
配列番号１で表されるＰＱＱＧＤＨは、Acinetobacter calcoaceticus由来のＰＱＱＧＤＨ（GenBank 受託番号X15871）であり、配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨは、Acinetobacter baumannii由来のＰＱＱＧＤＨ（GenBank 受託番号E28183）であり、これらはアミノ酸配列レベルで約92%のホモロジーを有している。２つの配列のアラインメントを下記に示す。
【００２０】
【表１】
これらの２つのＰＱＱＧＤＨは、類似する二次構造を有しており、対応するアミノ酸残基の置換により酵素の性質、例えば熱安定性や基質特異性が同様に変化することが知られている。
【００２１】
本発明の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素において、好ましくはＺはＳＸであり、特に好ましくはＺはＳＮである。すなわち、配列番号１の９９番目のアミノ酸残基Ｇまたは配列番号３の１００番目のアミノ酸残基Ｇの代わりに、アミノ酸配列：ＴＧＳＸＮ、好ましくはＴＧＳＮＮ、特に好ましくはＴＧＳＫＮ、ＴＧＳＲＮまたはＴＧＳＷＮが挿入されている。また好ましくは、このアミノ酸残基Ｇの代わりに、ＴＧＳＮまたはＴＧＮＮが挿入されている。
【００２２】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨと比較してグルコースに対して高い選択性を有する。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する反応性と比べて、マルトースに対する反応性が野生型より低下している。より好ましくは、グルコースに対する反応性を１００％とした場合、マルトースに対する活性が５０％以下であり、より好ましくは３０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、最も好ましくは１０％以下である。
【００２３】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１の９９番目または配列番号３の１００番目のアミノ酸残基の変異に加えて、さらに別の変異を有していてもよい。例えば、配列番号１の１−９８番目のアミノ酸残基および１００−４７８番目のアミノ酸残基の１またはそれ以上、または配列番号３の１−９９番目のアミノ酸残基および１０１−４８０番目のアミノ酸残基の１またはそれ以上、例えば１〜１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。
【００２４】
本発明の好ましい態様においては、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、
Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；
Ｌ１９３Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｅ２７７Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ａ３１８Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；
Ｇ４５１Ｃ；および
Ｎ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）
からなる群より選択される１またはそれ以上、好ましくは１〜１０個、例えば、１，２，３，４、５または６個の変異をさらに含む。なお、ここで例えば「Ｑ１９２Ｇ」との表記は、配列番号１の１９２番目のグルタミンまたはこれに対応する配列番号３の１９３番目のグルタミンがグリシンに置き換えられていることを表し、他の置換変異も同様にして表される。
【００２５】
本発明の特に好ましい態様は、以下のいずれかのアミノ酸の変異の組み合わせ：
G99(TGSXN)+Q192G+L193E；
G99(TGSXN)+Q192S+N452P；
G99(TGSXN)+Q192G+L193E+N452P；
G99(TGSXN)+Q192S+N452P；
G99(TGSNN)+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+N452P；
G99(TGSNN)+Q192S+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G+N452P；
G99(TGSNN)+L193E+N452P；
G99(TGSNN)+Q192S+L193M+N452P；
G99(TGSNN)+A318Y+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G；
G99(TGSNN)+Q192S；
G99(TGSNN)+Q192A；
G99(TGSNN)+Q192G+L193E；
G99(TGSNN)+Q192S+L193X；
G99(TGSNN)+Q192S+L193M；
G99(TGSNN)+Q192S+L193T；
G99(TGSNN)+Q192S+E277X；
G99(TGSNN)+Q192S+N452X；
G99(TGSNN)+Q192S+L193X+A318Y+N452P；
G99(TGSNN)+Q192S+A318X+N452P；
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+A318X+N452P；
G99(TGSKN)+Q192S+N452P；
G99(TGSRN)+Q192S+N452P；
G99(TGSWN)+Q192S+N452P；
G99(TGSN)+Q192S+N452P；
G99(TGSN)+Q192G+L193E；
G99(TGSN)+Q192S+L193M；
G99(TGNN)+Q192S+N452P；
G99(TGNN)+Q192G+L193E；または
G99(TGNN)+Q192S+L193M
を含む改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素である。上記式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、例えば、G99(TGSXN)とは、配列番号１で表されるＰＱＱＧＤＨにおいて９９番目のＧがＴＧＳＸＮで置き換えられていることを示す。
【００２６】
本発明の別の好ましい態様は、以下のいずれかのアミノ酸の変異の組み合わせ：
G99(TGSXN)+Q192G+L193E;
G99(TGSXN)+Q192S+N452P;
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+N452P;
G99(TGSNN)+Q192S+L193M+N452P;
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+A318K+N452P;または
G99(TGSNN)+Q192G+L193E+A318Q+N452P;
を含む改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素である。
【００２７】
１９２番目のグルタミン残基、１９３番目のロイシン残基および４５２番目のアスパラギン残基がＰＱＱＧＤＨによる基質の認識および結合に関与することは、WO04/005499に開示されている。しかし、一般的には、異なるドメインに存在するアミノ酸残基に同時に変異を導入することにより、基質の選択性や酵素活性がどのように変化するかについては、全く予測することができない。場合によっては、酵素活性が全く失われることもある。したがって、本発明において、これらのアミノ酸残基の置換と、配列番号１の９９番目のアミノ酸残基または配列番号３の１００番目のアミノ酸残基の挿入変異とを同時に導入することによりグルコースの選択性のさらなる向上が得られたことは、予測されないことであった。
【００２８】
改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法
Acinetobacter calcoaceticus 由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は配列番号２で、Acinetobacter baumannii由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の配列は配列番号４で規定される。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば下記の実施例に記載されるように、適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲを用いることができる。
【００２９】
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
【００３０】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨにおいては、所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野においてよく知られている。
【００３１】
上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、改変型ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現した改変型ＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを調製することができる。
【００３２】
酵素活性の測定方法
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒する作用を有する。酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨによるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱの量を酸化還元色素の呈色反応により定量することができる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、フェロセンなどを用いることができる。
【００３３】
グルコースに対する選択性
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースに対する選択性は、基質として、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノース、アロース、３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトース、キシロース、ラクトースおよびマルトース等の各種の糖を用いて上述のように酵素活性を測定し、グルコースを基質としたときの活性に対する相対活性を調べることにより評価することができる。
【００３４】
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型酵素と比較して、グルコースに対する選択性が向上しており、特にマルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する反応性が高い。したがって、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用いて作成されたアッセイキットあるいは酵素センサーはグルコース測定に関して選択性が高く、マルトースを含有する試料を用いた場合でも高感度でグルコースが検出できるという利点を有する。
【００３５】
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
【００３６】
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨをが装着されている酵素電極、ならびにこの酵素電極を用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【００３７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ2、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００３８】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子の構築
配列番号２に示されるAcinetobacter calcoaceticus由来水溶性ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、変異の導入を行った。簡単には、野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨ全長用のフォワード側のプライマーと変異導入領域のリバース側のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、一方で、全長用のリバース側のプライマーと変異導入領域のフォワード側のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、これらのＰＣＲ産物を混合して、全長用のフォワードプライマーおよびリバースのプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、変異が導入された全長ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を作製した。次に、シークエンシングにより目的とする変異が正しく導入されていることを確認した。
【００４１】
全長増幅用プライマーの配列は以下のとおりである：
フォワード：AACAGACCATGGATAAACATTTATTGGC（配列番号５）
リバース：ACAGCCAAGCTTTTACTTAGCCTTATAGG（配列番号６）
【００４２】
また、変異導入用のプライマー（Ｆ：フォワード、Ｒ：リバース）の配列は下記の表に示されるとおりである。
【００４３】
【表２】
【００４４】
その他の置換変異、例えば、Ｑ１９２Ｇ、Ｌ１９３Ｅなどの変異の導入は、WO00/66744に記載されているようにして、慣用の部位特異的変異導入法を用いて行った。また、複数の部位の変異を組み合わせて有する改変型ＰＱＱＧＤＨは、それぞれの変異に対応した複数のプライマーを用いる部位特異的変異導入法により、または制限酵素を利用した組換え法により作製した。
【００４５】
実施例２
改変型ＰＱＱＧＤＨの調製
野生型または上記のようにして調製した改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿入し、構築されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ含有）で３７℃で一晩振とう培養し、１ｍＭ ＣａＣｌ2、５００μＭＰＱＱを含む７ｌのＬ培地に植菌した。培養開始後約３時間でイソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭになるように添加し、その後１．５時間培養した。培養液から遠心分離（５０００×ｇ、１０分、４℃）で菌体を回収し、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）１５０μｌに懸濁した。体積の１／２〜２／３量のガラスビーズ（バクテリア用０．１０５〜０．１２５ｍｍ）を加え、４℃で２０分間ボルテックスした。各サンプルに１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）１ｍｌを加え、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）し、上清を回収した。これを粗精製酵素標品として以下の実施例において用いた。
【００４６】
実施例３
酵素活性の測定
実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素標品１００μｌに、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）＋１ｍＭ ＰＱＱ＋１ｍＭ ＣａＣｌ2ホロ化液９００μｌを加え、静置（室温、暗所、３０分以上）してホロ化を行った。１０倍希釈したホロ化済み酵素試液１５０μｌに、各濃度の基質（グルコースまたはマルトース）、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）０．６ｍＭ、ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールインドフェノール）０．３ｍＭ、いずれも終濃度）５０μｌを加え、計２００ｕｌで室温で反応させた。基質としては、グルコースおよびマルトースを、それぞれ終濃度０，１，２，４，１０，２０，４０ｍＭで用いた。ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ-1とした。蛋白質濃度は市販の蛋白質測定キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて測定した。
【００４７】
代表的な結果として、４ｍＭグルコースへの活性に対する４ｍＭマルトースへの活性の比（％）を以下の表に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
【表４】
【００５０】
【表５】
【００５１】
【表６】
【００５２】
【表７】
【００５３】
【表８】
【００５４】
【表９】
【００５５】
【表１０】
【００５６】
【表１１】
【００５７】
【表１２】
【００５８】
【表１３】
【００５９】
【表１４】
【００６０】
【表１５】
【００６１】
【表１６】
【００６２】
【表１７】
【００６３】
【表１８】
【００６４】
【表１９】
【００６５】
上記の表から明らかなように、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはいずれも、マルトースに対する反応性と比較してグルコースに対する高い反応性を示した。
【００６６】
実施例４
酵素センサーの作製および評価
５ユニットの本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨにカーボンペースト２０ｍｇを加えて凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０ｍＭリジンを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドをブロッキングした。この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。電極は４℃で保存した。
【００６７】
作製した酵素センサーを用いてグルコース濃度の測定を行った。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した酵素センサーを用いて、０．１ｍＭ−５ｍＭの範囲でグルコースの定量を行うことができた。
【００６８】
実施例５
精製酵素標品を用いた酵素活性の測定
実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素を、それぞれ１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用充填カラムＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社）に吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、７５０ｍｌで洗浄した後、０−０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０を用い、酵素を溶出させた。流速は５ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＧＤＨ活性を有する画分を回収し、１０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。このようにして電気泳動的に均一な改変型ＰＱＱＧＤＨ蛋白質を得た。得られた精製酵素標品について、実施例４と同様にしてグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を測定した。代表的な結果を以下の表に示す。
【００６９】
【表２０】
【００７０】
また、ＴＧＳＮＮ＋Ｑ１９２Ｇ＋Ｌ１９３Ｅ＋Ｎ４５２Ｐの変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨのグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を図１に示す。
【００７１】
実施例６
従来技術の改変型ＰＱＱＧＤＨとの比較
実施例２で得られた野生型および各改変型ＰＱＱＧＤＨの粗精製酵素、ならびに対照としてＰＱＱＧＤＨの９９番目のアミノ酸残基Ｇには変異が導入されていないが、他の位置で１または２以上のアミノ酸置換を有する従来技術の改変型ＰＱＱＧＤＨの酵素活性について、実施例４と同様にしてグルコースおよびマルトースに対する酵素活性を測定した。
【００７２】
代表的な結果として、９９ＧがＴＧＳＮＮで置き換えられている本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨと、９９Ｇの変異以外は同じ変異を有する対照ＰＱＱＧＤＨ、ならびに野生型ＰＱＱＧＤＨについて、４ｍＭまたは１０ｍＭグルコースに対する酵素活性、およびグルコースに対するマルトースの活性の比（％；マルトース４ｍＭ；グルコース４ｍＭあるいは１０ｍＭ：１０ｍＭ）を以下の表に示す。
【００７３】
【表２１】
【００７４】
上記の表に示されるように、本発明にしたがってＴＧＳＮＮの配列を挿入した改変型酵素の活性は、グルコースに対する酵素活性が上昇するかあるいは保たれていた。さらに、グルコースに対するマルトースの活性比は１／２から１／５の程度まで減少し、グルコースに対する選択性が向上した。例えば、Ｑ１９２ＧとＬ１９３Ｅとの二重変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨは、基質選択性が高まることがこれまでに報告されているが、この２つの変異だけでは、４ｍＭグルコースに対する活性は６．１Ｕ／ｍｇであり、４ｍＭグルコースに対する４ｍＭマルトースの活性比は９％であった。これに対して、さらにＴＧＳＮＮを挿入すると、４ｍＭグルコースに対する活性は１０．６３Ｕ／ｍｇと約１．７倍向上し、４ｍＭグルコースに対する４ｍＭマルトースの活性比は４．２％となり、２．１４倍基質特異性が向上した。
【００７５】
これらの結果から示されるように、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースに対する高い酵素活性を有し、かつ、グルコースに対してマルトースと比較して高い基質選択性を有する。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、グルコース濃度の測定、特に血糖値の測定に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の９９番目のアミノ酸残基Ｇ、または配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨの１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられており、かつ、配列番号１の１−９８番目のアミノ酸残基および１００−４７８番目のアミノ酸残基、または配列番号３の１−９９番目のアミノ酸残基および１０１−４８０番目のアミノ酸残基の１〜１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素であって、以下のアミノ酸置換：
Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；
Ｌ１９３Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｅ２７７Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ａ３１８Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；
Ｇ４５１Ｃ；および
Ｎ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）
からなる群より選択される１またはそれ以上の変異をさらに含む、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素。
【請求項２】
ＺがＳＸ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）である、請求項１記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素。
【請求項３】
ＺがＳＮである、請求項１記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素。
【請求項４】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養して、該培養物からピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするグルコース分析方法。
【請求項９】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキット。
【請求項１０】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素が装着されている酵素電極。
【請求項１１】
作用極として請求項１０に記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
【請求項１】
配列番号１で表されるピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の９９番目のアミノ酸残基Ｇ、または配列番号３で表されるＰＱＱＧＤＨの１００番目のアミノ酸残基Ｇが、アミノ酸配列：ＴＧＺＮ（式中、ＺはＳＸ、ＳまたはＮであり、Ｘは任意のアミノ酸残基である）で置き換えられており、かつ、配列番号１の１−９８番目のアミノ酸残基および１００−４７８番目のアミノ酸残基、または配列番号３の１−９９番目のアミノ酸残基および１０１−４８０番目のアミノ酸残基の１〜１０個が任意に他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素であって、以下のアミノ酸置換：
Ｑ１９２Ｇ、Ｑ１９２ＡまたはＱ１９２Ｓ；
Ｌ１９３Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｅ２７７Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ａ３１８Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）；
Ｙ３６７Ａ、Ｙ３６７ＦまたはＹ３６７Ｗ；
Ｇ４５１Ｃ；および
Ｎ４５２Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）
からなる群より選択される１またはそれ以上の変異をさらに含む、改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素。
【請求項２】
ＺがＳＸ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）である、請求項１記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素。
【請求項３】
ＺがＳＮである、請求項１記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素。
【請求項４】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養して、該培養物からピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を用いることを特徴とするグルコース分析方法。
【請求項９】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素を含むことを特徴とするグルコースのアッセイキット。
【請求項１０】
請求項１−３のいずれかに記載の改変型ピロロキノリンキノングルコース脱水素酵素が装着されている酵素電極。
【請求項１１】
作用極として請求項１０に記載の酵素電極を用いることを特徴とするグルコースセンサー。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２１０２１２（Ｐ２０１２−２１０２１２Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１２０７３８（Ｐ２０１２−１２０７３８）
【出願日】平成２４年５月２８日（２０１２．５．２８）
【分割の表示】特願２００９−５２０３４４（Ｐ２００９−５２０３４４）の分割
【原出願日】平成２０年６月２３日（２００８．６．２３）
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月２８日（２０１２．５．２８）
【分割の表示】特願２００９−５２０３４４（Ｐ２００９−５２０３４４）の分割
【原出願日】平成２０年６月２３日（２００８．６．２３）
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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