グルコース親和性タンパク質の精製方法
【課題】試料から、グルコース親和性タンパク質を選択的に精製する方法を提供する。
【解決手段】吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記パラハイドロキシアセトフェノンに、上記グルコース親和性タンパク質を結合させる第１ステップと、グルコースを含む第１溶液により、上記アフィニティカラムに結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得る第２ステップと、上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させる第３ステップと、を含む。
【解決手段】吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記パラハイドロキシアセトフェノンに、上記グルコース親和性タンパク質を結合させる第１ステップと、グルコースを含む第１溶液により、上記アフィニティカラムに結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得る第２ステップと、上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させる第３ステップと、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノン（ｐ−ＨＡＰ）が用いられたアフィニティクロマトグラフィーに基づき、グルコース親和性タンパク質を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、セファロース樹脂と共有結合したｐ−ＨＡＰ（ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）には、機能的には殆ど関連性のないタンパク質群との親和性が認められている。それらは、例えば、糖代謝（グリコーゲンフォスフォリラーゼ），薬物代謝（アルコール デヒドロゲナーゼ，アルデヒド デヒドロゲナーゼ，グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ），サイトカイン（マクロファージ遊走阻止因子），癌抑制遺伝子（プロテイン キナーゼ Ｃ インタラクティング プロテイン）などである。
【０００３】
上述されたｐ−ＨＡＰとタンパク質群との親和性に着目し、タンパク質を精製する方法が知られている。概要を以下に説明する。まず、タンパク質を含んだ試料に、ｐ−ＨＡＰを担体としたアフィニティクロマトグラフィーが適用される。担体と結合したタンパク質はｐ−ＨＡＰで溶出され、電気泳動で分離される。アフィニティクロマトグラフィーには、ＧｈｅｎｂｏｔとＷｅｉｎｅｒが提唱する方法により製造された、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムが使用される。この方法は、従来より、トランスフェラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はアルコールデヒドロゲナーゼなどの精製に利用されている（非特許文献１）。
【０００４】
また、タンパク質のうち、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の精製に特化した方法が知られている。この方法は、ＭＩＦとグルコースとの親和性に着目したものである。概要を以下に説明する。まず、マクロファージをグルタルアルデヒドで固定したマクロファージカラムを作成する。アフィニティクロマトグラフィーにより、細胞表面のＭＩＦ受容体にＭＩＦを結合させる。結合したＭＩＦを、グルコースで溶出させる（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｈｅｎｂｏｔ Ｇ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ Ｈ “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｂｙ ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ３：４７０−４７８， １９９２
【０００６】
【非特許文献２】Ｋｉｋｕｏ Ｏｎｏｚａｋｉ, Ｓｉｎｊｉ Ｈａｇａ, Ｋａｏｒｕ Ｍｉｕｒａ, ａｎｄ Ｔａｔｓｕｉｃｈｉｒｏ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ “Ｐａｒｔｉａｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕｉｎｅａ ＭＩＦ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ” Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ, Ｖｏｌ．２３（６）, ５３３−５４１, １９７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に記載されたｐ−ＨＡＰによる精製法において、担体と結合したタンパク質は、ｐ−ＨＡＰの溶液により溶出される。しかしながら、ｐ−ＨＡＰによる溶出では、特定の性質を持つタンパク質のみを選択的に溶出させることが困難であった。
【０００８】
また、非特許文献２に記載されたマクロファージによる精製法において、細胞を固定するためには、マクロファージの純化が必要であった。また、この方法では、ＭＩＦ以外のグルコース親和性のタンパク質を精製することはできなかった。カラムの再生や寿命についても、十分な検討がなされていなかった。
【０００９】
本発明は、前述された事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料から、グルコース親和性タンパク質を選択的に精製することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
(1) 本発明に係るグルコース親和性タンパク質の精製方法は、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記吸着剤に、上記グルコース親和性タンパク質を結合させる第１ステップと、グルコースを含む第１溶液により、上記吸着剤に結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得る第２ステップと、上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させる第３ステップと、を含む。
【００１１】
ｐ−ＨＡＰ親和性タンパク質として、アルデヒドを認識するアルデヒドロゲナーゼやアルコールデヒドロゲナーゼが確認されている。本発明は、オープンチェーン形式のブドウ糖が、水相に遊離アルデヒド基を有している点に着眼を得て為されたものである。本発明の発明者は、ｐ−ＨＡＰと結合したタンパク質には、グルコースによって溶出可能なものが存在することを新規に発見し、本発明を想到するに至った。
【００１２】
グルコース親和性タンパク質を含む試料が、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに適用されることで、吸着剤に、グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部が結合される。グルコースを含む第１溶液によって、吸着剤に結合したグルコース親和性タンパク質の少なくとも一部が分離される。こうして、少なくともグルコースとグルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液が得られる。得られた第２溶液から、グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部が分離される。この方法によるとタンパク質を含んだ試料から、グルコースに親和性を有するタンパク質だけを選択的に分離することが可能である。
【００１３】
(2) 上記第３ステップにおける上記グルコース親和性タンパク質の分離は、電気泳動によって行われてもよい。
【００１４】
(3) 上記吸着剤は、セファロース樹脂とパラハイドロキシアセトフェノンとの共有結合により構成されたものであってもよい。
【００１５】
(4) 上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織の一部を含んだものであってもよい。
【００１６】
試料に哺乳動物の臓器中の組織が使用されることで、哺乳動物の臓器中の組織からグルコース親和性タンパクを精製することが可能である。
【００１７】
(5) 上記グルコース親和性タンパク質が、グリコーゲン ホスホリラーゼ，アルコール デヒドロゲナーゼ，グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ，及びマクロファージ遊走阻止因子から成る群より選択されたものであってもよい。
【００１８】
(6) 上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織から遠心分離された細胞質基質を含むものであってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、試料から、グルコース親和性タンパク質を選択的に精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、試料Ａに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。
【図２】図２は、試料Ｂに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。
【図３】図３は、グルコースの添加量と、アルコール デヒドロゲナーゼ（Ａｌｃｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｚｅ（ＡＤＨ））の活性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本実施形態は、以下の第１から第３ステップを含むものである。各ステップについて以下に説明する。
【００２２】
本実施形態における第１ステップは、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノン（ｐ−ＨＡＰ）を含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記吸着剤に、上記グルコース親和性タンパク質を結合させるものである。
【００２３】
アフィニティカラムには、たとえば、ＧｈｅｎｂｏｔとＷｅｉｎｅｒによって提案されたｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ ６Ｂカラムが使用可能である。ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ ６Ｂカラムは、セファロース樹脂とｐ−ＨＡＰとが共有結合されたものを吸着剤（固定層）として含んでいる。
【００２４】
アフィニティカラムは、平衡化バッファによって平衡化される。平衡化バッファには、たとえば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びフェニルメチルスルフォニル フルオライド（ＰＭＳＦ）などを含んだ燐酸塩バッファが使用可能である。
【００２５】
グルコース親和性タンパク質を含む試料として、生物、特に哺乳動物の組織が使用されてもよい。哺乳動物の組織は、肝臓、心臓、又は脳などの臓器から取り出されたものであってもよく、たとえば、ラット肝臓やウマ肝臓（ＨＡＬＡＤ）が使用されてもよい。灌流や遠心分離などの処理を経て、臓器中の組織から細胞質基質が分離される。この細胞質基質を含んだ溶液が、試料として使用される。ただし、本実施形態の試料は、上記に限定されるものではなく、グルコース親和性タンパク質を含んだものであればよい。試料の他の一例として、食品、又はペットや家畜の餌などから精製されたものが挙げられる。
【００２６】
試料は、吸着剤のｐ−ＨＡＰが充填されたアフィニティカラムに適用される。この操作によって、試料に含まれるタンパク質のうち、ｐ−ＨＡＰと親和性を有するものがｐ−ＨＡＰと結合される。試料に哺乳動物の臓器が使用される場合、ここで結合されるタンパク質の一例として、たとえば、グリコーゲン ホスホリラーゼ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＰ））、アルコール デヒドロゲナーゼ（Ａｌｃｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｚｅ（ＡＤＨ））、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ））、マクロファージ遊走阻止因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｓｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ））、アルデヒド デヒドロゲナーゼ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ））、アデノシン キナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＡＫ））、又はプロテイン キナーゼ Ｃ インタラクティング プロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｚｅ Ｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＫＣＩ））などが挙げられる。
【００２７】
本実施形態における第２ステップは、グルコースを含む第１溶液により、上記吸着剤に結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得るものである。
【００２８】
ここで、グルコースを含む第１溶液とは、たとえばカラムの平衡化に使用される平衡化バッファにグルコースが混合されたものである。
【００２９】
まず、アフィニティカラムは、平衡化バッファによって洗浄される。これにより、アフィニティカラムに付着した試料が洗い流される。続けて、移動相としての第１溶液がアフィニティカラムに通液される。このとき、固定層のｐ−ＨＡＰからタンパク質が分離され、移動相と共に流出する。このときに流出する液体が第２溶液である。
【００３０】
ここで分離されるタンパク質は、ｐ−ＨＡＰと結合していたもののうち、グルコースと親和性を有するものである。一例として、ＧＰ、ＡＤＨ、ＧＳＴ、及びＭＩＦなどが挙げられる。
【００３１】
本実施形態における第３ステップは、上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させるものである。
【００３２】
第２溶液からのグルコース親和性タンパク質の分離には、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動が使用可能であり、好適には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が使用される。ただし、グルコース親和性タンパク質の分離にはこれとは異なる方法が用いられてもよい。
【００３３】
まず、第２溶液に含まれる分離されたアリコットが集められて、たとえば限外濾過セルによって濃縮される。濃縮された画分は、ＳＤＳのサンプルバッファに溶かされて、調整される。詳細には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びヨードアセトアミドが用いられて、カルボキシメチル化が行われる。これにより、タンパク質の鎖内ジスルフィド結合が分断される。また、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によって溶液のｐＨが調整される。
【００３４】
調整された溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者が任意の方法によって行うことができるものであるが、一般的な方法を以下に説明する。
【００３５】
溶液は、たとえばゲル中に添加される。ゲルに電位差が与えられて、電荷を有したタンパク質はゲル中を移動させられる。タンパク質の分子量が大きいほど、移動抵抗が大きくなる。したがって、分子量が小さいタンパク質ほど多くの距離を移動する。これにより、タンパク質の分子量に応じた複数のバンドがゲルに発生する。発生したバンドは、分子量マーカーなどを用いて染色されてもよい。以上の手順によって、グルコース親和性タンパク質が試料から選択的に分離される。
【実施例】
【００３６】
実施形態の実施例を以下に説明する。本実施例においては、試料として、ラット肝臓から採取された細胞質基質、及び、ウマ肝臓アルコール脱水素酵素（ＨＬＡＤＨ）がそれぞれ使用される。
【００３７】
［材料］
全ての化学物質は試薬グレードのものである。 エポキシ活性のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０カラムは、アマーシャム ファルマシア バイオテクノロジー社から購入されたものである。ｐ−ＨＡＰとグルコースは和光Ｐｕｒｅケミカル社から購入されたものである。ウマ肝臓アルコール脱水素酵素（ＨＬＡＤＨ）はシグマ社から購入されたものである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための分子重量マーカーは、バイオ ラッド ラボラトリーズ社から購入されたものである。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、ベーリンガー マンハイム社から購入されたものである。限界濾過の材料（ａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｐｕｌｕｓ ＹＭ１０）はミリポア社から購入されたものである。
【００３８】
［試料の準備］
雄ウィスターラットは、ナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）による麻酔状態で断頭された。肝臓は解剖されて、すぐに、冷却されたリン酸緩衝生理食塩水で灌流された。肝臓は、冷却された溶液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、０．２５Mの蔗糖(ｐＨ７．２)、２ｍＭの2メルカプトエタノール、及び１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む）によって均質化され、７００ｘｇにおいて１０分間遠心分離された。画分は、ミトコンドリアを取り除くために、７，０００ｘｇにおいて１０分間遠心分離され、続けて、マイクロソームの汚染の可能性を排除するために１０５，０００ｘｇにおいて１時間遠心分離された。結果として、細胞質基質の画分（試料Ａとする）が得られた。また、ＨＬＡＤＨは１０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）によって溶かされた（試料Ｂとする）。これらの操作はすべて４℃において実行された。試料Ａ，Ｂは、それぞれ後述するアフィニティクロマトグラフィーに使用される。
【００３９】
［アフィニティクロマトグラフィー］
非特許文献１に記載のＧｈｅｎｂｏｔとＷｅｉｎｅｒによって説明された方法によって、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムが準備された。ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムは公知なものであるため、製造手順の一例を簡単に説明する。
【００４０】
エポキシ活性のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂの乾燥粉末１ｇをグラスフイルター（Ｇ３）上で膨潤し、３．０ｍｌのゲルを得る。ゲルを２００ｍｌ／ｇの蒸留水によって洗浄する。カップリング溶液にリガンド（ｐ−ＨＡＰ）を溶解させる。得られたゲル懸濁液とリガンド溶液とを混合し、２５〜４０℃において１６時間、ウオーターバス中のシェーカー内で反応に供する。
【００４１】
ゲルを、カップリング溶液についで、蒸留水、重炭酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）、及び酢酸水溶液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）によって洗浄する。続けて、１Ｍのエタノールアミンに、４０〜５０℃において一晩放置し、活性基をブロックする。得られたｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合体を充填し、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムを得る。
【００４２】
上記方法によって、カラムは、試料Ａ，Ｂの実験のためにそれぞれ複数が準備された。カラムは、それぞれ、０．１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭの エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５０ｍＭの 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及び１ｍＭのフェニルメチルスルフォニル フルオライド（ＰＭＳＦ）を含んだ２０ｍＭの燐酸塩バッファ(ｐＨ７．４)によって平衡された。
【００４３】
試料Ａ，Ｂの硫安沈殿（ｐｏｓｔ−ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ （７０％） ｐｒｅｓｉｐｉｔａｎｔ）が、それぞれカラムに適用された。この操作が、本発明の第１ステップに相当する。なお、試料Ａ，Ｂのカラムは、異なる溶出液によって溶出の実験を行うためにそれぞれ複数が準備された。
【００４４】
カラムは、4カラム体積の平衡化バッファによって、それぞれ洗浄された。続けて、カラムと結びついたタンパク質は、流出量がそれぞれ０．５ｍｌ／ｍｉｎであり、グルコースを含む２カラム体積の平衡化バッファの通液により溶出された。試料Ａのカラムには１ｍＭ，１０ｍＭのグルコースを含む平衡化バッファ（それぞれ解離液Ａ，Ｂとする）がそれぞれ通液された。試料Ｂのカラムには１０ｍＭ，５０ｍＭ，２５０ｍＭのグルコースを含む平衡化バッファ（それぞれ解離液Ｃ，Ｄ，Ｅとする。本発明の第１溶液に相当）がそれぞれ通液された。また、比較例として、試料Ａ，試料Ｂのカラムには、それぞれ１０ｍＭのｐ−ＨＡＰを含む２カラム体積の平衡化バッファ（解離液Ｆとする）が通液された。ここで、グルコースを含む平衡化バッファをカラムに通液する操作が、本発明の第２ステップに相当する。
【００４５】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
カラムから流出する溶液（本発明の第２溶液に相当）に含まれる画分のアリコットはそれぞれプールされ、限外濾過セルの中で濃縮された。濃縮サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用される。濃縮サンプルは、ＳＤＳのサンプルバッファ（０．６２５Mの Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、5％の2−メルカプトエタノール、及び０．０１％のブロモフェノールブルー）に溶かされ、４００ｍＭのジチオスレイトールと共に、３７℃において２時間の間、１／１０の体積まで減らされた。次に、８００ｍＭのヨードアセトアミドが同体積のジチオスレイトールと共に添加され、カルボキシメチル化が３７℃において２時間行われた。水酸化ナトリウムにより、溶液のｐＨが６．８に調整された後、溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。ゲルはタンパク質染色色素で染色された。ここで、カラムから流出する溶液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う一連の操作が本発明の第３ステップに相当する。
【００４６】
図１は、試料Ａに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。縦軸は、統一原子質量単位（ｋＤａ）を示している。レーン１は、試料Ａとして用いられるラット肝臓の細胞質基質から得られたものである。レーン２は、硫安沈殿された後のラット肝臓の細胞質基質から得られたものである。レーン３は、試料Ａのカラムの洗浄された画分から得られたものである。レーン４は、試料Ａのカラムに通液された解離液Ａ（１ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン５、試料Ａのカラムに通液された解離液Ｂ（１０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン６は試料Ａのカラムに通液された解離液Ｆ（１０ｍＭのｐ−ＨＡＰを含む）から得られたものである。
【００４７】
レーン３が示すように、洗浄された画分からは、バンドは検出されなかった。これは、カラムが十分に洗浄され、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合しているもの以外のタンパク質がカラムに存在しないことを意味している。レーン４は、カラムから溶出したタンパク質の4つの主要なバンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したことを示している。レーン４が示すように、９４ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａ，１０ｋＤａの分子重量の4つのポリペプチドが、１ｍＭのグルコースによって同時に溶出した。９４ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａのポリペプチドは、１０ｋＤａのポリペプチドよりも容易に検出された。２５ｋＤａのポリペプチドは、レーン４に検出されたすべてのポリペプチドの中で最も効果的に溶出した。
【００４８】
レーン５は、９４ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａ，１０ｋＤａの分子重量の4つのポリペプチドが、１０ｍＭのグルコースによって同時に溶出したことを示している。レーン５は、レーン４と類似しているが、レーン４よりもパターンがわずかに弱く検出されている。レーン６は、９４ｋＤａ，５４ｋＤａ，４３ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａ，１４ｋＤａのポリペプチドが、ｐ−ＨＡＰによって同時に溶出したことを示している。３９ｋＤａのポリペプチドは、レーン６に検出されたすべてのポリペプチドの中で最も効果的に溶出した。
【００４９】
図２は、試料Ｂに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。縦軸は、統一原子質量単位（ｋＤａ）を示している。レーン１は、３７ｋＤａのリコンビナント合成ポリペプチドの分子量マーカーから得られたものである。レーン2は、矢印Ａ１に示されるように、商用のウマ肝臓アルコール脱水素酵素（ＨＬＡＤＨ）から得られたものである。レーン３は、試料Ｂを通液した際にカラムから流出した画分から得られたものである。レーン４は、試料Ｂのカラムの洗浄された画分から得られたものである。レーン５は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｃ（１０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン６は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｄ（５０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン７は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｅ（２５０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン８は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｆ（１０ｍＭのｐ−ＨＡＰを含む）から得られたものである。
【００５０】
レーン３に検出されたバンドは、カラムに過剰の試料Ｂが通液されたため、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合せずに流出したＨＬＡＤＨである。レーン４が示すように、洗浄された画分からはＨＬＡＤＨのバンドが検出されなかった。これは、カラムが十分に洗浄され、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合しているもの以外のタンパク質がカラムに存在しないことを意味している。レーン５〜８が示すように、３つの異なった濃度（１０ｍＭ，５０ｍＭ，２５０ｍＭ）のグルコースと１０ｍＭのｐ−ＨＡＰとが、カラムからＨＬＡＤＨを溶出させることに成功した。つまり、ＨＬＡＤＨは、テストされたすべての解離液において、効果的に溶出した。
【００５１】
[タンパク質配列の特定]
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルの染色された各部分は脱染色の後に切除されて、エッペンドルフチューブに移された。 それぞれの切除されたゲルは、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）及びアセトニトリルの混合液（１：１）によって3回濯がれた後、乾かされた。 次に、ゲルは、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０，３７℃）中で、アクロモバクターによるＬｙｓ特異的な蛋白酵素により１２時間の間処理された。ペプチド画分の混合物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（アマーシャム ファルマシア バイオテクノロジー社のＳＭＡＲＴ ＳＹＳＴＥＭ）を使用して、分離された。μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０カラム(３ｘｍｍ，２５０ｘｍｍ)が使用されて、０．０６０−０．０５５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中でアセトニトリルの濃度勾配が適用された。カラムは、アセトニトリル水溶液(８４％のアセトニトリル，０．００５％のトリフルオロ酢酸)の直線的な濃度勾配において変化を示した。流速は０．１ｍｌ／ｍｉｎであった。ＵＶ吸収は２１４ｎＭでモニターされた。これらの条件は、アマーシャム ファルマシア バイオテクノロジー社の解説に従って決定された。
【００５２】
それぞれのペプチド画分に関するマッピングの後に、３個の画分(１４ｋＤａからの1個と１０ｋＤａからの2個)が２つのタンパク質のアミノ酸配列を特定するために選択された。ＡＢＩ ４４７Ａシーケンサ(アプライド バイオシステムス社)が使用されて、配列の解読が行われた。それぞれの配列は、ゲノムネットのデータベースを使用したデータバンクから得られたタンパク質の配列と比較された。
【００５３】
３個の画分の推定アミノ酸配列の分析結果が表１に示される。データバンクの検索によって、ペプチドＡ１のアミノ酸残基の配列がラットのＰＫＣＩの部分的なアミノ酸配列（７−１６）と同じであることが示された。また、ペプチドＢ１の6つのアミノ酸残基とペプチドＢ２の8つのアミノ酸残基は、ラットのＭＩＦの部分的なアミノ酸配列（それぞれ３３−３８，４５−５５）と同じであった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
［グルコースによるＨＬＡＤＨの活性の減少］
続けて、ＨＬＡＤＨによるエタノールの酸化に対するグルコースの効果がテストされた。予備実験では、５００ｍＭまでのグルコースは、ＡＤＨの反応に関するアッセイバッファを含んだ１００ｍＭの燐酸塩(ｐＨ７．５)のｐＨに影響しなかった。そして、アッセイ溶液中のＮＡＤＨの生産は溶液へのエタノールの追加の前には観測されなった。したがって、５００ｍＭ以下の濃度のグルコースが本実験で使用された。グルコースは、エタノールが存在しないときにも、ＡＤＨによるＮＡＤ−ＮＡＤＨ反応を引き起こさなかった。
【００５６】
図３は、ＨＬＡＤＡの相対的な活性がグルコースの存在によって抑制されたことを示している。横軸はグルコースの添加量（ｍｌ）、縦軸は、グルコースの添加量０ｍｌを基準とした、ＨＬＡＤＡの相対的な活性（％）をそれぞれ示している。グルコース（２５０ｍＭ，５００ｍＭ）は、ＨＬＡＤＨの酵素の活性（ｐ＜０．０１）を濃度依存的に、大幅に減少させた。２５０ｍＭ，５００ｍＭの濃度のグルコースによるインキュベーションは、本来のＨＬＡＤＨの活性を９３．２±１．５％，８０．７±１．２％まで、それぞれ相対的に減少させた。
【００５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンド及びタンパク質配列の特定の結果より、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ樹脂が肝臓中のＰＫＣＩ及びＭＩＦと結合することが示された。また、グルコースが、ラット肝臓のＭＩＦと親和性を有することが示された。また、グルコースが、ラットＡＤＨ及びＨＬＡＤＨと親和性を有することが示された。
【００５８】
一方、図１のレーン４，５にＡＫ、ＡＬＤＨ、ＰＫＣＩに対応する分子重量のバンドが検出されなかったことから、グルコースは、ＡＫ、及び細胞質基質のＡＬＤＨ，ＰＫＣＩとの親和性を有さないことが示された。この相違は、グルコースとの親和性の有無に応じて、ｐ−ＨＡＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合するタンパク質が2つのグループに分類されることを示している。ｐ−ＨＡＰ親和性タンパク質の分類が表２に示される。
【００５９】
【表２】
【００６０】
また、本実施例の結果より、グルコースの添加量に依存して、ＨＬＡＤＨの活性が阻害されることが示された。
【００６１】
[実施形態の作用効果]
本実施形態によると、タンパク質を含んだ試料から、グルコース親和性のタンパク質だけを選択的に精製することが可能である。したがって、患者の体組織からグルコース親和性のタンパク質を同定し、糖尿病の予防や治療に有用な情報を得ることができる。
【００６２】
また、哺乳動物の臓器中の組織からグルコース親和性タンパクを容易に精製することが可能である。
【００６３】
また、食品、又はペットや家畜の餌などからグルコース親和性のタンパク質を同定することで、当該食品又は餌が健康に与える影響を分析することができる。
【符号の説明】
【００６４】
Ｙ１・・・矢印
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノン（ｐ−ＨＡＰ）が用いられたアフィニティクロマトグラフィーに基づき、グルコース親和性タンパク質を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、セファロース樹脂と共有結合したｐ−ＨＡＰ（ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）には、機能的には殆ど関連性のないタンパク質群との親和性が認められている。それらは、例えば、糖代謝（グリコーゲンフォスフォリラーゼ），薬物代謝（アルコール デヒドロゲナーゼ，アルデヒド デヒドロゲナーゼ，グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ），サイトカイン（マクロファージ遊走阻止因子），癌抑制遺伝子（プロテイン キナーゼ Ｃ インタラクティング プロテイン）などである。
【０００３】
上述されたｐ−ＨＡＰとタンパク質群との親和性に着目し、タンパク質を精製する方法が知られている。概要を以下に説明する。まず、タンパク質を含んだ試料に、ｐ−ＨＡＰを担体としたアフィニティクロマトグラフィーが適用される。担体と結合したタンパク質はｐ−ＨＡＰで溶出され、電気泳動で分離される。アフィニティクロマトグラフィーには、ＧｈｅｎｂｏｔとＷｅｉｎｅｒが提唱する方法により製造された、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムが使用される。この方法は、従来より、トランスフェラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はアルコールデヒドロゲナーゼなどの精製に利用されている（非特許文献１）。
【０００４】
また、タンパク質のうち、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の精製に特化した方法が知られている。この方法は、ＭＩＦとグルコースとの親和性に着目したものである。概要を以下に説明する。まず、マクロファージをグルタルアルデヒドで固定したマクロファージカラムを作成する。アフィニティクロマトグラフィーにより、細胞表面のＭＩＦ受容体にＭＩＦを結合させる。結合したＭＩＦを、グルコースで溶出させる（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｈｅｎｂｏｔ Ｇ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ Ｈ “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｂｙ ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｅｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍａｔｒｉｘ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ３：４７０−４７８， １９９２
【０００６】
【非特許文献２】Ｋｉｋｕｏ Ｏｎｏｚａｋｉ, Ｓｉｎｊｉ Ｈａｇａ, Ｋａｏｒｕ Ｍｉｕｒａ, ａｎｄ Ｔａｔｓｕｉｃｈｉｒｏ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ “Ｐａｒｔｉａｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕｉｎｅａ ＭＩＦ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ” Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ, Ｖｏｌ．２３（６）, ５３３−５４１, １９７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に記載されたｐ−ＨＡＰによる精製法において、担体と結合したタンパク質は、ｐ−ＨＡＰの溶液により溶出される。しかしながら、ｐ−ＨＡＰによる溶出では、特定の性質を持つタンパク質のみを選択的に溶出させることが困難であった。
【０００８】
また、非特許文献２に記載されたマクロファージによる精製法において、細胞を固定するためには、マクロファージの純化が必要であった。また、この方法では、ＭＩＦ以外のグルコース親和性のタンパク質を精製することはできなかった。カラムの再生や寿命についても、十分な検討がなされていなかった。
【０００９】
本発明は、前述された事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料から、グルコース親和性タンパク質を選択的に精製することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
(1) 本発明に係るグルコース親和性タンパク質の精製方法は、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記吸着剤に、上記グルコース親和性タンパク質を結合させる第１ステップと、グルコースを含む第１溶液により、上記吸着剤に結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得る第２ステップと、上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させる第３ステップと、を含む。
【００１１】
ｐ−ＨＡＰ親和性タンパク質として、アルデヒドを認識するアルデヒドロゲナーゼやアルコールデヒドロゲナーゼが確認されている。本発明は、オープンチェーン形式のブドウ糖が、水相に遊離アルデヒド基を有している点に着眼を得て為されたものである。本発明の発明者は、ｐ−ＨＡＰと結合したタンパク質には、グルコースによって溶出可能なものが存在することを新規に発見し、本発明を想到するに至った。
【００１２】
グルコース親和性タンパク質を含む試料が、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに適用されることで、吸着剤に、グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部が結合される。グルコースを含む第１溶液によって、吸着剤に結合したグルコース親和性タンパク質の少なくとも一部が分離される。こうして、少なくともグルコースとグルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液が得られる。得られた第２溶液から、グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部が分離される。この方法によるとタンパク質を含んだ試料から、グルコースに親和性を有するタンパク質だけを選択的に分離することが可能である。
【００１３】
(2) 上記第３ステップにおける上記グルコース親和性タンパク質の分離は、電気泳動によって行われてもよい。
【００１４】
(3) 上記吸着剤は、セファロース樹脂とパラハイドロキシアセトフェノンとの共有結合により構成されたものであってもよい。
【００１５】
(4) 上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織の一部を含んだものであってもよい。
【００１６】
試料に哺乳動物の臓器中の組織が使用されることで、哺乳動物の臓器中の組織からグルコース親和性タンパクを精製することが可能である。
【００１７】
(5) 上記グルコース親和性タンパク質が、グリコーゲン ホスホリラーゼ，アルコール デヒドロゲナーゼ，グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ，及びマクロファージ遊走阻止因子から成る群より選択されたものであってもよい。
【００１８】
(6) 上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織から遠心分離された細胞質基質を含むものであってもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、試料から、グルコース親和性タンパク質を選択的に精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、試料Ａに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。
【図２】図２は、試料Ｂに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。
【図３】図３は、グルコースの添加量と、アルコール デヒドロゲナーゼ（Ａｌｃｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｚｅ（ＡＤＨ））の活性との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本実施形態は、以下の第１から第３ステップを含むものである。各ステップについて以下に説明する。
【００２２】
本実施形態における第１ステップは、吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノン（ｐ−ＨＡＰ）を含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記吸着剤に、上記グルコース親和性タンパク質を結合させるものである。
【００２３】
アフィニティカラムには、たとえば、ＧｈｅｎｂｏｔとＷｅｉｎｅｒによって提案されたｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ ６Ｂカラムが使用可能である。ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ ６Ｂカラムは、セファロース樹脂とｐ−ＨＡＰとが共有結合されたものを吸着剤（固定層）として含んでいる。
【００２４】
アフィニティカラムは、平衡化バッファによって平衡化される。平衡化バッファには、たとえば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びフェニルメチルスルフォニル フルオライド（ＰＭＳＦ）などを含んだ燐酸塩バッファが使用可能である。
【００２５】
グルコース親和性タンパク質を含む試料として、生物、特に哺乳動物の組織が使用されてもよい。哺乳動物の組織は、肝臓、心臓、又は脳などの臓器から取り出されたものであってもよく、たとえば、ラット肝臓やウマ肝臓（ＨＡＬＡＤ）が使用されてもよい。灌流や遠心分離などの処理を経て、臓器中の組織から細胞質基質が分離される。この細胞質基質を含んだ溶液が、試料として使用される。ただし、本実施形態の試料は、上記に限定されるものではなく、グルコース親和性タンパク質を含んだものであればよい。試料の他の一例として、食品、又はペットや家畜の餌などから精製されたものが挙げられる。
【００２６】
試料は、吸着剤のｐ−ＨＡＰが充填されたアフィニティカラムに適用される。この操作によって、試料に含まれるタンパク質のうち、ｐ−ＨＡＰと親和性を有するものがｐ−ＨＡＰと結合される。試料に哺乳動物の臓器が使用される場合、ここで結合されるタンパク質の一例として、たとえば、グリコーゲン ホスホリラーゼ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＰ））、アルコール デヒドロゲナーゼ（Ａｌｃｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｚｅ（ＡＤＨ））、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ））、マクロファージ遊走阻止因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｓｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ））、アルデヒド デヒドロゲナーゼ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡＬＤＨ））、アデノシン キナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ（ＡＫ））、又はプロテイン キナーゼ Ｃ インタラクティング プロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｚｅ Ｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＫＣＩ））などが挙げられる。
【００２７】
本実施形態における第２ステップは、グルコースを含む第１溶液により、上記吸着剤に結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得るものである。
【００２８】
ここで、グルコースを含む第１溶液とは、たとえばカラムの平衡化に使用される平衡化バッファにグルコースが混合されたものである。
【００２９】
まず、アフィニティカラムは、平衡化バッファによって洗浄される。これにより、アフィニティカラムに付着した試料が洗い流される。続けて、移動相としての第１溶液がアフィニティカラムに通液される。このとき、固定層のｐ−ＨＡＰからタンパク質が分離され、移動相と共に流出する。このときに流出する液体が第２溶液である。
【００３０】
ここで分離されるタンパク質は、ｐ−ＨＡＰと結合していたもののうち、グルコースと親和性を有するものである。一例として、ＧＰ、ＡＤＨ、ＧＳＴ、及びＭＩＦなどが挙げられる。
【００３１】
本実施形態における第３ステップは、上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させるものである。
【００３２】
第２溶液からのグルコース親和性タンパク質の分離には、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動が使用可能であり、好適には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が使用される。ただし、グルコース親和性タンパク質の分離にはこれとは異なる方法が用いられてもよい。
【００３３】
まず、第２溶液に含まれる分離されたアリコットが集められて、たとえば限外濾過セルによって濃縮される。濃縮された画分は、ＳＤＳのサンプルバッファに溶かされて、調整される。詳細には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びヨードアセトアミドが用いられて、カルボキシメチル化が行われる。これにより、タンパク質の鎖内ジスルフィド結合が分断される。また、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）によって溶液のｐＨが調整される。
【００３４】
調整された溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは当業者が任意の方法によって行うことができるものであるが、一般的な方法を以下に説明する。
【００３５】
溶液は、たとえばゲル中に添加される。ゲルに電位差が与えられて、電荷を有したタンパク質はゲル中を移動させられる。タンパク質の分子量が大きいほど、移動抵抗が大きくなる。したがって、分子量が小さいタンパク質ほど多くの距離を移動する。これにより、タンパク質の分子量に応じた複数のバンドがゲルに発生する。発生したバンドは、分子量マーカーなどを用いて染色されてもよい。以上の手順によって、グルコース親和性タンパク質が試料から選択的に分離される。
【実施例】
【００３６】
実施形態の実施例を以下に説明する。本実施例においては、試料として、ラット肝臓から採取された細胞質基質、及び、ウマ肝臓アルコール脱水素酵素（ＨＬＡＤＨ）がそれぞれ使用される。
【００３７】
［材料］
全ての化学物質は試薬グレードのものである。 エポキシ活性のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ、μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０カラムは、アマーシャム ファルマシア バイオテクノロジー社から購入されたものである。ｐ−ＨＡＰとグルコースは和光Ｐｕｒｅケミカル社から購入されたものである。ウマ肝臓アルコール脱水素酵素（ＨＬＡＤＨ）はシグマ社から購入されたものである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための分子重量マーカーは、バイオ ラッド ラボラトリーズ社から購入されたものである。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、ベーリンガー マンハイム社から購入されたものである。限界濾過の材料（ａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｐｕｌｕｓ ＹＭ１０）はミリポア社から購入されたものである。
【００３８】
［試料の準備］
雄ウィスターラットは、ナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）による麻酔状態で断頭された。肝臓は解剖されて、すぐに、冷却されたリン酸緩衝生理食塩水で灌流された。肝臓は、冷却された溶液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、０．２５Mの蔗糖(ｐＨ７．２)、２ｍＭの2メルカプトエタノール、及び１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む）によって均質化され、７００ｘｇにおいて１０分間遠心分離された。画分は、ミトコンドリアを取り除くために、７，０００ｘｇにおいて１０分間遠心分離され、続けて、マイクロソームの汚染の可能性を排除するために１０５，０００ｘｇにおいて１時間遠心分離された。結果として、細胞質基質の画分（試料Ａとする）が得られた。また、ＨＬＡＤＨは１０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）によって溶かされた（試料Ｂとする）。これらの操作はすべて４℃において実行された。試料Ａ，Ｂは、それぞれ後述するアフィニティクロマトグラフィーに使用される。
【００３９】
［アフィニティクロマトグラフィー］
非特許文献１に記載のＧｈｅｎｂｏｔとＷｅｉｎｅｒによって説明された方法によって、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムが準備された。ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムは公知なものであるため、製造手順の一例を簡単に説明する。
【００４０】
エポキシ活性のＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂの乾燥粉末１ｇをグラスフイルター（Ｇ３）上で膨潤し、３．０ｍｌのゲルを得る。ゲルを２００ｍｌ／ｇの蒸留水によって洗浄する。カップリング溶液にリガンド（ｐ−ＨＡＰ）を溶解させる。得られたゲル懸濁液とリガンド溶液とを混合し、２５〜４０℃において１６時間、ウオーターバス中のシェーカー内で反応に供する。
【００４１】
ゲルを、カップリング溶液についで、蒸留水、重炭酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）、及び酢酸水溶液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）によって洗浄する。続けて、１Ｍのエタノールアミンに、４０〜５０℃において一晩放置し、活性基をブロックする。得られたｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合体を充填し、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂカラムを得る。
【００４２】
上記方法によって、カラムは、試料Ａ，Ｂの実験のためにそれぞれ複数が準備された。カラムは、それぞれ、０．１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭの エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５０ｍＭの 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及び１ｍＭのフェニルメチルスルフォニル フルオライド（ＰＭＳＦ）を含んだ２０ｍＭの燐酸塩バッファ(ｐＨ７．４)によって平衡された。
【００４３】
試料Ａ，Ｂの硫安沈殿（ｐｏｓｔ−ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ （７０％） ｐｒｅｓｉｐｉｔａｎｔ）が、それぞれカラムに適用された。この操作が、本発明の第１ステップに相当する。なお、試料Ａ，Ｂのカラムは、異なる溶出液によって溶出の実験を行うためにそれぞれ複数が準備された。
【００４４】
カラムは、4カラム体積の平衡化バッファによって、それぞれ洗浄された。続けて、カラムと結びついたタンパク質は、流出量がそれぞれ０．５ｍｌ／ｍｉｎであり、グルコースを含む２カラム体積の平衡化バッファの通液により溶出された。試料Ａのカラムには１ｍＭ，１０ｍＭのグルコースを含む平衡化バッファ（それぞれ解離液Ａ，Ｂとする）がそれぞれ通液された。試料Ｂのカラムには１０ｍＭ，５０ｍＭ，２５０ｍＭのグルコースを含む平衡化バッファ（それぞれ解離液Ｃ，Ｄ，Ｅとする。本発明の第１溶液に相当）がそれぞれ通液された。また、比較例として、試料Ａ，試料Ｂのカラムには、それぞれ１０ｍＭのｐ−ＨＡＰを含む２カラム体積の平衡化バッファ（解離液Ｆとする）が通液された。ここで、グルコースを含む平衡化バッファをカラムに通液する操作が、本発明の第２ステップに相当する。
【００４５】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
カラムから流出する溶液（本発明の第２溶液に相当）に含まれる画分のアリコットはそれぞれプールされ、限外濾過セルの中で濃縮された。濃縮サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用される。濃縮サンプルは、ＳＤＳのサンプルバッファ（０．６２５Mの Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、5％の2−メルカプトエタノール、及び０．０１％のブロモフェノールブルー）に溶かされ、４００ｍＭのジチオスレイトールと共に、３７℃において２時間の間、１／１０の体積まで減らされた。次に、８００ｍＭのヨードアセトアミドが同体積のジチオスレイトールと共に添加され、カルボキシメチル化が３７℃において２時間行われた。水酸化ナトリウムにより、溶液のｐＨが６．８に調整された後、溶液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた。ゲルはタンパク質染色色素で染色された。ここで、カラムから流出する溶液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う一連の操作が本発明の第３ステップに相当する。
【００４６】
図１は、試料Ａに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。縦軸は、統一原子質量単位（ｋＤａ）を示している。レーン１は、試料Ａとして用いられるラット肝臓の細胞質基質から得られたものである。レーン２は、硫安沈殿された後のラット肝臓の細胞質基質から得られたものである。レーン３は、試料Ａのカラムの洗浄された画分から得られたものである。レーン４は、試料Ａのカラムに通液された解離液Ａ（１ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン５、試料Ａのカラムに通液された解離液Ｂ（１０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン６は試料Ａのカラムに通液された解離液Ｆ（１０ｍＭのｐ−ＨＡＰを含む）から得られたものである。
【００４７】
レーン３が示すように、洗浄された画分からは、バンドは検出されなかった。これは、カラムが十分に洗浄され、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合しているもの以外のタンパク質がカラムに存在しないことを意味している。レーン４は、カラムから溶出したタンパク質の4つの主要なバンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したことを示している。レーン４が示すように、９４ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａ，１０ｋＤａの分子重量の4つのポリペプチドが、１ｍＭのグルコースによって同時に溶出した。９４ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａのポリペプチドは、１０ｋＤａのポリペプチドよりも容易に検出された。２５ｋＤａのポリペプチドは、レーン４に検出されたすべてのポリペプチドの中で最も効果的に溶出した。
【００４８】
レーン５は、９４ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａ，１０ｋＤａの分子重量の4つのポリペプチドが、１０ｍＭのグルコースによって同時に溶出したことを示している。レーン５は、レーン４と類似しているが、レーン４よりもパターンがわずかに弱く検出されている。レーン６は、９４ｋＤａ，５４ｋＤａ，４３ｋＤａ，３９ｋＤａ，２５ｋＤａ，１４ｋＤａのポリペプチドが、ｐ−ＨＡＰによって同時に溶出したことを示している。３９ｋＤａのポリペプチドは、レーン６に検出されたすべてのポリペプチドの中で最も効果的に溶出した。
【００４９】
図２は、試料Ｂに関する各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンドをクマシブリリアントブルーによって染色したものである。縦軸は、統一原子質量単位（ｋＤａ）を示している。レーン１は、３７ｋＤａのリコンビナント合成ポリペプチドの分子量マーカーから得られたものである。レーン2は、矢印Ａ１に示されるように、商用のウマ肝臓アルコール脱水素酵素（ＨＬＡＤＨ）から得られたものである。レーン３は、試料Ｂを通液した際にカラムから流出した画分から得られたものである。レーン４は、試料Ｂのカラムの洗浄された画分から得られたものである。レーン５は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｃ（１０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン６は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｄ（５０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン７は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｅ（２５０ｍＭのグルコースを含む）から得られたものである。レーン８は、試料Ｂのカラムに通液された解離液Ｆ（１０ｍＭのｐ−ＨＡＰを含む）から得られたものである。
【００５０】
レーン３に検出されたバンドは、カラムに過剰の試料Ｂが通液されたため、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合せずに流出したＨＬＡＤＨである。レーン４が示すように、洗浄された画分からはＨＬＡＤＨのバンドが検出されなかった。これは、カラムが十分に洗浄され、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合しているもの以外のタンパク質がカラムに存在しないことを意味している。レーン５〜８が示すように、３つの異なった濃度（１０ｍＭ，５０ｍＭ，２５０ｍＭ）のグルコースと１０ｍＭのｐ−ＨＡＰとが、カラムからＨＬＡＤＨを溶出させることに成功した。つまり、ＨＬＡＤＨは、テストされたすべての解離液において、効果的に溶出した。
【００５１】
[タンパク質配列の特定]
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ゲルの染色された各部分は脱染色の後に切除されて、エッペンドルフチューブに移された。 それぞれの切除されたゲルは、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）及びアセトニトリルの混合液（１：１）によって3回濯がれた後、乾かされた。 次に、ゲルは、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０，３７℃）中で、アクロモバクターによるＬｙｓ特異的な蛋白酵素により１２時間の間処理された。ペプチド画分の混合物は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（アマーシャム ファルマシア バイオテクノロジー社のＳＭＡＲＴ ＳＹＳＴＥＭ）を使用して、分離された。μＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８ ＳＣ２．１／１０カラム(３ｘｍｍ，２５０ｘｍｍ)が使用されて、０．０６０−０．０５５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中でアセトニトリルの濃度勾配が適用された。カラムは、アセトニトリル水溶液(８４％のアセトニトリル，０．００５％のトリフルオロ酢酸)の直線的な濃度勾配において変化を示した。流速は０．１ｍｌ／ｍｉｎであった。ＵＶ吸収は２１４ｎＭでモニターされた。これらの条件は、アマーシャム ファルマシア バイオテクノロジー社の解説に従って決定された。
【００５２】
それぞれのペプチド画分に関するマッピングの後に、３個の画分(１４ｋＤａからの1個と１０ｋＤａからの2個)が２つのタンパク質のアミノ酸配列を特定するために選択された。ＡＢＩ ４４７Ａシーケンサ(アプライド バイオシステムス社)が使用されて、配列の解読が行われた。それぞれの配列は、ゲノムネットのデータベースを使用したデータバンクから得られたタンパク質の配列と比較された。
【００５３】
３個の画分の推定アミノ酸配列の分析結果が表１に示される。データバンクの検索によって、ペプチドＡ１のアミノ酸残基の配列がラットのＰＫＣＩの部分的なアミノ酸配列（７−１６）と同じであることが示された。また、ペプチドＢ１の6つのアミノ酸残基とペプチドＢ２の8つのアミノ酸残基は、ラットのＭＩＦの部分的なアミノ酸配列（それぞれ３３−３８，４５−５５）と同じであった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
［グルコースによるＨＬＡＤＨの活性の減少］
続けて、ＨＬＡＤＨによるエタノールの酸化に対するグルコースの効果がテストされた。予備実験では、５００ｍＭまでのグルコースは、ＡＤＨの反応に関するアッセイバッファを含んだ１００ｍＭの燐酸塩(ｐＨ７．５)のｐＨに影響しなかった。そして、アッセイ溶液中のＮＡＤＨの生産は溶液へのエタノールの追加の前には観測されなった。したがって、５００ｍＭ以下の濃度のグルコースが本実験で使用された。グルコースは、エタノールが存在しないときにも、ＡＤＨによるＮＡＤ−ＮＡＤＨ反応を引き起こさなかった。
【００５６】
図３は、ＨＬＡＤＡの相対的な活性がグルコースの存在によって抑制されたことを示している。横軸はグルコースの添加量（ｍｌ）、縦軸は、グルコースの添加量０ｍｌを基準とした、ＨＬＡＤＡの相対的な活性（％）をそれぞれ示している。グルコース（２５０ｍＭ，５００ｍＭ）は、ＨＬＡＤＨの酵素の活性（ｐ＜０．０１）を濃度依存的に、大幅に減少させた。２５０ｍＭ，５００ｍＭの濃度のグルコースによるインキュベーションは、本来のＨＬＡＤＨの活性を９３．２±１．５％，８０．７±１．２％まで、それぞれ相対的に減少させた。
【００５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたバンド及びタンパク質配列の特定の結果より、ｐ−ＨＡＰ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ樹脂が肝臓中のＰＫＣＩ及びＭＩＦと結合することが示された。また、グルコースが、ラット肝臓のＭＩＦと親和性を有することが示された。また、グルコースが、ラットＡＤＨ及びＨＬＡＤＨと親和性を有することが示された。
【００５８】
一方、図１のレーン４，５にＡＫ、ＡＬＤＨ、ＰＫＣＩに対応する分子重量のバンドが検出されなかったことから、グルコースは、ＡＫ、及び細胞質基質のＡＬＤＨ，ＰＫＣＩとの親和性を有さないことが示された。この相違は、グルコースとの親和性の有無に応じて、ｐ−ＨＡＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅと結合するタンパク質が2つのグループに分類されることを示している。ｐ−ＨＡＰ親和性タンパク質の分類が表２に示される。
【００５９】
【表２】
【００６０】
また、本実施例の結果より、グルコースの添加量に依存して、ＨＬＡＤＨの活性が阻害されることが示された。
【００６１】
[実施形態の作用効果]
本実施形態によると、タンパク質を含んだ試料から、グルコース親和性のタンパク質だけを選択的に精製することが可能である。したがって、患者の体組織からグルコース親和性のタンパク質を同定し、糖尿病の予防や治療に有用な情報を得ることができる。
【００６２】
また、哺乳動物の臓器中の組織からグルコース親和性タンパクを容易に精製することが可能である。
【００６３】
また、食品、又はペットや家畜の餌などからグルコース親和性のタンパク質を同定することで、当該食品又は餌が健康に与える影響を分析することができる。
【符号の説明】
【００６４】
Ｙ１・・・矢印
【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記パラハイドロキシアセトフェノンに、上記グルコース親和性タンパク質を結合させる第１ステップと、
グルコースを含む第１溶液により、上記アフィニティカラムに結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得る第２ステップと、
上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させる第３ステップと、を含むグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項２】
上記第３ステップにおける上記グルコース親和性タンパク質の分離は、電気泳動によって行われる請求項１に記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項３】
上記吸着剤は、セファロース樹脂とパラハイドロキシアセトフェノンとの共有結合により構成されたものである請求項１または２に記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項４】
上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織の一部を含んだものである請求項１から３のいずれかに記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項５】
上記グルコース親和性タンパク質が、グリコーゲン ホスホリラーゼ，アルコール デヒドロゲナーゼ，グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ，及びマクロファージ遊走阻止因子から成る群より選択されたものである請求項１から４のいずれかに記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項６】
上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織から遠心分離された細胞質基質を含むものである請求項１から５のいずれかに記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項１】
吸着剤としてパラハイドロキシアセトフェノンを含むアフィニティカラムに、グルコース親和性タンパク質を含む試料を適用し、上記パラハイドロキシアセトフェノンに、上記グルコース親和性タンパク質を結合させる第１ステップと、
グルコースを含む第１溶液により、上記アフィニティカラムに結合した上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させ、少なくとも上記グルコースと上記グルコース親和性タンパク質とを含む第２溶液を得る第２ステップと、
上記第２溶液から、上記グルコース親和性タンパク質の少なくとも一部を分離させる第３ステップと、を含むグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項２】
上記第３ステップにおける上記グルコース親和性タンパク質の分離は、電気泳動によって行われる請求項１に記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項３】
上記吸着剤は、セファロース樹脂とパラハイドロキシアセトフェノンとの共有結合により構成されたものである請求項１または２に記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項４】
上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織の一部を含んだものである請求項１から３のいずれかに記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項５】
上記グルコース親和性タンパク質が、グリコーゲン ホスホリラーゼ，アルコール デヒドロゲナーゼ，グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ，及びマクロファージ遊走阻止因子から成る群より選択されたものである請求項１から４のいずれかに記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【請求項６】
上記試料は、哺乳動物の臓器中の組織から遠心分離された細胞質基質を含むものである請求項１から５のいずれかに記載のグルコース親和性タンパク質の精製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−１１２６０７（Ｐ２０１３−１１２６０７Ａ）
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５６７０４（Ｐ２０１１−２５６７０４）
【出願日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【出願人】（５１１２８５４２８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【出願人】（５１１２８５４２８）
【Ｆターム（参考）】
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