グルタチオンの製造方法
【課題】発酵生産物の合成能が向上した微生物の取得と、その培養法を提供する。
【解決手段】発酵生産物の合成能を有する微生物の細胞表層に、酵素を提示させることにより、菌体の生育が向上し、同時に発酵生産物の合成能を向上させることができる。
【解決手段】発酵生産物の合成能を有する微生物の細胞表層に、酵素を提示させることにより、菌体の生育が向上し、同時に発酵生産物の合成能を向上させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を細胞表層に提示した微生物によりグルタチオンを生産する方法に関する。さらに詳しくは、該微生物が資化可能な栄養培地中でグルタチオンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンから成るペプチドであり、肝疾患の治療薬、あるいは試薬として広く利用されている重要な化合物である。従来、グルタチオンは、有機合成法や酵母から抽出する方法によって製造されている。しかし、有機合成法は反応工程の長さと工程の複雑さの点で、また酵母からの抽出方法においては菌体から抽出されるグルタチオンの量に限界があるという点で問題があった。
【０００３】
これらの欠点を解決すべく、これまで数々の改良がなされてきている。酵母による生産方法において、例えば培地にシステイン等のアミノ酸を添加する方法（特許文献１）、亜鉛イオンを制限する方法（特許文献２）、通常よりも低い培養温度で培養する方法（特許文献３）などが挙げられる。また、突然変異処理により、エチオニン・亜硫酸塩耐性株（特許文献４）、ポリエン系抗生物質耐性株を取得する方法（特許文献５）などが挙げられる。しかしながら、これらの方法はグルタチオンの生産量の点で満足のいくものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭５３−９４０８９号公報
【特許文献２】特開２０００−２７９１６４号公報
【特許文献３】特開昭６０−１５６３７９号公報
【特許文献４】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献５】特開２００３−２８４５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の技術背景の下に、菌体内に多量のグルタチオンを保持した酵母および同酵母を培養することによるグルタチオンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、酵素を細胞表層に提示するように組み換えられたＤＮＡを有する酵母が、野生酵母よりも多量の菌体並びに発酵生産物を生産しうること、該酵母に資化可能なタンパク系バイオマスを加えることにより、発酵生産物の生産量を更に向上させうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、酵素を細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡを有する微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養する工程を含む発酵生産物の製造方法に関する。酵素はプロテアーゼであることが好ましい。微生物は酵母であることが好ましい。資化可能な栄養源にはタンパク系バイオマスが含まれることが好ましい。発酵生産物はグルタチオンであることが好ましい。
また、本発明は、プロテアーゼを細胞表層に提示する、遺伝子組換え微生物に関する。微生物は酵母であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の新規な微生物は、酵素を細胞表層に提示させることにより、菌体の生育および、発酵生産物の生産量を向上させることが出来る。またタンパク系バイオマス存在下で該酵母を培養することにより、発酵生産物の生産性を更に向上させることが出来る。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、酵素を細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡを有する微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養する工程を含む発酵生産物の製造方法に関する。
【００１０】
発酵生産物は、微生物の発酵作用により生産されるものであれば限定されないが、酵素などの生理活性蛋白質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン類、脂質、カロチノイド、有機酸などを挙げることができる。例えば、ペプチドとしてはグルタチオンが挙げられ、グルタチオンとしては、酸化型グルタチオン、又は還元型グルタチオンが挙げられる。
【００１１】
発酵生産物は、酵素を細胞表層に提示するための組換え遺伝子を含む微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養することにより得られる。遺伝子組み換えの対象となる微生物は、発酵生産物を生産できる微生物であれば限定されないが、酵母、カビ、細菌であることが好ましく、酵母であることがより好ましい。また、発酵生産物がグルタチオンである場合、グルタチオンを生産できる微生物であれば特に限定されないが、酵母が好ましい。酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｉｃｈｉａ属が好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓがより好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが最も好ましい。例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるＹＰＨ４９９株を親株とし、遺伝子組み換えによって得られたＹＰＨ４９９−ＰＲＣ１株が用いられ得る。
【００１２】
表層提示する酵素はプロテアーゼであることが好ましい。プロテアーゼはタンパク質を加水分解するものであればいずれでも良く、エキソ型、エンド型いずれのプロテアーゼ（ペプチダーゼ）でもよい。また、酵母、バクテリア、細菌などの微生物、植物および哺乳類に由来するプロテアーゼであってもよく、好ましくは微生物由来のプロテアーゼであり、より好ましくは酵母由来のプロテアーゼである。プロテアーゼの一例として、ＰＲＣ１遺伝子によってコードされる、酵母の小胞体に存在するカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ；ＥＣ ３．４．１６．５）が挙げられる。
【００１３】
次に、細胞表層に酵素を提示する一般的な方法について説明する。細胞表層に酵素を提示する方法には、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して酵素を細胞表層に提示する方法、および（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して酵素を細胞表層に提示する方法がある。１種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ａ）および（ｂ）のいずれの方法を用いてもよい。なお、２種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ｂ）の方法によって融合タンパク質と発現することが好ましい。
【００１４】
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の凝集性タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、およびＦＬＯ１１）、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。（ａ）および（ｂ）の方法について、以下に説明する。
【００１５】
（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法
ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元部が切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
【００１６】
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
【００１７】
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
【００１８】
従って、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とする酵素の構造遺伝子の配列で置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素を細胞表層に提示する組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素遺伝子を導入することが好ましい。
【００１９】
この目的とする酵素の構造遺伝子として、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）遺伝子を用いると、ＧＰＩアンカーを介して細胞表層にプロテアーゼ（ペプチダーゼ）を提示する組換えＤＮＡが得られる。
【００２０】
（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法
細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００２１】
この細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）と目的の酵素とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。
従って、例えば、
（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子、
（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素の構造遺伝子、
（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする他の酵素の構造遺伝子、
などのＤＮＡ配列を作成することにより、細胞表層に目的の酵素を提示する組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。
【００２２】
この目的とする酵素の構造遺伝子として、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）遺伝子を用いると、糖鎖結合タンパク質ドメインを利用して、細胞表層にプロテアーゼ（ペプチダーゼ）を提示する組換えＤＮＡが得られる。あるいは、糖鎖結合タンパク質ドメインのＮ末端およびＣ末端に、それぞれ異なる２種類のプロテアーゼ（ペプチダーゼ）遺伝子を有する組換えＤＮＡが得られ、融合タンパク質として両酵素を細胞表層に発現することもできる。
【００２３】
上記組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列を用いてもよいし、発現した酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列を用いてもよい。例えば、酵母のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列が好適に用いられる。酵素活性に影響を及ぼさないのであれば、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
【００２４】
組換え遺伝子は、ベクターにより微生物に導入される。ベクターは、マルチコピー型および染色体組込み型がある。どの型のベクターにどの遺伝子を組込むかは、当業者が適宜決定すればよいが、目的とする配列（組換えＤＮＡ）は、酵母の染色体に組み込まれる方がプラスミドとして保持されるよりも安定であり、コピー数が多い方が転写効率や翻訳効率が高いため、目的とする配列をベクター上でδ配列と結合させることがより好ましい。細胞表層に提示される酵素と分泌される酵素とは、同一のベクターに組込まれてもよく、それぞれ異なるベクターに組込まれてもよい。
【００２５】
プロテアーゼを細胞表層に提示するための、上述の組換え遺伝子を含む微生物は、培地に含まれるタンパク質成分をアミノ酸に加水分解することができ、栄養源の分解・摂取効率が高まるので、菌体の生育および、発酵生産物の生産量を大幅に改善することができる。発酵生産物がグルタチオンの場合、その構成成分であるグルタミン酸、グリシン、システインなどのアミノ酸が、プロテアーゼを細胞表層に提示することにより培地から効率的に供給されるので、グルタチオンの生産量が大幅に増加する。
【００２６】
発酵生産物は、上記微生物を、資化可能な栄養源の存在下で培養することにより製造される。培養は、好気的に行われることが好ましい。資化可能な栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類、及びタンパク系バイオマスから選択される１つ以上が挙げられる。
【００２７】
炭素源としては、通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜および亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選ばれる１種または２種以上が使用される。
【００２８】
窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機塩、およびコーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキスもしくはペプトン等の含窒素有機物等からなる群より選ばれる１種または２種以上が使用される。
【００２９】
更に、無機塩類として、リン酸成分、カリウム成分、マグネシウム成分を培地に添加してもよく、これらとしては、過リン酸石灰、リン安、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等の通常の工業用原料でよい。亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。その他、ビタミン、核酸関連物質等を添加しても良い。
【００３０】
上述の炭素源、窒素源、無機塩類を含む栄養源としては、ＳＤ培地を使用することもできる。
【００３１】
また、微生物が資化できるタンパク系バイオマスを培地組成として添加してもよい。バイオマスとは、地球生物圏の物質循環系に組み込まれた生物体又は生物体から派生する有機物の集積をいう（ＪＩＳ Ｋ ３６００ １２５８参照）。タンパク系バイオマスとはタンパク質を主要な有機成分とするバイオマスであり、その由来は植物、動物由来のどちらでもよい。植物由来のタンパク系バイオマスとしては、好ましくは大豆由来のタンパク系バイオマスであり、最も好ましくは大豆そのものまたは脱脂された大豆を乾燥して粉末化したものである。その他の植物由来のタンパク系バイオマスとしては、イネ科や大豆以外のマメ科由来のものが挙げられる。大豆以外のマメ科としては、エンドウなどが挙げられる。
【００３２】
動物由来のタンパク系バイオマスとしては、ケラチン、コラーゲンが挙げられ、なかでもケラチンが好ましい。ケラチンとしてはトリ羽毛由来、ウシ由来が挙げられる。
【００３３】
微生物の培養形式としては、回分培養、流加培養、あるいは連続培養のいずれでもよいが、工業的には流加培養あるいは連続培養が採用される。
【００３４】
培養温度は、酵母を使用する場合、一般的な酵母の培養条件に従えばよく、例えば２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃がよく、ｐＨは３．５〜８．０、特に４．０〜６．０が望ましい。
【００３５】
本発明の方法により高濃度グルタチオンを酵母菌体内に含有する培養物が得られるが、培養物からグルタチオンを含有する分画物を得てもよい。培養物からグルタチオンを含有する分画物を分画する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法でもよいが、熱水抽出、菌体破砕による抽出等を挙げることができる。また、得られた抽出物を担体に担持させることにより、グルタチオンを高濃度に含む画分に濃縮等することが可能となる。
【００３６】
また、上記方法により培養した培養物から酵母エキスを調製してもよい。酵母エキスを調製する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよいが、自己消化法、酵素分解法あるいはアルカリ抽出法などが工業的に採用される。
【００３７】
また、上記方法により培養した培養物から乾燥酵母菌体を調製してもよい。乾燥酵母菌体を調製する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよいが、工業的には、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法が採用される。
【００３８】
上記酵母変異株を好気的な条件で培養して得られる培養物、グルタチオンを含む前記培養物の分画物は飲食品に使用することもできる。 これらの飲食品としては、通常乾燥酵母、酵母エキスを添加しうる飲食品であれば何れでもよいが、例えばアルコール飲料、清涼飲料、発酵食品調味料、スープ類、一般食品、菓子類等を挙げることができる。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
（実施例１：プロテアーゼ提示酵母の作成方法）
非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）１４５：７９−８３）に記載のＰＧＫ１プロモーターおよびｐｒｅｐｒｏ−αファクターを含むプラスミドｐＦＧＫ４２６を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｌＩにて消化した後、これらの断片を連結し、ｐＲＳ４０６−ＰＧＫ５’−ｐｒｅｐｒｏを構築した。
【００４１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＣＡＡＣＣＡＣＴ−３’（配列番号１）および５’−ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＡＴＧＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号２）を用いてＰＣＲ増幅を行い、α−アグルチニンの３’部分およびＳＡＧ１ターミネーターを含む断片を増幅させた。この増幅断片およびプラスミドｐＲＳ４０６−ＰＧＫ５’−ｐｒｅｐｒｏを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩにて消化した後に連結し、ｐＧＫ４０６ＡＧを得た。
【００４２】
次にプロテアーゼＣＰＹをコードする遺伝子ＰＲＣ１をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９のゲノムをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＴＣＣＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＡＧＡＣＣＧ−３’（配列番号３）および５’−ＣＣＧＧＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧ−３’（配列番号４）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＧＫ４０６ＡＧをＳｐｈＩで消化した後に連結し、プロテアーゼＣＰＹ表層提示シングルコピープラスミドｐＧＫ４０６ＡＧ−ＰＲＣ１を得た。得られたｐＧＫ４０６ＡＧ−ＰＲＣ１を制限酵素ＡｆｌＩＩにて消化し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を宿主酵母株とし、形質転換を行った。
【００４３】
（実施例２：グルタチオン生産）
実施例１で取得した組換え酵母をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪培養し、種母培養とした。本種母培養液を、ＳＤ培地２０ｍｌにＯＤ５００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、４８時間振盪培養をおこない、グルタチオン濃度、菌濃度（ＯＤ６００）を測定した。
【００４４】
（実施例３：グルタチオン生産）
４８時間の振盪培養に、ＳＤ培地に替えて、ＳＤ培地２０ｍｌに大豆タンパク粉末を３．４４ｇ／Ｌとなるように加えた培地を使用した以外は、実施例２と同様の操作を行った。
【００４５】
（比較例１：グルタチオン生産）
酵母として、実施例１で取得した組換え酵母に替えて形質転換を行っていないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を使用した以外は、実施例２と同様の操作を行った。
【００４６】
培養液中の菌濃度（ＯＤ６００）、および培養液中のグルタチオン濃度（ｍｇ／Ｌ）を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１からわかるように、プロテアーゼ遺伝子を、グルタチオン生産能を有する酵母に導入することにより、菌体生育が向上しており、グルタチオン生産量に関しても培養４８時間でグルタチオン１０ｍｇ／Ｌが生産された。更に、大豆タンパク粉末を加えることでグルタチオン生産量は１８ｍｇ／Ｌに達した。
【００４９】
なお、グルタチオン濃度及び菌体濃度は、下記の方法により測定した。
（グルタチオン濃度測定法）
サンプリングした培養液１０ｍｌを遠心分離して上清を除去した後、蒸留水で沈殿した菌体を懸濁、再遠心することにより洗浄した。本洗浄操作を２回繰返した後、遠心分離後に沈殿する菌体を−８０℃で冷凍保管し、凍結乾燥後、得られる凍結乾燥物に５ｍｌ（移動層 ３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２０％（ｗ／ｖ）１−ヘプタンスルホン酸Ｎａ，９６．８％リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ２．８））を添加、懸濁し、その１ｍｌを８５℃で５分間熱処理後に遠心分離し、その上清中のグルタチオンを高速液体クロマトグラフィーにて分析した。
【００５０】
（菌体濃度測定法）
培養液の６００ｎｍにおける吸光度を測定することで菌体濃度を求めた。若しくは、培養液を８０℃で１２時間以上静置した後に重量を測定し、予め秤量した容器の重量を差し引くことで乾燥菌体重量を求めた。
【００５１】
（実施例４：グルタチオン生産）
実施例１で取得した組換え酵母をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪培養し、種母培養とした。本種母培養液を廃糖蜜培地（糖蜜１２０ｇ／Ｌ 尿素３ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム０．８ｇ／Ｌ リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７水和物５ｐｐｍ）２０ｍｌにＯＤ５００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、４８時間振盪培養をおこない、上述の方法でグルタチオン濃度、菌濃度（乾燥菌体重量ｇ／Ｌ）を測定した。
【００５２】
（比較例２：グルタチオン生産）
酵母として、実施例１で取得した組換え酵母に替えて形質転換を行っていないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を使用した以外は、実施例４と同様の操作を行った。
【００５３】
培養液中の菌濃度（ｇ／Ｌ）、および培養液中のグルタチオン濃度（ｍｇ／Ｌ）を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
表２からわかるように、プロテアーゼ遺伝子を、グルタチオン生産能を有する酵母に導入することにより、廃糖蜜培地で培養した場合でも菌体生育とグルタチオン生産量が向上しており、培養４８時間でグルタチオン濃度は４０ｍｇ／Ｌに達した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を細胞表層に提示した微生物によりグルタチオンを生産する方法に関する。さらに詳しくは、該微生物が資化可能な栄養培地中でグルタチオンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン及びグリシンから成るペプチドであり、肝疾患の治療薬、あるいは試薬として広く利用されている重要な化合物である。従来、グルタチオンは、有機合成法や酵母から抽出する方法によって製造されている。しかし、有機合成法は反応工程の長さと工程の複雑さの点で、また酵母からの抽出方法においては菌体から抽出されるグルタチオンの量に限界があるという点で問題があった。
【０００３】
これらの欠点を解決すべく、これまで数々の改良がなされてきている。酵母による生産方法において、例えば培地にシステイン等のアミノ酸を添加する方法（特許文献１）、亜鉛イオンを制限する方法（特許文献２）、通常よりも低い培養温度で培養する方法（特許文献３）などが挙げられる。また、突然変異処理により、エチオニン・亜硫酸塩耐性株（特許文献４）、ポリエン系抗生物質耐性株を取得する方法（特許文献５）などが挙げられる。しかしながら、これらの方法はグルタチオンの生産量の点で満足のいくものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭５３−９４０８９号公報
【特許文献２】特開２０００−２７９１６４号公報
【特許文献３】特開昭６０−１５６３７９号公報
【特許文献４】特開昭５９−１５１８９４号公報
【特許文献５】特開２００３−２８４５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の技術背景の下に、菌体内に多量のグルタチオンを保持した酵母および同酵母を培養することによるグルタチオンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、酵素を細胞表層に提示するように組み換えられたＤＮＡを有する酵母が、野生酵母よりも多量の菌体並びに発酵生産物を生産しうること、該酵母に資化可能なタンパク系バイオマスを加えることにより、発酵生産物の生産量を更に向上させうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、酵素を細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡを有する微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養する工程を含む発酵生産物の製造方法に関する。酵素はプロテアーゼであることが好ましい。微生物は酵母であることが好ましい。資化可能な栄養源にはタンパク系バイオマスが含まれることが好ましい。発酵生産物はグルタチオンであることが好ましい。
また、本発明は、プロテアーゼを細胞表層に提示する、遺伝子組換え微生物に関する。微生物は酵母であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の新規な微生物は、酵素を細胞表層に提示させることにより、菌体の生育および、発酵生産物の生産量を向上させることが出来る。またタンパク系バイオマス存在下で該酵母を培養することにより、発酵生産物の生産性を更に向上させることが出来る。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、酵素を細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡを有する微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養する工程を含む発酵生産物の製造方法に関する。
【００１０】
発酵生産物は、微生物の発酵作用により生産されるものであれば限定されないが、酵素などの生理活性蛋白質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン類、脂質、カロチノイド、有機酸などを挙げることができる。例えば、ペプチドとしてはグルタチオンが挙げられ、グルタチオンとしては、酸化型グルタチオン、又は還元型グルタチオンが挙げられる。
【００１１】
発酵生産物は、酵素を細胞表層に提示するための組換え遺伝子を含む微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養することにより得られる。遺伝子組み換えの対象となる微生物は、発酵生産物を生産できる微生物であれば限定されないが、酵母、カビ、細菌であることが好ましく、酵母であることがより好ましい。また、発酵生産物がグルタチオンである場合、グルタチオンを生産できる微生物であれば特に限定されないが、酵母が好ましい。酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｉｃｈｉａ属が好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓがより好ましく、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが最も好ましい。例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるＹＰＨ４９９株を親株とし、遺伝子組み換えによって得られたＹＰＨ４９９−ＰＲＣ１株が用いられ得る。
【００１２】
表層提示する酵素はプロテアーゼであることが好ましい。プロテアーゼはタンパク質を加水分解するものであればいずれでも良く、エキソ型、エンド型いずれのプロテアーゼ（ペプチダーゼ）でもよい。また、酵母、バクテリア、細菌などの微生物、植物および哺乳類に由来するプロテアーゼであってもよく、好ましくは微生物由来のプロテアーゼであり、より好ましくは酵母由来のプロテアーゼである。プロテアーゼの一例として、ＰＲＣ１遺伝子によってコードされる、酵母の小胞体に存在するカルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰＹ；ＥＣ ３．４．１６．５）が挙げられる。
【００１３】
次に、細胞表層に酵素を提示する一般的な方法について説明する。細胞表層に酵素を提示する方法には、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して酵素を細胞表層に提示する方法、および（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して酵素を細胞表層に提示する方法がある。１種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ａ）および（ｂ）のいずれの方法を用いてもよい。なお、２種の酵素を細胞表層に提示する場合は、（ｂ）の方法によって融合タンパク質と発現することが好ましい。
【００１４】
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の凝集性タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、およびＦＬＯ１１）、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。（ａ）および（ｂ）の方法について、以下に説明する。
【００１５】
（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法
ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元部が切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
【００１６】
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
【００１７】
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
【００１８】
従って、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とする酵素の構造遺伝子の配列で置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素を細胞表層に提示する組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素遺伝子を導入することが好ましい。
【００１９】
この目的とする酵素の構造遺伝子として、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）遺伝子を用いると、ＧＰＩアンカーを介して細胞表層にプロテアーゼ（ペプチダーゼ）を提示する組換えＤＮＡが得られる。
【００２０】
（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法
細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００２１】
この細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）と目的の酵素とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。
従って、例えば、
（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子、
（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素の構造遺伝子、
（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素の構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする他の酵素の構造遺伝子、
などのＤＮＡ配列を作成することにより、細胞表層に目的の酵素を提示する組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。
【００２２】
この目的とする酵素の構造遺伝子として、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）遺伝子を用いると、糖鎖結合タンパク質ドメインを利用して、細胞表層にプロテアーゼ（ペプチダーゼ）を提示する組換えＤＮＡが得られる。あるいは、糖鎖結合タンパク質ドメインのＮ末端およびＣ末端に、それぞれ異なる２種類のプロテアーゼ（ペプチダーゼ）遺伝子を有する組換えＤＮＡが得られ、融合タンパク質として両酵素を細胞表層に発現することもできる。
【００２３】
上記組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列を用いてもよいし、発現した酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列を用いてもよい。例えば、酵母のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列が好適に用いられる。酵素活性に影響を及ぼさないのであれば、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
【００２４】
組換え遺伝子は、ベクターにより微生物に導入される。ベクターは、マルチコピー型および染色体組込み型がある。どの型のベクターにどの遺伝子を組込むかは、当業者が適宜決定すればよいが、目的とする配列（組換えＤＮＡ）は、酵母の染色体に組み込まれる方がプラスミドとして保持されるよりも安定であり、コピー数が多い方が転写効率や翻訳効率が高いため、目的とする配列をベクター上でδ配列と結合させることがより好ましい。細胞表層に提示される酵素と分泌される酵素とは、同一のベクターに組込まれてもよく、それぞれ異なるベクターに組込まれてもよい。
【００２５】
プロテアーゼを細胞表層に提示するための、上述の組換え遺伝子を含む微生物は、培地に含まれるタンパク質成分をアミノ酸に加水分解することができ、栄養源の分解・摂取効率が高まるので、菌体の生育および、発酵生産物の生産量を大幅に改善することができる。発酵生産物がグルタチオンの場合、その構成成分であるグルタミン酸、グリシン、システインなどのアミノ酸が、プロテアーゼを細胞表層に提示することにより培地から効率的に供給されるので、グルタチオンの生産量が大幅に増加する。
【００２６】
発酵生産物は、上記微生物を、資化可能な栄養源の存在下で培養することにより製造される。培養は、好気的に行われることが好ましい。資化可能な栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類、及びタンパク系バイオマスから選択される１つ以上が挙げられる。
【００２７】
炭素源としては、通常の微生物の培養に利用されるグルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜および亜硫酸パルプ廃液等からなる群より選ばれる１種または２種以上が使用される。
【００２８】
窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機塩、およびコーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキスもしくはペプトン等の含窒素有機物等からなる群より選ばれる１種または２種以上が使用される。
【００２９】
更に、無機塩類として、リン酸成分、カリウム成分、マグネシウム成分を培地に添加してもよく、これらとしては、過リン酸石灰、リン安、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩酸マグネシウム等の通常の工業用原料でよい。亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を使用してもよい。その他、ビタミン、核酸関連物質等を添加しても良い。
【００３０】
上述の炭素源、窒素源、無機塩類を含む栄養源としては、ＳＤ培地を使用することもできる。
【００３１】
また、微生物が資化できるタンパク系バイオマスを培地組成として添加してもよい。バイオマスとは、地球生物圏の物質循環系に組み込まれた生物体又は生物体から派生する有機物の集積をいう（ＪＩＳ Ｋ ３６００ １２５８参照）。タンパク系バイオマスとはタンパク質を主要な有機成分とするバイオマスであり、その由来は植物、動物由来のどちらでもよい。植物由来のタンパク系バイオマスとしては、好ましくは大豆由来のタンパク系バイオマスであり、最も好ましくは大豆そのものまたは脱脂された大豆を乾燥して粉末化したものである。その他の植物由来のタンパク系バイオマスとしては、イネ科や大豆以外のマメ科由来のものが挙げられる。大豆以外のマメ科としては、エンドウなどが挙げられる。
【００３２】
動物由来のタンパク系バイオマスとしては、ケラチン、コラーゲンが挙げられ、なかでもケラチンが好ましい。ケラチンとしてはトリ羽毛由来、ウシ由来が挙げられる。
【００３３】
微生物の培養形式としては、回分培養、流加培養、あるいは連続培養のいずれでもよいが、工業的には流加培養あるいは連続培養が採用される。
【００３４】
培養温度は、酵母を使用する場合、一般的な酵母の培養条件に従えばよく、例えば２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃がよく、ｐＨは３．５〜８．０、特に４．０〜６．０が望ましい。
【００３５】
本発明の方法により高濃度グルタチオンを酵母菌体内に含有する培養物が得られるが、培養物からグルタチオンを含有する分画物を得てもよい。培養物からグルタチオンを含有する分画物を分画する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法でもよいが、熱水抽出、菌体破砕による抽出等を挙げることができる。また、得られた抽出物を担体に担持させることにより、グルタチオンを高濃度に含む画分に濃縮等することが可能となる。
【００３６】
また、上記方法により培養した培養物から酵母エキスを調製してもよい。酵母エキスを調製する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよいが、自己消化法、酵素分解法あるいはアルカリ抽出法などが工業的に採用される。
【００３７】
また、上記方法により培養した培養物から乾燥酵母菌体を調製してもよい。乾燥酵母菌体を調製する方法としては、通常行われている方法であればいずれの方法であってもよいが、工業的には、凍結乾燥法、スプレードライ法、ドラムドライ法が採用される。
【００３８】
上記酵母変異株を好気的な条件で培養して得られる培養物、グルタチオンを含む前記培養物の分画物は飲食品に使用することもできる。 これらの飲食品としては、通常乾燥酵母、酵母エキスを添加しうる飲食品であれば何れでもよいが、例えばアルコール飲料、清涼飲料、発酵食品調味料、スープ類、一般食品、菓子類等を挙げることができる。
【実施例】
【００３９】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４０】
（実施例１：プロテアーゼ提示酵母の作成方法）
非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）１４５：７９−８３）に記載のＰＧＫ１プロモーターおよびｐｒｅｐｒｏ−αファクターを含むプラスミドｐＦＧＫ４２６を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｌＩにて消化した後、これらの断片を連結し、ｐＲＳ４０６−ＰＧＫ５’−ｐｒｅｐｒｏを構築した。
【００４１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１のゲノムをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＣＡＡＣＣＡＣＴ−３’（配列番号１）および５’−ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧＡＴＡＴＧＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号２）を用いてＰＣＲ増幅を行い、α−アグルチニンの３’部分およびＳＡＧ１ターミネーターを含む断片を増幅させた。この増幅断片およびプラスミドｐＲＳ４０６−ＰＧＫ５’−ｐｒｅｐｒｏを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩにて消化した後に連結し、ｐＧＫ４０６ＡＧを得た。
【００４２】
次にプロテアーゼＣＰＹをコードする遺伝子ＰＲＣ１をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９のゲノムをテンプレートとし、プライマーとして５’−ＴＣＣＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＡＧＡＣＣＧ−３’（配列番号３）および５’−ＣＣＧＧＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧ−３’（配列番号４）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物およびｐＧＫ４０６ＡＧをＳｐｈＩで消化した後に連結し、プロテアーゼＣＰＹ表層提示シングルコピープラスミドｐＧＫ４０６ＡＧ−ＰＲＣ１を得た。得られたｐＧＫ４０６ＡＧ−ＰＲＣ１を制限酵素ＡｆｌＩＩにて消化し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を宿主酵母株とし、形質転換を行った。
【００４３】
（実施例２：グルタチオン生産）
実施例１で取得した組換え酵母をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪培養し、種母培養とした。本種母培養液を、ＳＤ培地２０ｍｌにＯＤ５００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、４８時間振盪培養をおこない、グルタチオン濃度、菌濃度（ＯＤ６００）を測定した。
【００４４】
（実施例３：グルタチオン生産）
４８時間の振盪培養に、ＳＤ培地に替えて、ＳＤ培地２０ｍｌに大豆タンパク粉末を３．４４ｇ／Ｌとなるように加えた培地を使用した以外は、実施例２と同様の操作を行った。
【００４５】
（比較例１：グルタチオン生産）
酵母として、実施例１で取得した組換え酵母に替えて形質転換を行っていないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を使用した以外は、実施例２と同様の操作を行った。
【００４６】
培養液中の菌濃度（ＯＤ６００）、および培養液中のグルタチオン濃度（ｍｇ／Ｌ）を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１からわかるように、プロテアーゼ遺伝子を、グルタチオン生産能を有する酵母に導入することにより、菌体生育が向上しており、グルタチオン生産量に関しても培養４８時間でグルタチオン１０ｍｇ／Ｌが生産された。更に、大豆タンパク粉末を加えることでグルタチオン生産量は１８ｍｇ／Ｌに達した。
【００４９】
なお、グルタチオン濃度及び菌体濃度は、下記の方法により測定した。
（グルタチオン濃度測定法）
サンプリングした培養液１０ｍｌを遠心分離して上清を除去した後、蒸留水で沈殿した菌体を懸濁、再遠心することにより洗浄した。本洗浄操作を２回繰返した後、遠心分離後に沈殿する菌体を−８０℃で冷凍保管し、凍結乾燥後、得られる凍結乾燥物に５ｍｌ（移動層 ３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２０％（ｗ／ｖ）１−ヘプタンスルホン酸Ｎａ，９６．８％リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ２．８））を添加、懸濁し、その１ｍｌを８５℃で５分間熱処理後に遠心分離し、その上清中のグルタチオンを高速液体クロマトグラフィーにて分析した。
【００５０】
（菌体濃度測定法）
培養液の６００ｎｍにおける吸光度を測定することで菌体濃度を求めた。若しくは、培養液を８０℃で１２時間以上静置した後に重量を測定し、予め秤量した容器の重量を差し引くことで乾燥菌体重量を求めた。
【００５１】
（実施例４：グルタチオン生産）
実施例１で取得した組換え酵母をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗ／ｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、２０ｇ／Ｌグルコース）５ｍｌで３０℃、１６時間振盪培養し、種母培養とした。本種母培養液を廃糖蜜培地（糖蜜１２０ｇ／Ｌ 尿素３ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム０．８ｇ／Ｌ リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛７水和物５ｐｐｍ）２０ｍｌにＯＤ５００＝０．０３となるよう植菌し、３０℃、４８時間振盪培養をおこない、上述の方法でグルタチオン濃度、菌濃度（乾燥菌体重量ｇ／Ｌ）を測定した。
【００５２】
（比較例２：グルタチオン生産）
酵母として、実施例１で取得した組換え酵母に替えて形質転換を行っていないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＰＨ４９９を使用した以外は、実施例４と同様の操作を行った。
【００５３】
培養液中の菌濃度（ｇ／Ｌ）、および培養液中のグルタチオン濃度（ｍｇ／Ｌ）を表２に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
表２からわかるように、プロテアーゼ遺伝子を、グルタチオン生産能を有する酵母に導入することにより、廃糖蜜培地で培養した場合でも菌体生育とグルタチオン生産量が向上しており、培養４８時間でグルタチオン濃度は４０ｍｇ／Ｌに達した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡを有する微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養する工程を含む発酵生産物の製造方法。
【請求項２】
酵素がプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
微生物が酵母である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
資化可能な栄養源にタンパク系バイオマスが含まれることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
発酵生産物がグルタチオンである、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
プロテアーゼを細胞表層に提示する、遺伝子組換え微生物。
【請求項７】
微生物が酵母である請求項６に記載の微生物。
【請求項１】
酵素を細胞表層に提示するように組換えられたＤＮＡを有する微生物を、該微生物が資化可能な栄養源の存在下で培養する工程を含む発酵生産物の製造方法。
【請求項２】
酵素がプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
微生物が酵母である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
資化可能な栄養源にタンパク系バイオマスが含まれることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
発酵生産物がグルタチオンである、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
プロテアーゼを細胞表層に提示する、遺伝子組換え微生物。
【請求項７】
微生物が酵母である請求項６に記載の微生物。
【公開番号】特開２０１３−３４３９１（Ｐ２０１３−３４３９１Ａ）
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７０１６６（Ｐ２０１１−１７０１６６）
【出願日】平成２３年８月３日（２０１１．８．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 化学工学会第７６年会研究発表講演要旨集（平成２３年２月２２日 化学工学会発行）、第１３回化学工学会学生発表会［神戸大会（西日本地区）］研究発表講演要旨集（平成２３年２月５日 化学工学会発行）、第１３回化学工学会学生発表会［神戸大会（西日本地区）］プレゼンテーション資料（平成２３年３月５日 化学工学会主催）、修士論文・卒業論文 研究発表講演要旨集（２０１０年度）（平成２３年２月２１日 神戸大学工学部応用化学科発行）、及び修士論文・卒業論文 研究発表講演 プレゼンテーション資料（平成２３年３月３日 国立大学法人神戸大学工学部応用化学科主催）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月２１日（２０１３．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月３日（２０１１．８．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 化学工学会第７６年会研究発表講演要旨集（平成２３年２月２２日 化学工学会発行）、第１３回化学工学会学生発表会［神戸大会（西日本地区）］研究発表講演要旨集（平成２３年２月５日 化学工学会発行）、第１３回化学工学会学生発表会［神戸大会（西日本地区）］プレゼンテーション資料（平成２３年３月５日 化学工学会主催）、修士論文・卒業論文 研究発表講演要旨集（２０１０年度）（平成２３年２月２１日 神戸大学工学部応用化学科発行）、及び修士論文・卒業論文 研究発表講演 プレゼンテーション資料（平成２３年３月３日 国立大学法人神戸大学工学部応用化学科主催）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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