ケショウシメジ抽出物を含有する医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、化粧料、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤、並びにケショウシメジに含まれる新規化合物及びその用途
【課題】ヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患及びヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している歯肉炎、乾皮症、荒れ肌、乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待でき、しかも直接線維芽細胞に作用する医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料を提供する。
【解決手段】ケショウシメジ抽出物、又はケショウシメジに含まれる特定の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料。
【解決手段】ケショウシメジ抽出物、又はケショウシメジに含まれる特定の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患及びヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している歯肉炎、乾皮症、荒れ肌、乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待でき、しかも直接線維芽細胞に作用する医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリクスを形成することに基づく細胞の保持、臓器組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害などの外力への抵抗、及び細菌感染の防止等多くの機能を有している（非特許文献１参照）。
【０００３】
更に、近年ヒアルロン酸はその分子量によって様々な生理作用を持つことがわかってきた。例えば、生体内で合成されていると考えられている高分子ヒアルロン酸（分子量１００万以上）はプロテオグリカン遊離抑制作用、ブラジキニン関節疼痛抑制作用、損傷軟骨修復作用、関節炎抑制作用を持つことから炎症抑制効果を持ち（非特許文献２参照）、その分解（低分子化）産物である低分子化ヒアルロン酸は、血管新生促進作用（非特許文献３参照）、白血球走化性促進作用（特許文献１参照）を持つことから炎症促進作用を持つと考えられている。
【０００４】
以上のことからヒアルロン酸の低分子化は肝炎、歯肉炎（非特許文献４参照）、関節リウマチ、変形性関節症（非特許文献５参照）、悪性腫瘍（非特許文献６参照）の症状悪化に密接に関連すると考えられ、したがって、ヒアルロン酸の低分子化を予防・防止するヒアルロン酸の分解阻害剤が望まれている。
【０００５】
実際、結合組織中のヒアルロン酸を低分子化するヒアルロニダーゼが炎症促進作用を持つ酵素として想定され、その阻害剤が薬理効果があることが期待された（非特許文献７参照）。しかし、ヒト結合組織を形成する線維芽細胞からヒアルロニダーゼが単離された報告はいまだなく、そのためヒト線維芽細胞の酵素が牛精巣由来のヒアルロニダーゼと同様な性質を持っていると仮定し、牛精巣由来のヒアルロニダーゼを用いた種々の阻害剤が報告されている（特許文献２〜９参照）のが現状である。
【０００６】
しかし、近年、関節に存在するヒト滑膜細胞（非特許文献８参照）、ヒト子宮けい管細胞（非特許文献９参照）、ヒト皮膚線維芽細胞（非特許文献１０参照）、ヒト肺線維芽細胞（非特許文献１１参照）において、エンド型でありヒアルロン酸を４糖、６糖にまで分解する牛精巣由来のヒアルロニダーゼとは明らかに異なるヒアルロン酸分解機構の存在が報告されている。これらのことから精巣由来のヒアルロニダーゼの阻害剤ではヒトのヒアルロン酸分解を効果的に阻害することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−８３２３号公報
【特許文献２】特公平６−２９２７１号公報
【特許文献３】特公平６−４５８４号公報
【特許文献４】特開平５−１７８８７６号公報
【特許文献５】特開平６−８０５５３号公報
【特許文献６】特開平６−８０５７６号公報
【特許文献７】特開平６−９４１５号公報
【特許文献８】特開平６−９４１６号公報
【特許文献９】特開平３−６８５１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「BIO INDUSTRY」、１９９１年、第８巻、ｐ．３４６
【非特許文献２】「BIO INDUSTRY」、１９９１年、第１１巻、ｐ．６３２
【非特許文献３】「Science」、１９８５年、第２２８巻、ｐ．１３２４
【非特許文献４】「炎症」、１９８４年、第４巻、ｐ．４３７
【非特許文献５】「結合組織」、１９９４年、第２５巻、ｐ．２４３
【非特許文献６】「Ｊ. Cellar Physiology」、１９９４年、第１６０巻、ｐ．２７５
【非特許文献７】「炎症」、１９８４年、第４巻、ｐ．４３７
【非特許文献８】「結合組織」、１９９４年、第２５巻、ｐ．２４３
【非特許文献９】「FEBS Letters」、１９９４年、第３４７巻、ｐ．９５
【非特許文献１０】「B.B.A.」、１９９０年、第１７２巻、ｐ．７０
【非特許文献１１】「J. Clin. Invest.」、１９９２年、第９０巻、ｐ．１４９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明の目的とするところは、ヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患及びヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している歯肉炎、乾皮症、荒れ肌、乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待でき、しかも直接線維芽細胞に作用する医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的は、ケショウシメジ抽出物、又はケショウシメジに含まれる特定の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料によって達成できる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を阻害するヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している疾患に優れた医薬品組成物、荒れ肌又は乾燥肌防止剤及び化粧料を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の構成について詳説する。
【００１３】
本発明に用いられるケショウシメジ抽出物としては、キシメジ科、キシメジ属に属するケショウシメジ（Tricholoma orirubens）の抽出物、又はその乾燥エキス末が挙げられる。
【００１４】
ケショウシメジ抽出物を製造する方法としては、例えばケショウシメジ子実体の凍結乾燥物に対し重量比で５〜３０倍の抽出溶剤を加え、通常１５〜５０℃で２４時間〜１週間浸漬して抽出液を得る方法等が挙げられる。また、抽出液をろ過又は遠心分離して不溶物を除去し、次いで通常の濃縮手段、例えば減圧濃縮等して濃縮抽出物として得ることもできる。
【００１５】
ケショウシメジ抽出物を製造する際に用いる抽出溶剤としては、例えば、水や、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール等の水溶性有機溶剤、又はこれらの混合溶剤が挙げられる。更に酢酸エチル等の極性有機溶媒によって再抽出してもよい。
【００１６】
ケショウシメジの乾燥エキス末を製造する方法としては、前記抽出物を通常の乾燥手段、例えば減圧乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥等により乾燥エキス末として得る方法等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられる下記一般式（１）及び（２）で示される化合物は、ケショウシメジ抽出物又は乾燥エキス末より得ることができる。
【００１８】
【化１】
【００１９】
［但し、式中Ｒ1は、メチル基又はカルボキシル基であり、Ｒ1がメチル基の場合、Ｒ2はカルボキシル基であり、Ｒ1がカルボキシル基の場合、Ｒ2はメチル基である。］
【００２０】
【化２】
【００２１】
尚、以下一般式（１）で示される化合物のうち、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＣＯＯＨのものをorirubenoneＡ、またＲ1＝ＣＯＯＨ、Ｒ2＝ＣＨ3のものをorirubenoneＢと称し、一般式（２）で示される化合物を、orirubenoneＣと称する。
【００２２】
本発明に係るorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを単離する方法としては、前記抽出物又は乾燥エキス末をメタノール等の有機溶剤で再抽出し、シリカゲルカラム等の分離手段で精製してorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃ画分として得る、又は更にシリカゲルカラム等の分離手段を繰り返したり、ＨＰＬＣを用いてorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを単離する方法等が挙げられる。
【００２３】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤は、ヒアルロン酸の異常分解が亢進している疾患の改善・治療剤、又はヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している疾患に対して、優れた歯肉炎防止剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤として用いられる。更には、通常の医薬組成物、化粧料の有効成分として、その他、培養細胞系に添加して研究・試験用試薬等として用いることもできる。化粧料として用いる場合は、特に皮膚に適用する皮膚化粧料が望ましい。尚、本発明において化粧料とは入浴剤をも包含するものである。
【００２４】
本発明において疾患とは、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進しているか、又はヒアルロン酸が異常に分解している症状を言う。
【００２５】
本発明においてヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患とは、ヒアルロン酸の分解が患部で異常亢進している、肝炎、歯肉炎、リウマチ、変形関節炎及び悪性腫瘍、また血清中でヒアルロン酸量が増大していることから患部でヒアルロン酸の分解が異常に亢進していると考えられる肝硬変、移植拒否、強皮症、並びに疾患によって臓器が硬化する肝硬変、動脈硬化等の線維症、更にはヒアルロン酸分解の結果として患部で水分保持能力が低下している乾皮症、乾燥肌、荒れ肌、その他動脈硬化、腎炎、ケロイド、過修復、敗血症等の疾患を言う。
【００２６】
本発明におけるヒアルロン酸異常分解疾患改善・治療剤とは、ヒアルロン酸の分解が異常に亢進した疾患を伴った患者に適用する薬剤を言う。
【００２７】
ヒスタミンは線維芽細胞のヒアルロン酸分解を促進することが知られていることから（特開平８-２２５４４７号公報）、前記ヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患の内、特に患者の血清中においてヒスタミン量が増大しているリウマチ、強皮症、ケロイド、悪性腫瘍、移植拒否に対しては、抗ヒスタミン剤との併用によって本発明の医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤は更に優れた効果が期待できる。
【００２８】
本発明における防止剤とは、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者に適用するものを言い、荒れ肌及び乾燥肌等が挙げられる。尚、予防として該防止剤を正常人が使用することもできるが、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者が適用するのが特に好ましい。
【００２９】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤及び防止剤の形態としては、適当な賦形剤、担体、希釈剤を用いて、錠剤、液剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤、坐剤、入浴剤等の剤形とすることができ、またゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、パック類、乳液、パウダー等の剤形が挙げられる。
【００３０】
係る製剤の調製は常法によって行われ、例えば、固形製剤については用途によって通常の医薬添加物、医薬部外品添加物、食品添加物、化粧品添加物等適宜選択でき、例えば、乳糖、でんぷん、結晶セルロース、タルク等を用いて製剤化することができる。カプセル剤はそのようにして調製された細粒剤、散剤等を適当なカプセルに充填して得ることができる。液剤は白糖、カルボキシメチルセルロース等を含む水溶液に本発明の薬剤を溶解、又は懸濁することにより調製することができる。
【００３１】
また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤及び防止剤に使用される賦形剤又は補助剤としては、通常、化粧品や医薬品、医薬部外品、食品等に使用されるもので良く、用途、剤形に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。例えばワセリン、スクワラン等の炭化水素、ステアリルアルコール等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン酸等の動物性油脂、グリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレンアルキルエーテルリン酸等の界面活性剤、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤、蝋、樹脂、各種香料、各種色素、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸等の各種有機酸や無機酸及びそれらの塩、水、及びエタノール等が挙げられる。
【００３２】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤を培養細胞系において研究・試験用試薬として用いる場合、配合量としては、培養細胞により高分子ヒアルロン酸を産生させるときは、培養液中に１μｍｏｌ／Ｌ以上含有されるのが好ましく、更に好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【００３３】
また本発明の医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤、及び化粧料におけるケショウシメジ抽出物、及びorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃの配合量としては、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等種々の要因により異なり一概には規定できないが、適用する組成物の総量を１００ｇ基準として、０．０００１ｇ〜１５ｇが好ましく、特に０．００１ｇ〜１０ｇが好ましい。０．０００１ｇ未満では本発明の効果が得られない場合があり、１５ｇを超えて配合しても配合量に見合った効果が得られない場合がある。尚、該抽出物においては上記数値は乾燥エキス末としての換算値を適用する。
【００３４】
本発明の医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤の投与方法としては、経口又は非経口投与が可能である。
【００３５】
通常１日当たり投与量としては、経口投与では、orirubenoneＡ、Ｂ、Ｃの量として１０μｇ〜１０ｇが好ましく、特に５０μｇ〜１ｇが好ましい。非経口投与では、５００μｇ〜１ｇが好ましい。しかしながら、投与量は、目的、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等により適宜変更されうるものであり、一概には規定できない。
【００３６】
本発明において、結合組織に存在する線維芽細胞には、その細胞間マトリクスの成分であるヒアルロン酸を分解する作用があり、これをorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃが抑制することが明らかになった。
【００３７】
その結果、本発明に係るorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを含有するヒアルロン酸分解阻害剤、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤によってアレルギー性疾患はもとより、結合組織においてヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患に対する治療が十分期待できる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例、比較例により本発明を更に詳しく説明する。尚、実施例に先立ちヒアルロン酸分解阻害剤の効果を調べるための評価系について説明する。以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥと略記する。
【００３９】
（１）ＭＥＭ培地の調製法
Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬社製、１０−１０１）１０．６ｇにそれぞれ終濃度として１％（Ｖ／Ｖ）Ｎｏｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（大日本製薬社製、１６−８１０）、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、１６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、蒸留水を加えて１Ｌとした後、炭酸ガスを吹き込んでｐＨを約７にした（以下、ＭＥＭ培地と略記する）。
【００４０】
（２）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化
ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５６℃で３０分間加熱処理した。
【００４１】
（３）細胞添加用高分子トリチウムヒアルロン酸の調製方法
正常ヒト線維芽細胞株［デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １１０）］の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて２×１０5個／ｍＬに調整し、２２５ｃｍ2のフラスコに５０ｍＬ入れ、３日間培養しコンフルエント状態にした。その後、ヒアルロン酸の前駆体であるトリチウムグルコサミン（American Radiolabeled Chemicals Inc.社製）を培養系に添加し（１０μＣｉ／ｍＬ）、更に３日間培養したのち、培養液からトリチウムラベルされたヒアルロン酸をUnderhill らの方法（J.Cell Biology，８２巻，４７５頁，１９７９年）によって精製し、更にゲルろ過カラムにより分子量１００万以上の高分子トリチウムヒアルロン酸（比放射活性０．１μＣｉ／μｇ）を調製した。これを細胞培養系への添加用高分子トリチウムヒアルロン酸とした。
【００４２】
（４）高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
正常ヒト線維芽細胞株［デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １１０）］の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．０×１０5個／ｍＬに調整し、２４穴プレート（ファルコン社製）に０．４ｍＬずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、更に、ＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４０００ＤＰＭ／ｍＬ＝２３３．３Ｂｑ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。尚、培地交換時に各種評価を行う薬剤（試料）を添加した。
【００４３】
（５）細胞による高分子トリチウムヒアルロン酸の分解評価
培養終了後、培養液を回収し、１００℃で５分間加熱処理を行った後、培地１ｍＬをセファロースＣＬ−２Ｂカラム（内径１ｃｍ、長さ６０ｃｍ）にアプライし、以下の条件でゲルろ過を行った。
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
分画：４ｍＬ／画分
分画総数：２５
更に分子量１００万以上のヒアルロン酸が溶出する画分５〜７の３本を集め、［3Ｈ］放射活性を測定し、分解したヒアルロン酸の量を求めた。更に、ヒアルロン酸分解率及び分解阻害率は以下の数１、数２によって求めた。
【００４４】
（数１）
ヒアルロン酸分解率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
Ａ＝無添加時のヒアルロン酸分解量
Ｂ＝薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００４５】
（数２）
ヒアルロン酸分解阻害率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ＝無添加時のヒアルロン酸分解量
Ｂ＝薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００４６】
実施例１（ケショウシメジ抽出物の調製）
ケショウシメジの子実体８．５ｋｇからメタノールで抽出を行った。またその残渣から８５％メタノールで抽出を行い、更にその残渣からアセトンで抽出を行った。得られた抽出液を混合後、減圧濃縮し、クロロホルムと蒸留水で溶媒分画した。水可溶部は更に酢酸エチルと蒸留水で溶媒分画し、酢酸エチル可溶性画分Ａ（３．４ｇ）を得た。
【００４７】
実施例２
上記実施例１の酢酸エチル可溶性画分Ａのうち１．５ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ，内径４ｃｍ，長さ５０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロホルム／アセトン（１０／０，７／３，３／７）、クロロホルム／メタノール（９／１，５／５，０／１０）で展開し、９画分を得、第５画分を減圧濃縮し３７０．７ｍｇを得た。
【００４８】
実施例３
上記実施例２（３７０．７ｍｇ）をＯＤＳ（ＵＬＴＲＡ ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ｓ−５０Ｄ，ＹＡＭＡＺＥＮ，内径５ｃｍ，長さ３０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒として６０％メタノールで展開し、１４画分を得、第６画分を減圧濃縮し４５．６ｍｇを得た。
【００４９】
実施例４（orirubenoneＡ）及び実施例５（orirubenoneＢ）の調製
上記実施例３（４５．６ｍｇ）をＨＰＬＣ（Ｇｒａｎｄ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−５ ＹＣ，ＭＡＳＩＳ，内径２ｃｍ，長さ２５ｃｍ）に供与し、６０％メタノールで分画し、３画分を得、第２画分を減圧濃縮し１８．５ｍｇのorirubenoneＡ、Ｂ含有画分を得た。これをｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＴＬＣ（Ｃ１８ Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，２．５×８．０ｃｍ）に供与し、６０％メタノールで分画し、５画分を得、第３画分を減圧濃縮し３．６ｍｇのorirubenoneＡ、及び第２画分を減圧濃縮し２．５ｍｇのorirubenoneＢを得た。
【００５０】
そして下記に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）及びマススペクトル（日本電子社製、ＪＯＥＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）により、一般式（１）で示されるorirubenoneＡ、Ｂであることを確認した。
【００５１】
orirubenoneＡデータ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；1.85(s)，2.11(s)，2.40(t，J=6.9Hz)，2.48(dt，J=6
.7，6.9Hz)，6.28(s)，6.62(s)，6.74(t，J=6.7Hz)，7.17(s)
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；12.9，19.5，27.7，40.7，104.1，113.8，116.0，122.0，131.2，139.3，140.9，155.7，157.2，160.7，173.0，196.5
ＦＡＢ−ＭＳ ： ｍ／ｚ ３０７（［Ｍ＋Ｈ]+）
【００５２】
orirubenoneＢデータ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；1.84(s)，2.04(s)，2.40(t，J=5.5Hz)，2.41(dt，J=5.8，5.5Hz)，6.25(s)，6.53(s)，6.55(t，J=5.8Hz)，7.17(s)
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；13.7，19.3，27.3，40.6，104.1，111.3，116.0，122.8，134.9，137.3，139.5，155.8，156.1，160.5，176.6，197.1
【００５３】
実施例６
また上記実施例１の酢酸エチル可溶性画分Ａのうち１．５ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ，内径４ｃｍ，長さ５０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロホルム／アセトン（１０／０，７／３，３／７）、クロロホルム／メタノール（９／１，５／５，０／１０）で展開し、９画分を得、第５画分を減圧濃縮し３７０．７ｍｇを得た。
【００５４】
実施例７
上記実施例７（３７０．７ｍｇ）をＯＤＳ（ＵＬＴＲＡ ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ｓ−５０Ｄ，ＹＡＭＡＺＥＮ，内径５ｃｍ，長さ３０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒として６０％メタノールで展開し、１４画分を得、第４画分を減圧濃縮し２７．４ｍｇを得た。
【００５５】
実施例８（orirubenoneＣ）の調製
上記実施例８（２７．４ｍｇ）をＨＰＬＣ（Ｇｒａｎｄ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−５ ＹＣ，ＭＡＳＩＳ，内径２ｃｍ，長さ２５ｃｍ）に供与し、４０％メタノールで分画し、３画分を得、第２画分を減圧濃縮し１０．１ｍｇのorirubenoneＣを得た。
【００５６】
そして下記に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）により、一般式（２）で示されるorirubenoneＣであることを確認した。
【００５７】
orirubenoneＣデータ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；1.39(s)，1.74(m)，1.78(s)，1.88(m)，2.33(m)，2.58(d，J=16.5Hz)，2.71(d，J=16.5Hz)，6.31(s)，6.73(m)，7.13(s)
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；12.4，23.9，24.0，38.7，47.9，81.7，104.7，111.2，113.5，129.6，141.7，142.6，156.2，157.1，171.9，193.5
【００５８】
実施例１〜８、比較例３
実施例１〜８それぞれ５０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍＬに溶解し、それぞれのＤＭＳＯ溶液を調製した。また、比較例３として従来知られている牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチン［炎症、４巻、ＮＯ４、４３７（１９８４）］０．１８ｇを水１０ｇに溶解し、水溶液を調製した。
【００５９】
試験例
実施例１〜８、比較例１（水溶液）、比較例２（ＤＭＳＯのみ）並びに比較例３を用いて、前述した（５）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解を調べ、ヒアルロン酸分解率及びヒアルロン酸分解阻害率を前記数１、数２より算出した。結果を表２に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
その結果、実施例１〜８のorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを含むケショウシメジ抽出物、orirubenoneＡ、Ｂ、Ｃ画分、いずれの薬剤においてもヒアルロン酸分解の阻害効果が認められた。また比較例３に示した牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチンの添加は、ヒトの細胞培養系である本評価系において全く効果がないことがわかった。
【００６２】
この結果からケショウシメジ抽出物、及びorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃは、ヒトのヒアルロン酸分解抑制剤として有効である。また本発明のヒアルロン酸分解抑制剤はヒアルロン酸分解が異常に亢進している疾患に有効であると考えられる。
【００６３】
実施例９〜１２（錠剤）
【００６４】
【表２】
【００６５】
上記の各成分を均一に混合し、常法に従って、１錠１７０ｍｇとなるように打錠し、錠剤を調製した。
【００６６】
実施例１３〜１６（カプセル剤）
【００６７】
【表３】
【００６８】
上記の各成分を均一に混合し、常法に従って、混合物の１５０ｍｇを３号硬カプセルに充填した。
【００６９】
実施例１７〜２０（液剤）
【００７０】
【表４】
【００７１】
精製水に上記の各成分を溶解し、攪拌均一化してシロップ剤とした。
【００７２】
実施例２１〜２４（クリーム）
【００７３】
【表５】
【００７４】
成分（Ａ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｂ）を混合溶解した（混合液Ｉ）。これとは別に、成分（Ｄ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｃ）を混合溶解した（混合液ＩＩ）。次に、混合液Ｉに、徐々に混合液ＩＩを加えて、充分攪拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００７５】
実施例２５〜２７（ローション）
【００７６】
【表６】
【００７７】
各成分を混合溶解して、ローションを調製した。
【００７８】
実施例２８〜３０（入浴剤）
【００７９】
【表７】
【００８０】
各成分を混合し、入浴剤を調製した。なお、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。
【００８１】
実施例３１〜３２（練歯磨）
【００８２】
【表８】
【００８３】
常法に従い、水、グリセリン、カラギナン、サッカリン、パラオキシ安息香酸ブチル、クロルヘキシジンジグリコネート、香料及びエルゴステロール配糖体誘導体を計量し、混合して粘結剤を膨潤させたのち、第２リン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、更によく混合し脱泡したのち、チューブに充填して練歯磨を得た。
【００８４】
実施例３３〜３４（洗口剤）
【００８５】
【表９】
【００８６】
常法に従い、上記組成からなる洗口剤を調製した。
【００８７】
実施例３５〜３８（関節注入剤）
【００８８】
【表１０】
【００８９】
記載された成分の水溶液を加熱または濾過滅菌し、注射シリンジに２．５ｍＬずつ分注し、関節注入剤を調製した。
【００９０】
尚、上記実施例２５〜３０において用いた香料は、下記香料処方のものである。
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患及びヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している歯肉炎、乾皮症、荒れ肌、乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待でき、しかも直接線維芽細胞に作用する医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリクスを形成することに基づく細胞の保持、臓器組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害などの外力への抵抗、及び細菌感染の防止等多くの機能を有している（非特許文献１参照）。
【０００３】
更に、近年ヒアルロン酸はその分子量によって様々な生理作用を持つことがわかってきた。例えば、生体内で合成されていると考えられている高分子ヒアルロン酸（分子量１００万以上）はプロテオグリカン遊離抑制作用、ブラジキニン関節疼痛抑制作用、損傷軟骨修復作用、関節炎抑制作用を持つことから炎症抑制効果を持ち（非特許文献２参照）、その分解（低分子化）産物である低分子化ヒアルロン酸は、血管新生促進作用（非特許文献３参照）、白血球走化性促進作用（特許文献１参照）を持つことから炎症促進作用を持つと考えられている。
【０００４】
以上のことからヒアルロン酸の低分子化は肝炎、歯肉炎（非特許文献４参照）、関節リウマチ、変形性関節症（非特許文献５参照）、悪性腫瘍（非特許文献６参照）の症状悪化に密接に関連すると考えられ、したがって、ヒアルロン酸の低分子化を予防・防止するヒアルロン酸の分解阻害剤が望まれている。
【０００５】
実際、結合組織中のヒアルロン酸を低分子化するヒアルロニダーゼが炎症促進作用を持つ酵素として想定され、その阻害剤が薬理効果があることが期待された（非特許文献７参照）。しかし、ヒト結合組織を形成する線維芽細胞からヒアルロニダーゼが単離された報告はいまだなく、そのためヒト線維芽細胞の酵素が牛精巣由来のヒアルロニダーゼと同様な性質を持っていると仮定し、牛精巣由来のヒアルロニダーゼを用いた種々の阻害剤が報告されている（特許文献２〜９参照）のが現状である。
【０００６】
しかし、近年、関節に存在するヒト滑膜細胞（非特許文献８参照）、ヒト子宮けい管細胞（非特許文献９参照）、ヒト皮膚線維芽細胞（非特許文献１０参照）、ヒト肺線維芽細胞（非特許文献１１参照）において、エンド型でありヒアルロン酸を４糖、６糖にまで分解する牛精巣由来のヒアルロニダーゼとは明らかに異なるヒアルロン酸分解機構の存在が報告されている。これらのことから精巣由来のヒアルロニダーゼの阻害剤ではヒトのヒアルロン酸分解を効果的に阻害することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−８３２３号公報
【特許文献２】特公平６−２９２７１号公報
【特許文献３】特公平６−４５８４号公報
【特許文献４】特開平５−１７８８７６号公報
【特許文献５】特開平６−８０５５３号公報
【特許文献６】特開平６−８０５７６号公報
【特許文献７】特開平６−９４１５号公報
【特許文献８】特開平６−９４１６号公報
【特許文献９】特開平３−６８５１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「BIO INDUSTRY」、１９９１年、第８巻、ｐ．３４６
【非特許文献２】「BIO INDUSTRY」、１９９１年、第１１巻、ｐ．６３２
【非特許文献３】「Science」、１９８５年、第２２８巻、ｐ．１３２４
【非特許文献４】「炎症」、１９８４年、第４巻、ｐ．４３７
【非特許文献５】「結合組織」、１９９４年、第２５巻、ｐ．２４３
【非特許文献６】「Ｊ. Cellar Physiology」、１９９４年、第１６０巻、ｐ．２７５
【非特許文献７】「炎症」、１９８４年、第４巻、ｐ．４３７
【非特許文献８】「結合組織」、１９９４年、第２５巻、ｐ．２４３
【非特許文献９】「FEBS Letters」、１９９４年、第３４７巻、ｐ．９５
【非特許文献１０】「B.B.A.」、１９９０年、第１７２巻、ｐ．７０
【非特許文献１１】「J. Clin. Invest.」、１９９２年、第９０巻、ｐ．１４９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明の目的とするところは、ヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患及びヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している歯肉炎、乾皮症、荒れ肌、乾燥肌等に対し予防・治療効果が期待でき、しかも直接線維芽細胞に作用する医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的は、ケショウシメジ抽出物、又はケショウシメジに含まれる特定の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤並びに化粧料によって達成できる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ヒト結合組織に存在する細胞に作用し、ヒアルロン酸分解を阻害するヒアルロン酸分解阻害剤、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している疾患に優れた医薬品組成物、荒れ肌又は乾燥肌防止剤及び化粧料を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の構成について詳説する。
【００１３】
本発明に用いられるケショウシメジ抽出物としては、キシメジ科、キシメジ属に属するケショウシメジ（Tricholoma orirubens）の抽出物、又はその乾燥エキス末が挙げられる。
【００１４】
ケショウシメジ抽出物を製造する方法としては、例えばケショウシメジ子実体の凍結乾燥物に対し重量比で５〜３０倍の抽出溶剤を加え、通常１５〜５０℃で２４時間〜１週間浸漬して抽出液を得る方法等が挙げられる。また、抽出液をろ過又は遠心分離して不溶物を除去し、次いで通常の濃縮手段、例えば減圧濃縮等して濃縮抽出物として得ることもできる。
【００１５】
ケショウシメジ抽出物を製造する際に用いる抽出溶剤としては、例えば、水や、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール等の水溶性有機溶剤、又はこれらの混合溶剤が挙げられる。更に酢酸エチル等の極性有機溶媒によって再抽出してもよい。
【００１６】
ケショウシメジの乾燥エキス末を製造する方法としては、前記抽出物を通常の乾燥手段、例えば減圧乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥等により乾燥エキス末として得る方法等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられる下記一般式（１）及び（２）で示される化合物は、ケショウシメジ抽出物又は乾燥エキス末より得ることができる。
【００１８】
【化１】
【００１９】
［但し、式中Ｒ1は、メチル基又はカルボキシル基であり、Ｒ1がメチル基の場合、Ｒ2はカルボキシル基であり、Ｒ1がカルボキシル基の場合、Ｒ2はメチル基である。］
【００２０】
【化２】
【００２１】
尚、以下一般式（１）で示される化合物のうち、Ｒ1＝ＣＨ3、Ｒ2＝ＣＯＯＨのものをorirubenoneＡ、またＲ1＝ＣＯＯＨ、Ｒ2＝ＣＨ3のものをorirubenoneＢと称し、一般式（２）で示される化合物を、orirubenoneＣと称する。
【００２２】
本発明に係るorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを単離する方法としては、前記抽出物又は乾燥エキス末をメタノール等の有機溶剤で再抽出し、シリカゲルカラム等の分離手段で精製してorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃ画分として得る、又は更にシリカゲルカラム等の分離手段を繰り返したり、ＨＰＬＣを用いてorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを単離する方法等が挙げられる。
【００２３】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤は、ヒアルロン酸の異常分解が亢進している疾患の改善・治療剤、又はヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進している疾患に対して、優れた歯肉炎防止剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤として用いられる。更には、通常の医薬組成物、化粧料の有効成分として、その他、培養細胞系に添加して研究・試験用試薬等として用いることもできる。化粧料として用いる場合は、特に皮膚に適用する皮膚化粧料が望ましい。尚、本発明において化粧料とは入浴剤をも包含するものである。
【００２４】
本発明において疾患とは、ヒアルロン酸分解が生理的に正常時より亢進しているか、又はヒアルロン酸が異常に分解している症状を言う。
【００２５】
本発明においてヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患とは、ヒアルロン酸の分解が患部で異常亢進している、肝炎、歯肉炎、リウマチ、変形関節炎及び悪性腫瘍、また血清中でヒアルロン酸量が増大していることから患部でヒアルロン酸の分解が異常に亢進していると考えられる肝硬変、移植拒否、強皮症、並びに疾患によって臓器が硬化する肝硬変、動脈硬化等の線維症、更にはヒアルロン酸分解の結果として患部で水分保持能力が低下している乾皮症、乾燥肌、荒れ肌、その他動脈硬化、腎炎、ケロイド、過修復、敗血症等の疾患を言う。
【００２６】
本発明におけるヒアルロン酸異常分解疾患改善・治療剤とは、ヒアルロン酸の分解が異常に亢進した疾患を伴った患者に適用する薬剤を言う。
【００２７】
ヒスタミンは線維芽細胞のヒアルロン酸分解を促進することが知られていることから（特開平８-２２５４４７号公報）、前記ヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患の内、特に患者の血清中においてヒスタミン量が増大しているリウマチ、強皮症、ケロイド、悪性腫瘍、移植拒否に対しては、抗ヒスタミン剤との併用によって本発明の医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤は更に優れた効果が期待できる。
【００２８】
本発明における防止剤とは、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者に適用するものを言い、荒れ肌及び乾燥肌等が挙げられる。尚、予防として該防止剤を正常人が使用することもできるが、ヒアルロン酸の分解が生理的に正常時より亢進している症状者が適用するのが特に好ましい。
【００２９】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤及び防止剤の形態としては、適当な賦形剤、担体、希釈剤を用いて、錠剤、液剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤、坐剤、入浴剤等の剤形とすることができ、またゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、パック類、乳液、パウダー等の剤形が挙げられる。
【００３０】
係る製剤の調製は常法によって行われ、例えば、固形製剤については用途によって通常の医薬添加物、医薬部外品添加物、食品添加物、化粧品添加物等適宜選択でき、例えば、乳糖、でんぷん、結晶セルロース、タルク等を用いて製剤化することができる。カプセル剤はそのようにして調製された細粒剤、散剤等を適当なカプセルに充填して得ることができる。液剤は白糖、カルボキシメチルセルロース等を含む水溶液に本発明の薬剤を溶解、又は懸濁することにより調製することができる。
【００３１】
また本発明のヒアルロン酸分解阻害剤及び防止剤に使用される賦形剤又は補助剤としては、通常、化粧品や医薬品、医薬部外品、食品等に使用されるもので良く、用途、剤形に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。例えばワセリン、スクワラン等の炭化水素、ステアリルアルコール等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン酸等の動物性油脂、グリセリン、プロピレングリコール等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、ポリエチレンアルキルエーテルリン酸等の界面活性剤、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の防腐剤、蝋、樹脂、各種香料、各種色素、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸等の各種有機酸や無機酸及びそれらの塩、水、及びエタノール等が挙げられる。
【００３２】
本発明のヒアルロン酸分解阻害剤を培養細胞系において研究・試験用試薬として用いる場合、配合量としては、培養細胞により高分子ヒアルロン酸を産生させるときは、培養液中に１μｍｏｌ／Ｌ以上含有されるのが好ましく、更に好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【００３３】
また本発明の医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、荒れ肌又は乾燥肌防止剤、及び化粧料におけるケショウシメジ抽出物、及びorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃの配合量としては、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等種々の要因により異なり一概には規定できないが、適用する組成物の総量を１００ｇ基準として、０．０００１ｇ〜１５ｇが好ましく、特に０．００１ｇ〜１０ｇが好ましい。０．０００１ｇ未満では本発明の効果が得られない場合があり、１５ｇを超えて配合しても配合量に見合った効果が得られない場合がある。尚、該抽出物においては上記数値は乾燥エキス末としての換算値を適用する。
【００３４】
本発明の医薬組成物、ヒアルロン酸分解阻害剤、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤の投与方法としては、経口又は非経口投与が可能である。
【００３５】
通常１日当たり投与量としては、経口投与では、orirubenoneＡ、Ｂ、Ｃの量として１０μｇ〜１０ｇが好ましく、特に５０μｇ〜１ｇが好ましい。非経口投与では、５００μｇ〜１ｇが好ましい。しかしながら、投与量は、目的、対象とする疾患の種類、程度、患者の年齢、体重、及び性別等により適宜変更されうるものであり、一概には規定できない。
【００３６】
本発明において、結合組織に存在する線維芽細胞には、その細胞間マトリクスの成分であるヒアルロン酸を分解する作用があり、これをorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃが抑制することが明らかになった。
【００３７】
その結果、本発明に係るorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを含有するヒアルロン酸分解阻害剤、及び荒れ肌又は乾燥肌防止剤によってアレルギー性疾患はもとより、結合組織においてヒアルロン酸の異常分解が伴う疾患に対する治療が十分期待できる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例、比較例により本発明を更に詳しく説明する。尚、実施例に先立ちヒアルロン酸分解阻害剤の効果を調べるための評価系について説明する。以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥと略記する。
【００３９】
（１）ＭＥＭ培地の調製法
Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬社製、１０−１０１）１０．６ｇにそれぞれ終濃度として１％（Ｖ／Ｖ）Ｎｏｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（大日本製薬社製、１６−８１０）、１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム（大日本製薬社製、１６−８２０）、１．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナトリウム、蒸留水を加えて１Ｌとした後、炭酸ガスを吹き込んでｐＨを約７にした（以下、ＭＥＭ培地と略記する）。
【００４０】
（２）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非働化
ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を５６℃で３０分間加熱処理した。
【００４１】
（３）細胞添加用高分子トリチウムヒアルロン酸の調製方法
正常ヒト線維芽細胞株［デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １１０）］の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて２×１０5個／ｍＬに調整し、２２５ｃｍ2のフラスコに５０ｍＬ入れ、３日間培養しコンフルエント状態にした。その後、ヒアルロン酸の前駆体であるトリチウムグルコサミン（American Radiolabeled Chemicals Inc.社製）を培養系に添加し（１０μＣｉ／ｍＬ）、更に３日間培養したのち、培養液からトリチウムラベルされたヒアルロン酸をUnderhill らの方法（J.Cell Biology，８２巻，４７５頁，１９７９年）によって精製し、更にゲルろ過カラムにより分子量１００万以上の高分子トリチウムヒアルロン酸（比放射活性０．１μＣｉ／μｇ）を調製した。これを細胞培養系への添加用高分子トリチウムヒアルロン酸とした。
【００４２】
（４）高分子トリチウムヒアルロン酸の添加培養
正常ヒト線維芽細胞株［デトロイト５５１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １１０）］の細胞数を１０％（Ｖ／Ｖ）の非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて１．０×１０5個／ｍＬに調整し、２４穴プレート（ファルコン社製）に０．４ｍＬずつ播種し、９５％（Ｖ／Ｖ）空気−５％（Ｖ／Ｖ）炭酸ガスの雰囲気下、３７℃で３日間静置培養し、更に、ＭＥＭ培地のみに培地交換し、１日間培養した。その後、高分子トリチウムヒアルロン酸を含む（１４０００ＤＰＭ／ｍＬ＝２３３．３Ｂｑ）ＭＥＭ培地を調製し、培地交換をし、３日間培養を行った。尚、培地交換時に各種評価を行う薬剤（試料）を添加した。
【００４３】
（５）細胞による高分子トリチウムヒアルロン酸の分解評価
培養終了後、培養液を回収し、１００℃で５分間加熱処理を行った後、培地１ｍＬをセファロースＣＬ−２Ｂカラム（内径１ｃｍ、長さ６０ｃｍ）にアプライし、以下の条件でゲルろ過を行った。
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
分画：４ｍＬ／画分
分画総数：２５
更に分子量１００万以上のヒアルロン酸が溶出する画分５〜７の３本を集め、［3Ｈ］放射活性を測定し、分解したヒアルロン酸の量を求めた。更に、ヒアルロン酸分解率及び分解阻害率は以下の数１、数２によって求めた。
【００４４】
（数１）
ヒアルロン酸分解率（％）＝Ｂ／Ａ×１００
Ａ＝無添加時のヒアルロン酸分解量
Ｂ＝薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００４５】
（数２）
ヒアルロン酸分解阻害率（％）＝（１−Ｂ／Ａ）×１００
Ａ＝無添加時のヒアルロン酸分解量
Ｂ＝薬剤添加によるヒアルロン酸分解量
【００４６】
実施例１（ケショウシメジ抽出物の調製）
ケショウシメジの子実体８．５ｋｇからメタノールで抽出を行った。またその残渣から８５％メタノールで抽出を行い、更にその残渣からアセトンで抽出を行った。得られた抽出液を混合後、減圧濃縮し、クロロホルムと蒸留水で溶媒分画した。水可溶部は更に酢酸エチルと蒸留水で溶媒分画し、酢酸エチル可溶性画分Ａ（３．４ｇ）を得た。
【００４７】
実施例２
上記実施例１の酢酸エチル可溶性画分Ａのうち１．５ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ，内径４ｃｍ，長さ５０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロホルム／アセトン（１０／０，７／３，３／７）、クロロホルム／メタノール（９／１，５／５，０／１０）で展開し、９画分を得、第５画分を減圧濃縮し３７０．７ｍｇを得た。
【００４８】
実施例３
上記実施例２（３７０．７ｍｇ）をＯＤＳ（ＵＬＴＲＡ ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ｓ−５０Ｄ，ＹＡＭＡＺＥＮ，内径５ｃｍ，長さ３０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒として６０％メタノールで展開し、１４画分を得、第６画分を減圧濃縮し４５．６ｍｇを得た。
【００４９】
実施例４（orirubenoneＡ）及び実施例５（orirubenoneＢ）の調製
上記実施例３（４５．６ｍｇ）をＨＰＬＣ（Ｇｒａｎｄ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−５ ＹＣ，ＭＡＳＩＳ，内径２ｃｍ，長さ２５ｃｍ）に供与し、６０％メタノールで分画し、３画分を得、第２画分を減圧濃縮し１８．５ｍｇのorirubenoneＡ、Ｂ含有画分を得た。これをｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＴＬＣ（Ｃ１８ Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，２．５×８．０ｃｍ）に供与し、６０％メタノールで分画し、５画分を得、第３画分を減圧濃縮し３．６ｍｇのorirubenoneＡ、及び第２画分を減圧濃縮し２．５ｍｇのorirubenoneＢを得た。
【００５０】
そして下記に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）及びマススペクトル（日本電子社製、ＪＯＥＬ−ＤＸ３０３ＨＦ）により、一般式（１）で示されるorirubenoneＡ、Ｂであることを確認した。
【００５１】
orirubenoneＡデータ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；1.85(s)，2.11(s)，2.40(t，J=6.9Hz)，2.48(dt，J=6
.7，6.9Hz)，6.28(s)，6.62(s)，6.74(t，J=6.7Hz)，7.17(s)
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；12.9，19.5，27.7，40.7，104.1，113.8，116.0，122.0，131.2，139.3，140.9，155.7，157.2，160.7，173.0，196.5
ＦＡＢ−ＭＳ ： ｍ／ｚ ３０７（［Ｍ＋Ｈ]+）
【００５２】
orirubenoneＢデータ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；1.84(s)，2.04(s)，2.40(t，J=5.5Hz)，2.41(dt，J=5.8，5.5Hz)，6.25(s)，6.53(s)，6.55(t，J=5.8Hz)，7.17(s)
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；13.7，19.3，27.3，40.6，104.1，111.3，116.0，122.8，134.9，137.3，139.5，155.8，156.1，160.5，176.6，197.1
【００５３】
実施例６
また上記実施例１の酢酸エチル可溶性画分Ａのうち１．５ｇをシリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０Ｎ，内径４ｃｍ，長さ５０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒としてクロロホルム／アセトン（１０／０，７／３，３／７）、クロロホルム／メタノール（９／１，５／５，０／１０）で展開し、９画分を得、第５画分を減圧濃縮し３７０．７ｍｇを得た。
【００５４】
実施例７
上記実施例７（３７０．７ｍｇ）をＯＤＳ（ＵＬＴＲＡ ＰＡＣＫ ＯＤＳ−Ｓ−５０Ｄ，ＹＡＭＡＺＥＮ，内径５ｃｍ，長さ３０ｃｍ）カラムに供与し、展開溶媒として６０％メタノールで展開し、１４画分を得、第４画分を減圧濃縮し２７．４ｍｇを得た。
【００５５】
実施例８（orirubenoneＣ）の調製
上記実施例８（２７．４ｍｇ）をＨＰＬＣ（Ｇｒａｎｄ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ｓ−５ ＹＣ，ＭＡＳＩＳ，内径２ｃｍ，長さ２５ｃｍ）に供与し、４０％メタノールで分画し、３画分を得、第２画分を減圧濃縮し１０．１ｍｇのorirubenoneＣを得た。
【００５６】
そして下記に示すＮＭＲシグナル（日本電子社製、ＪＥＯＬ−ＬＡＭＢＤＡ）により、一般式（２）で示されるorirubenoneＣであることを確認した。
【００５７】
orirubenoneＣデータ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；1.39(s)，1.74(m)，1.78(s)，1.88(m)，2.33(m)，2.58(d，J=16.5Hz)，2.71(d，J=16.5Hz)，6.31(s)，6.73(m)，7.13(s)
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ） δ；12.4，23.9，24.0，38.7，47.9，81.7，104.7，111.2，113.5，129.6，141.7，142.6，156.2，157.1，171.9，193.5
【００５８】
実施例１〜８、比較例３
実施例１〜８それぞれ５０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍＬに溶解し、それぞれのＤＭＳＯ溶液を調製した。また、比較例３として従来知られている牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチン［炎症、４巻、ＮＯ４、４３７（１９８４）］０．１８ｇを水１０ｇに溶解し、水溶液を調製した。
【００５９】
試験例
実施例１〜８、比較例１（水溶液）、比較例２（ＤＭＳＯのみ）並びに比較例３を用いて、前述した（５）の方法により、高分子トリチウムヒアルロン酸の分解を調べ、ヒアルロン酸分解率及びヒアルロン酸分解阻害率を前記数１、数２より算出した。結果を表２に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
その結果、実施例１〜８のorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃを含むケショウシメジ抽出物、orirubenoneＡ、Ｂ、Ｃ画分、いずれの薬剤においてもヒアルロン酸分解の阻害効果が認められた。また比較例３に示した牛精巣由来ヒアルロニダーゼの阻害剤であるグリチルリチンの添加は、ヒトの細胞培養系である本評価系において全く効果がないことがわかった。
【００６２】
この結果からケショウシメジ抽出物、及びorirubenoneＡ、Ｂ、Ｃは、ヒトのヒアルロン酸分解抑制剤として有効である。また本発明のヒアルロン酸分解抑制剤はヒアルロン酸分解が異常に亢進している疾患に有効であると考えられる。
【００６３】
実施例９〜１２（錠剤）
【００６４】
【表２】
【００６５】
上記の各成分を均一に混合し、常法に従って、１錠１７０ｍｇとなるように打錠し、錠剤を調製した。
【００６６】
実施例１３〜１６（カプセル剤）
【００６７】
【表３】
【００６８】
上記の各成分を均一に混合し、常法に従って、混合物の１５０ｍｇを３号硬カプセルに充填した。
【００６９】
実施例１７〜２０（液剤）
【００７０】
【表４】
【００７１】
精製水に上記の各成分を溶解し、攪拌均一化してシロップ剤とした。
【００７２】
実施例２１〜２４（クリーム）
【００７３】
【表５】
【００７４】
成分（Ａ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｂ）を混合溶解した（混合液Ｉ）。これとは別に、成分（Ｄ）を８０℃で均一に混合溶解した後、それに成分（Ｃ）を混合溶解した（混合液ＩＩ）。次に、混合液Ｉに、徐々に混合液ＩＩを加えて、充分攪拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００７５】
実施例２５〜２７（ローション）
【００７６】
【表６】
【００７７】
各成分を混合溶解して、ローションを調製した。
【００７８】
実施例２８〜３０（入浴剤）
【００７９】
【表７】
【００８０】
各成分を混合し、入浴剤を調製した。なお、この入浴剤は使用時に約３０００倍に希釈される。
【００８１】
実施例３１〜３２（練歯磨）
【００８２】
【表８】
【００８３】
常法に従い、水、グリセリン、カラギナン、サッカリン、パラオキシ安息香酸ブチル、クロルヘキシジンジグリコネート、香料及びエルゴステロール配糖体誘導体を計量し、混合して粘結剤を膨潤させたのち、第２リン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウムを加え、更によく混合し脱泡したのち、チューブに充填して練歯磨を得た。
【００８４】
実施例３３〜３４（洗口剤）
【００８５】
【表９】
【００８６】
常法に従い、上記組成からなる洗口剤を調製した。
【００８７】
実施例３５〜３８（関節注入剤）
【００８８】
【表１０】
【００８９】
記載された成分の水溶液を加熱または濾過滅菌し、注射シリンジに２．５ｍＬずつ分注し、関節注入剤を調製した。
【００９０】
尚、上記実施例２５〜３０において用いた香料は、下記香料処方のものである。
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示される化合物。
【化１】
［但し、式中Ｒ1は、メチル基又はカルボキシル基であり、Ｒ1がメチル基の場合、Ｒ2はカルボキシル基であり、Ｒ1がカルボキシル基の場合、Ｒ2はメチル基である。］
【請求項２】
下記一般式（２）で示される化合物。
【化２】
【請求項３】
請求項１又は２記載の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載の化合物を有効成分とするヒアルロン酸分解阻害剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載の化合物を含有することを特徴とする化粧料。
【請求項６】
請求項１又は２記載の化合物を含有することを特徴とする荒れ肌又は乾燥肌防止剤。
【請求項１】
下記一般式（１）で示される化合物。
【化１】
［但し、式中Ｒ1は、メチル基又はカルボキシル基であり、Ｒ1がメチル基の場合、Ｒ2はカルボキシル基であり、Ｒ1がカルボキシル基の場合、Ｒ2はメチル基である。］
【請求項２】
下記一般式（２）で示される化合物。
【化２】
【請求項３】
請求項１又は２記載の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載の化合物を有効成分とするヒアルロン酸分解阻害剤。
【請求項５】
請求項１又は２記載の化合物を含有することを特徴とする化粧料。
【請求項６】
請求項１又は２記載の化合物を含有することを特徴とする荒れ肌又は乾燥肌防止剤。
【公開番号】特開２００９−１６７２１１（Ｐ２００９−１６７２１１Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１０７６８５（Ｐ２００９−１０７６８５）
【出願日】平成２１年４月２７日（２００９．４．２７）
【分割の表示】特願２００３−３２７３２４（Ｐ２００３−３２７３２４）の分割
【原出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１５年９月１日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会誌 第７７巻 第９号」に発表
【出願人】（５０４１８０２０６）株式会社カネボウ化粧品 (125)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２７日（２００９．４．２７）
【分割の表示】特願２００３−３２７３２４（Ｐ２００３−３２７３２４）の分割
【原出願日】平成１５年９月１９日（２００３．９．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１５年９月１日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会誌 第７７巻 第９号」に発表
【出願人】（５０４１８０２０６）株式会社カネボウ化粧品 (125)
【Ｆターム（参考）】
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