ケナフ種子の超臨界流体抽出法
本発明は、超臨界流体を利用し、２００〜６００バールの範囲の圧力にて４０〜８０℃の温度で実施する、ケナフ種子（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ Ｌ．）の油を抽出するための超臨界流体抽出（ＳＦＥ）法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケナフ種子の超臨界流体抽出法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ Ｌ．（ケナフ）は、茎にある軟らかい靱皮繊維を目的として栽培される越年生で短日性の草本植物である。ケナフは、アオイ科に属し、経済的及び園芸学的重要性に関して注目すべきである。ケナフは、インド、バングラディシュ、タイ、一部アフリカにおいて、またわずかな程度に東南ヨーロッパにおいて長い栽培史を有していた。アフリカでは４０００年にわたり栽培されてきており、ケナフ木の異なる部位が、食料、動物飼料、手工芸品材料、及び地域社会への燃料の供給源として役立ってきた。いくつかの種が、多くの国々で広く生息していることがわかっている。現在、主な農業地帯は、中国全土、インド全土、並びにオーストラリアのマカイ、米国テキサス州（採種圃）、及びメキシコのタマウリパスを含めた他の多くの国々である。
【０００３】
マレーシアにおいて、ケナフは、繊維板、バイオコンポジット材料、及び高タンパク質動物飼料原料への幅広い用途を有するために、製造業者からますます注目を浴びている。マレーシア政府は、タバコ農園に代わるものとするため、また農業の多様化を実現するために、国の第４の工芸作物としてケナフを栽培したいと考えている。マレーシアのケナフ生産に関する調査は２０００年代初期に開始され、最初のケナフ種子生産事業がセランゴルのＳｅｒｄａｎｇで実施された。しかし、マレーシアにおけるケナフの栽培はまだ実験段階にあり、この植物の産業による利用はまだ最適でない。たとえば、栄養補助的な価値が見込まれる相当な含油量を含んでいるケナフ種子が、ケナフの収穫又は処理の間に屑材料として処分されている。
【０００４】
物理的には、ケナフ種子は、比較的小さく（長さ６ｍｍ×幅４ｍｍ）、紫がかった黒色であり、鋭角の三角形である。ケナフの複数の品種が、３６０００〜４００００種子／ｋｇの範囲に及ぶ幾種類かの種子を実らせる。ケナフ種子の収量は、種子の品種及び栽培場所に応じて決まるところが大きい。マレーシアでは、種子収量は現在約７００ｋｇ／ｈａにすぎない。１５００ｋｇ／ｈａの堅実な種子収量を実現することができれば、ケナフは、油抽出率２０％をベースとして、有益な脂肪種子作物となり得るはずである。
【０００５】
ケナフ種子油の組成は、綿実油中にはゴシポール（毒性のあるフェノール色素）が存在することを除き、綿実に非常に似ている。（ソックスレー抽出によって抽出した）ケナフ種子油には不飽和脂肪酸（７６．０％〜８１．５％）が多く、このケナフ種子油中の主な脂肪酸はリノール酸（Ｃ１８：２）（４５．９％）である。それ以外に、ケナフ種子油には、リン脂質及び植物ステロールも多い（それぞれ油の６．０％及び０．９％）。ケナフ種子油は、その相当な含油量及び独特な組成により、従来技術において、ヒトが消費する食用油の代替的かつ経済的な供給源として提供できると提案されている。
【０００６】
しかし、ｎ−ヘキサンや石油エーテルなどの有機溶媒を使用して抽出される油は、その安全な消費に関して常に疑わしい。したがって、この筋書では超臨界二酸化炭素流体抽出（ＳＦＥ）が妥当な解決策であるように思われる。ＳＦＥは、毒性、爆発性がなく、環境にやさしく、費用効果が高く、時間の節約となり、選択性が調節可能な溶媒（超臨界二酸化炭素流体）を抽出に好都合に使用しようというものである。さらに、ＳＦＥでは、低温で油抽出を実施し、抽出の最終段階で溶媒を完全に除去することも可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、超臨界流体を利用し、２００〜６００バールの範囲の圧力にて４０〜８０℃の範囲の温度で実施する、ケナフ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ Ｌ．）種子油を抽出するための超臨界流体抽出（ＳＦＥ）法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、いくつかの新規な特徴と、付随する記述及び図面において以下で十分に説明及び例示する各部分の組合せとからなるが、本発明の範囲から逸脱することも本発明の利点のいずれかを犠牲にすることもなく、細目を様々に変更してもよいことは理解される。
【０００９】
本発明は、以下に示す詳細な説明及び添付の図面から十分に理解されることとなるが、これらは実例として示すにすぎず、したがって本発明を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】異なるＳＦＥ抽出パラメーターによるケナフ種子油の収率を示すグラフである。
【図２】ＤＰＰＨ補足活性によるケナフ種子油及び市販食用油のＩＣ５０値を示すグラフである。
【図３】ＢＣＢアッセイによるケナフ種子油及び市販食用油の抗酸化活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ケナフ種子の超臨界流体抽出を提供する。以下、本明細書では、本発明を本発明の好ましい実施形態に従って記述する。しかし、その記述を本発明の好ましい実施形態に限定するのは、単に本発明の論述を容易にするためにすぎないと理解されたく、また当業者が、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な変更形態及び等価形態を考案してもよいと考える。
【実施例】
【００１２】
実施例１ ケナフ種子（Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３）抽出物
ａ．乾燥ケナフ種子の調製
ケナフ種子（品種：Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３）の汚れを除き、オーブン（ＦＤ１１５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）にて５０℃で乾燥させて恒量にした。乾燥に引き続いて、ケナフ種子を抽出前に４℃で保管した。
【００１３】
ｂ．超臨界二酸化炭素流体抽出（ＳＦＥ）
超臨界二酸化炭素抽出装置（Ｔｈａｒ １０００Ｆ、Ｔｈａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルヴェニア州ピッツバーグ）を９通りの異なる抽出パラメーター（圧力（バール）／温度（℃）：６００／４０、６００／６０、６００／８０、４００／４０、４００／６０、４００／８０、２００／４０、２００／６０、２００／８０）で使用することにより、ケナフ種子を抽出にかけた。簡潔に述べると、１００グラムのケナフ種子をＷａｒｉｎｇブレンダーで１分間粉砕し、１リットル容抽出容器に入れた。抽出容器をしっかりと密閉した後、所望の抽出温度を設定した。抽出容器内の圧力を、一定の二酸化炭素流量（２５ｇ／分）を用いて強め、自動式背圧調節装置によって調節した。望ましい温度及び圧力が得られた後、ＳＦＥ抽出を開始した。抽出過程は全体で１５０分間続き、油の収率を３０分間刻みで測定した。抽出が完了した後、抽出容器を減圧し、収集容器から油を集めた。この抽出から得られた総油量を、区間収率を合計して算出した。
【００１４】
ｃ．ソックスレー抽出
５０グラムのケナフ種子をＷａｒｉｎｇブレンダーで１分間粉砕し、２本の抽出シンブルに等分した。次いで、各シンブルをソックスレー抽出器（Ｗｉｔｅｇ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ、ドイツ国Ｗｅｒｔｈｅｉｍ）に移した。約３００ｍｌのｎ−ヘキサン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）を各フラスコに加え、フラスコを抽出器及び冷却器に接続した。抽出を開始した後、溶媒流量を手動で７分／サイクルに調節した。最後に、抽出過程を、それぞれ２０サイクル後（迅速ソックスレー抽出、ＳＯＸ／Ｓ）及び１００サイクル後（伝統的ソックスレー抽出、ＳＯＸ／Ｌ）に停止した。抽出が完了した後、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）を使用して、減圧下にて５０℃でｎ−ヘキサンを除去した。蒸発処理に引き続いて、フラスコを１時間デシケータチャンバーに入れた。得られた油を秤量し、収率を算出した。
【００１５】
ｄ．従来型超音波支援溶媒抽出（ｕｌｔｒａ−ｓｏｎｉｃ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ＳＯＮＩＣ）
２５グラムのケナフ種子を粉砕し、３００ｍｌのｎ−ヘキサン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州）と共に１３５００ｒｐｍで３分間ホモジナイズした（Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒａｘ Ｔ２５ ｂａｓｉｃ、ＩＫＡ（登録商標）−ＷＥＲＫＥ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、ドイツ国Ｓｔａｕｆｅｎ）。次いで、混合物を超音波浴（Ｐｏｗｅｒ ｓｏｎｉｃ ５０５、ＨｗａＳｈｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、韓国ソウル）中で９０分間音波処理（高周波数設定）した。音波処理後、混合物を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１）で濾過し、同じ手順に従って残渣を抽出し直した。最後に、濾液をプールし、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）を使用して蒸発にかけた。フラスコをデシケータチャンバー中で１時間冷却した後、油の収率を算出した。
【００１６】
図１は、９通りの異なるＳＦＥ抽出パラメーターによるケナフ種子油の収率を示す。一般に、ケナフ種子油の収率は、１５０分のＳＦＥ抽出後に２．１２％〜２０．１８％であり、二酸化炭素消費量は３．７５ｋｇであった。抽出圧の上昇によって、ケナフ種子油の収率が、６００／８０≧６００／６０≧６００／４０≧４００／８０≧４００／４０≧４００／６０＞２００／４０＞２００／６０≧２００／８０の順に増加していることは明らかである（Ｐ＜０．０５）。収油率が増加するほか、抽出圧の上昇によって抽出過程も促進されることがわかっている。
【００１７】
図１に示す抽出傾向によれば、６００バールで行った抽出では、６０〜９０分後に「プラトー」に達したのに対し、４００バールでは、抽出してから９０〜１２０分後にならないと「プラトー」段階が認められなかった。収油率が実験の終わりまで３０分刻みで有意にまた間断なく増加したことがわかったので、２００バールでの抽出過程では「プラトー」段階が認められなかった。この検討において、ＳＦＥ抽出を高抽出圧及び中程度抽出圧（６００バール及び４００バール）で行った場合、抽出温度は、油の収率への影響においてあまり決定的な役割を果たしていない（Ｐ＞０．０５）。しかし、低抽出圧（２００バール）では、抽出温度の上昇によって、得られる収油率が有意に低下する（Ｐ＜０．０５）。
【００１８】
溶媒抽出では、ＳＯＸ／Ｌ、ＳＯＸ／Ｓ、及びＳＯＮＩＣの収率が、それぞれ２４．８１％±０．３２、２２．４０％±０．７２、及び２１．０８％±０．００１であった。ＳＯＸ／Ｌが溶媒抽出で最高の収率を示し、続いてＳＯＸ／Ｓ及びＳＯＮＩＣとなった（Ｐ＜０．０５）。これにより、熱処理は、ホモジナイズしてから音波処理にかけるよりも、ケナフ種子油抽出をより効率的に補助することが示唆される。これ以外に、ソックスレー抽出の期間を延長することも、得られる収油率を増加させる。この検討における溶媒抽出から得られるケナフ種子の含油量は、ケナフ種子油収率（２１．６４％〜２６．４％）の範囲内である。
【００１９】
ＳＦＥ抽出と比較すると、ＳＯＸ／Ｌでは、すべての抽出パラメーターでのＳＦＥ抽出（２．１２％〜２０．１８％）より高い含油量（２４．８１％）が得られた。しかし、ＳＯＸ／Ｌによる収油率の数パーセントの上昇は、ＳＯＸ／Ｌでは抽出過程全体を遂行するのに１２時間より長くかかるので、ＳＦＥによる１５０分と比べて、経済的には有益でない。６００バール、ＳＯＸ／Ｓ、及びＳＯＮＩＣで抽出された各ケナフ油間に収率の有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。このことは、高圧でのＳＦＥ抽出が、溶媒が不要であり、（ＳＯＸ／Ｌと比較して）時間の節約になり、また環境にやさしいという特徴を有するので、ケナフ種子油抽出において優れた代替法になり得ることを示唆している。
【００２０】
実施例２ ７種類の市販料理用油と比較したケナフ種子油（Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３）の抗酸化活性
ａ．ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性
ケナフ種子、及び市販の食用油（パームオレイン（ＦＦＭ Ｂｅｒｈａｄ、マレーシア国セランゴル州Ｓｕｎｇａｉ Ｂｕｌｏｈ）、Ｍａｚｏｌａトウモロコシ油、Ｍａｚｏｌａダイズ油、Ｍａｚｏｌａカノーラ油、Ｍａｚｏｌａヒマワリ種子油（ＡＣＨ Ｆｏｏｄ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国テネシー州Ｃｏｒｄｏｖａ）、米ぬか油（Ａｍｏｒｎｃｈａｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、タイ国バンコクＢａｎｇｒａｋ）、純オリーブ油（８０％精製オリーブ油及び２０％エキストラバージンオリーブ油）（Ｂａｓｓｏ Ｆｅｄｅｌｅ ｅ ｆｉｇｌｉ ｓ．ｒ．ｌ．、イタリア国Ｓａｎ Ｍｉｃｈｅｌｅ ｄｉ Ｓｅｒｉｎｏ））の抗ラジカル捕捉活性を、Ｒａｍａｄａｎ、Ｋｒｏｈ、及びＭｏｒｓｅｌ（２００３年）が記載している方法に若干手を加えた方法に従って測定した。α−トコフェロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）をこの試験の標準親油性抗酸化物質として使用した。簡潔に述べると、異なる濃度のサンプルトルエン溶液０．１ｍｌに、０．３９ｍｌの新鮮なＤＰＰＨトルエン溶液（０．１ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）を加えた。次いで、混合物を激しく振盪し、６０分間暗所に放置した。最後に、混合物の吸光度を、紫外可視分光光度計（Ｐｈａｒｍａｓｐｅｃ ｕｖ−１７００、島津製作所、京都府）を使用して、５１５ｎｍで純粋トルエン（ブランク）に対して測定した。
【００２１】
ケナフ種子及び市販の食用油の抗ラジカル活性を、以下の式から推定した。
抑制％＝（［Ａ対照−Ａサンプル］／Ａ対照）×１００
これにより、
Ａブランク＝対照反応液（サンプルを除くすべての試薬を含有する）の吸光度
Ａサンプル＝試験化合物の吸光度
【００２２】
サンプルの５０％抑制濃度値（ＩＣ５０）は、ｍｇ／ｍｌで示し、線形回帰分析の内挿によって算出した。この試験におけるＩＣ５０は、総ＤＰＰＨフリーラジカルの５０％を抑制することのできる油の濃度であると定義した。
【００２３】
ｂ．β−カロテン漂白（ＢＣＢ）アッセイ
ケナフ種子及び市販の食用油のβ−カロテン漂白（ＢＣＢ）アッセイは、Ｋｕｍａｚａｗａら（２００２年）が記載しているプロトコールに従って測定を行った。α−トコフェロールをこの試験の標準親油性抗酸化物質として使用した。簡潔に述べると、４０ｍｇのリノール酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）及び４００ｍｇのＴｗｅｅｎ２０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）に、３ｍｌのβ−カロテン溶液（１００μｇ／ｍｌクロロホルム）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）を加えた。次いで、混合物をよく混合し、窒素流中で乾燥させた。即座に、乾燥した混合物に１００ｍｌの蒸留水を加えて、β−カロテン／リノール酸エマルションを生成した。１．５ミリリットルのエマルションに、２０μｌのメタノール（対照）又は５ｍｇ／ｍｌメタノールの濃度のサンプルを加えた。その後、サンプルを５０℃の水浴中で１時間インキュベートした。最後に、サンプルの吸光度を、紫外可視分光光度計（Ｐｈａｒｍａｓｐｅｃ ｕｖ−１７００、島津製作所、京都府）を使用して、４７０ｎｍで蒸留水（ブランク）に対して測定した。
【００２４】
サンプルの抗酸化活性パーセンテージ（％ＡＡ）を、次式を使用して算出した。
％ＡＡ＝１００（ＤＲ対照−ＤＲサンプル）／ＤＲ対照
これにより、
ＤＲ＝分解速度、（ａ／ｂ）／６０
ａ＝インキュベート前のサンプルの吸光度４７０ｎｍ
ｂ＝インキュベート後のサンプルの吸光度４７０ｎｍ
ＤＲ対照＝対照サンプルの分解速度
ＤＲサンプル＝試験したサンプルの分解速度
【００２５】
この検討におけるケナフ種子油及び市販食用油の抗酸化活性は、ｍｇ α−トコフェロール当量（Ｔｅｑ）／ｇ油サンプルで示した。
【００２６】
ＤＰＰＨ捕捉活性によるケナフ種子油及び市販食用油のＩＣ５０値を図２に示す。一般に、ケナフ種子油のＩＣ５０値は、１２．２７ｍｇ／ｍｌ〜３９．８０ｍｇ／ｍｌの範囲であったのに対し、市販料理用油では、その範囲が２０．５９ｍｇ／ｍｌ〜７０．４３ｍｇ／ｍｌであった。２００／８０で抽出したＳＦＥケナフ油は、全試験サンプルと比較して最も高い抗ラジカル活性を示した（Ｐ＜０．０５）。対称的に、オリーブ油は、抗ラジカル活性が最も弱かった（Ｐ＜０．０５）。この結果によって、オリーブ油が、１０種の試験植物油の中で最もＤＰＰＨ抗ラジカル活性の弱いサンプルの１つであることが確実になった。パーム核油及び米ぬか油は、おそらく脂肪酸不飽和及び（トコフェロール、トコトリエノール、γ−オリザノールなどの）抗酸化物質含有量のレベルにより、市販料理用油の中で最も高い抗ラジカル活性を有する（Ｐ＜０．０５）サンプルであることがわかった。ＤＰＰＨフリーラジカルの抑制における油の有効性の順序は、以下のとおりである。すなわち、ケナフ：２００／８０＞パーム≧米ぬか≧ケナフ：２００／６０≧ケナフ：２００／４０≧ケナフ：４００／６０≧ケナフ：４００／４０≧ケナフ：ＳＯＸ／Ｓ≧ダイズ≧カノーラ≧ヒマワリ≧トウモロコシ≧ケナフ：６００／６０≧ケナフ：６００／８０≧ケナフ：ＳＯＮＩＣ≧ケナフ：６００／４０≧ケナフ：４００／８０≧ケナフ：ＳＯＸ／Ｌ＞オリーブ（Ｐ＜０．０５）。４００バールを超えるＳＦＥによって抽出したケナフ種子油は、溶媒抽出したケナフ種子油、並びにパーム油、米ぬか油、及びオリーブ油を除く市販料理用油の大多数と同様の抗ラジカル活性を示した（Ｐ＞０．０５）。しかし、これらの市販食用油には、処理の際にＢＨＡ、ＢＨＴ、及びＴＢＨＱのような合成の抗酸化物剤が加えられている。したがって、ケナフ種子油は実際、これら市販料理用油と比べたとしても、より良好な抗ラジカル活性を有するといえ、また機能性料理用油として役立てられる可能性を秘めている。
【００２７】
図３は、ＢＣＢアッセイによるケナフ種子油及び市販料理用油の抗酸化活性を示す。サンプルの抗酸化活性は、α−トコフェロール標準曲線（ｙ＝９８４１．８ｘ−３．１６２６、ｒ２＝０．９８０１）の内挿によって算出し、ｍｇ Ｔｅｑ／ｇ油で示した。一般に、検討したサンプルの抗酸化活性は、０．１５ｍｇ Ｔｅｑ／ｇ油〜１．８５ｍｇ Ｔｅｑ／ｇ油の範囲であった。ＤＰＰＨ試験とは反対に、ＢＣＢアッセイでは抽出温度がＳＦＥケナフ種子油の抗酸化活性を決定する非常に重要な要素であると思われた。４００バール及び６００バールの抽出圧下で抽出温度が８０℃に上昇すると、抗酸化活性が大幅に低下する（Ｐ＜０．０５）。２００バールで抽出したケナフ種子油では、サンプルの抗酸化活性が、温度上昇に対応して徐々に低下した（Ｐ＜０．０５）。この結果の根拠となる、考えられる理由は、高圧高温で抽出されるケナフ種子油が、熱分解を受けやすい抗酸化物質特性を含んでいるのではないかということである。この理由のために、これらのサンプルは、熱を用いないＤＰＰＨ試験では良好な抗酸化活性を示し、ＢＣＢアッセイでは逆説的な結果を示すのではないかと思われる。これ以外に、ＤＰＰＨの捕捉活性は、主としてラジカル反応部位への抗酸化物質の立体的アクセシビリティー（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に応じて決まるので（Ｐｒｉｏｒ、Ｗｕ、及びＳｃｈａｉｃｈ、２００５年）、高温抽出したケナフ種子油中の抗酸化物質が、リノリ（ｌｉｎｏｌｙ）ラジカル（たとえば、ペルオキシル及びアルキルラジカル）に対してＤＰＰＨラジカルより弱い反応性しかもたないことも、この筋書の根拠となる、考えられる理由ではないかと思われる。しかし、Ｌｉｍ及びＱｕａｈ（２００７年）によれば、反応系が異なっているので、ＢＣＢアッセイでの結果をＤＰＰＨラジカル捕捉アッセイの結果と関係付けることはできない。
【００２８】
ＢＣＢアッセイでは、試験した７種類の市販食用油の中で、パーム油及びオリーブ油が、それぞれ抗酸化活性が最も強いサンプル及び最も弱いサンプルとなった（Ｐ＜０．０５）。市販食用油と比較すると、市販の油のほとんどが合成の抗酸化剤で補われているにもかかわらず、（ケナフ：４００／８０及び６００／８０を除く）ほとんどすべてのケナフ油サンプルが、市販食用油より高い抗酸化活性を示した（Ｐ＜０．０５）。（２００／６０、２００／８０、４００／８０、及び６００／８０を除く）大多数のＳＦＥ抽出ケナフ種子油と溶媒抽出ケナフ種子油とに、抗酸化活性の有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。このことは、熱によって誘発されるリノール酸の過酸化に対して、市販食用油と比べて強力な抗酸化活性を有するケナフ種子油の抽出において、ＳＦＥが有機溶媒の代替手段になり得ることを示唆している。
【００２９】
実施例３ Ｖ３６ケナフ種子の油抽出及び抗酸化活性の評価
ａ．乾燥ケナフ種子の調製
ケナフ種子（品種：Ｖ３６）の汚れを除き、オーブン（ＦＤ１１５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）にて４０℃で乾燥させて恒量にした。乾燥に引き続いて、ケナフ種子を抽出前に４℃で保管した。
【００３０】
ｂ．超臨界二酸化炭素流体抽出（ＳＦＥ）
実施例１（ｂ）に記載の方法に従って、超臨界二酸化炭素抽出装置（Ｔｈａｒ １０００Ｆ、Ｔｈａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルヴェニア州ピッツバーグ）を最適な抽出パラメーター（圧力（バール）／温度（℃）：６００／４０及び６００／６０）で使用することにより、ケナフ種子を抽出にかけた。１５０分間抽出した後、得られた総油量を算出した。
【００３１】
ｃ．従来型超音波支援溶媒抽出（ＳＯＮＩＣ）
実施例１（ｄ）に記載の方法に従って、Ｖ３６ケナフ種子の溶媒抽出を行った。
【００３２】
ｄ．総フェノール含量の決定
Ｒａｍａｄａｎら（２００３年）が記載している方法に従って、ケナフ種子油の精製処理を行った。簡潔に述べると、２グラムのサンプルをｎ−ヘキサン（５ｍｌ）に溶解させ、ガラス管中でボルテックスして２分間かけて１０ｍｌのメタノール−水（８０：２０、ｖ／ｖ）と混合した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、パスツールピペットを使用して水アルコール抽出物を脂相から分離した。その後、水アルコール抽出物をプールし、シロップが粘稠になるまで、減圧下にて５０℃で濃縮した（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）。水アルコール抽出物をアセトニトリル（１５ｍｌ）に溶解し直し、混合物をｎ−ヘキサン（各１５ｍｌ）で３回洗浄した。アセトニトリル中の精製された画分を、減圧下にて５０℃で濃縮し（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）、次いで、総フェノール含量分析に向けてメタノールに溶解させた。
【００３３】
ケナフ種子油中の総フェノール含量は、Ｓｉｎｇｈら（２００２年）の方法に従って求めた。ちょうど１００ｍｇの抽出物を１０ｍｌのメタノールに溶解させた。半ミリリットルずつの分割量を２．５ｍｌのＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、スイス国Ｂｕｃｈｓ）にそれぞれ加えた後、これを２ｍｌの７．５％Ｎａ２ＣＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）と混合した。混合物を十分に混合し、４０℃で３０分間インキュベートした。サンプルの吸光度を分光光度計によって７６０ｎｍで測定した（Ｐｈａｒｍａｓｐｅｃ ｕｖ−１７００、島津製作所、京都府）。サンプルの総フェノール含量を、没食子酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、スイス国Ｂｕｃｈｓ）標準曲線によって決定し、ｍｇ没食子酸当量／ｇサンプル（ＧＡＥ／ｇサンプル）で示した。
【００３４】
ｅ．ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性
ＤＰＰＨラジカル捕捉アッセイは、Ｒａｍａｄａｎら（２００３年）が記載している方法に多少手を加えた方法に従って実施した。簡潔に述べると、０．１ｍＭのＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）エタノール溶液０．３９ｍｌを、様々な濃度のサンプル抽出物０．１ｍｌと室温で反応させた。混合物を激しく振盪し、６０分間暗所に放置した。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）（ＪＥＯＬ ＦＡ１００、日本電子株式会社、東京都）を以下の条件で使用することにより、読取りを行った。すなわち、変調周波数：１００ｋＨｚ、中心磁場（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｉｅｌｄ）：３３６．７３４ｍＴ±５、掃引時間：１分、電力：８ｍＷ、変調幅（ｍｏｄ ｗｉｄｔｈ）：０．２ｍＴ、時定数＝０．１５秒、振幅：１６０。アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ドイツ国Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ）、及びα−トコフェロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）をこの試験の標準物質として使用した。ケナフ種子油のＤＰＰＨ捕捉活性は、ｍｇ α−トコフェロール当量／ｇサンプル（ｍｇ Ｔｅｑ／ｇサンプル）及びｍｇアスコルビン酸当量／ｇサンプル（ｍｇ ＡＡｅｑ／ｇサンプル）で示した。
【００３５】
ｆ．ヒドロキシル捕捉活性試験
ヒドロキシル捕捉活性試験は、ＥＳＲ（ＪＥＯＬ ＦＡ１００、日本電子株式会社、東京都）を使用して、扁平石英セルで実施した。反応は、４０μｌのＤＭＰＯ（ラボテック株式会社、東京都）（４００ｍＭ）、３７．５μｌのＦｅＳＯ４（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．、英国プール）（０．４ｍＭ）、１１２．５μｌのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州セントルイス）（０．１ｍＭ）、６０μｌの（様々な濃度の）サンプル、及び１５０μｌのＨ２Ｏ２（Ｂｅｎｄｏｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ノルウェー国Ｂｅｎｄｏｓｅｎ）（２ｍＭ）を混合してから約２分後に開始した。ＥＳＲの条件は、中心磁場：３３６．４５±５、電力：８ｍｗ、変調幅：０．１ｍＴ、掃引時間：２分、時定数：０．１秒、振幅：１６０、変調周波数：１００ｋＨｚとした。ケナフ油のヒドロキシルラジカル捕捉活性は、ｇ ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）当量／ｇサンプル（ｇ ＤＭＳＯＥ／ｇサンプル）で示した（Ｔｈｏｍｓｅｎら、２０００年）。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１は、Ｖ３６ケナフ種子油の総フェノール含量、ＤＰＰＨ捕捉活性、及びヒドロキシルラジカル捕捉活性を示す。収率、総フェノール含量、ＤＰＰＨ捕捉活性、及びＶ３６ケナフ種子油のヒドロキシルラジカル捕捉活性は、それぞれ、１３．０５〜１６．６０％、０．００８〜０．０１７ｍｇ ＧＡＥ／ｇサンプル、０．４８１〜０．５９４ｍｇ Ｔｅｑ／ｇサンプル及び０．３９５〜０．４８４ｍｇ ＡＡｅｑ／ｇサンプル、並びに１．４４８〜３．３４９ ＤＭＳＯＥ／ｇサンプルの範囲となった。ヘキサン抽出は、両方のＳＦＥ抽出より高い収率を示した（Ｐ＜０．０５）。等圧条件下（６００バール）で抽出温度が４０℃から６０℃に上昇すると、Ｖ３６ケナフ種子の収油率がわずかに向上した（Ｐ＜０．０５）。
【００３８】
この結果は、Ｑｕｉ ｐｉｎｇ ３ケナフ種子のＳＦＥ抽出（実施例１ｅ）での知見に一致している。しかし、結果は、Ｖ３６ケナフ種子の含油量がＱｕｉ Ｐｉｎｇ３と比べて少ないことも示している。Ｖ３６ケナフ種子のヘキサン、ＳＦＥ ６００／４０、及びＳＦＥ ６００／６０の各抽出からの収油率は、Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３よりそれぞれ２１．３％、３５．３％、及び３１．４％低い。ヘキサン抽出では、Ｖ３６ケナフ種子油のフェノール含量及びヒドロキシルラジカル捕捉活性がＳＦＥ抽出と比べて向上する（Ｐ＜０．０５）。
【００３９】
その上、これらの結果は、等圧条件下（６００バール）でＳＦＥ抽出温度が４０℃から６０℃に上昇しても、総フェノール含量及び抗酸化活性（ＤＰＰＨ及びヒドロキシルラジカル捕捉活性）に有意差がないことも示している（Ｐ＞０．０５）。この結果は、Ｑｕｉ ｐｉｎｇ ３ケナフ種子油のＤＰＰＨ捕捉活性（実施例２ｃ）での知見に一致している。ＤＰＰＨ捕捉活性試験ではサンプル間に有意差が見られなかった（Ｐ＞０．０５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケナフ種子の超臨界流体抽出法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ Ｌ．（ケナフ）は、茎にある軟らかい靱皮繊維を目的として栽培される越年生で短日性の草本植物である。ケナフは、アオイ科に属し、経済的及び園芸学的重要性に関して注目すべきである。ケナフは、インド、バングラディシュ、タイ、一部アフリカにおいて、またわずかな程度に東南ヨーロッパにおいて長い栽培史を有していた。アフリカでは４０００年にわたり栽培されてきており、ケナフ木の異なる部位が、食料、動物飼料、手工芸品材料、及び地域社会への燃料の供給源として役立ってきた。いくつかの種が、多くの国々で広く生息していることがわかっている。現在、主な農業地帯は、中国全土、インド全土、並びにオーストラリアのマカイ、米国テキサス州（採種圃）、及びメキシコのタマウリパスを含めた他の多くの国々である。
【０００３】
マレーシアにおいて、ケナフは、繊維板、バイオコンポジット材料、及び高タンパク質動物飼料原料への幅広い用途を有するために、製造業者からますます注目を浴びている。マレーシア政府は、タバコ農園に代わるものとするため、また農業の多様化を実現するために、国の第４の工芸作物としてケナフを栽培したいと考えている。マレーシアのケナフ生産に関する調査は２０００年代初期に開始され、最初のケナフ種子生産事業がセランゴルのＳｅｒｄａｎｇで実施された。しかし、マレーシアにおけるケナフの栽培はまだ実験段階にあり、この植物の産業による利用はまだ最適でない。たとえば、栄養補助的な価値が見込まれる相当な含油量を含んでいるケナフ種子が、ケナフの収穫又は処理の間に屑材料として処分されている。
【０００４】
物理的には、ケナフ種子は、比較的小さく（長さ６ｍｍ×幅４ｍｍ）、紫がかった黒色であり、鋭角の三角形である。ケナフの複数の品種が、３６０００〜４００００種子／ｋｇの範囲に及ぶ幾種類かの種子を実らせる。ケナフ種子の収量は、種子の品種及び栽培場所に応じて決まるところが大きい。マレーシアでは、種子収量は現在約７００ｋｇ／ｈａにすぎない。１５００ｋｇ／ｈａの堅実な種子収量を実現することができれば、ケナフは、油抽出率２０％をベースとして、有益な脂肪種子作物となり得るはずである。
【０００５】
ケナフ種子油の組成は、綿実油中にはゴシポール（毒性のあるフェノール色素）が存在することを除き、綿実に非常に似ている。（ソックスレー抽出によって抽出した）ケナフ種子油には不飽和脂肪酸（７６．０％〜８１．５％）が多く、このケナフ種子油中の主な脂肪酸はリノール酸（Ｃ１８：２）（４５．９％）である。それ以外に、ケナフ種子油には、リン脂質及び植物ステロールも多い（それぞれ油の６．０％及び０．９％）。ケナフ種子油は、その相当な含油量及び独特な組成により、従来技術において、ヒトが消費する食用油の代替的かつ経済的な供給源として提供できると提案されている。
【０００６】
しかし、ｎ−ヘキサンや石油エーテルなどの有機溶媒を使用して抽出される油は、その安全な消費に関して常に疑わしい。したがって、この筋書では超臨界二酸化炭素流体抽出（ＳＦＥ）が妥当な解決策であるように思われる。ＳＦＥは、毒性、爆発性がなく、環境にやさしく、費用効果が高く、時間の節約となり、選択性が調節可能な溶媒（超臨界二酸化炭素流体）を抽出に好都合に使用しようというものである。さらに、ＳＦＥでは、低温で油抽出を実施し、抽出の最終段階で溶媒を完全に除去することも可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、超臨界流体を利用し、２００〜６００バールの範囲の圧力にて４０〜８０℃の範囲の温度で実施する、ケナフ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ Ｌ．）種子油を抽出するための超臨界流体抽出（ＳＦＥ）法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、いくつかの新規な特徴と、付随する記述及び図面において以下で十分に説明及び例示する各部分の組合せとからなるが、本発明の範囲から逸脱することも本発明の利点のいずれかを犠牲にすることもなく、細目を様々に変更してもよいことは理解される。
【０００９】
本発明は、以下に示す詳細な説明及び添付の図面から十分に理解されることとなるが、これらは実例として示すにすぎず、したがって本発明を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】異なるＳＦＥ抽出パラメーターによるケナフ種子油の収率を示すグラフである。
【図２】ＤＰＰＨ補足活性によるケナフ種子油及び市販食用油のＩＣ５０値を示すグラフである。
【図３】ＢＣＢアッセイによるケナフ種子油及び市販食用油の抗酸化活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、ケナフ種子の超臨界流体抽出を提供する。以下、本明細書では、本発明を本発明の好ましい実施形態に従って記述する。しかし、その記述を本発明の好ましい実施形態に限定するのは、単に本発明の論述を容易にするためにすぎないと理解されたく、また当業者が、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な変更形態及び等価形態を考案してもよいと考える。
【実施例】
【００１２】
実施例１ ケナフ種子（Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３）抽出物
ａ．乾燥ケナフ種子の調製
ケナフ種子（品種：Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３）の汚れを除き、オーブン（ＦＤ１１５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）にて５０℃で乾燥させて恒量にした。乾燥に引き続いて、ケナフ種子を抽出前に４℃で保管した。
【００１３】
ｂ．超臨界二酸化炭素流体抽出（ＳＦＥ）
超臨界二酸化炭素抽出装置（Ｔｈａｒ １０００Ｆ、Ｔｈａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルヴェニア州ピッツバーグ）を９通りの異なる抽出パラメーター（圧力（バール）／温度（℃）：６００／４０、６００／６０、６００／８０、４００／４０、４００／６０、４００／８０、２００／４０、２００／６０、２００／８０）で使用することにより、ケナフ種子を抽出にかけた。簡潔に述べると、１００グラムのケナフ種子をＷａｒｉｎｇブレンダーで１分間粉砕し、１リットル容抽出容器に入れた。抽出容器をしっかりと密閉した後、所望の抽出温度を設定した。抽出容器内の圧力を、一定の二酸化炭素流量（２５ｇ／分）を用いて強め、自動式背圧調節装置によって調節した。望ましい温度及び圧力が得られた後、ＳＦＥ抽出を開始した。抽出過程は全体で１５０分間続き、油の収率を３０分間刻みで測定した。抽出が完了した後、抽出容器を減圧し、収集容器から油を集めた。この抽出から得られた総油量を、区間収率を合計して算出した。
【００１４】
ｃ．ソックスレー抽出
５０グラムのケナフ種子をＷａｒｉｎｇブレンダーで１分間粉砕し、２本の抽出シンブルに等分した。次いで、各シンブルをソックスレー抽出器（Ｗｉｔｅｇ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ、ドイツ国Ｗｅｒｔｈｅｉｍ）に移した。約３００ｍｌのｎ−ヘキサン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）を各フラスコに加え、フラスコを抽出器及び冷却器に接続した。抽出を開始した後、溶媒流量を手動で７分／サイクルに調節した。最後に、抽出過程を、それぞれ２０サイクル後（迅速ソックスレー抽出、ＳＯＸ／Ｓ）及び１００サイクル後（伝統的ソックスレー抽出、ＳＯＸ／Ｌ）に停止した。抽出が完了した後、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）を使用して、減圧下にて５０℃でｎ−ヘキサンを除去した。蒸発処理に引き続いて、フラスコを１時間デシケータチャンバーに入れた。得られた油を秤量し、収率を算出した。
【００１５】
ｄ．従来型超音波支援溶媒抽出（ｕｌｔｒａ−ｓｏｎｉｃ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（ＳＯＮＩＣ）
２５グラムのケナフ種子を粉砕し、３００ｍｌのｎ−ヘキサン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州）と共に１３５００ｒｐｍで３分間ホモジナイズした（Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒａｘ Ｔ２５ ｂａｓｉｃ、ＩＫＡ（登録商標）−ＷＥＲＫＥ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、ドイツ国Ｓｔａｕｆｅｎ）。次いで、混合物を超音波浴（Ｐｏｗｅｒ ｓｏｎｉｃ ５０５、ＨｗａＳｈｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、韓国ソウル）中で９０分間音波処理（高周波数設定）した。音波処理後、混合物を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１）で濾過し、同じ手順に従って残渣を抽出し直した。最後に、濾液をプールし、ロータリーエバポレーター（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）を使用して蒸発にかけた。フラスコをデシケータチャンバー中で１時間冷却した後、油の収率を算出した。
【００１６】
図１は、９通りの異なるＳＦＥ抽出パラメーターによるケナフ種子油の収率を示す。一般に、ケナフ種子油の収率は、１５０分のＳＦＥ抽出後に２．１２％〜２０．１８％であり、二酸化炭素消費量は３．７５ｋｇであった。抽出圧の上昇によって、ケナフ種子油の収率が、６００／８０≧６００／６０≧６００／４０≧４００／８０≧４００／４０≧４００／６０＞２００／４０＞２００／６０≧２００／８０の順に増加していることは明らかである（Ｐ＜０．０５）。収油率が増加するほか、抽出圧の上昇によって抽出過程も促進されることがわかっている。
【００１７】
図１に示す抽出傾向によれば、６００バールで行った抽出では、６０〜９０分後に「プラトー」に達したのに対し、４００バールでは、抽出してから９０〜１２０分後にならないと「プラトー」段階が認められなかった。収油率が実験の終わりまで３０分刻みで有意にまた間断なく増加したことがわかったので、２００バールでの抽出過程では「プラトー」段階が認められなかった。この検討において、ＳＦＥ抽出を高抽出圧及び中程度抽出圧（６００バール及び４００バール）で行った場合、抽出温度は、油の収率への影響においてあまり決定的な役割を果たしていない（Ｐ＞０．０５）。しかし、低抽出圧（２００バール）では、抽出温度の上昇によって、得られる収油率が有意に低下する（Ｐ＜０．０５）。
【００１８】
溶媒抽出では、ＳＯＸ／Ｌ、ＳＯＸ／Ｓ、及びＳＯＮＩＣの収率が、それぞれ２４．８１％±０．３２、２２．４０％±０．７２、及び２１．０８％±０．００１であった。ＳＯＸ／Ｌが溶媒抽出で最高の収率を示し、続いてＳＯＸ／Ｓ及びＳＯＮＩＣとなった（Ｐ＜０．０５）。これにより、熱処理は、ホモジナイズしてから音波処理にかけるよりも、ケナフ種子油抽出をより効率的に補助することが示唆される。これ以外に、ソックスレー抽出の期間を延長することも、得られる収油率を増加させる。この検討における溶媒抽出から得られるケナフ種子の含油量は、ケナフ種子油収率（２１．６４％〜２６．４％）の範囲内である。
【００１９】
ＳＦＥ抽出と比較すると、ＳＯＸ／Ｌでは、すべての抽出パラメーターでのＳＦＥ抽出（２．１２％〜２０．１８％）より高い含油量（２４．８１％）が得られた。しかし、ＳＯＸ／Ｌによる収油率の数パーセントの上昇は、ＳＯＸ／Ｌでは抽出過程全体を遂行するのに１２時間より長くかかるので、ＳＦＥによる１５０分と比べて、経済的には有益でない。６００バール、ＳＯＸ／Ｓ、及びＳＯＮＩＣで抽出された各ケナフ油間に収率の有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。このことは、高圧でのＳＦＥ抽出が、溶媒が不要であり、（ＳＯＸ／Ｌと比較して）時間の節約になり、また環境にやさしいという特徴を有するので、ケナフ種子油抽出において優れた代替法になり得ることを示唆している。
【００２０】
実施例２ ７種類の市販料理用油と比較したケナフ種子油（Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３）の抗酸化活性
ａ．ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性
ケナフ種子、及び市販の食用油（パームオレイン（ＦＦＭ Ｂｅｒｈａｄ、マレーシア国セランゴル州Ｓｕｎｇａｉ Ｂｕｌｏｈ）、Ｍａｚｏｌａトウモロコシ油、Ｍａｚｏｌａダイズ油、Ｍａｚｏｌａカノーラ油、Ｍａｚｏｌａヒマワリ種子油（ＡＣＨ Ｆｏｏｄ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国テネシー州Ｃｏｒｄｏｖａ）、米ぬか油（Ａｍｏｒｎｃｈａｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、タイ国バンコクＢａｎｇｒａｋ）、純オリーブ油（８０％精製オリーブ油及び２０％エキストラバージンオリーブ油）（Ｂａｓｓｏ Ｆｅｄｅｌｅ ｅ ｆｉｇｌｉ ｓ．ｒ．ｌ．、イタリア国Ｓａｎ Ｍｉｃｈｅｌｅ ｄｉ Ｓｅｒｉｎｏ））の抗ラジカル捕捉活性を、Ｒａｍａｄａｎ、Ｋｒｏｈ、及びＭｏｒｓｅｌ（２００３年）が記載している方法に若干手を加えた方法に従って測定した。α−トコフェロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）をこの試験の標準親油性抗酸化物質として使用した。簡潔に述べると、異なる濃度のサンプルトルエン溶液０．１ｍｌに、０．３９ｍｌの新鮮なＤＰＰＨトルエン溶液（０．１ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）を加えた。次いで、混合物を激しく振盪し、６０分間暗所に放置した。最後に、混合物の吸光度を、紫外可視分光光度計（Ｐｈａｒｍａｓｐｅｃ ｕｖ−１７００、島津製作所、京都府）を使用して、５１５ｎｍで純粋トルエン（ブランク）に対して測定した。
【００２１】
ケナフ種子及び市販の食用油の抗ラジカル活性を、以下の式から推定した。
抑制％＝（［Ａ対照−Ａサンプル］／Ａ対照）×１００
これにより、
Ａブランク＝対照反応液（サンプルを除くすべての試薬を含有する）の吸光度
Ａサンプル＝試験化合物の吸光度
【００２２】
サンプルの５０％抑制濃度値（ＩＣ５０）は、ｍｇ／ｍｌで示し、線形回帰分析の内挿によって算出した。この試験におけるＩＣ５０は、総ＤＰＰＨフリーラジカルの５０％を抑制することのできる油の濃度であると定義した。
【００２３】
ｂ．β−カロテン漂白（ＢＣＢ）アッセイ
ケナフ種子及び市販の食用油のβ−カロテン漂白（ＢＣＢ）アッセイは、Ｋｕｍａｚａｗａら（２００２年）が記載しているプロトコールに従って測定を行った。α−トコフェロールをこの試験の標準親油性抗酸化物質として使用した。簡潔に述べると、４０ｍｇのリノール酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）及び４００ｍｇのＴｗｅｅｎ２０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）に、３ｍｌのβ−カロテン溶液（１００μｇ／ｍｌクロロホルム）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）を加えた。次いで、混合物をよく混合し、窒素流中で乾燥させた。即座に、乾燥した混合物に１００ｍｌの蒸留水を加えて、β−カロテン／リノール酸エマルションを生成した。１．５ミリリットルのエマルションに、２０μｌのメタノール（対照）又は５ｍｇ／ｍｌメタノールの濃度のサンプルを加えた。その後、サンプルを５０℃の水浴中で１時間インキュベートした。最後に、サンプルの吸光度を、紫外可視分光光度計（Ｐｈａｒｍａｓｐｅｃ ｕｖ−１７００、島津製作所、京都府）を使用して、４７０ｎｍで蒸留水（ブランク）に対して測定した。
【００２４】
サンプルの抗酸化活性パーセンテージ（％ＡＡ）を、次式を使用して算出した。
％ＡＡ＝１００（ＤＲ対照−ＤＲサンプル）／ＤＲ対照
これにより、
ＤＲ＝分解速度、（ａ／ｂ）／６０
ａ＝インキュベート前のサンプルの吸光度４７０ｎｍ
ｂ＝インキュベート後のサンプルの吸光度４７０ｎｍ
ＤＲ対照＝対照サンプルの分解速度
ＤＲサンプル＝試験したサンプルの分解速度
【００２５】
この検討におけるケナフ種子油及び市販食用油の抗酸化活性は、ｍｇ α−トコフェロール当量（Ｔｅｑ）／ｇ油サンプルで示した。
【００２６】
ＤＰＰＨ捕捉活性によるケナフ種子油及び市販食用油のＩＣ５０値を図２に示す。一般に、ケナフ種子油のＩＣ５０値は、１２．２７ｍｇ／ｍｌ〜３９．８０ｍｇ／ｍｌの範囲であったのに対し、市販料理用油では、その範囲が２０．５９ｍｇ／ｍｌ〜７０．４３ｍｇ／ｍｌであった。２００／８０で抽出したＳＦＥケナフ油は、全試験サンプルと比較して最も高い抗ラジカル活性を示した（Ｐ＜０．０５）。対称的に、オリーブ油は、抗ラジカル活性が最も弱かった（Ｐ＜０．０５）。この結果によって、オリーブ油が、１０種の試験植物油の中で最もＤＰＰＨ抗ラジカル活性の弱いサンプルの１つであることが確実になった。パーム核油及び米ぬか油は、おそらく脂肪酸不飽和及び（トコフェロール、トコトリエノール、γ−オリザノールなどの）抗酸化物質含有量のレベルにより、市販料理用油の中で最も高い抗ラジカル活性を有する（Ｐ＜０．０５）サンプルであることがわかった。ＤＰＰＨフリーラジカルの抑制における油の有効性の順序は、以下のとおりである。すなわち、ケナフ：２００／８０＞パーム≧米ぬか≧ケナフ：２００／６０≧ケナフ：２００／４０≧ケナフ：４００／６０≧ケナフ：４００／４０≧ケナフ：ＳＯＸ／Ｓ≧ダイズ≧カノーラ≧ヒマワリ≧トウモロコシ≧ケナフ：６００／６０≧ケナフ：６００／８０≧ケナフ：ＳＯＮＩＣ≧ケナフ：６００／４０≧ケナフ：４００／８０≧ケナフ：ＳＯＸ／Ｌ＞オリーブ（Ｐ＜０．０５）。４００バールを超えるＳＦＥによって抽出したケナフ種子油は、溶媒抽出したケナフ種子油、並びにパーム油、米ぬか油、及びオリーブ油を除く市販料理用油の大多数と同様の抗ラジカル活性を示した（Ｐ＞０．０５）。しかし、これらの市販食用油には、処理の際にＢＨＡ、ＢＨＴ、及びＴＢＨＱのような合成の抗酸化物剤が加えられている。したがって、ケナフ種子油は実際、これら市販料理用油と比べたとしても、より良好な抗ラジカル活性を有するといえ、また機能性料理用油として役立てられる可能性を秘めている。
【００２７】
図３は、ＢＣＢアッセイによるケナフ種子油及び市販料理用油の抗酸化活性を示す。サンプルの抗酸化活性は、α−トコフェロール標準曲線（ｙ＝９８４１．８ｘ−３．１６２６、ｒ２＝０．９８０１）の内挿によって算出し、ｍｇ Ｔｅｑ／ｇ油で示した。一般に、検討したサンプルの抗酸化活性は、０．１５ｍｇ Ｔｅｑ／ｇ油〜１．８５ｍｇ Ｔｅｑ／ｇ油の範囲であった。ＤＰＰＨ試験とは反対に、ＢＣＢアッセイでは抽出温度がＳＦＥケナフ種子油の抗酸化活性を決定する非常に重要な要素であると思われた。４００バール及び６００バールの抽出圧下で抽出温度が８０℃に上昇すると、抗酸化活性が大幅に低下する（Ｐ＜０．０５）。２００バールで抽出したケナフ種子油では、サンプルの抗酸化活性が、温度上昇に対応して徐々に低下した（Ｐ＜０．０５）。この結果の根拠となる、考えられる理由は、高圧高温で抽出されるケナフ種子油が、熱分解を受けやすい抗酸化物質特性を含んでいるのではないかということである。この理由のために、これらのサンプルは、熱を用いないＤＰＰＨ試験では良好な抗酸化活性を示し、ＢＣＢアッセイでは逆説的な結果を示すのではないかと思われる。これ以外に、ＤＰＰＨの捕捉活性は、主としてラジカル反応部位への抗酸化物質の立体的アクセシビリティー（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に応じて決まるので（Ｐｒｉｏｒ、Ｗｕ、及びＳｃｈａｉｃｈ、２００５年）、高温抽出したケナフ種子油中の抗酸化物質が、リノリ（ｌｉｎｏｌｙ）ラジカル（たとえば、ペルオキシル及びアルキルラジカル）に対してＤＰＰＨラジカルより弱い反応性しかもたないことも、この筋書の根拠となる、考えられる理由ではないかと思われる。しかし、Ｌｉｍ及びＱｕａｈ（２００７年）によれば、反応系が異なっているので、ＢＣＢアッセイでの結果をＤＰＰＨラジカル捕捉アッセイの結果と関係付けることはできない。
【００２８】
ＢＣＢアッセイでは、試験した７種類の市販食用油の中で、パーム油及びオリーブ油が、それぞれ抗酸化活性が最も強いサンプル及び最も弱いサンプルとなった（Ｐ＜０．０５）。市販食用油と比較すると、市販の油のほとんどが合成の抗酸化剤で補われているにもかかわらず、（ケナフ：４００／８０及び６００／８０を除く）ほとんどすべてのケナフ油サンプルが、市販食用油より高い抗酸化活性を示した（Ｐ＜０．０５）。（２００／６０、２００／８０、４００／８０、及び６００／８０を除く）大多数のＳＦＥ抽出ケナフ種子油と溶媒抽出ケナフ種子油とに、抗酸化活性の有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。このことは、熱によって誘発されるリノール酸の過酸化に対して、市販食用油と比べて強力な抗酸化活性を有するケナフ種子油の抽出において、ＳＦＥが有機溶媒の代替手段になり得ることを示唆している。
【００２９】
実施例３ Ｖ３６ケナフ種子の油抽出及び抗酸化活性の評価
ａ．乾燥ケナフ種子の調製
ケナフ種子（品種：Ｖ３６）の汚れを除き、オーブン（ＦＤ１１５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）にて４０℃で乾燥させて恒量にした。乾燥に引き続いて、ケナフ種子を抽出前に４℃で保管した。
【００３０】
ｂ．超臨界二酸化炭素流体抽出（ＳＦＥ）
実施例１（ｂ）に記載の方法に従って、超臨界二酸化炭素抽出装置（Ｔｈａｒ １０００Ｆ、Ｔｈａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国ペンシルヴェニア州ピッツバーグ）を最適な抽出パラメーター（圧力（バール）／温度（℃）：６００／４０及び６００／６０）で使用することにより、ケナフ種子を抽出にかけた。１５０分間抽出した後、得られた総油量を算出した。
【００３１】
ｃ．従来型超音波支援溶媒抽出（ＳＯＮＩＣ）
実施例１（ｄ）に記載の方法に従って、Ｖ３６ケナフ種子の溶媒抽出を行った。
【００３２】
ｄ．総フェノール含量の決定
Ｒａｍａｄａｎら（２００３年）が記載している方法に従って、ケナフ種子油の精製処理を行った。簡潔に述べると、２グラムのサンプルをｎ−ヘキサン（５ｍｌ）に溶解させ、ガラス管中でボルテックスして２分間かけて１０ｍｌのメタノール−水（８０：２０、ｖ／ｖ）と混合した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、パスツールピペットを使用して水アルコール抽出物を脂相から分離した。その後、水アルコール抽出物をプールし、シロップが粘稠になるまで、減圧下にて５０℃で濃縮した（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）。水アルコール抽出物をアセトニトリル（１５ｍｌ）に溶解し直し、混合物をｎ−ヘキサン（各１５ｍｌ）で３回洗浄した。アセトニトリル中の精製された画分を、減圧下にて５０℃で濃縮し（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ２１０、Ｂｕｃｈｉ、スイス国Ｆｌａｗｉｌ Ｐｏｓｔｆａｃｈ）、次いで、総フェノール含量分析に向けてメタノールに溶解させた。
【００３３】
ケナフ種子油中の総フェノール含量は、Ｓｉｎｇｈら（２００２年）の方法に従って求めた。ちょうど１００ｍｇの抽出物を１０ｍｌのメタノールに溶解させた。半ミリリットルずつの分割量を２．５ｍｌのＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、スイス国Ｂｕｃｈｓ）にそれぞれ加えた後、これを２ｍｌの７．５％Ｎａ２ＣＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）と混合した。混合物を十分に混合し、４０℃で３０分間インキュベートした。サンプルの吸光度を分光光度計によって７６０ｎｍで測定した（Ｐｈａｒｍａｓｐｅｃ ｕｖ−１７００、島津製作所、京都府）。サンプルの総フェノール含量を、没食子酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、スイス国Ｂｕｃｈｓ）標準曲線によって決定し、ｍｇ没食子酸当量／ｇサンプル（ＧＡＥ／ｇサンプル）で示した。
【００３４】
ｅ．ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉活性
ＤＰＰＨラジカル捕捉アッセイは、Ｒａｍａｄａｎら（２００３年）が記載している方法に多少手を加えた方法に従って実施した。簡潔に述べると、０．１ｍＭのＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）エタノール溶液０．３９ｍｌを、様々な濃度のサンプル抽出物０．１ｍｌと室温で反応させた。混合物を激しく振盪し、６０分間暗所に放置した。電子スピン共鳴（ＥＳＲ）（ＪＥＯＬ ＦＡ１００、日本電子株式会社、東京都）を以下の条件で使用することにより、読取りを行った。すなわち、変調周波数：１００ｋＨｚ、中心磁場（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｉｅｌｄ）：３３６．７３４ｍＴ±５、掃引時間：１分、電力：８ｍＷ、変調幅（ｍｏｄ ｗｉｄｔｈ）：０．２ｍＴ、時定数＝０．１５秒、振幅：１６０。アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ドイツ国Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ）、及びα−トコフェロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、米国ミズーリ州セントルイス）をこの試験の標準物質として使用した。ケナフ種子油のＤＰＰＨ捕捉活性は、ｍｇ α−トコフェロール当量／ｇサンプル（ｍｇ Ｔｅｑ／ｇサンプル）及びｍｇアスコルビン酸当量／ｇサンプル（ｍｇ ＡＡｅｑ／ｇサンプル）で示した。
【００３５】
ｆ．ヒドロキシル捕捉活性試験
ヒドロキシル捕捉活性試験は、ＥＳＲ（ＪＥＯＬ ＦＡ１００、日本電子株式会社、東京都）を使用して、扁平石英セルで実施した。反応は、４０μｌのＤＭＰＯ（ラボテック株式会社、東京都）（４００ｍＭ）、３７．５μｌのＦｅＳＯ４（ＢＤＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．、英国プール）（０．４ｍＭ）、１１２．５μｌのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、米国ミズーリ州セントルイス）（０．１ｍＭ）、６０μｌの（様々な濃度の）サンプル、及び１５０μｌのＨ２Ｏ２（Ｂｅｎｄｏｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ノルウェー国Ｂｅｎｄｏｓｅｎ）（２ｍＭ）を混合してから約２分後に開始した。ＥＳＲの条件は、中心磁場：３３６．４５±５、電力：８ｍｗ、変調幅：０．１ｍＴ、掃引時間：２分、時定数：０．１秒、振幅：１６０、変調周波数：１００ｋＨｚとした。ケナフ油のヒドロキシルラジカル捕捉活性は、ｇ ＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国レスターシア州ラフバラ）当量／ｇサンプル（ｇ ＤＭＳＯＥ／ｇサンプル）で示した（Ｔｈｏｍｓｅｎら、２０００年）。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１は、Ｖ３６ケナフ種子油の総フェノール含量、ＤＰＰＨ捕捉活性、及びヒドロキシルラジカル捕捉活性を示す。収率、総フェノール含量、ＤＰＰＨ捕捉活性、及びＶ３６ケナフ種子油のヒドロキシルラジカル捕捉活性は、それぞれ、１３．０５〜１６．６０％、０．００８〜０．０１７ｍｇ ＧＡＥ／ｇサンプル、０．４８１〜０．５９４ｍｇ Ｔｅｑ／ｇサンプル及び０．３９５〜０．４８４ｍｇ ＡＡｅｑ／ｇサンプル、並びに１．４４８〜３．３４９ ＤＭＳＯＥ／ｇサンプルの範囲となった。ヘキサン抽出は、両方のＳＦＥ抽出より高い収率を示した（Ｐ＜０．０５）。等圧条件下（６００バール）で抽出温度が４０℃から６０℃に上昇すると、Ｖ３６ケナフ種子の収油率がわずかに向上した（Ｐ＜０．０５）。
【００３８】
この結果は、Ｑｕｉ ｐｉｎｇ ３ケナフ種子のＳＦＥ抽出（実施例１ｅ）での知見に一致している。しかし、結果は、Ｖ３６ケナフ種子の含油量がＱｕｉ Ｐｉｎｇ３と比べて少ないことも示している。Ｖ３６ケナフ種子のヘキサン、ＳＦＥ ６００／４０、及びＳＦＥ ６００／６０の各抽出からの収油率は、Ｑｕｉ Ｐｉｎｇ ３よりそれぞれ２１．３％、３５．３％、及び３１．４％低い。ヘキサン抽出では、Ｖ３６ケナフ種子油のフェノール含量及びヒドロキシルラジカル捕捉活性がＳＦＥ抽出と比べて向上する（Ｐ＜０．０５）。
【００３９】
その上、これらの結果は、等圧条件下（６００バール）でＳＦＥ抽出温度が４０℃から６０℃に上昇しても、総フェノール含量及び抗酸化活性（ＤＰＰＨ及びヒドロキシルラジカル捕捉活性）に有意差がないことも示している（Ｐ＞０．０５）。この結果は、Ｑｕｉ ｐｉｎｇ ３ケナフ種子油のＤＰＰＨ捕捉活性（実施例２ｃ）での知見に一致している。ＤＰＰＨ捕捉活性試験ではサンプル間に有意差が見られなかった（Ｐ＞０．０５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界流体を利用し、２００〜６００バールの範囲の圧力にて４０〜８０℃の範囲の温度で実施する、ケナフ種子（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ Ｌ．）の油を抽出するための超臨界流体抽出（ＳＦＥ）法。
【請求項２】
前記超臨界流体が超臨界二酸化炭素である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項３】
二酸化炭素消費量が０．０２５〜３．７５ｋｇの範囲である、請求項２に記載のＳＦＥ法。
【請求項４】
ケナフ種子の品種がＱｕｉ Ｐｉｎｇ ３及びＶ３６である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項５】
温度４０℃及び圧力６００バールでの収油率が２０．１８％である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項６】
温度６０℃及び圧力６００バールでの収油率が２０．８５％である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項７】
温度８０℃及び圧力６００バールでの収油率が２１．２９％である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項８】
請求項１に記載のＳＦＥ法と溶媒抽出との比較であって、使用する溶媒がｎ−ヘキサンである、比較。
【請求項９】
ＳＦＥ法の利点が、溶媒なしの条件下でケナフ種子油を抽出することである、請求項９に記載のＳＦＥと溶媒抽出との比較。
【請求項１０】
それぞれ１グラムのケナフ種子油が、０．４〜２ｍｇのα−トコフェロールと同等の抗酸化活性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
２００バールで抽出したケナフ種子油が、４００バール及び６００バールで抽出したケナフ種子油より高い抗ラジカル活性を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＦＥケナフ種子油が、溶媒抽出したケナフ種子油より２〜３倍高い抗ラジカル活性を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
超臨界流体を利用し、２００〜６００バールの範囲の圧力にて４０〜８０℃の範囲の温度で実施する、ケナフ種子（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ Ｌ．）の油を抽出するための超臨界流体抽出（ＳＦＥ）法。
【請求項２】
前記超臨界流体が超臨界二酸化炭素である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項３】
二酸化炭素消費量が０．０２５〜３．７５ｋｇの範囲である、請求項２に記載のＳＦＥ法。
【請求項４】
ケナフ種子の品種がＱｕｉ Ｐｉｎｇ ３及びＶ３６である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項５】
温度４０℃及び圧力６００バールでの収油率が２０．１８％である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項６】
温度６０℃及び圧力６００バールでの収油率が２０．８５％である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項７】
温度８０℃及び圧力６００バールでの収油率が２１．２９％である、請求項１に記載のＳＦＥ法。
【請求項８】
請求項１に記載のＳＦＥ法と溶媒抽出との比較であって、使用する溶媒がｎ−ヘキサンである、比較。
【請求項９】
ＳＦＥ法の利点が、溶媒なしの条件下でケナフ種子油を抽出することである、請求項９に記載のＳＦＥと溶媒抽出との比較。
【請求項１０】
それぞれ１グラムのケナフ種子油が、０．４〜２ｍｇのα−トコフェロールと同等の抗酸化活性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
２００バールで抽出したケナフ種子油が、４００バール及び６００バールで抽出したケナフ種子油より高い抗ラジカル活性を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＦＥケナフ種子油が、溶媒抽出したケナフ種子油より２〜３倍高い抗ラジカル活性を示す、請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５０６７５６（Ｐ２０１１−５０６７５６Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１４０９（Ｐ２０１０−５４１４０９）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／０００１１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６４８９０
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５０９１４２２０９）ユニヴェルシティ プトラ マレーシア (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＹ２００９／０００１１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６４８９０
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５０９１４２２０９）ユニヴェルシティ プトラ マレーシア (4)
【Ｆターム（参考）】
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