ケモカインα−５
【課題】αケモカインファミリーのメンバーである新規のＣＫα−５タンパク質、ＣＫα−５ポリペプチド、特に、ヒトＣＫα−５タンパク質をコードする単離された核酸分子、ＣＫα−５ポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、および組換え方法、ならびにＣＫα−５活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法を提供する。また、免疫系関連障害を検出するための診断方法および免疫系関連障害を処置するための治療方法を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する完全アミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１としてプラスミドＤＮＡとして寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列、を有するＣＫα−５ポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する完全アミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１としてプラスミドＤＮＡとして寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列、を有するＣＫα−５ポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ケモカインファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする、新規のヒト遺伝子に関する。より詳細には、ケモカインα−５（本明細書において、以下「ＣＫα−５」という）と命名されたヒトポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。ＣＫα−５ポリペプチドはまた、それらを産生するためのベクター、宿主細胞および組換え方法と同様に提供される。免疫系に関連する障害を検出するための診断方法およびこのような障害を処置するための治療方法もまた提供される。本発明はさらに、ＣＫα−５活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
種々の細胞型の移動および「輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）」を制御する能力は、因子の部分集合、またはタンパク質（ケモカインがその例である）により制御される。
【０００３】
ケモカインは、インタークライン（ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅ）サイトカインとも呼ばれ、構造的かつ機能的に関連する化学走性サイトカインのサブファミリーである。これらの分子は、通常、サイズが８〜１０ｋｄであるが、より大きな膜結合ケモカインポリペプチドが同定されている。一般に、ケモカインは、アミノ酸レベルで２０％〜７５％の相同性を示し、そして２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存されたシステイン残基により特徴付けられる。最初の２つのシステイン残基の配列に基づき、ケモカインは２つのサブファミリー（αおよびβ）に分類されている。αサブファミリーにおいて、最初の２つのシステインは、１つのアミノ酸により分離されており、従って「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリーと呼ばれる。βサブファミリーにおいて、この２つのシステインは、隣接する位置にあり、従って「Ｃ−Ｃ」サブファミリーと呼ばれる。これまでは、このファミリーの少なくとも１６の異なるメンバーが、ヒトにおいて同定されている。
【０００４】
インタークラインサイトカインは、広範な種類の機能を示す。顕著な特徴は、別個の細胞型（単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球および繊維芽細胞を含む）の化学走性移動を導くというその能力である。多くのケモカインは、前炎症性活性を有し、そして炎症反応の間の多数の段階に関与する。これらの活性は以下を含む；ヒスタミン放出の刺激、リソソーム酵素放出およびロイコトリエン放出、内皮細胞への標的免疫細胞の付着増大、補体タンパク質の結合増強、顆粒球付着分子および補体レセプターの発現誘導、および呼吸バースト。炎症におけるケモカインの関連に加えて、特定のケモカインは他の活性を示すことが、示されてきた。例えば、マクロファージ炎症タンパク質１（ＭＩＰ−１）は造血幹細胞増殖を抑制し得、血小板第４因子（ＰＦ−４）は内皮細胞増殖の強力なインヒビターであり、インターロイキン８（ＩＬ−８）はケラチノサイトの増殖を促進し、そしてＧＲＯは黒色腫細胞に関するオートクライン増殖因子である。
【０００５】
種々の生物学的活性を考えると、ケモカインが多数の生理学的状態および疾患状態（リンパ球の輸送、創傷治癒、造血調節および免疫学的障害（例えば、アレルギー、喘息および関節炎）を含む）に関連していることは、驚くことではない。
【０００６】
「Ｃ−Ｃ」ブランチのメンバーは、以下の細胞に対してその効力を発揮する；寄生生物を破壊することにより、寄生生物感染を弱め、そして呼吸系の気道における慢性の炎症を引き起こす好酸球；脊椎動物における腫瘍形成を抑制するマクロファージ；およびアレルギー性炎症において役割を果たすヒスタミンを放出する好塩基球。しかし、１つのブランチのメンバーは、他のブランチのケモカインに通常応答性である細胞に対して効果を発揮し得るので、従って、これらブランチのメンバーに正確な役割を結び付け得ない。
【０００７】
Ｃ−Ｃブランチのメンバーが単核細胞に対して支配的に作用し、そしてＣ−Ｘ−Ｃブランチのメンバーが好中球に対して支配的に作用する一方、明確な化学誘引物質特性を、この指針に基いてケモカインに割り当て得ない。１つのファミリーからのいくつかのケモカインは、他のファミリーの特徴を示す。
【０００８】
本発明のポリペプチドは、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」領域の保存されたシステイン残基を有し、そして公知のケモカインに対してアミノ酸配列相同性を有する。
【０００９】
従って、別個の細胞型の移動の調節因子、あるいは機能不全および疾患におけるそれらの役割の調節因子として機能する、ポリペプチドについての必要性が存在する。なぜなら、そのような調節の撹乱は、止血、新脈管形成、腫瘍転移、細胞移動、および排卵、ならびに神経発生に関する障害に関与し得るからである。従って、そのような障害を、検出、予防、寛解または矯正することにおいて役割を担い得る、そのようなヒトポリペプチドを同定して、そして特徴付ける必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、配列番号２に示される完全アミノ酸配列、または１９９７年８月２９日にＡＴＣＣ受託番号２０９２３１としてプラスミドＤＮＡとして寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列、を有するＣＫα−５ポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０〜２２０９にある。寄託されたＣＫα−５クローンを配列決定することにより決定されるヌクレオチド配列（これは、図１（配列番号１）に示される）は、２５４アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド５４２〜５４４位のＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む）を含む。本発明の核酸分子は、配列番号２に示されるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列（これらの分子はまた、ＣＫα−５アミノ酸配列のＮ末端に融合されたさらなるアミノ酸をコードし得る）をコードする核酸分子を含む。
【００１１】
本発明のポリペプチドは、公知のケモカインに対するアミノ酸配列相同性を有し、これは配列番号２のアミノ末端由来の最初のシステインから始まるという、αサブファミリーのケモカインの保存されたＣ−Ｘ−Ｃシステインパターンの特徴を含む。
【００１２】
ＣＫα−５はまた、いくつかのαケモカインにおいて見出される、最初のシステイン残基の直前にあるＥＬＲモチーフを欠き、このモチーフは好中球および内皮細胞の化学走性活性、ならびにＩＬ−８の脈管形成活性のために必要であることが公知である。
【００１３】
コードされたポリペプチドは、図１において下線を付けた２７アミノ酸の推定リーダー配列を有し；そして推定成熟ＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列はまた、図１において、配列番号２におけるアミノ酸残基２８〜２５４およびアミノ酸残基１〜２２７として、示される。さらに、このポリペプチドは、図１の残基２８〜２０５由来の配列（配列番号２の１〜１７８）を有する細胞外ドメイン、図１の残基２０６〜２２７由来の配列（配列番号２の１７９〜２００）を有する膜貫通ドメイン、および図１の残基２２８〜２５４由来の配列（配列番号２の２０１〜２２７）を有する細胞内ドメインからなると推定される。
【００１４】
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）図１（配列番号２）の完全なアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く図１（配列番号２）の完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２６位〜２２７位）を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）図１の２８位〜２５４位（配列番号２の１〜２２７）のアミノ酸配列を有する推定成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）図１の２８位〜２０５位（配列番号２の１〜１７８）のアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＮ末端メチオニンを除く、完全なアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＣＫα−５の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様には、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）の任意のヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）のポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）のアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によるＣＫα−５ポリペプチドまたはペプチドの産生のためにこれらを用いる方法に関する。
【００１７】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＣＫα−５ポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２に示される完全なアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なアミノ配列を有する、完全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２に示される完全アミノ配列（すなわち、配列番号２の−２６位〜２２７位）を有する完全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配列；（ｃ）残基１〜２２７として配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟ＣＫα−５のアミノ酸配列；および（ｄ）残基１〜１７８として配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＣＫα−５の細胞外ドメインのアミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００１８】
本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列を有する、ＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６または７個、好ましくは少なくとも９個、そしてより好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸を有する、このようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までおよびこれを含む任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。本発明はさらに、本明細書中に記載される通りのアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体は、下記の通りに診断的または治療的に有用である。
【００２０】
本発明はまた、例えば、創傷治癒を刺激するため、固形腫瘍、微生物感染、自己免疫疾患、肝硬変、変形性関節症および肺線維症を処置するために用いられ得るＣＫα−５ポリペプチド、特にヒトＣＫα−５ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。ＣＫα−５ポリペプチドが必要な個体を処置する方法もまた提供される。
【００２１】
本発明はさらに、インビトロの細胞、エクスビボの細胞、およびインビボの細胞、または多細胞生物への投与のためのＣＫα−５ポリヌクレオチドまたはＣＫα−５ポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特に好ましい特定の実施態様では、組成物は、疾患の処置のための、宿主生物におけるＣＫα−５ポリペプチドの発現のためのＣＫα−５ポリヌクレオチドを含む。これに関して特に好ましいのは、ＣＫα−５の異常な内在活性に関連する機能不全の処置のための、ヒト患者における発現である。
【００２２】
本発明はまた、ＣＫα−５ポリペプチドの生物学的活性を増強または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、ＣＫα−５ポリペプチドにより増強されるレセプターを、ＣＫα−５ポリペプチドの存在下で候補化合物と接触させる工程、候補化合物およびＣＫα−５ポリペプチドの存在下におけるこのレセプターを発現する細胞のカルシウム移動または化学走性活性をアッセイする工程、ならびにレセプター活性を標準レベルの活性と比較する工程（標準は、接触がレセプターとＣＫα−５ポリペプチドとの間で、候補化合物の非存在下で行なわれる場合にアッセイされる）を包含する。このアッセイでは、標準を超えるカルシウム移動および化学走性における増加は、候補化合物がＣＫα−５活性のアゴニストであることを示し、そして標準と比較したカルシウム移動および化学走性における減少は、化合物がＣＫα−５活性のアンタゴニストであることを示す。
【００２３】
ＣＫα−５が好中球においてだけではなく、単球、マクロファージ、肝臓、肺、精巣、小脳および松果体においてもまた発現することが見出されている。従って、本発明の核酸は、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の差示的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。さらに、上記の（特に、免疫系の）組織または細胞の多くの障害については、「標準」のＣＫα−５遺伝子発現レベル（すなわち、免疫系の障害を有さない個体からの健常組織におけるＣＫα−５発現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルのＣＫα−５遺伝子発現は、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、ガン組織および創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、もしくは髄液）において検出され得る。従って、本発明は、このような障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）個体の細胞または体液におけるＣＫα−５遺伝子の発現レベルをアッセイする工程：（ｂ）ＣＫα−５遺伝子の発現レベルを、標準のＣＫα−５遺伝子の発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較して、アッセイされたＣＫα−５遺伝子の発現レベルの増加または減少は、免疫系における障害を示す、工程。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、身体におけるＣＫα−５活性のレベルの増加が必要な個体を処置する方法に関する。この方法は、このような個体に、本発明の単離されたＣＫα−５ポリペプチドまたはそのアゴニストの治療有効量を含有する組成物を投与する工程を包含する。
【００２５】
本発明のなおさらなる局面は、身体におけるＣＫα−５活性のレベルの減少が必要な個体を処置するための方法に関する。この方法は、このような個体に、ＣＫα−５アンタゴニストの治療有効量を含有する組成物を投与する工程を包含する。本発明において使用するのに好ましいアンタゴニストは、ＣＫα−５特異的抗体である。
【００２６】
上記に加え、本発明は、以下を提供する：
（項目１）以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含有する単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２の残基−２７〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全長ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
（項目２）前記ポリヌクレオチドが、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３）前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の残基−２６〜２２７をコードする、配列番号１におけるヌクレオチド配列の部分を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の残基１〜１７８をコードする、配列番号１におけるヌクレオチド配列の部分を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目５）以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含有する単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２の残基ｎ〜１７８のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎは、−４〜１１の範囲の整数である、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基−４〜ｍのアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｍは、５５〜１７８の範囲の整数である、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の残基ｎ〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎおよびｍは、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において規定される整数である、ヌクレオチド配列；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全ＣＫα−５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該部分は、該完全アミノ酸配列のアミノ末端から２３〜約３８のアミノ酸を除く、ヌクレオチド配列；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全ＣＫα−５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該部分は、該完全アミノ酸配列のカルボキシ末端から２４〜約１７２のアミノ酸を除く、ヌクレオチド配列；および
（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全ＣＫα−５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該部分は、上記（ｄ）および（ｅ）における任意のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の組み合わせを含む、ヌクレオチド配列。
（項目６）前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目７）前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目８）前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチドを有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目９）項目１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）におけるヌクレオチド配列と同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、ここでハイブリダイズする前記ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチド。
（項目１０）項目１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）におけるアミノ酸配列を有するＣＫα −５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目１１）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチド；
（ａ）配列番号２のＴｙｒ−１２〜Ｓｅｒ−２４；
（ｂ）配列番号２のＣｙｓ−５５〜Ｖａｌ−６３；
（ｃ）配列番号２のＴｈｒ−９１〜Ｐｒｏ−１１０；および
（ｄ）配列番号２のＳｅｒ−１２０〜Ｉｌｅ−１４５。
（項目１２）項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する工程を包含する、組換えベクターを生成するための方法。
（項目１３）項目１２に記載の方法によって生成される、組換えベクター。
（項目１４）項目１３に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を産生するための方法。
（項目１５）項目１４に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
（項目１６）ＣＫα−５ポリペプチドを生成するための組換え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で項目１５に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
（項目１７）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたＣＫα−５ポリペプチド；
（ａ）配列番号２として示されるアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７として示されるアミノ酸、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７として示されるアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる成熟ＣＫα−５のアミノ酸配列；および
（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８として示されるアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列。
（項目１８）項目１０に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチド。
（項目１９）項目１８に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する、単離された抗体。
（項目２０）ＣＫα−５ポリペプチドを必要とする個体を処置する方法であって、該個体に対して項目１７に記載の単離されたポリペプチドを投与する工程を含む、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定して決定された、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された分子を提供する。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、２つのｃＤＮＡクローン：ＨＭＳＣＪ６２およびＨＮＦＥＭ０５を配列決定することにより得られた。ＨＭＳＣＪ６２は、図１に示される全長配列を含み、そしてＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，９４１０ Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５０に保管される。ＨＮＦＥＭ０５は、その最初の３６０ヌクレオチド（コード領域の全てを含む）を除いた全てを含み、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）受託番号２０９２３１（１９９７年８月２９日付）として寄託される。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に位置する。
【００２８】
寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に含まれる。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、公知のケモカインに対するアミノ酸配列の相同性を有し、それは配列番号２におけるアミノ末端からの最初のシステインより始まる、ケモカインのαサブファミリーに特徴的な、保存されたＣ−Ｘ−Ｃシステインパターンを含む。本発明のＣＫα−５タンパク質はまた、図２に示されるようなＭＩＰ１−β（配列番号３）についてのヒトｍＲＮＡの翻訳産物を特に含む、他のケモカインと配列相同性を共有する。
【００３０】
αケモカインファミリーの公知のメンバーについて、大部分はＥＬＲモチーフを含み（例えば、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ２、ＧＲＯ−α、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびＮＡＰ−２）、そして他はＥＬＲモチーフを欠失している（例えば、ＩＰ−１０、ＰＦ４およびＭＩＧ）。ＣＫα−５は、最初のシステイン残基に直ちに先行するＥＬＲモチーフを欠失している。このＥＬＲモチーフは、好中球および内皮細胞の化学走性活性、ならびにＩＬ−８の脈管形成活性に必要とされることが明らかに示された（Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２７３４８−２７３５７（１９９５））。さらに、ＥＬＲ−Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、インビトロおよびインビボにおいて、脈管形成活性を有するが、その一方で、ＥＬＲモチーフを欠失しているＣ−Ｘ−Ｃケモカインは、実際には、脈管形成静止的（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）である（Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、前述；Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２：１５５−１６２（１９９５）；およびＫｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１７９８−１８０１（１９９２））。腫瘍の脈管形成におけるそのような因子の可能な役割の点については、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１４０９−１４１５（１９９４）は、気管支原生癌腫瘍において、その腫瘍細胞から産生されるようであるＩＬ−８のレベルの上昇を報告した。
【００３１】
（核酸分子）
他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡからのＭｏｄｅｌ ３７３）を使用して決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤差を含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってさらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。このような差異は、このような挿入または欠失の点にて始まる。
【００３２】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては対応するリボヌクレオチド（Ａ，Ｇ，ＣおよびＵ）の配列（ここで、特定したデオキシリボヌクレオチド配列中のそれぞれのチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）により置換される）が、意図される。
【００３３】
本明細書中に提供した情報、例えば、図１（配列番号１）のヌクレオチド配列を使用して、ＣＫα−５ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準のクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡをクローン化する手順）を使用して入手され得る。本発明の実例として、図１（配列番号１）に記述される核酸分子は、主に免疫系組織由来のｃＤＮＡライブラリー中に発見された。クローンＨＭＳＣＪ６２は、単球のｃＤＮＡライブラリーから単離され、そしてＨＮＦＥＭ０５は、好中球ｃＤＮＡライブラリーから単離された。
【００３４】
同じ遺伝子のさらなるクローンもまた、以下のヒト組織：結腸および骨巨細胞腫由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された。
【００３５】
図１（配列番号１）のＣＫα−５ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列は、２５４アミノ酸残基のタンパク質（開始コドンを伴う、図１（配列番号１）中のヌクレオチド配列のヌクレオチドの５４２〜５４４位）をコードするオープンリーディングフレームを含む。配列番号２中に示されるＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列は、ラットマクロファージ炎症性タンパク質−１β（図２）（登録番号ｇｉ｜４５９１４８で、ＧｅｎＢａｎｋにアクセスされ得る）と、約５１％類似および約２８％同一である。
【００３６】
当業者に理解されるように、上記の配列決定の誤差の可能性に起因して、委託されるｃＤＮＡによりコードされる実際の完全ＣＫα−５ポリペプチド（約２５４アミノ酸を含む）は、幾分より長く、またはより短くあり得る。より一般に、実際のオープンリーディングフレームは、図１（配列番号１）において示されるＮ末端のメチオニンコドンから推定されるアミノ酸の、±２０アミノ酸の範囲内、より好ましくは±１０アミノ酸の範囲内における任意のものであり得る。
【００３７】
（リーダー配列および成熟配列）
完全ＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるような、リーダー配列および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、ＣＫα−５タンパク質の成熟形態をコードする核酸分子を提供する。従って、シグナル仮説に従って、一旦、成長するタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る輸送が開始されると、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、シグナルまたは分泌リーダー配列を有し、これは完全ポリペプチドから切断されて、タンパク質の分泌される「成熟」形態を産生する。ほとんどの哺乳動物細胞、および昆虫細胞さえ、分泌されたタンパク質を同じ特異性で切断する。しかし、いくつかの場合において、分泌されたタンパク質の切断は、全体的に均一ではなく、タンパク質の２つ以上の成熟種を生じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は、究極的には、完全タンパク質の一次構造によって決定されること、すなわち、ポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが公知である。それゆえ、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１として同定されるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。「ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１におけるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチド」によって、寄託されたベクターに含まれるクローンのヒトＤＮＡ配列によってコードされる完全なオープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例えば、以下に記載のような、ＣＯＳ細胞）における発現によって産生されるＣＫα−５タンパク質の成熟形態が意味される。
【００３８】
さらに、タンパク質が分泌リーダーならびにリーダー配列の切断点を有するか否かを推定するための方法が利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））の方法では、完全な（非切断の）タンパク質の短いＮ末端荷電領域、および引き続く非荷電領域からの情報が使用される。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））では、切断部位の周囲の残基（代表的には、残基−１３〜＋２、ここで、＋１は成熟タンパク質のアミノ末端を示す）からの情報が使用される。これらの方法の各々に関する、公知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推定する精度は、７５〜８０％の範囲にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前述）。しかしこの２つの方法は、所定のタンパク質に関して同じ推定切断点を常に生じるとは限らない。
【００３９】
本出願の場合において、完全ＣＫα−５ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、京都大学、化学研究所（Ｎａｋａｉ，Ｋ．および Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１９９２））のＫｅｎｔａ Ｎａｋａｉ博士より入手可能なコンピュータープログラム「ＰＳＯＲＴ」により解析された。ＰＳＯＲＴはアミノ酸配列に基づくタンパク質の細胞性局在位置を推定するためのエキスパートシステムである。局在化のこのコンピューター推定の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が取りこまれる。上記のコンピューター解析は、配列番号２に示される完全アミノ酸配列内で、１つの可能性のある切断部位を予測し；すなわち、図１における残基２７と残基２８との間、および配列番号２における残基−１と残基１との間である。
【００４０】
示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えばｍＲＮＡ）で、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより入手または合成的に生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としてもまた知られる、コード鎖であり得るか、またはアンチセンス鎖とも言われる非コード鎖であり得る。
【００４１】
「単離された」核酸分子によって、そのネイティブな環境から取り出された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成されたような分子をさらに含む。「単離された」とは、本発明者は、単離された染色体および酵母人工染色体（ＹＡＣ）のような、非常に大きい遺伝物質片（２００ｋｂ＋）を特異的に排除することを意図している。
【００４２】
本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の５４２〜５４４位の開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含む。
【００４３】
配列番号２の１〜２２７位に示される推定成熟ＣＫα−５タンパク質に対するコード配列を含むＤＮＡ分子もまた、含まれる。
【００４４】
さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列とは実質的に異なるが、遺伝コードの縮重により、なおＣＫα−５タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝コードおよび種特異的コドン優先度は、当該分野で周知である。従って、例えば、特定の宿主に関してコドン発現を至適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡ中のコドンをＥ．ｃｏｌｉのような細菌宿主に好ましいコドンに変更する）ために、上記の縮重改変体を作製することは当業者にとって慣用的である。
【００４５】
別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１（１９９７年８月２９日付）として受託されるプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードしている単離された核酸分子を提供する。
【００４６】
好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００４７】
本発明は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列もしくは上記の寄託クローンに含まれるＣＫα−５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子をさらに提供する。このような単離した分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子地図作製に使用するプローブとして、およびヒト組織におけるＣＫα−５遺伝子の発現を（例えば、ノーザンブロット解析によって）検出するために有用である。
【００４８】
本発明はさらに、本明細書中に記述されるヌクレオチド配列の一部をコードする核酸分子、ならびに本明細書中に記述した単離した核酸分子のフラグメントに関する。特に本発明は、配列番号１の１〜１３０３、５４２〜１３０３、６２２〜１３０３、６２５〜１３０３、６２８〜１３０３、６３１〜１３０３、６３４〜１３０３、６３７〜１３０３、６４０〜１３０３、６４３〜１３０３、６４６〜１３０３、６４９〜１３０３、６５２〜１３０３、６５２〜７８７、６５２〜８１７、６５２〜８４７、６５２〜８７７、６５２〜９０７、６５２〜９３７、６５２〜９６７、６５２〜９９７、６５２〜１０２７、６５２〜１０５７、６５２〜１０８７、６５２〜１１１７、６５２〜１１４７、６５２〜１１７７、６５２〜１２０７、６５２〜１２３７、または６５２〜１２６７位からなる配列番号１の一部を表しているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００４９】
さらに、配列番号１の広範な部分に関連したヌクレオチド配列を有する、以下の核酸分子が同定された：クローンＨＮＦＣＯ０９由来のＨＮＦＣＯ０９Ｒ（配列番号４）；クローンＨＮＥＤＳ２６Ｒ由来のＨＮＥＤＳ２６Ｒ（配列番号５）；。クローンＨＯＡＢＤ４７由来のＨＯＡＢＤ４７Ｒ（配列番号６）；クローンＨＴＥＩＲ４１由来のＨＴＥＩＲ４１Ｒ（配列番号７）；クローンＨＭＮＡＤ３６由来のＨＭＮＡＤ３６Ｒ（配列番号８）；およびクローンＨＴＥＤＱ０７由来のＨＴＥＤＱ０７ＲＡ（配列番号２０）。
【００５０】
配列番号１の一部に関連する、以下の公に利用可能なｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ「ＥＳＴ」もまた同定された：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１３０７７６（配列番号９）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ２９０７１２（配列番号１０）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ３６６３２９（配列番号１１）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１２１７１６（配列番号１２）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１４６６７２（配列番号１３）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１４９３５９（配列番号１４）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ５６９９７０（配列番号２１）；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ９９４５５２（配列番号２２）。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、１以上の上記の配列１〜１４および２０〜２２ではなく、そしてそれらを含むものではない。
【００５２】
さらに本発明は、配列番号１のヌクレオチド５４２〜１３０３からの少なくとも約１７ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２０、２５、または３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明はまた、配列番号１の，好ましくは残基５４２〜１，３０３からの、少なくとも約５００、好ましくは約６００のヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含む。この点において、特に好ましいヌクレオチドフラグメントは、配列番号１におけるヌクレオチド６２２〜１，３０３からのフラグメントを含む。
【００５４】
より一般的には、寄託したｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントは、本明細書中に議論したような診断プローブおよびプライマーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔ長のフラグメントを意図する。もちろん、寄託したｃＤＮＡの、または図１（配列番号１）に示したヌクレオチド配列の全てではないが、ほとんどに対応するフラグメントとして、５０〜１０００ｎｔ長のより大きなフラグメントもまた、本発明に従って有用である。少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントは、例えば、寄託したｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントを意図する。本発明の好ましい核酸フラグメントは、図３に示されるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数から同定され、そして以下により詳細に記述されるＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。
【００５５】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、引き続く約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を意図する。
【００５６】
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは約３０〜７０（例えば５０）ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これらは、上記で、そして以下でより詳細に議論されるように、診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
【００５７】
例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの部分とは、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列）からの２０以上の連続したヌクレオチドを意図する。もちろん、ポリＡ配列（例えば図１（配列番号１）に示されるＣＫα−５ ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なストレッチのみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の核酸分子またはその相補体（例えば、現実的には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
【００５８】
示されるように、ＣＫα−５ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、それ自体で成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；および成熟ポリペプチドおよび付加配列についてのコード配列、例えば約２７アミノ酸のリーダーまたは分泌配列（例えばプレ、またはプロ、またはプレプロタンパク質配列）をコードするもの；上記の付加コード配列を有する、または有さない成熟ポリペプチドのコード配列を含み得るがこれらに限定されない。
【００５９】
本発明の核酸によって、例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセッシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）において役割を果すような、、転写されるが翻訳されない配列（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性のための））を含むがこれらに限定されない付加的な非コード配列；付加的アミノ酸をコードする追付加的コード配列（例えば付加的な機能性を提供するもの）とともに上記のタンパク質配列もまたコードされる。
【００６０】
従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、このマーカーアミノ酸配列は、例えば、特にｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ
Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドであり、多くのものは市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記述されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製のために提供される。「ＨＡ」タグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）に記載されるインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと対応する、精製に有用な別のペプチドである。以下に議論するように、他のこのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端でＦｃに融合したＣＫα−５を含む。
【００６１】
（改変体および変異体ポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはＣＫα−５タンパク質の一部、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、天然の対立遺伝子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替的な形態のひとつを意図する。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野において公知の変異誘発技術を使用して産生され得る。
【００６２】
そのような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により産生される改変体を含む。置換、欠失または付加は１つ以上のヌクレオチドを含み得る。この改変体は、コード領域、非コード領域または両方で変更され得る。コード領域での変化は、保存的または非保存的のアミノ酸の置換、欠失または付加を産生し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これはＣＫα−５タンパク質またはその一部の特性および活性を変化させない。この点について、また特に好ましいものは、保存的置換である。
【００６３】
最も高度に好ましいものは、アミノ末端メチオニンをコードするように改変され得るか、または他のＮ−もしくはＣ−末端融合ペプチドもしくはポリペプチドをコードするように改変され得るかのいずれかの配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する成熟タンパク質または、寄託したｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟ＣＫα−５アミノ酸配列をコードする核酸分子である。
【００６４】
さらなる実施態様は、以下ものからなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む：（ａ）配列番号２として示されるＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７として示されるＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７として示される推定成熟ＣＫα−５をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８として示されるＣＫα−５ポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全アミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる、Ｎ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【００６５】
本発明のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）の任意のヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、もしくは（ｈ）のアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関係する。
【００６６】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によりＣＫα−５ポリペプチドまたはペプチドを産生するためにそれらを使用するための方法に関する。
【００６７】
ＣＫα−５ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ＣＫα−５ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異をポリヌクレオチド配列が含み得ることを除いて、参照配列に同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１以上の連続した群においての、いずれかで散在されて生じ得る。
【００６８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば図１に示されるヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も相同性の高いセグメントを見出す。特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列と９５％同一か否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列化プログラムを使用する場合、パラメーターは、もちろん、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが計算されるように、そして参照配列のヌクレオチドの総数の５％までの、相同性におけるギャップが可能であるように設定される。
【００６９】
本出願は、図１（配列番号１）に示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関し、それらがＣＫα−５活性を有するポリペプチドをコードするか否かとは無関係である。これは、特定の核酸分子がＣＫα−５活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者にはなお、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての核酸分子の使用方法が公知であるからである。ＣＫα−５活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリーにおけるＣＫα−５遺伝子またはその対立遺伝子改変体の単離；（２）Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される、ＣＫα−５遺伝子の正確な染色体位置を提供するための中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および特定の組織でのＣＫα−５ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット解析。
【００７０】
しかし、図１（配列番号１）に示される核酸配列、または実際に、ＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する核酸分子が好ましい。「ＣＫα−５活性を有するポリペプチド」とは、完全ＣＫα−５タンパク質の細胞外部分の活性に、類似するが同一である必要はない活性を提示するポリペプチドを意図する。そのようなポリペプチドに保持されると考えられる、そのような１つの活性は、ヒトケモカインＨＣＣ−１が行うような、骨髄前駆細胞のコロニー形成を調節する能力である。骨髄性前駆細胞の阻害の程度を測定するためのインビトロにおけるコロニー形成アッセイは、Ｙｏｕｎｇら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５５：２６６１−２６６７（１９９５）に記載される。手短には、アッセイは、ヒトまたはマウス骨髄細胞を収集し、そして寒天上にそれらをプレートして、１以上の成長因子、および（１）ＣＫα−５タンパク質（または候補ポリペプチド）を含むトランスフェクトさせた宿主細胞上清または（２）トランスフェクトされてない宿主細胞上清コントロールのいずれかを添加し、そしてマウスおよびヒトのＣＦＵ顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）によるか、ヒトの赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）によるか、あるいはヒトＣＦＵ顆粒球赤血球マクロファージ巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）によるコロニー形成の影響を測定することを含む。このような活性は、化学療法間の骨髄前駆細胞を保護するために有用である。
【００７１】
ＣＫα−５タンパク質は、上記アッセイにおいて用量依存様式で免疫系細胞増殖および分化を調節する。従って、「ＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチド」は、用量依存様式で、上記アッセイにおいて任意の同じ骨髄性前駆体調節活性をまた提示するポリペプチドを含む。用量依存活性の程度は、ＣＫα−５タンパク質の用量依存活性と同一である必要はないが、好ましくは「ＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチド」は、ＣＫα−５タンパク質と比較する場合、所定の活性において実質的に類似の用量依存性を提示する（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ＣＫα−５タンパク質と比較して、より高い活性、または約２５分の１未満でない活性、および好ましくは約１０分の１未満でない活性を提示する）。
【００７２】
他のＣＸＣケモカインのように、ＣＫα−５は、例えば、単球、リンパ球、好中球を含む白血球において活性を示す。この理由のために、ＣＫα−５は、これらの細胞型の増殖，分化、移動を指向するにおいて活性である。このような活性は、免疫増強または抑制、骨髄保護、幹細胞動員、急性および慢性の炎症制御ならびに白血病の処置に対して有用である。そのような活性を測定するためのアッセイは、当該分野で公知である。例えば、Ｐｅｔｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ １７：２７３（１９９６）；Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１１１１（１９９５）；Ｃａｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２５８（１９９２）；およびＳａｎｔｉａｇｏ−Ｓｃｈｗａｒｚら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７８：７（１９９５）を参照のこと。上記の学術論文の各々からのアッセイおよびプロトコールは、本明細書に参考として援用される。
【００７３】
もちろん遺伝コードの縮重に起因して、寄託したｃＤＮＡの核酸配列または図１（配列番号１）に示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する大多数の核酸分子が「ＣＫα−５タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを、当業者は直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て同じポリペプチドをコードするので、このことは上記の比較アッセイを実施しなくとも当業者に明らかである。縮重改変体でない核酸分子についても、妥当な数のものがまたＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることは、当該分野においてさらに認識される。これは、以下にさらに記述するように、タンパク質の機能を有意にもたらすようであるか、またはもたらさないようであるかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、一つの脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者らは十分に承知しているからである。
【００７４】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＣＫα−５ポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に相補的な宿主細胞においてのみ起こる。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物か、または荷電された脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００７６】
ＤＮＡインサートは、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどのような、適切なプロモーターに作動可能に結合されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始のための部位、終結のための部位、および転写された領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの最初の翻訳開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００７７】
示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
【００７８】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００７９】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている（例えば、Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００８０】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞においてか、精製の間か、または続く取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当該分野でよく知られており、そして慣用的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の安定化および精製のために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願第２０４５８６９号）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失し得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えば、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．ら， Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎ，ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【００８１】
ＣＫα−５タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む：天然の供給源からの精製産物（直接的に単離されたか、または培養されたかのいずれかの、体液、組織、および細胞を含む）；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変された開始メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによってコードされているＮ末端メチオニンは、一般的に、すべての真核細胞において翻訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野において周知である。大部分の原核細胞においても、大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、非効率的である。
【００８２】
（ポリペプチドおよびフラグメント）
本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたＣＫα−５ポリペプチド、あるいは上記ポリペプチドの一部を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。
【００８３】
（改変体および変異体ポリペプチド）
ＣＫα−５ポリペプチドの特徴を改善または変化させるために、タンパク質工学が利用され得る。当業者に公知である組換えＤＮＡ技術が、新規な変異体タンパク質もしくは「ムテイン」（単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含む）、または融合タンパク質を作製するために使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、活性の増強または安定性の増加を示し得る。さらに、それらは高収量で精製され得、そして少なくとも特定の精製および貯蔵条件下で、対応する天然のポリペプチドよりもより良好な可溶性を示す。
【００８４】
（Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体）
例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟型を含む多くのタンパク質について、生物学的な機能の実質的な損失なしにＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させ得ることが、当該分野において公知である。例えば、Ｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７のＮ末端アミノ酸残基が欠失した場合でさえ、ヘパリン結合活性を有した改変ＫＧＦタンパク質を報告した。今回の場合、本発明のタンパク質がケモカインポリペプチドファミリーのメンバーであるので、ジスルフィド架橋の形成に必要とされる最初の「Ｃｙｓ」までのＮ末端アミノ酸の欠失は、レセプター結合または標的細胞活性の調節のようないくらかの生物学的活性を保持し得る。図１の３８位（配列番号２の１１位）でのシステイン残基を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持することは期待されない。なぜなら、ケモカイン関連ペプチドにおけるこの残基は、レセプター結合およびシグナル伝達に必要とされる構造安定性を提供するジスルフィド架橋を形成することに必要とされることが、公知であるからである。
【００８５】
しかし、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質の、タンパク質の完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合する能力は、タンパク質の完全な形態または成熟形態の残基の大部分より少ない残基がＮ末端から除去された場合には、一般的に保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって、容易に決定され得る。
【００８６】
従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基（１１位のシステイン残基まで）を欠失したポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、配列番号２の残基ｎ〜１７８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｎは−４〜１１の範囲の整数であり、そしてシステイン１１は、ＣＫα−５タンパク質のレセプター結合活性に必要とされると考えられる、ＣＫα−５ポリペプチド（配列番号２に示される）の細胞外ドメインのＮ末端からの最初の残基の位置である。
【００８７】
より詳細には、本発明は、配列番号２の−４〜１７８、−３〜１７８、−２〜１７８、−１〜１７８、１〜１７８、２〜１７８、３〜１７８、４〜１７８、５〜１７８、６〜１７８、７〜１７８、８〜１７８、９〜１７８、１０〜１７８、および１１〜１７８、全部からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【００８８】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０アミノ酸残基を欠失することにより１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６；（１９８８））。今回の場合、本発明のタンパク質がケモカインポリペプチドファミリーのメンバーであるので、配列番号２の５５位のシステインまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、レセプター結合または標的細胞活性の調節のようないくらかの生物学的活性を保持し得る。図１の８２位（配列番号２の５５位）のシステイン残基を含むさらなるＣ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持することは期待されない。なぜなら、ケモカイン関連ポリペプチドにおけるこの残基が、レセプター結合およびシグナル伝達に必要とされる構造安定性を提供するジスルフィド架橋を形成するのに必要であることが公知であるからである。
【００８９】
しかし、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質の、タンパク質の完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合する能力は、完全なまたは成熟したタンパク質の残基の大部分より少ない残基がＣ末端から除去される場合、一般的に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野において公知の方法によって、容易に決定され得る。
【００９０】
従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＣＫα−５のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基（配列番号２の５５位のシステイン残基まで）を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基−４〜ｍのアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここでｍは５５〜１７８の範囲の任意の整数であり、そしてシステイン残基５５は、ＣＫα−５タンパク質のレセプター結合および標的細胞調節活性に必要とされると考えられる、完全ＣＫα−５ポリペプチド（配列番号２に示される）のＣ末端からの最初の残基の位置である。
【００９１】
より詳細には、本発明は、配列番号２の残基−４〜５５、−４〜５６、−４〜５７、−４〜５８、−４〜５９、−４〜６０、−４〜６１、−４〜６２、−４〜６３、−４〜６４、−４〜６５、−４〜６６、−４〜６７、−４〜６８、−４〜６９、−４〜７０、−４〜７１、−４〜７２、−４〜７３、−４〜７４、−４〜７５、−４〜７６、−４〜７７、−４〜７８、−４〜７９、−４〜７９、−４〜８０、−４〜８１、−４〜８２、−４〜８３、−４〜８４、−４〜８５、−４〜８６、−４〜８７、−４〜８８、−４〜８９、−４〜９０、−４〜９１、−４〜９２、−４〜９３、−４〜９４、−４〜９５、−４〜９６、−４〜９５、−４〜９６、−４〜９７、−４〜９８、−４〜９９、−４〜１００、−４〜１０１、−４〜１０２、−４〜１０３、−４〜１０４、−４〜１０５、−４〜１０６、−４〜１０７、−４〜１０８、−４〜１０９、−４〜１１０、−４〜１１１、−４〜１１２、−４〜１１３、−４〜１１４、−４〜１１５、−４〜１１６、−４〜１１７、−４〜１１８、−４〜１１９、−４〜１２０、−４〜１２１、−４〜１２２、−４〜１２３、−４〜１２４、−４〜１２５、−４〜１２６、−４〜１２７、−４〜１２８、−４〜１２９、−４〜１３０、−４〜１３１、−４〜１３２、−４〜１３３、−４〜１３４、−４〜１３５、−４〜１３６、−４〜１３７、−４〜１３８、−４〜１３９、−４〜１４０、−４〜１４１、−４〜１４２、−４〜１４３、−４〜１４４、−４〜１４５、−４〜１４６、−４〜１４７、−４〜１４８、−４〜１４９、−４〜１５０、−４〜１５１、−４〜１５２、−４〜１５３、−４〜１５４、−４〜１５５、−４〜１５６、−４〜１５７、−４〜１５８、−４〜１５９、−４〜１６０、−４〜１６１、−４〜１６２、−４〜１６３、−４〜１６４、−４〜１６５、−４〜１６６、−４〜１６７、−４〜１６８、−４〜１６９、−４〜１７０、−４〜１７１、−４〜１７２、−４〜１７３、−４〜１７４、−４〜１７５、−４〜１７６、−４〜１７７、−４〜１７８、全部からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【００９２】
本発明はまた、可溶型（細胞外ドメイン）のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供し、これは配列番号２の残基ｎ〜ｍを有するものとして一般的に記載され得る。ここでｎおよびｍは上記で述べたような整数である。特に好ましくは、配列番号２の１１〜５５、１１〜５６、１０〜５７、１０〜５８、１０〜５９、１０〜６０、１０〜６１、１０〜６２、９〜６３、９〜６４、９〜６５、９〜６６、９〜６７、９〜６８、９〜６９、９〜７０、９〜７１、９〜７２、９〜７３、８〜７４、８〜７５、８〜７６、８〜７７、８〜７８、８〜７９、８〜７９、８〜８０、８〜８１、８〜８２、８〜８３、８〜８４、７〜８５、７〜８６、７〜８７、７〜８８、７〜８９、７〜９０、７〜９１、７〜９２、７〜９３、７〜９４、７〜９５、７〜９６、７〜９５、７〜９６、７〜９７、７〜９８、７〜９９、７〜１００、６〜１０１、６〜１０２、６〜１０３、６〜１０４、６〜１０５、６〜１０６、６〜１０７、６〜１０８、６〜１０９、６〜１１０、６〜１１１、６〜１１２、６〜１１３、６〜１１４、６〜１１５、６〜１１６、６〜１１７、６〜１１８、６〜１１９、６〜１２０、６〜１２１、６〜１２２、６〜１２３、６〜１２４、６〜１２５、６〜１２６、６〜１２７、６〜１２８、６〜１２９、６〜１３０、６〜１３１、６〜１３２、６〜１３３、６〜１３４、６〜１３５、６〜１３６、６〜１３７、６〜１３８、６〜１３９、６〜１４０、６〜１４１、６〜１４２、６〜１４３、６〜１４４、６〜１４５、６〜１４６、６〜１４７、６〜１４８、６〜１４９、６〜１５０、６〜１５１、６〜１５２、６〜１５３、６〜１５４、６〜１５５、６〜１５６、６〜１５７、５〜１５８、５〜１５９、５〜１６０、５〜１６１、５〜１６２、５〜１６３、５〜１６４、５〜１６５、５〜１６６、５〜１６７、５〜１６８、５〜１６９、４〜１７０、４〜１７１、４〜１７２、４〜１７３、４〜１７４、４〜１７５、４〜１７６、４〜１７７、および４〜１７８、全部からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００９３】
また、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なＣＫα−５のアミノ酸の一部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、この部分は、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ末端から２３〜約３７のアミノ酸、あるいはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる細胞外ドメインのカルボキシ末端から４９〜約１７２アミノ酸、または上記のアミノ末端およびカルボキシ末端欠損の任意の組み合わせを除外する。上記の欠失変異ポリペプチド形態の全部をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００９４】
（他の変異体）
上記で議論したタンパク質の末端欠失形態に加えて、ＣＫα−５ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能の顕著な効果なしで改変され得ることもまた、当業者に認識される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在するということが、思い出されるべきである。
【００９５】
従って、本発明はさらに、実質的なＣＫα−５ポリペプチド活性を示すか、または以下で議論するタンパク質部分のようなＣＫα−５タンパク質の領域を含む、ＣＫα−５ポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体は、活性にほとんど効果を有さないような、当該分野において公知の一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスが、Ｂｏｗｉｅ．Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供されており、その中で著者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主なアプローチが存在することを示す。第１の方法は進化の過程に依存し、ここで変異は自然選択によって受け入れられるか、または拒絶されるかのいずれかである。第２のアプローチは、遺伝子操作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入し、そして選択またはスクリーニングを使用して機能性を維持する配列を同定する。
【００９６】
著者らがいうように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くべきほど寛容であることを明らかにしてきた。著者らはさらに、どのアミノ酸変化がタンパク質の特定の位置において許容的である可能性があるかを示す。例えば、大部分の埋没したアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、一方、表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されていない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら（前出）およびそこに引用される参考文献中に記載される。代表的には、保存的な置換とみなされるものを表１に示す。
【００９７】
従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるものは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基は、保存されたアミノ酸残基または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてそのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、別の化合物と融合しているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列、または上記の形態のポリペプチドの精製に利用される配列、またはプロタンパク質配列のような、さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの上記の形態に融合しているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００９８】
従って、本発明のＣＫα−５は、天然の変異または人為的操作のいずれか由来の、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、変化は、好ましくは、マイナーな性質のものであり、例えばタンパク質のフォールディングまたは活性に顕著な影響を与えない保存的アミノ酸置換である（表１を参照のこと）。
【００９９】
【表１】
【０１００】
本発明のＣＫα−５タンパク質の機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））により同定され得る。後者の手順は、分子のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合あるいはインビトロまたはインビトロでの増殖活性）について試験される。
【０１０１】
特に興味深いのは、荷電したアミノ酸を、高度に所望の改善された特徴（例えば、より少ない凝集）を有するタンパク質を産生し得る、他の荷電したアミノ酸または中性アミノ酸で置換することである。凝集は、活性を低下させるだけではなく、薬学的処方物を調製する場合にもまた問題ともなり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１０２】
アミノ酸の置き換えはまた、細胞表面レセプターに対するリガンドの結合の選択性を変化させ得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）は２つの公知のタイプのＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的な結合を生じる特定の変異を記載する。リガンド−レセプター結合について決定的である部位はまた、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴法または光親和性標識）により決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）；およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１０３】
上記のように、ＣＫα−５は、ＥＬＲモチーフを欠損する。このようなモチーフが関連したケモカインにおいて代表的に見出されるような位置で、ＥＬＲモチーフを含むように、ＣＫα−５において特定の変異体を作成することにより、ＣＫα−５は、アンタゴニストとして作用し、従って、脈管形成活性を有する。従って、本発明のポリペプチドは、ＣＫα−５−ＥＬＲ変異体を含む。このようなＣＫα−５−ＥＬＲ変異体は、全長ＣＫα−５タンパク質または好ましくは、成熟ＣＫα−５タンパク質を含む。さらに、ＣＫα−５は、ケモカイン関連タンパク質ファミリーのメンバーであるので、ＣＫα−５の生物学的活性を完全に除去するよりむしろ調整するために、好ましくは、変異が、ＣＫα−５細胞外ドメインにおける、すなわち、配列番号２の１〜１７８位において、より好ましくは、ケモカインファミリーの全てのメンバーで保存されていないこの領域中の残基において、アミノ酸をコードする配列中に作成される。当該分野で公知であるように、４つの空間的に保存されたシステインは、全てのケモカインに存在し、ＣＫα−５の１１位、１３位、４１位、および５５位は、２つのジスルフィド架橋の形成に必要とされる。従って、配列番号２の１１位、１３位、４１位および５５位に位置する４つのシステイン残基のいずれかの改変は、好ましくない。また、本発明の一部分を形成するものは、上記ＣＫα−５変異体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。
【０１０４】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、単離された形態で提供され、そして好ましくは、実質的に精製される。ＣＫα−５ポリペプチドの組換え的に産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載された一工程の方法により実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野で周知である方法において、本発明の抗ＣＫα−５抗体を用いて、天然または組換えの供給源から精製され得る。
【０１０５】
本発明はさらに、（ａ）配列番号２に示す完全なアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされる完全なアミノ酸配列を有する全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２に示す完全なアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２６〜２２７位）、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配列を有する全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｃ）残基１〜２２７として配列番号２に示すアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされる成熟ＣＫα−５のアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；および（ｄ）残基１〜１７８として配列番号２に示すアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされるＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＣＫα−５ポリペプチドを提供する。
【０１０６】
本発明のさらなるポリぺプチドは、上記のポリペプチドに対して、少なくとも９０％類似性、より好ましくは、少なくとも９５％類似性、およびなおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％類似性を有するポリぺプチドを含む。本発明のポリぺプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリぺプチドもしくは配列番号２のポリぺプチドに対して、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％同一、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるポリぺプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリぺプチドの一部分を含む。このような改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１０７】
２つのポリぺプチドについての「％類似性」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）および類似性を決定するためのデフォルト設定を使用して２つのポリぺプチドのアミノ酸配列を比較することによって生成される類似性スコアが意図される。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９， １９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最良のセグメントを見い出す。
【０１０８】
ＣＫα−５ポリペプチドの参照アミノ酸配列に、少なくとも、例えば、９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、ポリぺプチドのアミノ酸配列が、ポリぺプチド配列がＣＫα−５ポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸あたり５アミノ酸の変化までを含み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の５％までが、欠失され得るか、または別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは、参照配列の総アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置の間のどこかで、参照配列中の残基の間に個々に散在してか、または参照配列内で１つ以上の連続する群の中に散在してかのいずれかで、起こり得る。
【０１０９】
実際に、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列に対してか、または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータプログラムを使用して従来的に決定され得る。特定の配列が、本発明による参照配列と、例えば、９５％同一であるか否かを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、パラメータは、同一性のパーセンテージが、参照アミノ酸配列の全長にわたって算定されるように、そして相同性中のギャップが参照配列におけるアミノ酸残基の総数の５％まで許容するように、設定される。
【０１１０】
本発明のポリぺプチドは、当業者に周知の方法を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でまたは分子ふるいゲルろ過カラム上で分子量マーカーとして、使用され得る。
【０１１１】
以下に詳細に記載されるように、本発明のポリぺプチドはまた、以下に記載されるＣＫα−５タンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて、またはＣＫα−５タンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。さらに、このようなポリぺプチドは、酵母ツーハイブリッド系において、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるＣＫα−５タンパク質結合タンパク質を「捕捉」するために使用され得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９））に記載される。
【０１１２】
（エピトープ保有部分）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」とは、全体としてのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【０１１３】
抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に示され、一連の単純な化学的法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７頁を参照のこと。
【０１１４】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。ＣＫα−５特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリぺプチドまたはペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番号２における約Ｔｙｒ−１２〜約Ｓｅｒ−２４のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号２における約Ｃｙｓ−５５〜約Ｖａｌ−６３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約Ｔｈｒ−９１〜約Ｐｒｏ−１１０のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および約Ｓｅｒ−１２０〜約Ｉｌｅ１４５のアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリぺプチドフラグメントは、上記の図３に示すように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によりＣＫα−５タンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定されている。
【０１１５】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段により産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｒ．Ａ．ら（１９８５）「Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５；この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。
【０１１６】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリぺプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２５４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、全体としてのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質のその部分）は、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（前出）を参照のこと。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープ（すなわち、「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的なリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ＭｉｘｔｕｒｅｓのＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９９６）らの米国特許第５，４８０，９７１号は、直線状のＣ１〜Ｃ７アルキルペルアルキル化オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを、目的のアクセプター分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。
【０１１７】
（融合タンパク質）
当業者が理解するように、本発明のＣＫα−５ポリペプチドおよびその上記のエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と組み合わせられ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ＣＫα−５タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５）。
【０１１８】
（抗体）
本発明における使用のためのＣＫα−５タンパク質特異的抗体は、インタクトなＣＫα−５タンパク質またはその抗原性ポリぺプチドフラグメントに対して惹起され得、これは、アルブミンのようなキャリアタンパク質とともに、またはそれが十分に長ければ（少なくとも約２５アミノ酸）、キャリアなしに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得る。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、インタクトな分子、ならびにＣＫα−５タンパク質に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠失し、循環からより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体のより非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１２０】
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ＣＫα−５タンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法において、ＣＫα−５タンパク質の調製物が、天然の夾雑物を実質的に含まないようにするために調製および精製される。次いで、このような調製物は、より比活性の大きいポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
【０１２１】
最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそのＣＫα−５タンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１）、５６３〜６８１頁）。一般に、このような手順は、ＣＫα−５タンパク質抗原またはより好ましくはＣＫα−５タンパク質発現細胞を使用した、動物（好ましくはマウス）の免疫を含む。適切な細胞は、抗ＣＫα−５タンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得る；しかし、１０％胎児ウシ血清（約５６℃で非働化）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅの改変Ｅａｇｌｅ培地において細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株と融合する。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って利用され得る；しかし、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を利用することが好ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））に記載されるように、限界希釈によってクローン化する。次いで、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞を、ＣＫα−５タンパク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。
【０１２２】
あるいは、ＣＫα−５タンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体の使用を介して２工程手順において産生し得る。このような方法は、抗体がそれ自身抗原であり、そしてそれゆえ第２の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、ＣＫα−５タンパク質特異的抗体を、動物（好ましくはマウス）を免疫するために使用する。次いで、このような動物の脾細胞を、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用し、そしてそのハイブリドーマ細胞を、ＣＫα−５タンパク質特異的抗体に結合する抗体能力がＣＫα−５タンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングする。このような抗体は、ＣＫα−５タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＣＫα−５タンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用し得る。
【０１２３】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このようなフラグメントを、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために）のような酵素を用いる、タンパク質分解的切断によって生成する。あるいは、ＣＫα−５タンパク質結合フラグメントを、組換えＤＮＡ技術を適用することによって、または合成化学によって産生し得る。
【０１２４】
ヒトにおける抗ＣＫα−５のインビボでの使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。総説について、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０１２５】
（免疫系関連障害）
（診断）
本発明者らは、ＣＫα−５が、好中球および単球において発現されることを発見した。多くの免疫系関連障害について、「標準」ＣＫα−５遺伝子発現レベル、すなわち免疫系障害を有さない個体からの免疫系組織または体液におけるＣＫα−５発現レベルと比較して、実質的に変化した（増大または減少した）レベルのＣＫα−５遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取した免疫系組織または他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において、検出され得る。従って、本発明は、免疫系障害の診断の間に有用である診断方法を提供し、この方法は、個体からの免疫系組織または他の細胞または体液において、ＣＫα−５タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および測定された遺伝子発現レベルを標準的なＣＫα−５遺伝子発現レベルと比較する工程であって、それにより標準と比較した遺伝子発現レベルの増大または減少が、免疫系障害の指標である、工程を包含する。
【０１２６】
特に、ガン（特に、骨肉種）を有する哺乳動物における特定の組織が、対応する「標準」レベルと比較した場合に、有意に変化したレベルのＣＫα−５タンパク質およびＣＫα−５タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現すると考えられる。さらに、変化されたレベルのＣＫα−５タンパク質は、ガンを有さない同一の種の哺乳動物からの血清と比較した場合、このようなガンを有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）において、検出され得ると考えられている。
【０１２７】
従って、本発明は、免疫系障害（骨格系および免疫系のガンを含む）の診断の間に有用である診断方法を提供し、この方法は、個体由来の免疫系組織もしくは骨格系組織または他の細胞または体液においてＣＫα−５タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、およびその測定された遺伝子発現レベルを標準的なＣＫα−５遺伝子発現レべルと比較する工程であって、それにより標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増大または減少が、免疫系障害の指標である、工程、を包含する。
【０１２８】
腫瘍の診断を含む、免疫系における障害の診断が、従来の方法に従ってすでに行われている場合、本発明は、予後指標として有用であり、これにより、増強または抑制されたＣＫα−５遺伝子発現を示す患者が、標準的なレベルにより近いレベルで遺伝子を発現する患者に比較して、より悪い臨床的結果を経験する。
【０１２９】
「ＣＫα−５タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」により、第一の生物学的サンプルにおいて、ＣＫα−５タンパク質のレベルまたはＣＫα−５タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的に（例えば、絶対的タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または概算することによって）、あるいは相対的に（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較することによって）、定性的または定量的に測定するかまたは概算することを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または概算され、そして標準的なＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較される。この標準は、障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから採取されるか、または免疫系の障害を有さない個体の集団からのレベルを平均化することによって決定される。当該分野で理解されるように、一旦標準的なＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが知られると、それは比較のための標準として反復して使用され得る。
【０１３０】
「生物学的サンプル」により、個体から得られる任意の生物学的サンプル、体液、細胞株、組織培養物、またはＣＫα−５タンパク質もしくはｍＲＮＡを含有する他の供給源が意図される。示されるように、生物学的サンプルは、遊離のＣＫα−５タンパク質を含有する体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）、免疫系組織、骨格系組織および全長成熟ＣＫα−５またはＣＫα−５レセプターを発現することが見出されている他の組織供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含むべきである場合には、組織生検が好ましい供給源である。
【０１３１】
本発明は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の免疫系関連障害の診断または処置のために有用である。このような障害には、腫瘍、ガン、肉腫（例えば、骨肉種）、間隙性肺疾患（例えば、ランゲルハンス細胞肉芽腫症）、および免疫細胞機能の任意の調節障害（自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、免疫、体液性免疫、炎症性腸疾患、骨髄抑制などが含まれるがこれらに限定されない）が含まれる。
【０１３２】
細胞総ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９（１９８７））に記載される一工程グアニジン−チオシアネート−フェノールクロロホルム法のような任意の適切な技術を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ＣＫα−５タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を使用してアッセイされる。これらには、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が含まれる。
【０１３３】
生物学的サンプルにおけるＣＫα−５タンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく技術を用いて行い得る。例えば、組織でのＣＫα−５タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５（１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６（１９８７））。ＣＫα−５タンパク質遺伝子発現を検出するために有用なその他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射イムノアッセイ（ＲＩＡ））を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、そしてグルコースオキシダーゼのような酵素標識、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０１３４】
個体から得た生物学的サンプルにおいてＣＫα−５タンパク質レベルをアッセイするのに加えて、ＣＫα−５タンパク質はまた、画像化によってインビボで検出され得る。ＣＫα−５タンパク質のインビボ画像化のための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法について、適切な標識には、検出可能な放射線を放射するが、被験体には明白に有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーには、関連するハイブリドーマの栄養素を標識することによって抗体中に取り込まれ得る、検出可能特徴を有するスピンを有するもの（例えば、重水素）が含まれる。
【０１３５】
放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像化部分で標識したＣＫα−５タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、免疫系障害について検査される哺乳動物中に導入される（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）。被験体のサイズおよび使用される画像化系が、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量を決定することが当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は、通常、99mＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、ＣＫα−５タンパク質を含有する細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」に記載されている（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ 第１３章、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （１９８２））。
【０１３６】
（処置）
上記のように、ＣＫα−５ポリヌクレオチドおよびポリぺプチドは、ＣＫα−５活性の異常に高いかまたは低い発現を伴う状態の診断に有用である。ＣＫα−５が発現される細胞および組織ならびにＣＫα−５によって調節された活性が与えられれば、標準的なすなわち「正常な」レベルに比較して、個体における実質的に変化した（増大または減少した）レベルのＣＫα−５の発現は、ＣＫα−５が発現され、および／または活性である身体の系に関連する病理的状態を生じることが容易に明らかである。
【０１３７】
本発明のＣＫα−５タンパク質は、ケモカインファミリーのメンバーであるので、このタンパク質の成熟分泌形態は、タンパク質分解によってＣＫα−５を発現する細胞から可溶性形態で放出され得ることもまた、当業者に理解される。従って、ＣＫα−５が外因性供給源から、個体の細胞、組織または身体に添加される場合、そのタンパク質は、その個体の標的細胞においてその生理的活性を発揮する。また、この膜貫通タンパク質を発現する細胞は、個体の細胞、組織または身体に添加され得、そしてこれらの添加された細胞は、ＣＫα−５に対するレセプターを発現する細胞に結合し、それによってＣＫα−５を発現する細胞は、レセプターを有する標的細胞に対して作用（例えば、細胞刺激）を生じ得る。
【０１３８】
それゆえ、個体における標準的または正常なレベルのＣＫα−５活性における減少によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ＣＫα−５ポリぺプチドを、可溶性細胞外ドメインの形態、または完全タンパク質を発現する細胞の形態で投与することによって処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、増大したレベルのＣＫα−５活性を必要とする個体の処置の方法を提供し、この方法は、このような個体に、このような個体においてＣＫα−５活性レベルを増大させるのに有効な量の本発明の単離されたＣＫα−５ポリぺプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０１３９】
ＣＫα−５は、ＥＬＲモチーフを欠いているので、ＣＫα−５はまた、新脈管形成因子ではなく脈管形成停止（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）因子でもあるはずである。さらに、ＣＫα−５は、内皮細胞機能を阻害するので、広範な抗炎症活性を有する。ＣＫα−５は、抗新血管形成因子として使用されて、宿主防禦細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ）の侵襲および活性化を刺激すること、および腫瘍の脈管形成を阻害することによって固形腫瘍を処置し得る。当業者は、血管増殖が所望されない他の非ガン状態を認識する。また、それらを使用して、殺菌性白血球の誘引および活性化を介して、耐性の慢性感染および急性感染（例えば、ミコバクテリア（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）感染）に対する宿主防禦を増強し得る。ＣＫα−５をまた使用して、ＩＬ−２生合成の阻害によって、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患およびリンパ球白血病の処置のために、Ｔ細胞増殖を阻害し得る。ＣＫα−５をまた使用して、細胞砕片の除去および結合組織促進炎症性細胞の補充を介して、ならびに過剰なＴＧＦ媒介線維症のその制御を介しての両方で、創傷治癒を刺激し得る。これと同様に、ＣＫα−５をまた使用して、肝硬変、変形性関節症、および肺線維症を含む他の線維性障害を処置し得る。ＣＫα−５は、住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症の際に組織に侵入する寄生生物の幼虫を殺傷する顕著な機能を有する好酸球の存在を増加する。また、これを使用して、例えば、種々の造血性前駆細胞の活性化および分化を調節して、化学療法（すなわち、幹細胞動員）後に骨髄から成熟白血球を放出させることによって、造血を調節し得る。また、ＣＫα−５を使用して、敗血症を処置し得る。また、ＥＬＲモチーフを含む特定の変異体を作製することによって、ＣＫα−５−ＥＬＲは、新脈管形成が利益がある（すなわち、創傷治癒、創傷もしくは疾患からの損傷四肢の再血管生成、当業者に公知の他のものを促進する）場合に、疾患状態の全てを処置するために有用である。
【０１４０】
（処方物）
ＣＫα−５ポリペプチド組成物は良好な医療行為に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（特に、ＣＫα−５ポリペプチド単独での処置の副作用）、ＣＫα−５ポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。従って、本明細書における目的のためのＣＫα−５ポリペプチドの「有効量」は、このような考慮事項によって決定される。
【０１４１】
一般的な提案として、１用量あたりに非経口的に投与されるＣＫα−５ポリペプチドの薬学的に有効な総量は、患者の体重あたり約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療上の裁量を受ける。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そしてヒトについて最も好ましくは、このホルモンについて約０．０１と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与される場合、ＣＫα−５ポリペプチドは、代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射によって、または、例えば、ミニポンプを使用する継続的皮下注入によってのいずれかで投与される。静脈内点滴用バッグ溶液もまた使用され得る。変化を観察するに必要な処置の長さ、および応答が生じるための処置の後の間隔は、所望の効果に応じて変動するようである。
【０１４２】
本発明のＣＫα−５を含有する薬学的組成物は、経口、直腸内、非経口、槽内、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、液滴、または経皮パッチによるような）、口腔に（ｂｕｃａｌｌｙ）、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意の型の処方補助剤を意味する。本明細書で使用される場合、用語「非経口（的）」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、皮下、および関節内の注射および注入を包含する、投与様式をいう。
【０１４３】
ＣＫα−５ポリペプチドもまた、徐放系によって適切に投与される。徐放性組成物の適切な例は、成型製品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態における半透過性のポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ、Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、前出）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を含む。徐放性ＣＫα−５ポリペプチド組成物はまた、リポソームに捕捉されたＣＫα−５ポリペプチドを含む。ＣＫα−５ポリペプチドを含むリポソームは、それ自体が公知の方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号、および同４，５４４，５４５号；およびＥＰ１０２，３２４を参照のこと。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型であり、ここで脂質含有率は、約３０モル％コレステロールより多く、選択された部分は、最適なＣＫα−５ポリペプチド治療について調整される。
【０１４４】
非経口投与について、１つの実施態様において、ＣＫα−５ポリペプチドは、一般には、所望の程度の純度で、このポリペプチドを単位用量注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによって処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤およびポリペプチドにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【０１４５】
一般に、処方物は、ＣＫα−５ポリペプチドを、液体キャリアまたは細かく粉砕した固体キャリアまたは両方と、均一にかつしっかりと接触させることによって調製される。次いで、必要である場合、産物は、所望の処方物へと成型される。好ましくは、キャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液を含む。非水性ビヒクル（例えば、不揮発油およびオレイン酸エチル）もまた、本明細書において、リポソームと同様に有用である。
【０１４６】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰＥＧを含む。
【０１４７】
ＣＫα−５ポリペプチドは、代表的に、このようなビヒクル中で約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ約３〜８で処方される。上記の特定の賦形剤、キャリア、または安定化剤の使用は、ＣＫα−５ポリペプチド塩の形成をもたらすことが理解される。
【０１４８】
治療的な投与について使用されるＣＫα−５ポリペプチドは、滅菌されなければならない。滅菌性は、滅菌濾過メンブレン（例えば、０．２ミクロンメンブレン）を通しての濾過により容易に達成される。治療的ＣＫα−５ポリペプチド組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアルへ配置される。
【０１４９】
ＣＫα−５ポリペプチドは、通常、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌバイアルに、５ｍｌの滅菌濾過１％（ｗ／ｖ）水性ＣＫα−５ポリペプチド溶液を満たし、そして得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液を、静菌注射用水を用いて凍結乾燥したＣＫΑ−５ポリペプチドを再構成することによって調製する。
【０１５０】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分を満たした１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的産物または生物学的産物の製造、使用または販売を規制する政府当局によって規定される形式の通知が、このような容器にともなう。この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物とともに使用され得る。
【０１５１】
（アゴニストおよびアンタゴニスト − アッセイおよび分子）
本発明はまた、レセプター分子のようなＣＫα−５結合分子との相互作用のような、細胞に対するＣＫα−５の作用を増強またはブロックする化合物を同定する化合物のスクリーニング方法を提供する。アゴニストは、ＣＫα−５の天然の生物学的機能を増強させるか、またはＣＫα−５と類似する様式で機能する化合物であり、他方、アンタゴニストは、このような機能を減少または消去する。
【０１５２】
この実施態様の別の局面において、本発明は、ＣＫα−５ポリペプチドに特異的に結合するレセプタータンパク質または他のリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提供する。例えば、細胞区画（例えば、メンブレンまたはその調製物）は、ＣＫα−５を結合する分子を発現する細胞から調製され得る。調製物は、標識されたＣＫΑ−５とインキュベートされる。ＣＫΑ−５がレセプターもしくは他の結合タンパク質に結合した複合体は、当該分野で公知の慣用方法に従って単離および特徴づけされる。あるいは、ＣＫΑ−５ポリペプチドは、固体支持体に結合され得、その結果、細胞から可溶化された結合分子は、カラムに結合し、次いで溶出され、そして慣用方法に従って特徴づけされる。
【０１５３】
アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞区画（例えば、メンブレンまたはその調製物）は、ＣＫα−５を結合する分子（例えば、ＣＫα−５によって調節されるシグナル経路または調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。調製物は、ＣＫα−５アゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在または存在下で標識されたＣＫα−５とインキュベートされる。候補物質が結合分子を結合する能力は、標識されたリガンドの結合の減少を反映する。無償に、すなわちＣＫα−５結合分子との結合に対するＣＫα−５の効果を誘導することなく、結合する分子が、おそらく良好なアンタゴニストである。良好に結合し、そしてＣＫα−５と同一または密接に関連する効果を惹起する分子はアゴニストである。
【０１５４】
可能性のあるアゴニストおよびアンタゴニストのＣＫα−５様の効果は、例えば、細胞または適切な細胞調製物と候補分子との相互作用後にセカンドメッセンジャー系の活性を決定すること、およびＣＫα−５またはＣＫα−５と同一の効果を惹起する分子と効果を比較することによって測定され得る。この点に関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系は、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解物セカンドメッセンジャー系を含むがこれらに限定されない。
【０１５５】
ＣＫα−５アンタゴニストについてのアッセイの別の例は、ＣＫα−５および可能性のあるアンタゴニストと、メンブレン結合ＣＫα−５レセプター分子または組換えＣＫα−５レセプター分子とを、競合阻害アッセイについて適切な条件下で合わせる競合アッセイである。ＣＫα−５は、レセプター分子に結合したＣＫα−５分子の数を正確に決定して可能性のあるアンタゴニストの有効性を評価し得るように、例えば、放射能で標識され得る。
【０１５６】
可能性のあるアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、それによってその活性を阻害するかまたは消去する、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体を含む。可能性のあるアンタゴニストはまた、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド（例えば、結合分子（例えば、レセプター分子）上の同一の部位にＣＫα−５誘導性活性を誘導せずに結合し、それによりＣＫα−５が結合することを排除することによってＣＫα−５の作用を妨害する、密接に関連するタンパク質または抗体）であり得る。
【０１５７】
他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術を用いて、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して、あるいは三重らせん形成を介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば以下において考察される：Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８）。三重らせん形成は、例えば以下においてに考察される：Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）。この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計し、それにより、転写およびＣＫα−５の産生を妨害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＣＫα−５ポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されてＣＫα−５タンパク質の産生を阻害するように細胞へと送達され得る。
【０１５８】
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば上記のような薬学的に受容可能なキャリアとの組成物において使用され得る。
【０１５９】
アンタゴニストは、例えば、特定の自己免疫性および慢性炎症性および感染性疾患における、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）の走化性および活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症、およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニストはまた、単核食細胞の補充および活性化を防ぐことによる、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症を含む感染性疾患の処置に使用され得る。アンタゴニストはまた、好酸球産生および移動を妨げることによって、特発性好酸球増多症候群を処置するために使用され得る。エンドトキシンショックもまた、アンタゴニストによって、マクロファージの移動および本発明のヒトケモカインポリペプチドの産生を妨害することにより処置され得る。このアンタゴニストはまた、動脈壁において単球侵襲を妨害することによってアテローム性硬化症を処置するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、ヒスタミン媒介アレルギー反応および後期アレルギー反応、慢性蕁麻疹、およびアトピー性皮膚炎を含む免疫学的障害を、ケモカイン誘導マスト細胞および好塩基球分解およびヒスタミンの放出を阻害することによって処置するために用いられ得る。ＩｇＥ媒介性アレルギー反応（例えば、アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹）もまた処置され得る。また、アンタゴニストを使用して、創傷領域への単球の誘引を妨害することによって慢性炎症および急性炎症を処置し得る。また、アンタゴニストを使用して、正常な肺マクロファージ集団を調節し得る。なぜなら、慢性炎症性肺疾患および急性炎症性肺疾患は、肺における単核食細胞の分離と関連するからである。また、アンタゴニストを使用して、患者の関節における滑液への単球の誘引を妨害することによって慢性関節リウマチを処置し得る。単球流入および活性は、変性関節症および炎症性関節症の両方の病原において重要な役割を果たしている。このアンタゴニストを使用して、ＩＬ−１およびＴＮＦへ主に寄与する有害なカスケードを妨害し得る。これは、他の炎症性ケモカインの生合成を予防する。このようにして、このアンタゴニストを使用して炎症を予防し得る。また、このアンタゴニストを使用して、ケモカインによって誘発されるプロスタグランジン非依存性の発熱を阻害し得る。また、このアンタゴニストを使用して、骨髄不全（例えば、再生不良性貧血および骨髄形成異常症候群）の症例を処置し得る。また、このアンタゴニストを使用して、肺における好酸球蓄積を妨げることによって喘息およびアレルギーを処置し得る。また、このアンタゴニストを使用して、喘息肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置し得る。ＣＫα−５に対する抗体を使用して、ＣＫα−５活性に結合しそして阻害して、損傷後に肺への好中球の侵襲を予防することによって、ＡＲＤＳを処置し得る。上記のアンタゴニストのいずれかを、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書以下に記載されるようなもの）との組成物中で使用され得る。
【０１６０】
（遺伝子マッピング）
本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズし得る。さらに、染色体における特定の部位を同定することへの必要性が現在存在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色体位置をマークするのにはほどんと利用可能ではない。本発明に従う染色体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づけることにおいて重要な第一段階である。
【０１６１】
この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中で開示されるｃＤＮＡは、ＣＫα−５タンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするために用いられる。これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびライブラリーを用いて達成され得る。次いで、この目的のための周知の技術を用いて、インサイチュ染色体マッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。
【０１６２】
さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおいて１より多いエキソンにまたがらず、従って、増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、一工程で、正確な染色体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤＮＡ由来のプローブと共に用いられ得る。（この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。
【０１６３】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
【０１６４】
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原因因子である可能性が高い。
【０１６５】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定として意図されない。
【０１６６】
（実施例）
（実施例１（ａ）：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」ＣＫα−５の発現および精製）
細菌性発現ベクターｐＱＥ６０を、本実施例において、細菌性発現のために使用する（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）。ｐＱＥ６０はアンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，前出から市販されているニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合した６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するそのポリペプチドを発現するように、配置される。
【０１６７】
疎水性リーダー配列および膜貫通ドメインを欠くＣＫα−５タンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ＣＫα−５タンパク質の所望の部分のアミノ末端配列およびｃＤＮＡコード配列の３’に対する寄託された構築物における配列にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅する。ｐＱＥ６０ベクターにおけるクローニングを容易にするために制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’配列に加える。
【０１６８】
成熟タンパク質をクローニングするために、５’プライマーは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位を含む、配列５’ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣ３’（配列番号１５）を有する。当業者は、当然ながら、タンパク質コード配列における５’プライマーが開始する点が、タンパク質の成熟形態よりもより短いかまたはより長い完全ＣＫα−５タンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するよう変化させ得ることを認識する。３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む、配列５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣ３’（配列番号１６）を有する。
【０１６９】
増幅されたＣＫα−５ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化したＤＮＡを互いに連結する。ＣＫα−５ ＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターから下流の、および開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジンコドンにインフレームのＣＫα−５タンパク質コード配列を配置する。
【０１７０】
あるいは、好ましい細菌発現ベクターである、アンピシリン耐性遺伝子を含む「ｐＨＥ４−５」をこの実施例において使用し得る。ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３ベクタープラスミドＤＮＡは、独特の制限酵素部位ＮｄｅＩとＡｓｐ７１８との間の充填インサートを含み、そして、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１ Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｅｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に、１９９７年９月３０日に寄託し、そして受託番号２０９３１１を付与された。本明細書中で記載されたＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８についての制限酵素部位をそれぞれのプライマーにおいてＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに置換した５’プライマーおよび３’プライマーを使用して、ｐＨＥ４−５へサブクローニングするためのＤＮＡフラグメントをコードする適切なＣＫα−５を増幅し得る。ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３におけるスタッファーＤＮＡインサートは、ＣＫα−５フラグメントのｐＨＥ４−５への連結の前に除去されるべきである。ｐＨＥ４−５は、ほとんどの異種タンパク質の高収量を可能にする強力な細菌プロモーターを含む。
【０１７１】
連結混合液を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）に記載のような標準的な手順を使用してコンピテントなＥ． ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミドｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性を付与する（「Ｋａｎｒ」））の多コピーを含むＥ． ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書に記載される例示的な実施例を実行するために使用する。ＣＫα−５タンパク質を発現するのに適切な多くの内の１つにすぎないこの株は、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，前出から市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で生育するそれらの能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、そしてクローン化されたＤＮＡの同一性を、制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０１７２】
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地における液体培養物中で一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて約１：２５〜１：２５０の希釈率で大規模培養物に接種した。細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）にまで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加して１ｍＭの最終濃度にし、ｌａｃＩリプレッサーを不活化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３時間から４時間の間引き続きインキュベートする。次いで細胞を遠心分離により採集する。
【０１７３】
次いで細胞を３〜４時間４℃にて、６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８中で撹拌する。細胞細片を遠心分離によって除去し、そしてＣＫα−５を含む上清を、ニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＵＩＡＧＥＮ， ＩＮＣ．，前出から入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高いアフィニティーで結合し、そして簡単な一工程の手順で精製され得る（詳細には、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ， １９９５， ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出を参照のこと）。簡潔には、上清を６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８中でカラムにロードし、カラムを最初に１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８で洗浄し、次いで１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ６で洗浄し、そして最後にＣＫα−５を６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ５で溶出させる。
【０１７４】
次いで精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ Ｎａ−酢酸、ｐＨ ６緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することによって再生させる。あるいは、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に固定されている間に首尾よく再折り畳みし得る。推奨される条件は、以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ７．４中での直線状６Ｍ−１Ｍ尿素グラジエントを用いる再生。再生を１．５時間以上の時間にわたって行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ６緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析工程によって除去する。精製したタンパク質を４℃に保存するか、または−８０℃にて凍結させる。
【０１７５】
以下の代替的な方法は、それが封入体の形態で存在する場合の、Ｅ． ｃｏｌｉにおいて発現されたＣＫα−５を精製するために使用され得る。他に特定されない限り、すべての以下の工程は４〜１０℃で行われる。
【０１７６】
Ｅ． ｃｏｌｉ発酵の生産相の完了に際して、細胞培養物を、４〜１０℃に冷却し、そして細胞を１５，０００ｒｐｍにおける連続的な遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）によって収穫する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予測される収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁液に分散させる。
【０１７７】
次いで、ミクロフルーダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｃｏｒｐ．
またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ， Ｉｎｃ．）に溶液を通過させる（４０００〜６０００ｐｓｉ、２回）ことにより、細胞を溶解させる。次いでホモジネートを、ＮａＣｌ溶液と混合して最終濃度０．５ Ｍ ＮａＣｌにし、その後７０００×ｇで１５分間遠心分離する。生ずるペレットを、再度０．５ Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を用いて洗浄する。
【０１７８】
得られる洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間遠心分離後、ペレットを捨て去り、そしてＣＫα−５ポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートし、さらなるＧｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０１７９】
不溶性粒子を取り除くための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）の後、ＧｕＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と２０容量の５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ ４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液を、激しく撹拌しながら迅速に混合することによって、再折り畳みさせる。再折り畳みした希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合することなく４℃に保つ。
【０１８０】
再折り畳みしたＣＫα−５ポリペプチド溶液を清澄化するために、あらかじめ準備した、適切な表面領域に０．１６μｍメンブレンフィルターを備える、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した接線流濾過ユニット装置（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過した試料を、陽イオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にロードする。カラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０、で洗浄し、そして同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液中の２８０ｎｍにおける吸光度を、連続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０１８１】
次いで、ＣＫα−５ポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次いで希釈した試料を、あらかじめ準備した強陰イオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のカラムおよび弱陰イオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のカラムの直列のセットにロードする。カラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いで
ＣＭ−２０カラムを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０〜１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．５の範囲の１０カラム容量の直線状勾配を用いて溶出する。溶出液の一定のＡ280モニタリング下で画分を回収する。次にＣＫα−５ポリペプチドを含む画分（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する）をプールする。
【０１８２】
得られるＣＫα−５ポリペプチドは、上記の再折り畳みおよび精製工程後に９５％より高い純度を示す。５μｇの精製タンパク質をロードする場合に、クマシーブルー染色１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで主要な混在バンドは観察されない。精製したタンパク質は、エンドトキシン／ＬＰＳ混入についてまた試験され、そして代表的にはＬＰＳ含量は、ＬＡＬアッセイに従って０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０１８３】
（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＣＫα−５タンパク質のクローニングおよび発現）
この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を用いて、その天然に付随する分泌シグナル（リーダー）配列を含む、完全タンパク質をコードするクローニングされたＤＮＡを、成熟ＣＫΑ−５タンパク質を発現するためにバキュロウイルスに、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第１５５５号（１９８７）に記載のような標準的な方法を用いて挿入する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８のような都合良い制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミドは、同じ方向で、弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子には、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列が両側に隣接して、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを産生する。
【０１８４】
当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要ならば、シグナルペプチドおよびインフレームＡＵＧを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクターを、上記のベクターの代わりに用い得る（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９（１９８９）に記載される。
【０１８５】
寄託されたクローン中に、全長ＣＫα−５タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（ＡＵＧ開始コドン、および配列番号２に示される天然に付随するリーダー配列を含む）を、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるような真核生物細胞において翻訳の開始のための効率的なシグナルをむ、配列５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＧＣＧＧ３’（配列番号１７）を有する。３’プライマーは、下線を付したＸｂａＩ制限部位を含む、配列５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧＧ３’（配列番号１８）を有する。当業者は、他のプライマーを使用してより短いポリペプチドをコードする核酸フラグメントを生成し得ることを認識する。例えば、上記の５’プライマー（配列番号１９）と、以下の３’プライマーとともに使用して、可溶性細胞外ドメインをコードする核酸フラグメントを増幅し得る：
５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣ３’（配列番号１９）。３’プライマーは下線を付したＸｂａＩ部位を含む。
【０１８６】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いて、１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、再度１％アガロースゲル上で精製する。
【０１８７】
このプラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして必要に応じて、当該分野で公知の慣用技術を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いて１％アガロースゲルから単離する。
【０１８８】
フラグメントおよび脱リン酸化プラスミドを一緒に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合物で形質転換し、そして培養プレートに塗布する。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化すること、次いでゲル電気泳動による消化産物の分析によってヒトＣＫα−５遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローニングされたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中で、ｐＡ２ＧＰＣＫα−５と称する。
【０１８９】
５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰＣＫα−５を、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）によって記載されたリポフェクション法を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰＣＫα−５を、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートする。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで培養を、２７℃で４日間継続する。
【０１９０】
４日後、上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出に記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いて、青色染色されたプラークを生じるｇａｌ発現クローンの簡素な同定および単離を可能にする。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーション後、青色染色されたプラークをマイクロピペッター（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を用いて、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染させる。例えば制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０１９１】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ
Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０１９２】
（実施例４：ＣＫα−５ ｍＲＮＡ発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を、とりわけ上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される方法を用いて行って、ヒト組織におけるＣＫα−５遺伝子発現の調査を実施する。ＣＫα−５タンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って使用して32Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って使用して精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をＣＫα−５ ｍＲＮＡについて調べる。
【０１９３】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含むＭｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って使用し標識化プローブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝し、そして標準的な手順に従って、フィルムを現像する。
【０１９４】
本発明は前述の詳細な説明および実施例に特に記載されたものとは他の方法で実施され得ることが明らかである。本発明の多数の改変および変更は、上述の教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。
【０１９５】
本明細書中に引用した全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌論文、実験室マニュアル、本、または他の文書を含む）の全ての開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０１９６】
さらに、本明細書とともに提出したハードコピーおよびその電子的形態での配列表は、両方とも本明細書において参考として援用される。
マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
【０１９７】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３８−４４７（１９８５））およびＣＭＶエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化シグナル、および終結シグナルを含む。
【０１９８】
（実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現）
発現プラスミドｐＣＫα−５ＨＡを、ＣＫα−５タンパク質の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡの一部を発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．から入手し得る）へクローニングすることによって作製する。
【０１９９】
発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細胞における増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡが都合良くＣＭＶプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得るように配置された、赤血球凝集素フラグメントをコードするいくつかのコドン（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）に続く終止コドンおよびポリアデニル化シグナル。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いた、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。ｐｃＤＮＡＩＩＩはさらに、選択可能なネオマイシンマーカーを含む。
【０２００】
ＣＫα−５ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを、組換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによって指向されるように、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。プラスミド構築戦略は、以下のとおりである。寄託されたクローンのＣＫα−５ ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＫα−５発現のためのベクターの構築について先に記載されるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。適切なプライマーは、以下の本実施例に使用されたプライマーを含む。５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ部位、コザック配列、およびＡＵＧ開始コドンを含み、以下の配列を有する：配列５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＧＣＧＧ３’（配列番号１７）を有する。３’プライマーは、下線を付したＸｂａＩを含み、以下の配列５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧＧ３’（配列番号１９）を有する。
【０２０１】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで連結する。連結混合物で、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、そして形質転換培養物を、アンピシリン培地プレートへプレーティングし、次いで、インキュベートしてアンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするフラグメントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。
【０２０２】
組換えＣＫα−５の発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載のようにＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを用いて、上記のように発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるＣＫα−５の発現のための条件下でインキュベートする。
【０２０３】
ＣＫα−５−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、35Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細胞および培地を採取し、そして細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎら（上記に引用される）に記載されるように界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５で溶解する。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては見られない。
【０２０４】
（実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
本実施例において、ベクターｐＣ４を、ＣＫα−５ポリペプチドの発現のために使用する。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされているジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ． １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １０９７：１０７−１４３；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ． １９９１， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子と連鎖する場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれると、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。
【０２０５】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９８５：４３８−４４７）の長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位が存在する：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）もまた、発現のために使用され得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系および類似する系は、哺乳動物細胞において調節された方法でＣＫα−５ポリペプチドを発現するために使用され得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ． １９９２， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も、同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）との同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが、有利である。
【０２０６】
プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
【０２０７】
ＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を、遺伝子の所望の部分の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’プライマーおよび３’プライマーは、上記の実施例３（ａ）において使用されたものと同一である。
【０２０８】
増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼであるＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０２０９】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２１０】
（実施例４：ＣＫα−５ ｍＲＮＡ発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を、とりわけ上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される方法を用いて行って、ヒト組織におけるＣＫα−５遺伝子発現の調査を実施する。ＣＫα−５タンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って使用して32Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って使用して精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をＣＫα−５ ｍＲＮＡについて調べる。
【０２１１】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含むＭｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って使用し標識化プローブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝し、そして標準的な手順に従って、フィルムを現像する。
【０２１２】
本発明は前述の詳細な説明および実施例に特に記載されたものとは他の方法で実施され得ることが明らかである。本発明の多数の改変および変更は、上述の教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。
【０２１３】
本明細書中に引用した全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌論文、実験室マニュアル、本、または他の文書を含む）の全ての開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０２１４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、ＣＫα−５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約２７アミノ酸の推定リーダー配列に下線を付す。図１のリーダー配列の開始メチオニン残基は、位置番号＋１で示され、これに対し配列番号２の対応する配列中のリーダー位置は、負の位置番号で称されることに注意のこと。従って、図１のリーダー配列１〜２７位は、配列番号２の−２７〜−１位に対応する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｃは、ＣＫα−５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約２７アミノ酸の推定リーダー配列に下線を付す。図１のリーダー配列の開始メチオニン残基は、位置番号＋１で示され、これに対し配列番号２の対応する配列中のリーダー位置は、負の位置番号で称されることに注意のこと。従って、図１のリーダー配列１〜２７位は、配列番号２の−２７〜−１位に対応する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｃは、ＣＫα−５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約２７アミノ酸の推定リーダー配列に下線を付す。図１のリーダー配列の開始メチオニン残基は、位置番号＋１で示され、これに対し配列番号２の対応する配列中のリーダー位置は、負の位置番号で称されることに注意のこと。従って、図１のリーダー配列１〜２７位は、配列番号２の−２７〜−１位に対応する。
【図２】図２は、Ｂｅｓｔｆｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１１）によってデフォールトパラメーターを用いて決定した、ＣＫα−５タンパク質と、ＭＩＰ１−βに関するラットｍＲＮＡの翻訳産物（配列番号３）とのアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。
【図３】図３は、ＣＫα−５アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標、および表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」のグラフにおいて、正のピークは、ＣＫα−５タンパク質の高度に抗原性の領域（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域）の位置を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ケモカインファミリーのメンバーであるポリペプチドをコードする、新規のヒト遺伝子に関する。より詳細には、ケモカインα−５（本明細書において、以下「ＣＫα−５」という）と命名されたヒトポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。ＣＫα−５ポリペプチドはまた、それらを産生するためのベクター、宿主細胞および組換え方法と同様に提供される。免疫系に関連する障害を検出するための診断方法およびこのような障害を処置するための治療方法もまた提供される。本発明はさらに、ＣＫα−５活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
種々の細胞型の移動および「輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）」を制御する能力は、因子の部分集合、またはタンパク質（ケモカインがその例である）により制御される。
【０００３】
ケモカインは、インタークライン（ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅ）サイトカインとも呼ばれ、構造的かつ機能的に関連する化学走性サイトカインのサブファミリーである。これらの分子は、通常、サイズが８〜１０ｋｄであるが、より大きな膜結合ケモカインポリペプチドが同定されている。一般に、ケモカインは、アミノ酸レベルで２０％〜７５％の相同性を示し、そして２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存されたシステイン残基により特徴付けられる。最初の２つのシステイン残基の配列に基づき、ケモカインは２つのサブファミリー（αおよびβ）に分類されている。αサブファミリーにおいて、最初の２つのシステインは、１つのアミノ酸により分離されており、従って「Ｃ−Ｘ−Ｃ」サブファミリーと呼ばれる。βサブファミリーにおいて、この２つのシステインは、隣接する位置にあり、従って「Ｃ−Ｃ」サブファミリーと呼ばれる。これまでは、このファミリーの少なくとも１６の異なるメンバーが、ヒトにおいて同定されている。
【０００４】
インタークラインサイトカインは、広範な種類の機能を示す。顕著な特徴は、別個の細胞型（単球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球および繊維芽細胞を含む）の化学走性移動を導くというその能力である。多くのケモカインは、前炎症性活性を有し、そして炎症反応の間の多数の段階に関与する。これらの活性は以下を含む；ヒスタミン放出の刺激、リソソーム酵素放出およびロイコトリエン放出、内皮細胞への標的免疫細胞の付着増大、補体タンパク質の結合増強、顆粒球付着分子および補体レセプターの発現誘導、および呼吸バースト。炎症におけるケモカインの関連に加えて、特定のケモカインは他の活性を示すことが、示されてきた。例えば、マクロファージ炎症タンパク質１（ＭＩＰ−１）は造血幹細胞増殖を抑制し得、血小板第４因子（ＰＦ−４）は内皮細胞増殖の強力なインヒビターであり、インターロイキン８（ＩＬ−８）はケラチノサイトの増殖を促進し、そしてＧＲＯは黒色腫細胞に関するオートクライン増殖因子である。
【０００５】
種々の生物学的活性を考えると、ケモカインが多数の生理学的状態および疾患状態（リンパ球の輸送、創傷治癒、造血調節および免疫学的障害（例えば、アレルギー、喘息および関節炎）を含む）に関連していることは、驚くことではない。
【０００６】
「Ｃ−Ｃ」ブランチのメンバーは、以下の細胞に対してその効力を発揮する；寄生生物を破壊することにより、寄生生物感染を弱め、そして呼吸系の気道における慢性の炎症を引き起こす好酸球；脊椎動物における腫瘍形成を抑制するマクロファージ；およびアレルギー性炎症において役割を果たすヒスタミンを放出する好塩基球。しかし、１つのブランチのメンバーは、他のブランチのケモカインに通常応答性である細胞に対して効果を発揮し得るので、従って、これらブランチのメンバーに正確な役割を結び付け得ない。
【０００７】
Ｃ−Ｃブランチのメンバーが単核細胞に対して支配的に作用し、そしてＣ−Ｘ−Ｃブランチのメンバーが好中球に対して支配的に作用する一方、明確な化学誘引物質特性を、この指針に基いてケモカインに割り当て得ない。１つのファミリーからのいくつかのケモカインは、他のファミリーの特徴を示す。
【０００８】
本発明のポリペプチドは、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」領域の保存されたシステイン残基を有し、そして公知のケモカインに対してアミノ酸配列相同性を有する。
【０００９】
従って、別個の細胞型の移動の調節因子、あるいは機能不全および疾患におけるそれらの役割の調節因子として機能する、ポリペプチドについての必要性が存在する。なぜなら、そのような調節の撹乱は、止血、新脈管形成、腫瘍転移、細胞移動、および排卵、ならびに神経発生に関する障害に関与し得るからである。従って、そのような障害を、検出、予防、寛解または矯正することにおいて役割を担い得る、そのようなヒトポリペプチドを同定して、そして特徴付ける必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、配列番号２に示される完全アミノ酸配列、または１９９７年８月２９日にＡＴＣＣ受託番号２０９２３１としてプラスミドＤＮＡとして寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列、を有するＣＫα−５ポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０〜２２０９にある。寄託されたＣＫα−５クローンを配列決定することにより決定されるヌクレオチド配列（これは、図１（配列番号１）に示される）は、２５４アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド５４２〜５４４位のＮ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む）を含む。本発明の核酸分子は、配列番号２に示されるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列（これらの分子はまた、ＣＫα−５アミノ酸配列のＮ末端に融合されたさらなるアミノ酸をコードし得る）をコードする核酸分子を含む。
【００１１】
本発明のポリペプチドは、公知のケモカインに対するアミノ酸配列相同性を有し、これは配列番号２のアミノ末端由来の最初のシステインから始まるという、αサブファミリーのケモカインの保存されたＣ−Ｘ−Ｃシステインパターンの特徴を含む。
【００１２】
ＣＫα−５はまた、いくつかのαケモカインにおいて見出される、最初のシステイン残基の直前にあるＥＬＲモチーフを欠き、このモチーフは好中球および内皮細胞の化学走性活性、ならびにＩＬ−８の脈管形成活性のために必要であることが公知である。
【００１３】
コードされたポリペプチドは、図１において下線を付けた２７アミノ酸の推定リーダー配列を有し；そして推定成熟ＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列はまた、図１において、配列番号２におけるアミノ酸残基２８〜２５４およびアミノ酸残基１〜２２７として、示される。さらに、このポリペプチドは、図１の残基２８〜２０５由来の配列（配列番号２の１〜１７８）を有する細胞外ドメイン、図１の残基２０６〜２２７由来の配列（配列番号２の１７９〜２００）を有する膜貫通ドメイン、および図１の残基２２８〜２５４由来の配列（配列番号２の２０１〜２２７）を有する細胞内ドメインからなると推定される。
【００１４】
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：（ａ）図１（配列番号２）の完全なアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く図１（配列番号２）の完全アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２６位〜２２７位）を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）図１の２８位〜２５４位（配列番号２の１〜２２７）のアミノ酸配列を有する推定成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）図１の２８位〜２０５位（配列番号２の１〜１７８）のアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＮ末端メチオニンを除く、完全なアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＣＫα−５の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様には、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）の任意のヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）のポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）のアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によるＣＫα−５ポリペプチドまたはペプチドの産生のためにこれらを用いる方法に関する。
【００１７】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＣＫα−５ポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２に示される完全なアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なアミノ配列を有する、完全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２に示される完全アミノ配列（すなわち、配列番号２の−２６位〜２２７位）を有する完全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配列；（ｃ）残基１〜２２７として配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟ＣＫα−５のアミノ酸配列；および（ｄ）残基１〜１７８として配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＣＫα−５の細胞外ドメインのアミノ酸配列。本発明のポリペプチドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、そしてさらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００１８】
本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列を有する、ＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明のＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも６または７個、好ましくは少なくとも９個、そしてより好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸〜約５０個のアミノ酸を有する、このようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までおよびこれを含む任意の長さのエピトープ保有ポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に記載されるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。本発明はさらに、本明細書中に記載される通りのアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗体は、下記の通りに診断的または治療的に有用である。
【００２０】
本発明はまた、例えば、創傷治癒を刺激するため、固形腫瘍、微生物感染、自己免疫疾患、肝硬変、変形性関節症および肺線維症を処置するために用いられ得るＣＫα−５ポリペプチド、特にヒトＣＫα−５ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。ＣＫα−５ポリペプチドが必要な個体を処置する方法もまた提供される。
【００２１】
本発明はさらに、インビトロの細胞、エクスビボの細胞、およびインビボの細胞、または多細胞生物への投与のためのＣＫα−５ポリヌクレオチドまたはＣＫα−５ポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明のこの局面の特に好ましい特定の実施態様では、組成物は、疾患の処置のための、宿主生物におけるＣＫα−５ポリペプチドの発現のためのＣＫα−５ポリヌクレオチドを含む。これに関して特に好ましいのは、ＣＫα−５の異常な内在活性に関連する機能不全の処置のための、ヒト患者における発現である。
【００２２】
本発明はまた、ＣＫα−５ポリペプチドの生物学的活性を増強または阻害し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、ＣＫα−５ポリペプチドにより増強されるレセプターを、ＣＫα−５ポリペプチドの存在下で候補化合物と接触させる工程、候補化合物およびＣＫα−５ポリペプチドの存在下におけるこのレセプターを発現する細胞のカルシウム移動または化学走性活性をアッセイする工程、ならびにレセプター活性を標準レベルの活性と比較する工程（標準は、接触がレセプターとＣＫα−５ポリペプチドとの間で、候補化合物の非存在下で行なわれる場合にアッセイされる）を包含する。このアッセイでは、標準を超えるカルシウム移動および化学走性における増加は、候補化合物がＣＫα−５活性のアゴニストであることを示し、そして標準と比較したカルシウム移動および化学走性における減少は、化合物がＣＫα−５活性のアンタゴニストであることを示す。
【００２３】
ＣＫα−５が好中球においてだけではなく、単球、マクロファージ、肝臓、肺、精巣、小脳および松果体においてもまた発現することが見出されている。従って、本発明の核酸は、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の差示的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。さらに、上記の（特に、免疫系の）組織または細胞の多くの障害については、「標準」のＣＫα−５遺伝子発現レベル（すなわち、免疫系の障害を有さない個体からの健常組織におけるＣＫα−５発現レベル）に対して有意に高いかまたは低いレベルのＣＫα−５遺伝子発現は、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、ガン組織および創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、もしくは髄液）において検出され得る。従って、本発明は、このような障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）個体の細胞または体液におけるＣＫα−５遺伝子の発現レベルをアッセイする工程：（ｂ）ＣＫα−５遺伝子の発現レベルを、標準のＣＫα−５遺伝子の発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較して、アッセイされたＣＫα−５遺伝子の発現レベルの増加または減少は、免疫系における障害を示す、工程。
【００２４】
本発明のさらなる局面は、身体におけるＣＫα−５活性のレベルの増加が必要な個体を処置する方法に関する。この方法は、このような個体に、本発明の単離されたＣＫα−５ポリペプチドまたはそのアゴニストの治療有効量を含有する組成物を投与する工程を包含する。
【００２５】
本発明のなおさらなる局面は、身体におけるＣＫα−５活性のレベルの減少が必要な個体を処置するための方法に関する。この方法は、このような個体に、ＣＫα−５アンタゴニストの治療有効量を含有する組成物を投与する工程を包含する。本発明において使用するのに好ましいアンタゴニストは、ＣＫα−５特異的抗体である。
【００２６】
上記に加え、本発明は、以下を提供する：
（項目１）以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含有する単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２の残基−２７〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全長ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
（項目２）前記ポリヌクレオチドが、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３）前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の残基−２６〜２２７をコードする、配列番号１におけるヌクレオチド配列の部分を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の残基１〜１７８をコードする、配列番号１におけるヌクレオチド配列の部分を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目５）以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含有する単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２の残基ｎ〜１７８のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎは、−４〜１１の範囲の整数である、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基−４〜ｍのアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｍは、５５〜１７８の範囲の整数である、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の残基ｎ〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、ｎおよびｍは、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において規定される整数である、ヌクレオチド配列；
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全ＣＫα−５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該部分は、該完全アミノ酸配列のアミノ末端から２３〜約３８のアミノ酸を除く、ヌクレオチド配列；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全ＣＫα−５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該部分は、該完全アミノ酸配列のカルボキシ末端から２４〜約１７２のアミノ酸を除く、ヌクレオチド配列；および
（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全ＣＫα−５アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該部分は、上記（ｄ）および（ｅ）における任意のアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の組み合わせを含む、ヌクレオチド配列。
（項目６）前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目７）前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目８）前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチドを有する、項目１に記載のポリヌクレオチド。
（項目９）項目１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）におけるヌクレオチド配列と同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、ここでハイブリダイズする前記ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチド。
（項目１０）項目１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）におけるアミノ酸配列を有するＣＫα −５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目１１）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載の単離されたポリヌクレオチド；
（ａ）配列番号２のＴｙｒ−１２〜Ｓｅｒ−２４；
（ｂ）配列番号２のＣｙｓ−５５〜Ｖａｌ−６３；
（ｃ）配列番号２のＴｈｒ−９１〜Ｐｒｏ−１１０；および
（ｄ）配列番号２のＳｅｒ−１２０〜Ｉｌｅ−１４５。
（項目１２）項目１に記載の単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する工程を包含する、組換えベクターを生成するための方法。
（項目１３）項目１２に記載の方法によって生成される、組換えベクター。
（項目１４）項目１３に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、組換え宿主細胞を産生するための方法。
（項目１５）項目１４に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
（項目１６）ＣＫα−５ポリペプチドを生成するための組換え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で項目１５に記載の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。
（項目１７）以下からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたＣＫα−５ポリペプチド；
（ａ）配列番号２として示されるアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７として示されるアミノ酸、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７として示されるアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる成熟ＣＫα−５のアミノ酸配列；および
（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８として示されるアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列。
（項目１８）項目１０に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチド。
（項目１９）項目１８に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する、単離された抗体。
（項目２０）ＣＫα−５ポリペプチドを必要とする個体を処置する方法であって、該個体に対して項目１７に記載の単離されたポリペプチドを投与する工程を含む、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定して決定された、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された分子を提供する。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、２つのｃＤＮＡクローン：ＨＭＳＣＪ６２およびＨＮＦＥＭ０５を配列決定することにより得られた。ＨＭＳＣＪ６２は、図１に示される全長配列を含み、そしてＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，９４１０ Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５０に保管される。ＨＮＦＥＭ０５は、その最初の３６０ヌクレオチド（コード領域の全てを含む）を除いた全てを含み、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）受託番号２０９２３１（１９９７年８月２９日付）として寄託される。ＡＴＣＣは、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に位置する。
【００２８】
寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に含まれる。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、公知のケモカインに対するアミノ酸配列の相同性を有し、それは配列番号２におけるアミノ末端からの最初のシステインより始まる、ケモカインのαサブファミリーに特徴的な、保存されたＣ−Ｘ−Ｃシステインパターンを含む。本発明のＣＫα−５タンパク質はまた、図２に示されるようなＭＩＰ１−β（配列番号３）についてのヒトｍＲＮＡの翻訳産物を特に含む、他のケモカインと配列相同性を共有する。
【００３０】
αケモカインファミリーの公知のメンバーについて、大部分はＥＬＲモチーフを含み（例えば、ＩＬ−８、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ２、ＧＲＯ−α、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびＮＡＰ−２）、そして他はＥＬＲモチーフを欠失している（例えば、ＩＰ−１０、ＰＦ４およびＭＩＧ）。ＣＫα−５は、最初のシステイン残基に直ちに先行するＥＬＲモチーフを欠失している。このＥＬＲモチーフは、好中球および内皮細胞の化学走性活性、ならびにＩＬ−８の脈管形成活性に必要とされることが明らかに示された（Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：２７３４８−２７３５７（１９９５））。さらに、ＥＬＲ−Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、インビトロおよびインビボにおいて、脈管形成活性を有するが、その一方で、ＥＬＲモチーフを欠失しているＣ−Ｘ−Ｃケモカインは、実際には、脈管形成静止的（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）である（Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、前述；Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２：１５５−１６２（１９９５）；およびＫｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１７９８−１８０１（１９９２））。腫瘍の脈管形成におけるそのような因子の可能な役割の点については、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１４０９−１４１５（１９９４）は、気管支原生癌腫瘍において、その腫瘍細胞から産生されるようであるＩＬ−８のレベルの上昇を報告した。
【００３１】
（核酸分子）
他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡからのＭｏｄｅｌ ３７３）を使用して決定され、そして本明細書中で決定されるＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤差を含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプローチによってさらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。このような差異は、このような挿入または欠失の点にて始まる。
【００３２】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては対応するリボヌクレオチド（Ａ，Ｇ，ＣおよびＵ）の配列（ここで、特定したデオキシリボヌクレオチド配列中のそれぞれのチミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）により置換される）が、意図される。
【００３３】
本明細書中に提供した情報、例えば、図１（配列番号１）のヌクレオチド配列を使用して、ＣＫα−５ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準のクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡをクローン化する手順）を使用して入手され得る。本発明の実例として、図１（配列番号１）に記述される核酸分子は、主に免疫系組織由来のｃＤＮＡライブラリー中に発見された。クローンＨＭＳＣＪ６２は、単球のｃＤＮＡライブラリーから単離され、そしてＨＮＦＥＭ０５は、好中球ｃＤＮＡライブラリーから単離された。
【００３４】
同じ遺伝子のさらなるクローンもまた、以下のヒト組織：結腸および骨巨細胞腫由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された。
【００３５】
図１（配列番号１）のＣＫα−５ ｃＤＮＡの決定されたヌクレオチド配列は、２５４アミノ酸残基のタンパク質（開始コドンを伴う、図１（配列番号１）中のヌクレオチド配列のヌクレオチドの５４２〜５４４位）をコードするオープンリーディングフレームを含む。配列番号２中に示されるＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列は、ラットマクロファージ炎症性タンパク質−１β（図２）（登録番号ｇｉ｜４５９１４８で、ＧｅｎＢａｎｋにアクセスされ得る）と、約５１％類似および約２８％同一である。
【００３６】
当業者に理解されるように、上記の配列決定の誤差の可能性に起因して、委託されるｃＤＮＡによりコードされる実際の完全ＣＫα−５ポリペプチド（約２５４アミノ酸を含む）は、幾分より長く、またはより短くあり得る。より一般に、実際のオープンリーディングフレームは、図１（配列番号１）において示されるＮ末端のメチオニンコドンから推定されるアミノ酸の、±２０アミノ酸の範囲内、より好ましくは±１０アミノ酸の範囲内における任意のものであり得る。
【００３７】
（リーダー配列および成熟配列）
完全ＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるような、リーダー配列および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、ＣＫα−５タンパク質の成熟形態をコードする核酸分子を提供する。従って、シグナル仮説に従って、一旦、成長するタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る輸送が開始されると、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、シグナルまたは分泌リーダー配列を有し、これは完全ポリペプチドから切断されて、タンパク質の分泌される「成熟」形態を産生する。ほとんどの哺乳動物細胞、および昆虫細胞さえ、分泌されたタンパク質を同じ特異性で切断する。しかし、いくつかの場合において、分泌されたタンパク質の切断は、全体的に均一ではなく、タンパク質の２つ以上の成熟種を生じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は、究極的には、完全タンパク質の一次構造によって決定されること、すなわち、ポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが公知である。それゆえ、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１として同定されるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する、成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。「ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１におけるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチド」によって、寄託されたベクターに含まれるクローンのヒトＤＮＡ配列によってコードされる完全なオープンリーディングフレームの哺乳動物細胞（例えば、以下に記載のような、ＣＯＳ細胞）における発現によって産生されるＣＫα−５タンパク質の成熟形態が意味される。
【００３８】
さらに、タンパク質が分泌リーダーならびにリーダー配列の切断点を有するか否かを推定するための方法が利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））の方法では、完全な（非切断の）タンパク質の短いＮ末端荷電領域、および引き続く非荷電領域からの情報が使用される。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））では、切断部位の周囲の残基（代表的には、残基−１３〜＋２、ここで、＋１は成熟タンパク質のアミノ末端を示す）からの情報が使用される。これらの方法の各々に関する、公知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点を推定する精度は、７５〜８０％の範囲にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、前述）。しかしこの２つの方法は、所定のタンパク質に関して同じ推定切断点を常に生じるとは限らない。
【００３９】
本出願の場合において、完全ＣＫα−５ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、京都大学、化学研究所（Ｎａｋａｉ，Ｋ．および Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４：８９７−９１１（１９９２））のＫｅｎｔａ Ｎａｋａｉ博士より入手可能なコンピュータープログラム「ＰＳＯＲＴ」により解析された。ＰＳＯＲＴはアミノ酸配列に基づくタンパク質の細胞性局在位置を推定するためのエキスパートシステムである。局在化のこのコンピューター推定の一部として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法が取りこまれる。上記のコンピューター解析は、配列番号２に示される完全アミノ酸配列内で、１つの可能性のある切断部位を予測し；すなわち、図１における残基２７と残基２８との間、および配列番号２における残基−１と残基１との間である。
【００４０】
示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えばｍＲＮＡ）で、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより入手または合成的に生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としてもまた知られる、コード鎖であり得るか、またはアンチセンス鎖とも言われる非コード鎖であり得る。
【００４１】
「単離された」核酸分子によって、そのネイティブな環境から取り出された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成されたような分子をさらに含む。「単離された」とは、本発明者は、単離された染色体および酵母人工染色体（ＹＡＣ）のような、非常に大きい遺伝物質片（２００ｋｂ＋）を特異的に排除することを意図している。
【００４２】
本発明の単離された核酸分子は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列の５４２〜５４４位の開始コドンを有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含む。
【００４３】
配列番号２の１〜２２７位に示される推定成熟ＣＫα−５タンパク質に対するコード配列を含むＤＮＡ分子もまた、含まれる。
【００４４】
さらに、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列とは実質的に異なるが、遺伝コードの縮重により、なおＣＫα−５タンパク質をコードする配列を含むＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝コードおよび種特異的コドン優先度は、当該分野で周知である。従って、例えば、特定の宿主に関してコドン発現を至適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡ中のコドンをＥ．ｃｏｌｉのような細菌宿主に好ましいコドンに変更する）ために、上記の縮重改変体を作製することは当業者にとって慣用的である。
【００４５】
別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１（１９９７年８月２９日付）として受託されるプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードしている単離された核酸分子を提供する。
【００４６】
好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００４７】
本発明は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列もしくは上記の寄託クローンに含まれるＣＫα−５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子をさらに提供する。このような単離した分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子地図作製に使用するプローブとして、およびヒト組織におけるＣＫα−５遺伝子の発現を（例えば、ノーザンブロット解析によって）検出するために有用である。
【００４８】
本発明はさらに、本明細書中に記述されるヌクレオチド配列の一部をコードする核酸分子、ならびに本明細書中に記述した単離した核酸分子のフラグメントに関する。特に本発明は、配列番号１の１〜１３０３、５４２〜１３０３、６２２〜１３０３、６２５〜１３０３、６２８〜１３０３、６３１〜１３０３、６３４〜１３０３、６３７〜１３０３、６４０〜１３０３、６４３〜１３０３、６４６〜１３０３、６４９〜１３０３、６５２〜１３０３、６５２〜７８７、６５２〜８１７、６５２〜８４７、６５２〜８７７、６５２〜９０７、６５２〜９３７、６５２〜９６７、６５２〜９９７、６５２〜１０２７、６５２〜１０５７、６５２〜１０８７、６５２〜１１１７、６５２〜１１４７、６５２〜１１７７、６５２〜１２０７、６５２〜１２３７、または６５２〜１２６７位からなる配列番号１の一部を表しているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００４９】
さらに、配列番号１の広範な部分に関連したヌクレオチド配列を有する、以下の核酸分子が同定された：クローンＨＮＦＣＯ０９由来のＨＮＦＣＯ０９Ｒ（配列番号４）；クローンＨＮＥＤＳ２６Ｒ由来のＨＮＥＤＳ２６Ｒ（配列番号５）；。クローンＨＯＡＢＤ４７由来のＨＯＡＢＤ４７Ｒ（配列番号６）；クローンＨＴＥＩＲ４１由来のＨＴＥＩＲ４１Ｒ（配列番号７）；クローンＨＭＮＡＤ３６由来のＨＭＮＡＤ３６Ｒ（配列番号８）；およびクローンＨＴＥＤＱ０７由来のＨＴＥＤＱ０７ＲＡ（配列番号２０）。
【００５０】
配列番号１の一部に関連する、以下の公に利用可能なｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ「ＥＳＴ」もまた同定された：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１３０７７６（配列番号９）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ２９０７１２（配列番号１０）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ３６６３２９（配列番号１１）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１２１７１６（配列番号１２）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１４６６７２（配列番号１３）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ１４９３５９（配列番号１４）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ５６９９７０（配列番号２１）；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ９９４５５２（配列番号２２）。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、１以上の上記の配列１〜１４および２０〜２２ではなく、そしてそれらを含むものではない。
【００５２】
さらに本発明は、配列番号１のヌクレオチド５４２〜１３０３からの少なくとも約１７ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２０、２５、または３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明はまた、配列番号１の，好ましくは残基５４２〜１，３０３からの、少なくとも約５００、好ましくは約６００のヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌクレオチドを含む。この点において、特に好ましいヌクレオチドフラグメントは、配列番号１におけるヌクレオチド６２２〜１，３０３からのフラグメントを含む。
【００５４】
より一般的には、寄託したｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントは、本明細書中に議論したような診断プローブおよびプライマーとして有用である、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは、少なくとも約４０ｎｔ長のフラグメントを意図する。もちろん、寄託したｃＤＮＡの、または図１（配列番号１）に示したヌクレオチド配列の全てではないが、ほとんどに対応するフラグメントとして、５０〜１０００ｎｔ長のより大きなフラグメントもまた、本発明に従って有用である。少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントは、例えば、寄託したｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントを意図する。本発明の好ましい核酸フラグメントは、図３に示されるＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数から同定され、そして以下により詳細に記述されるＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分をコードする核酸分子を含む。
【００５５】
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローン）中のポリヌクレオチドの一部に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、以下：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーション、引き続く約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を意図する。
【００５６】
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは約３０〜７０（例えば５０）ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意図する。これらは、上記で、そして以下でより詳細に議論されるように、診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
【００５７】
例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの部分とは、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列）からの２０以上の連続したヌクレオチドを意図する。もちろん、ポリＡ配列（例えば図１（配列番号１）に示されるＣＫα−５ ｃＤＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なストレッチのみにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の核酸分子またはその相補体（例えば、現実的には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズするからである。
【００５８】
示されるように、ＣＫα−５ポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、それ自体で成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；および成熟ポリペプチドおよび付加配列についてのコード配列、例えば約２７アミノ酸のリーダーまたは分泌配列（例えばプレ、またはプロ、またはプレプロタンパク質配列）をコードするもの；上記の付加コード配列を有する、または有さない成熟ポリペプチドのコード配列を含み得るがこれらに限定されない。
【００５９】
本発明の核酸によって、例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセッシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）において役割を果すような、、転写されるが翻訳されない配列（例えば、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性のための））を含むがこれらに限定されない付加的な非コード配列；付加的アミノ酸をコードする追付加的コード配列（例えば付加的な機能性を提供するもの）とともに上記のタンパク質配列もまたコードされる。
【００６０】
従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、このマーカーアミノ酸配列は、例えば、特にｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ
Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグのような、ヘキサヒスチジンペプチドであり、多くのものは市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記述されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製のために提供される。「ＨＡ」タグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）に記載されるインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと対応する、精製に有用な別のペプチドである。以下に議論するように、他のこのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端でＦｃに融合したＣＫα−５を含む。
【００６１】
（改変体および変異体ポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはＣＫα−５タンパク質の一部、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、天然の対立遺伝子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替的な形態のひとつを意図する。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野において公知の変異誘発技術を使用して産生され得る。
【００６２】
そのような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により産生される改変体を含む。置換、欠失または付加は１つ以上のヌクレオチドを含み得る。この改変体は、コード領域、非コード領域または両方で変更され得る。コード領域での変化は、保存的または非保存的のアミノ酸の置換、欠失または付加を産生し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加および欠失であり、これはＣＫα−５タンパク質またはその一部の特性および活性を変化させない。この点について、また特に好ましいものは、保存的置換である。
【００６３】
最も高度に好ましいものは、アミノ末端メチオニンをコードするように改変され得るか、または他のＮ−もしくはＣ−末端融合ペプチドもしくはポリペプチドをコードするように改変され得るかのいずれかの配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する成熟タンパク質または、寄託したｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟ＣＫα−５アミノ酸配列をコードする核酸分子である。
【００６４】
さらなる実施態様は、以下ものからなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む：（ａ）配列番号２として示されるＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７として示されるＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７として示される推定成熟ＣＫα−５をコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８として示されるＣＫα−５ポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全アミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる、Ｎ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【００６５】
本発明のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）の任意のヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、もしくは（ｈ）のアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子に関係する。
【００６６】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、および組換え技術によりＣＫα−５ポリペプチドまたはペプチドを産生するためにそれらを使用するための方法に関する。
【００６７】
ＣＫα−５ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ＣＫα−５ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異をポリヌクレオチド配列が含み得ることを除いて、参照配列に同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々に、もしくは参照配列内の１以上の連続した群においての、いずれかで散在されて生じ得る。
【００６８】
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば図１に示されるヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１））の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も相同性の高いセグメントを見出す。特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列と９５％同一か否かを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列化プログラムを使用する場合、パラメーターは、もちろん、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって同一性のパーセンテージが計算されるように、そして参照配列のヌクレオチドの総数の５％までの、相同性におけるギャップが可能であるように設定される。
【００６９】
本出願は、図１（配列番号１）に示される核酸配列または寄託されたｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関し、それらがＣＫα−５活性を有するポリペプチドをコードするか否かとは無関係である。これは、特定の核酸分子がＣＫα−５活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者にはなお、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての核酸分子の使用方法が公知であるからである。ＣＫα−５活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリーにおけるＣＫα−５遺伝子またはその対立遺伝子改変体の単離；（２）Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載される、ＣＫα−５遺伝子の正確な染色体位置を提供するための中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および特定の組織でのＣＫα−５ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット解析。
【００７０】
しかし、図１（配列番号１）に示される核酸配列、または実際に、ＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする寄託されたｃＤＮＡの核酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する核酸分子が好ましい。「ＣＫα−５活性を有するポリペプチド」とは、完全ＣＫα−５タンパク質の細胞外部分の活性に、類似するが同一である必要はない活性を提示するポリペプチドを意図する。そのようなポリペプチドに保持されると考えられる、そのような１つの活性は、ヒトケモカインＨＣＣ−１が行うような、骨髄前駆細胞のコロニー形成を調節する能力である。骨髄性前駆細胞の阻害の程度を測定するためのインビトロにおけるコロニー形成アッセイは、Ｙｏｕｎｇら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５５：２６６１−２６６７（１９９５）に記載される。手短には、アッセイは、ヒトまたはマウス骨髄細胞を収集し、そして寒天上にそれらをプレートして、１以上の成長因子、および（１）ＣＫα−５タンパク質（または候補ポリペプチド）を含むトランスフェクトさせた宿主細胞上清または（２）トランスフェクトされてない宿主細胞上清コントロールのいずれかを添加し、そしてマウスおよびヒトのＣＦＵ顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）によるか、ヒトの赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）によるか、あるいはヒトＣＦＵ顆粒球赤血球マクロファージ巨核球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）によるコロニー形成の影響を測定することを含む。このような活性は、化学療法間の骨髄前駆細胞を保護するために有用である。
【００７１】
ＣＫα−５タンパク質は、上記アッセイにおいて用量依存様式で免疫系細胞増殖および分化を調節する。従って、「ＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチド」は、用量依存様式で、上記アッセイにおいて任意の同じ骨髄性前駆体調節活性をまた提示するポリペプチドを含む。用量依存活性の程度は、ＣＫα−５タンパク質の用量依存活性と同一である必要はないが、好ましくは「ＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチド」は、ＣＫα−５タンパク質と比較する場合、所定の活性において実質的に類似の用量依存性を提示する（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ＣＫα−５タンパク質と比較して、より高い活性、または約２５分の１未満でない活性、および好ましくは約１０分の１未満でない活性を提示する）。
【００７２】
他のＣＸＣケモカインのように、ＣＫα−５は、例えば、単球、リンパ球、好中球を含む白血球において活性を示す。この理由のために、ＣＫα−５は、これらの細胞型の増殖，分化、移動を指向するにおいて活性である。このような活性は、免疫増強または抑制、骨髄保護、幹細胞動員、急性および慢性の炎症制御ならびに白血病の処置に対して有用である。そのような活性を測定するためのアッセイは、当該分野で公知である。例えば、Ｐｅｔｅｒｓら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ １７：２７３（１９９６）；Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１１１１（１９９５）；Ｃａｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２５８（１９９２）；およびＳａｎｔｉａｇｏ−Ｓｃｈｗａｒｚら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７８：７（１９９５）を参照のこと。上記の学術論文の各々からのアッセイおよびプロトコールは、本明細書に参考として援用される。
【００７３】
もちろん遺伝コードの縮重に起因して、寄託したｃＤＮＡの核酸配列または図１（配列番号１）に示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する大多数の核酸分子が「ＣＫα−５タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコードすることを、当業者は直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て同じポリペプチドをコードするので、このことは上記の比較アッセイを実施しなくとも当業者に明らかである。縮重改変体でない核酸分子についても、妥当な数のものがまたＣＫα−５タンパク質活性を有するポリペプチドをコードすることは、当該分野においてさらに認識される。これは、以下にさらに記述するように、タンパク質の機能を有意にもたらすようであるか、またはもたらさないようであるかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、一つの脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者らは十分に承知しているからである。
【００７４】
（ベクターおよび宿主細胞）
本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるＣＫα−５ポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に相補的な宿主細胞においてのみ起こる。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物か、または荷電された脂質との複合体で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００７６】
ＤＮＡインサートは、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどのような、適切なプロモーターに作動可能に結合されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始のための部位、終結のための部位、および転写された領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの最初の翻訳開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００７７】
示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
【００７８】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬがある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００７９】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている（例えば、Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００８０】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞においてか、精製の間か、または続く取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当該分野でよく知られており、そして慣用的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の安定化および精製のために有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ対応出願第２０４５８６９号）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失し得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えば、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている。Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．ら， Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎ，ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【００８１】
ＣＫα−５タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む：天然の供給源からの精製産物（直接的に単離されたか、または培養されたかのいずれかの、体液、組織、および細胞を含む）；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変された開始メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによってコードされているＮ末端メチオニンは、一般的に、すべての真核細胞において翻訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野において周知である。大部分の原核細胞においても、大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、非効率的である。
【００８２】
（ポリペプチドおよびフラグメント）
本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたＣＫα−５ポリペプチド、あるいは上記ポリペプチドの一部を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。
【００８３】
（改変体および変異体ポリペプチド）
ＣＫα−５ポリペプチドの特徴を改善または変化させるために、タンパク質工学が利用され得る。当業者に公知である組換えＤＮＡ技術が、新規な変異体タンパク質もしくは「ムテイン」（単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含む）、または融合タンパク質を作製するために使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、例えば、活性の増強または安定性の増加を示し得る。さらに、それらは高収量で精製され得、そして少なくとも特定の精製および貯蔵条件下で、対応する天然のポリペプチドよりもより良好な可溶性を示す。
【００８４】
（Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体）
例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟型を含む多くのタンパク質について、生物学的な機能の実質的な損失なしにＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させ得ることが、当該分野において公知である。例えば、Ｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７のＮ末端アミノ酸残基が欠失した場合でさえ、ヘパリン結合活性を有した改変ＫＧＦタンパク質を報告した。今回の場合、本発明のタンパク質がケモカインポリペプチドファミリーのメンバーであるので、ジスルフィド架橋の形成に必要とされる最初の「Ｃｙｓ」までのＮ末端アミノ酸の欠失は、レセプター結合または標的細胞活性の調節のようないくらかの生物学的活性を保持し得る。図１の３８位（配列番号２の１１位）でのシステイン残基を含むさらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持することは期待されない。なぜなら、ケモカイン関連ペプチドにおけるこの残基は、レセプター結合およびシグナル伝達に必要とされる構造安定性を提供するジスルフィド架橋を形成することに必要とされることが、公知であるからである。
【００８５】
しかし、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質の、タンパク質の完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合する能力は、タンパク質の完全な形態または成熟形態の残基の大部分より少ない残基がＮ末端から除去された場合には、一般的に保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって、容易に決定され得る。
【００８６】
従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＣＫα−５タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基（１１位のシステイン残基まで）を欠失したポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、配列番号２の残基ｎ〜１７８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｎは−４〜１１の範囲の整数であり、そしてシステイン１１は、ＣＫα−５タンパク質のレセプター結合活性に必要とされると考えられる、ＣＫα−５ポリペプチド（配列番号２に示される）の細胞外ドメインのＮ末端からの最初の残基の位置である。
【００８７】
より詳細には、本発明は、配列番号２の−４〜１７８、−３〜１７８、−２〜１７８、−１〜１７８、１〜１７８、２〜１７８、３〜１７８、４〜１７８、５〜１７８、６〜１７８、７〜１７８、８〜１７８、９〜１７８、１０〜１７８、および１１〜１７８、全部からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【００８８】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０アミノ酸残基を欠失することにより１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６；（１９８８））。今回の場合、本発明のタンパク質がケモカインポリペプチドファミリーのメンバーであるので、配列番号２の５５位のシステインまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、レセプター結合または標的細胞活性の調節のようないくらかの生物学的活性を保持し得る。図１の８２位（配列番号２の５５位）のシステイン残基を含むさらなるＣ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持することは期待されない。なぜなら、ケモカイン関連ポリペプチドにおけるこの残基が、レセプター結合およびシグナル伝達に必要とされる構造安定性を提供するジスルフィド架橋を形成するのに必要であることが公知であるからである。
【００８９】
しかし、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質の、タンパク質の完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合する能力は、完全なまたは成熟したタンパク質の残基の大部分より少ない残基がＣ末端から除去される場合、一般的に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野において公知の方法によって、容易に決定され得る。
【００９０】
従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるＣＫα−５のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基（配列番号２の５５位のシステイン残基まで）を有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基−４〜ｍのアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここでｍは５５〜１７８の範囲の任意の整数であり、そしてシステイン残基５５は、ＣＫα−５タンパク質のレセプター結合および標的細胞調節活性に必要とされると考えられる、完全ＣＫα−５ポリペプチド（配列番号２に示される）のＣ末端からの最初の残基の位置である。
【００９１】
より詳細には、本発明は、配列番号２の残基−４〜５５、−４〜５６、−４〜５７、−４〜５８、−４〜５９、−４〜６０、−４〜６１、−４〜６２、−４〜６３、−４〜６４、−４〜６５、−４〜６６、−４〜６７、−４〜６８、−４〜６９、−４〜７０、−４〜７１、−４〜７２、−４〜７３、−４〜７４、−４〜７５、−４〜７６、−４〜７７、−４〜７８、−４〜７９、−４〜７９、−４〜８０、−４〜８１、−４〜８２、−４〜８３、−４〜８４、−４〜８５、−４〜８６、−４〜８７、−４〜８８、−４〜８９、−４〜９０、−４〜９１、−４〜９２、−４〜９３、−４〜９４、−４〜９５、−４〜９６、−４〜９５、−４〜９６、−４〜９７、−４〜９８、−４〜９９、−４〜１００、−４〜１０１、−４〜１０２、−４〜１０３、−４〜１０４、−４〜１０５、−４〜１０６、−４〜１０７、−４〜１０８、−４〜１０９、−４〜１１０、−４〜１１１、−４〜１１２、−４〜１１３、−４〜１１４、−４〜１１５、−４〜１１６、−４〜１１７、−４〜１１８、−４〜１１９、−４〜１２０、−４〜１２１、−４〜１２２、−４〜１２３、−４〜１２４、−４〜１２５、−４〜１２６、−４〜１２７、−４〜１２８、−４〜１２９、−４〜１３０、−４〜１３１、−４〜１３２、−４〜１３３、−４〜１３４、−４〜１３５、−４〜１３６、−４〜１３７、−４〜１３８、−４〜１３９、−４〜１４０、−４〜１４１、−４〜１４２、−４〜１４３、−４〜１４４、−４〜１４５、−４〜１４６、−４〜１４７、−４〜１４８、−４〜１４９、−４〜１５０、−４〜１５１、−４〜１５２、−４〜１５３、−４〜１５４、−４〜１５５、−４〜１５６、−４〜１５７、−４〜１５８、−４〜１５９、−４〜１６０、−４〜１６１、−４〜１６２、−４〜１６３、−４〜１６４、−４〜１６５、−４〜１６６、−４〜１６７、−４〜１６８、−４〜１６９、−４〜１７０、−４〜１７１、−４〜１７２、−４〜１７３、−４〜１７４、−４〜１７５、−４〜１７６、−４〜１７７、−４〜１７８、全部からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【００９２】
本発明はまた、可溶型（細胞外ドメイン）のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供し、これは配列番号２の残基ｎ〜ｍを有するものとして一般的に記載され得る。ここでｎおよびｍは上記で述べたような整数である。特に好ましくは、配列番号２の１１〜５５、１１〜５６、１０〜５７、１０〜５８、１０〜５９、１０〜６０、１０〜６１、１０〜６２、９〜６３、９〜６４、９〜６５、９〜６６、９〜６７、９〜６８、９〜６９、９〜７０、９〜７１、９〜７２、９〜７３、８〜７４、８〜７５、８〜７６、８〜７７、８〜７８、８〜７９、８〜７９、８〜８０、８〜８１、８〜８２、８〜８３、８〜８４、７〜８５、７〜８６、７〜８７、７〜８８、７〜８９、７〜９０、７〜９１、７〜９２、７〜９３、７〜９４、７〜９５、７〜９６、７〜９５、７〜９６、７〜９７、７〜９８、７〜９９、７〜１００、６〜１０１、６〜１０２、６〜１０３、６〜１０４、６〜１０５、６〜１０６、６〜１０７、６〜１０８、６〜１０９、６〜１１０、６〜１１１、６〜１１２、６〜１１３、６〜１１４、６〜１１５、６〜１１６、６〜１１７、６〜１１８、６〜１１９、６〜１２０、６〜１２１、６〜１２２、６〜１２３、６〜１２４、６〜１２５、６〜１２６、６〜１２７、６〜１２８、６〜１２９、６〜１３０、６〜１３１、６〜１３２、６〜１３３、６〜１３４、６〜１３５、６〜１３６、６〜１３７、６〜１３８、６〜１３９、６〜１４０、６〜１４１、６〜１４２、６〜１４３、６〜１４４、６〜１４５、６〜１４６、６〜１４７、６〜１４８、６〜１４９、６〜１５０、６〜１５１、６〜１５２、６〜１５３、６〜１５４、６〜１５５、６〜１５６、６〜１５７、５〜１５８、５〜１５９、５〜１６０、５〜１６１、５〜１６２、５〜１６３、５〜１６４、５〜１６５、５〜１６６、５〜１６７、５〜１６８、５〜１６９、４〜１７０、４〜１７１、４〜１７２、４〜１７３、４〜１７４、４〜１７５、４〜１７６、４〜１７７、および４〜１７８、全部からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００９３】
また、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なＣＫα−５のアミノ酸の一部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、この部分は、ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ末端から２３〜約３７のアミノ酸、あるいはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる細胞外ドメインのカルボキシ末端から４９〜約１７２アミノ酸、または上記のアミノ末端およびカルボキシ末端欠損の任意の組み合わせを除外する。上記の欠失変異ポリペプチド形態の全部をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００９４】
（他の変異体）
上記で議論したタンパク質の末端欠失形態に加えて、ＣＫα−５ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能の顕著な効果なしで改変され得ることもまた、当業者に認識される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在するということが、思い出されるべきである。
【００９５】
従って、本発明はさらに、実質的なＣＫα−５ポリペプチド活性を示すか、または以下で議論するタンパク質部分のようなＣＫα−５タンパク質の領域を含む、ＣＫα−５ポリペプチドのバリエーションを含む。このような変異体は、活性にほとんど効果を有さないような、当該分野において公知の一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスが、Ｂｏｗｉｅ．Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供されており、その中で著者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主なアプローチが存在することを示す。第１の方法は進化の過程に依存し、ここで変異は自然選択によって受け入れられるか、または拒絶されるかのいずれかである。第２のアプローチは、遺伝子操作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入し、そして選択またはスクリーニングを使用して機能性を維持する配列を同定する。
【００９６】
著者らがいうように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くべきほど寛容であることを明らかにしてきた。著者らはさらに、どのアミノ酸変化がタンパク質の特定の位置において許容的である可能性があるかを示す。例えば、大部分の埋没したアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、一方、表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されていない。他のこのような表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら（前出）およびそこに引用される参考文献中に記載される。代表的には、保存的な置換とみなされるものを表１に示す。
【００９７】
従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるものは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基は、保存されたアミノ酸残基または保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてそのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、別の化合物と融合しているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列、または上記の形態のポリペプチドの精製に利用される配列、またはプロタンパク質配列のような、さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの上記の形態に融合しているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００９８】
従って、本発明のＣＫα−５は、天然の変異または人為的操作のいずれか由来の、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように、変化は、好ましくは、マイナーな性質のものであり、例えばタンパク質のフォールディングまたは活性に顕著な影響を与えない保存的アミノ酸置換である（表１を参照のこと）。
【００９９】
【表１】
【０１００】
本発明のＣＫα−５タンパク質の機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））により同定され得る。後者の手順は、分子のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生物学的活性（例えば、レセプター結合あるいはインビトロまたはインビトロでの増殖活性）について試験される。
【０１０１】
特に興味深いのは、荷電したアミノ酸を、高度に所望の改善された特徴（例えば、より少ない凝集）を有するタンパク質を産生し得る、他の荷電したアミノ酸または中性アミノ酸で置換することである。凝集は、活性を低下させるだけではなく、薬学的処方物を調製する場合にもまた問題ともなり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３））。
【０１０２】
アミノ酸の置き換えはまた、細胞表面レセプターに対するリガンドの結合の選択性を変化させ得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６−２６８（１９９３）は２つの公知のタイプのＴＮＦレセプターの１つのみへのＴＮＦ−αの選択的な結合を生じる特定の変異を記載する。リガンド−レセプター結合について決定的である部位はまた、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴法または光親和性標識）により決定され得る（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）；およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１０３】
上記のように、ＣＫα−５は、ＥＬＲモチーフを欠損する。このようなモチーフが関連したケモカインにおいて代表的に見出されるような位置で、ＥＬＲモチーフを含むように、ＣＫα−５において特定の変異体を作成することにより、ＣＫα−５は、アンタゴニストとして作用し、従って、脈管形成活性を有する。従って、本発明のポリペプチドは、ＣＫα−５−ＥＬＲ変異体を含む。このようなＣＫα−５−ＥＬＲ変異体は、全長ＣＫα−５タンパク質または好ましくは、成熟ＣＫα−５タンパク質を含む。さらに、ＣＫα−５は、ケモカイン関連タンパク質ファミリーのメンバーであるので、ＣＫα−５の生物学的活性を完全に除去するよりむしろ調整するために、好ましくは、変異が、ＣＫα−５細胞外ドメインにおける、すなわち、配列番号２の１〜１７８位において、より好ましくは、ケモカインファミリーの全てのメンバーで保存されていないこの領域中の残基において、アミノ酸をコードする配列中に作成される。当該分野で公知であるように、４つの空間的に保存されたシステインは、全てのケモカインに存在し、ＣＫα−５の１１位、１３位、４１位、および５５位は、２つのジスルフィド架橋の形成に必要とされる。従って、配列番号２の１１位、１３位、４１位および５５位に位置する４つのシステイン残基のいずれかの改変は、好ましくない。また、本発明の一部分を形成するものは、上記ＣＫα−５変異体をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドである。
【０１０４】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、単離された形態で提供され、そして好ましくは、実質的に精製される。ＣＫα−５ポリペプチドの組換え的に産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に記載された一工程の方法により実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野で周知である方法において、本発明の抗ＣＫα−５抗体を用いて、天然または組換えの供給源から精製され得る。
【０１０５】
本発明はさらに、（ａ）配列番号２に示す完全なアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされる完全なアミノ酸配列を有する全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２に示す完全なアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２６〜２２７位）、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配列を有する全長ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｃ）残基１〜２２７として配列番号２に示すアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされる成熟ＣＫα−５のアミノ酸配列を有する成熟ＣＫα−５ポリペプチドのアミノ酸配列；および（ｄ）残基１〜１７８として配列番号２に示すアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡクローンにコードされるＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列を有するＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたＣＫα−５ポリペプチドを提供する。
【０１０６】
本発明のさらなるポリぺプチドは、上記のポリペプチドに対して、少なくとも９０％類似性、より好ましくは、少なくとも９５％類似性、およびなおより好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％類似性を有するポリぺプチドを含む。本発明のポリぺプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリぺプチドもしくは配列番号２のポリぺプチドに対して、少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％同一、なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるポリぺプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリぺプチドの一部分を含む。このような改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【０１０７】
２つのポリぺプチドについての「％類似性」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）および類似性を決定するためのデフォルト設定を使用して２つのポリぺプチドのアミノ酸配列を比較することによって生成される類似性スコアが意図される。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９， １９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最良のセグメントを見い出す。
【０１０８】
ＣＫα−５ポリペプチドの参照アミノ酸配列に、少なくとも、例えば、９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、ポリぺプチドのアミノ酸配列が、ポリぺプチド配列がＣＫα−５ポリペプチドの参照アミノ酸の各１００アミノ酸あたり５アミノ酸の変化までを含み得ることを除いて、参照配列に同一であることが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の５％までが、欠失され得るか、または別のアミノ酸で置換され得るか、あるいは、参照配列の総アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置の間のどこかで、参照配列中の残基の間に個々に散在してか、または参照配列内で１つ以上の連続する群の中に散在してかのいずれかで、起こり得る。
【０１０９】
実際に、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列に対してか、または寄託されたＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータプログラムを使用して従来的に決定され得る。特定の配列が、本発明による参照配列と、例えば、９５％同一であるか否かを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、パラメータは、同一性のパーセンテージが、参照アミノ酸配列の全長にわたって算定されるように、そして相同性中のギャップが参照配列におけるアミノ酸残基の総数の５％まで許容するように、設定される。
【０１１０】
本発明のポリぺプチドは、当業者に周知の方法を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でまたは分子ふるいゲルろ過カラム上で分子量マーカーとして、使用され得る。
【０１１１】
以下に詳細に記載されるように、本発明のポリぺプチドはまた、以下に記載されるＣＫα−５タンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて、またはＣＫα−５タンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。さらに、このようなポリぺプチドは、酵母ツーハイブリッド系において、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるＣＫα−５タンパク質結合タンパク質を「捕捉」するために使用され得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９））に記載される。
【０１１２】
（エピトープ保有部分）
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」とは、全体としてのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【０１１３】
抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列で頻繁に示され、一連の単純な化学的法則により特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために有用である。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７頁を参照のこと。
【０１１４】
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。ＣＫα−５特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリぺプチドまたはペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番号２における約Ｔｙｒ−１２〜約Ｓｅｒ−２４のアミノ酸残基を含むポリペプチド、配列番号２における約Ｃｙｓ−５５〜約Ｖａｌ−６３のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約Ｔｈｒ−９１〜約Ｐｒｏ−１１０のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および約Ｓｅｒ−１２０〜約Ｉｌｅ１４５のアミノ酸残基を含むポリペプチド。これらのポリぺプチドフラグメントは、上記の図３に示すように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析によりＣＫα−５タンパク質の抗原性エピトープを保有することが決定されている。
【０１１５】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段により産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｒ．Ａ．ら（１９８５）「Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５；この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号にさらに記載されている。
【０１１６】
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリぺプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２５４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち、全体としてのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質のその部分）は、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（前出）を参照のこと。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープ（すなわち、「ミモトープ」）の位相幾何学的等価物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的なリガンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ＭｉｘｔｕｒｅｓのＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９９６）らの米国特許第５，４８０，９７１号は、直線状のＣ１〜Ｃ７アルキルペルアルキル化オリゴペプチドならびにこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、ならびにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを、目的のアクセプター分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するために使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。
【０１１７】
（融合タンパク質）
当業者が理解するように、本発明のＣＫα−５ポリペプチドおよびその上記のエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と組み合わせられ得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体ＣＫα−５タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５）。
【０１１８】
（抗体）
本発明における使用のためのＣＫα−５タンパク質特異的抗体は、インタクトなＣＫα−５タンパク質またはその抗原性ポリぺプチドフラグメントに対して惹起され得、これは、アルブミンのようなキャリアタンパク質とともに、またはそれが十分に長ければ（少なくとも約２５アミノ酸）、キャリアなしに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得る。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、インタクトな分子、ならびにＣＫα−５タンパク質に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠失し、循環からより迅速に除去され、そしてインタクトな抗体のより非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１２０】
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、ＣＫα−５タンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法において、ＣＫα−５タンパク質の調製物が、天然の夾雑物を実質的に含まないようにするために調製および精製される。次いで、このような調製物は、より比活性の大きいポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される。
【０１２１】
最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそのＣＫα−５タンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１）、５６３〜６８１頁）。一般に、このような手順は、ＣＫα−５タンパク質抗原またはより好ましくはＣＫα−５タンパク質発現細胞を使用した、動物（好ましくはマウス）の免疫を含む。適切な細胞は、抗ＣＫα−５タンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得る；しかし、１０％胎児ウシ血清（約５６℃で非働化）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅの改変Ｅａｇｌｅ培地において細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切なミエローマ細胞株と融合する。任意の適切なミエローマ細胞株は、本発明に従って利用され得る；しかし、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を利用することが好ましい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次いで、Ｗａｎｄｓ（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））に記載されるように、限界希釈によってクローン化する。次いで、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞を、ＣＫα−５タンパク質抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。
【０１２２】
あるいは、ＣＫα−５タンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体の使用を介して２工程手順において産生し得る。このような方法は、抗体がそれ自身抗原であり、そしてそれゆえ第２の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、ＣＫα−５タンパク質特異的抗体を、動物（好ましくはマウス）を免疫するために使用する。次いで、このような動物の脾細胞を、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用し、そしてそのハイブリドーマ細胞を、ＣＫα−５タンパク質特異的抗体に結合する抗体能力がＣＫα−５タンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングする。このような抗体は、ＣＫα−５タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＣＫα−５タンパク質特異的抗体の形成を誘導するために使用し得る。
【０１２３】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このようなフラグメントを、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために）のような酵素を用いる、タンパク質分解的切断によって生成する。あるいは、ＣＫα−５タンパク質結合フラグメントを、組換えＤＮＡ技術を適用することによって、または合成化学によって産生し得る。
【０１２４】
ヒトにおける抗ＣＫα−５のインビボでの使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生する方法は、当該分野で公知である。総説について、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと。
【０１２５】
（免疫系関連障害）
（診断）
本発明者らは、ＣＫα−５が、好中球および単球において発現されることを発見した。多くの免疫系関連障害について、「標準」ＣＫα−５遺伝子発現レベル、すなわち免疫系障害を有さない個体からの免疫系組織または体液におけるＣＫα−５発現レベルと比較して、実質的に変化した（増大または減少した）レベルのＣＫα−５遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取した免疫系組織または他の細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において、検出され得る。従って、本発明は、免疫系障害の診断の間に有用である診断方法を提供し、この方法は、個体からの免疫系組織または他の細胞または体液において、ＣＫα−５タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および測定された遺伝子発現レベルを標準的なＣＫα−５遺伝子発現レベルと比較する工程であって、それにより標準と比較した遺伝子発現レベルの増大または減少が、免疫系障害の指標である、工程を包含する。
【０１２６】
特に、ガン（特に、骨肉種）を有する哺乳動物における特定の組織が、対応する「標準」レベルと比較した場合に、有意に変化したレベルのＣＫα−５タンパク質およびＣＫα−５タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現すると考えられる。さらに、変化されたレベルのＣＫα−５タンパク質は、ガンを有さない同一の種の哺乳動物からの血清と比較した場合、このようなガンを有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）において、検出され得ると考えられている。
【０１２７】
従って、本発明は、免疫系障害（骨格系および免疫系のガンを含む）の診断の間に有用である診断方法を提供し、この方法は、個体由来の免疫系組織もしくは骨格系組織または他の細胞または体液においてＣＫα−５タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、およびその測定された遺伝子発現レベルを標準的なＣＫα−５遺伝子発現レべルと比較する工程であって、それにより標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増大または減少が、免疫系障害の指標である、工程、を包含する。
【０１２８】
腫瘍の診断を含む、免疫系における障害の診断が、従来の方法に従ってすでに行われている場合、本発明は、予後指標として有用であり、これにより、増強または抑制されたＣＫα−５遺伝子発現を示す患者が、標準的なレベルにより近いレベルで遺伝子を発現する患者に比較して、より悪い臨床的結果を経験する。
【０１２９】
「ＣＫα−５タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」により、第一の生物学的サンプルにおいて、ＣＫα−５タンパク質のレベルまたはＣＫα−５タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的に（例えば、絶対的タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または概算することによって）、あるいは相対的に（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較することによって）、定性的または定量的に測定するかまたは概算することを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または概算され、そして標準的なＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較される。この標準は、障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから採取されるか、または免疫系の障害を有さない個体の集団からのレベルを平均化することによって決定される。当該分野で理解されるように、一旦標準的なＣＫα−５タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルが知られると、それは比較のための標準として反復して使用され得る。
【０１３０】
「生物学的サンプル」により、個体から得られる任意の生物学的サンプル、体液、細胞株、組織培養物、またはＣＫα−５タンパク質もしくはｍＲＮＡを含有する他の供給源が意図される。示されるように、生物学的サンプルは、遊離のＣＫα−５タンパク質を含有する体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）、免疫系組織、骨格系組織および全長成熟ＣＫα−５またはＣＫα−５レセプターを発現することが見出されている他の組織供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含むべきである場合には、組織生検が好ましい供給源である。
【０１３１】
本発明は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の免疫系関連障害の診断または処置のために有用である。このような障害には、腫瘍、ガン、肉腫（例えば、骨肉種）、間隙性肺疾患（例えば、ランゲルハンス細胞肉芽腫症）、および免疫細胞機能の任意の調節障害（自己免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、免疫、体液性免疫、炎症性腸疾患、骨髄抑制などが含まれるがこれらに限定されない）が含まれる。
【０１３２】
細胞総ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９（１９８７））に記載される一工程グアニジン−チオシアネート−フェノールクロロホルム法のような任意の適切な技術を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ＣＫα−５タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を使用してアッセイされる。これらには、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）が含まれる。
【０１３３】
生物学的サンプルにおけるＣＫα−５タンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく技術を用いて行い得る。例えば、組織でのＣＫα−５タンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａｎｅｎ Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５（１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６（１９８７））。ＣＫα−５タンパク質遺伝子発現を検出するために有用なその他の抗体に基づく方法は、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射イムノアッセイ（ＲＩＡ））を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、そしてグルコースオキシダーゼのような酵素標識、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）、およびテクネチウム（99mＴｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０１３４】
個体から得た生物学的サンプルにおいてＣＫα−５タンパク質レベルをアッセイするのに加えて、ＣＫα−５タンパク質はまた、画像化によってインビボで検出され得る。ＣＫα−５タンパク質のインビボ画像化のための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法について、適切な標識には、検出可能な放射線を放射するが、被験体には明白に有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーには、関連するハイブリドーマの栄養素を標識することによって抗体中に取り込まれ得る、検出可能特徴を有するスピンを有するもの（例えば、重水素）が含まれる。
【０１３５】
放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像化部分で標識したＣＫα−５タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、免疫系障害について検査される哺乳動物中に導入される（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）。被験体のサイズおよび使用される画像化系が、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量を決定することが当該分野において理解される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は、通常、99mＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、ＣＫα−５タンパク質を含有する細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」に記載されている（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ 第１３章、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （１９８２））。
【０１３６】
（処置）
上記のように、ＣＫα−５ポリヌクレオチドおよびポリぺプチドは、ＣＫα−５活性の異常に高いかまたは低い発現を伴う状態の診断に有用である。ＣＫα−５が発現される細胞および組織ならびにＣＫα−５によって調節された活性が与えられれば、標準的なすなわち「正常な」レベルに比較して、個体における実質的に変化した（増大または減少した）レベルのＣＫα−５の発現は、ＣＫα−５が発現され、および／または活性である身体の系に関連する病理的状態を生じることが容易に明らかである。
【０１３７】
本発明のＣＫα−５タンパク質は、ケモカインファミリーのメンバーであるので、このタンパク質の成熟分泌形態は、タンパク質分解によってＣＫα−５を発現する細胞から可溶性形態で放出され得ることもまた、当業者に理解される。従って、ＣＫα−５が外因性供給源から、個体の細胞、組織または身体に添加される場合、そのタンパク質は、その個体の標的細胞においてその生理的活性を発揮する。また、この膜貫通タンパク質を発現する細胞は、個体の細胞、組織または身体に添加され得、そしてこれらの添加された細胞は、ＣＫα−５に対するレセプターを発現する細胞に結合し、それによってＣＫα−５を発現する細胞は、レセプターを有する標的細胞に対して作用（例えば、細胞刺激）を生じ得る。
【０１３８】
それゆえ、個体における標準的または正常なレベルのＣＫα−５活性における減少によって引き起こされる状態（特に、免疫系の障害）は、ＣＫα−５ポリぺプチドを、可溶性細胞外ドメインの形態、または完全タンパク質を発現する細胞の形態で投与することによって処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、増大したレベルのＣＫα−５活性を必要とする個体の処置の方法を提供し、この方法は、このような個体に、このような個体においてＣＫα−５活性レベルを増大させるのに有効な量の本発明の単離されたＣＫα−５ポリぺプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０１３９】
ＣＫα−５は、ＥＬＲモチーフを欠いているので、ＣＫα−５はまた、新脈管形成因子ではなく脈管形成停止（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）因子でもあるはずである。さらに、ＣＫα−５は、内皮細胞機能を阻害するので、広範な抗炎症活性を有する。ＣＫα−５は、抗新血管形成因子として使用されて、宿主防禦細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ）の侵襲および活性化を刺激すること、および腫瘍の脈管形成を阻害することによって固形腫瘍を処置し得る。当業者は、血管増殖が所望されない他の非ガン状態を認識する。また、それらを使用して、殺菌性白血球の誘引および活性化を介して、耐性の慢性感染および急性感染（例えば、ミコバクテリア（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）感染）に対する宿主防禦を増強し得る。ＣＫα−５をまた使用して、ＩＬ−２生合成の阻害によって、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患およびリンパ球白血病の処置のために、Ｔ細胞増殖を阻害し得る。ＣＫα−５をまた使用して、細胞砕片の除去および結合組織促進炎症性細胞の補充を介して、ならびに過剰なＴＧＦ媒介線維症のその制御を介しての両方で、創傷治癒を刺激し得る。これと同様に、ＣＫα−５をまた使用して、肝硬変、変形性関節症、および肺線維症を含む他の線維性障害を処置し得る。ＣＫα−５は、住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症の際に組織に侵入する寄生生物の幼虫を殺傷する顕著な機能を有する好酸球の存在を増加する。また、これを使用して、例えば、種々の造血性前駆細胞の活性化および分化を調節して、化学療法（すなわち、幹細胞動員）後に骨髄から成熟白血球を放出させることによって、造血を調節し得る。また、ＣＫα−５を使用して、敗血症を処置し得る。また、ＥＬＲモチーフを含む特定の変異体を作製することによって、ＣＫα−５−ＥＬＲは、新脈管形成が利益がある（すなわち、創傷治癒、創傷もしくは疾患からの損傷四肢の再血管生成、当業者に公知の他のものを促進する）場合に、疾患状態の全てを処置するために有用である。
【０１４０】
（処方物）
ＣＫα−５ポリペプチド組成物は良好な医療行為に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（特に、ＣＫα−５ポリペプチド単独での処置の副作用）、ＣＫα−５ポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。従って、本明細書における目的のためのＣＫα−５ポリペプチドの「有効量」は、このような考慮事項によって決定される。
【０１４１】
一般的な提案として、１用量あたりに非経口的に投与されるＣＫα−５ポリペプチドの薬学的に有効な総量は、患者の体重あたり約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療上の裁量を受ける。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そしてヒトについて最も好ましくは、このホルモンについて約０．０１と１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与される場合、ＣＫα−５ポリペプチドは、代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射によって、または、例えば、ミニポンプを使用する継続的皮下注入によってのいずれかで投与される。静脈内点滴用バッグ溶液もまた使用され得る。変化を観察するに必要な処置の長さ、および応答が生じるための処置の後の間隔は、所望の効果に応じて変動するようである。
【０１４２】
本発明のＣＫα−５を含有する薬学的組成物は、経口、直腸内、非経口、槽内、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、液滴、または経皮パッチによるような）、口腔に（ｂｕｃａｌｌｙ）、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意の型の処方補助剤を意味する。本明細書で使用される場合、用語「非経口（的）」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、皮下、および関節内の注射および注入を包含する、投与様式をいう。
【０１４３】
ＣＫα−５ポリペプチドもまた、徐放系によって適切に投与される。徐放性組成物の適切な例は、成型製品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態における半透過性のポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ、Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、前出）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を含む。徐放性ＣＫα−５ポリペプチド組成物はまた、リポソームに捕捉されたＣＫα−５ポリペプチドを含む。ＣＫα−５ポリペプチドを含むリポソームは、それ自体が公知の方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号、および同４，５４４，５４５号；およびＥＰ１０２，３２４を参照のこと。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）単層型であり、ここで脂質含有率は、約３０モル％コレステロールより多く、選択された部分は、最適なＣＫα−５ポリペプチド治療について調整される。
【０１４４】
非経口投与について、１つの実施態様において、ＣＫα−５ポリペプチドは、一般には、所望の程度の純度で、このポリペプチドを単位用量注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによって処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤およびポリペプチドにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【０１４５】
一般に、処方物は、ＣＫα−５ポリペプチドを、液体キャリアまたは細かく粉砕した固体キャリアまたは両方と、均一にかつしっかりと接触させることによって調製される。次いで、必要である場合、産物は、所望の処方物へと成型される。好ましくは、キャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液を含む。非水性ビヒクル（例えば、不揮発油およびオレイン酸エチル）もまた、本明細書において、リポソームと同様に有用である。
【０１４６】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰＥＧを含む。
【０１４７】
ＣＫα−５ポリペプチドは、代表的に、このようなビヒクル中で約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ約３〜８で処方される。上記の特定の賦形剤、キャリア、または安定化剤の使用は、ＣＫα−５ポリペプチド塩の形成をもたらすことが理解される。
【０１４８】
治療的な投与について使用されるＣＫα−５ポリペプチドは、滅菌されなければならない。滅菌性は、滅菌濾過メンブレン（例えば、０．２ミクロンメンブレン）を通しての濾過により容易に達成される。治療的ＣＫα−５ポリペプチド組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアルへ配置される。
【０１４９】
ＣＫα−５ポリペプチドは、通常、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌバイアルに、５ｍｌの滅菌濾過１％（ｗ／ｖ）水性ＣＫα−５ポリペプチド溶液を満たし、そして得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液を、静菌注射用水を用いて凍結乾燥したＣＫΑ−５ポリペプチドを再構成することによって調製する。
【０１５０】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分を満たした１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的産物または生物学的産物の製造、使用または販売を規制する政府当局によって規定される形式の通知が、このような容器にともなう。この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物とともに使用され得る。
【０１５１】
（アゴニストおよびアンタゴニスト − アッセイおよび分子）
本発明はまた、レセプター分子のようなＣＫα−５結合分子との相互作用のような、細胞に対するＣＫα−５の作用を増強またはブロックする化合物を同定する化合物のスクリーニング方法を提供する。アゴニストは、ＣＫα−５の天然の生物学的機能を増強させるか、またはＣＫα−５と類似する様式で機能する化合物であり、他方、アンタゴニストは、このような機能を減少または消去する。
【０１５２】
この実施態様の別の局面において、本発明は、ＣＫα−５ポリペプチドに特異的に結合するレセプタータンパク質または他のリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提供する。例えば、細胞区画（例えば、メンブレンまたはその調製物）は、ＣＫα−５を結合する分子を発現する細胞から調製され得る。調製物は、標識されたＣＫΑ−５とインキュベートされる。ＣＫΑ−５がレセプターもしくは他の結合タンパク質に結合した複合体は、当該分野で公知の慣用方法に従って単離および特徴づけされる。あるいは、ＣＫΑ−５ポリペプチドは、固体支持体に結合され得、その結果、細胞から可溶化された結合分子は、カラムに結合し、次いで溶出され、そして慣用方法に従って特徴づけされる。
【０１５３】
アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞区画（例えば、メンブレンまたはその調製物）は、ＣＫα−５を結合する分子（例えば、ＣＫα−５によって調節されるシグナル経路または調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。調製物は、ＣＫα−５アゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在または存在下で標識されたＣＫα−５とインキュベートされる。候補物質が結合分子を結合する能力は、標識されたリガンドの結合の減少を反映する。無償に、すなわちＣＫα−５結合分子との結合に対するＣＫα−５の効果を誘導することなく、結合する分子が、おそらく良好なアンタゴニストである。良好に結合し、そしてＣＫα−５と同一または密接に関連する効果を惹起する分子はアゴニストである。
【０１５４】
可能性のあるアゴニストおよびアンタゴニストのＣＫα−５様の効果は、例えば、細胞または適切な細胞調製物と候補分子との相互作用後にセカンドメッセンジャー系の活性を決定すること、およびＣＫα−５またはＣＫα−５と同一の効果を惹起する分子と効果を比較することによって測定され得る。この点に関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系は、ＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解物セカンドメッセンジャー系を含むがこれらに限定されない。
【０１５５】
ＣＫα−５アンタゴニストについてのアッセイの別の例は、ＣＫα−５および可能性のあるアンタゴニストと、メンブレン結合ＣＫα−５レセプター分子または組換えＣＫα−５レセプター分子とを、競合阻害アッセイについて適切な条件下で合わせる競合アッセイである。ＣＫα−５は、レセプター分子に結合したＣＫα−５分子の数を正確に決定して可能性のあるアンタゴニストの有効性を評価し得るように、例えば、放射能で標識され得る。
【０１５６】
可能性のあるアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、それによってその活性を阻害するかまたは消去する、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド、および抗体を含む。可能性のあるアンタゴニストはまた、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド（例えば、結合分子（例えば、レセプター分子）上の同一の部位にＣＫα−５誘導性活性を誘導せずに結合し、それによりＣＫα−５が結合することを排除することによってＣＫα−５の作用を妨害する、密接に関連するタンパク質または抗体）であり得る。
【０１５７】
他の潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス技術を用いて、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して、あるいは三重らせん形成を介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば以下において考察される：Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８）。三重らせん形成は、例えば以下においてに考察される：Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）。この方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計し、それにより、転写およびＣＫα−５の産生を妨害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のＣＫα−５ポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されてＣＫα−５タンパク質の産生を阻害するように細胞へと送達され得る。
【０１５８】
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば上記のような薬学的に受容可能なキャリアとの組成物において使用され得る。
【０１５９】
アンタゴニストは、例えば、特定の自己免疫性および慢性炎症性および感染性疾患における、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）の走化性および活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症、およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニストはまた、単核食細胞の補充および活性化を防ぐことによる、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症を含む感染性疾患の処置に使用され得る。アンタゴニストはまた、好酸球産生および移動を妨げることによって、特発性好酸球増多症候群を処置するために使用され得る。エンドトキシンショックもまた、アンタゴニストによって、マクロファージの移動および本発明のヒトケモカインポリペプチドの産生を妨害することにより処置され得る。このアンタゴニストはまた、動脈壁において単球侵襲を妨害することによってアテローム性硬化症を処置するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、ヒスタミン媒介アレルギー反応および後期アレルギー反応、慢性蕁麻疹、およびアトピー性皮膚炎を含む免疫学的障害を、ケモカイン誘導マスト細胞および好塩基球分解およびヒスタミンの放出を阻害することによって処置するために用いられ得る。ＩｇＥ媒介性アレルギー反応（例えば、アレルギー性喘息、鼻炎、および湿疹）もまた処置され得る。また、アンタゴニストを使用して、創傷領域への単球の誘引を妨害することによって慢性炎症および急性炎症を処置し得る。また、アンタゴニストを使用して、正常な肺マクロファージ集団を調節し得る。なぜなら、慢性炎症性肺疾患および急性炎症性肺疾患は、肺における単核食細胞の分離と関連するからである。また、アンタゴニストを使用して、患者の関節における滑液への単球の誘引を妨害することによって慢性関節リウマチを処置し得る。単球流入および活性は、変性関節症および炎症性関節症の両方の病原において重要な役割を果たしている。このアンタゴニストを使用して、ＩＬ−１およびＴＮＦへ主に寄与する有害なカスケードを妨害し得る。これは、他の炎症性ケモカインの生合成を予防する。このようにして、このアンタゴニストを使用して炎症を予防し得る。また、このアンタゴニストを使用して、ケモカインによって誘発されるプロスタグランジン非依存性の発熱を阻害し得る。また、このアンタゴニストを使用して、骨髄不全（例えば、再生不良性貧血および骨髄形成異常症候群）の症例を処置し得る。また、このアンタゴニストを使用して、肺における好酸球蓄積を妨げることによって喘息およびアレルギーを処置し得る。また、このアンタゴニストを使用して、喘息肺の顕著な特徴である上皮下基底膜線維症を処置し得る。ＣＫα−５に対する抗体を使用して、ＣＫα−５活性に結合しそして阻害して、損傷後に肺への好中球の侵襲を予防することによって、ＡＲＤＳを処置し得る。上記のアンタゴニストのいずれかを、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本明細書以下に記載されるようなもの）との組成物中で使用され得る。
【０１６０】
（遺伝子マッピング）
本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズし得る。さらに、染色体における特定の部位を同定することへの必要性が現在存在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色体位置をマークするのにはほどんと利用可能ではない。本発明に従う染色体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づけることにおいて重要な第一段階である。
【０１６１】
この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中で開示されるｃＤＮＡは、ＣＫα−５タンパク質遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするために用いられる。これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびライブラリーを用いて達成され得る。次いで、この目的のための周知の技術を用いて、インサイチュ染色体マッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。
【０１６２】
さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおいて１より多いエキソンにまたがらず、従って、増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、一工程で、正確な染色体位置を提供し得る。この技術は、５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤＮＡ由来のプローブと共に用いられ得る。（この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。
【０１６３】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例えば、Ｖ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンラインで入手可能である）に見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
【０１６４】
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原因因子である可能性が高い。
【０１６５】
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定として意図されない。
【０１６６】
（実施例）
（実施例１（ａ）：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」ＣＫα−５の発現および精製）
細菌性発現ベクターｐＱＥ６０を、本実施例において、細菌性発現のために使用する（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）。ｐＱＥ６０はアンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，前出から市販されているニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂を使用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合した６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するそのポリペプチドを発現するように、配置される。
【０１６７】
疎水性リーダー配列および膜貫通ドメインを欠くＣＫα−５タンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、ＣＫα−５タンパク質の所望の部分のアミノ末端配列およびｃＤＮＡコード配列の３’に対する寄託された構築物における配列にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたｃＤＮＡクローンから増幅する。ｐＱＥ６０ベクターにおけるクローニングを容易にするために制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’配列に加える。
【０１６８】
成熟タンパク質をクローニングするために、５’プライマーは、下線を付したＮｃｏＩ制限部位を含む、配列５’ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＧＣ３’（配列番号１５）を有する。当業者は、当然ながら、タンパク質コード配列における５’プライマーが開始する点が、タンパク質の成熟形態よりもより短いかまたはより長い完全ＣＫα−５タンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するよう変化させ得ることを認識する。３’プライマーは、下線を付したＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む、配列５’ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣ３’（配列番号１６）を有する。
【０１６９】
増幅されたＣＫα−５ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで消化したＤＮＡを互いに連結する。ＣＫα−５ ＤＮＡの制限されたｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターから下流の、および開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジンコドンにインフレームのＣＫα−５タンパク質コード配列を配置する。
【０１７０】
あるいは、好ましい細菌発現ベクターである、アンピシリン耐性遺伝子を含む「ｐＨＥ４−５」をこの実施例において使用し得る。ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３ベクタープラスミドＤＮＡは、独特の制限酵素部位ＮｄｅＩとＡｓｐ７１８との間の充填インサートを含み、そして、アメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１ Ｐａｒｋ Ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｅｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に、１９９７年９月３０日に寄託し、そして受託番号２０９３１１を付与された。本明細書中で記載されたＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８についての制限酵素部位をそれぞれのプライマーにおいてＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに置換した５’プライマーおよび３’プライマーを使用して、ｐＨＥ４−５へサブクローニングするためのＤＮＡフラグメントをコードする適切なＣＫα−５を増幅し得る。ｐＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３におけるスタッファーＤＮＡインサートは、ＣＫα−５フラグメントのｐＨＥ４−５への連結の前に除去されるべきである。ｐＨＥ４−５は、ほとんどの異種タンパク質の高収量を可能にする強力な細菌プロモーターを含む。
【０１７１】
連結混合液を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９）に記載のような標準的な手順を使用してコンピテントなＥ． ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミドｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性を付与する（「Ｋａｎｒ」））の多コピーを含むＥ． ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書に記載される例示的な実施例を実行するために使用する。ＣＫα−５タンパク質を発現するのに適切な多くの内の１つにすぎないこの株は、ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，前出から市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で生育するそれらの能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、そしてクローン化されたＤＮＡの同一性を、制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０１７２】
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地における液体培養物中で一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて約１：２５〜１：２５０の希釈率で大規模培養物に接種した。細胞を、０．４と０．６との間の６００ｎｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）にまで増殖させる。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加して１ｍＭの最終濃度にし、ｌａｃＩリプレッサーを不活化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３時間から４時間の間引き続きインキュベートする。次いで細胞を遠心分離により採集する。
【０１７３】
次いで細胞を３〜４時間４℃にて、６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８中で撹拌する。細胞細片を遠心分離によって除去し、そしてＣＫα−５を含む上清を、ニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＵＩＡＧＥＮ， ＩＮＣ．，前出から入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高いアフィニティーで結合し、そして簡単な一工程の手順で精製され得る（詳細には、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ， １９９５， ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出を参照のこと）。簡潔には、上清を６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８中でカラムにロードし、カラムを最初に１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８で洗浄し、次いで１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ６で洗浄し、そして最後にＣＫα−５を６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ５で溶出させる。
【０１７４】
次いで精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ Ｎａ−酢酸、ｐＨ ６緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することによって再生させる。あるいは、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に固定されている間に首尾よく再折り畳みし得る。推奨される条件は、以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ７．４中での直線状６Ｍ−１Ｍ尿素グラジエントを用いる再生。再生を１．５時間以上の時間にわたって行うべきである。再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ６緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析工程によって除去する。精製したタンパク質を４℃に保存するか、または−８０℃にて凍結させる。
【０１７５】
以下の代替的な方法は、それが封入体の形態で存在する場合の、Ｅ． ｃｏｌｉにおいて発現されたＣＫα−５を精製するために使用され得る。他に特定されない限り、すべての以下の工程は４〜１０℃で行われる。
【０１７６】
Ｅ． ｃｏｌｉ発酵の生産相の完了に際して、細胞培養物を、４〜１０℃に冷却し、そして細胞を１５，０００ｒｐｍにおける連続的な遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）によって収穫する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予測される収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁液に分散させる。
【０１７７】
次いで、ミクロフルーダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｃｏｒｐ．
またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ， Ｉｎｃ．）に溶液を通過させる（４０００〜６０００ｐｓｉ、２回）ことにより、細胞を溶解させる。次いでホモジネートを、ＮａＣｌ溶液と混合して最終濃度０．５ Ｍ ＮａＣｌにし、その後７０００×ｇで１５分間遠心分離する。生ずるペレットを、再度０．５ Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を用いて洗浄する。
【０１７８】
得られる洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間遠心分離後、ペレットを捨て去り、そしてＣＫα−５ポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートし、さらなるＧｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０１７９】
不溶性粒子を取り除くための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）の後、ＧｕＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と２０容量の５０ｍＭ ナトリウム、ｐＨ ４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液を、激しく撹拌しながら迅速に混合することによって、再折り畳みさせる。再折り畳みした希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合することなく４℃に保つ。
【０１８０】
再折り畳みしたＣＫα−５ポリペプチド溶液を清澄化するために、あらかじめ準備した、適切な表面領域に０．１６μｍメンブレンフィルターを備える、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化した接線流濾過ユニット装置（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過した試料を、陽イオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にロードする。カラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０、で洗浄し、そして同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液中の２８０ｎｍにおける吸光度を、連続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する。
【０１８１】
次いで、ＣＫα−５ポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次いで希釈した試料を、あらかじめ準備した強陰イオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のカラムおよび弱陰イオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のカラムの直列のセットにロードする。カラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いで
ＣＭ−２０カラムを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０〜１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．５の範囲の１０カラム容量の直線状勾配を用いて溶出する。溶出液の一定のＡ280モニタリング下で画分を回収する。次にＣＫα−５ポリペプチドを含む画分（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する）をプールする。
【０１８２】
得られるＣＫα−５ポリペプチドは、上記の再折り畳みおよび精製工程後に９５％より高い純度を示す。５μｇの精製タンパク質をロードする場合に、クマシーブルー染色１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで主要な混在バンドは観察されない。精製したタンパク質は、エンドトキシン／ＬＰＳ混入についてまた試験され、そして代表的にはＬＰＳ含量は、ＬＡＬアッセイに従って０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０１８３】
（実施例２：バキュロウイルス発現系におけるＣＫα−５タンパク質のクローニングおよび発現）
この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を用いて、その天然に付随する分泌シグナル（リーダー）配列を含む、完全タンパク質をコードするクローニングされたＤＮＡを、成熟ＣＫΑ−５タンパク質を発現するためにバキュロウイルスに、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第１５５５号（１９８７）に記載のような標準的な方法を用いて挿入する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８のような都合良い制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミドは、同じ方向で、弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子には、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列が両側に隣接して、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを産生する。
【０１８４】
当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要ならば、シグナルペプチドおよびインフレームＡＵＧを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクターを、上記のベクターの代わりに用い得る（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１）。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９（１９８９）に記載される。
【０１８５】
寄託されたクローン中に、全長ＣＫα−５タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（ＡＵＧ開始コドン、および配列番号２に示される天然に付随するリーダー配列を含む）を、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ制限酵素部位、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（１９８７）に記載されるような真核生物細胞において翻訳の開始のための効率的なシグナルをむ、配列５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＧＣＧＧ３’（配列番号１７）を有する。３’プライマーは、下線を付したＸｂａＩ制限部位を含む、配列５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧＧ３’（配列番号１８）を有する。当業者は、他のプライマーを使用してより短いポリペプチドをコードする核酸フラグメントを生成し得ることを認識する。例えば、上記の５’プライマー（配列番号１９）と、以下の３’プライマーとともに使用して、可溶性細胞外ドメインをコードする核酸フラグメントを増幅し得る：
５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＧＧＣ３’（配列番号１９）。３’プライマーは下線を付したＸｂａＩ部位を含む。
【０１８６】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いて、１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、再度１％アガロースゲル上で精製する。
【０１８７】
このプラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして必要に応じて、当該分野で公知の慣用技術を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いて１％アガロースゲルから単離する。
【０１８８】
フラグメントおよび脱リン酸化プラスミドを一緒に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合物で形質転換し、そして培養プレートに塗布する。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化すること、次いでゲル電気泳動による消化産物の分析によってヒトＣＫα−５遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローニングされたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中で、ｐＡ２ＧＰＣＫα−５と称する。
【０１８９】
５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰＣＫα−５を、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）によって記載されたリポフェクション法を用いて、１．０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰＣＫα−５を、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートする。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで培養を、２７℃で４日間継続する。
【０１９０】
４日後、上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出に記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用いて、青色染色されたプラークを生じるｇａｌ発現クローンの簡素な同定および単離を可能にする。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーション後、青色染色されたプラークをマイクロピペッター（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を用いて、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に感染させる。例えば制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０１９１】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ
Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０１９２】
（実施例４：ＣＫα−５ ｍＲＮＡ発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を、とりわけ上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される方法を用いて行って、ヒト組織におけるＣＫα−５遺伝子発現の調査を実施する。ＣＫα−５タンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って使用して32Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って使用して精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をＣＫα−５ ｍＲＮＡについて調べる。
【０１９３】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含むＭｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って使用し標識化プローブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝し、そして標準的な手順に従って、フィルムを現像する。
【０１９４】
本発明は前述の詳細な説明および実施例に特に記載されたものとは他の方法で実施され得ることが明らかである。本発明の多数の改変および変更は、上述の教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。
【０１９５】
本明細書中に引用した全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌論文、実験室マニュアル、本、または他の文書を含む）の全ての開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０１９６】
さらに、本明細書とともに提出したハードコピーおよびその電子的形態での配列表は、両方とも本明細書において参考として援用される。
マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
【０１９７】
発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ４３８−４４７（１９８５））およびＣＭＶエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル化シグナル、および終結シグナルを含む。
【０１９８】
（実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現）
発現プラスミドｐＣＫα−５ＨＡを、ＣＫα−５タンパク質の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡの一部を発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．から入手し得る）へクローニングすることによって作製する。
【０１９９】
発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物細胞における増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡが都合良くＣＭＶプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位によってＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得るように配置された、赤血球凝集素フラグメントをコードするいくつかのコドン（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）に続く終止コドンおよびポリアデニル化シグナル。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを認識する抗体を用いた、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。ｐｃＤＮＡＩＩＩはさらに、選択可能なネオマイシンマーカーを含む。
【０２００】
ＣＫα−５ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを、組換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによって指向されるように、ベクターのポリリンカー領域にクローン化する。プラスミド構築戦略は、以下のとおりである。寄託されたクローンのＣＫα−５ ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＫα−５発現のためのベクターの構築について先に記載されるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。適切なプライマーは、以下の本実施例に使用されたプライマーを含む。５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ部位、コザック配列、およびＡＵＧ開始コドンを含み、以下の配列を有する：配列５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＧＣＧＧ３’（配列番号１７）を有する。３’プライマーは、下線を付したＸｂａＩを含み、以下の配列５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧＧ３’（配列番号１９）を有する。
【０２０１】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで連結する。連結混合物で、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １１０９９ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７より入手可能）に形質転換し、そして形質転換培養物を、アンピシリン培地プレートへプレーティングし、次いで、インキュベートしてアンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、そしてＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするフラグメントの存在について制限分析または他の手段によって試験する。
【０２０２】
組換えＣＫα−５の発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載のようにＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを用いて、上記のように発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるＣＫα−５の発現のための条件下でインキュベートする。
【０２０３】
ＣＫα−５−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗら， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、35Ｓ−システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細胞および培地を採取し、そして細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎら（上記に引用される）に記載されるように界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５で溶解する。タンパク質を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次いで、沈降されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において観察され、これはネガティブコントロールにおいては見られない。
【０２０４】
（実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現）
本実施例において、ベクターｐＣ４を、ＣＫα−５ポリペプチドの発現のために使用する。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされているジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に考証されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ． １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １０９７：１０７−１４３；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ． １９９１， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子と連鎖する場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれると、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。
【０２０５】
プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９８５：４３８−４４７）の長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵素切断部位が存在する：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）もまた、発現のために使用され得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系および類似する系は、哺乳動物細胞において調節された方法でＣＫα−５ポリペプチドを発現するために使用され得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ． １９９２， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来）も、同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）との同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初は、１つより多い選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を使用することが、有利である。
【０２０６】
プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼを用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単離する。
【０２０７】
ＣＫα−５ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を、遺伝子の所望の部分の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’プライマーおよび３’プライマーは、上記の実施例３（ａ）において使用されたものと同一である。
【０２０８】
増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼであるＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
【０２０９】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペトリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２１０】
（実施例４：ＣＫα−５ ｍＲＮＡ発現の組織分布）
ノーザンブロット分析を、とりわけ上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載される方法を用いて行って、ヒト組織におけるＣＫα−５遺伝子発現の調査を実施する。ＣＫα−５タンパク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って使用して32Ｐで標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って使用して精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をＣＫα−５ ｍＲＮＡについて調べる。
【０２１１】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含むＭｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って使用し標識化プローブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマウントし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝し、そして標準的な手順に従って、フィルムを現像する。
【０２１２】
本発明は前述の詳細な説明および実施例に特に記載されたものとは他の方法で実施され得ることが明らかである。本発明の多数の改変および変更は、上述の教示に照らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲の範囲内である。
【０２１３】
本明細書中に引用した全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌論文、実験室マニュアル、本、または他の文書を含む）の全ての開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０２１４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、ＣＫα−５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約２７アミノ酸の推定リーダー配列に下線を付す。図１のリーダー配列の開始メチオニン残基は、位置番号＋１で示され、これに対し配列番号２の対応する配列中のリーダー位置は、負の位置番号で称されることに注意のこと。従って、図１のリーダー配列１〜２７位は、配列番号２の−２７〜−１位に対応する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｃは、ＣＫα−５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約２７アミノ酸の推定リーダー配列に下線を付す。図１のリーダー配列の開始メチオニン残基は、位置番号＋１で示され、これに対し配列番号２の対応する配列中のリーダー位置は、負の位置番号で称されることに注意のこと。従って、図１のリーダー配列１〜２７位は、配列番号２の−２７〜−１位に対応する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｃは、ＣＫα−５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。約２７アミノ酸の推定リーダー配列に下線を付す。図１のリーダー配列の開始メチオニン残基は、位置番号＋１で示され、これに対し配列番号２の対応する配列中のリーダー位置は、負の位置番号で称されることに注意のこと。従って、図１のリーダー配列１〜２７位は、配列番号２の−２７〜−１位に対応する。
【図２】図２は、Ｂｅｓｔｆｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７１１）によってデフォールトパラメーターを用いて決定した、ＣＫα−５タンパク質と、ＭＩＰ１−βに関するラットｍＲＮＡの翻訳産物（配列番号３）とのアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。
【図３】図３は、ＣＫα−５アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標、および表面確率が示されている。「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」のグラフにおいて、正のピークは、ＣＫα−５タンパク質の高度に抗原性の領域（すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域）の位置を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含有する単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２の残基−２７〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全長ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【請求項１】
以下からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含有する単離されたポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２の残基−２７〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基−２６〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２の残基１〜２２７をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基１〜１７８をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる完全長ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号２０９２３１に含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−９４８６３（Ｐ２００６−９４８６３Ａ）
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３４６２０（Ｐ２００５−３３４６２０）
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【分割の表示】特願２０００−５２２２２０（Ｐ２０００−５２２２２０）の分割
【原出願日】平成１０年１１月１８日（１９９８．１１．１８）
【出願人】（５９７０１８３８１）ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド (44)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９４１０ Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１８日（２００５．１１．１８）
【分割の表示】特願２０００−５２２２２０（Ｐ２０００−５２２２２０）の分割
【原出願日】平成１０年１１月１８日（１９９８．１１．１８）
【出願人】（５９７０１８３８１）ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド (44)
【氏名又は名称原語表記】Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９４１０ Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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