ケラチン含有医療デバイスのための生物活性コーティング
【課題】ケラチンを含有する保護コーティングを含む医療デバイス（およびこの医療デバイスを作製する方法）を提供する。
【解決手段】この保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。この結合領域は、基材表面に結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含み、この生物活性領域は、ケラチンの反応性ペンダント基に結合した有機成分を含む。医療デバイスは、好ましくは、組織工学構成、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される。
【解決手段】この保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。この結合領域は、基材表面に結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含み、この生物活性領域は、ケラチンの反応性ペンダント基に結合した有機成分を含む。医療デバイスは、好ましくは、組織工学構成、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、係属中の米国仮出願番号６０／３３９，０３９（２００２年７月２５日出願）
に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本願は、医療デバイスのためのコーティングに関し、好ましくは、医療移植片のための
コーティングに関する。より具体的には、本願は、生物活性コーティングに関し、好まし
くは、骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）特性を有するケラチンを含む生物活性コ
ーティングに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
医療デバイス表面を保護する目的で、多くの異なる型のコーティングが開発されている
。コラーゲン、ヒドロキシアパタイトおよびより最近には、いわゆるＲＧＤペプチドの全
てが、整形外科移植片適用におけるコーティングとして研究されている。これらの物質全
ては、少なくとも骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）であると示されているが
、骨誘導性であるとは示されていない。骨誘導特性を有し、ヒト免疫系から移植片をマス
クし得る保護コーティングが必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（簡単な要旨）
本願は、ケラチンを含有する保護コーティングを含む医療移植片を提供する。この保護
コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。前記結合領域は、前記基材表面に
結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含む。この生物活性領域
は、ケラチンの反応性ペンダント基（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｅｎｄａｎｔ ｇｒｏｕｐ）
に結合した前記有機シランの有機成分を含む。
【０００５】
（詳細な要旨）
本願は、ケラチンを含有する保護コーティングを含む基材を提供する。好ましい実施形
態において、この保護コーティングは、骨誘導特性を含む。さらに好ましい実施形態にお
いて、この保護コーティングは、骨伝導特性と骨誘導特性の両方を含む。
【０００６】
この基材は、好ましくは、医療デバイス上に存在し、さらに好ましくは、医療移植片上
に存在する。この医療デバイスは、好ましくは、組織工学構造物、整形外科移植片、歯科
移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される。
【０００７】
この基材は、生体適合性物質を含む。この生体適合性物質は、好ましくは、シリコン、
金属、合金およびセラミックからなる群から選択される。好ましい金属は、チタンを含み
、そして、チタン金属またはその合金であり得る。好ましいセラミックは、ヒドロキシア
パタイトを含む。
【０００８】
好ましい実施形態において、保護コーティングは、ケラチンならびに骨形成タンパク質
（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択さ
れる１つ以上の生物活性因子を含む。このケラチンは、毛髪、毛皮、羽毛、角、蹄、嘴ま
たは足からなる群から選択される物質由来である。ケラチンは、好ましくは、毛髪由来で
あり、より好ましくはヒト毛髪由来であり、これは、「ヒト毛髪ケラチン」と呼ばれ得る
。ケラチンはまた、好ましくは、還元ケラチンを含む。
【０００９】
好ましくは、この保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。この結合
領域は、移植片表面の結合とケラチン上の反応性ペンダント基の結合の両方に適合される
物質を含む。好ましくは、この結合領域は、少なくとも１つのシラン化合物を含み、さら
に好ましくは、有機シランを含む。
【００１０】
好ましくは、この有機シランは、シラン成分および有機成分を含む。この結合領域は、
医療デバイス表面に結合したシラン成分を含み、そしてこの生物活性領域は、有機シラン
の有機成分に結合したケラチンを含む。この有機シランについて適切な有機成分は、ケラ
チン上の反応性ペンダント基との反応に適合される。好ましくは、この有機シランは、
エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル
基からなる群から選択される部分を含む有機成分を含む。好ましい有機成分は、エポキシ
基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む。さら
に好ましい有機成分は、エポキシ基、アクリレート基、アルコキシ基、ビニル基およびア
ルキルアミン基からなる群から選択される。最も好ましい有機部分は、ビニル基およびエ
ポキシ基からなる群から選択される。好ましくは、この有機シランは、約１個〜３個のハ
ロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む。好ま
しいハロゲンは、塩素である。
【００１１】
また、基材を保護基材でコーティングする方法を、提供する。この方法は、以下：前記
基材とカップリング物質を結合して結合領域を生成する工程；および前記結合領域とケラ
チンを結合する工程を包含する。さらに好ましくは、この方法は、前記基材とカップリン
グ物質を結合する前に、この基材表面を酸化する工程を包含する。
【００１２】
好ましい実施形態において、この基材とカップリング物質を結合する前に、この基材を
洗浄する。さらに好ましくは、この洗浄工程は、無水溶媒中での超音波処理および水中で
の超音波処理を包含する。適切な無水溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロピル
アルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランが挙げられるが
、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジクロロメタンである。好まし
くは、水は、脱イオン水である。
【００１３】
前記結合領域にケラチンを結合させる工程は、適切な溶媒にケラチンを溶解して、無水
溶媒を添加してケラチン混合物を生成する工程、前記ケラチン混合物に前記結合領域を曝
露する工程；そして前記生物活性領域を生成するのに有効な条件下で硬化させる工程を包
含する。
【００１４】
還元／還元ケラチンについて、適切な溶媒は、水である。酸化／還元ケラチンについて
、適切な溶媒は、塩基含有水溶液を含む。適切な塩基には、水酸化アンモニウム、水酸化
ナトリウムおよび／または水酸化カリウムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されな
い。好ましい塩基は、水酸化アンモニウムである。
【００１５】
適切な無水溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルス
ルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定
されない。好ましい無水溶媒は、ジメチルスルホキシドである。
【００１６】
この方法は、触媒および開始剤からなる群から選択される試薬とケラチン混合物とを混
合する工程を包含する。ビニル官能化シランカップリング剤を使用する場合、適切な開始
剤または触媒は、フリーラジカルを生成する。好ましいフリーラジカル開始剤は、アント
ラキノン−２−スルホン酸またはアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物
（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からなる群から選択される。
【００１７】
硬化は、このケラチン混合物に曝露される基材を、このコーティングを硬化させるのに
十分な期間にわたって有効なエネルギー供給源に曝露する工程を包含する。好ましくは、
この硬化は、前記触媒または前記開始剤の存在下で生じる。この硬化期間は、代表的には
、約１時間〜約２４時間であり、好ましくは約２４時間である。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
医療デバイスであって、以下：
ケラチンを含む保護コーティングを含む基材であって、該保護コーティングは、結合領
域および生物活性領域を含む、基材；
該基材の表面に結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含む該
結合領域；および
該ケラチンの反応性ペンダント基に結合した該有機シランの有機成分を含む該生物活性
領域
を含む、医療デバイス。
（項目２）
項目１に記載の医療デバイスであって、前記有機シラン化合物の前記シラン成分が、前記基材の表面と共有結合している、医療デバイス。
（項目３）
項目２に記載の医療デバイスであって、前記生物活性領域が、前記有機シラン化合物の前記シラン成分に共有結合した前記ケラチンの反応性ペンダント基を含む、医療デバイス。
（項目４）
項目１に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞によって示される骨マトリクス形成を増加させるのに有効である、医療デバイス。
（項目５）
組織工学構築物、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される、項目３に記載の医療デバイス。
（項目６）
組織工学構築物、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される、項目４に記載の医療デバイス。
（項目７）
医療移植片を含む、項目１に記載の医療デバイス。
（項目８）
医療移植片を含む、項目３に記載の医療デバイス。
（項目９）
医療移植片を含む、項目４に記載の医療デバイス。
（項目１０）
医療移植片を含む、項目５に記載の医療デバイス。
（項目１１）
医療移植片を含む、項目６に記載の医療デバイス。
（項目１２）
項目１に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１３）
項目７に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１４）
項目８に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１５）
項目９に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１６）
項目１０に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１７）
項目１１に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１８）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目１９）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２０）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目２１）
項目１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２２）
項目１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２３）
項目１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目２４）
項目１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２５）
項目１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２６）
項目１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目２７）
項目１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２８）
項目１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２９）
項目１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目３０）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目３１）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目３２）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目３３）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療デバイス。
（項目３４）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療デバイス。
（項目３５）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、毛髪、毛皮、羽毛、角、蹄、嘴および足からなる群から選択される物質由来である、医療デバイス。
（項目３６）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、毛髪由来である、医療デバイス。
（項目３７）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、ヒトの毛髪ケラチンである、医療デバイス。
（項目３８）
項目３５に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
（項目３９）
項目３６に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
（項目４０）
項目３７に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
（項目４１）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４２）
項目３５のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４３）
項目３６いずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４４）
項目３９に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４５）
項目４０に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４６）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目４７）
項目４１に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目４８）
項目４４に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目４９）
項目４３に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目５０）
項目４５に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目５１）
医療移植片を含む、項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイス。
（項目５２）
医療移植片を含む、項目４１に記載の医療デバイス。
（項目５３）
医療移植片を含む、項目４３に記載の医療デバイス。
（項目５４）
医療移植片を含む、項目４４に記載の医療デバイス。
（項目５５）
医療移植片を含む、項目４５に記載の医療デバイス。
（項目５６）
医療移植片を含む、項目４６に記載の医療デバイス。
（項目５７）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目５８）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目５９）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目６０）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目６１）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６２）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６３）
項目６２に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目６４）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６５）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６６）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６７）
項目６６に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目６８）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６９）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７０）
項目３４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７１）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目７２）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７３）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７４）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７５）
項目７４に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目７６）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７７）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７８）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７９）
項目７８に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目８０）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８１）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８２）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８３）
項目８２に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目８４）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８５）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８６）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８７）
項目８６に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目８８）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８９）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９０）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９１）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９２）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９３）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９４）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９５）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９６）
項目８８に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９７）
保護コーティングを用いて医療デバイスをコーティングする方法であって、該方法が、以下：
結合領域を生成する該医療デバイスの１つ以上の表面にカップリング剤を結合させる工程；および
該結合領域にケラチンを結合させる工程
を包含する、方法。
（項目９８）
項目９７に記載の方法であって、前記結合領域にケラチンを結合させる工程が、以下：
溶媒にケラチンを溶解する工程；および
ケラチン混合物を生成するために、第２の無水溶媒を添加する工程；
該ケラチン混合物に該結合領域を曝露し、ケラチンコーティング結合領域を生成する工程；および
前記生物活性領域を生成するのに有効な条件下で、該ケラチンコーティング結合領域を硬化する工程を包含する、方法。
（項目９９）
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を洗浄する工程をさらに包含する、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を酸化する工程をさらに包含する、項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を酸化する工程をさらに包含する、項目９９に記載の方法。
（項目１０２）
項目９９に記載の方法であって、前記洗浄工程が、最初に無水溶媒中で、前記１つ以上の表面に超音波処理し、そして該１つ以上の表面を水中で超音波処理する工程を包含する、方法。
（項目１０３）
項目１０２に記載の方法であって、前記第１の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１０４）
項目１０２に記載の方法であって、前記最初の無粋溶媒が、ジクロロメタンである、方法。
（項目１０５）
項目１０１に記載の方法であって、前記洗浄が、最初に無水溶媒で、前記１つ以上の表面に超音波をあて、そして前記１つ以上の表面を水で超音波処理する工程を包含する、方法。
（項目１０６）
項目１０５に記載の方法であって、前記第１の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１０７）
項目１０６に記載の方法であって、前記最初の無粋溶媒が、ジクロロメタンである、方法。
（項目１０８）
項目１０５に記載の方法であって、前記水が、脱イオン水である、方法。
（項目１０９）
項目１０７に記載の方法であって、前記水が、脱イオン水である、方法。
（項目１１０）
項目１０９に記載の方法であって、前記ケラチンが、還元／還元ケラチンである場合、前記溶媒が水である、方法。
（項目１１１）
項目１０９に記載の方法であって、前記ケラチンが、酸化／還元ケラチンである場合、前記溶媒が塩基含有水溶液を含む、方法。
（項目１１２）
項目１１１に記載の方法であって、前記塩基が、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（項目１１３）
項目１１１に記載の方法であって、前記塩基が、水酸化アンモニウムである、方法。（項目１１４）
項目９８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１１５）
項目９８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
（項目１１６）
項目１０５に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１１７）
項目１０５に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
（項目１１８）
項目１０７に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１１９）
項目１１８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
（項目１２０）
触媒およびインヒビターからなる群から選択される活性化剤と前記ケラチン混合物を混合する工程をさらに包含する、項目９９〜１１８および項目１１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２１）
項目１２０に記載の方法であって、前記活性化剤が、ビニル官能化シランであり、そして該活性化剤が、フリーラジカルを生成するのに有効である、方法。
（項目１２２）
項目１２１に記載の方法であって、前記活性化剤が、アントラキノン−２−スルホン酸を含む、方法。
（項目１２３）
項目９８に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２４）
項目１２０に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２５）
項目１２１に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２６）
項目１２２に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２７）
項目１２３に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
（項目１２８）
項目１２４に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の方法を包含する、方法。
（項目１２９）
項目１２５に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
（項目１３０）
項目１２６に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
（項目１３１）
項目１２３に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３２）
項目１２６に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３３）
項目１２７に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３４）
項目１３０に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３５）
項目１２６に記載の方法であって、前記期間が、約２４時間である、方法。
（項目１３６）
項目１３０に記載の方法であって、前記期間が、約２４時間である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ケラチンコーティングされたチタンディスクの水接触角を示すグラフであり、これは、本願の工程に供されたディスク（シランコーティングに続いてケラチンを接合させたディスク）が、得られる最も低い接触角を有したことを説明する。
【図２】図２は、チタンとガラスの両方が、浸漬プロセスを使用して効率的にコーティングされることを示すケラチンコーティングされた基材の水接触角を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、非処理のチタンディスクとシランコーティングディスクとの間のＸＰＳスペクトル（Ｓｉ２ｐ スペクトル）を比較するチャートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、非処理のチタンディスクと生理食塩水、触媒およびケラチンで処理されたディスクとの間のＸＰＳスペクトル（Ｎ１ｓ スペクトル）を比較するチャートである。
【図４】図４は、ケラチンコーティングされたチタンディスクのＳｉおよびＮ ＸＰＳ原子濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、推定されたチタンディスク上コーティングの厚さであり、ここで、括弧内の数字は、シランコーティング上フィルムの厚さを示す。
【図６】図６は、２Ｔ３細胞が、ケラチンコーティングされたチタンディスクに付着し、そして分化することを示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（詳細な説明）
ケラチンは、傷害または損傷なしで容易に提供され得るヒトタンパク質の、唯一ではな
いにしても数少ないファミリーの１つである。この独特の構造タンパク質のファミリーは
、非常に多くの脊椎動物組織において見出され得、最も著しくは毛髪および毛皮において
見出され得る。何百トンというヒト毛髪が、毎日破棄されている。１００以上の相同体を
有するファミリーのように、ケラチンの生体適合性は、その構造改変体によって予め決定
される。どのヒトタンパク質も、この程度の構造および組成の多様性を示さず、それゆえ
、免疫系による耐性を示さない。
【００２０】
本願は、ヒト毛髪繊維からケラチンを選択的に抽出し、医療デバイス物質（例えば、金
属およびセラミック）表面上に分子コーティングを生成する浸漬プロセスにおいて、この
ケラチンを使用する。この方法は、この移植片表面とケラチン上の反応性ペンダント基の
両方に結合するのに適合したカップリング剤を使用する。好ましくは、この結合領域は、
少なくとも１つのシラン化合物を含み、さらに好ましくは、有機シランを含む。好ましく
は、この有機シランは、シラン成分および有機成分を含み、ここでこの結合領域は、医療
デバイス表面に結合したシラン成分およびケラチン上の反応性部分と結合した有機成分を
含む。好ましい実施形態において、この有機シランのシラン成分は、医療デバイス表面と
共有結合しており、この有機シランの有機成分はケラチン上の反応性部分と共有結合して
いる。
【００２１】
水接触角およびＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によるこれらのコーティングの特性決定か
ら、非常に異なった表面特性が示された。このオングストロームの薄さのケラチンコーテ
ィングは、頑強であり、そしてグリットブラストされたチタンディスクの標準形態の妨げ
にはならなかった。これらの表面特性は、培養中のケラチンコーティングされたチタンデ
ィスク上の２Ｔ３マウス骨芽細胞の付着、増殖および分化につながることが示された。
【００２２】
一般的に、このコーティング方法は、代表的には、金属およびセラミック表面を有する
医療デバイス物質に、適用可能である。このコーティング方法は、宿主の受容性を促進し
て、そして／または組織増殖を加速する、より生体適合性の界面を生成して、最終的には
、生物学的に活性な表面を生成する能力を有する。
【００２３】
（ケラチン）
ヒト毛髪は、角質として知られる鱗状の重なった形に配置される扁平細胞からなる剛健
な管状外層から構成される。この毛髪の内部バルクは、皮質として知られており、繊維状
ケラチンにより高密度に充填された細長い細胞から構成されている。α−ヘリカルケラチ
ンのミクロフィブリルコイルドコイルを含む、この繊維状ケラチンは、束状に配置され、
マクロフィブリルと呼ばれる。この構造の中間フィラメント（ＩＦ）は、非晶質ケラチン
マトリックス物質と一緒に結合している。このマトリックスおよびＩＦは、機能および組
成において異なる。このマトリックスは、ＩＦを一緒に維持する「接着剤」である。この
接着剤は、硫黄含量が高く、低分子量ケラチン（ＬＭＷＫ）（代表的には、１０〜１５ｋ
Ｄａ未満）からなる。このＩＦは、相対的に低い硫黄含量ではあるが、高分子量のケラチ
ン（高分子量ケラチンすなわちＨＭＷＫ）を含み、ほぼ５０〜８５ｋＤａである。
【００２４】
ケラチンの１つの際立った特徴は、ポリペプチド鎖の３次元ネットワークを形成するジ
スルフィド架橋の存在により、ケラチンに、大部分において構造の完全性を与える。この
ネットワーク構造は、ケラチンが不溶性であることを示す。しかしながら、ケラチンは、
ジスルフィド結合切断を介する３次元構造の破壊により、可溶性になり得る。ジスルフィ
ド結合切断は、酸化的、還元的に行なわれるか、またはこの２つの組み合わせによって行
なわれ得る。
【００２５】
制御された条件下でのジスルフィド結合切断および選択的抽出により、ＨＭＷＫからＬ
ＭＷＫが単離される。このプロセスは、角質をばらばらにすることなく皮質タンパク質を
取り外すのに用いる。毛髪繊維の内部構造を、角質に対して実質的な障害を与えずに取り
外す。この抽出プロセスによるＨＭＷＫは、ゲル電気泳動により、分子量６６ｋＤａおよ
び４３ｋＤａで２つの広いタンパク質バンドを生じる。これらのケラチンは、構造的生体
適合性物質（セラミックおよび金属表面のコーティングを含む）として有用である。
【００２６】
成長因子（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子
β（ＴＧＦ−β））は、毛髪濾胞に存在し、コーティングにより送達可能であり、このコ
ーティングに骨誘導性および骨伝導性の特性を提供する。
【００２７】
ケラチンは、一般的に、式：
【００２８】
【化１】
を有するアミノ酸を含む。表１は、例えば、ヒト毛髪に見出されるアミノ酸残基を要約し
、各残基に対応する「Ｒ１」基を示す。
【００２９】
【表１−１】
【００３０】
【表１−２】
ヒト毛髪における最も多いアミノ酸は、システインであり、これは、ジスルフィド架橋
されたシステイン基の形態で見出される。上に議論したように、この基は、他の硫黄含有
部分（最も著しくは、チオール）に変換され得る。チオールは、以下に記載されるような
多くの化学技術を使用してカップリング物質の反応性末端と反応し得る：Ｓ．Ｐａｔａｉ
（Ｅｄ．），ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｏｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｐ
ａｒｔｓ １ ａｎｄ ２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ
（１９７４）（これは、本明細書中で参考として援用される）。他の反応シナリオ（例え
ば、ポリマー合成に関するもの）はまた、チオールを利用して所望の架橋の組み合わせを
形成するのに役立つ（例えば、これは、Ｒｅｍｐｐ，Ｐ．およびＭｅｒｒｉｌｌ，Ｅ．Ｗ
．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｈｕｅｔｈｉｎｇ＆Ｗｅｐｆ Ｖｅｒｌａｇ
Ｂａｓｅｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８６）；Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．
Ｊ．ａｎｄ Ｌｏｖｅｌｌ，Ｐ．Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１）；Ｏｄｉａｎ，Ｇ．，Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）に記載され、本明細書中で参考として援用さ
れる）。
【００３１】
システインに加えて、以下のアミノ酸は、反応性ペンダント基として有用であり得る、
窒素または酸素を含むペンダント基を有する；アルギニン、セリン、グルタミン酸、スレ
オニン、アスパラギン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファ
ンおよびヒスチジン。タンパク質が、α−ケラチンである場合、架橋のための反応性ペン
ダント基を含む好ましいアミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリンおよびグルタ
ミン酸であり、最も好ましくは、シスチンおよびアルギニンである。
【００３２】
（ジスルフィド結合切断およびケラチン抽出）
ケラチンは、多くの方法でプロセシングされ得、および／または単離され得る。好まし
くは、このプロセシングは、得られるタンパク質を水溶性にするのに十分である。適切な
プロセシング技術としては、プロセシングが、ペプチド結合の有意な加水分解なしにタン
パク質を水溶性にする限り、公知の酸化技術、還元技術、および／またはそれらの組み合
わせが挙げられる。
【００３３】
多くの還元化学は、ケラチンのジスルフィド結合切断について公知である：Ｗａｒｄｅ
ｌｌ，Ｊ．Ｌ．，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏｌｓ」ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｏｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｐａｔａｉ，Ｓ．（Ｅｄｉｔｏｒ）
，ｐｐ．１６３−３５３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ
Ｙ（１９７４）を参照のこと。これは、本明細書中で参考として援用される。ＨＭＷＫは
、少なくとも２つの還元性抽出を使用して毛髪から抽出され得る（例えば、Ｃｒｅｗｔｈ
ｅｒ，Ｗ．Ｇ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｂ．，Ｌｅｎｎｏｘ，Ｆ．Ｇ．，ａｎｄ Ｌｉ
ｎｄｌｅｙ，Ｈ．，「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｋｅｒａｔｉｎｓ」Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．，
Ｊｒ．，Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｊ．Ｔ．，およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ
．Ｍ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．
１９１−３４６（１９９５）に記載され、本明細書中に参考として援用される）。
【００３４】
以下の方法は、コーティングを作製する際に使用するため、ケラチンをプロセシングす
るのに適している：
（−酸化／還元）
ケラチンを供給源物質（例えば、ヒト毛髪）として使用する好ましい実施形態において
、毛髪を、適切な酸化剤により酸化する。適切な酸化剤としては、過酸化水素、過酢酸、
過カルボン酸、過硫酸、二酸化塩素、ナトリウム過酸化物およびカルシウム過酸化物、過
ホウ酸塩ならびに次亜塩素酸塩が、挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。最も
好ましい酸化剤は、過酸化水素である。このオキシダントを、約３５％までの濃度で、好
ましくは、約０．１％〜約１０％の濃度で使用する。この酸化は好ましくは、還流温度で
生じる。
【００３５】
好ましい実施形態において、角質をばらばらにして、ケラチン供給源物質を増やすため
に、毛髪は、約０．１％〜約１０％の濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を用いて処理される
。このプロセスはまた、幾つかのシスチン残基の分画を硫酸基に変換する。他の酸化反応
条件を一定に保持したままで、酸化時間を変えることにより、好ましくは、約０時間〜約
４時間で、酸化量を制御し得る。これらの条件としては、オキシダントの濃度および型、
温度、ならびに抽出培地とケラチン供給源物質との比が挙げられる。反応が完了した後、
酸化した毛髪を濾過して、好ましくは脱イオン水を用いてリンスする。この濾液を破棄し
、毛髪を乾燥させた。
【００３６】
他の酸化の条件が一定に維持される場合、シスチンの硫酸残基への変換速度は、酸化に
使用された時間量に大まかに比例している。得られる酸化ケラチン固体中の残留シスチン
を、還元技術を使用して硫黄を含む他の部分に変換する。好ましくは、ジスルフィド架橋
されるシスチン基を、それ自体で有用であるか、または種々の化学技術を使用して改変さ
れ得るチオール基に変換する。
【００３７】
酸化された毛髪を、好ましくは還元剤で処理する。適切な還元剤としては、チオグリコ
ール酸およびその塩、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、
チオ乳酸、グルタチオン、システイン、硫化ナトリウムならびに硫化水素ナトリウムが挙
げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい還元剤は、チオグリコール酸およ
びメルカプトエタノールであり、最も好ましくは、チオグリコール酸である。
【００３８】
酸化した毛髪を、還元剤で処理するために、予め酸化した毛髪を、代表的には約１０Ｎ
までの濃度、好ましくは、約０．１Ｎ〜１Ｎの濃度の還元剤；約７より大きいｐＨ、好ま
しくは、ｐＨ９以上、最も好ましくは、ｐＨ９で；約２５℃〜約８０℃の温度、好ましく
は、約６０℃の温度にて、好ましくは、約１時間〜約７２時間かけて、最も好ましくは、
約２４時間かけて懸濁する。この反応は、不活性雰囲気、好ましくは窒素下で生じる。こ
の液体分画を、公知の方法（例えば、濾過もしくはカニュレーションおよび／または遠心
分離が挙げられ、必ずしもこれらに限定はされず、好ましくは、不活性雰囲気下である）
を使用して、残りの固体から分離する。好ましい分離方法は、濾過である。一旦、この固
体を除去すると、可溶性ケラチンタンパク質は、水混和性非溶媒の添加またはスプレー乾
燥により、この溶液から分離される。水混和性非溶媒には、エタノール、メタノール、イ
ソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられるが、
必ずしもこれらに限定されず、この場合も不活性雰囲気下である。好ましい非溶媒は、エ
タノールである。沈殿物を、公知の技術を使用して、好ましくは、濾過および非溶媒のさ
らなるアリコートを使用するリンスによって、非溶媒から分離する。得られたケラチンタ
ンパク質を、公知の技術を使用して、好ましくは、室温にて一晩減圧下で乾燥させる。こ
のプロセスは、スルホン酸基およびチオール基の両方を有するケラチンを生じる。
【００３９】
最も好ましい反応において、清浄な乾燥したヒト毛髪を、過酸化水素を用いて、加熱し
ながら、好ましくは還流で、ジスルフィド結合を切断するのに有効な期間、代表的には、
約１８０分間かけて処理する。この毛髪を、好ましくは、濾過によって液体から分離し、
溶液を廃棄した。毛髪を、好ましくは、大量の水でリンスし、風乾させた。次いで、この
乾燥させた酸化毛髪を、還元剤、好ましくは、ｐＨ９（水酸化アンモニウムで調整する）
の１Ｍ チオグリコール酸を用いてで処理し、この混合物を、不活性ガス、好ましくは、
窒素雰囲気下で、一定の時間、好ましくは２４時間かけて、好ましくは約６０℃まで加熱
する。還元性抽出後、この固体を、好ましくは、遠心分離により溶液から分離する。この
濾過した液体を、過剰のエタノール、好ましくは、約８倍量過剰のエタノールに、添加、
好ましくは滴下し、それによりケラチン沈殿物を形成させる。この沈殿したケラチンを、
濾過により分離し、減圧下で乾燥する。乳鉢および乳棒を使用して、ケラチンを微粉末に
挽く。
【００４０】
（還元／還元抽出）
別の実施形態において、選択的にマトリックスケラチンを抽出するのに有効な第１の条
件下で、第１の還元剤を用いて毛髪を処理して、可溶性の還元マトリックスケラチン（Ｌ
ＭＷＫ）を含む第１の溶液を生成し、そして毛髪固体（ＨＭＷＫ）を維持することにより
、第１の還元性抽出を行う。ＬＭＷＫを本明細書中に記載の技術に供して、コーティング
を生成し得るが、本明細書中の技術における用途に好ましいタンパク質は、ＨＭＷＫであ
り、これは、好ましくは、２回目の抽出の間に単離される。残りの毛髪固体および第１の
溶液を分離して、この残りの毛髪固体を、α−ケラチンを可溶化するのに有効な第２の条
件下で、可溶性の還元α−ケラチン（ＨＭＷＫ）および固体角質を含む第２の溶液を生成
して、２回目の抽出溶液に曝露する。
【００４１】
適切な還元剤としては、この場合も、チオグリコール酸およびその塩、メルカプトエタ
ノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、チオ乳酸、グルタチオン、システイン
、硫化ナトリウムならびに水硫化ナトリウムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定され
ない。好ましい還元剤は、チオグリコール酸およびメルカプトエタノールであり、最も好
ましくは、チオグリコール酸である。
【００４２】
所望のタンパク質を、選択的に還元および抽出するために、毛髪（または他のタンパク
質源）を、約０．１Ｍ〜約１０Ｍの濃度、好ましくは約１．０Ｍの還元剤に、懸濁する。
毛髪繊維を穏やかに膨張させて、ｐＨを約９以上（好ましくは、ｐＨを約９〜約１０．５
）にする。従って、最初の還元は、約２０℃〜約１００℃の温度で、好ましくは、約２５
℃で生じる。最初の還元を達成するのに必要とされる時間は、約８時間〜約３６時間、最
も好ましくは、約２４時間である。この反応は、不活性雰囲気、好ましくは窒素下で生じ
る。この液体分画を、公知の方法（例えば、濾過、カニュレーションおよび／または遠心
分離が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、好ましくは、不活性雰囲気下）を使
用して、残りの固体から分離する。好ましい分離方法は、濾過である。
【００４３】
２回目の抽出を、適切な膨張剤、好ましくは、尿素および／または塩基（例えば、水酸
化アンモニウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）を使用して行う。この２回目
の抽出のための最も好ましい膨張剤は、濃尿素である。２回目の抽出は、約１Ｍ〜約１０
Ｍ尿素、好ましくは、約７Ｍ尿素で、少なくとも約１時間、好ましくは約１時間〜約７２
時間、より好ましくは２０時間以上、最も好ましくは約２４時間の時間で生じる。２回目
の抽出は、室温で生じるが、約２０℃〜約１００℃の温度、好ましくは２５℃で行われ得
る。液体分画を、公知の方法を使用して空のインタクトな角質から分離する。適切な方法
としては、濾過、カニュレーションおよび／または遠心分離が挙げられるが、必ずしもこ
れらに限定されず、好ましくは、不活性雰囲気下である。好ましい分離方法は濾過である
。
【００４４】
一旦、角質を取り除くと、この水溶性ケラチンタンパク質を、さらなる使用のために溶
液中に保持し得、あるいはこれを、水混和性非溶媒への添加またはスプレー乾燥によって
、この溶液から単離し得る。水混和性非溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプ
ロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられるが、必ず
しもこれらに限定されず、この場合も不活性雰囲気下である。好ましい非溶媒は、エタノ
ールである。沈殿物を、公知の方法を使用し、好ましくは、濾過および非溶媒のさらなる
アリコートを使用するリンスによって、非溶媒から分離する。沈殿したタンパク質を、公
知の方法を使用し、好ましくは、室温にて一晩、減圧下で乾燥する。抽出された水溶性ケ
ラチンタンパク質（本明細書中において、集合的に「水溶性タンパク質」という）は、チ
オールまたはチオール基を含む。
【００４５】
（コーティングプロセス）
（表面を洗浄する工程）
基材をコーティングする前に、任意の適切な手順を使用して、表面を洗浄する。適切な
手順の例は、無水溶媒および水中の連続した超音波処理である。適切な無水溶媒としては
、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン
またはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無
水溶媒は、ジクロロメタンである。水は、好ましくは、脱イオン水であり、その後、乾燥
し、好ましくは風乾する。
【００４６】
（結合領域を形成する工程）
洗浄後、移植片を、カップリング物質、好ましくは有機シランの溶液に浸す。表面コー
ティングにおけるシラン化合物の使用は、公知の工業プロセスである。Ａｒｋｅｌｓ Ｂ
．「Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｌａｎｅｓ」．Ｃｈｅｍｔ
ｅｃｈ １９７７；７６６−７７８（本明細書中に、参考として援用される）。有機シラ
ンは、表面化学を保護し、変化させ得るだけでなく、カップリング剤として使用されて、
さらに別の化合物と基材の外側表面との結合を容易にさせ得る。
【００４７】
種々の化学官能基を有する市販の有機シランには、多くの異なる型がある。有機シラン
は、好ましくは、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基お
よびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む有機成分を含む。好ましい有機
成分は、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される
部分を含む。さらに好ましい有機成分は、エポキシ基、メタクリレート基、アルコキシ基
、ビニル基およびアルキルアミン基からなる群から選択される。最も好ましい有機部分は
、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される。
【００４８】
有機シランは、好ましくは、約１〜３個のハロゲンおよび約１〜３個のアルコキシ基か
らなる群から選択される置換基を含む。好ましいハロゲンは、塩素である。
【００４９】
好ましい有機シランは、特に表面がチタンの場合、ビニルメチルジクロロシラン（Ｇｅ
ｌｅｓｔ Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）である。有機シランは、有機溶媒中で
ある。有機溶媒は、実質的に、結合プロセスに負の影響を与えることなしに、溶液中の有
機シランを維持するのに有効な、任意の有機溶媒である。有機溶媒は、好ましくは、酸素
および／または窒素以外の元素を含む。適切な有機溶媒の例としては、アルカン、アルキ
レンクロライド、クロロホルム、キシレンおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、必
ずしもこれらに限定されない。好ましいアルカンはヘキサンであり、好ましいアルキレン
クロライドは、メチレンクロライドである。最も好ましい有機溶媒は、ヘキサンである。
有機溶媒中の有機シランのパーセンテージは、約１〜約１０重量パーセンテージまで変動
し得、好ましくは、約１重量パーセントである。
【００５０】
基材を、コーティングを形成するのに十分な時間、適切には約１〜約３０分間、代表的
には約１０分間、溶媒中に維持する。次いで、この基材を溶液から取り出し、大量の新た
な有機溶媒でリンスして、風乾させた。
【００５１】
（生物活性領域を形成する工程）
生物活性領域を形成するために、上記のように得られたケラチン粉末を、適切な溶媒に
溶解する。還元／還元ケラチンについて、適切な溶媒は水である。酸化／還元ケラチンに
ついて、適切な溶媒は、塩基を含む水溶液を含む。適切な塩基としては、水酸化アンモニ
ウム、水酸化ナトリウムおよび／または水酸化カリウムが挙げられるが、これらに限定さ
れない。好ましい塩基は、水酸化アンモニウムである。好ましい実施形態において、約１
５グラムのケラチン粉末を、約３０ｍＬの３Ｎ水酸化アンモニウムに溶解する。
【００５２】
無水溶媒を加える。適切な無水溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピル
アルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン、またはテトラヒドロフランが挙げられる
が、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジメチルスルホキシドである
。ケラチンおよび塩基の前記の重量および容積に、約２７０ｍＬのジメチルスルホキシド
を加える。この混合物を、穏やかに加熱しながら、ケラチンが溶解するまで攪拌する。
【００５３】
好ましくは、適切な触媒または開始剤を使用する。例えば、ビニル官能化シランカップ
リング剤を使用する場合、フリーラジカルを生成するために適切な開始剤または触媒を使
用する。そのような開始剤の例は、ＵＶ活性化された光開始剤（例えば、アントラキノン
−２−スルホン酸またはアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）である。前記の重量および容積に、約１．５グラ
ムのアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物を加える。得られる溶液を、
シランコーティング移植片に、これを完全に浸すように注ぐ。次いで、効果的なエネルギ
ー源（例えば、加熱ランプ、オートクレーブ、マイクロ波、またはＵＶランプ）を使用し
て、浸した基材のコーティングを硬化する。好ましいエネルギー源は、ＵＶランプ（λ＝
３６５ｎｍ、１．０５ａｍｐｓ）である。硬化は、コーティングを硬化するのに十分な時
間（代表的には、約１時間〜約２４時間、好ましくは、約２４時間）継続される。硬化後
、基材を溶液から取り出して、好ましくは、多量の脱イオン水を用いてリンスし、乾燥し
、好ましくは風乾する。
【００５４】
当業者は、前記のパラメータ（例えば、重量、容積、および時間）が、移植片の表面領
域、使用される特定の結合材料および他の因子に依存して変化し得ることを認知する。
【００５５】
本願は、以下の実施例（これは、単に説明であり、特許請求の範囲を特定の実施形態に
制限するものとして構成されるべきではない）を参照してよりよく理解される。以下の材
料と方法を、以下に記載する実施例において使用した：
（材料と方法）
（ケラチンの調製）
代表的な反応において、５００ｇの清浄な乾燥したヒト毛髪を、１２Ｌ丸底フラスコに
入れた。１重量パーセント／体積の過酸化水素８，３５０ｍＬを加え、この反応物を加熱
して１８０分間還流した。この毛髪を、濾過により液体から分離し、この液体を廃棄した
。毛髪を多量の水でリンスして、風乾させた。１００ｇの乾燥した、酸化した毛髪を、２
０００ｍｌ丸底フラスコに入れた。ｐＨ９にて（水酸化アンモニウムで調節する）、１０
００ｍＬの１Ｍチオグリコール酸を加え、この混合物を窒素雰囲気下、２４時間にわたっ
て６０℃まで加熱した。還元抽出後、固体を遠心分離により液体から分離した。濾過した
液体を、８倍の容量過剰のエタノールに滴下し、それによってケラチンの沈殿を形成させ
た。形成したケラチンを濾過によって分離し、減圧下で乾燥した。ケラチンを乳鉢と乳棒
を使用して微粉末に挽いた。
【００５６】
細胞応答に使用するために非常に制御され、かつ十分に特性化された表面を有するグリ
ットブラストチタン試験ディスクを、調製した。選択された材料は、医療等級で市販され
ている純粋なチタンである（Ｃ．Ｐ．Ｔｉ）。この材料を、大きなシート（約５フィート
×４フィート×０．０５０インチ、全てのサンプルセットについて金属同質性を確保する
ため）として、Ｔｉｍｅｔ（Ｏ’Ｆａｌｌｏｎ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【００５７】
１フィート×１フィートシートを、元の大きな単一シートから切り取った。各ディスク
について、一貫した表面の仕上がりを確保するために、これらのシートにおいて表面調製
を行なった。各１フィート×１フィートシートを、＃２０グリット酸化アルミニウム（Ａ
ｌ２Ｏ３）粉末を粗い表面の仕上がりのために使用し、圧縮空気を用いた酸化アルミニウ
ムグリットブラストプロセスに供した；グリッドブラストは、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって
行なわれた。
【００５８】
表面の仕上がり操作の品質制御を行い、これを、表面の粗さの均一性測定により評価し
た。ダイヤモンド針接触側面計を使用して、表面の粗さを、各１フィート×１フィートの
プレート上の異なる１０個の位置で測定した。この粗さ測定を、あらゆる方向で行なった
。平均Ｒａは、９．５６μｍであり、標準偏差は１．６３μｍであった。
【００５９】
直径１４．７５ｍｍおよび厚さ０．８０ｍｍを有するディスクを、細胞アッセイのため
に調製した。ディスクを、洗浄剤溶液で３回洗浄し、各洗浄の間にＤＩ水で２回リンスし
た。最後のリンスの後、エタノールをディスクに注ぎ、過剰な水を除去した。ディスクを
風乾した。
【００６０】
（チタンディスクのコーティング）
代表的な手順において、チタンディスクを、ジクロロメタンおよび脱イオン水中での連
続した超音波処理により洗浄した後、風乾した。ディスクを、ヘキサン中１重量％のビニ
ルメチルジクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）溶液に
１０分間浸した。各ディスクを、個別に溶液から取り出して、多量の新たなヘキサンでリ
ンスし、風乾させた。
【００６１】
代表的なケラチンコーティング工程において、１５グラムのケラチン粉末を、３０ｍＬ
の３Ｎ水酸化アンモニウムに溶解した。２７０ｍＬのジメチルスルホキシドを加えて、こ
の混合物を穏やかに加熱しながら、ケラチンが溶解するまで攪拌した。１．５グラムのア
ントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋ
ｅｅ，ＷＩ）を加えて、この溶液を、シランコーティングされたチタンディスクサンプル
に注ぎ、ディスクサンプルを、浅いガラス皿に完全に浸した。このガラス皿を、ＵＶラン
プ（λ＝３６５ｎｍ、１．０５ａｍｐｓ）下に２４時間、置いた。ＵＶ曝露後、各ディス
クを溶液から取り出して、多量の脱イオン水でリンスし、風乾させた。
【００６２】
（水接触角）
水平な表面に１滴の超純水１００μＬを置くことによって、接触角を、光学コンパレー
タ上で測定した。測定値を得る前に、界面エネルギーを３０秒間平衡化させた。
【００６３】
（Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ））
Ａｌ単色源（１４８６．６ｅＶにてＡｌ Ｋα放射）を備える物理電子工学ＰＨＩ５７
００ＥＳＣＡシステムを使用して、ＸＰＳデータを得た。分析の間、ＸＰＳ超高真空チャ
ンバ中の基本圧力は、２×１０−１０トールであった。０．１ｅＶの工程サイズおよび１
１．７５ｅＶのパスエネルギーを用いて、高解像スキャンを得た。シランおよびケラチン
コーティングの存在を、これらの各コーティングのみに存在する元素の原子濃度を探知す
ることによってモニターした。シランコーティングには、シリコンを使用し、ケラチンコ
ーティングには、窒素を使用した。硫黄がまた、ケラチン中に存在し、ＸＰＳにより検出
されるが、硫黄のシグナルとノイズの比が、ほぼ１．５であり；それゆえ、硫黄シグナル
について計算される原子の濃度は、エラーバーと同じオーダーにあったので、本研究では
硫黄を使用しなかった。
【００６４】
ＸＰＳはまた、フィルム厚さを測定するために使用した。清浄な基材のシグナルが公知
である場合、フィルムを上に有するこの基材由来のＸＰＳシグナルは、以下の標準減衰式
を使用して、計算され得る：
Ｎ＝Ｎ０・ｅｘｐ［−ｔ／（λ・ｓｉｎθ）］
ここで、Ｎは、フィルムを上に有する基材のＸＰＳシグナル（ピーク下の領域）であり、
Ｎ０は、清浄な基材のＸＰＳシグナルであり、ｔは、フィルムの厚さであり、λは、フィ
ルム中の光電子の平均自由光路（本研究において、２０Åであると想定される）であり、
θは、ＸＰＳ検出器と表面の間の角度であり、この場合、４５°に等しい。Ｃ．Ｓ．Ｆａ
ｄｌｅｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８４；１６
：２７５−３８８（本明細書中で参考として援用される）。
【００６５】
（骨芽細胞培養アッセイ）
α−最小基本培地（α−ＭＥＭ）をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，
ＮＹ，ＵＳＡ）から、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）をＳｕｍｍｉｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）から購入した。ホルマリンをＥｌｅｃ
ｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。全ての他の試薬を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【００６６】
骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）プロモータにより駆動された２Ｔ３細胞株は、トラ
ンスジェニックマウスから単離され、クローン化されている。Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈ
ｕｒｙ Ｎ，Ｗｉｎｄｌｅ ＪＪ，Ｋｏｏｐ ＢＡ，Ｈａｒｒｉｓ ＭＡ，Ｇｕｅｒｒｅ
ｒｏ，ＤＬ，Ｗｏｚｎｅｙ ＪＭ，Ｍｕｎｄｙ ＧＲ，およびＨａｒｒｉｓ ＳＥ．「Ｉ
ｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆ
ｒｏｍ ＢＭＰ２−Ｔ−ａｎｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｍｉｃｅ」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９６；１３７：３３１−３３９（本明細書
中に参考として援用される）。
【００６７】
これらの細胞は、インビトロで骨マトリックス形成を起こす。２Ｔ３細胞を、１群あた
り１プレートの１２−ウェルプレートにおいて、各チタンディスク上にプレートした。１
０％ＦＢＳで補充したα−ＭＥＭを用いて、細胞が９０％コンフルーエンスに達するまで
（約５日）培養した。培地を、１日おきに変えた。一旦、細胞がコンフルーエンスに達す
ると、培地を、処理群について５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＡｓＡ）
および５ｍＭ β−グリセロリン酸（β−ＧＰ）含有α−ＭＥＭに変え、コントロール群
についてＡｓＡおよびβＧＰ無しの５％ＦＢＳα−ＭＥＭに変えた。この培地を、３日お
きに変えて、処理期間の最終日である１４日までに新たな試薬を加えた。細胞を３７℃、
５％ＣＯ２で培養した。
【００６８】
（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色）
Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ細胞染色を、以前に出版された手順から改変した。Ｂｅｒｅｓｆｏ
ｒｄ ＪＮ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＥ，およびＳｍｏｏｔｈｙ ＣＡ、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｎｏｄｕｌｅｓ ｂｙ ｂｏｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ：ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
？」。Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３；４５：１６３−７８。
【００６９】
２Ｔ３細胞を、チタンディスク上に固定するために、最初に細胞を、ＰＢＳ出洗浄して
、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で１０分間固定した。このホルマリン溶液を吸引し、細
胞を、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）でリンスした。新たな２％硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を、細胞
に加え、次いで、細胞を有するチタンディスクを、１０分間直射日光下に置いた。１０分
後、ＡｇＮＯ３を取り除いて、２Ｔ３細胞を、ｄＨ２Ｏの安定な気流下でリンスした。５
％チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）溶液を、細胞に３分間にわたって添加した。Ｎ
ａ２Ｓ２Ｏ３を取り除いて、細胞をｄＨ２Ｏで再びリンスした。以下のエタノール（Ｅｔ
ＯＨ）シリーズを、細胞に適用した：３０秒間の９５％ＥｔＯＨ、もう一度これを繰り返
した後、各３０秒間の１００％ＥｔＯＨ適用を２回行なう。次いで、細胞を風乾させた。
【００７０】
（走査型電子顕微鏡検査）
表面形態学の画像を得るために、細胞を有するチタンディスクを、１０秒間スパッタコ
ータ−で、金／パラジウム（Ａｕ／Ｐｄ）コーティングした。チタン表面の画像を、Ａｍ
ｒａｙ走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ａｍｒａｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に
、１５ｋＶにて得た。画像を、３つの倍率：１００×、５００×および１，０００×
で得た。
【００７１】
（統計的方法）
示される場合、サンプル群間の違いを、不均等分散で生徒の両側スチューデントｔ−検
定を使用して決定した。統計的有意差を、０．０５未満のｐ値に設定した。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
本研究において、フリーラジカル付加化学を使用して、ケラチンを、コーティングされ
たガラスおよびチタン基材上に移植するために、ビニル官能化シランカップリング剤を使
用した。ＵＶ活性化光開始剤（アントラキノン−２−スルホン酸）を、フリーラジカル生
成のために使用したが、別の触媒による熱開始反応もまた、使用され得る。このプロセス
の最初の工程において、基材の優れたコーティングを、シランのヘキサン溶液に浸漬する
ことによって達成した。図１に示されるように、チタンディスクの水接触角において得ら
れた増加は、平均して３８°だった。処理群としては、光開始剤（図１において「ｃａｔ
．（触媒）」と示される）の存在下、および非存在下の両方において、シランカップリン
グを有するケラチンコーティングおよびシランカップリングを有さないケラチンコーティ
ングの種々の組み合わせが挙げられる。これは、２工程コーティングアプローチの有効性
を確かめるために行なわれた。全てのサンプル群は、コントロールチタン群の接触角（ｐ
≦０．０５の統計的有意差）と異なる接触角を生じたが、シランコーティングの全処理後
のケラチンの共有結合接合により、非処理のコントロールと比べて、接触角の最も効果的
な減少を生じた。完全に処理したチタンディスクサンプルは、７．６°の平均接触角を有
した。ガラス基材についての結果は、非処理のコントロールと完全に処理されたサンプル
との間の接触角の１６．５°の減少と同様である。ケラチン処理されたガラスは、９．０
°の平均接触角を有した。これらのデータを、図２に示す。一旦、チタンディスクおよび
ガラス顕微鏡スライドの両方が、コーティングされ得ることが決定されると、チタンディ
スクのみを、さらなる評価に使用した。
【００７３】
前に述べたように、チタンディスクを、シランのヘキサン溶液に浸漬することによって
、首尾よいコーティングを得た。非処理のチタンディスクおよびシランコーティングされ
たチタンディスク由来のＸＰＳ Ｓｉ２ｐシグナルを、図３Ａに示す。約２０％の原子濃
度に相当するコーティングされたディスク由来のＳｉシグナルは、非処理のディスクの３
％未満の原子濃度と比べると、明かに、シランコーティングの存在を示している。非処理
のディスク上の少量のＳｉは、おそらく表面汚染のためであった。ケラチンの添加により
、約３％（非処理ディスクにおけるバックグランドレベル）から８．５％までの窒素原子
濃度が増加した。図３Ｂは、非処理チタンディスク由来の代表的なＮ１ｓ ＸＰＳシグナ
ルならびにシラン、触媒およびケラチンでコーティングされたサンプルの代表的なＮ１ｓ
ＸＰＳシグナルを示す。異なる処理群において測定されたＳｉおよびＮの原子濃度を、
図４に示す。これら２つの元素の濃度は、有機シランおよびケラチンの存在と非常によく
相関していた。
【００７４】
シランコーティングにおける触媒およびケラチンの添加により、Ｓｉの原子濃度が減少
した。これは、異なったさらなるコーティングによるシリコンシグナルの減衰に起因する
。チタンＸＰＳシグナルを、上記の減衰式に使用して、全フィルムの厚さを計算した。結
果を、図５に示す。シラン＋「触媒」またはケラチンを有するフィルムの厚さの変化は、
おそらく、シランフィルム自体の厚さの変化のためである。それにもかかわらず、触媒＋
ケラチンフィルムおよびケラチンのみのフィルムから、シランコーティング存在下で、ケ
ラチンフィルムはより頑丈であることが明らかである。
【００７５】
シランフィルムの変化をなくして、ケラチンコーティングの厚さをさらに正確に決定す
るために、基材としてシランを処理して、シランコーティングされたディスク由来のシリ
コンシグナルを使用した減衰式を使用して、シランフィルム表面のケラチンコーティング
の厚さを計算した。シランのみでコーティングされたディスク由来のＳｉ２ｐ ＸＰＳシ
グナルを、この場合において、清浄な基材のシグナルとして使用した。幾つかの異なるサ
ンプルの結果を、図５の括弧内に示す。このデータは、ケラチンコーティングの平均の厚
さが、約８．５Åであることを示す。
【００７６】
ケラチンコーティングされたチタンディスク上の骨芽細胞の分化および石灰化を、ディ
スク表面のｖｏｎ Ｋｏｓｓａ分析によって実証した。小結節形成が、インビトロでの石
灰化に重要な工程であると考えられる。
【００７７】
１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸および５ｍＭ β−グリセロリン酸の存在（＋）下ま
たは非存在（−）下で、細胞を、５％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で培養した。ＡｓＡおよ
びβ−ＧＰ無し（−）のｖｏｎ Ｋｏｓｓａ分析により実証されたように（パネルＡおよ
びＣ）、骨芽細胞の分化および石灰化は、より小さく僅かな小結節を示した。２週間後、
２Ｔ３細胞は、１００μｇ／ｍｌ ＡｓＡおよび５ｍＭ β−ＧＰの存在（＋）下で、移
植片表面上に大きな小結節を石灰化することが観察された（パネルＢおよびＤ）。画像Ａ
およびＢは、１００×倍率（スケールバー＝１００μｍ）で得られ、画像ＣおよびＤは、
１，０００×倍率（スケールバー＝１０μｍ）で得られた。
【００７８】
インビトロでの小結節の石灰化は、インビボで生成される線維性骨に似ているように見
える。２週間後、２Ｔ３細胞は、ＡｓＡおよびβ−ＧＰを有する、または有さない移植片
表面上の培養において、石灰化することが観察された。２週目におけるＡｓＡおよびβ−
ＧＰなしの細胞のｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色は、より小さくわずかな小結節を示した（図６
Ａおよび６Ｃ）。対照的に、ＡｓＡおよびβ−ＧＰで処理したディスクには、より多くの
大きな小結節が存在した（図６Ｂおよび６Ｄ）。コラーゲンコーティング基材上の２Ｔ３
骨芽細胞における小結節形成を誘導するＡｓＡおよびβ−ＧＰの能力は、以前に報告され
ている。本研究において、本発明者らは、ケラチンコーティング基材について類似の結果
を見出し、従って、これは、生体適合性を示す。
【００７９】
チタン基材上にケラチンコーティングを適用するための２工程の浸漬プロセスは、それ
ぞれ水接触角およびＸＰＳスペクトルデータにより実証されるように、親水性かつ頑強な
フィルムを生じた。このプロセスは、ケラチンが表面に共有結合するために、より生体安
定なコーティングを生じるはずである。このコーティングプロセスは、シランおよびケラ
チンの両方の非常に薄い層を生じ、表面の粗いチタン移植片表面への細胞の接着を促進す
るために、移植片の製造業者によりしばしば使用される表面形態学と干渉しないと予測さ
れる。２Ｔ３骨芽細胞アッセイは、コーティングが、接着、増殖および分化を促進したこ
とを示した。これらの細胞の、骨マトリックスを生成する能力は、ケラチンコーティング
骨伝導性特性を示す。さらなる研究において、本発明者らは、これらのケラチンコーティ
ングが骨の増殖速度を加速し得ることを示すことを意図している。
【００８０】
当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上記の本発明に対して多く
の改変がなされ得ることを理解する。本明細書中に記載される実施形態は、例示のみを意
味し、添付の特許請求の範囲において規定される本発明を制限するものとして理解される
べきでない。
【技術分野】
【０００１】
本願は、係属中の米国仮出願番号６０／３３９，０３９（２００２年７月２５日出願）
に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本願は、医療デバイスのためのコーティングに関し、好ましくは、医療移植片のための
コーティングに関する。より具体的には、本願は、生物活性コーティングに関し、好まし
くは、骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）特性を有するケラチンを含む生物活性コ
ーティングに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
医療デバイス表面を保護する目的で、多くの異なる型のコーティングが開発されている
。コラーゲン、ヒドロキシアパタイトおよびより最近には、いわゆるＲＧＤペプチドの全
てが、整形外科移植片適用におけるコーティングとして研究されている。これらの物質全
ては、少なくとも骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）であると示されているが
、骨誘導性であるとは示されていない。骨誘導特性を有し、ヒト免疫系から移植片をマス
クし得る保護コーティングが必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（簡単な要旨）
本願は、ケラチンを含有する保護コーティングを含む医療移植片を提供する。この保護
コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。前記結合領域は、前記基材表面に
結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含む。この生物活性領域
は、ケラチンの反応性ペンダント基（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｅｎｄａｎｔ ｇｒｏｕｐ）
に結合した前記有機シランの有機成分を含む。
【０００５】
（詳細な要旨）
本願は、ケラチンを含有する保護コーティングを含む基材を提供する。好ましい実施形
態において、この保護コーティングは、骨誘導特性を含む。さらに好ましい実施形態にお
いて、この保護コーティングは、骨伝導特性と骨誘導特性の両方を含む。
【０００６】
この基材は、好ましくは、医療デバイス上に存在し、さらに好ましくは、医療移植片上
に存在する。この医療デバイスは、好ましくは、組織工学構造物、整形外科移植片、歯科
移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される。
【０００７】
この基材は、生体適合性物質を含む。この生体適合性物質は、好ましくは、シリコン、
金属、合金およびセラミックからなる群から選択される。好ましい金属は、チタンを含み
、そして、チタン金属またはその合金であり得る。好ましいセラミックは、ヒドロキシア
パタイトを含む。
【０００８】
好ましい実施形態において、保護コーティングは、ケラチンならびに骨形成タンパク質
（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択さ
れる１つ以上の生物活性因子を含む。このケラチンは、毛髪、毛皮、羽毛、角、蹄、嘴ま
たは足からなる群から選択される物質由来である。ケラチンは、好ましくは、毛髪由来で
あり、より好ましくはヒト毛髪由来であり、これは、「ヒト毛髪ケラチン」と呼ばれ得る
。ケラチンはまた、好ましくは、還元ケラチンを含む。
【０００９】
好ましくは、この保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。この結合
領域は、移植片表面の結合とケラチン上の反応性ペンダント基の結合の両方に適合される
物質を含む。好ましくは、この結合領域は、少なくとも１つのシラン化合物を含み、さら
に好ましくは、有機シランを含む。
【００１０】
好ましくは、この有機シランは、シラン成分および有機成分を含む。この結合領域は、
医療デバイス表面に結合したシラン成分を含み、そしてこの生物活性領域は、有機シラン
の有機成分に結合したケラチンを含む。この有機シランについて適切な有機成分は、ケラ
チン上の反応性ペンダント基との反応に適合される。好ましくは、この有機シランは、
エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル
基からなる群から選択される部分を含む有機成分を含む。好ましい有機成分は、エポキシ
基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む。さら
に好ましい有機成分は、エポキシ基、アクリレート基、アルコキシ基、ビニル基およびア
ルキルアミン基からなる群から選択される。最も好ましい有機部分は、ビニル基およびエ
ポキシ基からなる群から選択される。好ましくは、この有機シランは、約１個〜３個のハ
ロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む。好ま
しいハロゲンは、塩素である。
【００１１】
また、基材を保護基材でコーティングする方法を、提供する。この方法は、以下：前記
基材とカップリング物質を結合して結合領域を生成する工程；および前記結合領域とケラ
チンを結合する工程を包含する。さらに好ましくは、この方法は、前記基材とカップリン
グ物質を結合する前に、この基材表面を酸化する工程を包含する。
【００１２】
好ましい実施形態において、この基材とカップリング物質を結合する前に、この基材を
洗浄する。さらに好ましくは、この洗浄工程は、無水溶媒中での超音波処理および水中で
の超音波処理を包含する。適切な無水溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロピル
アルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランが挙げられるが
、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジクロロメタンである。好まし
くは、水は、脱イオン水である。
【００１３】
前記結合領域にケラチンを結合させる工程は、適切な溶媒にケラチンを溶解して、無水
溶媒を添加してケラチン混合物を生成する工程、前記ケラチン混合物に前記結合領域を曝
露する工程；そして前記生物活性領域を生成するのに有効な条件下で硬化させる工程を包
含する。
【００１４】
還元／還元ケラチンについて、適切な溶媒は、水である。酸化／還元ケラチンについて
、適切な溶媒は、塩基含有水溶液を含む。適切な塩基には、水酸化アンモニウム、水酸化
ナトリウムおよび／または水酸化カリウムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されな
い。好ましい塩基は、水酸化アンモニウムである。
【００１５】
適切な無水溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルス
ルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定
されない。好ましい無水溶媒は、ジメチルスルホキシドである。
【００１６】
この方法は、触媒および開始剤からなる群から選択される試薬とケラチン混合物とを混
合する工程を包含する。ビニル官能化シランカップリング剤を使用する場合、適切な開始
剤または触媒は、フリーラジカルを生成する。好ましいフリーラジカル開始剤は、アント
ラキノン−２−スルホン酸またはアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物
（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からなる群から選択される。
【００１７】
硬化は、このケラチン混合物に曝露される基材を、このコーティングを硬化させるのに
十分な期間にわたって有効なエネルギー供給源に曝露する工程を包含する。好ましくは、
この硬化は、前記触媒または前記開始剤の存在下で生じる。この硬化期間は、代表的には
、約１時間〜約２４時間であり、好ましくは約２４時間である。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
医療デバイスであって、以下：
ケラチンを含む保護コーティングを含む基材であって、該保護コーティングは、結合領
域および生物活性領域を含む、基材；
該基材の表面に結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含む該
結合領域；および
該ケラチンの反応性ペンダント基に結合した該有機シランの有機成分を含む該生物活性
領域
を含む、医療デバイス。
（項目２）
項目１に記載の医療デバイスであって、前記有機シラン化合物の前記シラン成分が、前記基材の表面と共有結合している、医療デバイス。
（項目３）
項目２に記載の医療デバイスであって、前記生物活性領域が、前記有機シラン化合物の前記シラン成分に共有結合した前記ケラチンの反応性ペンダント基を含む、医療デバイス。
（項目４）
項目１に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞によって示される骨マトリクス形成を増加させるのに有効である、医療デバイス。
（項目５）
組織工学構築物、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される、項目３に記載の医療デバイス。
（項目６）
組織工学構築物、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される、項目４に記載の医療デバイス。
（項目７）
医療移植片を含む、項目１に記載の医療デバイス。
（項目８）
医療移植片を含む、項目３に記載の医療デバイス。
（項目９）
医療移植片を含む、項目４に記載の医療デバイス。
（項目１０）
医療移植片を含む、項目５に記載の医療デバイス。
（項目１１）
医療移植片を含む、項目６に記載の医療デバイス。
（項目１２）
項目１に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１３）
項目７に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１４）
項目８に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１５）
項目９に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１６）
項目１０に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１７）
項目１１に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
（項目１８）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目１９）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２０）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目２１）
項目１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２２）
項目１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２３）
項目１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目２４）
項目１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２５）
項目１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２６）
項目１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目２７）
項目１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２８）
項目１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目２９）
項目１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目３０）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目３１）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
（項目３２）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
（項目３３）
項目１２に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療デバイス。
（項目３４）
項目１７に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療デバイス。
（項目３５）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、毛髪、毛皮、羽毛、角、蹄、嘴および足からなる群から選択される物質由来である、医療デバイス。
（項目３６）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、毛髪由来である、医療デバイス。
（項目３７）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、ヒトの毛髪ケラチンである、医療デバイス。
（項目３８）
項目３５に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
（項目３９）
項目３６に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
（項目４０）
項目３７に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
（項目４１）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４２）
項目３５のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４３）
項目３６いずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４４）
項目３９に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４５）
項目４０に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
（項目４６）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目４７）
項目４１に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目４８）
項目４４に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目４９）
項目４３に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目５０）
項目４５に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
（項目５１）
医療移植片を含む、項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療デバイス。
（項目５２）
医療移植片を含む、項目４１に記載の医療デバイス。
（項目５３）
医療移植片を含む、項目４３に記載の医療デバイス。
（項目５４）
医療移植片を含む、項目４４に記載の医療デバイス。
（項目５５）
医療移植片を含む、項目４５に記載の医療デバイス。
（項目５６）
医療移植片を含む、項目４６に記載の医療デバイス。
（項目５７）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目５８）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目５９）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目６０）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
（項目６１）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６２）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６３）
項目６２に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目６４）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６５）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６６）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６７）
項目６６に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目６８）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目６９）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７０）
項目３４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７１）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目７２）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７３）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７４）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７５）
項目７４に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目７６）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７７）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７８）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目７９）
項目７８に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目８０）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８１）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８２）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８３）
項目８２に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目８４）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８５）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８６）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８７）
項目８６に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
（項目８８）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
（項目８９）
項目１〜３３および項目３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９０）
項目５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９１）
項目５３に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９２）
項目５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９３）
項目５５に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９４）
項目５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９５）
項目６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９６）
項目８８に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
（項目９７）
保護コーティングを用いて医療デバイスをコーティングする方法であって、該方法が、以下：
結合領域を生成する該医療デバイスの１つ以上の表面にカップリング剤を結合させる工程；および
該結合領域にケラチンを結合させる工程
を包含する、方法。
（項目９８）
項目９７に記載の方法であって、前記結合領域にケラチンを結合させる工程が、以下：
溶媒にケラチンを溶解する工程；および
ケラチン混合物を生成するために、第２の無水溶媒を添加する工程；
該ケラチン混合物に該結合領域を曝露し、ケラチンコーティング結合領域を生成する工程；および
前記生物活性領域を生成するのに有効な条件下で、該ケラチンコーティング結合領域を硬化する工程を包含する、方法。
（項目９９）
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を洗浄する工程をさらに包含する、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を酸化する工程をさらに包含する、項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を酸化する工程をさらに包含する、項目９９に記載の方法。
（項目１０２）
項目９９に記載の方法であって、前記洗浄工程が、最初に無水溶媒中で、前記１つ以上の表面に超音波処理し、そして該１つ以上の表面を水中で超音波処理する工程を包含する、方法。
（項目１０３）
項目１０２に記載の方法であって、前記第１の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１０４）
項目１０２に記載の方法であって、前記最初の無粋溶媒が、ジクロロメタンである、方法。
（項目１０５）
項目１０１に記載の方法であって、前記洗浄が、最初に無水溶媒で、前記１つ以上の表面に超音波をあて、そして前記１つ以上の表面を水で超音波処理する工程を包含する、方法。
（項目１０６）
項目１０５に記載の方法であって、前記第１の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１０７）
項目１０６に記載の方法であって、前記最初の無粋溶媒が、ジクロロメタンである、方法。
（項目１０８）
項目１０５に記載の方法であって、前記水が、脱イオン水である、方法。
（項目１０９）
項目１０７に記載の方法であって、前記水が、脱イオン水である、方法。
（項目１１０）
項目１０９に記載の方法であって、前記ケラチンが、還元／還元ケラチンである場合、前記溶媒が水である、方法。
（項目１１１）
項目１０９に記載の方法であって、前記ケラチンが、酸化／還元ケラチンである場合、前記溶媒が塩基含有水溶液を含む、方法。
（項目１１２）
項目１１１に記載の方法であって、前記塩基が、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
（項目１１３）
項目１１１に記載の方法であって、前記塩基が、水酸化アンモニウムである、方法。（項目１１４）
項目９８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１１５）
項目９８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
（項目１１６）
項目１０５に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１１７）
項目１０５に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
（項目１１８）
項目１０７に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
（項目１１９）
項目１１８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
（項目１２０）
触媒およびインヒビターからなる群から選択される活性化剤と前記ケラチン混合物を混合する工程をさらに包含する、項目９９〜１１８および項目１１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２１）
項目１２０に記載の方法であって、前記活性化剤が、ビニル官能化シランであり、そして該活性化剤が、フリーラジカルを生成するのに有効である、方法。
（項目１２２）
項目１２１に記載の方法であって、前記活性化剤が、アントラキノン−２−スルホン酸を含む、方法。
（項目１２３）
項目９８に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２４）
項目１２０に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２５）
項目１２１に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２６）
項目１２２に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１２７）
項目１２３に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
（項目１２８）
項目１２４に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の方法を包含する、方法。
（項目１２９）
項目１２５に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
（項目１３０）
項目１２６に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
（項目１３１）
項目１２３に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３２）
項目１２６に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３３）
項目１２７に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３４）
項目１３０に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
（項目１３５）
項目１２６に記載の方法であって、前記期間が、約２４時間である、方法。
（項目１３６）
項目１３０に記載の方法であって、前記期間が、約２４時間である、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ケラチンコーティングされたチタンディスクの水接触角を示すグラフであり、これは、本願の工程に供されたディスク（シランコーティングに続いてケラチンを接合させたディスク）が、得られる最も低い接触角を有したことを説明する。
【図２】図２は、チタンとガラスの両方が、浸漬プロセスを使用して効率的にコーティングされることを示すケラチンコーティングされた基材の水接触角を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、非処理のチタンディスクとシランコーティングディスクとの間のＸＰＳスペクトル（Ｓｉ２ｐ スペクトル）を比較するチャートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、非処理のチタンディスクと生理食塩水、触媒およびケラチンで処理されたディスクとの間のＸＰＳスペクトル（Ｎ１ｓ スペクトル）を比較するチャートである。
【図４】図４は、ケラチンコーティングされたチタンディスクのＳｉおよびＮ ＸＰＳ原子濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、推定されたチタンディスク上コーティングの厚さであり、ここで、括弧内の数字は、シランコーティング上フィルムの厚さを示す。
【図６】図６は、２Ｔ３細胞が、ケラチンコーティングされたチタンディスクに付着し、そして分化することを示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（詳細な説明）
ケラチンは、傷害または損傷なしで容易に提供され得るヒトタンパク質の、唯一ではな
いにしても数少ないファミリーの１つである。この独特の構造タンパク質のファミリーは
、非常に多くの脊椎動物組織において見出され得、最も著しくは毛髪および毛皮において
見出され得る。何百トンというヒト毛髪が、毎日破棄されている。１００以上の相同体を
有するファミリーのように、ケラチンの生体適合性は、その構造改変体によって予め決定
される。どのヒトタンパク質も、この程度の構造および組成の多様性を示さず、それゆえ
、免疫系による耐性を示さない。
【００２０】
本願は、ヒト毛髪繊維からケラチンを選択的に抽出し、医療デバイス物質（例えば、金
属およびセラミック）表面上に分子コーティングを生成する浸漬プロセスにおいて、この
ケラチンを使用する。この方法は、この移植片表面とケラチン上の反応性ペンダント基の
両方に結合するのに適合したカップリング剤を使用する。好ましくは、この結合領域は、
少なくとも１つのシラン化合物を含み、さらに好ましくは、有機シランを含む。好ましく
は、この有機シランは、シラン成分および有機成分を含み、ここでこの結合領域は、医療
デバイス表面に結合したシラン成分およびケラチン上の反応性部分と結合した有機成分を
含む。好ましい実施形態において、この有機シランのシラン成分は、医療デバイス表面と
共有結合しており、この有機シランの有機成分はケラチン上の反応性部分と共有結合して
いる。
【００２１】
水接触角およびＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によるこれらのコーティングの特性決定か
ら、非常に異なった表面特性が示された。このオングストロームの薄さのケラチンコーテ
ィングは、頑強であり、そしてグリットブラストされたチタンディスクの標準形態の妨げ
にはならなかった。これらの表面特性は、培養中のケラチンコーティングされたチタンデ
ィスク上の２Ｔ３マウス骨芽細胞の付着、増殖および分化につながることが示された。
【００２２】
一般的に、このコーティング方法は、代表的には、金属およびセラミック表面を有する
医療デバイス物質に、適用可能である。このコーティング方法は、宿主の受容性を促進し
て、そして／または組織増殖を加速する、より生体適合性の界面を生成して、最終的には
、生物学的に活性な表面を生成する能力を有する。
【００２３】
（ケラチン）
ヒト毛髪は、角質として知られる鱗状の重なった形に配置される扁平細胞からなる剛健
な管状外層から構成される。この毛髪の内部バルクは、皮質として知られており、繊維状
ケラチンにより高密度に充填された細長い細胞から構成されている。α−ヘリカルケラチ
ンのミクロフィブリルコイルドコイルを含む、この繊維状ケラチンは、束状に配置され、
マクロフィブリルと呼ばれる。この構造の中間フィラメント（ＩＦ）は、非晶質ケラチン
マトリックス物質と一緒に結合している。このマトリックスおよびＩＦは、機能および組
成において異なる。このマトリックスは、ＩＦを一緒に維持する「接着剤」である。この
接着剤は、硫黄含量が高く、低分子量ケラチン（ＬＭＷＫ）（代表的には、１０〜１５ｋ
Ｄａ未満）からなる。このＩＦは、相対的に低い硫黄含量ではあるが、高分子量のケラチ
ン（高分子量ケラチンすなわちＨＭＷＫ）を含み、ほぼ５０〜８５ｋＤａである。
【００２４】
ケラチンの１つの際立った特徴は、ポリペプチド鎖の３次元ネットワークを形成するジ
スルフィド架橋の存在により、ケラチンに、大部分において構造の完全性を与える。この
ネットワーク構造は、ケラチンが不溶性であることを示す。しかしながら、ケラチンは、
ジスルフィド結合切断を介する３次元構造の破壊により、可溶性になり得る。ジスルフィ
ド結合切断は、酸化的、還元的に行なわれるか、またはこの２つの組み合わせによって行
なわれ得る。
【００２５】
制御された条件下でのジスルフィド結合切断および選択的抽出により、ＨＭＷＫからＬ
ＭＷＫが単離される。このプロセスは、角質をばらばらにすることなく皮質タンパク質を
取り外すのに用いる。毛髪繊維の内部構造を、角質に対して実質的な障害を与えずに取り
外す。この抽出プロセスによるＨＭＷＫは、ゲル電気泳動により、分子量６６ｋＤａおよ
び４３ｋＤａで２つの広いタンパク質バンドを生じる。これらのケラチンは、構造的生体
適合性物質（セラミックおよび金属表面のコーティングを含む）として有用である。
【００２６】
成長因子（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子
β（ＴＧＦ−β））は、毛髪濾胞に存在し、コーティングにより送達可能であり、このコ
ーティングに骨誘導性および骨伝導性の特性を提供する。
【００２７】
ケラチンは、一般的に、式：
【００２８】
【化１】
を有するアミノ酸を含む。表１は、例えば、ヒト毛髪に見出されるアミノ酸残基を要約し
、各残基に対応する「Ｒ１」基を示す。
【００２９】
【表１−１】
【００３０】
【表１−２】
ヒト毛髪における最も多いアミノ酸は、システインであり、これは、ジスルフィド架橋
されたシステイン基の形態で見出される。上に議論したように、この基は、他の硫黄含有
部分（最も著しくは、チオール）に変換され得る。チオールは、以下に記載されるような
多くの化学技術を使用してカップリング物質の反応性末端と反応し得る：Ｓ．Ｐａｔａｉ
（Ｅｄ．），ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｏｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｐ
ａｒｔｓ １ ａｎｄ ２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ
（１９７４）（これは、本明細書中で参考として援用される）。他の反応シナリオ（例え
ば、ポリマー合成に関するもの）はまた、チオールを利用して所望の架橋の組み合わせを
形成するのに役立つ（例えば、これは、Ｒｅｍｐｐ，Ｐ．およびＭｅｒｒｉｌｌ，Ｅ．Ｗ
．，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｈｕｅｔｈｉｎｇ＆Ｗｅｐｆ Ｖｅｒｌａｇ
Ｂａｓｅｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８６）；Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．
Ｊ．ａｎｄ Ｌｏｖｅｌｌ，Ｐ．Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｏｌｙｍｅ
ｒｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１）；Ｏｄｉａｎ，Ｇ．，Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）に記載され、本明細書中で参考として援用さ
れる）。
【００３１】
システインに加えて、以下のアミノ酸は、反応性ペンダント基として有用であり得る、
窒素または酸素を含むペンダント基を有する；アルギニン、セリン、グルタミン酸、スレ
オニン、アスパラギン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファ
ンおよびヒスチジン。タンパク質が、α−ケラチンである場合、架橋のための反応性ペン
ダント基を含む好ましいアミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリンおよびグルタ
ミン酸であり、最も好ましくは、シスチンおよびアルギニンである。
【００３２】
（ジスルフィド結合切断およびケラチン抽出）
ケラチンは、多くの方法でプロセシングされ得、および／または単離され得る。好まし
くは、このプロセシングは、得られるタンパク質を水溶性にするのに十分である。適切な
プロセシング技術としては、プロセシングが、ペプチド結合の有意な加水分解なしにタン
パク質を水溶性にする限り、公知の酸化技術、還元技術、および／またはそれらの組み合
わせが挙げられる。
【００３３】
多くの還元化学は、ケラチンのジスルフィド結合切断について公知である：Ｗａｒｄｅ
ｌｌ，Ｊ．Ｌ．，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏｌｓ」ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｏｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｐａｔａｉ，Ｓ．（Ｅｄｉｔｏｒ）
，ｐｐ．１６３−３５３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ
Ｙ（１９７４）を参照のこと。これは、本明細書中で参考として援用される。ＨＭＷＫは
、少なくとも２つの還元性抽出を使用して毛髪から抽出され得る（例えば、Ｃｒｅｗｔｈ
ｅｒ，Ｗ．Ｇ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｂ．，Ｌｅｎｎｏｘ，Ｆ．Ｇ．，ａｎｄ Ｌｉ
ｎｄｌｅｙ，Ｈ．，「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｋｅｒａｔｉｎｓ」Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．，
Ｊｒ．，Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｊ．Ｔ．，およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ
．Ｍ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．
１９１−３４６（１９９５）に記載され、本明細書中に参考として援用される）。
【００３４】
以下の方法は、コーティングを作製する際に使用するため、ケラチンをプロセシングす
るのに適している：
（−酸化／還元）
ケラチンを供給源物質（例えば、ヒト毛髪）として使用する好ましい実施形態において
、毛髪を、適切な酸化剤により酸化する。適切な酸化剤としては、過酸化水素、過酢酸、
過カルボン酸、過硫酸、二酸化塩素、ナトリウム過酸化物およびカルシウム過酸化物、過
ホウ酸塩ならびに次亜塩素酸塩が、挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。最も
好ましい酸化剤は、過酸化水素である。このオキシダントを、約３５％までの濃度で、好
ましくは、約０．１％〜約１０％の濃度で使用する。この酸化は好ましくは、還流温度で
生じる。
【００３５】
好ましい実施形態において、角質をばらばらにして、ケラチン供給源物質を増やすため
に、毛髪は、約０．１％〜約１０％の濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を用いて処理される
。このプロセスはまた、幾つかのシスチン残基の分画を硫酸基に変換する。他の酸化反応
条件を一定に保持したままで、酸化時間を変えることにより、好ましくは、約０時間〜約
４時間で、酸化量を制御し得る。これらの条件としては、オキシダントの濃度および型、
温度、ならびに抽出培地とケラチン供給源物質との比が挙げられる。反応が完了した後、
酸化した毛髪を濾過して、好ましくは脱イオン水を用いてリンスする。この濾液を破棄し
、毛髪を乾燥させた。
【００３６】
他の酸化の条件が一定に維持される場合、シスチンの硫酸残基への変換速度は、酸化に
使用された時間量に大まかに比例している。得られる酸化ケラチン固体中の残留シスチン
を、還元技術を使用して硫黄を含む他の部分に変換する。好ましくは、ジスルフィド架橋
されるシスチン基を、それ自体で有用であるか、または種々の化学技術を使用して改変さ
れ得るチオール基に変換する。
【００３７】
酸化された毛髪を、好ましくは還元剤で処理する。適切な還元剤としては、チオグリコ
ール酸およびその塩、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、
チオ乳酸、グルタチオン、システイン、硫化ナトリウムならびに硫化水素ナトリウムが挙
げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい還元剤は、チオグリコール酸およ
びメルカプトエタノールであり、最も好ましくは、チオグリコール酸である。
【００３８】
酸化した毛髪を、還元剤で処理するために、予め酸化した毛髪を、代表的には約１０Ｎ
までの濃度、好ましくは、約０．１Ｎ〜１Ｎの濃度の還元剤；約７より大きいｐＨ、好ま
しくは、ｐＨ９以上、最も好ましくは、ｐＨ９で；約２５℃〜約８０℃の温度、好ましく
は、約６０℃の温度にて、好ましくは、約１時間〜約７２時間かけて、最も好ましくは、
約２４時間かけて懸濁する。この反応は、不活性雰囲気、好ましくは窒素下で生じる。こ
の液体分画を、公知の方法（例えば、濾過もしくはカニュレーションおよび／または遠心
分離が挙げられ、必ずしもこれらに限定はされず、好ましくは、不活性雰囲気下である）
を使用して、残りの固体から分離する。好ましい分離方法は、濾過である。一旦、この固
体を除去すると、可溶性ケラチンタンパク質は、水混和性非溶媒の添加またはスプレー乾
燥により、この溶液から分離される。水混和性非溶媒には、エタノール、メタノール、イ
ソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられるが、
必ずしもこれらに限定されず、この場合も不活性雰囲気下である。好ましい非溶媒は、エ
タノールである。沈殿物を、公知の技術を使用して、好ましくは、濾過および非溶媒のさ
らなるアリコートを使用するリンスによって、非溶媒から分離する。得られたケラチンタ
ンパク質を、公知の技術を使用して、好ましくは、室温にて一晩減圧下で乾燥させる。こ
のプロセスは、スルホン酸基およびチオール基の両方を有するケラチンを生じる。
【００３９】
最も好ましい反応において、清浄な乾燥したヒト毛髪を、過酸化水素を用いて、加熱し
ながら、好ましくは還流で、ジスルフィド結合を切断するのに有効な期間、代表的には、
約１８０分間かけて処理する。この毛髪を、好ましくは、濾過によって液体から分離し、
溶液を廃棄した。毛髪を、好ましくは、大量の水でリンスし、風乾させた。次いで、この
乾燥させた酸化毛髪を、還元剤、好ましくは、ｐＨ９（水酸化アンモニウムで調整する）
の１Ｍ チオグリコール酸を用いてで処理し、この混合物を、不活性ガス、好ましくは、
窒素雰囲気下で、一定の時間、好ましくは２４時間かけて、好ましくは約６０℃まで加熱
する。還元性抽出後、この固体を、好ましくは、遠心分離により溶液から分離する。この
濾過した液体を、過剰のエタノール、好ましくは、約８倍量過剰のエタノールに、添加、
好ましくは滴下し、それによりケラチン沈殿物を形成させる。この沈殿したケラチンを、
濾過により分離し、減圧下で乾燥する。乳鉢および乳棒を使用して、ケラチンを微粉末に
挽く。
【００４０】
（還元／還元抽出）
別の実施形態において、選択的にマトリックスケラチンを抽出するのに有効な第１の条
件下で、第１の還元剤を用いて毛髪を処理して、可溶性の還元マトリックスケラチン（Ｌ
ＭＷＫ）を含む第１の溶液を生成し、そして毛髪固体（ＨＭＷＫ）を維持することにより
、第１の還元性抽出を行う。ＬＭＷＫを本明細書中に記載の技術に供して、コーティング
を生成し得るが、本明細書中の技術における用途に好ましいタンパク質は、ＨＭＷＫであ
り、これは、好ましくは、２回目の抽出の間に単離される。残りの毛髪固体および第１の
溶液を分離して、この残りの毛髪固体を、α−ケラチンを可溶化するのに有効な第２の条
件下で、可溶性の還元α−ケラチン（ＨＭＷＫ）および固体角質を含む第２の溶液を生成
して、２回目の抽出溶液に曝露する。
【００４１】
適切な還元剤としては、この場合も、チオグリコール酸およびその塩、メルカプトエタ
ノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、チオ乳酸、グルタチオン、システイン
、硫化ナトリウムならびに水硫化ナトリウムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定され
ない。好ましい還元剤は、チオグリコール酸およびメルカプトエタノールであり、最も好
ましくは、チオグリコール酸である。
【００４２】
所望のタンパク質を、選択的に還元および抽出するために、毛髪（または他のタンパク
質源）を、約０．１Ｍ〜約１０Ｍの濃度、好ましくは約１．０Ｍの還元剤に、懸濁する。
毛髪繊維を穏やかに膨張させて、ｐＨを約９以上（好ましくは、ｐＨを約９〜約１０．５
）にする。従って、最初の還元は、約２０℃〜約１００℃の温度で、好ましくは、約２５
℃で生じる。最初の還元を達成するのに必要とされる時間は、約８時間〜約３６時間、最
も好ましくは、約２４時間である。この反応は、不活性雰囲気、好ましくは窒素下で生じ
る。この液体分画を、公知の方法（例えば、濾過、カニュレーションおよび／または遠心
分離が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、好ましくは、不活性雰囲気下）を使
用して、残りの固体から分離する。好ましい分離方法は、濾過である。
【００４３】
２回目の抽出を、適切な膨張剤、好ましくは、尿素および／または塩基（例えば、水酸
化アンモニウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）を使用して行う。この２回目
の抽出のための最も好ましい膨張剤は、濃尿素である。２回目の抽出は、約１Ｍ〜約１０
Ｍ尿素、好ましくは、約７Ｍ尿素で、少なくとも約１時間、好ましくは約１時間〜約７２
時間、より好ましくは２０時間以上、最も好ましくは約２４時間の時間で生じる。２回目
の抽出は、室温で生じるが、約２０℃〜約１００℃の温度、好ましくは２５℃で行われ得
る。液体分画を、公知の方法を使用して空のインタクトな角質から分離する。適切な方法
としては、濾過、カニュレーションおよび／または遠心分離が挙げられるが、必ずしもこ
れらに限定されず、好ましくは、不活性雰囲気下である。好ましい分離方法は濾過である
。
【００４４】
一旦、角質を取り除くと、この水溶性ケラチンタンパク質を、さらなる使用のために溶
液中に保持し得、あるいはこれを、水混和性非溶媒への添加またはスプレー乾燥によって
、この溶液から単離し得る。水混和性非溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプ
ロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられるが、必ず
しもこれらに限定されず、この場合も不活性雰囲気下である。好ましい非溶媒は、エタノ
ールである。沈殿物を、公知の方法を使用し、好ましくは、濾過および非溶媒のさらなる
アリコートを使用するリンスによって、非溶媒から分離する。沈殿したタンパク質を、公
知の方法を使用し、好ましくは、室温にて一晩、減圧下で乾燥する。抽出された水溶性ケ
ラチンタンパク質（本明細書中において、集合的に「水溶性タンパク質」という）は、チ
オールまたはチオール基を含む。
【００４５】
（コーティングプロセス）
（表面を洗浄する工程）
基材をコーティングする前に、任意の適切な手順を使用して、表面を洗浄する。適切な
手順の例は、無水溶媒および水中の連続した超音波処理である。適切な無水溶媒としては
、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン
またはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無
水溶媒は、ジクロロメタンである。水は、好ましくは、脱イオン水であり、その後、乾燥
し、好ましくは風乾する。
【００４６】
（結合領域を形成する工程）
洗浄後、移植片を、カップリング物質、好ましくは有機シランの溶液に浸す。表面コー
ティングにおけるシラン化合物の使用は、公知の工業プロセスである。Ａｒｋｅｌｓ Ｂ
．「Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ｓｉｌａｎｅｓ」．Ｃｈｅｍｔ
ｅｃｈ １９７７；７６６−７７８（本明細書中に、参考として援用される）。有機シラ
ンは、表面化学を保護し、変化させ得るだけでなく、カップリング剤として使用されて、
さらに別の化合物と基材の外側表面との結合を容易にさせ得る。
【００４７】
種々の化学官能基を有する市販の有機シランには、多くの異なる型がある。有機シラン
は、好ましくは、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基お
よびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む有機成分を含む。好ましい有機
成分は、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される
部分を含む。さらに好ましい有機成分は、エポキシ基、メタクリレート基、アルコキシ基
、ビニル基およびアルキルアミン基からなる群から選択される。最も好ましい有機部分は
、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される。
【００４８】
有機シランは、好ましくは、約１〜３個のハロゲンおよび約１〜３個のアルコキシ基か
らなる群から選択される置換基を含む。好ましいハロゲンは、塩素である。
【００４９】
好ましい有機シランは、特に表面がチタンの場合、ビニルメチルジクロロシラン（Ｇｅ
ｌｅｓｔ Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）である。有機シランは、有機溶媒中で
ある。有機溶媒は、実質的に、結合プロセスに負の影響を与えることなしに、溶液中の有
機シランを維持するのに有効な、任意の有機溶媒である。有機溶媒は、好ましくは、酸素
および／または窒素以外の元素を含む。適切な有機溶媒の例としては、アルカン、アルキ
レンクロライド、クロロホルム、キシレンおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、必
ずしもこれらに限定されない。好ましいアルカンはヘキサンであり、好ましいアルキレン
クロライドは、メチレンクロライドである。最も好ましい有機溶媒は、ヘキサンである。
有機溶媒中の有機シランのパーセンテージは、約１〜約１０重量パーセンテージまで変動
し得、好ましくは、約１重量パーセントである。
【００５０】
基材を、コーティングを形成するのに十分な時間、適切には約１〜約３０分間、代表的
には約１０分間、溶媒中に維持する。次いで、この基材を溶液から取り出し、大量の新た
な有機溶媒でリンスして、風乾させた。
【００５１】
（生物活性領域を形成する工程）
生物活性領域を形成するために、上記のように得られたケラチン粉末を、適切な溶媒に
溶解する。還元／還元ケラチンについて、適切な溶媒は水である。酸化／還元ケラチンに
ついて、適切な溶媒は、塩基を含む水溶液を含む。適切な塩基としては、水酸化アンモニ
ウム、水酸化ナトリウムおよび／または水酸化カリウムが挙げられるが、これらに限定さ
れない。好ましい塩基は、水酸化アンモニウムである。好ましい実施形態において、約１
５グラムのケラチン粉末を、約３０ｍＬの３Ｎ水酸化アンモニウムに溶解する。
【００５２】
無水溶媒を加える。適切な無水溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピル
アルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン、またはテトラヒドロフランが挙げられる
が、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジメチルスルホキシドである
。ケラチンおよび塩基の前記の重量および容積に、約２７０ｍＬのジメチルスルホキシド
を加える。この混合物を、穏やかに加熱しながら、ケラチンが溶解するまで攪拌する。
【００５３】
好ましくは、適切な触媒または開始剤を使用する。例えば、ビニル官能化シランカップ
リング剤を使用する場合、フリーラジカルを生成するために適切な開始剤または触媒を使
用する。そのような開始剤の例は、ＵＶ活性化された光開始剤（例えば、アントラキノン
−２−スルホン酸またはアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）である。前記の重量および容積に、約１．５グラ
ムのアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物を加える。得られる溶液を、
シランコーティング移植片に、これを完全に浸すように注ぐ。次いで、効果的なエネルギ
ー源（例えば、加熱ランプ、オートクレーブ、マイクロ波、またはＵＶランプ）を使用し
て、浸した基材のコーティングを硬化する。好ましいエネルギー源は、ＵＶランプ（λ＝
３６５ｎｍ、１．０５ａｍｐｓ）である。硬化は、コーティングを硬化するのに十分な時
間（代表的には、約１時間〜約２４時間、好ましくは、約２４時間）継続される。硬化後
、基材を溶液から取り出して、好ましくは、多量の脱イオン水を用いてリンスし、乾燥し
、好ましくは風乾する。
【００５４】
当業者は、前記のパラメータ（例えば、重量、容積、および時間）が、移植片の表面領
域、使用される特定の結合材料および他の因子に依存して変化し得ることを認知する。
【００５５】
本願は、以下の実施例（これは、単に説明であり、特許請求の範囲を特定の実施形態に
制限するものとして構成されるべきではない）を参照してよりよく理解される。以下の材
料と方法を、以下に記載する実施例において使用した：
（材料と方法）
（ケラチンの調製）
代表的な反応において、５００ｇの清浄な乾燥したヒト毛髪を、１２Ｌ丸底フラスコに
入れた。１重量パーセント／体積の過酸化水素８，３５０ｍＬを加え、この反応物を加熱
して１８０分間還流した。この毛髪を、濾過により液体から分離し、この液体を廃棄した
。毛髪を多量の水でリンスして、風乾させた。１００ｇの乾燥した、酸化した毛髪を、２
０００ｍｌ丸底フラスコに入れた。ｐＨ９にて（水酸化アンモニウムで調節する）、１０
００ｍＬの１Ｍチオグリコール酸を加え、この混合物を窒素雰囲気下、２４時間にわたっ
て６０℃まで加熱した。還元抽出後、固体を遠心分離により液体から分離した。濾過した
液体を、８倍の容量過剰のエタノールに滴下し、それによってケラチンの沈殿を形成させ
た。形成したケラチンを濾過によって分離し、減圧下で乾燥した。ケラチンを乳鉢と乳棒
を使用して微粉末に挽いた。
【００５６】
細胞応答に使用するために非常に制御され、かつ十分に特性化された表面を有するグリ
ットブラストチタン試験ディスクを、調製した。選択された材料は、医療等級で市販され
ている純粋なチタンである（Ｃ．Ｐ．Ｔｉ）。この材料を、大きなシート（約５フィート
×４フィート×０．０５０インチ、全てのサンプルセットについて金属同質性を確保する
ため）として、Ｔｉｍｅｔ（Ｏ’Ｆａｌｌｏｎ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【００５７】
１フィート×１フィートシートを、元の大きな単一シートから切り取った。各ディスク
について、一貫した表面の仕上がりを確保するために、これらのシートにおいて表面調製
を行なった。各１フィート×１フィートシートを、＃２０グリット酸化アルミニウム（Ａ
ｌ２Ｏ３）粉末を粗い表面の仕上がりのために使用し、圧縮空気を用いた酸化アルミニウ
ムグリットブラストプロセスに供した；グリッドブラストは、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって
行なわれた。
【００５８】
表面の仕上がり操作の品質制御を行い、これを、表面の粗さの均一性測定により評価し
た。ダイヤモンド針接触側面計を使用して、表面の粗さを、各１フィート×１フィートの
プレート上の異なる１０個の位置で測定した。この粗さ測定を、あらゆる方向で行なった
。平均Ｒａは、９．５６μｍであり、標準偏差は１．６３μｍであった。
【００５９】
直径１４．７５ｍｍおよび厚さ０．８０ｍｍを有するディスクを、細胞アッセイのため
に調製した。ディスクを、洗浄剤溶液で３回洗浄し、各洗浄の間にＤＩ水で２回リンスし
た。最後のリンスの後、エタノールをディスクに注ぎ、過剰な水を除去した。ディスクを
風乾した。
【００６０】
（チタンディスクのコーティング）
代表的な手順において、チタンディスクを、ジクロロメタンおよび脱イオン水中での連
続した超音波処理により洗浄した後、風乾した。ディスクを、ヘキサン中１重量％のビニ
ルメチルジクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）溶液に
１０分間浸した。各ディスクを、個別に溶液から取り出して、多量の新たなヘキサンでリ
ンスし、風乾させた。
【００６１】
代表的なケラチンコーティング工程において、１５グラムのケラチン粉末を、３０ｍＬ
の３Ｎ水酸化アンモニウムに溶解した。２７０ｍＬのジメチルスルホキシドを加えて、こ
の混合物を穏やかに加熱しながら、ケラチンが溶解するまで攪拌した。１．５グラムのア
ントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋ
ｅｅ，ＷＩ）を加えて、この溶液を、シランコーティングされたチタンディスクサンプル
に注ぎ、ディスクサンプルを、浅いガラス皿に完全に浸した。このガラス皿を、ＵＶラン
プ（λ＝３６５ｎｍ、１．０５ａｍｐｓ）下に２４時間、置いた。ＵＶ曝露後、各ディス
クを溶液から取り出して、多量の脱イオン水でリンスし、風乾させた。
【００６２】
（水接触角）
水平な表面に１滴の超純水１００μＬを置くことによって、接触角を、光学コンパレー
タ上で測定した。測定値を得る前に、界面エネルギーを３０秒間平衡化させた。
【００６３】
（Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ））
Ａｌ単色源（１４８６．６ｅＶにてＡｌ Ｋα放射）を備える物理電子工学ＰＨＩ５７
００ＥＳＣＡシステムを使用して、ＸＰＳデータを得た。分析の間、ＸＰＳ超高真空チャ
ンバ中の基本圧力は、２×１０−１０トールであった。０．１ｅＶの工程サイズおよび１
１．７５ｅＶのパスエネルギーを用いて、高解像スキャンを得た。シランおよびケラチン
コーティングの存在を、これらの各コーティングのみに存在する元素の原子濃度を探知す
ることによってモニターした。シランコーティングには、シリコンを使用し、ケラチンコ
ーティングには、窒素を使用した。硫黄がまた、ケラチン中に存在し、ＸＰＳにより検出
されるが、硫黄のシグナルとノイズの比が、ほぼ１．５であり；それゆえ、硫黄シグナル
について計算される原子の濃度は、エラーバーと同じオーダーにあったので、本研究では
硫黄を使用しなかった。
【００６４】
ＸＰＳはまた、フィルム厚さを測定するために使用した。清浄な基材のシグナルが公知
である場合、フィルムを上に有するこの基材由来のＸＰＳシグナルは、以下の標準減衰式
を使用して、計算され得る：
Ｎ＝Ｎ０・ｅｘｐ［−ｔ／（λ・ｓｉｎθ）］
ここで、Ｎは、フィルムを上に有する基材のＸＰＳシグナル（ピーク下の領域）であり、
Ｎ０は、清浄な基材のＸＰＳシグナルであり、ｔは、フィルムの厚さであり、λは、フィ
ルム中の光電子の平均自由光路（本研究において、２０Åであると想定される）であり、
θは、ＸＰＳ検出器と表面の間の角度であり、この場合、４５°に等しい。Ｃ．Ｓ．Ｆａ
ｄｌｅｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８４；１６
：２７５−３８８（本明細書中で参考として援用される）。
【００６５】
（骨芽細胞培養アッセイ）
α−最小基本培地（α−ＭＥＭ）をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，
ＮＹ，ＵＳＡ）から、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）をＳｕｍｍｉｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）から購入した。ホルマリンをＥｌｅｃ
ｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。全ての他の試薬を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．
（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【００６６】
骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）プロモータにより駆動された２Ｔ３細胞株は、トラ
ンスジェニックマウスから単離され、クローン化されている。Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈ
ｕｒｙ Ｎ，Ｗｉｎｄｌｅ ＪＪ，Ｋｏｏｐ ＢＡ，Ｈａｒｒｉｓ ＭＡ，Ｇｕｅｒｒｅ
ｒｏ，ＤＬ，Ｗｏｚｎｅｙ ＪＭ，Ｍｕｎｄｙ ＧＲ，およびＨａｒｒｉｓ ＳＥ．「Ｉ
ｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆ
ｒｏｍ ＢＭＰ２−Ｔ−ａｎｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｍｉｃｅ」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９６；１３７：３３１−３３９（本明細書
中に参考として援用される）。
【００６７】
これらの細胞は、インビトロで骨マトリックス形成を起こす。２Ｔ３細胞を、１群あた
り１プレートの１２−ウェルプレートにおいて、各チタンディスク上にプレートした。１
０％ＦＢＳで補充したα−ＭＥＭを用いて、細胞が９０％コンフルーエンスに達するまで
（約５日）培養した。培地を、１日おきに変えた。一旦、細胞がコンフルーエンスに達す
ると、培地を、処理群について５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＡｓＡ）
および５ｍＭ β−グリセロリン酸（β−ＧＰ）含有α−ＭＥＭに変え、コントロール群
についてＡｓＡおよびβＧＰ無しの５％ＦＢＳα−ＭＥＭに変えた。この培地を、３日お
きに変えて、処理期間の最終日である１４日までに新たな試薬を加えた。細胞を３７℃、
５％ＣＯ２で培養した。
【００６８】
（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色）
Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ細胞染色を、以前に出版された手順から改変した。Ｂｅｒｅｓｆｏ
ｒｄ ＪＮ，Ｇｒａｖｅｓ ＳＥ，およびＳｍｏｏｔｈｙ ＣＡ、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｎｏｄｕｌｅｓ ｂｙ ｂｏｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ：ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
？」。Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３；４５：１６３−７８。
【００６９】
２Ｔ３細胞を、チタンディスク上に固定するために、最初に細胞を、ＰＢＳ出洗浄して
、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で１０分間固定した。このホルマリン溶液を吸引し、細
胞を、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）でリンスした。新たな２％硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を、細胞
に加え、次いで、細胞を有するチタンディスクを、１０分間直射日光下に置いた。１０分
後、ＡｇＮＯ３を取り除いて、２Ｔ３細胞を、ｄＨ２Ｏの安定な気流下でリンスした。５
％チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）溶液を、細胞に３分間にわたって添加した。Ｎ
ａ２Ｓ２Ｏ３を取り除いて、細胞をｄＨ２Ｏで再びリンスした。以下のエタノール（Ｅｔ
ＯＨ）シリーズを、細胞に適用した：３０秒間の９５％ＥｔＯＨ、もう一度これを繰り返
した後、各３０秒間の１００％ＥｔＯＨ適用を２回行なう。次いで、細胞を風乾させた。
【００７０】
（走査型電子顕微鏡検査）
表面形態学の画像を得るために、細胞を有するチタンディスクを、１０秒間スパッタコ
ータ−で、金／パラジウム（Ａｕ／Ｐｄ）コーティングした。チタン表面の画像を、Ａｍ
ｒａｙ走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ａｍｒａｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に
、１５ｋＶにて得た。画像を、３つの倍率：１００×、５００×および１，０００×
で得た。
【００７１】
（統計的方法）
示される場合、サンプル群間の違いを、不均等分散で生徒の両側スチューデントｔ−検
定を使用して決定した。統計的有意差を、０．０５未満のｐ値に設定した。
【実施例】
【００７２】
（実施例１）
本研究において、フリーラジカル付加化学を使用して、ケラチンを、コーティングされ
たガラスおよびチタン基材上に移植するために、ビニル官能化シランカップリング剤を使
用した。ＵＶ活性化光開始剤（アントラキノン−２−スルホン酸）を、フリーラジカル生
成のために使用したが、別の触媒による熱開始反応もまた、使用され得る。このプロセス
の最初の工程において、基材の優れたコーティングを、シランのヘキサン溶液に浸漬する
ことによって達成した。図１に示されるように、チタンディスクの水接触角において得ら
れた増加は、平均して３８°だった。処理群としては、光開始剤（図１において「ｃａｔ
．（触媒）」と示される）の存在下、および非存在下の両方において、シランカップリン
グを有するケラチンコーティングおよびシランカップリングを有さないケラチンコーティ
ングの種々の組み合わせが挙げられる。これは、２工程コーティングアプローチの有効性
を確かめるために行なわれた。全てのサンプル群は、コントロールチタン群の接触角（ｐ
≦０．０５の統計的有意差）と異なる接触角を生じたが、シランコーティングの全処理後
のケラチンの共有結合接合により、非処理のコントロールと比べて、接触角の最も効果的
な減少を生じた。完全に処理したチタンディスクサンプルは、７．６°の平均接触角を有
した。ガラス基材についての結果は、非処理のコントロールと完全に処理されたサンプル
との間の接触角の１６．５°の減少と同様である。ケラチン処理されたガラスは、９．０
°の平均接触角を有した。これらのデータを、図２に示す。一旦、チタンディスクおよび
ガラス顕微鏡スライドの両方が、コーティングされ得ることが決定されると、チタンディ
スクのみを、さらなる評価に使用した。
【００７３】
前に述べたように、チタンディスクを、シランのヘキサン溶液に浸漬することによって
、首尾よいコーティングを得た。非処理のチタンディスクおよびシランコーティングされ
たチタンディスク由来のＸＰＳ Ｓｉ２ｐシグナルを、図３Ａに示す。約２０％の原子濃
度に相当するコーティングされたディスク由来のＳｉシグナルは、非処理のディスクの３
％未満の原子濃度と比べると、明かに、シランコーティングの存在を示している。非処理
のディスク上の少量のＳｉは、おそらく表面汚染のためであった。ケラチンの添加により
、約３％（非処理ディスクにおけるバックグランドレベル）から８．５％までの窒素原子
濃度が増加した。図３Ｂは、非処理チタンディスク由来の代表的なＮ１ｓ ＸＰＳシグナ
ルならびにシラン、触媒およびケラチンでコーティングされたサンプルの代表的なＮ１ｓ
ＸＰＳシグナルを示す。異なる処理群において測定されたＳｉおよびＮの原子濃度を、
図４に示す。これら２つの元素の濃度は、有機シランおよびケラチンの存在と非常によく
相関していた。
【００７４】
シランコーティングにおける触媒およびケラチンの添加により、Ｓｉの原子濃度が減少
した。これは、異なったさらなるコーティングによるシリコンシグナルの減衰に起因する
。チタンＸＰＳシグナルを、上記の減衰式に使用して、全フィルムの厚さを計算した。結
果を、図５に示す。シラン＋「触媒」またはケラチンを有するフィルムの厚さの変化は、
おそらく、シランフィルム自体の厚さの変化のためである。それにもかかわらず、触媒＋
ケラチンフィルムおよびケラチンのみのフィルムから、シランコーティング存在下で、ケ
ラチンフィルムはより頑丈であることが明らかである。
【００７５】
シランフィルムの変化をなくして、ケラチンコーティングの厚さをさらに正確に決定す
るために、基材としてシランを処理して、シランコーティングされたディスク由来のシリ
コンシグナルを使用した減衰式を使用して、シランフィルム表面のケラチンコーティング
の厚さを計算した。シランのみでコーティングされたディスク由来のＳｉ２ｐ ＸＰＳシ
グナルを、この場合において、清浄な基材のシグナルとして使用した。幾つかの異なるサ
ンプルの結果を、図５の括弧内に示す。このデータは、ケラチンコーティングの平均の厚
さが、約８．５Åであることを示す。
【００７６】
ケラチンコーティングされたチタンディスク上の骨芽細胞の分化および石灰化を、ディ
スク表面のｖｏｎ Ｋｏｓｓａ分析によって実証した。小結節形成が、インビトロでの石
灰化に重要な工程であると考えられる。
【００７７】
１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸および５ｍＭ β−グリセロリン酸の存在（＋）下ま
たは非存在（−）下で、細胞を、５％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で培養した。ＡｓＡおよ
びβ−ＧＰ無し（−）のｖｏｎ Ｋｏｓｓａ分析により実証されたように（パネルＡおよ
びＣ）、骨芽細胞の分化および石灰化は、より小さく僅かな小結節を示した。２週間後、
２Ｔ３細胞は、１００μｇ／ｍｌ ＡｓＡおよび５ｍＭ β−ＧＰの存在（＋）下で、移
植片表面上に大きな小結節を石灰化することが観察された（パネルＢおよびＤ）。画像Ａ
およびＢは、１００×倍率（スケールバー＝１００μｍ）で得られ、画像ＣおよびＤは、
１，０００×倍率（スケールバー＝１０μｍ）で得られた。
【００７８】
インビトロでの小結節の石灰化は、インビボで生成される線維性骨に似ているように見
える。２週間後、２Ｔ３細胞は、ＡｓＡおよびβ−ＧＰを有する、または有さない移植片
表面上の培養において、石灰化することが観察された。２週目におけるＡｓＡおよびβ−
ＧＰなしの細胞のｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色は、より小さくわずかな小結節を示した（図６
Ａおよび６Ｃ）。対照的に、ＡｓＡおよびβ−ＧＰで処理したディスクには、より多くの
大きな小結節が存在した（図６Ｂおよび６Ｄ）。コラーゲンコーティング基材上の２Ｔ３
骨芽細胞における小結節形成を誘導するＡｓＡおよびβ−ＧＰの能力は、以前に報告され
ている。本研究において、本発明者らは、ケラチンコーティング基材について類似の結果
を見出し、従って、これは、生体適合性を示す。
【００７９】
チタン基材上にケラチンコーティングを適用するための２工程の浸漬プロセスは、それ
ぞれ水接触角およびＸＰＳスペクトルデータにより実証されるように、親水性かつ頑強な
フィルムを生じた。このプロセスは、ケラチンが表面に共有結合するために、より生体安
定なコーティングを生じるはずである。このコーティングプロセスは、シランおよびケラ
チンの両方の非常に薄い層を生じ、表面の粗いチタン移植片表面への細胞の接着を促進す
るために、移植片の製造業者によりしばしば使用される表面形態学と干渉しないと予測さ
れる。２Ｔ３骨芽細胞アッセイは、コーティングが、接着、増殖および分化を促進したこ
とを示した。これらの細胞の、骨マトリックスを生成する能力は、ケラチンコーティング
骨伝導性特性を示す。さらなる研究において、本発明者らは、これらのケラチンコーティ
ングが骨の増殖速度を加速し得ることを示すことを意図している。
【００８０】
当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上記の本発明に対して多く
の改変がなされ得ることを理解する。本明細書中に記載される実施形態は、例示のみを意
味し、添付の特許請求の範囲において規定される本発明を制限するものとして理解される
べきでない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１１２３３（Ｐ２０１２−１１２３３Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２２７３９２（Ｐ２０１１−２２７３９２）
【出願日】平成２３年１０月１４日（２０１１．１０．１４）
【分割の表示】特願２００４−５２４７８９（Ｐ２００４−５２４７８９）の分割
【原出願日】平成１５年７月２５日（２００３．７．２５）
【出願人】（５０３３４５５１４）ケラプラスト テクノロジーズ， リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２７３９２（Ｐ２０１１−２２７３９２）
【出願日】平成２３年１０月１４日（２０１１．１０．１４）
【分割の表示】特願２００４−５２４７８９（Ｐ２００４−５２４７８９）の分割
【原出願日】平成１５年７月２５日（２００３．７．２５）
【出願人】（５０３３４５５１４）ケラプラスト テクノロジーズ， リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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