ゲノムＤＮＡの精製のための簡単な負荷および溶離プロセス
ゲノムＤＮＡの単離のための新規の２工程のクロマトグラフィー的精製プロセス（負荷および溶離）を提供する。この方法では、試料をカラムに負荷し、いかなる中間の洗浄の工程も無しでゲノムＤＮＡ産物を直接溶離する。これは出入り制限樹脂（すなわちリッドビーズ）を利用することにより成し遂げられ、それは用意するのが容易であり、異なる特性を有する２つの層および外側の層の上の非機能性表面で構成される。内側の層はイオン交換体として働く官能基で修飾されている。小さい分子、例えばＲＮＡおよびタンパク質はその樹脂の内部に入ることができ、より大きいゲノムＤＮＡ分子はその樹脂を通過するであろう。ＲＮＡおよびタンパク質は出入り制限樹脂の内側の層で捕えられ、一方でゲノムＤＮＡは素通り画分中にすぐに溶離される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００８年８月２５日に出願された米国仮特許出願番号６１／０９１，５７３に対して優先権を主張し；その開示をそのまま本明細書に援用する。
技術分野
この発明は概して生物学的試料からの核酸の分離および単離のための方法に関する。特に、本発明は他の構成要素を含む混合物からのゲノムＤＮＡの精製のための簡単なクロマトグラフィー的プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
この３０年間で、生物学的源からの核酸およびタンパク質の単離および精製のための向上した方法の開発においてかなりの努力があった。これは主に医学および生物科学における核酸およびタンパク質の適用の増大によるものである。血液、組織または培養細胞から単離されたゲノムＤＮＡはいくつかの適用を有しており、それにはＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、ハイブリダイゼーションおよびサザンブロッティングが含まれる。プラスミドＤＮＡは配列決定、ＰＣＲにおいて、ワクチンの開発において、および遺伝子療法において利用されてきた。単離されたＲＮＡは、ブロットハイブリダイゼーション、インビトロ翻訳、ｃＤＮＡ合成、およびＲＴ−ＰＣＲを含む様々な下流の適用を有する。同様に、単離されたタンパク質はウェスタンブロット、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、酵素活性分析、タンパク質−タンパク質相互作用、および発現分析のために使用することができる。
【０００３】
現在、ＤＮＡ（ゲノムおよびプラスミド）、ＲＮＡおよびタンパク質の精製に関していくつかの市販品を利用することができる。それらはシリカに基づく膜精製、イオン交換樹脂、ｃｈａｒｇｅ ｓｗｉｔｃｈ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたは磁気ビーズに基づく精製のいずれかを利用している。これらの異なる技術は全て、負荷、不純物の洗い落としおよび望まれる生成物（単数または複数）の溶離の、同じクロマトグラフィーの原理を利用している。例えば、細胞からのゲノムＤＮＡの単離に関して、その精製プロセスの最初の工程は未処理の（ｃｒｕｄｅ）細胞溶解物をカラムに負荷することである。第２の工程において、適切な洗浄緩衝液を用いて結合したＤＮＡから不純物を洗い落とす。最後に、溶離緩衝液を用いてＤＮＡを溶離する。過去３０年の間にこの領域において数え切れない報告が発表されたにも関わらず、負に荷電した核酸を互いから、および他の負に荷電した構成要素、例えばタンパク質から分離するのはまだ複雑で困難な仕事のままである。
【０００４】
核酸の分離に関して、２種類の主な原理が以前に用いられていた：
１．分離媒体は堅固に取り付けられた結合基（ｌｉｇａｎｄ）構造を有し、望まれる核酸および不純物は、それに結合した状態になる、またはそれから脱着する異なる能力を有する。典型的にはその結合基構造は陰イオン交換基であり、分離はイオン交換に基づく、例えばイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）である(参考のため、米国特許出願ＵＳ ２００５／０２６７２９５において言及されているそれらを参照)。
【０００５】
２．分離媒体は望まれる核酸または不純物の一方の、細孔内部でのより容易な輸送を可能にする細孔の大きさを有する。その分離はゲル濾過（ＧＦ）として行われる（同書）。
異なる分離機能性を有する内側部分および外側表面層を有する分離媒体が以前に記述された。これらの媒体の一部は、吸着性マトリックス（出入り制限ビーズと呼ばれることもある）の内側部分の中へのより大きな分子の通過を妨げる遮蔽層（外層、ロック、リッド）を有する。これらの媒体はタンパク質、プラスミド、炭水化物、脂質等の分離のために使用することができることが提案されている：ＷＯ １９９８／０３９０９４、ＷＯ １９９８／０３９３６４、ＵＳ ２００５／０２６７２９５、米国特許第７，２０８，０９３号およびGustavsson P.-E. et al. Journal of Chromatography A, 1038: 131-140 (2004)。しかし、これらのいずれもゲノムＤＮＡの精製のための簡単なプロセスを開示または教示していない。
【０００６】
ゲノムＤＮＡの精製のための簡単かつ効果的な方法に関する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願ＵＳ ２００５／０２６７２９５
【特許文献２】ＷＯ １９９８／０３９０９４
【特許文献３】ＷＯ １９９８／０３９３６４
【特許文献４】ＵＳ ２００５／０２６７２９５
【特許文献５】米国特許第７，２０８，０９３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gustavsson P.-E. et al. Journal of Chromatography A, 1038: 131-140 (2004)
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明の目的はゲノムＤＮＡの精製のための方法を提供することであり、その方法は、（ａ）操作の簡単さ、（ｂ）増大したゲノムＤＮＡの純度および収率、ならびに（ｃ）関係する工程の数の減少に関して向上している。
【００１０】
従って、本発明は、ゲノムＤＮＡの精製のための新規の２工程のクロマトグラフィー的精製プロセス（負荷および溶離）を提供する。この新規の精製法では、試料をカラムに負荷し、いかなる中間の洗浄の工程も無しでゲノムＤＮＡ産物を直接溶離する。この単純化された精製法は、出入り制限樹脂（すなわちリッドビーズ）を利用することにより成し遂げられ、それは用意するのが容易であり、異なる特性を有する２つの層および外側の層の上の非機能性表面で構成される。内側の層はイオン交換体として働く官能基で修飾されている。小さい分子、例えばＲＮＡおよびタンパク質はその樹脂の内部に入ることができ、より大きいゲノムＤＮＡ分子はその樹脂を通過するであろう。ＲＮＡおよびタンパク質は出入り制限樹脂の内側の層で捕えられ、一方でゲノムＤＮＡは素通り画分（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中にすぐに溶離される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は実施例１において記述される原理証明試験において溶離されたゲノムＤＮＡの電気泳動のゲルの画像を示す。
【図２】図２は実施例２において記述される方法を用いて血液試料から単離されたゲノムＤＮＡの電気泳動のゲルの画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の第１観点は、異なる大きさを有するが同じ結合基構造に関して親和性を有する他の生体分子を含む試料からの、ゲノムＤＮＡのための簡単な２工程のクロマトグラフィー的精製プロセスである。言い換えると、その方法は、大きさが異なるが共通の結合基構造に関して親和性を有する他の生体分子からのゲノムＤＮＡの分離を意味する。
【００１３】
従って、その方法は、ゲノムＤＮＡおよび他の生体分子構成要素を含む試料溶液を用意する；その試料を分離マトリックスと接触させて他の構成要素を結合させる；ならびに精製されたゲノムＤＮＡを含む液相を集める工程を含む。必要であれば、回収されたゲノムＤＮＡをさらに精製することができる。
【００１４】
本発明の方法の独特の特徴は、用いられる分離マトリックスが（ａ）ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有し、その他の構成要素にとって出入り可能である内側部分；ならびに（ｂ）実質的にゲノムＤＮＡを吸着せず、その他の構成要素によりゲノムＤＮＡよりも容易に浸透される外側表面層を有することである。
【００１５】
これは、その外側表面層は試料中の物質にとって対流物質輸送により出入り可能であり、そのマトリックスの内側部分は拡散物質輸送によってのみ出入り可能であることを意味する。従って、その外側表面層は対流環境を拡散環境から制限している境界層と考えてよい。
【００１６】
その外側表面層は、多孔性粒子の外側表面に、またはマクロ細孔およびミクロ細孔の両方を含む粒子の内部の、もしくはモノリスの内部のマクロ細孔の表面に位置していてよい。その細孔は、少なくとも外側表面層において、ゲノムＤＮＡおよび他の細胞の構成要素（例えばＲＮＡおよびタンパク質）に関する見かけ上の分子サイズ（流体力学半径）の間の見かけ上の分子サイズに相当する、化合物の流入に関する分子サイズのカットオフ値を有する。内側部分は、外側表面層における細孔と同じ分子カットオフ値を有する細孔を有していてよく、またはこれらの細孔よりも大きい、もしくは小さい細孔を有していてよい。内側部分はこれらの細孔の大きさの組み合わせを含んでいてもよい。
【００１７】
“実質的にゲノムＤＮＡを吸着しない外側表面層”という表現は、少なくともその層の表面には吸着性の結合基構造が本質的に無いことを意味する。
その外側表面層は反発構造、例えばゲノムＤＮＡと同じ電荷を有する構造；疎水性構造等も含んでいてよい。反発構造は、その外側表面層を通る輸送における選択性を向上させる可能性がある。ＷＯ １９９８／０３９３６４を参照。
【００１８】
“その他の構成要素によりゲノムＤＮＡよりも容易に浸透される”という表現は、その他の構成要素はゲノムＤＮＡよりも実質的に速く外側表面層を通って輸送されることを意味する。これは、ゲノムＤＮＡが内側部分から完全に排除されることを含む。
【００１９】
“ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有する”という表現は、その物質のそれぞれがその結合基構造に、もしそれらがそれに出入りした場合に結合することができることを意味する。従って、ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の間のビーズへの結合に関する選択性の違いは、主に外側表面層の細孔の大きさによりもたらされ、結合基構造への親和性自体の違いによるものでは無い。
【００２０】
試料
試料は異なる源に由来することができ、様々な方法で調製することができる。それは血液試料、組織試料、培養細胞等に由来するものであってよい。それは未処理の細胞抽出物または細胞溶解物の形であってよい。それは粒子状物質、タンパク質、核酸の特定の画分を除去するための遠心分離、濾過、限外濾過、透析、沈殿等、濃縮、脱塩等を経た、処理された試料であってもよい。従って、任意ではあるが、次のことを行うのが慣習である：
（ａ）核酸を吸着剤上に捕捉する、および／または分画する前に、試料のタンパク質を沈殿させる、
（ｂ）もしＤＮＡ画分を単離するのであれば、ＲＮＡを沈殿させる、または分解する、
（ｃ）試料をイオン交換体等に適用する場合は、脱塩および／または希釈によりイオン強度を低下させる。
【００２１】
妨げとなる物質を除去するために、他の方法論を適用してもよい。多くの場合、本発明において用いられる試料は本質的に粒子状物質を含まない。
試料は典型的には水性である。
【００２２】
ゲノムＤＮＡから分離される他の構成要素は、ＲＮＡまたは結合基構造に結合することができる構造を含む限り全ての他の化合物であってよい。これは、その他の構成要素がタンパク質／ポリペプチド、または炭水化物、脂質、界面活性剤、細胞もしくはその一部等であってよいことを意味する。本発明の重要な変形において、その他の構成要素は核酸構造物（オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ）を含む。
【００２３】
物質の見かけ上の分子サイズは、（ａ）その分子量、および（ｂ）適用された条件の下でのその形状により決定される。従って、その見かけ上の大きさはｐＨ、イオン強度、塩のタイプおよび温度の変化によって変化する可能性がある。これは特にバイオポリマー、例えば高分子量の核酸およびタンパク質に当てはまる。内側部分の内部および外側表面層の内部の細孔の大きさと望まれる分子の見かけ上の大きさの適合は、異なる内側部分および遮蔽層（外側の細孔）の分子サイズ排除の振る舞いを試験することにより容易になされる。様々なサイズ排除分離媒体に関係する物質のサイズ排除の振る舞いから結論を引き出すことも可能であろう。サイズ排除クロマトグラフィーからの一般的な知識が当てはまる。
【００２４】
外側表面層の分子サイズカットオフ値を適切に設定することにより、本発明の接触させる工程は試料の２つの画分への分離を容易にするであろう。一方の画分はその分子サイズカットオフ値より上の見かけ上の大きさのゲノムＤＮＡを含む。第２の画分はその分子サイズカットオフ値より下の大きさを有する他の構成要素を含む。従って、本発明は様々な長さのゲノムＤＮＡをＤＮＡ、ＲＮＡ等のより小さい断片から分離することを可能にするであろうと予想することができる。典型的には、ゲノムＤＮＡの精製に関して最も有用な分子サイズカットオフ値は、有用なゲノムＤＮＡに関する見かけ上の分子サイズに相当する区間の中にある、すなわち１〜２０ｋｂｐ（キロ塩基対）の区間の中にあるであろう。これは、より大きな分子がその内側部分に浸透することが許される場合、そのカットオフ値をより大きくすることができることを排除せず、例えばその区間は１から４０ｋｂｐまでの長さを有するゲノムＤＮＡに対応していてよい。
【００２５】
本発明の好ましい方式において、その外側表面層の分子サイズカットオフ値は、望まれるゲノムＤＮＡが液体中に保持される、すなわち、かなりの程度までそのマトリックスの内側部分の中に輸送されることが決して無いように設定される。主な利点の１つは、ゲノムＤＮＡが次いで収率を低下させＤＮＡの変性／分解を引き起す可能性がある吸着／脱着プロセスを経る必要が無いことである。
【００２６】
分離マトリックス
本発明は分離マトリックスとして異なる特性を有する２つの層で構成される多孔性のポリマー性粒子を利用する。特定の態様において、その粒子は中性の、すなわち電荷の無い、または非機能性外層を提供する。特定の好ましい態様において、その粒子は米国特許出願公開ＵＳ ２００５／０２６７２９５において記述されている方法に従って、あるいは米国特許第７，２０８，０９３号において記述されている方法に従って製造され、その開示をそのまま本明細書に援用する。
【００２７】
その分離マトリックスは、ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有し、その他の構成要素にとって出入り可能である内側部分（すなわち内側の細孔）；ならびに実質的にゲノムＤＮＡを吸着せず、その他の構成要素によりゲノムＤＮＡよりも容易に浸透される外側表面層を有する。これは、その外側表面層は試料中の物質にとって対流物質輸送により出入り可能であり、そのマトリックスの内側部分は拡散物質輸送によってのみ出入り可能であることを意味する。従って、その外側表面層は対流環境を拡散環境から制限している境界層と考えてよい。
【００２８】
（１）結合基構造
内側の細孔系の表面に結合している結合基は、クロマトグラフィーにおいて結合基として一般的に用いられるあらゆる周知の基、またはそれらの組み合わせ、例えば親和性基、疎水性相互作用基、イオン交換基、例えば負に荷電した陽イオン交換基もしくは正に荷電した陰イオン交換基等であることができる。従って、本文脈において、“結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）”という用語はあらゆる種類の吸着または結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を指す。従って、本方法の１態様において、その結合する基はイオン交換基である。特定の態様において、その陰イオン交換体はジエチルアミン（ＡＮＸ）またはエチレンジアミン（ＥＤＡ）である。
【００２９】
本出願に関する最も明らかな結合基構造は、正に荷電した基（陰イオン交換基）を含む。陰イオン交換基は原則的にあらゆる負に荷電した種に結合する。従って、これらの種類の結合基構造は本発明においてゲノムＤＮＡからあらゆる負に荷電した種を分離するために用いることができる。唯一の要求は、見かけ上の分子サイズにおける違いが十分に大きくあるべきであることである。１つの、および同じマトリックスが２種類以上の異なる結合基、例えば陰イオン交換結合基を含んでいてよい。
【００３０】
好ましい陰イオン交換結合基は、結合すべき物質との混合方式での相互作用を提供し、および／または穏やかなアルカリ性のｐＨ値におけるｐＨスイッチ（ｐＨの増大）による脱電荷（ｄｅｃｈａｒｇｉｎｇ）を可能にする。その脱電荷の能力は、その陰イオン交換結合基が第一級、第二級および第三級アンモニウム基を、好ましくは１０．５以下、または１０．０以下のｐＫａを有する第一級、第二級および第三級アンモニウム基を、すなわち、典型的な第一級または第二級アンモニウム基を含むことを意味する。最も好ましいと考えられる変形において、本質的に全ての陰イオン交換基はこの基準に従うべきである。
【００３１】
“その陰イオン交換結合基は、結合すべき物質との混合方式での相互作用を提供する”という用語は、結合すべき物質と相互作用する、少なくとも２種類の異なるが協同的な部位を提供することができる結合基を指す。これらの部位の一方は、結合基および目的の物質の間の誘引型の電荷−電荷相互作用をもたらす。第２の部位は、典型的には水素結合を含む電子供与体−受容体相互作用をもたらす。
【００３２】
電子供与体−受容体相互作用は、フリーの電子対を有する電気陰性の原子が供与体として働き、供与体の電子対の受容体として働く電子不足の原子に結合することを意味する。Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973)の４２ページを参照。
【００３３】
（２）マトリックスの内側部分
マトリックスのこの部分は、典型的には親和性吸着、例えばクロマトグラフィーの内部で一般的に利用されているものと同じタイプのものである。その内側部分はマクロ細孔およびミクロ細孔の両方を含んでいてよい。
【００３４】
その内側部分は好ましくは親水性であり、水中で不溶性であり多少膨潤可能であるポリマーの形である。親水性ポリマー類は典型的には極性基、例えばヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、エステル、低級アルキル類のエーテル（例えば（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎＨ、（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−）ｎＨ、ならびにエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体である基を有する（例えばＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））（ｎは０より大きい整数、例えば１、２、３〜１００である）。誘導体化されて親水性になった疎水性ポリマー類もこの定義に含まれる。適切なポリマー類は、ポリヒドロキシポリマー類、例えば多糖類、例えばアガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン等に基づくもの、ならびに完全に合成によるポリマー類、例えばポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエステル）類、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）類、およびポリメタクリレート類（例えばポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール類、ならびにスチレン類およびジビニルベンゼン類に基づくポリマー類、ならびに上記のポリマー類に対応するモノマーの２種類以上が含まれるコポリマー類である。水溶性であるポリマー類は、例えばクロスリンクにより、および吸着または共有結合による不溶性マトリックスへのカップリングにより、誘導体化して不溶性にすることができる。親水性の基を疎水性ポリマー上に（例えばモノビニルおよびジビニルベンゼン類のコポリマー上に）、ＯＨに変換することができる基を示すモノマーの重合により、または最終的なポリマーの親水化（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）により、例えば適切な化合物、例えば親水性ポリマー類の吸着により導入することができる。
【００３５】
その内側部分は無機材料、例えばシリカ、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタル等に基づくものであることもできる。その内側部分は、好ましくは加水分解的に不安定な基、例えばシラン、エステル、アミド基およびシリカ自体の中に存在する基を持たない。本発明の特に興味深い態様において、その内側部分は、１〜１０００μｍ、好ましくは５〜１０００μｍの範囲の大きさを有する不揃いな、または球状のビーズの形である。その内側部分は多孔性のモノリスの形であってもよい。
【００３６】
その結合基構造は、その内側部分の中に、当技術で既知の方法により導入される。必要とされる結合基構造に関する置換の程度（結合基構造の密度）は、結合基のタイプ、マトリックスの種類、結合すべき化合物等に依存するであろう。通常、それは０．００１〜４ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックス、例えば０．０１〜１ｍｍｏｌの区間において選択される。アガロースに基づくマトリックスに関して、その密度は通常０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスの範囲内である。デキストランに基づくマトリックスに関して、その区間は０．５〜０．６ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスまで上方に拡張されてよい。
【００３７】
前の段落で与えられた範囲は、そのマトリックスが完全にプロトン化された形で塩化物イオンを結合する能力を表す。“ｍｌマトリックス”は、水で飽和したマトリックスを指す。その外側表面層は、これらの範囲の計算においてそのマトリックスに含まれる。
【００３８】
（３）外側表面層
外側表面層（シード（ｓｈｉｅｄ）、ロック）は、液体試料により浸透可能でなければならない。水性の液体に関して、これはその外側表面層が親水性ポリマーで構築されているべきであることを意味する。
【００３９】
外側表面層の作製に関して、異なる方法論が存在する。その方法の１つは、むき出しの形の多孔性粒子の表面、またはマクロ細孔およびミクロ細孔の両方を有する粒子の、もしくはモノリスのマクロ細孔の表面を親水性ポリマーでコートすることを含む。その親水性ポリマーの見かけ上の分子サイズは、内部の一部であることを意図されている細孔に著しく浸透することができないように選択されるべきである。好ましくは、その親水性ポリマーは上記で論じられた親水性の基を含み、例えばそれはポリヒドロキシポリマー、例えば可溶性の形の多糖類（デキストラン、アガロース、デンプン、セルロース等）である。その結合基構造は内側部分の上に、外側表面層の形成の前または後のどちらかに導入されてよい。この方法で生成される外側表面層の様々な物質に関する浸透性は、コーティングに用いられる溶液中のポリマーの濃度および大きさにより制御されるであろう。コーティングの後に、外側表面層をその層の内部での、および内側部分へのクロスリンクにより安定化してよい。この方法論は、ＷＯ １９９８／０３９０９４ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）において詳細に記述されている。
【００４０】
本発明において用いられるロックの媒体は、その液体よりも高い、または低い密度を有する粒子／ビーズの形であってよい（例えばマトリックス粒子あたり１種類以上の密度を制御する粒子を導入することによる）。この種類のマトリックスは、流動または拡張床クロマトグラフィーのための大規模操作、および充填されていないカラムにおける異なるバッチ式でのクロマトグラフィーの技法、例えば攪拌タンク中での単純なバッチ吸着において特に適用可能である。この種類の技法はＷＯ １９９２／０１８２３７ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＷＯ １９９２／０００７９９ （Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｋ／Ｕｐｆｒｏｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）において記述されており、用いられる粒子の上にロックを導入することにより本発明の概念に容易に適用することができる。
【００４１】
他の考慮すべき事柄
本発明のプロセスを動かすための条件は、原則的に一般的に行われる吸着技法、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーに関するものと同じである。分離マトリックスの独特の構造のため、より小さい核酸分子（例えばＲＮＡ）およびタンパク質はそのマトリックスの内側部分に入るが、ゲノムＤＮＡは入らない。ゲノムＤＮＡは液相中に容易に集められる。好ましい方法において、分離マトリックスは充填床カラムの形であり、ゲノムＤＮＡはすぐにカラムを出て素通り画分中に集められる。この方法はゲノムＤＮＡの細胞性混入物からの分離および単離のための最も簡単なプロセスを提供する。そのプロセスは、完了するのに少なくとも３０〜４０分間かかる他の利用可能な方法と比較して、５〜１０分間しかかからない。
【００４２】
ゲノムＤＮＡの細胞性混入物からの分離および精製に加えて、このプロセスは他の方法により精製されたゲノムＤＮＡの中に存在する、ＲＮＡおよび他の不純物を含む不純物を除去するために用いることもできる。これは仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）工程と呼ばれることもある。ここで、ゲノムＤＮＡに関して脱塩も同時に成し遂げられる。
【００４３】
本明細書で示した精製プロセスは最も簡単なゲノムＤＮＡ精製プロセスであるため、これを自動化の開発において探求することもできる。
結合基構造を注意深く選択することにより、マトリックスの内側部分と結合する特定の構成要素を溶離することができる。マトリックスからの脱着は、マトリックスと接触する液体のイオン強度を望まれる構成要素（単数または複数）が溶離されるまで増大させることにより成し遂げられる。特に、結合基構造が第一級、第二級または第三級アミン基のプロトン化された形である、および／または望まれる構成要素が核酸（例えばＲＮＡ）である場合、脱着は好ましくはｐＨを増大させることにより援助される。脱着のための代替法は、可溶性の結合基アナログ、すなわち望まれる構成要素への結合に関して結合基構造と競合することができる構造アナログを液体中に含ませることである。液体中の構造破壊化合物の存在は脱着を援助する可能性もある。これは特に、結合基構造が結合基構造の荷電した第一級、第二級または第三級窒素から２または３原子の距離の炭素原子において１個以上のヒドロキシル基またはアミノ基を含む場合に当てはめることができる。周知の構造破壊剤はグアニジンおよび尿素である。ＷＯ １９９７／０２９８２５ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）も参照。従って、ある試料からのゲノムＤＮＡおよび他の構成要素、例えばＲＮＡまたはタンパク質の両方の単離のための簡単なプロセスも提供する。
【００４４】
上記で示したように、単離されたゲノムＤＮＡおよび他の構成要素は、例えばいわゆる仕上げおよび／または中間精製工程によりさらに精製されてよい。特別な精製／仕上げ工程の必要性は、典型的にはインビボ療法に関するように望まれる物質への純度の要求が高い場合に当てはまる。その追加の工程は、陰イオン交換体、陽イオン交換体、逆相マトリックス、ＨＩＣマトリックス（疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス）等への／からの吸着／脱着を含んでいてよい。サイズ排除クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイト上での吸着／脱着も用いられてよい。
【実施例】
【００４５】
実験部分
下記で、本発明は実施例として記述されるであろう。しかし、本実施例は説明の目的でのみ与えられるのであって、添付した特許請求の範囲により定められる本発明を限定するものとして解釈されるべきでは無い。下記および本明細書中の他の箇所で与えられる全ての参考文献を本明細書に援用する。
【００４６】
実施例１：ゲノムＤＮＡの精製のためのリッドビーズ樹脂の評価
ゲノムＤＮＡの分離および精製のための簡単かつ効果的な方法を見つけようとして、我々は様々なマトリックスを試験した。それらの内の２種類は、いわゆるリッドビーズである。そのリッドビーズの１つのタイプはジエチルアミン（ＡＮＸ）と結合しており、一方で他方のタイプはオクチルアミン（Ｏｃｔｙｌ）と結合していた。そのビーズは米国特許第７，２０８，０９３号の実施例の節において開示されている方法に従って作られ、その開示をそのまま本明細書に援用する。
【００４７】
そのビーズをＮＡＰ（商標）−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）中に、１×ＴＥ緩衝液を用いて１．２ｃｍの床高（ｂｅｄ ｈｅｉｇｈｔ）まで充填した。１×ＴＥ緩衝液１ｍｌ中の２０μｇのゲノムＤＮＡをそれぞれのカラム上に負荷した。負荷画分および２ｍｌの１×ＴＥでの溶離液を、第１画分として集めた。３ｍｌの１×ＴＥにより第２の溶離を、および２ｍｌの１×ＴＥにより第３の溶離を行った。１Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍ Ｋ２ＣＯ３を含む溶液２ｍｌにより、最後の（第４の）溶離を行った。図１は、ＡＮＸマトリックス（レーン１〜４）またはＯｃｔｙｌマトリックス（レーン５〜８）を充填したカラムを用いて画分１〜４において集められたゲノムＤＮＡの、対照としての投入したゲノムＤＮＡ（レーン９）と比較した電気泳動のゲルの画像を示す。
【００４８】
ゲノムＤＮＡはＯｃｔｙｌマトリックスには結合しなかった（ゲノムＤＮＡは第１画分にのみ存在している、レーン５参照）。ＡＮＸマトリックスの場合では、投入されたＤＮＡの一部が最初に溶離され（レーン１）、残りのＤＮＡは１Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍ Ｋ２ＣＯ３を含む溶液により溶離された（レーン４）。ゲノムＤＮＡがそのマトリックスに非特異的相互作用により結合したのか、またはイオン交換の機構により結合したのかを決定するため、増大する量の塩濃度（１００〜５００ｍＭ）を用いて実験を行った。もしゲノムＤＮＡを非常に高い塩濃度の緩衝液無しで溶離できるのであれば、その結合は非特異的相互作用のみによるものである。実際、我々は２００ｍＭ未満の塩の緩衝液を用いることによりゲノムＤＮＡのほとんどを溶離することができた。従って、ゲノムＤＮＡはそのマトリックスと非特異的な方式で相互作用しており、マトリックスの内側部分の結合基とは相互作用していない。
【００４９】
我々はＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの混合物を用いた同様の実験も行った。これらの実験において、ＤＮＡはＲＮＡの混入無しに素通り画分中にすぐに分離された。
実施例２：細胞溶解物からのゲノムＤＮＡの簡単な２工程精製
細胞溶解物からのゲノムＤＮＡの精製に関してリッドビーズマトリックスを評価するために実験を行った。
【００５０】
ヒトの血液試料を、ＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標） ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）からの溶解プロトコルを用いて溶解した。５ミリリットルの血液を、まず白血球を単離し、次いで単離された白血球を溶解し、プロテイナーゼＫと共に保温することにより処理した（製品の小冊子の１６〜１７ページを参照、Ｒｅｖ Ｅ ０８／２００７）。
【００５１】
カラムを上記の実施例１におけるように１×ＴＥ緩衝液中で予め平衡化したＯｃｔｙｌを結合させたリッド樹脂を用いて充填した。溶解物の５分の１を１ミリリットルに希釈し、カラム上に負荷した。ボイド容量をエッペンドルフチューブ中に集めた。次いで２．５ｍｌの１×ＴＥ緩衝液をカラム上に負荷し、素通り画分を０．５ｍｌ画分中に集めた。
【００５２】
図２はその集めたものの電気泳動のゲルの画像を示す。レーン１はボイド容量からのものであり、一方レーン２〜６は順に集められた素通り画分からのもの、第１画分〜第５画分からのものであった。レーン７はＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標） ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔを用いて単離された対照のゲノムＤＮＡであった。その結果は、ボイド容量および第１画分はゲノムＤＮＡを全く含んでいなかったことを示している。画分２〜４（すなわちレーン３〜５）は生成物のほとんどを含んでおり、ＲＮＡ不純物は全く含んでいなかった。物質の純度はＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標） ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔを用いて単離されたゲノムＤＮＡ（レーン７）に匹敵する。
【００５３】
画分２および３（ゲルのレーン３、４）は、塩は全く含まずに純粋な生成物を含んでいた（表１：ＵＶスペクトルのデータ参照）。純度（ＵＶ２６０／２８０）は１．７６〜１．９０の特定範囲内であり、従って精製されたゲノムＤＮＡ中にほとんどタンパク質の混入が無かったことを示している。従って、ゲノムＤＮＡは未処理の細胞溶解物から分離され、簡単な負荷／溶離プロセスでうまく単離された。
【００５４】
表１：ＵＶスペクトルデータ、１×ＴＥを基準とする
２３０ ２６０ ２８０
画分２ ０．１２７５ ０．２６２５ ０．１４９５
画分３ ０．２５４７ ０．４８８２ ０．２７２９
画分４ １．６５２０ ０．２０８７ ０．１０９６
本明細書で言及された全ての特許、特許出願、および他の刊行された参考文献を、あたかもそれぞれを本明細書に個別に、かつ具体的に援用したかのように、本明細書にそのまま援用する。本発明の好ましい説明的な態様が記述されているが、当業者は、説明のためにのみ与えられ限定としてでは無い記述された態様以外により本発明を実行することができることを理解するであろう。本発明は下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００８年８月２５日に出願された米国仮特許出願番号６１／０９１，５７３に対して優先権を主張し；その開示をそのまま本明細書に援用する。
技術分野
この発明は概して生物学的試料からの核酸の分離および単離のための方法に関する。特に、本発明は他の構成要素を含む混合物からのゲノムＤＮＡの精製のための簡単なクロマトグラフィー的プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
この３０年間で、生物学的源からの核酸およびタンパク質の単離および精製のための向上した方法の開発においてかなりの努力があった。これは主に医学および生物科学における核酸およびタンパク質の適用の増大によるものである。血液、組織または培養細胞から単離されたゲノムＤＮＡはいくつかの適用を有しており、それにはＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、ハイブリダイゼーションおよびサザンブロッティングが含まれる。プラスミドＤＮＡは配列決定、ＰＣＲにおいて、ワクチンの開発において、および遺伝子療法において利用されてきた。単離されたＲＮＡは、ブロットハイブリダイゼーション、インビトロ翻訳、ｃＤＮＡ合成、およびＲＴ−ＰＣＲを含む様々な下流の適用を有する。同様に、単離されたタンパク質はウェスタンブロット、ＤＮＡ−タンパク質相互作用、酵素活性分析、タンパク質−タンパク質相互作用、および発現分析のために使用することができる。
【０００３】
現在、ＤＮＡ（ゲノムおよびプラスミド）、ＲＮＡおよびタンパク質の精製に関していくつかの市販品を利用することができる。それらはシリカに基づく膜精製、イオン交換樹脂、ｃｈａｒｇｅ ｓｗｉｔｃｈ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたは磁気ビーズに基づく精製のいずれかを利用している。これらの異なる技術は全て、負荷、不純物の洗い落としおよび望まれる生成物（単数または複数）の溶離の、同じクロマトグラフィーの原理を利用している。例えば、細胞からのゲノムＤＮＡの単離に関して、その精製プロセスの最初の工程は未処理の（ｃｒｕｄｅ）細胞溶解物をカラムに負荷することである。第２の工程において、適切な洗浄緩衝液を用いて結合したＤＮＡから不純物を洗い落とす。最後に、溶離緩衝液を用いてＤＮＡを溶離する。過去３０年の間にこの領域において数え切れない報告が発表されたにも関わらず、負に荷電した核酸を互いから、および他の負に荷電した構成要素、例えばタンパク質から分離するのはまだ複雑で困難な仕事のままである。
【０００４】
核酸の分離に関して、２種類の主な原理が以前に用いられていた：
１．分離媒体は堅固に取り付けられた結合基（ｌｉｇａｎｄ）構造を有し、望まれる核酸および不純物は、それに結合した状態になる、またはそれから脱着する異なる能力を有する。典型的にはその結合基構造は陰イオン交換基であり、分離はイオン交換に基づく、例えばイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）である(参考のため、米国特許出願ＵＳ ２００５／０２６７２９５において言及されているそれらを参照)。
【０００５】
２．分離媒体は望まれる核酸または不純物の一方の、細孔内部でのより容易な輸送を可能にする細孔の大きさを有する。その分離はゲル濾過（ＧＦ）として行われる（同書）。
異なる分離機能性を有する内側部分および外側表面層を有する分離媒体が以前に記述された。これらの媒体の一部は、吸着性マトリックス（出入り制限ビーズと呼ばれることもある）の内側部分の中へのより大きな分子の通過を妨げる遮蔽層（外層、ロック、リッド）を有する。これらの媒体はタンパク質、プラスミド、炭水化物、脂質等の分離のために使用することができることが提案されている：ＷＯ １９９８／０３９０９４、ＷＯ １９９８／０３９３６４、ＵＳ ２００５／０２６７２９５、米国特許第７，２０８，０９３号およびGustavsson P.-E. et al. Journal of Chromatography A, 1038: 131-140 (2004)。しかし、これらのいずれもゲノムＤＮＡの精製のための簡単なプロセスを開示または教示していない。
【０００６】
ゲノムＤＮＡの精製のための簡単かつ効果的な方法に関する必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願ＵＳ ２００５／０２６７２９５
【特許文献２】ＷＯ １９９８／０３９０９４
【特許文献３】ＷＯ １９９８／０３９３６４
【特許文献４】ＵＳ ２００５／０２６７２９５
【特許文献５】米国特許第７，２０８，０９３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gustavsson P.-E. et al. Journal of Chromatography A, 1038: 131-140 (2004)
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明の目的はゲノムＤＮＡの精製のための方法を提供することであり、その方法は、（ａ）操作の簡単さ、（ｂ）増大したゲノムＤＮＡの純度および収率、ならびに（ｃ）関係する工程の数の減少に関して向上している。
【００１０】
従って、本発明は、ゲノムＤＮＡの精製のための新規の２工程のクロマトグラフィー的精製プロセス（負荷および溶離）を提供する。この新規の精製法では、試料をカラムに負荷し、いかなる中間の洗浄の工程も無しでゲノムＤＮＡ産物を直接溶離する。この単純化された精製法は、出入り制限樹脂（すなわちリッドビーズ）を利用することにより成し遂げられ、それは用意するのが容易であり、異なる特性を有する２つの層および外側の層の上の非機能性表面で構成される。内側の層はイオン交換体として働く官能基で修飾されている。小さい分子、例えばＲＮＡおよびタンパク質はその樹脂の内部に入ることができ、より大きいゲノムＤＮＡ分子はその樹脂を通過するであろう。ＲＮＡおよびタンパク質は出入り制限樹脂の内側の層で捕えられ、一方でゲノムＤＮＡは素通り画分（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中にすぐに溶離される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は実施例１において記述される原理証明試験において溶離されたゲノムＤＮＡの電気泳動のゲルの画像を示す。
【図２】図２は実施例２において記述される方法を用いて血液試料から単離されたゲノムＤＮＡの電気泳動のゲルの画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の第１観点は、異なる大きさを有するが同じ結合基構造に関して親和性を有する他の生体分子を含む試料からの、ゲノムＤＮＡのための簡単な２工程のクロマトグラフィー的精製プロセスである。言い換えると、その方法は、大きさが異なるが共通の結合基構造に関して親和性を有する他の生体分子からのゲノムＤＮＡの分離を意味する。
【００１３】
従って、その方法は、ゲノムＤＮＡおよび他の生体分子構成要素を含む試料溶液を用意する；その試料を分離マトリックスと接触させて他の構成要素を結合させる；ならびに精製されたゲノムＤＮＡを含む液相を集める工程を含む。必要であれば、回収されたゲノムＤＮＡをさらに精製することができる。
【００１４】
本発明の方法の独特の特徴は、用いられる分離マトリックスが（ａ）ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有し、その他の構成要素にとって出入り可能である内側部分；ならびに（ｂ）実質的にゲノムＤＮＡを吸着せず、その他の構成要素によりゲノムＤＮＡよりも容易に浸透される外側表面層を有することである。
【００１５】
これは、その外側表面層は試料中の物質にとって対流物質輸送により出入り可能であり、そのマトリックスの内側部分は拡散物質輸送によってのみ出入り可能であることを意味する。従って、その外側表面層は対流環境を拡散環境から制限している境界層と考えてよい。
【００１６】
その外側表面層は、多孔性粒子の外側表面に、またはマクロ細孔およびミクロ細孔の両方を含む粒子の内部の、もしくはモノリスの内部のマクロ細孔の表面に位置していてよい。その細孔は、少なくとも外側表面層において、ゲノムＤＮＡおよび他の細胞の構成要素（例えばＲＮＡおよびタンパク質）に関する見かけ上の分子サイズ（流体力学半径）の間の見かけ上の分子サイズに相当する、化合物の流入に関する分子サイズのカットオフ値を有する。内側部分は、外側表面層における細孔と同じ分子カットオフ値を有する細孔を有していてよく、またはこれらの細孔よりも大きい、もしくは小さい細孔を有していてよい。内側部分はこれらの細孔の大きさの組み合わせを含んでいてもよい。
【００１７】
“実質的にゲノムＤＮＡを吸着しない外側表面層”という表現は、少なくともその層の表面には吸着性の結合基構造が本質的に無いことを意味する。
その外側表面層は反発構造、例えばゲノムＤＮＡと同じ電荷を有する構造；疎水性構造等も含んでいてよい。反発構造は、その外側表面層を通る輸送における選択性を向上させる可能性がある。ＷＯ １９９８／０３９３６４を参照。
【００１８】
“その他の構成要素によりゲノムＤＮＡよりも容易に浸透される”という表現は、その他の構成要素はゲノムＤＮＡよりも実質的に速く外側表面層を通って輸送されることを意味する。これは、ゲノムＤＮＡが内側部分から完全に排除されることを含む。
【００１９】
“ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有する”という表現は、その物質のそれぞれがその結合基構造に、もしそれらがそれに出入りした場合に結合することができることを意味する。従って、ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の間のビーズへの結合に関する選択性の違いは、主に外側表面層の細孔の大きさによりもたらされ、結合基構造への親和性自体の違いによるものでは無い。
【００２０】
試料
試料は異なる源に由来することができ、様々な方法で調製することができる。それは血液試料、組織試料、培養細胞等に由来するものであってよい。それは未処理の細胞抽出物または細胞溶解物の形であってよい。それは粒子状物質、タンパク質、核酸の特定の画分を除去するための遠心分離、濾過、限外濾過、透析、沈殿等、濃縮、脱塩等を経た、処理された試料であってもよい。従って、任意ではあるが、次のことを行うのが慣習である：
（ａ）核酸を吸着剤上に捕捉する、および／または分画する前に、試料のタンパク質を沈殿させる、
（ｂ）もしＤＮＡ画分を単離するのであれば、ＲＮＡを沈殿させる、または分解する、
（ｃ）試料をイオン交換体等に適用する場合は、脱塩および／または希釈によりイオン強度を低下させる。
【００２１】
妨げとなる物質を除去するために、他の方法論を適用してもよい。多くの場合、本発明において用いられる試料は本質的に粒子状物質を含まない。
試料は典型的には水性である。
【００２２】
ゲノムＤＮＡから分離される他の構成要素は、ＲＮＡまたは結合基構造に結合することができる構造を含む限り全ての他の化合物であってよい。これは、その他の構成要素がタンパク質／ポリペプチド、または炭水化物、脂質、界面活性剤、細胞もしくはその一部等であってよいことを意味する。本発明の重要な変形において、その他の構成要素は核酸構造物（オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ）を含む。
【００２３】
物質の見かけ上の分子サイズは、（ａ）その分子量、および（ｂ）適用された条件の下でのその形状により決定される。従って、その見かけ上の大きさはｐＨ、イオン強度、塩のタイプおよび温度の変化によって変化する可能性がある。これは特にバイオポリマー、例えば高分子量の核酸およびタンパク質に当てはまる。内側部分の内部および外側表面層の内部の細孔の大きさと望まれる分子の見かけ上の大きさの適合は、異なる内側部分および遮蔽層（外側の細孔）の分子サイズ排除の振る舞いを試験することにより容易になされる。様々なサイズ排除分離媒体に関係する物質のサイズ排除の振る舞いから結論を引き出すことも可能であろう。サイズ排除クロマトグラフィーからの一般的な知識が当てはまる。
【００２４】
外側表面層の分子サイズカットオフ値を適切に設定することにより、本発明の接触させる工程は試料の２つの画分への分離を容易にするであろう。一方の画分はその分子サイズカットオフ値より上の見かけ上の大きさのゲノムＤＮＡを含む。第２の画分はその分子サイズカットオフ値より下の大きさを有する他の構成要素を含む。従って、本発明は様々な長さのゲノムＤＮＡをＤＮＡ、ＲＮＡ等のより小さい断片から分離することを可能にするであろうと予想することができる。典型的には、ゲノムＤＮＡの精製に関して最も有用な分子サイズカットオフ値は、有用なゲノムＤＮＡに関する見かけ上の分子サイズに相当する区間の中にある、すなわち１〜２０ｋｂｐ（キロ塩基対）の区間の中にあるであろう。これは、より大きな分子がその内側部分に浸透することが許される場合、そのカットオフ値をより大きくすることができることを排除せず、例えばその区間は１から４０ｋｂｐまでの長さを有するゲノムＤＮＡに対応していてよい。
【００２５】
本発明の好ましい方式において、その外側表面層の分子サイズカットオフ値は、望まれるゲノムＤＮＡが液体中に保持される、すなわち、かなりの程度までそのマトリックスの内側部分の中に輸送されることが決して無いように設定される。主な利点の１つは、ゲノムＤＮＡが次いで収率を低下させＤＮＡの変性／分解を引き起す可能性がある吸着／脱着プロセスを経る必要が無いことである。
【００２６】
分離マトリックス
本発明は分離マトリックスとして異なる特性を有する２つの層で構成される多孔性のポリマー性粒子を利用する。特定の態様において、その粒子は中性の、すなわち電荷の無い、または非機能性外層を提供する。特定の好ましい態様において、その粒子は米国特許出願公開ＵＳ ２００５／０２６７２９５において記述されている方法に従って、あるいは米国特許第７，２０８，０９３号において記述されている方法に従って製造され、その開示をそのまま本明細書に援用する。
【００２７】
その分離マトリックスは、ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有し、その他の構成要素にとって出入り可能である内側部分（すなわち内側の細孔）；ならびに実質的にゲノムＤＮＡを吸着せず、その他の構成要素によりゲノムＤＮＡよりも容易に浸透される外側表面層を有する。これは、その外側表面層は試料中の物質にとって対流物質輸送により出入り可能であり、そのマトリックスの内側部分は拡散物質輸送によってのみ出入り可能であることを意味する。従って、その外側表面層は対流環境を拡散環境から制限している境界層と考えてよい。
【００２８】
（１）結合基構造
内側の細孔系の表面に結合している結合基は、クロマトグラフィーにおいて結合基として一般的に用いられるあらゆる周知の基、またはそれらの組み合わせ、例えば親和性基、疎水性相互作用基、イオン交換基、例えば負に荷電した陽イオン交換基もしくは正に荷電した陰イオン交換基等であることができる。従って、本文脈において、“結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）”という用語はあらゆる種類の吸着または結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を指す。従って、本方法の１態様において、その結合する基はイオン交換基である。特定の態様において、その陰イオン交換体はジエチルアミン（ＡＮＸ）またはエチレンジアミン（ＥＤＡ）である。
【００２９】
本出願に関する最も明らかな結合基構造は、正に荷電した基（陰イオン交換基）を含む。陰イオン交換基は原則的にあらゆる負に荷電した種に結合する。従って、これらの種類の結合基構造は本発明においてゲノムＤＮＡからあらゆる負に荷電した種を分離するために用いることができる。唯一の要求は、見かけ上の分子サイズにおける違いが十分に大きくあるべきであることである。１つの、および同じマトリックスが２種類以上の異なる結合基、例えば陰イオン交換結合基を含んでいてよい。
【００３０】
好ましい陰イオン交換結合基は、結合すべき物質との混合方式での相互作用を提供し、および／または穏やかなアルカリ性のｐＨ値におけるｐＨスイッチ（ｐＨの増大）による脱電荷（ｄｅｃｈａｒｇｉｎｇ）を可能にする。その脱電荷の能力は、その陰イオン交換結合基が第一級、第二級および第三級アンモニウム基を、好ましくは１０．５以下、または１０．０以下のｐＫａを有する第一級、第二級および第三級アンモニウム基を、すなわち、典型的な第一級または第二級アンモニウム基を含むことを意味する。最も好ましいと考えられる変形において、本質的に全ての陰イオン交換基はこの基準に従うべきである。
【００３１】
“その陰イオン交換結合基は、結合すべき物質との混合方式での相互作用を提供する”という用語は、結合すべき物質と相互作用する、少なくとも２種類の異なるが協同的な部位を提供することができる結合基を指す。これらの部位の一方は、結合基および目的の物質の間の誘引型の電荷−電荷相互作用をもたらす。第２の部位は、典型的には水素結合を含む電子供与体−受容体相互作用をもたらす。
【００３２】
電子供与体−受容体相互作用は、フリーの電子対を有する電気陰性の原子が供与体として働き、供与体の電子対の受容体として働く電子不足の原子に結合することを意味する。Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973)の４２ページを参照。
【００３３】
（２）マトリックスの内側部分
マトリックスのこの部分は、典型的には親和性吸着、例えばクロマトグラフィーの内部で一般的に利用されているものと同じタイプのものである。その内側部分はマクロ細孔およびミクロ細孔の両方を含んでいてよい。
【００３４】
その内側部分は好ましくは親水性であり、水中で不溶性であり多少膨潤可能であるポリマーの形である。親水性ポリマー類は典型的には極性基、例えばヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、エステル、低級アルキル類のエーテル（例えば（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎＨ、（−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−）ｎＨ、ならびにエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドの共重合体である基を有する（例えばＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））（ｎは０より大きい整数、例えば１、２、３〜１００である）。誘導体化されて親水性になった疎水性ポリマー類もこの定義に含まれる。適切なポリマー類は、ポリヒドロキシポリマー類、例えば多糖類、例えばアガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン等に基づくもの、ならびに完全に合成によるポリマー類、例えばポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ（ヒドロキシアルキルビニルエステル）類、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）類、およびポリメタクリレート類（例えばポリグリシジルメタクリレート）、ポリビニルアルコール類、ならびにスチレン類およびジビニルベンゼン類に基づくポリマー類、ならびに上記のポリマー類に対応するモノマーの２種類以上が含まれるコポリマー類である。水溶性であるポリマー類は、例えばクロスリンクにより、および吸着または共有結合による不溶性マトリックスへのカップリングにより、誘導体化して不溶性にすることができる。親水性の基を疎水性ポリマー上に（例えばモノビニルおよびジビニルベンゼン類のコポリマー上に）、ＯＨに変換することができる基を示すモノマーの重合により、または最終的なポリマーの親水化（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）により、例えば適切な化合物、例えば親水性ポリマー類の吸着により導入することができる。
【００３５】
その内側部分は無機材料、例えばシリカ、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタル等に基づくものであることもできる。その内側部分は、好ましくは加水分解的に不安定な基、例えばシラン、エステル、アミド基およびシリカ自体の中に存在する基を持たない。本発明の特に興味深い態様において、その内側部分は、１〜１０００μｍ、好ましくは５〜１０００μｍの範囲の大きさを有する不揃いな、または球状のビーズの形である。その内側部分は多孔性のモノリスの形であってもよい。
【００３６】
その結合基構造は、その内側部分の中に、当技術で既知の方法により導入される。必要とされる結合基構造に関する置換の程度（結合基構造の密度）は、結合基のタイプ、マトリックスの種類、結合すべき化合物等に依存するであろう。通常、それは０．００１〜４ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックス、例えば０．０１〜１ｍｍｏｌの区間において選択される。アガロースに基づくマトリックスに関して、その密度は通常０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスの範囲内である。デキストランに基づくマトリックスに関して、その区間は０．５〜０．６ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスまで上方に拡張されてよい。
【００３７】
前の段落で与えられた範囲は、そのマトリックスが完全にプロトン化された形で塩化物イオンを結合する能力を表す。“ｍｌマトリックス”は、水で飽和したマトリックスを指す。その外側表面層は、これらの範囲の計算においてそのマトリックスに含まれる。
【００３８】
（３）外側表面層
外側表面層（シード（ｓｈｉｅｄ）、ロック）は、液体試料により浸透可能でなければならない。水性の液体に関して、これはその外側表面層が親水性ポリマーで構築されているべきであることを意味する。
【００３９】
外側表面層の作製に関して、異なる方法論が存在する。その方法の１つは、むき出しの形の多孔性粒子の表面、またはマクロ細孔およびミクロ細孔の両方を有する粒子の、もしくはモノリスのマクロ細孔の表面を親水性ポリマーでコートすることを含む。その親水性ポリマーの見かけ上の分子サイズは、内部の一部であることを意図されている細孔に著しく浸透することができないように選択されるべきである。好ましくは、その親水性ポリマーは上記で論じられた親水性の基を含み、例えばそれはポリヒドロキシポリマー、例えば可溶性の形の多糖類（デキストラン、アガロース、デンプン、セルロース等）である。その結合基構造は内側部分の上に、外側表面層の形成の前または後のどちらかに導入されてよい。この方法で生成される外側表面層の様々な物質に関する浸透性は、コーティングに用いられる溶液中のポリマーの濃度および大きさにより制御されるであろう。コーティングの後に、外側表面層をその層の内部での、および内側部分へのクロスリンクにより安定化してよい。この方法論は、ＷＯ １９９８／０３９０９４ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）において詳細に記述されている。
【００４０】
本発明において用いられるロックの媒体は、その液体よりも高い、または低い密度を有する粒子／ビーズの形であってよい（例えばマトリックス粒子あたり１種類以上の密度を制御する粒子を導入することによる）。この種類のマトリックスは、流動または拡張床クロマトグラフィーのための大規模操作、および充填されていないカラムにおける異なるバッチ式でのクロマトグラフィーの技法、例えば攪拌タンク中での単純なバッチ吸着において特に適用可能である。この種類の技法はＷＯ １９９２／０１８２３７ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）およびＷＯ １９９２／０００７９９ （Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｋ／Ｕｐｆｒｏｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）において記述されており、用いられる粒子の上にロックを導入することにより本発明の概念に容易に適用することができる。
【００４１】
他の考慮すべき事柄
本発明のプロセスを動かすための条件は、原則的に一般的に行われる吸着技法、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーに関するものと同じである。分離マトリックスの独特の構造のため、より小さい核酸分子（例えばＲＮＡ）およびタンパク質はそのマトリックスの内側部分に入るが、ゲノムＤＮＡは入らない。ゲノムＤＮＡは液相中に容易に集められる。好ましい方法において、分離マトリックスは充填床カラムの形であり、ゲノムＤＮＡはすぐにカラムを出て素通り画分中に集められる。この方法はゲノムＤＮＡの細胞性混入物からの分離および単離のための最も簡単なプロセスを提供する。そのプロセスは、完了するのに少なくとも３０〜４０分間かかる他の利用可能な方法と比較して、５〜１０分間しかかからない。
【００４２】
ゲノムＤＮＡの細胞性混入物からの分離および精製に加えて、このプロセスは他の方法により精製されたゲノムＤＮＡの中に存在する、ＲＮＡおよび他の不純物を含む不純物を除去するために用いることもできる。これは仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）工程と呼ばれることもある。ここで、ゲノムＤＮＡに関して脱塩も同時に成し遂げられる。
【００４３】
本明細書で示した精製プロセスは最も簡単なゲノムＤＮＡ精製プロセスであるため、これを自動化の開発において探求することもできる。
結合基構造を注意深く選択することにより、マトリックスの内側部分と結合する特定の構成要素を溶離することができる。マトリックスからの脱着は、マトリックスと接触する液体のイオン強度を望まれる構成要素（単数または複数）が溶離されるまで増大させることにより成し遂げられる。特に、結合基構造が第一級、第二級または第三級アミン基のプロトン化された形である、および／または望まれる構成要素が核酸（例えばＲＮＡ）である場合、脱着は好ましくはｐＨを増大させることにより援助される。脱着のための代替法は、可溶性の結合基アナログ、すなわち望まれる構成要素への結合に関して結合基構造と競合することができる構造アナログを液体中に含ませることである。液体中の構造破壊化合物の存在は脱着を援助する可能性もある。これは特に、結合基構造が結合基構造の荷電した第一級、第二級または第三級窒素から２または３原子の距離の炭素原子において１個以上のヒドロキシル基またはアミノ基を含む場合に当てはめることができる。周知の構造破壊剤はグアニジンおよび尿素である。ＷＯ １９９７／０２９８２５ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ）も参照。従って、ある試料からのゲノムＤＮＡおよび他の構成要素、例えばＲＮＡまたはタンパク質の両方の単離のための簡単なプロセスも提供する。
【００４４】
上記で示したように、単離されたゲノムＤＮＡおよび他の構成要素は、例えばいわゆる仕上げおよび／または中間精製工程によりさらに精製されてよい。特別な精製／仕上げ工程の必要性は、典型的にはインビボ療法に関するように望まれる物質への純度の要求が高い場合に当てはまる。その追加の工程は、陰イオン交換体、陽イオン交換体、逆相マトリックス、ＨＩＣマトリックス（疎水性相互作用クロマトグラフィーマトリックス）等への／からの吸着／脱着を含んでいてよい。サイズ排除クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイト上での吸着／脱着も用いられてよい。
【実施例】
【００４５】
実験部分
下記で、本発明は実施例として記述されるであろう。しかし、本実施例は説明の目的でのみ与えられるのであって、添付した特許請求の範囲により定められる本発明を限定するものとして解釈されるべきでは無い。下記および本明細書中の他の箇所で与えられる全ての参考文献を本明細書に援用する。
【００４６】
実施例１：ゲノムＤＮＡの精製のためのリッドビーズ樹脂の評価
ゲノムＤＮＡの分離および精製のための簡単かつ効果的な方法を見つけようとして、我々は様々なマトリックスを試験した。それらの内の２種類は、いわゆるリッドビーズである。そのリッドビーズの１つのタイプはジエチルアミン（ＡＮＸ）と結合しており、一方で他方のタイプはオクチルアミン（Ｏｃｔｙｌ）と結合していた。そのビーズは米国特許第７，２０８，０９３号の実施例の節において開示されている方法に従って作られ、その開示をそのまま本明細書に援用する。
【００４７】
そのビーズをＮＡＰ（商標）−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）中に、１×ＴＥ緩衝液を用いて１．２ｃｍの床高（ｂｅｄ ｈｅｉｇｈｔ）まで充填した。１×ＴＥ緩衝液１ｍｌ中の２０μｇのゲノムＤＮＡをそれぞれのカラム上に負荷した。負荷画分および２ｍｌの１×ＴＥでの溶離液を、第１画分として集めた。３ｍｌの１×ＴＥにより第２の溶離を、および２ｍｌの１×ＴＥにより第３の溶離を行った。１Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍ Ｋ２ＣＯ３を含む溶液２ｍｌにより、最後の（第４の）溶離を行った。図１は、ＡＮＸマトリックス（レーン１〜４）またはＯｃｔｙｌマトリックス（レーン５〜８）を充填したカラムを用いて画分１〜４において集められたゲノムＤＮＡの、対照としての投入したゲノムＤＮＡ（レーン９）と比較した電気泳動のゲルの画像を示す。
【００４８】
ゲノムＤＮＡはＯｃｔｙｌマトリックスには結合しなかった（ゲノムＤＮＡは第１画分にのみ存在している、レーン５参照）。ＡＮＸマトリックスの場合では、投入されたＤＮＡの一部が最初に溶離され（レーン１）、残りのＤＮＡは１Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍ Ｋ２ＣＯ３を含む溶液により溶離された（レーン４）。ゲノムＤＮＡがそのマトリックスに非特異的相互作用により結合したのか、またはイオン交換の機構により結合したのかを決定するため、増大する量の塩濃度（１００〜５００ｍＭ）を用いて実験を行った。もしゲノムＤＮＡを非常に高い塩濃度の緩衝液無しで溶離できるのであれば、その結合は非特異的相互作用のみによるものである。実際、我々は２００ｍＭ未満の塩の緩衝液を用いることによりゲノムＤＮＡのほとんどを溶離することができた。従って、ゲノムＤＮＡはそのマトリックスと非特異的な方式で相互作用しており、マトリックスの内側部分の結合基とは相互作用していない。
【００４９】
我々はＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの混合物を用いた同様の実験も行った。これらの実験において、ＤＮＡはＲＮＡの混入無しに素通り画分中にすぐに分離された。
実施例２：細胞溶解物からのゲノムＤＮＡの簡単な２工程精製
細胞溶解物からのゲノムＤＮＡの精製に関してリッドビーズマトリックスを評価するために実験を行った。
【００５０】
ヒトの血液試料を、ＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標） ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）からの溶解プロトコルを用いて溶解した。５ミリリットルの血液を、まず白血球を単離し、次いで単離された白血球を溶解し、プロテイナーゼＫと共に保温することにより処理した（製品の小冊子の１６〜１７ページを参照、Ｒｅｖ Ｅ ０８／２００７）。
【００５１】
カラムを上記の実施例１におけるように１×ＴＥ緩衝液中で予め平衡化したＯｃｔｙｌを結合させたリッド樹脂を用いて充填した。溶解物の５分の１を１ミリリットルに希釈し、カラム上に負荷した。ボイド容量をエッペンドルフチューブ中に集めた。次いで２．５ｍｌの１×ＴＥ緩衝液をカラム上に負荷し、素通り画分を０．５ｍｌ画分中に集めた。
【００５２】
図２はその集めたものの電気泳動のゲルの画像を示す。レーン１はボイド容量からのものであり、一方レーン２〜６は順に集められた素通り画分からのもの、第１画分〜第５画分からのものであった。レーン７はＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標） ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔを用いて単離された対照のゲノムＤＮＡであった。その結果は、ボイド容量および第１画分はゲノムＤＮＡを全く含んでいなかったことを示している。画分２〜４（すなわちレーン３〜５）は生成物のほとんどを含んでおり、ＲＮＡ不純物は全く含んでいなかった。物質の純度はＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標） ｂｌｏｏｄ ｇｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ Ｍｉｄｉ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔを用いて単離されたゲノムＤＮＡ（レーン７）に匹敵する。
【００５３】
画分２および３（ゲルのレーン３、４）は、塩は全く含まずに純粋な生成物を含んでいた（表１：ＵＶスペクトルのデータ参照）。純度（ＵＶ２６０／２８０）は１．７６〜１．９０の特定範囲内であり、従って精製されたゲノムＤＮＡ中にほとんどタンパク質の混入が無かったことを示している。従って、ゲノムＤＮＡは未処理の細胞溶解物から分離され、簡単な負荷／溶離プロセスでうまく単離された。
【００５４】
表１：ＵＶスペクトルデータ、１×ＴＥを基準とする
２３０ ２６０ ２８０
画分２ ０．１２７５ ０．２６２５ ０．１４９５
画分３ ０．２５４７ ０．４８８２ ０．２７２９
画分４ １．６５２０ ０．２０８７ ０．１０９６
本明細書で言及された全ての特許、特許出願、および他の刊行された参考文献を、あたかもそれぞれを本明細書に個別に、かつ具体的に援用したかのように、本明細書にそのまま援用する。本発明の好ましい説明的な態様が記述されているが、当業者は、説明のためにのみ与えられ限定としてでは無い記述された態様以外により本発明を実行することができることを理解するであろう。本発明は下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素を含む試料溶液からゲノムＤＮＡを精製するための方法であって、次のことを含む方法：
（ｉ）ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素を含む前記の試料溶液を提供する；
（ｉｉ）前記の試料を分離マトリックスと接触させて前記の他の構成要素を結合させる；ならびに
（ｉｉｉ）精製されたゲノムＤＮＡを含む液相を集める；
ここで、前記の分離マトリックスは次のものを有する物質である：
（ａ）実質的にゲノムＤＮＡを吸着せず、より容易にその他の構成要素により浸透される外側表面層、ならびに
（ｂ）内側部分、それは
・ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有し、ならびに
・その他の構成要素にとって出入り可能である。
【請求項２】
その試料溶液が澄んだアルカリ溶解物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
その試料溶液がゲノムＤＮＡを含む生体分子の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
その外側表面層が他の構成要素により浸透可能であるがゲノムＤＮＡにより浸透可能では無い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
その結合基構造が正に荷電した基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
その正に荷電した基が第一級、第二級および第三級アンモニウム基からなるグループから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
その正に荷電した基が混合方式での陰イオン交換体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
その外側表面層が本質的に結合基構造を持たない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
その分離マトリックスが充填されたクロマトグラフィーカラムの形であり、その集められる液相がカラムからの素通り画分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素を含む試料溶液からゲノムＤＮＡを精製するための方法であって、次のことを含む方法：
（ｉ）ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素を含む前記の試料溶液を提供する；
（ｉｉ）前記の試料を分離マトリックスと接触させて前記の他の構成要素を結合させる；ならびに
（ｉｉｉ）精製されたゲノムＤＮＡを含む液相を集める；
ここで、前記の分離マトリックスは次のものを有する物質である：
（ａ）実質的にゲノムＤＮＡを吸着せず、より容易にその他の構成要素により浸透される外側表面層、ならびに
（ｂ）内側部分、それは
・ゲノムＤＮＡおよび他の構成要素の両方に結合することができる結合基構造を有し、ならびに
・その他の構成要素にとって出入り可能である。
【請求項２】
その試料溶液が澄んだアルカリ溶解物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
その試料溶液がゲノムＤＮＡを含む生体分子の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
その外側表面層が他の構成要素により浸透可能であるがゲノムＤＮＡにより浸透可能では無い、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
その結合基構造が正に荷電した基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
その正に荷電した基が第一級、第二級および第三級アンモニウム基からなるグループから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
その正に荷電した基が混合方式での陰イオン交換体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
その外側表面層が本質的に結合基構造を持たない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
その分離マトリックスが充填されたクロマトグラフィーカラムの形であり、その集められる液相がカラムからの素通り画分である、請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５００６５１（Ｐ２０１２−５００６５１Ａ）
【公表日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２５１０７（Ｐ２０１１−５２５１０７）
【出願日】平成２１年８月２１日（２００９．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４５５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２７６９６
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２１日（２００９．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４５５７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２７６９６
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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