コネキシンに対するアンチセンスヌクレオチドを含む配合物
【課題】細胞−細胞連絡を容易にする細胞膜構造であるギャップ結合チャンネルを構成するタンパク質であるコネキシンの発現を、治療目的および／または整形目的のため、部位特異的にダウンレギュレーションする方法の提供。
【解決手段】コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドを含む配合物を、前記レギュレーションが必要とされる患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法。該方法は、特に、ニューロン細胞の死の低下、傷の治癒、炎症の低下、傷痕形成の低下、ならびに皮膚の若返りおよび厚化において有用である。
【解決手段】コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドを含む配合物を、前記レギュレーションが必要とされる患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法。該方法は、特に、ニューロン細胞の死の低下、傷の治癒、炎症の低下、傷痕形成の低下、ならびに皮膚の若返りおよび厚化において有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療的処置および／または整形的処置において使用される配合物に関し、詳しくは、直接的な細胞−細胞連絡の限局的な破壊が望まれる配合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ギャップ結合は、直接的な細胞−細胞連絡を容易にする細胞膜構造である。ギャップ結合チャンネルが、それぞれが６個のコネキシンサブユニットから構成される２つの半チャンネル（コネキソン）から形成されている。これらのコネキシンは、その分子量に従って一般に名付けられているか、あるいは系統発生的な基準に基づいて、すなわち、αクラスおよびβクラスに分類されるタンパク質のファミリーである。
【０００３】
従って、コネキシンの発現を制御する能力（特に、コネキシン発現をダウンレギュレーションする能力）は、治療目的および／または矯正目的のために患者における細胞−細胞連絡を調節する可能性をもたらす。しかし、多数のコネキシンタンパク質が身体中で広く発現しているので、全身的なダウンレギュレーション作用は、治療効果を特定の部位において誘導する際には望ましくない。
【０００４】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、特異的な遺伝子発現を操作する薬剤として大きな可能性を有している（総説：Ｓｔｅｉｎ他、１９９２；Ｗａｇｎｅｒ、１９９４）。しかし、克服することが必要な困難が依然として存在する。これらには、そのようなＯＤＮの短い半減期（未修飾のホスホジエステルオリゴマーは、典型的には、細胞内の半減期が、細胞内ヌクレアーゼによる分解のために２０分にすぎない（Ｗａｇｎｅｒ、１９９４））、および標的組織に対する安定かつ確実な送達が含まれる。
【０００５】
本出願人が本発明を考案したのは、これらの困難を少なくとも部分的に克服することを目的としている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｅｉｎ他、１９９２
【非特許文献２】Ｗａｇｎｅｒ、１９９４
【発明の概要】
【０００７】
（発明の要旨）
従って、第１の局面において、本発明は、治療的処置および／または整形的処置において使用される配合物であって、コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドと薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルとともに含む配合物を提供する。
【０００８】
１つの好ましい形態において、配合物は、１つのコネキシンタンパク質のみに対するポリヌクレオチドを含有する。最も好ましくは、このコネキシンタンパク質はコネキシン４３である。
【０００９】
本発明の多くの局面がオリゴデオキシヌクレオチドに関して記載されている。しかし、他の好適なポリヌクレオチド（ＲＮＡポリヌクレオチドなど）がこれらの局面において使用され得ることが理解される。
【００１０】
あるいは、配合物は、２つ以上のコネキシンタンパク質に対するオリゴデオキシヌクレオチドを含有する。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチドが指向するコネキシンタンパク質の１つはコネキシン４３である。オリゴデオキシヌクレオチドが指向する他のコネキシンタンパク質には、コネキシン２６、コネキシン３１．１およびコネキシン３２が含まれる。
【００１１】
好都合には、コネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１２】
【化１】
から選択される。
【００１３】
最も好都合には、コネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１４】
【化２】
である。
【００１５】
好都合には、コネキシン２６に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１６】
【化３】
である。
【００１７】
好都合には、コネキシン３１．１に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１８】
【化４】
である。
【００１９】
好都合には、コネキシン３２に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００２０】
【化５】
である。
【００２１】
これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、非経口投与、筋肉内投与、大脳内投与、静脈内投与、皮下投与または経皮投与のために配合することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、好ましくは（処置しようとする部位に）局所投与される。好適には、アンチセンスポリヌクレオチドは、薬学的組成物を得るために薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤と一緒にされる。
【００２２】
好適な薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルには、局所投与のために広く使用されている任意のものが含まれる。局所用配合物は、クリーム、軟膏、ゲル、エマルション、ローションまたは塗布剤の形態であり得る。本発明の配合物はまた、含浸包帯の形態で提供され得る。
【００２３】
好適なキャリア材には、局所投与のためのクリーム、ローション、ゲル、エマルションまたは塗布剤の基剤として広く使用されている任意のキャリアまたはビヒクルが含まれる。例として、乳化剤、炭化水素基剤を含む不活性なキャリア、乳化基剤、非毒性の溶媒または水溶性基剤が挙げられる。特に好適な例として、ラノリン、硬パラフィン、液状パラフィン、軟黄色パラフィンまたは軟白色パラフィン、白蜜ろう、黄蜜ろう、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ジメチコーン、乳化ワックス、ミリスチン酸イソプロピル、微結晶ワックス、オレイルアルコールおよびステアリルアルコールが挙げられる。
【００２４】
好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルはゲルであり、好ましくは非イオン性のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体ゲル（例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル、プルロニックＦ−１２７（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．））である。このゲルは、低温で液体であるが、生理学的温度で急速に硬化し、それにより適用部位またはそのような部位のすぐ近くでのＯＤＮ成分の放出が制限されるために特に好ましい。
【００２５】
カゼイン、ゼラチン、アルブミン、膠剤、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースまたはポリビニルアルコールなどの補助的な薬剤もまた本発明の配合物に含ませることができる。
【００２６】
薬学的組成物は、アンチセンスポリヌクレオチドの持続的な放出が得られるように配合することができる。
【００２７】
好都合なことに、配合物はさらに、オリゴデオキシヌクレオチドの細胞浸透を助ける界面活性剤を含むか、または配合物は任意の好適な負荷剤を含有することができる。ＤＭＳＯなどの任意の好適な非毒性の界面活性剤を含むことができる。あるいは、尿素などの経皮浸透剤を含むことができる。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、治療目的および／または整形目的のためにコネキシンタンパク質の発現を部位特異的にダウンレギュレーションする方法であって、上記に記載された配合物を、前記のダウンレギュレーションが必要とされる患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
なおさらなる局面において、本発明は、その他の場合では、患者の脳、脊髄または視神経における特異的部位に対するニューロン傷害から生じるニューロン細胞の死を低下させる方法であって、前記部位およびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定された配合物を前記部位に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、配合物は、脳、脊髄または視神経に対する物理的外傷によるニューロン喪失を低下させるために投与される。
【００３１】
好都合なことに、配合物は、投与後の少なくとも２４時間にわたって前記のコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために十分な量で投与される。
【００３２】
なおさらなる局面において、本発明は、患者の傷治癒を促進する方法であって、前記傷の部位およびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定された配合物を前記傷に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３３】
通常、傷は、火傷を含む外傷の結果である。しかし、傷は手術の結果であってもよい。
【００３４】
なおさらなる局面において、本発明は、物理的外傷を受けた傷および／または組織を処置することの一部としての炎症を低下させる方法であって、上記に規定された配合物を前記傷または組織あるいはその近くに投与する工程を含む方法を提供する。
【００３５】
好ましくは、前記傷は火傷である。
【００３６】
あるいは、前記傷は、脳、脊髄または視神経などのニューロン組織を含む組織に対する物理的外傷の結果である。
【００３７】
なおさらなる局面において、本発明は、傷を受けた患者の傷痕形成を低下させる方法であって、前記傷の部位またはそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定された配合物を前記傷に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３８】
再度ではあるが、傷は外傷または手術の結果であり得るし、配合物は、外科的な修復および／またはその閉鎖の直前にその傷に適用される。
【００３９】
なおさらなる局面において、本発明は、整形目的または治療目的のために皮膚を若返らせるか、または厚くする方法であって、上記に規定された配合物を皮膚表面に１回または反復的に投与する工程を含む方法を提供する。
【００４０】
好都合なことに、前記配合物は、コネキシン２６またはコネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドを含み、そして上皮基底細胞の分裂および増殖を調節するために投与される。
【００４１】
別の実施形態において、前記配合物は、コネキシン３１．１に対するオリゴデオキシヌクレオチドを含み、そして外層の角質化を調節するために投与される。
【００４２】
好ましくは、配合物はクリームまたはゲルである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ａおよび図１Ｃは、傷害を与えた２４時間後のコントロール傷害部の２つの面を示す。傷害部はプルロニックゲル単独で処置されている。切片はＮｉｓｓｌ染色（青色核）され、ニューロンマーカーのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（褐色細胞）で抗体標識されている。
【図１Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ｂおよび図１Ｄは、印を付けた傷害部の輪郭に関する図１Ａおよび図１Ｃのグレースケール像をそれぞれ示す。傷害部の大きなサイズおよび不規則に広がった端に注意すること。傷害部は、傷害を与えたちょうど２４時間以内に脳梁（点線）に向かって下側に広がっている。
【図１Ｃ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ａおよび図１Ｃは、傷害を与えた２４時間後のコントロール傷害部の２つの面を示す。傷害部はプルロニックゲル単独で処置されている。切片はＮｉｓｓｌ染色（青色核）され、ニューロンマーカーのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（褐色細胞）で抗体標識されている。
【図１Ｄ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ｂおよび図１Ｄは、印を付けた傷害部の輪郭に関する図１Ａおよび図１Ｃのグレースケール像をそれぞれ示す。傷害部の大きなサイズおよび不規則に広がった端に注意すること。傷害部は、傷害を与えたちょうど２４時間以内に脳梁（点線）に向かって下側に広がっている。
【図２Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図２は、傷を付けた２４時間後のコントール傷害部を示す。図２Ａには、Ｎｉｓｓｌ染色（青色核）および生存ニューロンのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識が示されている。図２Ｂは、印を付けた傷害部端および印を付けた脳梁（点線）の頂上に関するグレースケール等価図である。元の針跡は明瞭であるが、ニューロンの死が、Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識によって示されているように、傷害部端の十分な後方に生じている。傷害部の端は不規則であり、傷害部は、ちょうど２４時間以内に脳梁内にまっすぐ広がった。
【図２Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図２は、傷を付けた２４時間後のコントール傷害部を示す。図２Ａには、Ｎｉｓｓｌ染色（青色核）および生存ニューロンのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識が示されている。図２Ｂは、印を付けた傷害部端および印を付けた脳梁（点線）の頂上に関するグレースケール等価図である。元の針跡は明瞭であるが、ニューロンの死が、Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識によって示されているように、傷害部端の十分な後方に生じている。傷害部の端は不規則であり、傷害部は、ちょうど２４時間以内に脳梁内にまっすぐ広がった。
【図３Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図３Ａおよび図３Ｂは、傷害を与えた４８時間後の、コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部のカラー像およびグレースケール像である。傷害部の輪郭には、傷害部の広がりおよび印をつけた脳梁（点線）の頂部を示すために、図３Ｂにおいて印が付けられている。図３Ａは、Ｎｉｓｓｌ（青色核）およびＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（ピンク細胞）について染色されている。コントロールの傷害部と比較して、傷害部は４８時間後でさえもかなり密集していることに注意すること（図１および２）。右側に少しの広がりが存在するが、傷害部の左側は、本質的には元の針跡に従い、広がりの徴候はほとんど見られない。傷害部の左側は非常に直線的であるが、脳梁まで広がっていない。
【図３Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図３Ａおよび図３Ｂは、傷害を与えた４８時間後の、コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部のカラー像およびグレースケール像である。傷害部の輪郭には、傷害部の広がりおよび印をつけた脳梁（点線）の頂部を示すために、図３Ｂにおいて印が付けられている。図３Ａは、Ｎｉｓｓｌ（青色核）およびＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（ピンク細胞）について染色されている。コントロールの傷害部と比較して、傷害部は４８時間後でさえもかなり密集していることに注意すること（図１および２）。右側に少しの広がりが存在するが、傷害部の左側は、本質的には元の針跡に従い、広がりの徴候はほとんど見られない。傷害部の左側は非常に直線的であるが、脳梁まで広がっていない。
【図４Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図４Ａおよび図４Ｂは、傷を付けた４８時間後における別のコネキシン４３アンチセンス処置傷害部を示す。標識は、グレースケール像（図４Ｂ）に輪郭が示される傷害部に関する図３と同じである。４８時間後でさえ、この傷害部は極めて密集しており、左側（中央側）へのみのわずかな広がりが見られる。傷害部の右側は、針跡の端までの生存ニューロン（傷害部領域内で実際に生存している）を伴ってかなり直線的であることに注意すること。傷害部は、脳梁（点線）の十分に上方にあり、実際には下方向の広がりがないことを示している。
【図４Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図４Ａおよび図４Ｂは、傷を付けた４８時間後における別のコネキシン４３アンチセンス処置傷害部を示す。標識は、グレースケール像（図４Ｂ）に輪郭が示される傷害部に関する図３と同じである。４８時間後でさえ、この傷害部は極めて密集しており、左側（中央側）へのみのわずかな広がりが見られる。傷害部の右側は、針跡の端までの生存ニューロン（傷害部領域内で実際に生存している）を伴ってかなり直線的であることに注意すること。傷害部は、脳梁（点線）の十分に上方にあり、実際には下方向の広がりがないことを示している。
【図５】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図５は、コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部の端を示す高倍率像である。傷害部の端に印が付けられ、傷害を与えた４８時間後でさえ、傷害を与えた針跡の端までの生存ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ染色）が示されている。
【図６】図６は、傷害を与えた２４時間後の、コネキシン４３に特異的なアンチセンスで処置された傷害部のＧＦＡＰ（赤色）およびコネキシン４３（緑色）の免疫組織化学的標識である。像は、傷害部の深さの半分の地点での傷害部の側方端で得られている。活性化された星状膠細胞のレベルは、コントロール（図７）と比較して上昇しており、コネキシン４３のレベルは著しく低下している。残存するコネキシン標識は、一般に血管（矢印）に結合している。
【図７】図７は、傷害を与えた２４時間後の、コントロール傷害物のＧＦＡＰ（赤色）およびコネキシン４３（緑色）の免疫組織化学的標識である。像は傷害部の中央端から得られ、ＧＦＡＰレベルが、傷害を受けていない皮質よりもわずかに上昇したことを示している。ＧＦＡＰ星状膠細胞マーカー（矢印）と同時に存在することが多い広範囲のコネキシン４３標識に注意すること。
【図８】図８は、傷害を与えた２４時間後（丸）および４８時間後（ひし形）における傷害部断面の下側半領域の比較を示す。分析を、冠状面で切断された連続的な切片化傷害部の中央部分について行った。傷害部は、生存ニューロンを明らかにするＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ抗体標識を使用して評価した。ＤＢ１で処置された傷害部（緑色マーカー）は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで処置されている。ゲルのみの傷害部群（赤色マーカー）もまた、中身のない傷害部を含み、ＨＢ３群（紫色マーカー）は、ランダム配列のコントロールオリゴデオキシヌクレオチドを含有するゲルで処置されている。コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部が大きくなっている場合がある（アンチセンスが十分に送達されていない場合と考えられる）が、非常に小さくなった傷害部はすべて、コネキシン４３アンチセンスで処置されていることに注意すること。傷害部は２ｍｍの深さに達し、分析はその１ｍｍ下までを含み、アンチセンスが到着しなかった外側端を除くようにした。
【図９】図９は、コネキシン４３のセンスＯＤＮおよびアンチセンスＯＤＮによる処置を行った２４時間後のラット脊髄における傷害部である。センスで処置された傷害部は未処置のコントロールと差がなかったが、アンチセンスで処置された傷害部は小さくなり、炎症が低下していた。
【図１０】図１０は、コネキシン４３のセンスＯＤＮ（左肢）およびアンチセンスＯＤＮ（右肢）による処置を行った２４時間後の新生児マウス前肢における傷害部である。アンチセンスで処置された肢における炎症の低下および増大した治癒速度に注意すること。
【図１１】図１１は、図１０に示された２４時間の傷の中心部を通る切片である。切片は、好中球を明らかにするためにトルイジンブルーで染色されている。アンチセンスで処置された傷には、著しいことに好中球がほとんど存在しておらず、炎症もほとんど生じていなかった。
【図１２】図１２は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスＯＤＮまたはセンスのコントロールＯＤＮで処置された、傷害を与えた５日後のラット肢の組合せである。アンチセンスで処置された傷害部は、より早く治癒しつつあり、傷痕の徴候はほとんど見られない。
【図１３】図１３は、新生児段階で作製されたラット肢の傷害部の組合せであり、この場合には傷害を与えた８日後が示されている。傷害部は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスＯＤＮまたはセンスのコントロールＯＤＮで処置された。毛が成長し、そして、アンチセンス処置により、より小さな傷痕、およびより少ない毛喪失が得られたことが明かである。傷害部の部位は、センスで処置されたコントールでは依然として目立っているが、アンチセンスで処置された肢では検出することが困難である。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
上記に広く規定されているように、本発明の中心は、コネキシン発現の部位特異的なダウンレギュレーションにある。これは、コネキシン発現をダウンレギュレーションさせる部位での直接的な細胞−細胞連絡を低下させるという作用を有し、これにより、下記に記載されているように多数の治療的／整形的な適用がもたらされる。
【００４５】
コネキシン発現のダウンレギュレーションは、一般には、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど）を使用するアンチセンス法に基づいており、より詳細には、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用に基づいている。これらのポリヌクレオチド（例えば、ＯＤＮ）は、ダウンレギュレーションすべきコネキシンタンパク質（１つまたは複数）を標的とする。典型的には、ポリヌクレオチドは一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。
【００４６】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンの転写および／または翻訳を阻害することができる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、コネキシン遺伝子からの転写および／または翻訳の特異的な阻害剤であり、他の遺伝子からの転写および／または翻訳を阻害しない。その産物は、（ｉ）コード領域の５’および／または（ｉｉ）コード領域および／または（ｉｉｉ）コード領域の３’のいずれかでコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡに結合することができる。
【００４７】
一般に、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の細胞内での発現を低下させる。
【００４８】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、一般には、コネキシンｍＲＮＡに対するアンチセンスである。そのようなポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし得ることがあり、従って、コネキシンの発現が、転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡの核からの輸送、翻訳またはｍＲＮＡ分解を含むコネキシンｍＲＮＡ代謝の１つまたは２つ以上の局面を妨害することによって阻害され得る。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、コネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションして、ｍＲＮＡの翻訳の直接的な阻害および／または脱安定化をもたらし得る二重鎖を形成する。そのような二重鎖はヌクレアーゼによる分解を受けやすい場合がある。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部にハイブリダイゼーションすることができる。典型的には、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡのリボソーム結合領域またはコード領域にハイブリダイゼーションする。本発明のポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部の領域に対して相補的であり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部の完全な相補体であり得る。しかし、絶対的な相補性は必要とされず、生理学的条件のもとで、２０℃、３０℃または４０℃よりも大きな脱離温度を有する二重鎖を形成するために十分な相補性を有するポリヌクレオチドが、本発明における使用には特に好適である。
【００５０】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、典型的にはｍＲＮＡのホモログである。本発明のポリヌクレオチドは、約５０℃〜約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムなどの中度から高度のストリンジェンシーな条件のもとでコネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであり得る。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、長さが６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドである。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは長さが１２ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、長さが少なくとも４０ヌクレオチドであってもよく、例えば、少なくとも６０ヌクレオチドまたは少なくとも８０ヌクレオチドであり、そして１００ヌクレオチドまで、２００ヌクレオチドまで、３００ヌクレオチドまで、４００ヌクレオチドまで、５００ヌクレオチドまで、１０００ヌクレオチドまで、２０００ヌクレオチドまで、または３０００ヌクレオチドまで、またはそれ以上までのヌクレオチドの長さであってもよい。
【００５２】
コネキシンタンパク質またはＯＤＮに標的とされるタンパク質は、ダウンレギュレーションが作用する部位によって変わる。このことはコネキシンサブユニット組成物による、体全体の各種部位におけるギャップ結合の不均一構造を反映している。コネキシンはヒトまたは動物において自然発生するいずれのコネキシンでもよい。コネキシン遺伝子（コード化配列を含む）は一般に、表１に示すコネキシン４３コード化配列と相同であるように、本明細書で述べる特定のコネキシンのいずれとも相同性を持つ。コネキシンは通常、αまたはβコネキシンである。好ましくは、コネキシンは皮膚または神経組織（脳細胞を含む）中で発現される。
【００５３】
しかし一部のコネキシンタンパク質は、組織中の分布に関しては他のタンパク質よりも遍在性である。最も広範囲に及ぶもののひとつは、コネキシン４３である。したがって、コネキシン４３を標的とするＯＤＮは本発明での使用に特に適している。
【００５４】
別個のコネキシンタンパク質を標的とするＯＤＮを組み合わせて使用すること（たとえば、１、２、３、４またはさらに異なるコネキシンを標的としてもよい）も考慮されている。たとえばコネキシン４３を標的とするＯＤＮおよびコネキシン族の他の１個以上の要素（コネキシン２６、３１．１、３２、３６、４０および４５）は組み合わせて使用できる。
【００５５】
個々のアンチセンスポリヌクレオチドはあるコネキシンに対して特異性であるか、１、２、３またはさらに別のコネキシンを標的とすることがある。特異性ポリヌクレオチドは一般に、コネキシン間で保存されないコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡ内の配列を標的とするが、非特異性ポリヌクレオチドは保存配列を標的とする。
【００５６】
本発明で使用するＯＤＮは一般に、未修飾ホスホジエステルオリゴマーとなる。これらの長さは変化するが、３０ｍｅｒＯＤＮを持つものが特に適する。
【００５７】
アンチセンスポリヌクレオチドは化学修飾してもよい。化学修飾によってヌクレアーゼに対する耐性が高まり、細胞を入れる能力が向上する。たとえばホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドが使用できる。他のデオキシヌクレオチド類似体としては、メチルホスホン酸、ホスホルアミド酸、ホスホロジチオ酸、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミド酸、オリゴリボヌクレオチドホスホロチオ酸、その２’−Ｏ−アルキル類似体および２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホン酸が挙げられる。
【００５８】
または、混合主鎖オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）を使用してもよい。ＭＢＯはホスホチオ酸オリゴデオキシヌクレオチドのセグメントおよび修飾オリゴデオキシ−またはオリゴリボヌクレオチドの適切に配置されたセグメントを含む。ＭＢＯはホスホロチオ酸結合のセグメント、および非イオン性で、ヌクレアーゼに高い耐性を持つメチルホスホン酸などの他の修飾オリゴヌクレオチドや２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドの他のセグメントを持つ。
【００５９】
本発明で使用するアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は、標的コネキシンタンパク質によって変わる。コネキシン４３の場合、次の配列を持つＯＤＮが特に適している：
【００６０】
【化６】
【００６１】
他のコネキシンタンパク質を標的とするＯＤＮは、任意の便利な従来の手法によって、そのヌクレオチド配列の観点から選択できる。たとえば、コンピュータプログラムのＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＯｌｉｇｏＴｅｃｈ（米国オレゴン州のユージーンのＯｌｉｇｏ ｅｔｃ．）を使用できる。たとえば、コネキシン２６、３１．１および３２のＯＤＮは以下の配列を持つ。
【００６２】
【化７】
ＯＤＮはいったん選択すると、ＤＮＡ合成装置を用いて合成できる。
【００６３】
本発明で使用する場合、ＯＤＮは部位特異性送達が必要である。これらは長期間にわたる送達も必要とする。送達時間は明らかにダウンレギュレーションが誘発される部位と望ましい治療効果の両方に依存し、２４時間以上の連続送達が必要な場合が多い。
【００６４】
本発明によれば、このことは、ＯＤＮを製薬的に許容可能な担体またはビヒクルとともに、特に局所投与用の調合物の形の調合物中に包含させることによって実現できる。
【００６５】
本発明の調合物はいったん調製してしまえば、細胞−細胞伝達における過渡的および部位特異性の中断が望ましい場合のあらゆる治療／化粧用手法において有用である。これらは、脳、脊髄または視神経におけるニューロン損傷の治療（損傷ができるだけ局在化される場合）、創傷治癒の促進、たとえば成形外科およ火傷の後の傷形成の低減などが含まれる。
【００６６】
特にクリームなどの局所調合物を使用して、上皮基底細胞の分裂ならびに増殖（コネキシン４３を標的とするＯＤＮを使用）および外層角質化（コネキシン３１．１を標的とするＯＤＮを使用）を調節できる。
【００６７】
アンチセンスポリヌクレオチド（ＯＤＮを含む）は、実質的に遊離形で存在する。生成物は、生成物の所期の目的を阻害せず、実質的に遊離していると見なされる担体または希釈在と混合してもよいことを理解されたい。本発明の生成物は実質的に精製形であり、そのような場合、ポリヌクレオチドまたは調製物の乾燥重量の一般に９０％、たとえば少なくとも９５％、９８％または９９％より成る。
【００６８】
投与
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（ＯＤＮを含む）（一般に本明細書で述べる調合物の形で）はしたがって、本明細書で述べる疾病または症状のいずれかを持つヒトまたは動物などの、治療の必要なヒトまたは動物に投与される。すると、ヒトまたは動物の症状を改善することができる。ポリヌクレオチドおよび調合物はそのため、治療によるヒトまたは動物の体の処置に使用できる。これらは本明細書で述べる症状すべてを治療するための薬剤の製造に使用される。
【００６９】
アンチセンスポリヌクレオチドは局所的に（治療される部位に）投与できる。製薬組成物を製造するために、アンチセンスポリヌクレオチドを製薬的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせることが好ましい。適切な担体および希釈剤としては、たとえばリン酸緩衝生理食塩水などの等張食塩水が挙げられる。該組成物は、非経口、筋肉内、脳内、静脈内、皮下または経皮投与用に調合できる。
【００７０】
患者に投与されるアンチセンスポリヌクレオチドの用量は、年齢、体重および患者の全身状態、治療する症状、投与される特定のアンチセンスポリヌクレオチドなどによって変わる。しかし適切な投与量は、１〜４０ｍｇ／体重１ｋｇなど、０．１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００７１】
哺乳類細胞による核酸の摂取は、たとえば形質移入剤の使用を含む手法などの、複数の既知の形質移入手法によって向上する。投与される調合物はこのような薬剤を含むことがある。このような薬剤の例としては、カチオン剤（たとえばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタント（たとえばリポフェクタム（登録商標）およびトランスフェクタム（登録商標））が挙げられる。
【００７２】
熟練した医師は特定の患者および症状に最適な投与経路および用量をただちに決定できるため、上述した投与経路および用量は単なる指標である。
【００７３】
相同体
本明細書では相同および相同体について述べる（たとえば該ポリヌクレオチドはコネキシンｍＲＮＡにおける配列の相同体でもよい）。このようなポリヌクレオチドは一般に、たとえば（相同性配列の）少なくとも１５、２０、４０、１００以上の近接ヌクレオチドの領域に渡って、関連配列と少なくとも７０％は相同性であり、少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％は相同性であることが好ましい。
【００７４】
相同性は当業界におけるどの方法に基づいて計算してもよい。たとえばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性の計算に使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（たとえばそのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ．３８７−３９５）。たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０で述べられているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性やラインアップ配列（通常はデフォルト設定で）を計算できる。
【００７５】
ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｈｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとともに整列させた場合、ある正の閾値スコアＴに一致または満足する問合せ配列における長さＷのショートワードを識別することによって、高得点配列対（ＨＳＰ）を最初に識別することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， 同上）と呼ばれる。これらの初期隣接ワードのヒットが、それらを含むＨＳＰを見つける検索を開始する発端として作用する。このワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限りは、各配列に沿って両方向に拡張する。各方向のワードヒットの拡張は次の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大達成値よりＸという量だけ低下した場合；累積アラインメントスコアが、１個以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積によって、ゼロ以下になった場合；またはどちらかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ） １０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を用いる。
【００７６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計解析を行う；たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の基準の１つは最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致が偶然発生する確率を示すものである。たとえば、第１の配列を第２の配列と比較した場合に最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、ある配列が別の配列と等しいと見なされる。
【００７７】
相同性配列は通常、関連配列とは、少なくとも（またはせいぜい）２、５、１０、１５、２０以上の（置換、欠失または挿入である）変異により相違する。これらの突然変異は、相同性の計算に関連して上述したいずれの領域においても測定できる。
【００７８】
相同性配列は通常、バックグラウンドよりも著しく高いレベルで、選択的に元の配列にハイブリダイズする。選択的ハイブリダイゼーションは通常、厳密性が中程度から高程度（たとえば、約５０〜６０℃において０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて実施される。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、当業界で既知の適切などの条件下でも実施できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）を参照）。たとえば高い厳密性が必要な場合、適切な条件としては６０℃における０．２ｘＳＳＣが挙げられる。低い厳密性が必要な場合、適切な条件としては６０℃における２ｘＳＳＣが挙げられる。
【００７９】
本発明の各種態様は、以下の実験節を引用して説明する。これらは例示のみのために与えられ、本発明の範囲を制限するものでないことを理解されたい。
【００８０】
実験
実験１
物質および方法
アンチセンスの適用
リン酸緩衝生理食塩水（分子級水）中の３０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７ゲル（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ）を用いて、未修飾ａ１コネキシン（コネキシン４３）特異性アンチセンスＯＤＮを発生中のニワトリ胚に送達した（Ｓｉｍｏｎｓ， ｅｔ ａｌ．， １９９２）。ニワトリ胚は３８℃でインキュベートし、ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＨａｍｂｕｒｇｅｒのステージに従って実施した。卵に窓を開け、治療する領域のｖｉｔｌｅｌｉｎｅおよび羊膜は細い鉗子を用いて開いた。アンチセンスの適用の後、卵をテープで密封し、大半の実験が解析される４８時間の間、インキュベータ内に置いた。ただし、ａ１コネキシン「ノックダウン」および回復の時間経過解析の場合は除く。
【００８１】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは０〜４℃の低温では液体であるが、生理温度の胚に滴下すると凝固して、少なくとも１２時間定着したままである。該ゲルの別の利点は弱い界面活性剤であることであり、これは単独で使用したり、ＤＭＳＯとともに使用すると、ＯＤＮの細胞内へ浸透を著しく促進するように思われる（Ｗａｇｎｅｒ、１９９４）。共焦レーザー走査顕微鏡法を用いて見られる、ＦＩＴＣタグのＤＢ１ ＯＤＮへの付加は、プローブの細胞間貫入を示す。使用したデオキシオリゴヌクレオチドの配列は、表１に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
すべてのＯＤＮは、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭを範囲とする予備実験中の用量依存解析の後、０．５〜１．０ｍＭ最終濃度で適用された。一般毒性効果は、ＯＤＮ濃度が１０ｍＭを超える場合のみに明らかになった。ＯＤＮゲル混合物は、−８０℃で保存した濃縮貯蔵溶液から調製した。
【００８４】
アンチセンス配列
ＤＢ１は、ａ１コネキシン遺伝子の塩基１０９４−１１２３の対して相補性の、マウスのアンチセンス配列である。ニワトリａ１コネキシン配列とは４つのミスマッチがある。ＣＧはニワトリａ１コネキシン塩基７２０−７４９に対して相補性である。このプローブの有効性は、１％のジミメチルスフホキシド（ＤＭＳＯ）をゲルに添加すると向上した。ＤＭＳＯは他のアンチセンスＯＤＮまたは対照の結果に、追加の影響を与えなかった。
【００８５】
対照配列
ＤＢ１（ニワトリ）は、ニワトリａ１コネキシン塩基９５４−９８３に一致する、ＤＢ１のニワトリａ１コネキシン相当物である。しかし解析は、ステムループ構造（Ｇ＝−７．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，ループＴｍ＝９２°）の形成およびホモ二量体化（Ｔｍ＝１．５°）が高い確率で生じることを示しているため、対照配列として作用する。一部のセンスオリゴヌクレオチドが、転写を阻害する安定なＤＮＡトリプレットを形成可能であることが報告されている（Ｎｅｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。しかし、これはＤＢ１（センス）では明確ではなかった。安定な第２構造（Ｇ＝１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を持たず、不安定なホモニ量体化が生じるランダム対照配列も使用され、ＣＶ３と呼ばれた。ＤＢ１の追加の対照適用同濃度混合物およびＤＢ１（センス）は、欠失のバックグラウンドレベルを与えた。
【００８６】
タンパク質ノックダウンの監視
細胞−細胞界面におけるａｌコネキシンギャップ結合タンパク質の免疫組織化学局在化は、アンチセンス効果の直接測定値を与える。アンチペプチドａ１コネキシン特異性抗体プローブを用いて、ホールマウント胚を染色し、コネキシン分布は、確立された手順（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）に従って、共焦レーザー走査顕微鏡法を用いて解析した。発生ニワトリ胚で発現される他の２つのコネキシン（コネキシンｂ１およびｂ２）の対照標識付けも、配列特異性抗体を使用して同様に実施した（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００８７】
結果
ａ１コネキシン発現の低下
未修飾ａ１コネキシン特異性アンチセンスＯＤＮを発生ニワトリ胚に送達するためにＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲルを使用すると、タンパク質発現が選択された時点で阻害され、ニワトリ胚の特定領域を標的としたアンチセンス治療が可能となる。比較的低濃度でアンチセンスを含むゲルの小滴を各胚に正確に滴下した。ゲルは凝固し、少なくとも１２時間は定着したままであるため、この領域では低用量のアンチセンスが持続した。アンチセンス適用は、肢、神経管および顔における上昇発現の前に結合を抑止するために、標的化および計時された。これらの時間は、標的組織の細胞膜中にすでに存在するタンパク質のターンオーバーに依存するのではなく、新たなタンパク質の発現を低下させることによってアンチセンスの効果を最適化するために選択した。ＤＢ１およびＣＧ１ ＯＤＮの両者が、２時間以内に神経管および肢芽内のａ１コネキシンタンパク質の発現を低下させ、４〜８時間内に劇的に低下させ、１８〜２４時間および４８時間では一部の組織で持続していた（データは示さない）。ａ１コネキシンタンパク質のダウンレギュレーションは、使用したいずれの対照においても明確ではなかった。同様に、ニワトリ胚で発現したコネキシン族の２つの要素、ｂ１コネキシンおよびｂ２コネキシンは、ａ１コネキシン特異性アンチセンスＯＤＮによって影響を受けなかった。
【００８８】
すべての実験で、複数の並行対照を実施した。これらには；ＤＢ１センス、組み合わされたＤＢ１アンチセンスおよびＤＢ１センス、（それ自体を用いてステムループ構造を形成する）ＤＢ１ニワトリ、ランダムＯＤＮ’ｓ ＣＶ３、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル単独、ＤＭＳＯを含むＰｌｕｒｏｎｉｃゲル、ＰＢＳ単独が含まれる。いずれの対照も、ａ１コネキシンタンパク質発現に対して顕著な効果は示さなかった。
【００８９】
実験２
概要
星状細胞は、哺乳類の脳において最も豊富な細胞種を構成している。これらは主としてコネキシン４３より成るギャップ結合によって、相互におよびニューロンに幅広く結合する（Ｇｉａｕｒｍｅ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９６））。誘発された虚血または物理的脳損傷の後、これらのチャネルは開いたままで、（上昇した組織内カリウムならびにグルタミン酸およびアポトーシス信号によって開始される）機能低下の拡張波が伝播される（Ｃｏｔｒｉｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９８））。上昇したサイトゾルカルシウムの波およびＩＰ３などの第２メッセンジャー分子は、ギャップ結合チャネル経由で損傷領域の核を越えてゆっくりとニューロンに広がり、攻撃の２４〜４８時間後に損傷への拡張が起きる。このような方法で、損傷していない隣接細胞は破壊され（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、これがいわゆるバイスタンダー効果である。
【００９０】
本実験は、本発明の調合物がこのバイスタンダー効果を防止する能力を調査する。
【００９１】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列によって調製した。
【００９２】
【化８】
【００９３】
方法
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）
未修飾ＯＤＮは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲル（ＢＡＳＦ）によって送達した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは低温（０−４℃）にて液体であり、生理温度にて凝固し、弱い界面活性剤でもある。未修飾ＯＤＮは通常、細胞内での半減期が約２０分であるが（Ｗａｇｎｅｒ １９９４）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル装填法によって連続拡散源が与えられ、ゲルがリザーバーとして作用する（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９））。コネキシン４３に対して特異性のＯＤＮまたは同様の塩基組成の対照ランダムＯＤＮは、２ｍＭの最終濃度にて適用した。ゲルのみの対照も実施された。ＯＤＮは３０ｍｅｒであり、解析によってヘアーピンループまたはホモ二量体化が生じないことが示された。
【００９４】
障害
脳障害は２５０〜３００ｇのオスのウィスターラットで実施した。動物は酸素中の１〜２％ハロセンによって麻酔をかけ、頭は定位固定クランプで保持した。障害部位周辺の領域は剪毛し、頭骨上の皮膚はメスを用いて矢状断面で切開し、頭骨板を露出させておくために引き戻した。Ａｒｌｅｃエングレーバーを用いて前頂の右側に直径０．５ｍｍの穴を頭骨板３ｍｍに開け、マイクロメータステージに結合された１９Ｇ１ １／２ゲージシリンジを用いて、脳の皮質内に窓外を作成した。ステージによって正確な方向制御と、障害を脳梁のはるか上の皮質内に維持する、正確な２ｍｍの貫入深さが可能となる。
【００９５】
準備した動物を用いて、コネキシン４３特異性ＯＤＮ（または対照ＯＤＮ）を含む、１０ｍｌの氷冷Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲル（ＢＡＳＦ）を、先が平らになるようにやすりで切り、予備冷却した１９Ｇ１ １／２ゲージ注射器の針内に吸引した。注射針は、切り詰めた黄色いピペットチップによってメスピペットに取り付けた。次に、針内のゲルは室温まで加温すると凝固した。チップにゲルの栓を含む針を、ＰＢＳを含む１ｍｌ注射器に付け替えて、過度に貫入するのを防ぐため、針チップが（頭骨に対して直面している）スリーブを備えた障害まで下げられるように、スリーブを針シャフト上に滑らせた。注射器のピストンにゆっくりと圧を加えると、ゲルが針から押し出されて障害に貫入した。次に創傷を過酸化水素で処置して出血を止め、皮膚を元通りに縫合した。動物を注意深く監視し、２４時間後、４８時間後または１２日後に屠殺する準備ができるまで放置した。
【００９６】
凍結切断
動物はＮｅｍｂｕｔａｌ（ペントバルビトンナトリウム、Ｖｉｒｂａｃ）を用いて屠殺し、断頭した。脳を損なわないように取り出し、ドライアイスでただちに凍結させ、切断準備ができるまで−８０℃で保存した。連続凍結切片（３０ｍｍ切片）を前部から後部（冠状面）まで採取し、乾燥した切片をクロム明礬処理スライドに装着し、組織化学または免疫組織化学用に−８０℃で保存した。障害の中間切片が明確に識別されるように、各障害の最初と最後の切片を記録した。
【００９７】
組織化学
ヘマトキシリンおよびエオシン染色するため、切片を順次濃度を下げたアルコール（無水、２×９５％、１×７０％、水）で水和させ、Ｇｉｌｌのヘマトキシリンで４分間染色した。次に切片を水で洗浄し、Ｓｃｏｔｔ水に浸漬し、再度水で洗浄した。次にＭｏｏｒｅの緩衝エオシンで３０秒間染色した。切片を再度水で洗浄してから、一連のアルコール（２×９５％、１×無水）、５０：５０のアルコール：キシロールで脱水し、キシレンに浸漬した。さらに切片をＨｉｓｔｏｍｏｕｎｔａ封入剤を用いて標本とした。
【００９８】
Ｎｉｓｓｌ染色のために、切片を順次濃度を上げたアルコール（７５％、９５％、３×１００％）でそれぞれ５分間脱水し、キシレンで５分間脱脂した。次に切片を順次濃度を上げた同一のアルコールで再度水和させ、水で洗浄した。さらに切片をＮｉｓｓｌ染色溶液（５ｍｌの２％水性Ｃｒｅｓｙｌバイオレット原液、９０ｍｌの６％氷酢酸水溶液、１０ｍｌの１．３５％酢酸ナトリウム溶液）中に１０分間放置した。次いで切片を一連の昇順濃度のアルコール（７５％で５分間、９５％と３×１００％で各２分間）と、キシレン×３でそれぞれ１０分間素早く脱水した。さらにＨｉｓｔｏｍｏｕｎｔａ封入剤を用いてカバーガラスをかけた。
【００９９】
免疫組織化学
最初に、凍結切片をＰＢＳ中で室温に戻した。次にメタノール中で２分間透過化処理し、ＰＢＳですすいで、０．１Ｍリジンおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−ＸのＰＢＳ溶液中に移して、３０分以上ブロッキングした。次にＰＢＳで２分間、２回洗浄した。ＰＢＳを除去し、切片当たり５０ｍｌの一次抗体を加えた。
【０１００】
免疫組織化学法は、コネキシン４３に対する一次抗体であるＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎｕｃｌｅｉ（脊椎動物固有の核タンパク質ＮｅｕＮ）およびＧＦＡＰ（グリア原繊維酸性タンパク質）を用いて実施した。以下の抗体を使用した：
濃度１：３００のウサギ抗−Ｃｘ４３（Ｇｏｕｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９１））
濃度１：１００のマウス抗−Ｃｘ４３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）
濃度１：１０００のウサギ抗−ラットＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ，Ｚ０３３４）
濃度１：０００のマウス抗ニューロン核（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）
【０１０１】
コネキシンおよびＧＦＡＰ用に、標識切片は４℃で一晩インキュベートした。次に軌道振盪機上でＰＢＳによって１５分間、３回洗浄した。この後、過剰のＰＢＳを除去し、切片当たり５０ｍｌのＡｌｅｘａａ４８８抗−ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）を１：２００の濃度で加えた。モノクローナルおよび二重標識用に、ＣＹ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１３２Ｃ）抗−マウス二次抗体を使用した。切片を暗所にて室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。標本作成のため、過剰なＰＢＳをスライドから除去し、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（グリセロール／ＰＢＳ溶液）抗−退色剤を１，２滴加えた。カバーガラスを切片上に下げて、マニキュア液で密封した。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識の場合、二次抗体はビオチン化ヤギ抗−マウスであって、次いでアビジン結合ＨＲＰおよびＤＡＢ反応（Ｓｉｇｍａ ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎまたはＤＡＫＯ Ｑｕｉｃｋｓｔａｉｎキット）を行った。
【０１０２】
画像診断および分析
Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ４Ｄ共焦レーザー走査顕微鏡を用いて、免疫蛍光標識を実施した。次いで、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｍｂｉｎｅ機能を用いて、またはＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐによって二重標識画像を組み合わせた。ヘマトキシリンおよびエオシン、Ｎｉｓｓｌ染色サンプル、またはＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識切片は、Ｋｏｎｔｒｏｎ（Ｚｅｉｓｓ）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ３００８デジタルカメラを用いてキャプチャーし、障害領域はＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ）を用いて解析した。障害領域は各障害の中間切片で解析した。
【０１０３】
結果
我々の対照ゲル実験、すべての障害、対照およびアンチセンス処理において、外傷発生から最初の２４〜４８時間における詳細に記録された脳障害の拡大は、ゲルの装填後、ゲルが停止しにくい外縁付近で広がる傾向を見せた。しかし、対照障害は脳梁に向かって下方および側面に広がって、でこぼこに広がった縁を形成した（図１および２）。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ抗体標識組織を調べると、障害縁の十分後ろからニューロンの死が起こっており、Ｎｉｓｓｌ染色領域では生存しているニューロンが残っていないことが明らかになった。この拡大は主として２４時間以内に発生し（図１および２）、障害後４８時間まで続いた。このことは、図２で特に明確である。図２では、２４時間以内でニューロンの死が、障害縁の十分後ろから別の正常に見える組織にかけて明らかであり、障害はすぐ下の脳梁へ広がっている。これに対して、コネキシン４３アンチセンス処理した、より良い障害は、元の障害部位に限定されたままであり、基準面が明確に限定されている（図３および４）。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識はＮｉｓｓｌ染色組織と共存し、いずれのコネキシン４３アンチセンス処理した障害も脳梁へは広がらない。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識は、元の針路障害のすぐ縁までニューロンが生存していることを示している。これらの障害周囲の生存ニューロンは、針路障害の縁を示す明確な境界を規定することが多い（図３および５）。アンチセンス処理後は、障害自体の内部でさらに多くの組織が生存している；対照障害では、細胞死は障害区域内の組織損失を引き起こす（図２の２４時間後の対照障害と、図３および４の４８時間後のアンチセンス処理障害を比較）。
【０１０４】
グリア原繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の抗体標識によって、障害縁における星状細胞の活性化上昇が多少見られるのに対して、コネキシン４３タンパク質レベルは、アンチセンス処理障害縁に沿った多くの箇所で、対照（図７）と比較すると特に基底および内側縁（図６）で明らかに低下している。一部の領域では、コネキシン４３特異性アンチセンス処理の２４時間後に残っているコネキシン４３標識は、ＧＦＡＰレベルの上昇（図６）にもかかわらず、血管壁内にある。一般にアンチセンス処理障害周辺を標識するコネキシン４３は、半分以上のコネキシン４３標識が星状細胞に関連している対照においてよりもはるかに低い程度で、ＧＦＡＰと共存する。他のコネキシンレベル（コネキシン２６および３２）は、コネキシン４３特異性アンチセンス処理によって変化したようには思われなかった。
【０１０５】
３６匹の動物に障害を加えた。２１匹の動物について断面積（冠状面における中央切片の障害量）を解析した。結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
最終解析では、（ゲルが障害の底部に注入および定置されるため）アンチセンス処理がほとんどまたは全く効果を示さない外縁にて広がる障害を除外するために、外側皮質縁から１ｍｍ下のラインによる障害領域を測定した。１匹のアンチセンス処理動物がこのグループの平均から３倍標準偏差を超えて外れたため、これを除外した。アンチセンス処理障害の平均障害サイズは２４および４８時間後で、１．４５ｍｍ２（＋／−０．５５）であり、対照の場合は２．１ｍｍ２（＋／−０．６）であった。（２４および４８時間後のアンチセンス処理８個および対照障害８個のうち）最小の４個はすべてコネキシン４３処理によるものであり、最小の対照障害はこれらの４個よりも５０％以上大きかった。このデータはさらに、図８に図式的に示してある。１２日後までに、ラットでは再生が起こり（ヒトの脳組織では起こらないが）、障害拡大の限界は明確に規定されていなかった。
【０１０８】
考察
Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル栓−アンチセンスＯＤＮ法を用いて、哺乳動物の脳の大脳皮質における障害後に発生する星状細胞増加時の、コネキシン４３ノックダウンの効果を調査した。脳において、瀕死のニューロンによる毒素放出によって、バイスタンダー効果として知られる影響が生じ、毒素がギャップ結合チャネルを通じて近隣細胞に広がる（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８））。神経変性条件下で、毒素をゆっくりと放出させると、明らかに星状細胞におけるコネキシン４３チャネルのアップレギュレーションが生じ、血流への毒素の輸送および血流からの毒素の除去が可能となる。しかし重篤な外傷の場合は、このアップレギュレーションが高濃度の毒素が近隣のニューロンに広がるのを促進するため、近隣のニューロンは死に至る。コネキシン４３アップレギュレーションおよびコネキシン４３チャネルのノックダウンを阻止すると、この広がりが阻害され、障害が断面積で最大５０％に縮小する。このことは、虚血性脳卒中の処置、神経変性疾病の治療、外科的介入による副作用の調整に多大な意味を持つ。
【０１０９】
実験３
概要
損傷ニューロンが放出する毒素による神経組織におけるバイスタンダー効果が近隣細胞に広がり、それを死に至らしめることは詳細に記録されている。実験２は、ギャップ結合タンパク質コネキシン４３をノックダウンするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの持続性放出手法を用いて、脳におけるこの効果を低下させられることを示している。
【０１１０】
脳に似た組成の別の組織は脊髄であり、ここでは神経集団はグリア細胞の集団によって支持されている。グリア細胞には、神経環境からグルタミン酸および過剰なカルシウムを除去して神経保護効果を担っている星状細胞が含まれる。この実験は、本発明の調合物が脊髄障害の拡張を低減する能力について調査する。
【０１１１】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した。
【０１１２】
【化９】
【０１１３】
方法
ウィスターラットに麻酔をかけ、脊髄を露出させた。脊髄に標準二等分障害を作成し、コネキシン４３に対するアンチセンスまたはセンスＯＤＮ（５ｍＭ）のいずれかを含む冷却Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル５ｍｌを障害中に配置した。適用は盲目的に行った。次に露出した脊髄を元に戻し、ラットをケージに戻した。一部の動物は２４時間後に屠殺したが、残りの動物は１２日間および２ヶ月間維持し、ニューロン再生の程度と障害の最終サイズを判定した。軸索再生実験では、ラットに麻酔をかけ、脊髄への入口部位の前で軸索を切断した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のペレットを切断部に配置して、軸索を２４時間に渡って逆標識した。翌日ラットを屠殺し、その脊髄を取り出し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。次に脊髄を細胞切断用に処理し、索軸から連続した縦方向８ｍｍの切片を取り出した。次いで切片を、コネキシンまたはＧＦＡＰ用にヨウ化プロピジウムを核マーカーとして用いて免疫染色するか、ＨＲＰを示すように処理した。
【０１１４】
結果
障害の２４時間後、コネキシン４３およびアンチセンスＯＤＮで処理した脊髄には著しい相違が見られた。センス障害は未処理対照との相違は示さなかったが、これに対してアンチセンス処理障害はより小さく、炎症が少ないように見えた（図９）。
【０１１５】
１２日後、ＨＲＰ標識軸索はセンスおよびアンチセンス処理脊髄の両方で見られたが、どちらの場合も障害にわたる著しく多くの再生索軸は見られなかった。しかし、アンチセンス障害の障害サイズには著しい相違が見られ、センスまたは未処理障害よりも非常に小さく見えた。
【０１１６】
障害の２ヵ月後、再生索軸の脊髄ＨＲＰ標識によって、センスおよびアンチセンス処理の両方において障害部位を通過できなかったことがわかった。アンチセンス処理コードにおいて障害サイズが著しく小さかったのは、二次ニューロン細胞の死が大幅に減少したことを示している。
【０１１７】
考察
本発明の調合物を使用すると、コネキシン４３のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドノックダウンによって、脊髄損傷の最初の２４〜４８時間後に発生する障害拡張が著しく低減される。コネキシン４３のノックダウンも炎症を低減し、さらに神経保護効果を促進するが、ニューロンが障害部位で再増殖する能力は変化しなかった。したがって、コネキシン４３特異性オリゴヌクレオチドによるアンチセンス処理は、損傷ニューロンの再増殖を促進できないが、損傷の拡大を低減する著しい神経保護効果を備えている。
【０１１８】
実験４
概要
皮膚創傷を修復するために、繊維芽細胞、内皮細胞およびケラチノサイトなどの多数の細胞種が活性化され、細胞外基質を増殖、移動および固着させて創傷を満たす。
【０１１９】
伝達および細胞間信号伝達は、創傷治癒プロセスの重要な機能である。細胞間信号伝達も皮膚層のギャップ結合チャネルの広範なネットワークを通じて役割を担っていると思われるが、細胞外信号伝達機構は主要な因子と考えられている。損傷細胞から表皮を通じて広がるカルシウム波は、その損傷を信号伝達する。正常な創傷治癒コネキシンレベルは、６時間以内に低下を開始し、回復するのに６日間かかる。これらの変化が担う役割は理解されていないが、ひとつの理論は、細胞が迅速に分裂するために近隣の細胞から放出されて、次に接合部が再生されて、創傷部位の内部や上部への移動を調整される。
【０１２０】
本実験は、本発明の創傷治癒を行う調合物の能力について調査する。
【０１２１】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した：
【０１２２】
【化１０】
【０１２３】
方法
ＣＤ１系統の新生マウスにスプレーによる局所麻酔で麻酔をかけた。次に長さ２ｍｍの清潔な切開創傷を前脚に沿って虹彩刀で作成した。解剖顕微鏡の下で該創傷を作成することによって、大きさが非常に再現しやすくなる。創傷は通常３〜６日で治癒する。後の時点で創傷部位を引き続き確認するための印として、炭素粉を創傷に振りかけた−どちらにしても、炭素粉は治癒には影響を与えない。次に、センスまたはアンチセンスＯＤＮを含む、冷却した５ｍｌのＰｌｕｒｏｎｉｃゲルを創傷に塗布した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは０〜４℃では液体であるが、それ以上の温度では凝固する。創傷に塗布すると、ゲルはその場で凝固し、ＯＤＮの徐放リザーバーとしてはもちろん弱い界面活性剤として作用し、ＯＤＮが組織に浸透するのを助ける。センスＯＤＮの塗布は片脚に行い、もう一方にはアンチセンスを塗布し、同腹仔間で左右交互にする。新生マウスはランプの下で温めた後、母親に返した。創傷は毎日検査し、治癒品質について評価した。手術の１日後、５日後および８日後に代表となる新生マウスを選択し、その前肢の写真を撮ってから、麻酔をかけ、２％パラホルムアルデヒドを振りかけた。前肢を取り外し、２％パラホルムアルデヒド中で一晩浸漬固定し、その後、樹脂（１日）またはワックス（その後２日間）組織学用に処理した。
【０１２４】
創傷の炎症は、切開の２４時間後に評価した。樹脂部分は創傷を通じて、損傷に反応する最初の細胞である、ｎｉｓｓｌ陽性細胞の好中球を示すためにトルイジンブルーで染色した。これらは好中球特異性マーカーを用いても示すことができる。
【０１２５】
細胞死およびクリアランスは、アポトーシス細胞のクリアランス速度を決定するために、Ｔｕｎｅｌ標識によって評価する。マクロファージ染色を用いて、次の細胞死が終了する期間を示した。これらは損傷の３〜５日後に実施した。
【０１２６】
血管形成
肉芽は治癒結合組織の特徴であり、多数の毛細血管の浸潤によって囲まれる。マクロファージは、ＶＥＧＦなどの強力な血管形成因子を発現することで知られている。血管新生の程度は、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体である、抗−ＰＣＡＭおよび抗−ｆｌｔ−１を用いて監視される。この組織の収縮は、創傷繊維芽細胞が収縮性筋線維芽細胞に分化することによって引き起こされる。創傷を引き合わせた後、アポトーシスによって死に、マクロファージによって除去される。これらの細胞は、平滑筋アクチン特異性抗体によって明らかにされ、次にその形成および除去が行われる。
【０１２７】
過神経支配
知覚神経は、損傷時に放出される信号に非常に敏感であり、成人の創傷部位では一過性発芽を示す。しかし新生創傷では、この発芽はさらにおびただしく、永久の過神経支配を生じる。これらの信号が何であるか明らかではないが、炎症性マクロファージから放出されると思われる。過神経支配は創傷７日後に極大であり、神経分布は神経フィラメントに対するＰＧＰ９．５抗体を用いて明らかになる。
【０１２８】
瘢痕は通常、創傷閉包の数週間または数ヵ月後に評価する。しかし、合理的な評価は損傷の１２日後に実施できる。創傷による切片をコラーゲン染色Ｐｉｃｒｏｓｉｒｕｓ Ｒｅｄを用いて染色し、共焦顕微鏡で調べて、創傷部位でのコラーゲン密度および配向を決定する。
【０１２９】
結果
１日
創傷の２４時間後、センスおよびアンチセンス処置肢で著しい相違が明らかであった。センス処理創傷は、未処理と違いがないように見え、正常な治癒グレードおよび速度のスペクトルが得られた（図１０）。アンチセンス処理肢は、対照とは著しく異なり、炎症が少ないように思われ、治癒速度が一般に速かった。
【０１３０】
ｎｉｓｓｌ染色した代表的な肢の樹脂切片によって、好中球細胞が著しく少ないことが明らかになり、このことは炎症組織が少ないことを示していた（図１１）。
【０１３１】
５日
創傷の数日後には、かさぶたが落ち始めた。この段階では、アンチセンス処理創傷の大半がセンス処理よりも小さく見え、かさぶたが小さいか、瘢痕がより目立たないかのどちらかであった（図１２）。
【０１３２】
８日
創傷の８日後、肢に体毛が生えた。センス処理創傷はまだ見えており、創傷部位周辺に体毛ｊがないために境界が定められていた。アンチセンス処理創傷はほとんど見えず、正常な体毛成長によって覆われていた。体毛成長におけるこのような相違は、アンチセンス処理創傷では瘢痕の発生が減少することを示している（図１３）。
【０１３３】
結論
コネキシン４３アンチセンスＯＤＮを創傷に塗布すると、治癒プロセスに著しい影響が見られる。最初の顕著な効果は、好中球のレベルによってはるかに低い炎症反応を示す部分にて顕著である創傷の炎症が減少することである。治癒が進むにつれ、アンチセンス処理創傷はより速く治癒し、対照障害よりも瘢痕が少ない。
【０１３４】
このような炎症反応の低下およびその後の治癒の改善はおそらく、好中球伝達の低下と自然治癒プロセスの高速化によるものである。アンチセンスＯＤＮは４〜８時間後にコネキシン発現を低下できるため、創傷の最初の信号伝達に対して影響をもたないが、第２の信号伝達イベントでは役割を果たす。創傷に反応して侵入する好中球は、通常大量のコネキシン４３を発現することに注目するのは興味深い。それらが創傷における他の細胞とギャップ結合を形成して、それを用いて伝達することも可能である。この形式の伝達が減少すると、好中球による分泌要素が減少し、創傷内の細胞死が減少することはもちろん、肉芽および過神経支配も減少することがある。通常の条件下で、コネキシンタンパク質レベル（コネキシン２６、３１．１および４３）は、創傷の上皮および皮下層の両方で６時間以内に減少し、最大６日間は低下したままであることも知られている。アンチセンス手法は、膜からタンパク質除去が行われている間に翻訳プロセスを阻止することによって、この初期のタンパク質減少を高速化できる。確かに、創傷直後のコネキシン４３ノックダウンの効果は、炎症レベルの低下および治癒速度の向上に著しい効果をもたらす。
【０１３５】
実験５
概要
火傷後の炎症および第２細胞死は、主な関心事である。身体の高い割合を占める重篤な火傷の犠牲者は、外傷後１または２日で死に至ることが多い。本実験は、本発明の調合物の火傷回復プロセスに有利な影響を及ぼす能力を調査する。
【０１３６】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した：
【０１３７】
【化１１】
【０１３８】
方法
再現性がよい火傷は湿った皮膚にもたらされ、アンチセンスＯＤＮを含むＰｌｕｒｏｎｉｃゲルは火傷に皮下注射した。一連の火傷は、６匹の新生マウスの頭蓋の左側と右側にはんだごてを用いて作成した。頭の片側の火傷はＰｌｕｒｏｎｉｃゲルに含まれるコネキシン４３−特異性ＯＤＮによって、反対側はＰｌｕｒｏｎｉｃゲルに含まれるセンス対照ＯＤＮによって処理した。
【０１３９】
結果
２４時間後、６匹すべてのコネキシン４３ＯＤＮ処置火傷は、対照火傷と比較して低レベルの炎症を示した。これらの相違は顕著であった（データは示さない）。
【０１４０】
有用性
そのため本発明により、細胞−細胞伝達が一時的で、部位特異的な方法でダウンレギュレート可能な調合物が与えられる。したがって、該調合物は治療方法における用途と化粧処置における用途がある。
【０１４１】
該調合物のＯＤＮ成分を長時間（２４時間以上）にわたって送達することは、ニューロン損傷の治療に特に遊離である。これは直接の物理的ニューロン損傷の多くの例において、ニューロン細胞損失が実際の損傷部位をはるかに越えて周囲の細胞に広がるためである。この第２のニューロン細胞損失は、元の損傷の２４時間以内に発生し、結合ギャップ細胞−細胞伝達によって伝達される。したがってコネキシンタンパク質発現のダウンレギュレーションは、細胞間の伝達を阻害または少なくともダウンレギュレートし、第２のニューロン細胞損失を最小限に抑える。
【０１４２】
同様に、他の組織損傷の例では（特に創傷）、本発明の調合物が、創傷治癒プロセスの促進、炎症の低減、および瘢痕形成の最小化のいずれにも有効であることがわかっている。したがって該調合物は、外部からの外傷（火傷を含む）または外科的介入のどちらであっても、創傷の治療において明らかに有利である。
【０１４３】
上の説明は例示目的のためのみに与えており、本発明の範囲を逸脱せずに採用した特異性ＯＤＮおよび製薬的に許容可能な担体またはビヒクルのどちらによっても、修正できることをさらに認識されたい。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
【表４】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療的処置および／または整形的処置において使用される配合物に関し、詳しくは、直接的な細胞−細胞連絡の限局的な破壊が望まれる配合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
ギャップ結合は、直接的な細胞−細胞連絡を容易にする細胞膜構造である。ギャップ結合チャンネルが、それぞれが６個のコネキシンサブユニットから構成される２つの半チャンネル（コネキソン）から形成されている。これらのコネキシンは、その分子量に従って一般に名付けられているか、あるいは系統発生的な基準に基づいて、すなわち、αクラスおよびβクラスに分類されるタンパク質のファミリーである。
【０００３】
従って、コネキシンの発現を制御する能力（特に、コネキシン発現をダウンレギュレーションする能力）は、治療目的および／または矯正目的のために患者における細胞−細胞連絡を調節する可能性をもたらす。しかし、多数のコネキシンタンパク質が身体中で広く発現しているので、全身的なダウンレギュレーション作用は、治療効果を特定の部位において誘導する際には望ましくない。
【０００４】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、特異的な遺伝子発現を操作する薬剤として大きな可能性を有している（総説：Ｓｔｅｉｎ他、１９９２；Ｗａｇｎｅｒ、１９９４）。しかし、克服することが必要な困難が依然として存在する。これらには、そのようなＯＤＮの短い半減期（未修飾のホスホジエステルオリゴマーは、典型的には、細胞内の半減期が、細胞内ヌクレアーゼによる分解のために２０分にすぎない（Ｗａｇｎｅｒ、１９９４））、および標的組織に対する安定かつ確実な送達が含まれる。
【０００５】
本出願人が本発明を考案したのは、これらの困難を少なくとも部分的に克服することを目的としている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｔｅｉｎ他、１９９２
【非特許文献２】Ｗａｇｎｅｒ、１９９４
【発明の概要】
【０００７】
（発明の要旨）
従って、第１の局面において、本発明は、治療的処置および／または整形的処置において使用される配合物であって、コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドと薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルとともに含む配合物を提供する。
【０００８】
１つの好ましい形態において、配合物は、１つのコネキシンタンパク質のみに対するポリヌクレオチドを含有する。最も好ましくは、このコネキシンタンパク質はコネキシン４３である。
【０００９】
本発明の多くの局面がオリゴデオキシヌクレオチドに関して記載されている。しかし、他の好適なポリヌクレオチド（ＲＮＡポリヌクレオチドなど）がこれらの局面において使用され得ることが理解される。
【００１０】
あるいは、配合物は、２つ以上のコネキシンタンパク質に対するオリゴデオキシヌクレオチドを含有する。好ましくは、オリゴデオキシヌクレオチドが指向するコネキシンタンパク質の１つはコネキシン４３である。オリゴデオキシヌクレオチドが指向する他のコネキシンタンパク質には、コネキシン２６、コネキシン３１．１およびコネキシン３２が含まれる。
【００１１】
好都合には、コネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１２】
【化１】
から選択される。
【００１３】
最も好都合には、コネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１４】
【化２】
である。
【００１５】
好都合には、コネキシン２６に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１６】
【化３】
である。
【００１７】
好都合には、コネキシン３１．１に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００１８】
【化４】
である。
【００１９】
好都合には、コネキシン３２に対するオリゴデオキシヌクレオチドは、
【００２０】
【化５】
である。
【００２１】
これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、非経口投与、筋肉内投与、大脳内投与、静脈内投与、皮下投与または経皮投与のために配合することができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、好ましくは（処置しようとする部位に）局所投与される。好適には、アンチセンスポリヌクレオチドは、薬学的組成物を得るために薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルまたは希釈剤と一緒にされる。
【００２２】
好適な薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルには、局所投与のために広く使用されている任意のものが含まれる。局所用配合物は、クリーム、軟膏、ゲル、エマルション、ローションまたは塗布剤の形態であり得る。本発明の配合物はまた、含浸包帯の形態で提供され得る。
【００２３】
好適なキャリア材には、局所投与のためのクリーム、ローション、ゲル、エマルションまたは塗布剤の基剤として広く使用されている任意のキャリアまたはビヒクルが含まれる。例として、乳化剤、炭化水素基剤を含む不活性なキャリア、乳化基剤、非毒性の溶媒または水溶性基剤が挙げられる。特に好適な例として、ラノリン、硬パラフィン、液状パラフィン、軟黄色パラフィンまたは軟白色パラフィン、白蜜ろう、黄蜜ろう、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ジメチコーン、乳化ワックス、ミリスチン酸イソプロピル、微結晶ワックス、オレイルアルコールおよびステアリルアルコールが挙げられる。
【００２４】
好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルはゲルであり、好ましくは非イオン性のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体ゲル（例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ゲル、プルロニックＦ−１２７（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．））である。このゲルは、低温で液体であるが、生理学的温度で急速に硬化し、それにより適用部位またはそのような部位のすぐ近くでのＯＤＮ成分の放出が制限されるために特に好ましい。
【００２５】
カゼイン、ゼラチン、アルブミン、膠剤、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースまたはポリビニルアルコールなどの補助的な薬剤もまた本発明の配合物に含ませることができる。
【００２６】
薬学的組成物は、アンチセンスポリヌクレオチドの持続的な放出が得られるように配合することができる。
【００２７】
好都合なことに、配合物はさらに、オリゴデオキシヌクレオチドの細胞浸透を助ける界面活性剤を含むか、または配合物は任意の好適な負荷剤を含有することができる。ＤＭＳＯなどの任意の好適な非毒性の界面活性剤を含むことができる。あるいは、尿素などの経皮浸透剤を含むことができる。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、治療目的および／または整形目的のためにコネキシンタンパク質の発現を部位特異的にダウンレギュレーションする方法であって、上記に記載された配合物を、前記のダウンレギュレーションが必要とされる患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
なおさらなる局面において、本発明は、その他の場合では、患者の脳、脊髄または視神経における特異的部位に対するニューロン傷害から生じるニューロン細胞の死を低下させる方法であって、前記部位およびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定された配合物を前記部位に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、配合物は、脳、脊髄または視神経に対する物理的外傷によるニューロン喪失を低下させるために投与される。
【００３１】
好都合なことに、配合物は、投与後の少なくとも２４時間にわたって前記のコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために十分な量で投与される。
【００３２】
なおさらなる局面において、本発明は、患者の傷治癒を促進する方法であって、前記傷の部位およびそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定された配合物を前記傷に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３３】
通常、傷は、火傷を含む外傷の結果である。しかし、傷は手術の結果であってもよい。
【００３４】
なおさらなる局面において、本発明は、物理的外傷を受けた傷および／または組織を処置することの一部としての炎症を低下させる方法であって、上記に規定された配合物を前記傷または組織あるいはその近くに投与する工程を含む方法を提供する。
【００３５】
好ましくは、前記傷は火傷である。
【００３６】
あるいは、前記傷は、脳、脊髄または視神経などのニューロン組織を含む組織に対する物理的外傷の結果である。
【００３７】
なおさらなる局面において、本発明は、傷を受けた患者の傷痕形成を低下させる方法であって、前記傷の部位またはそのすぐ近くにおけるコネキシンタンパク質（１つまたは複数）の発現をダウンレギュレーションするために、上記に規定された配合物を前記傷に投与する工程を含む方法を提供する。
【００３８】
再度ではあるが、傷は外傷または手術の結果であり得るし、配合物は、外科的な修復および／またはその閉鎖の直前にその傷に適用される。
【００３９】
なおさらなる局面において、本発明は、整形目的または治療目的のために皮膚を若返らせるか、または厚くする方法であって、上記に規定された配合物を皮膚表面に１回または反復的に投与する工程を含む方法を提供する。
【００４０】
好都合なことに、前記配合物は、コネキシン２６またはコネキシン４３に対するオリゴデオキシヌクレオチドを含み、そして上皮基底細胞の分裂および増殖を調節するために投与される。
【００４１】
別の実施形態において、前記配合物は、コネキシン３１．１に対するオリゴデオキシヌクレオチドを含み、そして外層の角質化を調節するために投与される。
【００４２】
好ましくは、配合物はクリームまたはゲルである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ａおよび図１Ｃは、傷害を与えた２４時間後のコントロール傷害部の２つの面を示す。傷害部はプルロニックゲル単独で処置されている。切片はＮｉｓｓｌ染色（青色核）され、ニューロンマーカーのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（褐色細胞）で抗体標識されている。
【図１Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ｂおよび図１Ｄは、印を付けた傷害部の輪郭に関する図１Ａおよび図１Ｃのグレースケール像をそれぞれ示す。傷害部の大きなサイズおよび不規則に広がった端に注意すること。傷害部は、傷害を与えたちょうど２４時間以内に脳梁（点線）に向かって下側に広がっている。
【図１Ｃ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ａおよび図１Ｃは、傷害を与えた２４時間後のコントロール傷害部の２つの面を示す。傷害部はプルロニックゲル単独で処置されている。切片はＮｉｓｓｌ染色（青色核）され、ニューロンマーカーのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（褐色細胞）で抗体標識されている。
【図１Ｄ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図１Ｂおよび図１Ｄは、印を付けた傷害部の輪郭に関する図１Ａおよび図１Ｃのグレースケール像をそれぞれ示す。傷害部の大きなサイズおよび不規則に広がった端に注意すること。傷害部は、傷害を与えたちょうど２４時間以内に脳梁（点線）に向かって下側に広がっている。
【図２Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図２は、傷を付けた２４時間後のコントール傷害部を示す。図２Ａには、Ｎｉｓｓｌ染色（青色核）および生存ニューロンのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識が示されている。図２Ｂは、印を付けた傷害部端および印を付けた脳梁（点線）の頂上に関するグレースケール等価図である。元の針跡は明瞭であるが、ニューロンの死が、Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識によって示されているように、傷害部端の十分な後方に生じている。傷害部の端は不規則であり、傷害部は、ちょうど２４時間以内に脳梁内にまっすぐ広がった。
【図２Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図２は、傷を付けた２４時間後のコントール傷害部を示す。図２Ａには、Ｎｉｓｓｌ染色（青色核）および生存ニューロンのＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識が示されている。図２Ｂは、印を付けた傷害部端および印を付けた脳梁（点線）の頂上に関するグレースケール等価図である。元の針跡は明瞭であるが、ニューロンの死が、Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識によって示されているように、傷害部端の十分な後方に生じている。傷害部の端は不規則であり、傷害部は、ちょうど２４時間以内に脳梁内にまっすぐ広がった。
【図３Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図３Ａおよび図３Ｂは、傷害を与えた４８時間後の、コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部のカラー像およびグレースケール像である。傷害部の輪郭には、傷害部の広がりおよび印をつけた脳梁（点線）の頂部を示すために、図３Ｂにおいて印が付けられている。図３Ａは、Ｎｉｓｓｌ（青色核）およびＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（ピンク細胞）について染色されている。コントロールの傷害部と比較して、傷害部は４８時間後でさえもかなり密集していることに注意すること（図１および２）。右側に少しの広がりが存在するが、傷害部の左側は、本質的には元の針跡に従い、広がりの徴候はほとんど見られない。傷害部の左側は非常に直線的であるが、脳梁まで広がっていない。
【図３Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図３Ａおよび図３Ｂは、傷害を与えた４８時間後の、コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部のカラー像およびグレースケール像である。傷害部の輪郭には、傷害部の広がりおよび印をつけた脳梁（点線）の頂部を示すために、図３Ｂにおいて印が付けられている。図３Ａは、Ｎｉｓｓｌ（青色核）およびＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ（ピンク細胞）について染色されている。コントロールの傷害部と比較して、傷害部は４８時間後でさえもかなり密集していることに注意すること（図１および２）。右側に少しの広がりが存在するが、傷害部の左側は、本質的には元の針跡に従い、広がりの徴候はほとんど見られない。傷害部の左側は非常に直線的であるが、脳梁まで広がっていない。
【図４Ａ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図４Ａおよび図４Ｂは、傷を付けた４８時間後における別のコネキシン４３アンチセンス処置傷害部を示す。標識は、グレースケール像（図４Ｂ）に輪郭が示される傷害部に関する図３と同じである。４８時間後でさえ、この傷害部は極めて密集しており、左側（中央側）へのみのわずかな広がりが見られる。傷害部の右側は、針跡の端までの生存ニューロン（傷害部領域内で実際に生存している）を伴ってかなり直線的であることに注意すること。傷害部は、脳梁（点線）の十分に上方にあり、実際には下方向の広がりがないことを示している。
【図４Ｂ】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図４Ａおよび図４Ｂは、傷を付けた４８時間後における別のコネキシン４３アンチセンス処置傷害部を示す。標識は、グレースケール像（図４Ｂ）に輪郭が示される傷害部に関する図３と同じである。４８時間後でさえ、この傷害部は極めて密集しており、左側（中央側）へのみのわずかな広がりが見られる。傷害部の右側は、針跡の端までの生存ニューロン（傷害部領域内で実際に生存している）を伴ってかなり直線的であることに注意すること。傷害部は、脳梁（点線）の十分に上方にあり、実際には下方向の広がりがないことを示している。
【図５】図１〜５は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含有するプルロニックゲルで処置されたラットの脳傷害部の切片、またはプルロニックゲル単独のコントール傷害部の切片を示す。すべての場合、傷害部は冠状面で連続的に切片にされ、中点切片を分析に使用した。各像（図５を除く）には、４ｍｍ×５．３３ｍｍの組織が示されている。図５は、約１．２ｍｍ×２ｍｍである。図５は、コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部の端を示す高倍率像である。傷害部の端に印が付けられ、傷害を与えた４８時間後でさえ、傷害を与えた針跡の端までの生存ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ染色）が示されている。
【図６】図６は、傷害を与えた２４時間後の、コネキシン４３に特異的なアンチセンスで処置された傷害部のＧＦＡＰ（赤色）およびコネキシン４３（緑色）の免疫組織化学的標識である。像は、傷害部の深さの半分の地点での傷害部の側方端で得られている。活性化された星状膠細胞のレベルは、コントロール（図７）と比較して上昇しており、コネキシン４３のレベルは著しく低下している。残存するコネキシン標識は、一般に血管（矢印）に結合している。
【図７】図７は、傷害を与えた２４時間後の、コントロール傷害物のＧＦＡＰ（赤色）およびコネキシン４３（緑色）の免疫組織化学的標識である。像は傷害部の中央端から得られ、ＧＦＡＰレベルが、傷害を受けていない皮質よりもわずかに上昇したことを示している。ＧＦＡＰ星状膠細胞マーカー（矢印）と同時に存在することが多い広範囲のコネキシン４３標識に注意すること。
【図８】図８は、傷害を与えた２４時間後（丸）および４８時間後（ひし形）における傷害部断面の下側半領域の比較を示す。分析を、冠状面で切断された連続的な切片化傷害部の中央部分について行った。傷害部は、生存ニューロンを明らかにするＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ抗体標識を使用して評価した。ＤＢ１で処置された傷害部（緑色マーカー）は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで処置されている。ゲルのみの傷害部群（赤色マーカー）もまた、中身のない傷害部を含み、ＨＢ３群（紫色マーカー）は、ランダム配列のコントロールオリゴデオキシヌクレオチドを含有するゲルで処置されている。コネキシン４３アンチセンスで処置された傷害部が大きくなっている場合がある（アンチセンスが十分に送達されていない場合と考えられる）が、非常に小さくなった傷害部はすべて、コネキシン４３アンチセンスで処置されていることに注意すること。傷害部は２ｍｍの深さに達し、分析はその１ｍｍ下までを含み、アンチセンスが到着しなかった外側端を除くようにした。
【図９】図９は、コネキシン４３のセンスＯＤＮおよびアンチセンスＯＤＮによる処置を行った２４時間後のラット脊髄における傷害部である。センスで処置された傷害部は未処置のコントロールと差がなかったが、アンチセンスで処置された傷害部は小さくなり、炎症が低下していた。
【図１０】図１０は、コネキシン４３のセンスＯＤＮ（左肢）およびアンチセンスＯＤＮ（右肢）による処置を行った２４時間後の新生児マウス前肢における傷害部である。アンチセンスで処置された肢における炎症の低下および増大した治癒速度に注意すること。
【図１１】図１１は、図１０に示された２４時間の傷の中心部を通る切片である。切片は、好中球を明らかにするためにトルイジンブルーで染色されている。アンチセンスで処置された傷には、著しいことに好中球がほとんど存在しておらず、炎症もほとんど生じていなかった。
【図１２】図１２は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスＯＤＮまたはセンスのコントロールＯＤＮで処置された、傷害を与えた５日後のラット肢の組合せである。アンチセンスで処置された傷害部は、より早く治癒しつつあり、傷痕の徴候はほとんど見られない。
【図１３】図１３は、新生児段階で作製されたラット肢の傷害部の組合せであり、この場合には傷害を与えた８日後が示されている。傷害部は、コネキシン４３に特異的なアンチセンスＯＤＮまたはセンスのコントロールＯＤＮで処置された。毛が成長し、そして、アンチセンス処置により、より小さな傷痕、およびより少ない毛喪失が得られたことが明かである。傷害部の部位は、センスで処置されたコントールでは依然として目立っているが、アンチセンスで処置された肢では検出することが困難である。
【００４４】
（発明の詳細な説明）
上記に広く規定されているように、本発明の中心は、コネキシン発現の部位特異的なダウンレギュレーションにある。これは、コネキシン発現をダウンレギュレーションさせる部位での直接的な細胞−細胞連絡を低下させるという作用を有し、これにより、下記に記載されているように多数の治療的／整形的な適用がもたらされる。
【００４５】
コネキシン発現のダウンレギュレーションは、一般には、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど）を使用するアンチセンス法に基づいており、より詳細には、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の使用に基づいている。これらのポリヌクレオチド（例えば、ＯＤＮ）は、ダウンレギュレーションすべきコネキシンタンパク質（１つまたは複数）を標的とする。典型的には、ポリヌクレオチドは一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。
【００４６】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンの転写および／または翻訳を阻害することができる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、コネキシン遺伝子からの転写および／または翻訳の特異的な阻害剤であり、他の遺伝子からの転写および／または翻訳を阻害しない。その産物は、（ｉ）コード領域の５’および／または（ｉｉ）コード領域および／または（ｉｉｉ）コード領域の３’のいずれかでコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡに結合することができる。
【００４７】
一般に、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の細胞内での発現を低下させる。
【００４８】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、一般には、コネキシンｍＲＮＡに対するアンチセンスである。そのようなポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし得ることがあり、従って、コネキシンの発現が、転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡの核からの輸送、翻訳またはｍＲＮＡ分解を含むコネキシンｍＲＮＡ代謝の１つまたは２つ以上の局面を妨害することによって阻害され得る。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、コネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションして、ｍＲＮＡの翻訳の直接的な阻害および／または脱安定化をもたらし得る二重鎖を形成する。そのような二重鎖はヌクレアーゼによる分解を受けやすい場合がある。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部にハイブリダイゼーションすることができる。典型的には、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡのリボソーム結合領域またはコード領域にハイブリダイゼーションする。本発明のポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部の領域に対して相補的であり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、コネキシンｍＲＮＡの全体または一部の完全な相補体であり得る。しかし、絶対的な相補性は必要とされず、生理学的条件のもとで、２０℃、３０℃または４０℃よりも大きな脱離温度を有する二重鎖を形成するために十分な相補性を有するポリヌクレオチドが、本発明における使用には特に好適である。
【００５０】
従って、本発明のポリヌクレオチドは、典型的にはｍＲＮＡのホモログである。本発明のポリヌクレオチドは、約５０℃〜約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウムなどの中度から高度のストリンジェンシーな条件のもとでコネキシンｍＲＮＡにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであり得る。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、長さが６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドである。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは長さが１２ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、長さが少なくとも４０ヌクレオチドであってもよく、例えば、少なくとも６０ヌクレオチドまたは少なくとも８０ヌクレオチドであり、そして１００ヌクレオチドまで、２００ヌクレオチドまで、３００ヌクレオチドまで、４００ヌクレオチドまで、５００ヌクレオチドまで、１０００ヌクレオチドまで、２０００ヌクレオチドまで、または３０００ヌクレオチドまで、またはそれ以上までのヌクレオチドの長さであってもよい。
【００５２】
コネキシンタンパク質またはＯＤＮに標的とされるタンパク質は、ダウンレギュレーションが作用する部位によって変わる。このことはコネキシンサブユニット組成物による、体全体の各種部位におけるギャップ結合の不均一構造を反映している。コネキシンはヒトまたは動物において自然発生するいずれのコネキシンでもよい。コネキシン遺伝子（コード化配列を含む）は一般に、表１に示すコネキシン４３コード化配列と相同であるように、本明細書で述べる特定のコネキシンのいずれとも相同性を持つ。コネキシンは通常、αまたはβコネキシンである。好ましくは、コネキシンは皮膚または神経組織（脳細胞を含む）中で発現される。
【００５３】
しかし一部のコネキシンタンパク質は、組織中の分布に関しては他のタンパク質よりも遍在性である。最も広範囲に及ぶもののひとつは、コネキシン４３である。したがって、コネキシン４３を標的とするＯＤＮは本発明での使用に特に適している。
【００５４】
別個のコネキシンタンパク質を標的とするＯＤＮを組み合わせて使用すること（たとえば、１、２、３、４またはさらに異なるコネキシンを標的としてもよい）も考慮されている。たとえばコネキシン４３を標的とするＯＤＮおよびコネキシン族の他の１個以上の要素（コネキシン２６、３１．１、３２、３６、４０および４５）は組み合わせて使用できる。
【００５５】
個々のアンチセンスポリヌクレオチドはあるコネキシンに対して特異性であるか、１、２、３またはさらに別のコネキシンを標的とすることがある。特異性ポリヌクレオチドは一般に、コネキシン間で保存されないコネキシン遺伝子またはｍＲＮＡ内の配列を標的とするが、非特異性ポリヌクレオチドは保存配列を標的とする。
【００５６】
本発明で使用するＯＤＮは一般に、未修飾ホスホジエステルオリゴマーとなる。これらの長さは変化するが、３０ｍｅｒＯＤＮを持つものが特に適する。
【００５７】
アンチセンスポリヌクレオチドは化学修飾してもよい。化学修飾によってヌクレアーゼに対する耐性が高まり、細胞を入れる能力が向上する。たとえばホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドが使用できる。他のデオキシヌクレオチド類似体としては、メチルホスホン酸、ホスホルアミド酸、ホスホロジチオ酸、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホルアミド酸、オリゴリボヌクレオチドホスホロチオ酸、その２’−Ｏ−アルキル類似体および２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホン酸が挙げられる。
【００５８】
または、混合主鎖オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）を使用してもよい。ＭＢＯはホスホチオ酸オリゴデオキシヌクレオチドのセグメントおよび修飾オリゴデオキシ−またはオリゴリボヌクレオチドの適切に配置されたセグメントを含む。ＭＢＯはホスホロチオ酸結合のセグメント、および非イオン性で、ヌクレアーゼに高い耐性を持つメチルホスホン酸などの他の修飾オリゴヌクレオチドや２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチドの他のセグメントを持つ。
【００５９】
本発明で使用するアンチセンスポリヌクレオチドの正確な配列は、標的コネキシンタンパク質によって変わる。コネキシン４３の場合、次の配列を持つＯＤＮが特に適している：
【００６０】
【化６】
【００６１】
他のコネキシンタンパク質を標的とするＯＤＮは、任意の便利な従来の手法によって、そのヌクレオチド配列の観点から選択できる。たとえば、コンピュータプログラムのＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＯｌｉｇｏＴｅｃｈ（米国オレゴン州のユージーンのＯｌｉｇｏ ｅｔｃ．）を使用できる。たとえば、コネキシン２６、３１．１および３２のＯＤＮは以下の配列を持つ。
【００６２】
【化７】
ＯＤＮはいったん選択すると、ＤＮＡ合成装置を用いて合成できる。
【００６３】
本発明で使用する場合、ＯＤＮは部位特異性送達が必要である。これらは長期間にわたる送達も必要とする。送達時間は明らかにダウンレギュレーションが誘発される部位と望ましい治療効果の両方に依存し、２４時間以上の連続送達が必要な場合が多い。
【００６４】
本発明によれば、このことは、ＯＤＮを製薬的に許容可能な担体またはビヒクルとともに、特に局所投与用の調合物の形の調合物中に包含させることによって実現できる。
【００６５】
本発明の調合物はいったん調製してしまえば、細胞−細胞伝達における過渡的および部位特異性の中断が望ましい場合のあらゆる治療／化粧用手法において有用である。これらは、脳、脊髄または視神経におけるニューロン損傷の治療（損傷ができるだけ局在化される場合）、創傷治癒の促進、たとえば成形外科およ火傷の後の傷形成の低減などが含まれる。
【００６６】
特にクリームなどの局所調合物を使用して、上皮基底細胞の分裂ならびに増殖（コネキシン４３を標的とするＯＤＮを使用）および外層角質化（コネキシン３１．１を標的とするＯＤＮを使用）を調節できる。
【００６７】
アンチセンスポリヌクレオチド（ＯＤＮを含む）は、実質的に遊離形で存在する。生成物は、生成物の所期の目的を阻害せず、実質的に遊離していると見なされる担体または希釈在と混合してもよいことを理解されたい。本発明の生成物は実質的に精製形であり、そのような場合、ポリヌクレオチドまたは調製物の乾燥重量の一般に９０％、たとえば少なくとも９５％、９８％または９９％より成る。
【００６８】
投与
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（ＯＤＮを含む）（一般に本明細書で述べる調合物の形で）はしたがって、本明細書で述べる疾病または症状のいずれかを持つヒトまたは動物などの、治療の必要なヒトまたは動物に投与される。すると、ヒトまたは動物の症状を改善することができる。ポリヌクレオチドおよび調合物はそのため、治療によるヒトまたは動物の体の処置に使用できる。これらは本明細書で述べる症状すべてを治療するための薬剤の製造に使用される。
【００６９】
アンチセンスポリヌクレオチドは局所的に（治療される部位に）投与できる。製薬組成物を製造するために、アンチセンスポリヌクレオチドを製薬的に許容可能な担体または希釈剤と組み合わせることが好ましい。適切な担体および希釈剤としては、たとえばリン酸緩衝生理食塩水などの等張食塩水が挙げられる。該組成物は、非経口、筋肉内、脳内、静脈内、皮下または経皮投与用に調合できる。
【００７０】
患者に投与されるアンチセンスポリヌクレオチドの用量は、年齢、体重および患者の全身状態、治療する症状、投与される特定のアンチセンスポリヌクレオチドなどによって変わる。しかし適切な投与量は、１〜４０ｍｇ／体重１ｋｇなど、０．１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇである。
【００７１】
哺乳類細胞による核酸の摂取は、たとえば形質移入剤の使用を含む手法などの、複数の既知の形質移入手法によって向上する。投与される調合物はこのような薬剤を含むことがある。このような薬剤の例としては、カチオン剤（たとえばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタント（たとえばリポフェクタム（登録商標）およびトランスフェクタム（登録商標））が挙げられる。
【００７２】
熟練した医師は特定の患者および症状に最適な投与経路および用量をただちに決定できるため、上述した投与経路および用量は単なる指標である。
【００７３】
相同体
本明細書では相同および相同体について述べる（たとえば該ポリヌクレオチドはコネキシンｍＲＮＡにおける配列の相同体でもよい）。このようなポリヌクレオチドは一般に、たとえば（相同性配列の）少なくとも１５、２０、４０、１００以上の近接ヌクレオチドの領域に渡って、関連配列と少なくとも７０％は相同性であり、少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％は相同性であることが好ましい。
【００７４】
相同性は当業界におけるどの方法に基づいて計算してもよい。たとえばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性の計算に使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（たとえばそのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，ｐ．３８７−３９５）。たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ．（１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０で述べられているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性やラインアップ配列（通常はデフォルト設定で）を計算できる。
【００７５】
ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｈｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとともに整列させた場合、ある正の閾値スコアＴに一致または満足する問合せ配列における長さＷのショートワードを識別することによって、高得点配列対（ＨＳＰ）を最初に識別することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， 同上）と呼ばれる。これらの初期隣接ワードのヒットが、それらを含むＨＳＰを見つける検索を開始する発端として作用する。このワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限りは、各配列に沿って両方向に拡張する。各方向のワードヒットの拡張は次の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大達成値よりＸという量だけ低下した場合；累積アラインメントスコアが、１個以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積によって、ゼロ以下になった場合；またはどちらかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ） １０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を用いる。
【００７６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計解析を行う；たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の基準の１つは最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致が偶然発生する確率を示すものである。たとえば、第１の配列を第２の配列と比較した場合に最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、ある配列が別の配列と等しいと見なされる。
【００７７】
相同性配列は通常、関連配列とは、少なくとも（またはせいぜい）２、５、１０、１５、２０以上の（置換、欠失または挿入である）変異により相違する。これらの突然変異は、相同性の計算に関連して上述したいずれの領域においても測定できる。
【００７８】
相同性配列は通常、バックグラウンドよりも著しく高いレベルで、選択的に元の配列にハイブリダイズする。選択的ハイブリダイゼーションは通常、厳密性が中程度から高程度（たとえば、約５０〜６０℃において０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて実施される。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、当業界で既知の適切などの条件下でも実施できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）を参照）。たとえば高い厳密性が必要な場合、適切な条件としては６０℃における０．２ｘＳＳＣが挙げられる。低い厳密性が必要な場合、適切な条件としては６０℃における２ｘＳＳＣが挙げられる。
【００７９】
本発明の各種態様は、以下の実験節を引用して説明する。これらは例示のみのために与えられ、本発明の範囲を制限するものでないことを理解されたい。
【００８０】
実験
実験１
物質および方法
アンチセンスの適用
リン酸緩衝生理食塩水（分子級水）中の３０％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７ゲル（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ）を用いて、未修飾ａ１コネキシン（コネキシン４３）特異性アンチセンスＯＤＮを発生中のニワトリ胚に送達した（Ｓｉｍｏｎｓ， ｅｔ ａｌ．， １９９２）。ニワトリ胚は３８℃でインキュベートし、ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＨａｍｂｕｒｇｅｒのステージに従って実施した。卵に窓を開け、治療する領域のｖｉｔｌｅｌｉｎｅおよび羊膜は細い鉗子を用いて開いた。アンチセンスの適用の後、卵をテープで密封し、大半の実験が解析される４８時間の間、インキュベータ内に置いた。ただし、ａ１コネキシン「ノックダウン」および回復の時間経過解析の場合は除く。
【００８１】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは０〜４℃の低温では液体であるが、生理温度の胚に滴下すると凝固して、少なくとも１２時間定着したままである。該ゲルの別の利点は弱い界面活性剤であることであり、これは単独で使用したり、ＤＭＳＯとともに使用すると、ＯＤＮの細胞内へ浸透を著しく促進するように思われる（Ｗａｇｎｅｒ、１９９４）。共焦レーザー走査顕微鏡法を用いて見られる、ＦＩＴＣタグのＤＢ１ ＯＤＮへの付加は、プローブの細胞間貫入を示す。使用したデオキシオリゴヌクレオチドの配列は、表１に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
すべてのＯＤＮは、０．０５ｍＭ〜５０ｍＭを範囲とする予備実験中の用量依存解析の後、０．５〜１．０ｍＭ最終濃度で適用された。一般毒性効果は、ＯＤＮ濃度が１０ｍＭを超える場合のみに明らかになった。ＯＤＮゲル混合物は、−８０℃で保存した濃縮貯蔵溶液から調製した。
【００８４】
アンチセンス配列
ＤＢ１は、ａ１コネキシン遺伝子の塩基１０９４−１１２３の対して相補性の、マウスのアンチセンス配列である。ニワトリａ１コネキシン配列とは４つのミスマッチがある。ＣＧはニワトリａ１コネキシン塩基７２０−７４９に対して相補性である。このプローブの有効性は、１％のジミメチルスフホキシド（ＤＭＳＯ）をゲルに添加すると向上した。ＤＭＳＯは他のアンチセンスＯＤＮまたは対照の結果に、追加の影響を与えなかった。
【００８５】
対照配列
ＤＢ１（ニワトリ）は、ニワトリａ１コネキシン塩基９５４−９８３に一致する、ＤＢ１のニワトリａ１コネキシン相当物である。しかし解析は、ステムループ構造（Ｇ＝−７．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，ループＴｍ＝９２°）の形成およびホモ二量体化（Ｔｍ＝１．５°）が高い確率で生じることを示しているため、対照配列として作用する。一部のセンスオリゴヌクレオチドが、転写を阻害する安定なＤＮＡトリプレットを形成可能であることが報告されている（Ｎｅｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。しかし、これはＤＢ１（センス）では明確ではなかった。安定な第２構造（Ｇ＝１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を持たず、不安定なホモニ量体化が生じるランダム対照配列も使用され、ＣＶ３と呼ばれた。ＤＢ１の追加の対照適用同濃度混合物およびＤＢ１（センス）は、欠失のバックグラウンドレベルを与えた。
【００８６】
タンパク質ノックダウンの監視
細胞−細胞界面におけるａｌコネキシンギャップ結合タンパク質の免疫組織化学局在化は、アンチセンス効果の直接測定値を与える。アンチペプチドａ１コネキシン特異性抗体プローブを用いて、ホールマウント胚を染色し、コネキシン分布は、確立された手順（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）に従って、共焦レーザー走査顕微鏡法を用いて解析した。発生ニワトリ胚で発現される他の２つのコネキシン（コネキシンｂ１およびｂ２）の対照標識付けも、配列特異性抗体を使用して同様に実施した（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００８７】
結果
ａ１コネキシン発現の低下
未修飾ａ１コネキシン特異性アンチセンスＯＤＮを発生ニワトリ胚に送達するためにＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲルを使用すると、タンパク質発現が選択された時点で阻害され、ニワトリ胚の特定領域を標的としたアンチセンス治療が可能となる。比較的低濃度でアンチセンスを含むゲルの小滴を各胚に正確に滴下した。ゲルは凝固し、少なくとも１２時間は定着したままであるため、この領域では低用量のアンチセンスが持続した。アンチセンス適用は、肢、神経管および顔における上昇発現の前に結合を抑止するために、標的化および計時された。これらの時間は、標的組織の細胞膜中にすでに存在するタンパク質のターンオーバーに依存するのではなく、新たなタンパク質の発現を低下させることによってアンチセンスの効果を最適化するために選択した。ＤＢ１およびＣＧ１ ＯＤＮの両者が、２時間以内に神経管および肢芽内のａ１コネキシンタンパク質の発現を低下させ、４〜８時間内に劇的に低下させ、１８〜２４時間および４８時間では一部の組織で持続していた（データは示さない）。ａ１コネキシンタンパク質のダウンレギュレーションは、使用したいずれの対照においても明確ではなかった。同様に、ニワトリ胚で発現したコネキシン族の２つの要素、ｂ１コネキシンおよびｂ２コネキシンは、ａ１コネキシン特異性アンチセンスＯＤＮによって影響を受けなかった。
【００８８】
すべての実験で、複数の並行対照を実施した。これらには；ＤＢ１センス、組み合わされたＤＢ１アンチセンスおよびＤＢ１センス、（それ自体を用いてステムループ構造を形成する）ＤＢ１ニワトリ、ランダムＯＤＮ’ｓ ＣＶ３、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル単独、ＤＭＳＯを含むＰｌｕｒｏｎｉｃゲル、ＰＢＳ単独が含まれる。いずれの対照も、ａ１コネキシンタンパク質発現に対して顕著な効果は示さなかった。
【００８９】
実験２
概要
星状細胞は、哺乳類の脳において最も豊富な細胞種を構成している。これらは主としてコネキシン４３より成るギャップ結合によって、相互におよびニューロンに幅広く結合する（Ｇｉａｕｒｍｅ ａｎｄ ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９６））。誘発された虚血または物理的脳損傷の後、これらのチャネルは開いたままで、（上昇した組織内カリウムならびにグルタミン酸およびアポトーシス信号によって開始される）機能低下の拡張波が伝播される（Ｃｏｔｒｉｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９８））。上昇したサイトゾルカルシウムの波およびＩＰ３などの第２メッセンジャー分子は、ギャップ結合チャネル経由で損傷領域の核を越えてゆっくりとニューロンに広がり、攻撃の２４〜４８時間後に損傷への拡張が起きる。このような方法で、損傷していない隣接細胞は破壊され（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、これがいわゆるバイスタンダー効果である。
【００９０】
本実験は、本発明の調合物がこのバイスタンダー効果を防止する能力を調査する。
【００９１】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列によって調製した。
【００９２】
【化８】
【００９３】
方法
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）
未修飾ＯＤＮは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲル（ＢＡＳＦ）によって送達した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは低温（０−４℃）にて液体であり、生理温度にて凝固し、弱い界面活性剤でもある。未修飾ＯＤＮは通常、細胞内での半減期が約２０分であるが（Ｗａｇｎｅｒ １９９４）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル装填法によって連続拡散源が与えられ、ゲルがリザーバーとして作用する（Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９９））。コネキシン４３に対して特異性のＯＤＮまたは同様の塩基組成の対照ランダムＯＤＮは、２ｍＭの最終濃度にて適用した。ゲルのみの対照も実施された。ＯＤＮは３０ｍｅｒであり、解析によってヘアーピンループまたはホモ二量体化が生じないことが示された。
【００９４】
障害
脳障害は２５０〜３００ｇのオスのウィスターラットで実施した。動物は酸素中の１〜２％ハロセンによって麻酔をかけ、頭は定位固定クランプで保持した。障害部位周辺の領域は剪毛し、頭骨上の皮膚はメスを用いて矢状断面で切開し、頭骨板を露出させておくために引き戻した。Ａｒｌｅｃエングレーバーを用いて前頂の右側に直径０．５ｍｍの穴を頭骨板３ｍｍに開け、マイクロメータステージに結合された１９Ｇ１ １／２ゲージシリンジを用いて、脳の皮質内に窓外を作成した。ステージによって正確な方向制御と、障害を脳梁のはるか上の皮質内に維持する、正確な２ｍｍの貫入深さが可能となる。
【００９５】
準備した動物を用いて、コネキシン４３特異性ＯＤＮ（または対照ＯＤＮ）を含む、１０ｍｌの氷冷Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７ゲル（ＢＡＳＦ）を、先が平らになるようにやすりで切り、予備冷却した１９Ｇ１ １／２ゲージ注射器の針内に吸引した。注射針は、切り詰めた黄色いピペットチップによってメスピペットに取り付けた。次に、針内のゲルは室温まで加温すると凝固した。チップにゲルの栓を含む針を、ＰＢＳを含む１ｍｌ注射器に付け替えて、過度に貫入するのを防ぐため、針チップが（頭骨に対して直面している）スリーブを備えた障害まで下げられるように、スリーブを針シャフト上に滑らせた。注射器のピストンにゆっくりと圧を加えると、ゲルが針から押し出されて障害に貫入した。次に創傷を過酸化水素で処置して出血を止め、皮膚を元通りに縫合した。動物を注意深く監視し、２４時間後、４８時間後または１２日後に屠殺する準備ができるまで放置した。
【００９６】
凍結切断
動物はＮｅｍｂｕｔａｌ（ペントバルビトンナトリウム、Ｖｉｒｂａｃ）を用いて屠殺し、断頭した。脳を損なわないように取り出し、ドライアイスでただちに凍結させ、切断準備ができるまで−８０℃で保存した。連続凍結切片（３０ｍｍ切片）を前部から後部（冠状面）まで採取し、乾燥した切片をクロム明礬処理スライドに装着し、組織化学または免疫組織化学用に−８０℃で保存した。障害の中間切片が明確に識別されるように、各障害の最初と最後の切片を記録した。
【００９７】
組織化学
ヘマトキシリンおよびエオシン染色するため、切片を順次濃度を下げたアルコール（無水、２×９５％、１×７０％、水）で水和させ、Ｇｉｌｌのヘマトキシリンで４分間染色した。次に切片を水で洗浄し、Ｓｃｏｔｔ水に浸漬し、再度水で洗浄した。次にＭｏｏｒｅの緩衝エオシンで３０秒間染色した。切片を再度水で洗浄してから、一連のアルコール（２×９５％、１×無水）、５０：５０のアルコール：キシロールで脱水し、キシレンに浸漬した。さらに切片をＨｉｓｔｏｍｏｕｎｔａ封入剤を用いて標本とした。
【００９８】
Ｎｉｓｓｌ染色のために、切片を順次濃度を上げたアルコール（７５％、９５％、３×１００％）でそれぞれ５分間脱水し、キシレンで５分間脱脂した。次に切片を順次濃度を上げた同一のアルコールで再度水和させ、水で洗浄した。さらに切片をＮｉｓｓｌ染色溶液（５ｍｌの２％水性Ｃｒｅｓｙｌバイオレット原液、９０ｍｌの６％氷酢酸水溶液、１０ｍｌの１．３５％酢酸ナトリウム溶液）中に１０分間放置した。次いで切片を一連の昇順濃度のアルコール（７５％で５分間、９５％と３×１００％で各２分間）と、キシレン×３でそれぞれ１０分間素早く脱水した。さらにＨｉｓｔｏｍｏｕｎｔａ封入剤を用いてカバーガラスをかけた。
【００９９】
免疫組織化学
最初に、凍結切片をＰＢＳ中で室温に戻した。次にメタノール中で２分間透過化処理し、ＰＢＳですすいで、０．１Ｍリジンおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−ＸのＰＢＳ溶液中に移して、３０分以上ブロッキングした。次にＰＢＳで２分間、２回洗浄した。ＰＢＳを除去し、切片当たり５０ｍｌの一次抗体を加えた。
【０１００】
免疫組織化学法は、コネキシン４３に対する一次抗体であるＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎｕｃｌｅｉ（脊椎動物固有の核タンパク質ＮｅｕＮ）およびＧＦＡＰ（グリア原繊維酸性タンパク質）を用いて実施した。以下の抗体を使用した：
濃度１：３００のウサギ抗−Ｃｘ４３（Ｇｏｕｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９１））
濃度１：１００のマウス抗−Ｃｘ４３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）
濃度１：１０００のウサギ抗−ラットＧＦＡＰ（ＤＡＫＯ，Ｚ０３３４）
濃度１：０００のマウス抗ニューロン核（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）
【０１０１】
コネキシンおよびＧＦＡＰ用に、標識切片は４℃で一晩インキュベートした。次に軌道振盪機上でＰＢＳによって１５分間、３回洗浄した。この後、過剰のＰＢＳを除去し、切片当たり５０ｍｌのＡｌｅｘａａ４８８抗−ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州）を１：２００の濃度で加えた。モノクローナルおよび二重標識用に、ＣＹ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１３２Ｃ）抗−マウス二次抗体を使用した。切片を暗所にて室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄した。標本作成のため、過剰なＰＢＳをスライドから除去し、Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ（グリセロール／ＰＢＳ溶液）抗−退色剤を１，２滴加えた。カバーガラスを切片上に下げて、マニキュア液で密封した。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識の場合、二次抗体はビオチン化ヤギ抗−マウスであって、次いでアビジン結合ＨＲＰおよびＤＡＢ反応（Ｓｉｇｍａ ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎまたはＤＡＫＯ Ｑｕｉｃｋｓｔａｉｎキット）を行った。
【０１０２】
画像診断および分析
Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ４Ｄ共焦レーザー走査顕微鏡を用いて、免疫蛍光標識を実施した。次いで、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｍｂｉｎｅ機能を用いて、またはＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐによって二重標識画像を組み合わせた。ヘマトキシリンおよびエオシン、Ｎｉｓｓｌ染色サンプル、またはＮｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識切片は、Ｋｏｎｔｒｏｎ（Ｚｅｉｓｓ）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ３００８デジタルカメラを用いてキャプチャーし、障害領域はＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ）を用いて解析した。障害領域は各障害の中間切片で解析した。
【０１０３】
結果
我々の対照ゲル実験、すべての障害、対照およびアンチセンス処理において、外傷発生から最初の２４〜４８時間における詳細に記録された脳障害の拡大は、ゲルの装填後、ゲルが停止しにくい外縁付近で広がる傾向を見せた。しかし、対照障害は脳梁に向かって下方および側面に広がって、でこぼこに広がった縁を形成した（図１および２）。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ抗体標識組織を調べると、障害縁の十分後ろからニューロンの死が起こっており、Ｎｉｓｓｌ染色領域では生存しているニューロンが残っていないことが明らかになった。この拡大は主として２４時間以内に発生し（図１および２）、障害後４８時間まで続いた。このことは、図２で特に明確である。図２では、２４時間以内でニューロンの死が、障害縁の十分後ろから別の正常に見える組織にかけて明らかであり、障害はすぐ下の脳梁へ広がっている。これに対して、コネキシン４３アンチセンス処理した、より良い障害は、元の障害部位に限定されたままであり、基準面が明確に限定されている（図３および４）。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識はＮｉｓｓｌ染色組織と共存し、いずれのコネキシン４３アンチセンス処理した障害も脳梁へは広がらない。Ｎｅｕｒｏｎａｌ−Ｎ標識は、元の針路障害のすぐ縁までニューロンが生存していることを示している。これらの障害周囲の生存ニューロンは、針路障害の縁を示す明確な境界を規定することが多い（図３および５）。アンチセンス処理後は、障害自体の内部でさらに多くの組織が生存している；対照障害では、細胞死は障害区域内の組織損失を引き起こす（図２の２４時間後の対照障害と、図３および４の４８時間後のアンチセンス処理障害を比較）。
【０１０４】
グリア原繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の抗体標識によって、障害縁における星状細胞の活性化上昇が多少見られるのに対して、コネキシン４３タンパク質レベルは、アンチセンス処理障害縁に沿った多くの箇所で、対照（図７）と比較すると特に基底および内側縁（図６）で明らかに低下している。一部の領域では、コネキシン４３特異性アンチセンス処理の２４時間後に残っているコネキシン４３標識は、ＧＦＡＰレベルの上昇（図６）にもかかわらず、血管壁内にある。一般にアンチセンス処理障害周辺を標識するコネキシン４３は、半分以上のコネキシン４３標識が星状細胞に関連している対照においてよりもはるかに低い程度で、ＧＦＡＰと共存する。他のコネキシンレベル（コネキシン２６および３２）は、コネキシン４３特異性アンチセンス処理によって変化したようには思われなかった。
【０１０５】
３６匹の動物に障害を加えた。２１匹の動物について断面積（冠状面における中央切片の障害量）を解析した。結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
最終解析では、（ゲルが障害の底部に注入および定置されるため）アンチセンス処理がほとんどまたは全く効果を示さない外縁にて広がる障害を除外するために、外側皮質縁から１ｍｍ下のラインによる障害領域を測定した。１匹のアンチセンス処理動物がこのグループの平均から３倍標準偏差を超えて外れたため、これを除外した。アンチセンス処理障害の平均障害サイズは２４および４８時間後で、１．４５ｍｍ２（＋／−０．５５）であり、対照の場合は２．１ｍｍ２（＋／−０．６）であった。（２４および４８時間後のアンチセンス処理８個および対照障害８個のうち）最小の４個はすべてコネキシン４３処理によるものであり、最小の対照障害はこれらの４個よりも５０％以上大きかった。このデータはさらに、図８に図式的に示してある。１２日後までに、ラットでは再生が起こり（ヒトの脳組織では起こらないが）、障害拡大の限界は明確に規定されていなかった。
【０１０８】
考察
Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル栓−アンチセンスＯＤＮ法を用いて、哺乳動物の脳の大脳皮質における障害後に発生する星状細胞増加時の、コネキシン４３ノックダウンの効果を調査した。脳において、瀕死のニューロンによる毒素放出によって、バイスタンダー効果として知られる影響が生じ、毒素がギャップ結合チャネルを通じて近隣細胞に広がる（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８））。神経変性条件下で、毒素をゆっくりと放出させると、明らかに星状細胞におけるコネキシン４３チャネルのアップレギュレーションが生じ、血流への毒素の輸送および血流からの毒素の除去が可能となる。しかし重篤な外傷の場合は、このアップレギュレーションが高濃度の毒素が近隣のニューロンに広がるのを促進するため、近隣のニューロンは死に至る。コネキシン４３アップレギュレーションおよびコネキシン４３チャネルのノックダウンを阻止すると、この広がりが阻害され、障害が断面積で最大５０％に縮小する。このことは、虚血性脳卒中の処置、神経変性疾病の治療、外科的介入による副作用の調整に多大な意味を持つ。
【０１０９】
実験３
概要
損傷ニューロンが放出する毒素による神経組織におけるバイスタンダー効果が近隣細胞に広がり、それを死に至らしめることは詳細に記録されている。実験２は、ギャップ結合タンパク質コネキシン４３をノックダウンするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの持続性放出手法を用いて、脳におけるこの効果を低下させられることを示している。
【０１１０】
脳に似た組成の別の組織は脊髄であり、ここでは神経集団はグリア細胞の集団によって支持されている。グリア細胞には、神経環境からグルタミン酸および過剰なカルシウムを除去して神経保護効果を担っている星状細胞が含まれる。この実験は、本発明の調合物が脊髄障害の拡張を低減する能力について調査する。
【０１１１】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した。
【０１１２】
【化９】
【０１１３】
方法
ウィスターラットに麻酔をかけ、脊髄を露出させた。脊髄に標準二等分障害を作成し、コネキシン４３に対するアンチセンスまたはセンスＯＤＮ（５ｍＭ）のいずれかを含む冷却Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲル５ｍｌを障害中に配置した。適用は盲目的に行った。次に露出した脊髄を元に戻し、ラットをケージに戻した。一部の動物は２４時間後に屠殺したが、残りの動物は１２日間および２ヶ月間維持し、ニューロン再生の程度と障害の最終サイズを判定した。軸索再生実験では、ラットに麻酔をかけ、脊髄への入口部位の前で軸索を切断した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のペレットを切断部に配置して、軸索を２４時間に渡って逆標識した。翌日ラットを屠殺し、その脊髄を取り出し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。次に脊髄を細胞切断用に処理し、索軸から連続した縦方向８ｍｍの切片を取り出した。次いで切片を、コネキシンまたはＧＦＡＰ用にヨウ化プロピジウムを核マーカーとして用いて免疫染色するか、ＨＲＰを示すように処理した。
【０１１４】
結果
障害の２４時間後、コネキシン４３およびアンチセンスＯＤＮで処理した脊髄には著しい相違が見られた。センス障害は未処理対照との相違は示さなかったが、これに対してアンチセンス処理障害はより小さく、炎症が少ないように見えた（図９）。
【０１１５】
１２日後、ＨＲＰ標識軸索はセンスおよびアンチセンス処理脊髄の両方で見られたが、どちらの場合も障害にわたる著しく多くの再生索軸は見られなかった。しかし、アンチセンス障害の障害サイズには著しい相違が見られ、センスまたは未処理障害よりも非常に小さく見えた。
【０１１６】
障害の２ヵ月後、再生索軸の脊髄ＨＲＰ標識によって、センスおよびアンチセンス処理の両方において障害部位を通過できなかったことがわかった。アンチセンス処理コードにおいて障害サイズが著しく小さかったのは、二次ニューロン細胞の死が大幅に減少したことを示している。
【０１１７】
考察
本発明の調合物を使用すると、コネキシン４３のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドノックダウンによって、脊髄損傷の最初の２４〜４８時間後に発生する障害拡張が著しく低減される。コネキシン４３のノックダウンも炎症を低減し、さらに神経保護効果を促進するが、ニューロンが障害部位で再増殖する能力は変化しなかった。したがって、コネキシン４３特異性オリゴヌクレオチドによるアンチセンス処理は、損傷ニューロンの再増殖を促進できないが、損傷の拡大を低減する著しい神経保護効果を備えている。
【０１１８】
実験４
概要
皮膚創傷を修復するために、繊維芽細胞、内皮細胞およびケラチノサイトなどの多数の細胞種が活性化され、細胞外基質を増殖、移動および固着させて創傷を満たす。
【０１１９】
伝達および細胞間信号伝達は、創傷治癒プロセスの重要な機能である。細胞間信号伝達も皮膚層のギャップ結合チャネルの広範なネットワークを通じて役割を担っていると思われるが、細胞外信号伝達機構は主要な因子と考えられている。損傷細胞から表皮を通じて広がるカルシウム波は、その損傷を信号伝達する。正常な創傷治癒コネキシンレベルは、６時間以内に低下を開始し、回復するのに６日間かかる。これらの変化が担う役割は理解されていないが、ひとつの理論は、細胞が迅速に分裂するために近隣の細胞から放出されて、次に接合部が再生されて、創傷部位の内部や上部への移動を調整される。
【０１２０】
本実験は、本発明の創傷治癒を行う調合物の能力について調査する。
【０１２１】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した：
【０１２２】
【化１０】
【０１２３】
方法
ＣＤ１系統の新生マウスにスプレーによる局所麻酔で麻酔をかけた。次に長さ２ｍｍの清潔な切開創傷を前脚に沿って虹彩刀で作成した。解剖顕微鏡の下で該創傷を作成することによって、大きさが非常に再現しやすくなる。創傷は通常３〜６日で治癒する。後の時点で創傷部位を引き続き確認するための印として、炭素粉を創傷に振りかけた−どちらにしても、炭素粉は治癒には影響を与えない。次に、センスまたはアンチセンスＯＤＮを含む、冷却した５ｍｌのＰｌｕｒｏｎｉｃゲルを創傷に塗布した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルは０〜４℃では液体であるが、それ以上の温度では凝固する。創傷に塗布すると、ゲルはその場で凝固し、ＯＤＮの徐放リザーバーとしてはもちろん弱い界面活性剤として作用し、ＯＤＮが組織に浸透するのを助ける。センスＯＤＮの塗布は片脚に行い、もう一方にはアンチセンスを塗布し、同腹仔間で左右交互にする。新生マウスはランプの下で温めた後、母親に返した。創傷は毎日検査し、治癒品質について評価した。手術の１日後、５日後および８日後に代表となる新生マウスを選択し、その前肢の写真を撮ってから、麻酔をかけ、２％パラホルムアルデヒドを振りかけた。前肢を取り外し、２％パラホルムアルデヒド中で一晩浸漬固定し、その後、樹脂（１日）またはワックス（その後２日間）組織学用に処理した。
【０１２４】
創傷の炎症は、切開の２４時間後に評価した。樹脂部分は創傷を通じて、損傷に反応する最初の細胞である、ｎｉｓｓｌ陽性細胞の好中球を示すためにトルイジンブルーで染色した。これらは好中球特異性マーカーを用いても示すことができる。
【０１２５】
細胞死およびクリアランスは、アポトーシス細胞のクリアランス速度を決定するために、Ｔｕｎｅｌ標識によって評価する。マクロファージ染色を用いて、次の細胞死が終了する期間を示した。これらは損傷の３〜５日後に実施した。
【０１２６】
血管形成
肉芽は治癒結合組織の特徴であり、多数の毛細血管の浸潤によって囲まれる。マクロファージは、ＶＥＧＦなどの強力な血管形成因子を発現することで知られている。血管新生の程度は、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体である、抗−ＰＣＡＭおよび抗−ｆｌｔ−１を用いて監視される。この組織の収縮は、創傷繊維芽細胞が収縮性筋線維芽細胞に分化することによって引き起こされる。創傷を引き合わせた後、アポトーシスによって死に、マクロファージによって除去される。これらの細胞は、平滑筋アクチン特異性抗体によって明らかにされ、次にその形成および除去が行われる。
【０１２７】
過神経支配
知覚神経は、損傷時に放出される信号に非常に敏感であり、成人の創傷部位では一過性発芽を示す。しかし新生創傷では、この発芽はさらにおびただしく、永久の過神経支配を生じる。これらの信号が何であるか明らかではないが、炎症性マクロファージから放出されると思われる。過神経支配は創傷７日後に極大であり、神経分布は神経フィラメントに対するＰＧＰ９．５抗体を用いて明らかになる。
【０１２８】
瘢痕は通常、創傷閉包の数週間または数ヵ月後に評価する。しかし、合理的な評価は損傷の１２日後に実施できる。創傷による切片をコラーゲン染色Ｐｉｃｒｏｓｉｒｕｓ Ｒｅｄを用いて染色し、共焦顕微鏡で調べて、創傷部位でのコラーゲン密度および配向を決定する。
【０１２９】
結果
１日
創傷の２４時間後、センスおよびアンチセンス処置肢で著しい相違が明らかであった。センス処理創傷は、未処理と違いがないように見え、正常な治癒グレードおよび速度のスペクトルが得られた（図１０）。アンチセンス処理肢は、対照とは著しく異なり、炎症が少ないように思われ、治癒速度が一般に速かった。
【０１３０】
ｎｉｓｓｌ染色した代表的な肢の樹脂切片によって、好中球細胞が著しく少ないことが明らかになり、このことは炎症組織が少ないことを示していた（図１１）。
【０１３１】
５日
創傷の数日後には、かさぶたが落ち始めた。この段階では、アンチセンス処理創傷の大半がセンス処理よりも小さく見え、かさぶたが小さいか、瘢痕がより目立たないかのどちらかであった（図１２）。
【０１３２】
８日
創傷の８日後、肢に体毛が生えた。センス処理創傷はまだ見えており、創傷部位周辺に体毛ｊがないために境界が定められていた。アンチセンス処理創傷はほとんど見えず、正常な体毛成長によって覆われていた。体毛成長におけるこのような相違は、アンチセンス処理創傷では瘢痕の発生が減少することを示している（図１３）。
【０１３３】
結論
コネキシン４３アンチセンスＯＤＮを創傷に塗布すると、治癒プロセスに著しい影響が見られる。最初の顕著な効果は、好中球のレベルによってはるかに低い炎症反応を示す部分にて顕著である創傷の炎症が減少することである。治癒が進むにつれ、アンチセンス処理創傷はより速く治癒し、対照障害よりも瘢痕が少ない。
【０１３４】
このような炎症反応の低下およびその後の治癒の改善はおそらく、好中球伝達の低下と自然治癒プロセスの高速化によるものである。アンチセンスＯＤＮは４〜８時間後にコネキシン発現を低下できるため、創傷の最初の信号伝達に対して影響をもたないが、第２の信号伝達イベントでは役割を果たす。創傷に反応して侵入する好中球は、通常大量のコネキシン４３を発現することに注目するのは興味深い。それらが創傷における他の細胞とギャップ結合を形成して、それを用いて伝達することも可能である。この形式の伝達が減少すると、好中球による分泌要素が減少し、創傷内の細胞死が減少することはもちろん、肉芽および過神経支配も減少することがある。通常の条件下で、コネキシンタンパク質レベル（コネキシン２６、３１．１および４３）は、創傷の上皮および皮下層の両方で６時間以内に減少し、最大６日間は低下したままであることも知られている。アンチセンス手法は、膜からタンパク質除去が行われている間に翻訳プロセスを阻止することによって、この初期のタンパク質減少を高速化できる。確かに、創傷直後のコネキシン４３ノックダウンの効果は、炎症レベルの低下および治癒速度の向上に著しい効果をもたらす。
【０１３５】
実験５
概要
火傷後の炎症および第２細胞死は、主な関心事である。身体の高い割合を占める重篤な火傷の犠牲者は、外傷後１または２日で死に至ることが多い。本実験は、本発明の調合物の火傷回復プロセスに有利な影響を及ぼす能力を調査する。
【０１３６】
物質
オリゴヌクレオチドは以下の配列を用いて調製した：
【０１３７】
【化１１】
【０１３８】
方法
再現性がよい火傷は湿った皮膚にもたらされ、アンチセンスＯＤＮを含むＰｌｕｒｏｎｉｃゲルは火傷に皮下注射した。一連の火傷は、６匹の新生マウスの頭蓋の左側と右側にはんだごてを用いて作成した。頭の片側の火傷はＰｌｕｒｏｎｉｃゲルに含まれるコネキシン４３−特異性ＯＤＮによって、反対側はＰｌｕｒｏｎｉｃゲルに含まれるセンス対照ＯＤＮによって処理した。
【０１３９】
結果
２４時間後、６匹すべてのコネキシン４３ＯＤＮ処置火傷は、対照火傷と比較して低レベルの炎症を示した。これらの相違は顕著であった（データは示さない）。
【０１４０】
有用性
そのため本発明により、細胞−細胞伝達が一時的で、部位特異的な方法でダウンレギュレート可能な調合物が与えられる。したがって、該調合物は治療方法における用途と化粧処置における用途がある。
【０１４１】
該調合物のＯＤＮ成分を長時間（２４時間以上）にわたって送達することは、ニューロン損傷の治療に特に遊離である。これは直接の物理的ニューロン損傷の多くの例において、ニューロン細胞損失が実際の損傷部位をはるかに越えて周囲の細胞に広がるためである。この第２のニューロン細胞損失は、元の損傷の２４時間以内に発生し、結合ギャップ細胞−細胞伝達によって伝達される。したがってコネキシンタンパク質発現のダウンレギュレーションは、細胞間の伝達を阻害または少なくともダウンレギュレートし、第２のニューロン細胞損失を最小限に抑える。
【０１４２】
同様に、他の組織損傷の例では（特に創傷）、本発明の調合物が、創傷治癒プロセスの促進、炎症の低減、および瘢痕形成の最小化のいずれにも有効であることがわかっている。したがって該調合物は、外部からの外傷（火傷を含む）または外科的介入のどちらであっても、創傷の治療において明らかに有利である。
【０１４３】
上の説明は例示目的のためのみに与えており、本発明の範囲を逸脱せずに採用した特異性ＯＤＮおよび製薬的に許容可能な担体またはビヒクルのどちらによっても、修正できることをさらに認識されたい。
【０１４４】
【表３】
【０１４５】
【表４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療目的および／または整形目的のためにコネキシンタンパク質の発現を部位特異的にダウンレギュレーションする方法であって、コネキシンタンパク質に対する少なくとも1つのアンチセンスポリヌクレオチドを含む配合物を、前記レギュレーションが必要とされる患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法。
【請求項２】
コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドの使用であって、治療目的または整形目的のために、前記コネキシンタンパク質の発現をダウンレギュレーションするための医薬品を製造する際の使用。
【請求項１】
治療目的および／または整形目的のためにコネキシンタンパク質の発現を部位特異的にダウンレギュレーションする方法であって、コネキシンタンパク質に対する少なくとも1つのアンチセンスポリヌクレオチドを含む配合物を、前記レギュレーションが必要とされる患者表面部位または患者体内部位に投与することを含む方法。
【請求項２】
コネキシンタンパク質に対する少なくとも１つのアンチセンスポリヌクレオチドの使用であって、治療目的または整形目的のために、前記コネキシンタンパク質の発現をダウンレギュレーションするための医薬品を製造する際の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１２−４１３４２（Ｐ２０１２−４１３４２Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１７９８３２（Ｐ２０１１−１７９８３２）
【出願日】平成２３年８月１９日（２０１１．８．１９）
【分割の表示】特願２０００−５９５７１１（Ｐ２０００−５９５７１１）の分割
【原出願日】平成１２年１月２７日（２０００．１．２７）
【出願人】（５０４３６４７５８）
【出願人】（５０４３６４７６９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７９８３２（Ｐ２０１１−１７９８３２）
【出願日】平成２３年８月１９日（２０１１．８．１９）
【分割の表示】特願２０００−５９５７１１（Ｐ２０００−５９５７１１）の分割
【原出願日】平成１２年１月２７日（２０００．１．２７）
【出願人】（５０４３６４７５８）
【出願人】（５０４３６４７６９）
【Ｆターム（参考）】
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