本発明は、再生可能な生物学的供給原料からコハク酸及び／又は他の産物を効率的に生産するための生物触媒に関する。その生物触媒は、遺伝的操作及び代謝進化の両者の結果として、糖質供給原料からの、成長とカップリングしたコハク酸及び／又は他の産物の生産について非常に高い効率を有する。さらに具体的には、本発明のある種の生物触媒は、外因性遺伝物質の添加なしに、ｐＨコントロールされた単純なバッチ発酵の間に無機塩培地において高い力価及び収量でコハク酸を生産する。本発明の遺伝的操作は、コハク酸生産経路以外の代替ＮＡＤＨ酸化経路の排除とカップリングしたエネルギー保存戦略に関する。その生物触媒は、遺伝的改変によって抑制解除されたグルコース抑制型糖新生性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）及び遺伝的に不活性化されたホスホトランスフェラーゼ系を有する。コハク酸生産の効率の点から見て、本発明の生物触媒は、Actinobacillus succinogens及びMannheimia succiniproducensなどのコハク酸生産ルーメン細菌と機能的に等価であるが、ルーメン細菌によるコハク酸生産のために肥沃な培地が必要なこととは対照的に、その生物触媒は、糖質を有する最少塩培地中でこの高レベルのコハク酸生産を達成可能であるという一つの違いがある。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
増加したレベルのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）遺伝子転写物を含む細菌細胞であって、該転写物が活性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）をコードし、該細胞が増加したＰＣＫ活性を示す、細菌細胞。
【請求項２】
非反芻動物性細菌細胞である、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項３】
細菌が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・アサイ（Gluconobacter asaii）、アクロモバクター・デルマーベ（Achromobacter delmarvae）、アクロモバクター・ビスコーサス（Achromobacter viscosus）、アクロモバクター・ラクティカム（Achromobacter lacticum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アルカリゲネス・フェーカリス（Alcaligenes faecalis）、アルスロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アルスロバクター・ツメッセンス（Arthrobacter tumescens）、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アルスロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxydans）、オーレオバクテリウム・サペルダエ（Aureobacterium saperdae）、アゾトバクター・インディカス（Azotobacter indicus）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ディバリカタム（divaricatum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・グロボサム（Brevibacterium globosum）、ブレビバクテリウム・フスカム（Brevibacterium fuscum）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・ヘルコルム（Brevibacterium helcolum）、ブレビバクテリウム・プシルム（Brevibacterium pusillum）、ブレビバクテリウム・テスタセウム（Brevibacterium testaceum）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）、ブレビバクテリウム・インマリオフィリウム（Brevibacterium immariophilium）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ（Brevibacterium protopharmiae）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（Corynebacterium acetophilum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カルトボーラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・クリザンセミ（Erwinia chrysanthemi）、フラボバクテリウム・ペレグリナム（Flavobacterium peregrinum）、フラボバクテリウム・フカタム（Flavobacterium fucatum）、フラボバクテリウム・アウランティナム（Flavobacterium aurantinum）、フラボバクテリウム・レナヌム（Flavobacterium rhenanum）、フラボバクテリウム・セワネンセ（Flavobacterium sewanense）、フラボバクテリウム・ブレベ（Flavobacterium breve）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Flavobacterium meningosepticum）、ミクロコッカス（Micrococcus）種ＣＣＭ８２５、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）、ノカルディア・オパカ（Nocardia opaca）、ノカルディア・ルゴーサ（Nocardia rugosa）、プラノコッカス・ユーシナタス（Planococcus eucinatus）、プロテウス・レットゲリ（Proteus rettgeri）、プロピオニバクテリウム・シャーマニ（Propionibacterium shermanii）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovolans）、シュードモナス・ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）、シュードモナス・テルトステロニ（Pseudomonas testosteroni）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）、ロドコッカス（Rhodococcus）種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス（Rhodococcus）種ＡＴＣＣ１９０７０、スポロサルシナ・ウレア（Sporosarcina ureae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ビブリオ・メッシュニコビ（Vibrio metschnikovii）、ビブリオ・チロゲネス（Vibrio tyrogenes）、アクチノマドゥラ・マドゥラ（Actinomadura madurae）、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス（Actinomyces violaceochromogenes）、キタサトスポリア・パルロサ（Kitasatosporia parulosa）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・フラベラス（Streptomyces flavelus）、ストレプトマイセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリバセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・バージニエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス・アンチビオティカス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・カカオイ（Streptomyces cacaoi）、ストレプトマイセス・ラベンデュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、アエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・チアミノリティカス（Bacillus thiaminolyticus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリキファシエンス（Bacillus amyloliquifaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、エシェリキア・フロインディ（Escherichia freundii）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、サルモネア・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・ショットムレリ（Salmonella schottmulleri）、またはキサントモナス・シトリ（Xanthomonas citri）である、請求項１記載の細菌株。
【請求項４】
前記増加したレベルのｐｃｋ転写物が、ｐｃｋ遺伝子のネイティブな調節配列から、ｐｃｋの転写を増加させる変更された調節配列への置換に起因する、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項５】
前記調節配列が、前記ｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域中にある、請求項４記載の細菌細胞。
【請求項６】
前記増加したレベルの前記ｐｃｋ転写物が、ｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域中の１または複数の突然変異に起因する、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項７】
前記１または複数の突然変異が、ｐｃｋ遺伝子開始コドン上流の６８位でのヌクレオチドＡからヌクレオチドＧへの置換を含む点突然変異である、請求項６記載の細菌細胞。
【請求項８】
増加したレベルの前記ｐｃｋ転写物が、ネイティブなプロモーター配列から外因性プロモーター配列への置換に起因する、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項９】
外因性プロモーターが、構成性プロモーターである、請求項８記載の細菌細胞。
【請求項１０】
外因性プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項８記載の細菌細胞。
【請求項１１】
誘導性プロモーターが、ｌａｃプロモーターである、請求項８記載の細菌細胞。
【請求項１２】
ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊する１または複数の遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項１３】
前記遺伝的改変が、ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の構造成分をコードする１または複数の遺伝子中にある、請求項１２記載の細菌細胞。
【請求項１４】
前記遺伝的改変が、ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の発現をレギュレーションするタンパク質をコードする１または複数の遺伝子中にある、請求項１２記載の細菌細胞。
【請求項１５】
前記遺伝的改変が、ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒおよびｃｒｐから成る群より選択される１または複数の遺伝子中にある、請求項１２記載の細菌細胞。
【請求項１６】
（ａ）ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊する１または複数の遺伝的改変；および（ｂ）糖輸送体をコードする１または複数の遺伝子の発現をアップレギュレーションする１または複数の遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項１７】
前記糖輸送体が、ＡＴＰ結合カセット輸送体のメンバーである、請求項１６記載の細菌細胞。
【請求項１８】
前記糖輸送体が、ＭＦＳ（major facilitator super family）のメンバーである、請求項１６記載の細菌細胞。
【請求項１９】
発酵経路に関与する１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２０】
ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＡ、ａｃｋ、ｐｔａ、ｐｄｈ、ｍｇｓＡ、ｔｄｃＤ、ｔｄｃＥおよびｐｏｘＢから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２１】
（ａ）ＰＥＰ依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を破壊する１または複数の遺伝的改変；および（ｂ）発酵経路に関与する１または複数の遺伝子における突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２２】
（ａ）ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒおよびｃｒｐから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変；ならびに（ｂ）ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＡ、ａｃｋ、ｐｔａ、ｐｄｈ、ｍｇｓＡ、ｔｄｃＤ、ｔｄｃＥおよびｐｏｘＢから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２３】
ＴＣＡ回路の作動に関連する１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２４】
ｍｄｈ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ａｃｃｅＡＢ、ａｃｎＡＢ、ｉｃｄ、ｉｃｌＲ、ａｓｐＣ、およびｓｃｆＡから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２５】
（ａ）ｐｔｓＧ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒおよびｃｒｐから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変；（ｂ）ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＡ、ａｃｋ、ｐｔａ、ｐｄｈ、ｍｇｓＡ、ｔｄｃＤ、ｔｄｃＥおよびｐｏｘＢから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝子発現の不活性化へと導く遺伝的改変；ならびに（ｃ）ｍｄｈ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ａｃｃｅＡＢ、ａｃｎＡＢ、ｉｃｄ、ｉｃｌＲ、ａｓｐＣ、およびｓｃｆＡから成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項２６】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ＮＡＤＨ依存性リンゴ酸酵素およびＮＡＤＰＨ依存性リンゴ酸酵素から成る群より選択される１または複数の遺伝子における遺伝的改変をさらに含む、請求項１記載の細菌株。
【請求項２７】
外因性ピルビン酸カルボキシラーゼをさらに含む、請求項１記載の細菌株。
【請求項２８】
ピルビン酸カルボキシラーゼが、ラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis）またはソルガム・ブルガレ（Sorghum vulgare）またはリゾピウム・エトリ（Rhizopium etli）由来である、請求項２７記載の細菌株。
【請求項２９】
ＸＺ３２０、ＸＺ３３２、ＸＺ３４３１、ＸＺ４６８、ＸＺ４６９、ＸＺ４７０、ＸＺ６１３、ＸＺ６１５、ＸＺ６１６、ＸＺ６１８、ＸＺ６２０、ＸＺ６４７、ＸＺ７１２１、またはＸＺ７２３である、遺伝的に改変された細菌細胞。
【請求項３０】
（ａ）不活性化されたｌｄｈＡ；（ｂ）不活性化されたｆｏｃＡ；（ｃ）不活性化されたｐｆｌＢ；（ｄ）不活性化されたａｃｋＡ；（ｅ）不活性化されたｍｇｓＡ；（ｆ）不活性化されたａｄｈＥ；（ｇ）不活性化されたｔｄｃＤ；（ｈ）不活性化されたｔｄｃＥ；（ｉ）不活性化されたａｓｐＣ；（ｊ）不活性化されたｓｆｃＡ；（ｋ）不活性化されたｐｔｓＨ；（ｌ）不活性化されたｃｉｔＤおよび（ｍ）アップレギュレーションされたｐｃｋを含むエシェリキア・コリ（Escherichia coli）細菌株。
【請求項３１】
前記細菌株が、２％〜２０％(w/v)のグルコースを含む最小塩培地中でグルコース１molあたり少なくとも０．１molのコハク酸を生産する、請求項２９または３０記載の細菌細胞。
【請求項３２】
（ａ）請求項１記載の細菌株を培養すること；
（ｂ）炭素源を提供すること；
（ｃ）該細菌に該炭素源を代謝させること；および
（ｄ）コハク酸を単離すること
を含む、コハク酸を生産する方法。
【請求項３３】
前記細菌株が、嫌気性条件、好気性条件、微好気性条件またはその組み合わせで培養される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌株が、最少塩成長培地中で培養される、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記最少塩成長培地が、２％〜２０％(w/v)の炭素源を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記炭素源が、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース（arbinose）、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロース、グリセロールまたはその組み合わせである、請求項３２記載の方法。
【請求項３７】
前記培養が、バッチプロセスまたは流加プロセスである、請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
前記培養が、連続プロセスである、請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
ｇｌｄＡ遺伝子における突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４０】
ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４１】
（ａ）ｇｌｄＡにおける突然変異；および（ｂ）ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４２】
（ａ）ｇｌｄＡにおける突然変異；（ｂ）ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異；および（ｃ）ホスホトランスフェラーゼ系におけるタンパク質をコードする１または複数の遺伝子における突然変異をさらに含む。請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４３】
（ａ）ｇｌｄＡにおける突然変異；（ｂ）ｄｈａＫＬＭオペロンにおける突然変異；（ｃ）ホスホトランスフェラーゼ系におけるタンパク質をコードする１または複数の遺伝子における突然変異；および（ｄ）発酵経路に関与するタンパク質をコードする１または複数の遺伝子における突然変異をさらに含む、請求項１記載の細菌細胞。
【請求項４４】
前記ｐｃｋ転写物が内因性ｐｃｋ転写物である、請求項１〜３０または３９〜４３のいずれか一項記載の細菌細胞。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図４Ｆ】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【公表番号】特表２０１２−５２２５１５（Ｐ２０１２−５２２５１５Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３７３２（Ｐ２０１２−５０３７３２）
【出願日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２９７２８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５０６７
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５０７３７１１６８）ユニバーシティ　オブ　フロリダ　リサーチ　ファンデーション　インコーポレーティッド (38)
【Ｆターム（参考）】