コラーゲンゲル収縮剤
【課題】コラーゲンゲル収縮剤を提供する。
【解決手段】コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリンを有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
【解決手段】コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリンを有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンゲル収縮剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、真皮組織モデルとして、コラーゲンゲルが、薬剤評価に利用されている。前記コラーゲンゲルは、コラーゲン液に線維芽細胞を懸濁し、前記線維芽細胞の培養条件下でゲル化させたものである。前記線維芽細胞は、前記コラーゲンゲル内で三次元的に培養され、その形状は、単層培養と異なり、生体内と類似の二極化した紡錘状となる。また、前記コラーゲンは、ゲル化によりコラーゲン繊維が再配列し、真皮組織に似た構造となる。前記コラーゲンゲルは、ｉｎ ｖｉｖｏ試験との相関性が高く、また、再現性が高いことから、細胞毒性試験、ｉｎ ｖｉｔｒｏ眼刺激性試験に用いられ、近年は、皮膚の弾力性、たるみ、ハリ、しわ改善評価モデル（例えば、特許文献１）や、創傷治癒促進（例えば、特許文献２）または創収縮の評価モデル（例えば、特許文献３）としても、用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１７６２０８号公報
【特許文献２】特開２００１−０６４１９６号公報
【特許文献３】特開２００４−３５５２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる、コラーゲンゲル収縮剤を提供する。創傷治癒促進や収縮の評価モデルなどに利用可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
リンゴ抽出物に着目して、試験した結果コラーゲン収縮能があることを知見し、さらにコラーゲントリペプチド及びシリマリンとの併用によってコラーゲン収縮を増強できることを見出して、本発明に至った。
１．コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリンを有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
２．リンゴ抽出物がリンゴ由来のポリフェノールであり、コラーゲントリペプチドの平均分子量が４００以下のものを含有するコラーゲントリペプチドであることを特徴とする１．記載のコラーゲンゲル収縮剤。
３．シリマリンがマリアアザミ抽出物であることを特徴とする１．又は２．記載のコラーゲンゲル収縮剤。
４．１．〜３．のいずれかに記載されたコラーゲン収縮剤を含む飲食品。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のコラーゲンゲル収縮剤は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させることができる。リンゴポリフェノール、コラーゲントリペプチド及びシリマリンの３成分を併用することにより、コラーゲンゲルを収縮する機能が顕著に向上することが認められた。この３成分併用剤は、それぞれ単独あるいは２成分の組み合わせに比較して、コラーゲンゲルを収縮する機能が顕著である。コラーゲンゲル収縮能の試験系は、線維芽細胞とコラーゲンの相互作用によりゲルが収縮し真皮構造に類似のコラーゲンゲル構造になる。コラーゲンゲル収縮効果により、肌のはりや弾力改善効果が期待でき、皮膚状態が改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】リンゴ抽出物単独添加のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ
【図２】シリマリン単独添加のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ
【図３】コラーゲントリペプチド単独添加のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ
【図４】３成分のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図５】コラーゲントリペプチドとシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図６】リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチド併用によるコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図７】リンゴ抽出物とシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図８】シリマリン、リンゴ、コラーゲントリペプチド３者の組合せによるコラーゲンゲル収縮能状態図
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明者は、先にリンゴ抽出物に、コラーゲンゲル収縮作用があることを知見し、リンゴ抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤に関する特許出願（特願２００９−８３８１８号）を行った。本発明者は、さらに、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドを併用することにより、コラーゲンゲル収縮作用が増強されることを見出し特許出願（特願2009-180406号）した。
本発明は、更にシリマリンを併用した３成分において、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる、コラーゲンゲル収縮剤である。それぞれ単独のコラーゲン収縮作用、あるいは、２成分の組み合わせに比較して、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリン３成分併用剤は、格段に優れたコラーゲン収縮作用を示す。
本発明のコラーゲンゲル収縮剤は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる。コラーゲンゲルの収縮とは、例えば、ゲルの大きさが小さくなることをいう。コラーゲンゲルの大きさの指標としては、特に制限されないが、例えば、コラーゲンゲルの直径、表面積、体積などが挙げられる。
【０００９】
＜コラーゲンゲル＞
本発明において、コラーゲンゲルは、収縮可能な形状であれば良く、ゲル状以外に、例えば、固形状であっても良い。
コラーゲンゲルに含まれるコラーゲンの種類は、特に制限されず、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型コラーゲンなどが挙げられ、好ましくは、Ｉ型コラーゲンである。また、コラーゲンは、例えば、コラーゲンを加工処理したものであっても良い。加工処理としては、特に制限されないが、例えば、熱処理、酵素処理などが挙げられる。熱処理したコラーゲンとしては、例えば、ゼラチンなどが挙げられ、酵素処理したコラーゲンとしては、例えば、アテロコラーゲン、コラーゲンペプチドなどが挙げられる。コラーゲンゲル中の前記コラーゲン濃度は、特に制限されず、例えば、形状などに応じて、適宜設定可能である。
コラーゲンゲルにおいて、線維芽細胞の由来組織は、特に制限されず、例えば、皮膚、肺、心臓などが挙げられ、好ましくは、皮膚である。線維芽細胞の由来種は、特に制限されず、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどがあげられ、好ましくは、ヒトである。コラーゲンゲル中の線維芽細胞の細胞密度は、特に制限されず、適宜設定可能である。
コラーゲンゲルは、例えば、コラーゲンおよび線維芽細胞以外のその他成分を含んでも良い。その他成分としては、特に制限されず、例えば、培養液、血清などが挙げられる。
【００１０】
＜リンゴ抽出物＞
リンゴ抽出物が、リンゴ果実の抽出物であるのが好ましい。特に、リンゴ幼果抽出物に含まれるポリフェノールを主成分とすることが好ましい。
リンゴ抽出物には、ポリフェノール、有機酸、アミノ酸などを含むことが知られている。
リンゴ抽出物は、血管機能改善作用を高めることが可能なBNP調節剤として抽出物を有効成分として含有してなるBNP調節剤、血行促進剤（特開２００７−００８８３７号公報、特開２００６−２６５２２０号公報）や飲料（特開２００４−３０５０８７号公報）、化粧料配合剤（特開２００１−１８７７２４号公報）、消臭剤成分（特開平１１−３１９０５１号公報）、香料成分（特開平０８−０２３９３９号公報）などに用いられることが知られている。
しかしながら、リンゴ抽出物およびリンゴ由来のポリフェノールについて、コラーゲンゲル収縮効果は、未だ報告されていない。
【００１１】
リンゴ抽出物において、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）の品種は、例えば、ふじ、国光、王林、紅玉、ジョナゴールド、デリシャス、さんさ、千秋などが挙げられ、特に制限されない。リンゴの抽出部位は、特に制限されず、例えば、果実、葉、幹、花などが挙げられ、好ましくは、果実である。前記果実は、例えば、未熟果（幼果）でも良く、完熟果でも良く、特に制限されない。抽出に用いる前記果実の部位は、特に制限されず、例えば、全果、果肉、果皮、種などが挙げられる。リンゴ抽出物は、これらの部位を、単独で、または２種以上組み合わせて抽出しても良い。
【００１２】
リンゴ抽出物を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。抽出方法の具体例としては、例えば、以下のようであっても良い。まず、リンゴの全果を、水洗後、グラインダーなどにより粉砕する。この粉砕物を、ペクチナーゼ処理に供し、遠心分離後、抽出溶媒により分配ろ過して、リンゴ抽出物を調製しても良い。前記ペクチナーゼ処理としては、特に制限されないが、例えば、20〜60℃の温度条件化で、ペクチナーゼを10〜50ppm添加して行っても良い。抽出溶媒としては、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒が挙げられる。
【００１３】
リンゴ抽出物は、例えば、市販のリンゴ抽出物を用いても良く、リンゴ果実から抽出して調製しても良く、特に制限されない。
コラーゲンゲル収縮剤中に含まれるリンゴ抽出物含量は、特に制限されないが、例えば、0.001〜99重量％、好ましくは、0.001〜５重量％である。コラーゲンやゼラチンとの併用によって、コラーゲンゲル収縮能が飛躍的に向上するので、0.01重量％以下で十分である。コラーゲンゲル収縮剤は、リンゴ由来のポリフェノールを含むリンゴ抽出物が好ましい。
【００１４】
ポリフェノールの分画方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。ポリフェノールは、例えば、リンゴ抽出物をカラムに通液後、カラムの吸着物を溶出し、この溶出画分を減圧留去濃縮して分画しても良い。また、さらに、この濃縮液に粉末助剤を添加し、凍結乾燥または噴霧乾燥して、ポリフェノール粉末を調製しても良い。
ポリフェノールは、例えば、市販のリンゴ由来のポリフェノール含有物を用いても良く、リンゴ果実から抽出および分画して調製しても良く、特に制限されない。本発明のコラーゲンゲル収縮剤中に含まれる前記ポリフェノール含量は、特に制限されないが、例えば、0.01〜99重量％、好ましくは、0.1〜５０重量％である。
【００１５】
＜コラーゲントリペプチド＞
リンゴ抽出物を併用するコラーゲントリペプチドは、平均分子量が400以下のものを含有するトリペプチドであり、通常一般のコラーゲンと称するものとは区別されるものである。さらに詳しくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。 本発明のコラーゲントリペプチドは、豚などの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。
本発明のコラーゲントリペプチドは、主にコラーゲンを加水分解して製造することができる。コラーゲン加水分解物は、既に市販されているが、これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が二千から八万である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものである。
これに対して本発明のコラーゲン加水分解物は、特定の有効成分として分子量で
約400以下のペプタイドを含むことを特徴とする。
添加量は、0.01重量％以上が好ましい。本試験系の試験ではコラーゲンゲルの収縮は80％程度が上限と想定されるので、コラーゲンゲルの収縮が70％程度以上は、添加濃度を増やしても増加効果は小さい。したがって、マイナスとなることは無いと言う意味では、上限は無いが、実質的には1.0重量％程度が上限となる。
【００１６】
＜シリマリン＞
シリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．６５６６６−０７−１）は、キク科マリアアザミ（学名シリバム・マリアナムＳｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ Ｇａｅｒｔｎ、別名オオアザミ、オオヒレアザミ、ミルクアザミ；ＣＡＳ Ｎｏ．８４６０４−２０−６）から抽出されるフラボノリグナンの総称であり、分子式Ｃ２５Ｈ２２Ｏ１０で表される、シリビン（Ｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２２８８８−７０−６）、シリジアニン（Ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２９７８２−６８−１）、シリクリスチン（Ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．３３８８９−６９−９）、イソシリビン（Ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．７２５８１−７１−６）などを含有している組成物である（天然薬物事典、奥田拓男編、廣川書店、昭和６１年３月３日 発行）。
本発明においては、シリマリンを含む植物体から抽出した抽出物に含有されるこれらのフラボノリグナンを含有している組成物を従来技術と同様、シリマリンと呼ぶ。例えば、シリマリンを含む植物体から抽出した抽出物としては、マリアアザミ抽出物がある。
またシリマリンは前記の通りフラボノリグナンの混合物であり、シリマリンとしての植物抽出物や植物中の含有量は、分光光度計による測定に基づいた方法（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｎ．Ｆｏｒｓｃｈ，１８，６９６，１９６８．）、薄層クロマトグラフィーによる方法（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｎ．Ｆｏｒｓｃｈ，２４，４６６，１９７４．）、高速液体クロマトグラフィーによる方法（Ｔｉｔｔｅｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１３５，４９９，１９７７．、Ｔｉｔｔｅｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１５３，２２７，１９７８．、Ｑｕｅｒｃｉａ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ Ａ．（Ｅｄ）．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８３，ｐ１．）により測定可能である。これらの測定法の中でも、分光光度計による測定に基づいた方法の一つである２,４−ジニトロヒドラジン分析は、ドイツ薬局方（Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍの果実に関するモノグラフ）に報告されており、広く用いられている。
また、シリマリン又はその構成成分であるシリビン、シリジアニン、シリクリスチン、イソシリビンをリン脂質複合体として配合することができる。リン脂質複合体はＩＮＤＥＮＡ社が市販しているＳＩＬＹＭＡＲＩＮ ＰＨＹＴＯＳＯＭＥ（シリマリンのリン脂質複合体）、ＳＩＬＩＰＨＯＳ（シリビンのリン脂質複合体）を使用することができる。
例えば、ＩＮＤＥＮＡ社製シリマリンは、ドイツ薬局方DABに収載された吸光度比法でシリビン換算で測定したシリビン、イソシリビン、シリクリスチン、シリジアニン含量が約６５％以上、そのうちＨＰＬＣ法で測定したシリビンとイソシリビンの合計は約３０％以上である。ＳＩＧＭＡ社製のシリビンは、ＳＩＬＩＢＩＮＩＮ（Ｓｉｌｙｂｉｎ：２，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−３−[４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ]−２−[ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ]−６−[３，５，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｏｘｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−２−ｙｌ]ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎで、ＨＰＬＣ法で測定したシリビン含量が約９８．０質量％である。ＩＮＤＥＮＡ社製のリン脂質複合体ＳＩＬＹＭＡＲＩＮ ＰＨＹＴＯＳＯＭＥは、シリマリン３０％（うちＨＰＬＣ法で測定したシリビンを約９％含有）、大豆リン脂質７０％のリン脂質複合体である。ＩＮＤＥＮＡ社製のリン脂質複合体ＳＩＬＩＰＨＯＳは、シリビン濃縮エキス３０％（うちＨＰＬＣ法で測定したシリビンを約２５％含有）、大豆リン脂質７０％のリン脂質複合体である。
本発明に配合するシリマリン又はその構成成分であるシリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンの濃度は０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がさらに好ましい。０．０１重量％未満では、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、エラスチン産生促進作用が十分に発揮されない。濃度は高いほど好ましいが、２．０重量％以上では完全に溶解しにくい傾向がある。
【００１７】
以下に、３成分について、コラーゲン収縮作用に関して、それぞれ単独、２成分系及び３成分系の試験を行い実証する。
〔試験に用いる材料〕
［材料］
（１）アテロコラーゲン（商品名：AteloCell、アテロコラーゲン（牛真皮由来）５mg/ml（２）ＤＭＥＭ（粉末）（商品名：ダルベッコ変法イーグル培地(2)、日水）
（３）ＤＭＥＭ（液体）（商品名；Ｇｉｂｃｏ）
［評価検体］
（１）リンゴ抽出物（リンゴポリフェノール） 商品名：ポマクティブHFV（ユニテックフーズ社製）
規格；全ポリフェノール量９０％以上（ＵＶ法）
（２）コラーゲントリペプチド 商品名：HACP-01（HTCコラーゲン、ゼライス社製）
規格；トリペプチド１５％以上
（３）シリマリン 商品名：シリマリンＥＴ／Ｇ（Ｉｎｄｅｎａ Ｓ．ｐ．Ａ．社製）
規格；シリビン・イソシリビン合計３０％以上（ＨＰＬＣ法）、シリマリン含量６５％以上（ＤＡＢ１０［ドイツ薬物規格第１０項］による）
【００１８】
［試験方法］
予め継代培養した皮膚線維芽細胞（新生児由来）を細胞懸濁液（６×１０５cells/ml 溶媒１０％FBS含有DMEM）として調整した。氷冷中でアテロコラーゲン（5mg/ml）４ml、3倍濃度DMEM２ml、FBS（牛血清）０．６７ml、10%FBS含有DMEM ３．３４ml及び細胞懸濁液２mlを混合し、平底１２ウェルプレートに１ｍｌずつ添加した。３７℃５％CO2インキューベーターで培養し、５時間後にアテロコラーゲンが再線維化することでゲル化することを認めた。添加から６時間後に滅菌したスパチュラの柄を用いてゲルをウェルプレートから剥がした後、各評価検体を任意の濃度に調整した１０％FBS含有DMEM溶液１ｍｌを添加して、再び３７℃５％CO2インキューベーターで７日間培養した。培養液は１日おきに評価薬剤を任意の濃度に溶解させた10%FBS含有DMEM溶液１ｍｌを培地交換した。培養終了後、培養液を完全に除去しPBSで洗浄後、１０％中性ホルマリン溶液（Wako）で２４時間浸潤しゲルを固定した。その後、１％（ｗ／ｖ）Triton−X溶液に置換して、ゲル直径の計測を行った。
【００１９】
［ゲル直径の計測およびゲル面積の算出］
ゲルの形状はウェルプレートと同様に真円状になることを利用してゲル面積を算出した。
上記処理方法によって調整したゲルを２方向について直径を計測し、２直線の平均値を算出した。そのゲル直径の平均値からゲル半径が算出され、ゲル面積は次の式で算出することができる。
ゲル面積＝（ゲル半径 cm）×（ゲル半径 cm）×円周率
【００２０】
薬剤未処理のコラーゲンゲルのゲル面積に対する薬剤処理時のコラーゲンゲルのゲル面積の面積比からコラーゲンゲル収縮率（％）を算出した。
コラーゲンゲル収縮率（％）＝１００×{（薬剤未処理のゲル面積）−（薬剤処理時のゲル面積）}／（薬剤未処理のゲル面積）
一つのデータについてn=3ウェルで評価し、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）でグラフ表記した。
【００２１】
[リンゴ抽出物単独試験]
表１及び図１に、リンゴ抽出物（ポマクティブHFV）単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。ポマクティブＨＦＶは数mｇ／ｍｌから数十mｇ／ｍｌの濃度域で濃度依存的にコラーゲンゲル収縮能が認められた（図１）。
【００２２】
【表１】
【００２３】
[シリマリン単独添加試験]
表２及び図２に、シリマリン（シリマリンＥＴ／Ｇ）単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。シリマリンＥＴ／Ｇは数mｇ／ｍｌから数十mｇ／ｍｌの濃度域で濃度依存的にコラーゲンゲル収縮能が認められた（図２）。
【００２４】
【表２】
【００２５】
[コラーゲントリペプチド単独試験]
表３及び図３に、コラーゲントリペプチド（ＨＡＣＰ−０１）単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。 ＨＡＣＰ−０１は数百mｇ／ｍｌから数千mｇ／ｍｌの濃度域で濃度依存的にコラーゲンゲル収縮能が認められた（図３）。
【００２６】
【表３】
【００２７】
[３成分のコラーゲンゲル収縮能試験]
表４及び図４に、３成分を配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
【００２８】
【表４】
【００２９】
＜考察＞
（１）想定総和効果について
表１、２、３に示されたそれぞれの検体を単独添加した時の結果、
ポマクティブＨＦＶ １mｇ／ｍｌで収縮率１６．０％
シリマリンＥＴ／Ｇ ５mｇ／ｍｌで収縮率２２．６％
ＨＡＣＰ−０１ ３０mｇ／ｍｌで収縮率０％、
３００mｇ／ｍｌで収縮率１８．１％
から、３者の理論値としてのゲル収縮率の総和（表４、図４参照）は、
例えば
理論値１：
ポマクティブＨＦＶ：シリマリンＥＴ／Ｇ：ＨＡＣＰ−０１＝１mｇ／ｍｌ：５mｇ／ｍｌ：３０mｇ／ｍｌで １６．０％＋２２．６％＋０％＝３８．６％ 、
理論値２：
ポマクティブＨＦＶ：シリマリンＥＴ／Ｇ：ＨＡＣＰ−０１＝１mｇ／ｍｌ：５mｇ／ｍｌ：３００mｇ／ｍｌで １６．０％＋２２．６％＋１８．１％＝５６．７％、
等となる。
【００３０】
（２）３者併用時のコラーゲンゲル収縮能についてシリマリンＥＴ／Ｇ、ポマクティブＨＦＶ、ＨＡＣＰ−０１の３者添加時の評価（表４、図４参照）
（ａ） 試験群１における収縮率の理論値は３８．６％であるのに対し、実験値では５７．５±２．３％であり、実験値５７．５％＞理論値３８．６％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｂ）試験群２における収縮率の理論値は５６．７％であるのに対し、実験値では７０．７±２．４％であり、実験値７０．７％＞理論値３８．６％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｃ）試験群３における収縮率の理論値は７２．９％であるのに対し、実験値では８０．８±２．２％であり、実験値８０．８％＞理論値７２．９％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｄ）試験群４における収縮率の理論値は３８．６％であるのに対し、実験値では５６．６±６．７％であり、実験値５６．６％＞理論値３８．６％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｅ）試験群５における収縮率の理論値は５３．７％であるのに対し、実験値では６５．５±５．９％であり、実験値５６．６％＞理論値５３．７％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
したがって、図４試験群１から試験群５の任意の濃度添加条件のいずれにおいても、リンゴ抽出物、シリマリン、コラーゲントリペプチド３者間の相乗効果が認められる。
【００３１】
[コラーゲントリペプチドとシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験]
表５及び図５に、コラーゲントリペプチド（ＨＡＣＰ−０１）とシリマリン（シリマリンＥＴ／Ｇ）併用配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
（ａ）配合１では、シリマリンＥＴ／Ｇ単独添加５mｇ／ｍｌで２２．６±５．４％ゲル収縮した。
（ｂ）配合２における収縮率の理論値は２２．６％であるのに対し、実験値では２７．４±４．８％であり、実験値２７．４％＞理論値２２．６％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
（ｃ）配合３における収縮率の理論値は２２．６％であるのに対し、実験値では３９．１±４．９％であり、実験値３９．１％＞理論値２２．６％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｄ）配合４における収縮率の理論値は４０．７％であるのに対し、実験値では４１．２±３１．７％であり、実験値４１．２％＞理論値４０．７％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
したがって、図５の配合２から配合４において相乗効果は認められたが、配合２および配合４における相乗効果はごく僅かなものであり、シリマリンとコラーゲントリペプチド２者間の相乗効果はごく僅かもしくは無いと考えられる。
【００３２】
【表５】
【００３３】
[リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチド併用によるコラーゲンゲル収縮能試験]
表６及び図６に、リンゴ抽出物（ポマクティブHFV）とコラーゲントリペプチド（ＨＡＣＰ−０１）併用配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
（ａ）配合１では、ポマクティブHFV単独添加１mｇ／ｍｌで１６．０±９．４％ゲル収縮した。
（ｂ）配合２における収縮率の理論値は１６．０％であるのに対し、実験値では１８．０±３．６％であり、実験値１８．０％＞理論値１６．０％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
（ｃ）配合３における収縮率の理論値は１６．０％であるのに対し、実験値では３４．５±３．９％であり、実験値３４．５％＞理論値１６．０％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｄ）配合４における収縮率の理論値は３４．１％であるのに対し、実験値では３６．５±８．０％であり、実験値３６．５％＞理論値３４．１％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
したがって、図６の配合２から配合４において相乗効果が認められたが、配合２および配合４における相乗効果はごく僅かなものであり、シリマリンとコラーゲントリペプチド２者間の相乗効果はごく僅かもしくは無いと考えられる。
【００３４】
【表６】
【００３５】
[リンゴ抽出物とシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験]
表７及び図７に、リンゴ抽出物（ポマクティブHFV）とシリマリン（シリマリンＥＴ／Ｇ）併用配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
（ａ）配合１における収縮率の理論値は５３．７％であるのに対し、実験値では４５．１±１１．５％であり、実験値４５．１％＜理論値５３．７％となり、２者間での相乗効果が無かった。
（ｂ）配合２における収縮率の理論値は５７．５％であるのに対し、実験値では４６．２±５．３％であり、実験値４６．２％＜理論値５７．５％となり、２者間での相乗効果が無かった。
（ｃ）配合３における収縮率の理論値は５３．７％であるのに対し、実験値では３４．９±１２．０％であり、実験値３４．９％＜理論値５３．７％となり、２者間の相乗効果が無かった。
したがって、図７の配合１から配合３において、いずれも理論値を上回るゲル収縮能を発揮しなかった事から、リンゴ抽出物とシリマリンとの間に相乗効果は無いと結論付けた。
【００３６】
【表７】
【００３７】
[試験結果の総合考察]
（ａ）リンゴ抽出物、シリマリン、コラーゲントリペプチドの３者併用により、著しくゲル収縮能が高まった。
（ｂ）リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドの２者併用により相乗的にゲル収縮能が高まったが、その相乗効果は僅かであるか、もしくは、特定の濃度の組合せに限定された。
（ｃ）シリマリンとコラーゲントリペプチドの２者併用により相乗的にゲル収縮能が高まったが、その相乗効果は僅かであるか、もしくは、特定の濃度の組合せに限定された。
（ｄ）リンゴ抽出物とシリマリンの２者併用により相乗的なゲル収縮能は見出せなかった。
という結果になり、リンゴ抽出物、シリマリン、コラーゲントリペプチドの３者の組合せがそれぞれ２者の組合せよりも優れたコラーゲンゲル収縮能を発揮する事が明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲンゲル収縮剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、真皮組織モデルとして、コラーゲンゲルが、薬剤評価に利用されている。前記コラーゲンゲルは、コラーゲン液に線維芽細胞を懸濁し、前記線維芽細胞の培養条件下でゲル化させたものである。前記線維芽細胞は、前記コラーゲンゲル内で三次元的に培養され、その形状は、単層培養と異なり、生体内と類似の二極化した紡錘状となる。また、前記コラーゲンは、ゲル化によりコラーゲン繊維が再配列し、真皮組織に似た構造となる。前記コラーゲンゲルは、ｉｎ ｖｉｖｏ試験との相関性が高く、また、再現性が高いことから、細胞毒性試験、ｉｎ ｖｉｔｒｏ眼刺激性試験に用いられ、近年は、皮膚の弾力性、たるみ、ハリ、しわ改善評価モデル（例えば、特許文献１）や、創傷治癒促進（例えば、特許文献２）または創収縮の評価モデル（例えば、特許文献３）としても、用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−１７６２０８号公報
【特許文献２】特開２００１−０６４１９６号公報
【特許文献３】特開２００４−３５５２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる、コラーゲンゲル収縮剤を提供する。創傷治癒促進や収縮の評価モデルなどに利用可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
リンゴ抽出物に着目して、試験した結果コラーゲン収縮能があることを知見し、さらにコラーゲントリペプチド及びシリマリンとの併用によってコラーゲン収縮を増強できることを見出して、本発明に至った。
１．コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリンを有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
２．リンゴ抽出物がリンゴ由来のポリフェノールであり、コラーゲントリペプチドの平均分子量が４００以下のものを含有するコラーゲントリペプチドであることを特徴とする１．記載のコラーゲンゲル収縮剤。
３．シリマリンがマリアアザミ抽出物であることを特徴とする１．又は２．記載のコラーゲンゲル収縮剤。
４．１．〜３．のいずれかに記載されたコラーゲン収縮剤を含む飲食品。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のコラーゲンゲル収縮剤は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させることができる。リンゴポリフェノール、コラーゲントリペプチド及びシリマリンの３成分を併用することにより、コラーゲンゲルを収縮する機能が顕著に向上することが認められた。この３成分併用剤は、それぞれ単独あるいは２成分の組み合わせに比較して、コラーゲンゲルを収縮する機能が顕著である。コラーゲンゲル収縮能の試験系は、線維芽細胞とコラーゲンの相互作用によりゲルが収縮し真皮構造に類似のコラーゲンゲル構造になる。コラーゲンゲル収縮効果により、肌のはりや弾力改善効果が期待でき、皮膚状態が改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】リンゴ抽出物単独添加のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ
【図２】シリマリン単独添加のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ
【図３】コラーゲントリペプチド単独添加のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ
【図４】３成分のコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図５】コラーゲントリペプチドとシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図６】リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチド併用によるコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図７】リンゴ抽出物とシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験結果を示すグラフ。
【図８】シリマリン、リンゴ、コラーゲントリペプチド３者の組合せによるコラーゲンゲル収縮能状態図
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明者は、先にリンゴ抽出物に、コラーゲンゲル収縮作用があることを知見し、リンゴ抽出物を有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤に関する特許出願（特願２００９−８３８１８号）を行った。本発明者は、さらに、リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドを併用することにより、コラーゲンゲル収縮作用が増強されることを見出し特許出願（特願2009-180406号）した。
本発明は、更にシリマリンを併用した３成分において、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる、コラーゲンゲル収縮剤である。それぞれ単独のコラーゲン収縮作用、あるいは、２成分の組み合わせに比較して、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリン３成分併用剤は、格段に優れたコラーゲン収縮作用を示す。
本発明のコラーゲンゲル収縮剤は、コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させる。コラーゲンゲルの収縮とは、例えば、ゲルの大きさが小さくなることをいう。コラーゲンゲルの大きさの指標としては、特に制限されないが、例えば、コラーゲンゲルの直径、表面積、体積などが挙げられる。
【０００９】
＜コラーゲンゲル＞
本発明において、コラーゲンゲルは、収縮可能な形状であれば良く、ゲル状以外に、例えば、固形状であっても良い。
コラーゲンゲルに含まれるコラーゲンの種類は、特に制限されず、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型コラーゲンなどが挙げられ、好ましくは、Ｉ型コラーゲンである。また、コラーゲンは、例えば、コラーゲンを加工処理したものであっても良い。加工処理としては、特に制限されないが、例えば、熱処理、酵素処理などが挙げられる。熱処理したコラーゲンとしては、例えば、ゼラチンなどが挙げられ、酵素処理したコラーゲンとしては、例えば、アテロコラーゲン、コラーゲンペプチドなどが挙げられる。コラーゲンゲル中の前記コラーゲン濃度は、特に制限されず、例えば、形状などに応じて、適宜設定可能である。
コラーゲンゲルにおいて、線維芽細胞の由来組織は、特に制限されず、例えば、皮膚、肺、心臓などが挙げられ、好ましくは、皮膚である。線維芽細胞の由来種は、特に制限されず、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、ウサギ、ラット、マウスなどがあげられ、好ましくは、ヒトである。コラーゲンゲル中の線維芽細胞の細胞密度は、特に制限されず、適宜設定可能である。
コラーゲンゲルは、例えば、コラーゲンおよび線維芽細胞以外のその他成分を含んでも良い。その他成分としては、特に制限されず、例えば、培養液、血清などが挙げられる。
【００１０】
＜リンゴ抽出物＞
リンゴ抽出物が、リンゴ果実の抽出物であるのが好ましい。特に、リンゴ幼果抽出物に含まれるポリフェノールを主成分とすることが好ましい。
リンゴ抽出物には、ポリフェノール、有機酸、アミノ酸などを含むことが知られている。
リンゴ抽出物は、血管機能改善作用を高めることが可能なBNP調節剤として抽出物を有効成分として含有してなるBNP調節剤、血行促進剤（特開２００７−００８８３７号公報、特開２００６−２６５２２０号公報）や飲料（特開２００４−３０５０８７号公報）、化粧料配合剤（特開２００１−１８７７２４号公報）、消臭剤成分（特開平１１−３１９０５１号公報）、香料成分（特開平０８−０２３９３９号公報）などに用いられることが知られている。
しかしながら、リンゴ抽出物およびリンゴ由来のポリフェノールについて、コラーゲンゲル収縮効果は、未だ報告されていない。
【００１１】
リンゴ抽出物において、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）の品種は、例えば、ふじ、国光、王林、紅玉、ジョナゴールド、デリシャス、さんさ、千秋などが挙げられ、特に制限されない。リンゴの抽出部位は、特に制限されず、例えば、果実、葉、幹、花などが挙げられ、好ましくは、果実である。前記果実は、例えば、未熟果（幼果）でも良く、完熟果でも良く、特に制限されない。抽出に用いる前記果実の部位は、特に制限されず、例えば、全果、果肉、果皮、種などが挙げられる。リンゴ抽出物は、これらの部位を、単独で、または２種以上組み合わせて抽出しても良い。
【００１２】
リンゴ抽出物を抽出する方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。抽出方法の具体例としては、例えば、以下のようであっても良い。まず、リンゴの全果を、水洗後、グラインダーなどにより粉砕する。この粉砕物を、ペクチナーゼ処理に供し、遠心分離後、抽出溶媒により分配ろ過して、リンゴ抽出物を調製しても良い。前記ペクチナーゼ処理としては、特に制限されないが、例えば、20〜60℃の温度条件化で、ペクチナーゼを10〜50ppm添加して行っても良い。抽出溶媒としては、特に制限されないが、例えば、ヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒が挙げられる。
【００１３】
リンゴ抽出物は、例えば、市販のリンゴ抽出物を用いても良く、リンゴ果実から抽出して調製しても良く、特に制限されない。
コラーゲンゲル収縮剤中に含まれるリンゴ抽出物含量は、特に制限されないが、例えば、0.001〜99重量％、好ましくは、0.001〜５重量％である。コラーゲンやゼラチンとの併用によって、コラーゲンゲル収縮能が飛躍的に向上するので、0.01重量％以下で十分である。コラーゲンゲル収縮剤は、リンゴ由来のポリフェノールを含むリンゴ抽出物が好ましい。
【００１４】
ポリフェノールの分画方法は、特に制限されず、従来公知の方法を採用できる。ポリフェノールは、例えば、リンゴ抽出物をカラムに通液後、カラムの吸着物を溶出し、この溶出画分を減圧留去濃縮して分画しても良い。また、さらに、この濃縮液に粉末助剤を添加し、凍結乾燥または噴霧乾燥して、ポリフェノール粉末を調製しても良い。
ポリフェノールは、例えば、市販のリンゴ由来のポリフェノール含有物を用いても良く、リンゴ果実から抽出および分画して調製しても良く、特に制限されない。本発明のコラーゲンゲル収縮剤中に含まれる前記ポリフェノール含量は、特に制限されないが、例えば、0.01〜99重量％、好ましくは、0.1〜５０重量％である。
【００１５】
＜コラーゲントリペプチド＞
リンゴ抽出物を併用するコラーゲントリペプチドは、平均分子量が400以下のものを含有するトリペプチドであり、通常一般のコラーゲンと称するものとは区別されるものである。さらに詳しくは、アミノ酸配列がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙはアミノ酸）であるペプタイドが好ましく、特に好ましくはアミノ酸配列がＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐのものである。 本発明のコラーゲントリペプチドは、豚などの動物由来、魚由来いずれも使用可能である。
本発明のコラーゲントリペプチドは、主にコラーゲンを加水分解して製造することができる。コラーゲン加水分解物は、既に市販されているが、これらの酵素的に加水分解されたコラーゲンの多くは、分子量の分布範囲が二千から八万である。これらの加水分解物は水に対する分散性の向上を目的とするものである。
これに対して本発明のコラーゲン加水分解物は、特定の有効成分として分子量で
約400以下のペプタイドを含むことを特徴とする。
添加量は、0.01重量％以上が好ましい。本試験系の試験ではコラーゲンゲルの収縮は80％程度が上限と想定されるので、コラーゲンゲルの収縮が70％程度以上は、添加濃度を増やしても増加効果は小さい。したがって、マイナスとなることは無いと言う意味では、上限は無いが、実質的には1.0重量％程度が上限となる。
【００１６】
＜シリマリン＞
シリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．６５６６６−０７−１）は、キク科マリアアザミ（学名シリバム・マリアナムＳｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ Ｇａｅｒｔｎ、別名オオアザミ、オオヒレアザミ、ミルクアザミ；ＣＡＳ Ｎｏ．８４６０４−２０−６）から抽出されるフラボノリグナンの総称であり、分子式Ｃ２５Ｈ２２Ｏ１０で表される、シリビン（Ｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２２８８８−７０−６）、シリジアニン（Ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２９７８２−６８−１）、シリクリスチン（Ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．３３８８９−６９−９）、イソシリビン（Ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．７２５８１−７１−６）などを含有している組成物である（天然薬物事典、奥田拓男編、廣川書店、昭和６１年３月３日 発行）。
本発明においては、シリマリンを含む植物体から抽出した抽出物に含有されるこれらのフラボノリグナンを含有している組成物を従来技術と同様、シリマリンと呼ぶ。例えば、シリマリンを含む植物体から抽出した抽出物としては、マリアアザミ抽出物がある。
またシリマリンは前記の通りフラボノリグナンの混合物であり、シリマリンとしての植物抽出物や植物中の含有量は、分光光度計による測定に基づいた方法（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｎ．Ｆｏｒｓｃｈ，１８，６９６，１９６８．）、薄層クロマトグラフィーによる方法（Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｎ．Ｆｏｒｓｃｈ，２４，４６６，１９７４．）、高速液体クロマトグラフィーによる方法（Ｔｉｔｔｅｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１３５，４９９，１９７７．、Ｔｉｔｔｅｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１５３，２２７，１９７８．、Ｑｕｅｒｃｉａ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｒｉｇｅｒｉｏ Ａ．（Ｅｄ）．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８３，ｐ１．）により測定可能である。これらの測定法の中でも、分光光度計による測定に基づいた方法の一つである２,４−ジニトロヒドラジン分析は、ドイツ薬局方（Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍの果実に関するモノグラフ）に報告されており、広く用いられている。
また、シリマリン又はその構成成分であるシリビン、シリジアニン、シリクリスチン、イソシリビンをリン脂質複合体として配合することができる。リン脂質複合体はＩＮＤＥＮＡ社が市販しているＳＩＬＹＭＡＲＩＮ ＰＨＹＴＯＳＯＭＥ（シリマリンのリン脂質複合体）、ＳＩＬＩＰＨＯＳ（シリビンのリン脂質複合体）を使用することができる。
例えば、ＩＮＤＥＮＡ社製シリマリンは、ドイツ薬局方DABに収載された吸光度比法でシリビン換算で測定したシリビン、イソシリビン、シリクリスチン、シリジアニン含量が約６５％以上、そのうちＨＰＬＣ法で測定したシリビンとイソシリビンの合計は約３０％以上である。ＳＩＧＭＡ社製のシリビンは、ＳＩＬＩＢＩＮＩＮ（Ｓｉｌｙｂｉｎ：２，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−３−[４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ]−２−[ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ]−６−[３，５，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｏｘｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−２−ｙｌ]ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎで、ＨＰＬＣ法で測定したシリビン含量が約９８．０質量％である。ＩＮＤＥＮＡ社製のリン脂質複合体ＳＩＬＹＭＡＲＩＮ ＰＨＹＴＯＳＯＭＥは、シリマリン３０％（うちＨＰＬＣ法で測定したシリビンを約９％含有）、大豆リン脂質７０％のリン脂質複合体である。ＩＮＤＥＮＡ社製のリン脂質複合体ＳＩＬＩＰＨＯＳは、シリビン濃縮エキス３０％（うちＨＰＬＣ法で測定したシリビンを約２５％含有）、大豆リン脂質７０％のリン脂質複合体である。
本発明に配合するシリマリン又はその構成成分であるシリビン、イソシリビン、シリジアニン、シリクリスチンの濃度は０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がさらに好ましい。０．０１重量％未満では、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、エラスチン産生促進作用が十分に発揮されない。濃度は高いほど好ましいが、２．０重量％以上では完全に溶解しにくい傾向がある。
【００１７】
以下に、３成分について、コラーゲン収縮作用に関して、それぞれ単独、２成分系及び３成分系の試験を行い実証する。
〔試験に用いる材料〕
［材料］
（１）アテロコラーゲン（商品名：AteloCell、アテロコラーゲン（牛真皮由来）５mg/ml（２）ＤＭＥＭ（粉末）（商品名：ダルベッコ変法イーグル培地(2)、日水）
（３）ＤＭＥＭ（液体）（商品名；Ｇｉｂｃｏ）
［評価検体］
（１）リンゴ抽出物（リンゴポリフェノール） 商品名：ポマクティブHFV（ユニテックフーズ社製）
規格；全ポリフェノール量９０％以上（ＵＶ法）
（２）コラーゲントリペプチド 商品名：HACP-01（HTCコラーゲン、ゼライス社製）
規格；トリペプチド１５％以上
（３）シリマリン 商品名：シリマリンＥＴ／Ｇ（Ｉｎｄｅｎａ Ｓ．ｐ．Ａ．社製）
規格；シリビン・イソシリビン合計３０％以上（ＨＰＬＣ法）、シリマリン含量６５％以上（ＤＡＢ１０［ドイツ薬物規格第１０項］による）
【００１８】
［試験方法］
予め継代培養した皮膚線維芽細胞（新生児由来）を細胞懸濁液（６×１０５cells/ml 溶媒１０％FBS含有DMEM）として調整した。氷冷中でアテロコラーゲン（5mg/ml）４ml、3倍濃度DMEM２ml、FBS（牛血清）０．６７ml、10%FBS含有DMEM ３．３４ml及び細胞懸濁液２mlを混合し、平底１２ウェルプレートに１ｍｌずつ添加した。３７℃５％CO2インキューベーターで培養し、５時間後にアテロコラーゲンが再線維化することでゲル化することを認めた。添加から６時間後に滅菌したスパチュラの柄を用いてゲルをウェルプレートから剥がした後、各評価検体を任意の濃度に調整した１０％FBS含有DMEM溶液１ｍｌを添加して、再び３７℃５％CO2インキューベーターで７日間培養した。培養液は１日おきに評価薬剤を任意の濃度に溶解させた10%FBS含有DMEM溶液１ｍｌを培地交換した。培養終了後、培養液を完全に除去しPBSで洗浄後、１０％中性ホルマリン溶液（Wako）で２４時間浸潤しゲルを固定した。その後、１％（ｗ／ｖ）Triton−X溶液に置換して、ゲル直径の計測を行った。
【００１９】
［ゲル直径の計測およびゲル面積の算出］
ゲルの形状はウェルプレートと同様に真円状になることを利用してゲル面積を算出した。
上記処理方法によって調整したゲルを２方向について直径を計測し、２直線の平均値を算出した。そのゲル直径の平均値からゲル半径が算出され、ゲル面積は次の式で算出することができる。
ゲル面積＝（ゲル半径 cm）×（ゲル半径 cm）×円周率
【００２０】
薬剤未処理のコラーゲンゲルのゲル面積に対する薬剤処理時のコラーゲンゲルのゲル面積の面積比からコラーゲンゲル収縮率（％）を算出した。
コラーゲンゲル収縮率（％）＝１００×{（薬剤未処理のゲル面積）−（薬剤処理時のゲル面積）}／（薬剤未処理のゲル面積）
一つのデータについてn=3ウェルで評価し、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．）でグラフ表記した。
【００２１】
[リンゴ抽出物単独試験]
表１及び図１に、リンゴ抽出物（ポマクティブHFV）単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。ポマクティブＨＦＶは数mｇ／ｍｌから数十mｇ／ｍｌの濃度域で濃度依存的にコラーゲンゲル収縮能が認められた（図１）。
【００２２】
【表１】
【００２３】
[シリマリン単独添加試験]
表２及び図２に、シリマリン（シリマリンＥＴ／Ｇ）単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。シリマリンＥＴ／Ｇは数mｇ／ｍｌから数十mｇ／ｍｌの濃度域で濃度依存的にコラーゲンゲル収縮能が認められた（図２）。
【００２４】
【表２】
【００２５】
[コラーゲントリペプチド単独試験]
表３及び図３に、コラーゲントリペプチド（ＨＡＣＰ−０１）単独添加の試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。 ＨＡＣＰ−０１は数百mｇ／ｍｌから数千mｇ／ｍｌの濃度域で濃度依存的にコラーゲンゲル収縮能が認められた（図３）。
【００２６】
【表３】
【００２７】
[３成分のコラーゲンゲル収縮能試験]
表４及び図４に、３成分を配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
【００２８】
【表４】
【００２９】
＜考察＞
（１）想定総和効果について
表１、２、３に示されたそれぞれの検体を単独添加した時の結果、
ポマクティブＨＦＶ １mｇ／ｍｌで収縮率１６．０％
シリマリンＥＴ／Ｇ ５mｇ／ｍｌで収縮率２２．６％
ＨＡＣＰ−０１ ３０mｇ／ｍｌで収縮率０％、
３００mｇ／ｍｌで収縮率１８．１％
から、３者の理論値としてのゲル収縮率の総和（表４、図４参照）は、
例えば
理論値１：
ポマクティブＨＦＶ：シリマリンＥＴ／Ｇ：ＨＡＣＰ−０１＝１mｇ／ｍｌ：５mｇ／ｍｌ：３０mｇ／ｍｌで １６．０％＋２２．６％＋０％＝３８．６％ 、
理論値２：
ポマクティブＨＦＶ：シリマリンＥＴ／Ｇ：ＨＡＣＰ−０１＝１mｇ／ｍｌ：５mｇ／ｍｌ：３００mｇ／ｍｌで １６．０％＋２２．６％＋１８．１％＝５６．７％、
等となる。
【００３０】
（２）３者併用時のコラーゲンゲル収縮能についてシリマリンＥＴ／Ｇ、ポマクティブＨＦＶ、ＨＡＣＰ−０１の３者添加時の評価（表４、図４参照）
（ａ） 試験群１における収縮率の理論値は３８．６％であるのに対し、実験値では５７．５±２．３％であり、実験値５７．５％＞理論値３８．６％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｂ）試験群２における収縮率の理論値は５６．７％であるのに対し、実験値では７０．７±２．４％であり、実験値７０．７％＞理論値３８．６％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｃ）試験群３における収縮率の理論値は７２．９％であるのに対し、実験値では８０．８±２．２％であり、実験値８０．８％＞理論値７２．９％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｄ）試験群４における収縮率の理論値は３８．６％であるのに対し、実験値では５６．６±６．７％であり、実験値５６．６％＞理論値３８．６％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｅ）試験群５における収縮率の理論値は５３．７％であるのに対し、実験値では６５．５±５．９％であり、実験値５６．６％＞理論値５３．７％となり、３者の評価検体における相乗効果が認められた。
したがって、図４試験群１から試験群５の任意の濃度添加条件のいずれにおいても、リンゴ抽出物、シリマリン、コラーゲントリペプチド３者間の相乗効果が認められる。
【００３１】
[コラーゲントリペプチドとシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験]
表５及び図５に、コラーゲントリペプチド（ＨＡＣＰ−０１）とシリマリン（シリマリンＥＴ／Ｇ）併用配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
（ａ）配合１では、シリマリンＥＴ／Ｇ単独添加５mｇ／ｍｌで２２．６±５．４％ゲル収縮した。
（ｂ）配合２における収縮率の理論値は２２．６％であるのに対し、実験値では２７．４±４．８％であり、実験値２７．４％＞理論値２２．６％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
（ｃ）配合３における収縮率の理論値は２２．６％であるのに対し、実験値では３９．１±４．９％であり、実験値３９．１％＞理論値２２．６％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｄ）配合４における収縮率の理論値は４０．７％であるのに対し、実験値では４１．２±３１．７％であり、実験値４１．２％＞理論値４０．７％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
したがって、図５の配合２から配合４において相乗効果は認められたが、配合２および配合４における相乗効果はごく僅かなものであり、シリマリンとコラーゲントリペプチド２者間の相乗効果はごく僅かもしくは無いと考えられる。
【００３２】
【表５】
【００３３】
[リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチド併用によるコラーゲンゲル収縮能試験]
表６及び図６に、リンゴ抽出物（ポマクティブHFV）とコラーゲントリペプチド（ＨＡＣＰ−０１）併用配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
（ａ）配合１では、ポマクティブHFV単独添加１mｇ／ｍｌで１６．０±９．４％ゲル収縮した。
（ｂ）配合２における収縮率の理論値は１６．０％であるのに対し、実験値では１８．０±３．６％であり、実験値１８．０％＞理論値１６．０％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
（ｃ）配合３における収縮率の理論値は１６．０％であるのに対し、実験値では３４．５±３．９％であり、実験値３４．５％＞理論値１６．０％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められた。
（ｄ）配合４における収縮率の理論値は３４．１％であるのに対し、実験値では３６．５±８．０％であり、実験値３６．５％＞理論値３４．１％となり、２者の評価検体における相乗効果が認められたが、その差はごく僅かであった。
したがって、図６の配合２から配合４において相乗効果が認められたが、配合２および配合４における相乗効果はごく僅かなものであり、シリマリンとコラーゲントリペプチド２者間の相乗効果はごく僅かもしくは無いと考えられる。
【００３４】
【表６】
【００３５】
[リンゴ抽出物とシリマリン併用によるコラーゲンゲル収縮能試験]
表７及び図７に、リンゴ抽出物（ポマクティブHFV）とシリマリン（シリマリンＥＴ／Ｇ）併用配合した試験例についてのコラーゲンゲル収縮率（％）の結果を示す。
（ａ）配合１における収縮率の理論値は５３．７％であるのに対し、実験値では４５．１±１１．５％であり、実験値４５．１％＜理論値５３．７％となり、２者間での相乗効果が無かった。
（ｂ）配合２における収縮率の理論値は５７．５％であるのに対し、実験値では４６．２±５．３％であり、実験値４６．２％＜理論値５７．５％となり、２者間での相乗効果が無かった。
（ｃ）配合３における収縮率の理論値は５３．７％であるのに対し、実験値では３４．９±１２．０％であり、実験値３４．９％＜理論値５３．７％となり、２者間の相乗効果が無かった。
したがって、図７の配合１から配合３において、いずれも理論値を上回るゲル収縮能を発揮しなかった事から、リンゴ抽出物とシリマリンとの間に相乗効果は無いと結論付けた。
【００３６】
【表７】
【００３７】
[試験結果の総合考察]
（ａ）リンゴ抽出物、シリマリン、コラーゲントリペプチドの３者併用により、著しくゲル収縮能が高まった。
（ｂ）リンゴ抽出物とコラーゲントリペプチドの２者併用により相乗的にゲル収縮能が高まったが、その相乗効果は僅かであるか、もしくは、特定の濃度の組合せに限定された。
（ｃ）シリマリンとコラーゲントリペプチドの２者併用により相乗的にゲル収縮能が高まったが、その相乗効果は僅かであるか、もしくは、特定の濃度の組合せに限定された。
（ｄ）リンゴ抽出物とシリマリンの２者併用により相乗的なゲル収縮能は見出せなかった。
という結果になり、リンゴ抽出物、シリマリン、コラーゲントリペプチドの３者の組合せがそれぞれ２者の組合せよりも優れたコラーゲンゲル収縮能を発揮する事が明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリンを有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
【請求項２】
リンゴ抽出物がリンゴ由来のポリフェノールであり、コラーゲントリペプチドの平均分子量が４００以下のものを含有するコラーゲントリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のコラーゲンゲル収縮剤。
【請求項３】
シリマリンがマリアアザミ抽出物であることを特徴とする請求項１又は２記載のコラーゲンゲル収縮剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載されたコラーゲン収縮剤を含む飲食品。
【請求項１】
コラーゲンおよび線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させるコラーゲンゲル収縮剤であって、リンゴ抽出物、コラーゲントリペプチド及びシリマリンを有効成分とするコラーゲンゲル収縮剤。
【請求項２】
リンゴ抽出物がリンゴ由来のポリフェノールであり、コラーゲントリペプチドの平均分子量が４００以下のものを含有するコラーゲントリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のコラーゲンゲル収縮剤。
【請求項３】
シリマリンがマリアアザミ抽出物であることを特徴とする請求項１又は２記載のコラーゲンゲル収縮剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載されたコラーゲン収縮剤を含む飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１５７２８１（Ｐ２０１１−１５７２８１Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７８８４（Ｐ２０１０−１７８８４）
【出願日】平成２２年１月２９日（２０１０．１．２９）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２９日（２０１０．１．２９）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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