コラーゲン生産植物及びその作成方法及びその使用
【課題】コラーゲン生産植物及びその作成方法の提供。
【解決手段】植物又は単離された植物細胞中で生産された組み換えコラーゲンであって、植物又は単離された植物細胞の液胞に少なくとも一種のコラーゲン鎖及び外因性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）を標的化して、前記外因性Ｐ４Ｈによるが植物又は単離された植物細胞の内因性Ｐ４Ｈによらない前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のヒドロキシル化を可能にすることによって生産された組み換えコラーゲン。
【解決手段】植物又は単離された植物細胞中で生産された組み換えコラーゲンであって、植物又は単離された植物細胞の液胞に少なくとも一種のコラーゲン鎖及び外因性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）を標的化して、前記外因性Ｐ４Ｈによるが植物又は単離された植物細胞の内因性Ｐ４Ｈによらない前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のヒドロキシル化を可能にすることによって生産された組み換えコラーゲン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン生産植物及びその作成方法及びその使用に関する。特に、本発明は、生来的な三重らせんＩ型コラーゲン線維を形成することができる高レベルにヒドロキシル化されたコラーゲン鎖を生産することができる植物を作成するための新規のアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、脊椎動物及び多くの他の多細胞生物の構造的完全性を担う主要な構造タンパク質である。Ｉ型コラーゲンは原型線維状コラーゲンを表し、大部分の組織における主要なコラーゲン型である。
【０００３】
Ｉ型コラーゲンは、骨及び腱の優勢なコラーゲン成分であり、皮膚、大動脈及び肺に多量に見出される。Ｉ型コラーゲン線維は、大きな引張り強度及び限定された伸度を与える。Ｉ型コラーゲンの最も豊富な分子形態は、二つの異なるアルファ鎖［アルファ１（Ｉ）］２及びアルファ２（Ｉ）からなるヘテロトリマーである（Ｉｎｋｉｎｅｎ、２００３年）。すべての線維状コラーゲン分子は、繰返しＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットから構築される三つのポリペプチド鎖を含み、ここでＸ及びＹはいかなるアミノ酸であることができるが、イミノ酸プロリン及びヒドロキシプロリンであることが多い。
【０００４】
原線維形成コラーゲン（線維状コラーゲン）は、球状Ｎ及びＣ末端延長プロペプチドを含む前駆体プロコラーゲンとして合成される。プロコラーゲンの生合成は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化及び鎖内及び鎖間ジスルフィド結合の形成を含む多数の異なる翻訳後修飾が関与する複雑な過程である。これらの修飾を行う酵素は、協調した様式で作用し、正確にアラインメントされた熱的に安定な三重らせん分子の折畳み及び会合を確実にする。
【０００５】
各プロコラーゲン分子は、三つの構成的ポリペプチド鎖から大まかな小胞体内で会合する。ポリペプチド鎖が小胞体の膜を横切って共翻訳的に転位されるにつれて、プロリン及びリシン残基のヒドロキシル化がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ繰返し領域内で起こる。一旦ポリペプチド鎖が小胞体の管腔中に十分に転位されたら、Ｃプロペプチドが折畳まれる。次に三つのプロアルファ鎖がそれらのＣプロペプチドを介して会合し、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ繰返し領域がそのＣ末端に核形成点を形成して鎖の正確なアラインメントを確実にすることを可能にするトリマー分子を形成する。次にＧｌｙ−Ｘ−Ｙ領域はＣからＮ方向に折畳まれ、三重らせんを形成する。
【０００６】
ポリペプチド鎖修飾と三重らせん形成との間の時間的な関係は重大である。何故なら、プロリン残基のヒドロキシル化は体温での三重らせんの安定性を確実にするために必要であり、一旦形成されると三重らせんはヒドロキシル化酵素のための基質としてもはや作用しないからである。Ｃプロペプチド（及びより少ない程度のＮプロペプチド）は、プロコラーゲンが細胞を通過する間、プロコラーゲンを可溶性に維持する（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。細胞外マトリックス中へのプロコラーゲン分子の分泌後又は分泌中、プロペプチドはプロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによって除去され、それにより原線維へのコラーゲン分子の自発的な自己会合を引き起す（Ｈｕｌｍｅｓ、２００２年）。プロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによるプロペプチドの除去は、プロコラーゲンの可溶性を１００００倍以上低下させ、コラーゲンの線維への自己会合を開始するのに必要かつ十分である。この会合過程にとって重要なのは、三重らせんドメインの終わりに位置する短い非三重らせんペプチド（テロペプチドと称される）であり、これは、原線維構造内のコラーゲン分子の正確な位置決めを確実にし、自己会合のための臨界濃度を低下させる（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。天然では、コラーゲンの三重らせん構造の安定性は、酵素プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）によりプロリンがヒドロキシル化されてコラーゲン鎖内にヒドロキシプロリン残基を形成することを必要とする。
【０００７】
コラーゲン鎖を発現する植物は当該技術分野で知られており、例えば米国特許第６６１７４３１号及び（Ｍｅｒｌｅら、２００２年、Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、２０００年）を参照できる。植物はヒドロキシプロリン含有タンパク質を合成することができるが、植物細胞中のヒドロキシプロリンの合成のために必要なプロリルヒドロキシラーゼは、哺乳類のＰ４Ｈと比較して比較的ゆるい基質配列特異性を示し、従って、Ｇｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置のみにヒドロキシプロリンを含むコラーゲンの生産は、コラーゲン及びＰ４Ｈ遺伝子の植物中での共発現を必要とする（Ｏｌｓｅｎら、２００３年）。
【０００８】
植物中に天然に存在するヒドロキシル化作用機構に依存してヒトコラーゲンを生産する試みは、プロリンのヒドロキシル化が不十分なコラーゲンを生じた（Ｍｅｒｌｅら、２００２年）。かかるコラーゲンは、３０℃より下の温度で溶解するか又はその三重らせん構造を失う。コラーゲン及びプロリルヒドロキシラーゼの共発現は、体温での用途のために生物学的に意味のある安定なヒドロキシル化コラーゲンを生じる（Ｍｅｒｌｅら、２０００２年）。
【０００９】
リシルヒロドキシラーゼ（ＬＨ，ＥＣ １．１４．１１．４）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．５０）及びグルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６６）は、コラーゲンの翻訳後修飾に関与する酵素である。これらは特定位置のリシル残基をヒドロキシシリル、ガラクトシルヒドロキシリシル及びグルコシルガラクトシルヒドロキシリシル残基へと連続的に修飾する。これらの構造は、コラーゲンにとって特異的であり、それらの機能的活性のために必須である（Ｗａｎｇら、２００２年）。単一のヒト酵素であるリシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）は、ヒドロキシリシンに結合された炭水化物形成において三つのすべての連続的ステップを触媒することができる（Ｗａｎｇら、２００２年）。
【００１０】
タバコ中で発現されるヒトコラーゲンのヒドロキシリシンは、ウシコラーゲン中で見出されるヒドロキシリシンの２％未満を形成する（０．０４％の残基／１．８８％の残基）。これは、植物に内在するリシルヒドロキシラーゼはコラーゲン中のリシンを十分にヒドロキシル化することができないということを示唆する。
【００１１】
本発明を実施に移す際に、本発明者らは、コラーゲン鎖の効果的なヒドロキシル化は、このポリペプチドを正確に修飾することができる酵素に沿ってコラーゲン鎖を封鎖することに依存するということを発見した。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の一つの側面によれば、植物又は単離された植物細胞中でコラーゲンを生産する方法であって、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び外因性Ｐ４Ｈが蓄積することを可能にする態様で、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び前記外因性Ｐ４Ｈを植物又は単離された植物細胞中で発現させ、それにより植物中でコラーゲンを生産することを含む方法が提供される。
【００１３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によれば、方法は、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く前記細胞内区画中で外因性ＬＨ３を発現させることをさらに含む。
【００１４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００１５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００１６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００１７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００１８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００１９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００２０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ１鎖である。
【００２１】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ２鎖である。
【００２２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む。
【００２３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、植物は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、ニンジン及び綿からなる群から選択される。
【００２４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖又は前記外因性Ｐ４Ｈは、前記植物の一部分のみで発現される。
【００２５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記植物の前記一部分は、葉、種子、根、塊茎又は茎である。
【００２６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができる。
【００２７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである。
【００２８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記植物は、ストレス条件に供される。
【００２９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、寒さ及びストレス誘導性化合物の噴霧からなる群から選択される。
【００３０】
本発明の別の側面によれば、コラーゲンアルファ鎖がヒト細胞中で発現される場合に生産されるヒドロキシル化パターンと同一のヒドロキシルパターンを有するコラーゲンアルファ鎖を蓄積することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００３１】
本発明のなお別の側面によれば、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中にコラーゲンアルファ鎖を蓄積することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００３２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、遺伝的に改変された植物は、外因性Ｐ４Ｈをさらに含む。
【００３３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００３４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００３５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００３６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００３７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００３８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００３９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ鎖は、アルファ１鎖である。
【００４０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ鎖は、アルファ２鎖である。
【００４１】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む。
【００４２】
本発明のなお別の側面によれば、コラーゲンアルファ１鎖を蓄積することができる第一の遺伝的に改変された植物と、コラーゲンアルファ２鎖を蓄積することができる第二の遺伝的に改変された植物とを含む植物システムが提供される。
【００４３】
本発明のさらに別の側面によれば、コラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖を蓄積することができる第一の遺伝的に改変された植物と、Ｐ４Ｈを蓄積することができる第二の遺伝的に改変された植物とを含む植物システムが提供される。
【００４４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記第一の遺伝的に改変された植物及び前記第二の遺伝的に改変された植物の少なくとも一つは外因性Ｐ４Ｈをさらに含む。
【００４５】
本発明のさらに別の側面によれば、線維状コラーゲンの生産方法であって、（ａ）第一植物中でコラーゲンアルファ１鎖を発現させ；（ｂ）第二植物中でコラーゲンアルファ２鎖を発現させ、ただし、前記第一植物及び前記第二植物中での発現は、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖がそれぞれ、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができるように構成されており、そして（ｃ）前記第一植物と前記第二植物を交配させ、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖を発現する子孫を選択し、それにより線維状コラーゲンを生産することを含む方法が提供される。
【００４６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、方法は前記第一植物及び前記第二植物のそれぞれにおいて外因性Ｐ４Ｈを発現させることをさらに含む。
【００４７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００４８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００４９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中の発現を介して行われる。
【００５０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００５１】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００５２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００５３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む。
【００５４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができる。
【００５５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである。
【００５６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記植第一植物及び前記第二植物は、ストレス条件に供される。
【００５７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、重金属毒性及び寒さストレスからなる群から選択される。
【００５８】
本発明のさらに別の側面によれば、線維状コラーゲンの生産方法であって、（ａ）第一植物中でコラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖を発現させ、ただし、前記第一植物中での発現は、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖がそれぞれ、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができるように構成されており；（ｂ）第二植物中で、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く前記細胞内区画中に蓄積することができる外因性Ｐ４Ｈを発現させ；そして（ｃ）前記第一植物と前記第二植物を交配させ、前記コラーゲンアルファ１鎖、前記コラーゲンアルファ２鎖及び前記Ｐ４Ｈを発現する子孫を選択し、それにより線維状コラーゲンを生産することを含む方法が提供される。
【００５９】
本発明のさらに別の側面によれば、植物細胞中で機能的なプロモーターの転写制御下に配置されたヒトＰ４Ｈをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００６０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎプロモーター、ｒｂｃＳプロモーター及びＳＶＢＶプロモーターからなる群から選択される。
【００６１】
本発明のさらに別の側面によれば、コラーゲンアルファ１鎖、コラーゲンアルファ２鎖、Ｐ４Ｈ、ＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はプロテアーゼＮを発現することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００６２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖はそれぞれ、内因性の植物Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができる。
【００６３】
本発明のさらに別の側面によれば、哺乳類のコラーゲンの温度安定性特性と同一の温度安定性特性を有するコラーゲンを蓄積することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００６４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである。
【００６５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンは、ヒトのコラーゲンである。
【００６６】
本発明のさらに別の側面によれば、植物中での発現のために最適化されたコラーゲンコード配列が提供される。
【００６７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンコード配列は配列番号１によって規定されるものである。
【００６８】
本発明は、ヒトコラーゲンの特性と同様の特性を有するコラーゲンへと会合することができる正確にヒドロキシル化されたコラーゲン鎖を発現することができる植物を提供することによって、現在知られている構成の欠点を成功裏に克服する。
【００６９】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似の又は均等の方法と材料は本発明を実施又は試験するのに使用できるが、適切な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法及び実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００７１】
【図１ａ】図１ａは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図１ｂ】図１ｂは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図１ｃ】図１ｃは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図１ｄ】図１ｄは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図２】図２は、様々な共形質転換アプローチを示す。それぞれの発現カセットは、コード配列の短い名称によって表される。コード配列は、表１中で特定される。それぞれの共形質転換は、二つのｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクターによって行われた。それぞれの長方形は、一つ、二つ又は三つの発現カセットを担持する単一のｐＢＩＮＰＬＵＳベクターを表す。プロモーター及びターミネーターは、実施例１で特定される。
【図３】図３は、コラーゲンアルファ１（３２４ｂｐフラグメント）又はコラーゲンアルファ２（５３７ｂｐフラグメント）又は両者について陽性である植物を示す形質転換体のマルチプレックスＰＣＲスクリーニングである。
【図４】図４は、共形質転換２，３及び４によって作成されたトランスジェニック植物のウェスタンブロット分析である。全可溶性タンパク質は、タバコ形質転換体＃２、＃３及び＃４から抽出され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を用いて試験された。サイズマーカーは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．からの＃ＳＭ０６７１であった。Ｗ．Ｔ．は野生型タバコである。陽性のコラーゲンバンドは、コラーゲンＩ型アルファ１又はアルファ２又は両者についてＰＣＲ陽性である植物において見ることができる。ヒト胎盤（ペプシン消化によってヒトの胎盤から抽出されたＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）からの５００ｎｇのコラーゲンＩ型の陽性コントロールバンドは、トランスジェニック植物からのサンプル中の全可溶性タンパク質の約０．３％（約１５０μｇ）を表す。ヒトコラーゲンサンプル中の約１４０ｋＤａの大きなバンドは、コラーゲンＩ型抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＭＡＢ１９１３）の抗カルボキシ末端プロペプチドによって検出されるようにそのＣプロペプチドを有するプロコラーゲンである。ヒトコラーゲンサンプル中の約１２０ｋＤａの小さなバンドは、プロペプチドを有さないコラーゲンである。それらの異常な組成のため、プロリンリッチタンパク質（コラーゲンを含む）は、予測されたより高い分子量を有するバンドとしてポリアクリルアミドゲル上を一貫して移動する。それ故、約９５ｋＤａの分子量のプロペプチドを有さないコラーゲン鎖は、約１２０ｋＤａのバンドとして移動する。
【図５】図５は、共形質転換によって作成されたトランスジェニック植物＃８（コラーゲン鎖に翻訳的に融合されたアポプラストシグナルを担持する）のウェスタンブロット分析である。全可溶性タンパク質は、トランスジェニックタバコの葉から抽出され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を用いて試験された。陽性のコラーゲンアルファ２バンドが植物８−１４１で見ることができる。ヒト胎盤（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）からのコラーゲンＩ型は、コントロールとして使用された。
【図６ａ】図６ａは、加熱処理及びトリプシン又はペプシン消化によって定性決定されるようなコラーゲン三重らせん会合体及び熱安定性を示す。図６ａでは、タバコ２−９（コラーゲンアルファ１鎖のみを発現し、Ｐ４Ｈを発現しない）及び３−５（コラーゲンアルファ１鎖及びアルファ２鎖並びにヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニットの両方を発現する）からの全可溶性タンパク質は、加熱処理（３８℃又は４３℃で１５分間）に供され、続いてトリプシン消化（室温で２０分間）に供され、抗コラーゲンＩ抗体を用いてウェスタンブロット手順で試験された。陽性コントロールは、５００ｎｇのヒトコラーゲンＩ＋ｗ．ｔ．タバコの全可溶性タンパク質のサンプルであった。
【図６ｂ】図６ｂは、加熱処理及びトリプシン又はペプシン消化によって定性決定されるようなコラーゲン三重らせん会合体及び熱安定性を示す。図６ｂでは、全可溶性タンパク質はトランスジェニックタバコ１３−６（矢印によって示されるコラーゲンＩアルファ１及びアルファ２鎖、ヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びヒトＬＨ３を発現する）から抽出され、加熱処理（３３℃、３８℃又は４２℃で２０分間）に供され、直ちに氷上で冷却されて三重らせんの再会合を防止され、そしてペプシンと共に３０分間室温（約２２℃）でインキュベートされ、続いて抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を用いて標準的なウェスタンブロット手順で試験された。陽性コントロールは、ｗ．ｔ．タバコから抽出された全可溶性タンパク質に添加された約５０ｎｇのヒトコラーゲンＩ（ペプシン消化によってヒトの胎盤から抽出されたＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）のサンプルであった。
【図７】図７は、野生型タバコで行われたノーザンブロット分析を示す。ブロットは、タバコＰ４ＨのｃＤＮＡを用いてプローブされた。
【図８】図８は、共形質転換２，３及び１３によって作成されたトランスジェニック植物のウェスタンブロット分析である。全可溶性タンパク質は、タバコ共形質転換体から抽出され、抗ヒトＰ４Ｈアルファ及びベータ並びに抗コラーゲンＩ抗体を用いて試験された。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明は、哺乳類のコラーゲンの特徴を示すコラーゲン及びコラーゲン線維を生産するために使用されることができるコラーゲンを発現して蓄積する植物の発明である。
【００７３】
本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解することができる。
【００７４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７５】
コラーゲン生産植物は、当該技術分野で知られている。かかる植物は、コラーゲン鎖ならびにコラーゲンを生産するために使用されることができるが、かかる鎖は不正確にヒドロキシル化されており、従って、その自己会合は、植物中で生じるか否かにかかわらず、本来不安定なコラーゲンに導く。
【００７６】
本発明を実施に移す際に、本発明者らは、コラーゲン鎖の正確なヒドロキシル化を確実にし、従ってヒトＩ型コラーゲンの特徴（例えば温度安定性）を良く模倣するコラーゲンの植物中での生産を可能にする植物発現アプローチを案出した。
【００７７】
従って、本発明の一つの側面によれば、少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖を発現することができかつそれを内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができる遺伝的に改変された植物が提供される。
【００７８】
本明細書で使用される通り、「遺伝的に改変された植物（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｌａｎｔ）」は、外因性ポリヌクレオチド配列で安定に又は一過的に形質転換されるいかなる下等植物（例えば苔）又は高等植物（維管束植物）、又はその組織もしくは単離された細胞（例えば細胞懸濁液）に言及する。植物の例は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、綿並びに苔の如き下等植物を含む。
【００７９】
本明細書で使用される通り、句「コラーゲン鎖」は、コラーゲン線維のアルファ１又は２鎖の如きコラーゲンサブユニット、好ましくはＩ型線維に言及する。本明細書で使用される通り、句「コラーゲン」は、会合したコラーゲントリマーに言及し、これはＩ型コラーゲンの場合、二つのアルファ１鎖及び一つのアルファ２鎖を含む。コラーゲン線維は、末端プロペプチドＣ及びＮを欠くコラーゲンである。
【００８０】
本明細書で使用される通り、句「内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画」は、植物のＰ４Ｈ又は植物様Ｐ４Ｈ活性を有する酵素を含まない細胞のいかなる区画化された領域に言及する。かかる細胞内区画の例は、液胞、アポプラスト及び細胞質並びにクロロプラスト、ミトコンドリアなどのオルガネラを含む。
【００８１】
いかなる種類のコラーゲン鎖も本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されることができる。その例は、原線維形成コラーゲン（Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｖ及びＸＩ型）、網状組織形成コラーゲン（ＩＶ，ＶＩＩＩ及びＸ型）、原線維表面に結合するコラーゲン（ＩＸ，ＸＩＩ及びＸＩＶ型）、膜貫通タンパク質として生じるコラーゲン（ＸＩＩＩ及びＸＶＩＩ型）、又は１１ｎｍの周期でビーズを有するフィラメント（ＶＩ型）を含む。さらなる記述については、Ｈｕｌｍｅｓ、２００２年を参照されたい。
【００８２】
好ましくは、発現されるコラーゲン鎖は、Ｉ型コラーゲンのアルファ１及び／又は２鎖である。発現されるコラーゲンアルファ鎖は、いかなる哺乳類から由来するいかなるポリヌクレオチド配列によってコードされることができる。好ましくは、コラーゲンアルファ鎖をコードする配列は、ヒトのものであり、配列番号１及び４によって規定されるものである。
【００８３】
典型的には、植物中で発現されるアルファコラーゲン鎖は、それらの末端ポリペプチド（即ち、プロペプチドＣ及びプロペプチドＮ）を含んでいてもよく、又は含まなくてもよい。
【００８４】
Ｒｕｇｇｉｅｒｏら（２０００年）は、植物のタンパク質分解活性によるプロコラーゲンの処理は、ヒトにおける正常な処理とは異なること、及び開裂部位は不明であるが、プロペプチドＣは、植物のタンパク質分解活性によって除去されることに気付いた。Ｃプロペプチドの開裂は、トリマーの会合の前にプロコラーゲンペプチドに対して生じるであろう（三つのＣプロペプチドの会合がトリマーの会合を開始するために必須である）。
【００８５】
植物のタンパク質分解活性によるＮプロペプチドの開裂は、成熟した植物では生じるが苗木では生じない。かかる開裂は、Ｎテロペプチドから２個のアミノ酸を除去する（１７個のうちの２個）。
【００８６】
Ｃプロペプチド（及びより少ない程度のＮプロペプチド）は、プロコラーゲンが動物細胞を通過する間、プロコラーゲンを可溶性に維持し（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）、植物細胞でも同様の効果を有すると予測される。細胞外マトリックス中へのプロコラーゲン分子の分泌後又は分泌中、プロペプチドはプロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによって除去され、それにより原線維へのコラーゲン分子の自発的な自己会合を引き起す（Ｈｕｌｍｅｓ、２００２年）。プロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによるプロペプチドの除去は、プロコラーゲンの可溶性を１００００倍以上低下させ、コラーゲンの線維への自己会合を開始するのに必要かつ十分である。この会合過程にとって重要なのは、三重らせんドメインの終わりに位置する短い非三重らせんペプチド（テロペプチドと称される）であり、これは、原線維構造内のコラーゲン分子の正確な位置決めを確実にし、自己会合のための臨界濃度を低下させる（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。従来技術は、コラーゲンの生産中にプロペプチドを開裂させるためのペプシンの使用を記述する（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。しかし、ペプシンはテロペプチドを損傷させ、結果としてペプシン抽出されたコラーゲンは、整列された線維状構造を形成することができない（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。
【００８７】
ヒトＰ４Ｈのベータサブユニットを形成するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、トリマー会合に先立ってＣプロペプチドに結合し、それにより鎖会合の間の分子シャペロンとしても作用することが示されている（Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、２０００年）。様々な植物中で発現されるヒトＩ型プロコラーゲンＮプロテイナーゼ及びプロコラーゲンＣプロテイナーゼの使用は、生来的なヒトのコラーゲンに一層類似しかつ整列された原線維構造を形成することができるコラーゲンを生産することができるであろう。
【００８８】
ＮもしくはＣプロペプチド又はこれらの両方が、発現されるコラーゲン鎖に含まれる場合、本発明の遺伝的に改変された植物はそれぞれのプロテアーゼ（即ちＣもしくはＮ又はこれらの両方）を発現することもできる。かかるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１８（プロテアーゼＣ）及び２０（プロテアーゼＮ）によって例示される。かかるプロテアーゼは、それらがコラーゲン鎖と同じ細胞内区画中に蓄積されるように発現されることができる。
【００８９】
内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中での発現されるコラーゲン鎖の蓄積は、いくつかのアプローチのいずれか一つによって実行されることができる。
【００９０】
例えば、発現されるコラーゲン鎖は、発現されるタンパク質をアポプラスト又はオルガネラ（例えば葉緑体）の如き細胞内区画へと標的化するためのシグナル配列を含むことができる。好適なシグナル配列の例は、葉緑体輸送ペプチド（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ０７６８９、アミノ酸１〜５７に含まれる）及びミトコンドリア輸送ペプチド（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ４６６４３、アミノ酸１〜２８に含まれる）を含む。以下の実施例セクションは、好適なシグナル配列の追加の例示並びにかかるシグナル配列を植物細胞中でのコラーゲン鎖の発現において使用するためのガイドラインを与える。
【００９１】
代わりに、コラーゲン鎖の配列は、植物中で発現されたときにコラーゲンの細胞内局在化を変化させるような方法で改変されることができる。
【００９２】
上述の通り、植物のＥＲは、コラーゲン鎖を正確にヒドロキシル化することができないＰ４Ｈを含む。コラーゲンアルファ鎖は、発現されるコラーゲンをＥＲ中に指向させるＥＲ標的化配列を生来的に含み、発現されるコラーゲンはＥＲ中で翻訳後修飾される（不正確なヒドロキシル化を含む）。従って、ＥＲ標的化配列の除去は、いかなるヒドロキシル化も含む翻訳後修飾を欠くコラーゲン鎖の細胞質内蓄積に導くであろう。
【００９３】
以下の実施例セクションの実施例１は、ＥＲ配列を欠くコラーゲン配列の生成を記述する。
【００９４】
また代わりに、コラーゲン鎖は、葉緑体又はミトコンドリアの如きＤＮＡ含有オルガネラ中に発現されて蓄積されることができる。葉緑体発現のさらなる記述は以下に与えられる。
【００９５】
上述の通り、アルファ鎖のヒドロキシル化は、安定なＩ型コラーゲンの会合のために要求される。本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるアルファ鎖は、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く、細胞内区画中に蓄積するので、かかる鎖は、植物、植物組織又は細胞から単離されなければならず、インビトロでヒドロキシル化されなければならない。かかるヒドロキシル化は、Ｔｕｒｐｅｅｎｎｉｅｍｉ−Ｈｕｊａｎｅｎ及びＭｙｌｌｙｌａによって記述される方法（Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８４ Ｊｕｌ １６：８００（１）５９−６５）によって達成されることができる。
【００９６】
かかるインビトロヒドロキシル化は、正確にヒドロキシル化されたコラーゲン鎖に導くことができるが、達成するのが困難である場合があり費用がかかる場合がある。
【００９７】
インビトロヒドロキシル化の制限を克服するため、本発明の遺伝的に改変された植物は、コラーゲンアルファ鎖を正確にヒドロキシル化する（即ち、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットのプロリン（Ｙ）位置のみをヒドロキシル化する）ことができるＰ４Ｈを共発現することが好ましい。Ｐ４Ｈは、二つのサブユニットアルファ及びベータからなる酵素である。これら両方が活性酵素を形成するのに必要であるが、ベータサブユニットはシャペロン機能をも担持する。
【００９８】
本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるＰ４Ｈは、例えば配列番号１２及び１４によってコードされるヒトＰ４Ｈであることが好ましい。加えて、増大された基質特異性を示すＰ４Ｈ突然変異体又はＰ４Ｈ相同体も使用されることができる。
【００９９】
好適なＰ４Ｈ相同体は、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ １７９３６３によって同定されるアラビドプシスのオキシドレダクターゼによって例示される。本発明者らによって行われたこのタンパク質の配列とヒトＰ４Ｈアルファサブユニットの対様式アラインメントは、植物のいかなる公知のＰ４Ｈ相同体の機能性ドメイン間の最高の相同性を明らかにした。
【０１００】
Ｐ４Ｈは、発現されたコラーゲン鎖と共蓄積される必要があるので、そのコード配列は、それに応じて改変されることが好ましい（シグナル配列の付加、ＥＲ標的化を防止することができる欠失など）。
【０１０１】
哺乳類細胞では、コラーゲンはリシルヒドロキシラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びグルコシルトランスフェラーゼによっても修飾される。これらの酵素は、特定位置のリシル残基をヒドロキシリシル、ガラクトシルヒドロキシリシル及びグルコシルガラクトシルヒドロキシリシル残基へと連続的に修飾する。単一のヒト酵素であるリシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）は、ヒドロキシリシンに関連する炭水化物形成における三つの連続的ステップすべてを触媒することができる。
【０１０２】
従って、本発明の遺伝的に改変された植物は、哺乳類のＬＨ３も発現することが好ましい。配列番号２２によって規定されるようなＬＨ３コード配列が、かかる目的のために使用されることができる。
【０１０３】
上述のコラーゲン鎖及び修飾酵素は、植物の機能的プロモーターの転写制御下に配置されたアルファ鎖及び／又は修飾酵素（例えばＰ４Ｈ及びＬＨ３）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、安定に組込まれた又は一過的に発現される核酸構築物から発現されることができる。かかる核酸構築物（本明細書では発現構築物とも称される）は、植物全体での発現のために、又は限定された植物組織もしくは限定された植物細胞での発現のために、又は植物の限定された発生段階での発現のために構成されることができる。かかる構築物は、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、エンハンサーエレメント及び細菌での複製のための複製起点も含むことができる。
【０１０４】
二つの発現性挿入物（例えば二つのアルファ鎖型又はアルファ鎖及びＰ４Ｈ）を含む構築物は、それぞれの挿入物について個別のプロモーターを含むことが好ましいことは理解されるであろう。又は代わりにかかる構築物は、単一のプロモーターから両方の挿入物配列を含む単一の転写キメラを発現することができる。かかる場合、キメラ転写物は、下流の挿入物が翻訳されることができるように二つの挿入物の間にＩＲＥＳ配列を含む。
【０１０５】
組織特異的、発生段階特異的、構成的、又は誘導性であることができる多数の植物機能的発現プロモーター及びエンハンサーが本発明の構築物によって利用されることができ、いくつかの例が以下に与えられる。
【０１０６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される通り、句「植物プロモーター」又は「プロモーター」は、植物細胞（ＤＮＡ含有オルガネラを含む）中での遺伝子発現を指図することができるプロモーターを含む。かかるプロモーターは、植物、細菌、ウイルス、真菌又は動物起源のものであることができる。かかるプロモーターは、構成的、即ち複数の植物組織中での高レベルの遺伝子発現を指図することができるか、又は組織特異的、即ち特定の植物組織での遺伝子発現を指図することができるか、又は誘導性、即ち刺激の下で遺伝子発現を指図することができるか、又はキメラ、即ち少なくとも二つの異なるプロモーターの部分から形成されるものであることができる。
【０１０７】
従って、使用される植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、又はキメラプロモーターであることができる。
【０１０８】
構成的植物プロモーターの例は、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＦＭＶ３４Ｓプロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルスプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、アラビドプシスＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチンプロモーター、アラビドプシスユビキチンＵＢＱ１プロモーター、大麦葉チオニンＢＴＨ６プロモーター、及びイネアクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
組織特異的プロモーターの例は、マメファゼオリン貯蔵タンパク質プロモーター、ＤＬＥＣプロモーター、ＰＨＳプロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質プロモーター、ダイズからのコングルチンガンマプロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子プロモーター、アラビドプシスからのＡＣＴ１１アクチンプロモーター、ブラシカ ナプスからのｎａｐＡプロモーター、及びジャガイモパタチン遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０１１０】
誘導性プロモーターは、例えば光、温度、化学物質、渇水、高塩分、浸透圧ショック、酸化的条件又は病原体を含むストレス条件の如き特定の刺激によって誘導されるプロモーターであり、エンドウマメｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子由来のプロモーター、渇水時に活性となるプロモーターＤＲＥ，ＭＹＣ及びＭＹＢ、高塩分及び浸透圧ストレス時に活性となるプロモーターＩＮＴ，ＩＮＰＳ，ｐｒｘＥａ，Ｈａ ｈｓｐ１７．７Ｇ４及びＲＤ２１、及び病原体ストレス時に活性となるプロモーターｈｓｒ２０３Ｊ及びｓｔｒ２４６Ｃを含むがこれらに限定されない。
【０１１１】
好ましくは、本発明によって利用されるプロモーターは、挿入された構築物の過剰発現が植物の形質転換後に行われるような強い構成的プロモーターである。
【０１１２】
本発明で使用されるいかなる構築物型も、各構築物型において同一又は異なる選択マーカーを使用して同一植物中へと共形質転換されることができることは理解されるであろう。代わりに、第一の構築物型が第一植物中に導入され、第二の構築物型が第二同系植物中に導入され、その後、生じたトランスジェニック植物が交配され、子孫が二重形質転換体について選択されることができる。かかる子孫のさらなる自家交配は、両方の構築物について同型接合体である遺伝系統を作成するために使用されることができる。
【０１１３】
単子葉植物及び双子葉植物の両方に核酸構築物を導入する様々な方法がある（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４−２７６）。かかる方法は、核酸構築物又はその一部の植物ゲノム中への安定な組込み又は核酸構築物の一過性発現に依存しており、後者の場合、これらの配列は植物の子孫には遺伝しない。
【０１１４】
加えて、核酸構築物が、葉緑体の如きＤＮＡ含有オルガネラのＤＮＡ中に直接導入されることができるいくつかの方法がある。
【０１１５】
本発明の核酸構築物の中に含まれるような外因性配列を植物ゲノム中に安定に組込むためには二つの原理的な方法がある：
【０１１６】
（ｉ）アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子移入：Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７−４８６；Ｋｌｅｅ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．２−２５；Ｇａｔｅｎｂｙ，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｕｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９８９）ｐ．９３−１１２。
【０１１７】
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．５２−６８；この方法は、プロトプラストへＤＮＡを直接取込むための方法を含む：Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０７２−１０７４。植物細胞の短い電気ショックによって誘導されるＤＮＡ取込み：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９−３８４．Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１−７９３。粒子衝撃による植物細胞又は組織中へのＤＮＡ注入：Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９−５６３；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３−９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６−２０９。マイクロピペット系の使用による植物細胞又は組織中へのＤＮＡ注入：Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０−３６；Ｎｅｕｈａｕｓ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３−２１７。又は発芽花粉とのＤＮＡの直接培養による植物細胞又は組織中へのＤＮＡ注入：ＤｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ，ｅｄｓ．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｍａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８５）ｐ．１９７−２０９；ａｎｄ Ｏｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５−７１９。
【０１１８】
アグロバクテリウム系は、植物ゲノムＤＮＡ中に組込まれる限定されたＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の接種方法は、植物種及びアグロバクテリウム送達系によって異なる。幅広く使用されているアプローチは、リーフディスク手順であり、これは植物全体への分化を開始するのに良好な源を提供するいかなる組織外植体を用いて行われることができる。Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）ｐ．１−９参照。補助的なアプローチは、アグロバクテリウム送達系を減圧浸潤との組合せで使用する。アグロバクテリウム系は、トランスジェニック双子葉植物の作成において特に実行可能である。
【０１１９】
植物細胞中への直接ＤＮＡ移入には様々な方法がある。エレクトロポレーションでは、プロトプラストは強い電場に短時間さらされる。マイクロ注入では、ＤＮＡは極めて小さいマイクロピペットを使用して細胞中へ直接機械的に注入される。微小粒子衝撃では、ＤＮＡは硫酸マグネシウムの結晶、タングステン粒子又は金粒子の如き微小投射物に吸着され、この微小投射物が細胞又は植物組織中へと物理的に加速される。
【０１２０】
形質転換後、植物の繁殖が行われる。植物繁殖の最も一般的な方法は種子による方法である。しかし、種子繁殖による再生は、異型接合性のため作物には均一性の欠失があるという欠点を有する。何故なら種子は、メンデルの法則によって支配される遺伝的変異に従って植物によって生産されるからである。基本的に、各種子は遺伝的に異なり、各種子はそれ自身の特異的な形質を有して成長するであろう。従って、形質転換植物は、再生された植物が親のトランスジェニック植物と同一の形質及び特徴を有するように生産されることが好ましい。それ故、形質転換植物は、形質転換植物の迅速で一貫した再生を与える微小繁殖によって再生されることが好ましい。
【０１２１】
本発明の核酸構築物内に含まれる単離された核酸を一過的に発現させるために利用されることができる一過的発現方法は、上述のマイクロ注入及び衝撃（しかし一過的発現が好ましい条件下で）、及びウイルスによって媒介される発現を含むがこれらに限定されない。ウイルスによって媒介される発現では、核酸構築物を含むパッケージ化された又はパッケージ化されていない組換えウイルスベクターが植物組織又は細胞を感染させるために利用され、そこに確立された繁殖する組換えウイルスが非ウイルス性核酸配列を発現する。
【０１２２】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスはＣａＭＶ，ＴＭＶ及びＢＶを含む。植物ウイルスを使用した植物の形質転換は、米国特許第４８８５２３７号（ＢＧＶ），ＥＰ−Ａ６７５５３（ＴＭＶ）、日本国公開特許公報第６３−１４６９３号（ＴＭＶ），ＥＰＡ第１９４８０９号（ＢＶ），ＥＰＡ第２７８６６７号（ＢＶ）及びＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７２−１８９（１９８８）に記述されている。植物を含む多くの宿主中で外来ＤＮＡを発現させるのに使用するためのシュードウイルス粒子は、ＷＯ ８７／０６２６１に記述されている。
【０１２３】
植物中に非ウイスル性外因性核酸配列を導入して発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上述の文献並びにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ｅｒ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５−２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：３０７−３１１；Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４−１２９７；ａｎｄ Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３−７６によって示されている。
【０１２４】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、構築はウイルス自体に対してなされることができる。代わりに、ウイルスは、外来ＤＮＡを有する望ましいウイルスベクターを構築するのが容易なように細菌プラスミド中へとまずクローニングされることができる。次にウイルスはプラスミドから切り出されることができる。もしウイルスがＤＮＡウイルスであるなら、細菌の複製起点がウイルスＤＮＡに取付けられることができ、ウイルスＤＮＡは細菌によって複製されることができる。このＤＮＡの転写及び翻訳は、ウイルスＤＮＡを包囲するコートタンパク質を生産するであろう。もしウイルスがＲＮＡウイルスであるなら、ウイルスは一般的にｃＤＮＡとしてクローニングされ、プラスミド中に挿入される。次にプラスミドは構築物のすべてを作るために使用される。次にＲＮＡウイルスは、プラスミドのウイルス配列を転写することよって及びウイルス遺伝子を翻訳してウイルスＲＮＡを包囲するコートタンパク質を生産することによって生産される。
【０１２５】
本発明の構築物中に含まれるような非ウイルス性外因性核酸配列の植物中への導入及び発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上述の文献並びに米国特許第５３１６９３１号によって示されている。
【０１２６】
一つの実施態様では、生来的コートタンパク質コード配列がウイルス核酸から欠失されており、かつ植物宿主中での発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング及び組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染を確実にすることができる非生来的プロモーター、好ましくは非生来的コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターが挿入されている植物ウイルス核酸が提供される。代わりに、コートタンパク質遺伝子は、タンパク質が生産されるようにその中に非生来的核酸を挿入することによって不活性化されることができる。組換え植物ウイルス核酸は一以上の追加の非生来的サブゲノムプロモーターを含むことができる。それぞれの非生来的サブゲノムプロモーターは、植物宿主中の隣接遺伝子又は核酸配列を転写又は発現させることができるが、相互に及び生来的サブゲノムプロモーターと組換えられることができない。非生来的（外来性）核酸配列は、一以上の核酸配列が含められる場合、生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーター又は生来的な及び非生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入されることができる。非生来的核酸配列はサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物中で転写又は発現され、望ましい生成物を生産する。
【０１２７】
第二の実施態様では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列の代わりに非生来的なコートタンパク質サブゲノムプロモーターの一つに隣接して配置されていることを除いては第一の実施態様と同様の組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０１２８】
第三の実施態様では、生来的なコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接されておりかつ一以上の非生来的サブゲノムプロモーターがウイルス核酸中に挿入されている組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非生来サブゲノムプロモーターは、隣接遺伝子を転写又は発現させることができるが、相互に及び生来的サブゲノムプロモーターと組換えられることができない。非生来的な核酸配列は、前記配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物中で転写又は発現され、望ましい生成物を生産するように非生来的なサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入されることができる。
【０１２９】
第四の実施態様では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列によって置換されていることを除いては第三の実施態様と同様の組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０１３０】
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸によってコードされるコートタンパク質によって包囲されて組換え植物ウイルスを生産する。組換え植物ウイルス核酸又は組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物を感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸は、宿主中で複製し、宿主中に全身的に広がり、宿主中で外来遺伝子（単離された核酸）を転写又は発現させて望ましいタンパク質を生産することができる。
【０１３１】
外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための技術が知られている。この技術は下記の手順を伴う。第１に、植物細胞が、細胞あたりの葉緑体の数を約１個に減らすように化学的に処理される。その後、外因性核酸が、少なくとも１つの外因性核酸分子を葉緑体に導入することを目指して、粒子衝撃によって細胞に導入される。外因性核酸は、相同的組換え（これは葉緑体に固有の酵素によって容易に行われる）による葉緑体ゲノムへの組込みを可能にするように選択される。この目的のために、外因性核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体ゲノムに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。加えて、外因性核酸は選択マーカーを含み、そのような選択マーカーは、逐次的な選抜手法によって、そのような選抜の後の葉緑体ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのコピー体が外因性核酸を含むことを確認するために役立つ。この技術に関するさらなる詳細が、米国特許第４９４５０５０号および同第５６９３５０７号に見出される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させることができ、かつ、葉緑体の内膜に一体化させることができる。
【０１３２】
上述の形質転換アプローチは、いかなる種の植物又はそこから由来する植物組織もしくは単離された植物細胞においてコラーゲン鎖及び／又は修飾酵素並びに会合されたコラーゲン（プロペプチドあり又はなし）を生産するために使用されることができる。
【０１３３】
好ましい植物は、本明細書に記述されたコラーゲン鎖、コラーゲン及び／又は処理酵素を多量に蓄積することができるものである。かかる植物は、ストレス条件に対するそれらの抵抗性及び発現された成分又は会合されたコラーゲンが抽出される容易さに従って選択されることもできる。好ましい植物の例は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、ニンジン及び綿を含む。
【０１３４】
コラーゲン線維は、食品及び化粧品産業で広範囲に使用される。従って、植物によって発現されるコラーゲン線維成分（アルファ鎖）及び修飾酵素はコラーゲンの産業的合成において有用性を見出し、植物中での完全なコラーゲンの生産は、その簡単さ及び費用効率のために好ましい。
【０１３５】
植物中でＩ型コラーゲンを生成するためにいくつかのアプローチが使用されることができる。例えば、コラーゲンアルファ１鎖は、コラーゲンアルファ１及びＰ４Ｈ（及び所望によりＬＨ３）を発現する植物から単離されることができ、コラーゲンアルファ２及びＰ４Ｈ（及び所望によりＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する植物から単離されるコラーゲンアルファ２鎖と混合されることができる。コラーゲンアルファ１鎖はそれ自身によって三重らせんへと自己会合するため、混合前にかかるホモトリマーを変性させてコラーゲンアルファ２鎖と共に再生することが必要であるかもしれない。
【０１３６】
好ましくは、コラーゲンアルファ１及びＰ４Ｈ（及び所望によりＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する第一植物は、コラーゲンアルファ２を発現する第二（及び好ましくは同系の）植物と交配されることができるか、又は代わりに両アルファ鎖を発現する第一植物は、Ｐ４Ｈ及び所望によりＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はＮを発現する第二植物と交配されることができる。
【０１３７】
上述の植物育種アプローチは二つの個別に形質転換された植物を利用するが、それぞれが一つ又は二つの成分を発現する三つ以上の個別に形質転換された植物を利用するアプローチも利用できるということは注意されるべきである。
【０１３８】
当業者は様々な植物育種技術に精通しているであろう。従って、かかる技術のさらなる記述は本明細書中では与えられない。
【０１３９】
植物育種アプローチが好ましいが、コラーゲンアルファ１及び２、Ｐ４Ｈ及びＬＨ３（及び所望によりプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する単一の植物が、それぞれが一以上の発現可能な成分を細胞中に導入するために設計されているいくつかの形質転換事象を介して作成されることができることに注意すべきである。かかる場合には、各形質転換事象の安定性は特異的な選択マーカーを使用して確認されることができる。
【０１４０】
いかなる場合でも、形質転換及び植物育種アプローチはいかなる数の成分を発現するいかなる植物を作成するために使用されることができる。現在好まれているものはコラーゲンアルファ１及び２鎖、Ｐ４Ｈ，ＬＨ３及び少なくとも一つのプロテアーゼ（例えばプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する植物である。以下の実施例の節でさらに記述されるように、かかる植物は４２℃までの温度で安定性を示すコラーゲンを蓄積する。
【０１４１】
育種から生じた子孫又は代わりに多数回形質転換植物は、核酸又はタンパク質プローブ（例えば抗体）を使用して外因性ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの存在を確認することによって選択されることができる。後者のアプローチが好ましい。何故なら、それは発現されたポリペプチド成分の局在化を可能にし（例えば分別された植物抽出物をプロービングすることによって）、従って、正確な処理及び会合についての可能性も確認するからである。好適なプローブの例は以下の実施例の節に与えられる。
【０１４２】
一旦コラーゲンを発現する子孫が同定されたら、かかる植物はコラーゲン鎖ならびに修飾酵素の発現を最大にする条件下でさらに栽培される。
【０１４３】
遊離プロリンの蓄積は、本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるコラーゲン鎖を含む様々なプロリンリッチタンパク質の過剰生産を容易にすることができ、好ましい栽培条件は栽培された植物中での遊離プロリンの蓄積を増大させるようなものである。
【０１４４】
遊離プロリンの蓄積は、渇水、塩分、低温、高温、病原体感染、重金属毒性、嫌気生活、栄養欠乏、大気汚染及びＵＶ照射を含む広範囲の環境ストレスに対する応答において様々な植物中に蓄積する（Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｃｒｅｓｓ，１９９７年）。
【０１４５】
遊離プロリンは、ＡＢＡの如き化合物での植物又は土壌の処理に対する応答において又は銅、塩、パラコート、サリチル酸などの如き化合物を含むストレスに対する応答においても蓄積することがあり得る。
【０１４６】
従って、コラーゲンを発現する子孫は様々なストレス条件（例えば５０ｍＭから２５０ｍＭまでの範囲のＮａＣｌの異なる濃度）下で生長させられることができる。コラーゲン生産をさらに増大させるために、コラーゲン発現に対する様々なストレス条件の影響が調査され、植物の生存性、バイオマス及びコラーゲン蓄積に関して最適化されるであろう。
【０１４７】
植物組織／細胞は成熟時に収穫されることが好ましく、コラーゲン線維は周知の従来技術の抽出アプローチを使用して単離され、一つのかかるアプローチが以下に詳述される。
【０１４８】
形質転換植物の葉は液体窒素下で粉末へと磨砕され、ホモジネートは０．２ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍ酢酸中で６０時間４℃で抽出される。不溶性材料は遠心分離によって除去される。組換えコラーゲンを含む上澄みは０．４Ｍ及び０．７ＭのＮａＣｌで塩分画される。組換えヘテロトリマーコラーゲンを含む０．７Ｍ ＮａＣｌ沈殿は０．１Ｍの酢酸中に溶解されてこれに対して透析され、−２０℃で貯蔵される（Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、２０００年に従う）。
【０１４９】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１５０】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１５１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ著、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（第３版）Ｎ．Ｙ．（１９９４年）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１５２】
実施例１
構築及び形質転換スキーム
本研究で使用された発現カセットの構築は図１ａ−ｄに示されている。本研究におけるコード配列のすべては、タバコ中での発現のために最適化され、望ましいフランキング領域（配列番号１，４，７，１２，１４，１６，１８，２０，２２）を有するように化学的に合成された。図１ａ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合された又はシグナルなしのＣｏｌ１及びＣｏｌ２（配列番号１，４）をコードする合成遺伝子は、キクｒｂｃＳ１プロモーター及び５′ＵＴＲ（配列番号１０）並びにキクｒｂｃＳ１ ３′ＵＴＲ及びターミネーター（配列番号１１）からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはｐＢＩＮＰＬＵＳ植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ４：２８８−２９０）。図１ｂ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合された又はシグナルなしのＰ４Ｈベータヒト、Ｐ４Ｈアルファヒト及びＰ４Ｈ植物（配列番号１２，１４及び１６）をコードする合成遺伝子は、ベクターｐＪＤ３３０によって担持されるＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及びＴＭＶオメガ配列及びアグロバクテリウムノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ターミネーターからなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットは、Ｃｏｌ１又はＣｏｌ２の発現ベクターを担持するｐＢＩＮＰＬＵＳベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図１ｃ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合されたプロテイナーゼＣ及びプロテイナーゼＮ（配列番号１８，２０）をコードする合成遺伝子は、キクｒｂｃＳ１プロモーター及び５′ＵＴＲ（配列番号１０）並びにキクｒｂｃＳ１ ３′ＵＴＲ及びターミネーター（配列番号１１）からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはｐＢＩＮＰＬＵＳ植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図１ｄ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合された又はシグナルなしのＬＨ３（配列番号２２）をコードする合成遺伝子（フランキングイチゴツル結合ウイルス（ＳＶＢＶ）プロモーター（ＮＣＢＩアクセッションＡＦ３３１６６６ ＲＥＧＩＯＮ：６２３．．９５０バージョンＡＦ３３１６６６．１ ＧＩ：１３３４５７８８）を有しかつアグロバクテリウムオクトピン合成酵素（ＯＣＳ）ターミネーター（ＮＣＢＩアクセッションＺ３７５１５ ＲＥＧＩＯＮ：１３４４．．１５３８バージョンＺ３７５１５．１ ＧＩ：８８６８４３）で末端停止されている）は、Ｃｏｌ１及びＰ４Ｈベータの発現カセットを担持するｐＢＩＮＰＬＵＳベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。
【０１５３】
図１に記述される発現カセットを利用した宿主植物中への共形質転換スキームは図２に図示される。各発現カセット挿入物はコード配列の短い名前によって表される。コード配列及び関連する配列番号は表１に記載されている。それぞれの共形質転換は二つのｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクターによって行われる。それぞれの長方形は一つ、二つ又は三つの発現カセットを担持する単一のｐＢＩＮＰＬＵＳベクターを表す。プロモーター及びターミネーターは図１で特定される。
【０１５４】
実施例２
植物コラーゲン発現
以下の表１に提示されるタンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド配列が設計され、タバコ植物中での発現のために最適化された。
【０１５５】
【０１５６】
シグナルペプチド
（ｉ）チオールプロテアーゼアレウレイン（ａｌｅｕｒａｉｎ）前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列（ＮＣＢＩアクセッションＰ０５１６７ ＧＩ：１１３６０３）
（ｉｉ）アラビドプシスタリアーナのエンド１，４−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナル（Ｃｅｌ１、ＮＣＢＩアクセッションＣＡＡ６７１５６．１ ＧＩ：２４４００３３）；配列番号９、配列番号７によってコードされる
【０１５７】
プラスミドの構築
植物発現ベクターは実施例１に教示されるようにして構築された。それぞれの構築された発現ベクターの組成は制限酵素分析及び配列決定を介して確認された。
【０１５８】
以下の発現カセットを含む発現ベクターが構築された：
１．コラーゲンアルファ１
２．コラーゲンアルファ１＋ヒトＰ４Ｈベータサブユニット
３．コラーゲンアルファ１＋ヒトＰ４Ｈベータサブユニット＋ヒトＬＨ３
４．コラーゲンアルファ２
５．コラーゲンアルファ２＋ヒトＰ４Ｈアルファサブユニット
６．コラーゲンアルファ２＋アラビドプシスＰ４Ｈ
７．ヒトＰ４Ｈベータサブユニット＋ヒトＬＨ３
８．ヒトＰ４Ｈアルファサブユニット
上述のコード配列のそれぞれは、液胞輸送ペプチドもしくはアポプラスト輸送ペプチドに翻訳的に融合されたか、又はいかなる輸送ペプチド配列も欠いており、その場合、細胞質蓄積が期待される。
【０１５９】
植物形質転換及びＰＣＲスクリーニング
タバコ植物（ニコチアーナ・タバクム、Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ）は、図２に教示される形質転換スキームに従って上述の発現ベクターで形質転換された。
【０１６０】
生じた形質転換植物は、コラーゲンアルファ１の３２４ｂｐフラグメント及びコラーゲンアルファ２の５３７ｂｐフラグメントを増幅することができるように設計された四つのプライマー（表２）を使用したマルチプレックスＰＣＲを介してスクリーニングされた。図３は一つのマルチプレックスＰＣＲスクリーニングの結果を示す。
【０１６１】
【０１６２】
実施例３
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトコラーゲンの検出
全可溶性タンパク質は、「完全な」プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨからの製造＃１８３６１４５、５０ｍｌの緩衝液あたり一錠）を使用して０．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中で５００ｍｇの葉を粉砕することによってタバコ形質転換体２，３及び４から抽出された。粗抽出物は、１０％ベータ−メルカプト−エタノール及び８％ＳＤＳを含む２５０μｌの４Ｘサンプル適用緩衝液と混合され、サンプルは７分間沸騰され、１３０００ｒｐｍで８分間遠心分離された。２０μｌの上澄みは１０％ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンＩ（変性）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた（図４）。Ｗ．Ｔ．は野生型タバコである。陽性コラーゲンバンドは、コラーゲンＩ型アルファ１又はアルファ２又は両方についてＰＣＲ陽性である植物において見ることができる。ヒト胎盤（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）からの５００ｎｇのコラーゲンＩ型の陽性コントロールバンドは、トランスジェニック植物からのサンプル中の約０．３％の全可溶性タンパク質（約１５０μｇ）を表す。
【０１６３】
全可溶性タンパク質の１％までの予測される分子量でコラーゲンを発現する植物は、コラーゲンが液胞に対して標準化された場合に検出された（図４）。アポプラストに対する全長コラーゲンの細胞内標的化は成功裏に達成された（図５）。細胞質中でコラーゲンを発現する植物（即ち標的化ペプチドなし）は、コラーゲンを検出可能なレベルに蓄積せず、植物中でのコラーゲンの細胞内標的化は成功のために重要であることを示した。
【０１６４】
Ｎ−プロペプチドを欠くコラーゲンが有意なタンパク質分解に供されることを示すＲｕｇｇｉｅｒｏら２０００年及びＭｅｒｌｅら２００２年の研究に加えて及びこれらの研究とは対照的に、現在のアプローチを使用すると、Ｃ−プロペプチド及びＮ−プロペプチドを有する全長コラーゲンタンパク質は高レベルで細胞内区画中に蓄積した。
【０１６５】
本データはまた、それぞれが異なるコラーゲン鎖型を発現する二つの植物を交配することは、それぞれの鎖型を最適レベルで発現する植物の選択及び望ましいコラーゲン生産植物を達成するための続く植物交配を可能にする点で有利であるということを明らかに示す。
【０１６６】
本発明の植物によって生産されるコラーゲンは、生来的なプロペプチドを含み、従って、タンパク質分解によって精製されたヒトのコントロールタンパク質より大きなタンパク質を形成すると予測される。ヒドロキシル化又はグリコシル化を有さないコラーゲンアルファ１及びアルファ２鎖の計算される分子量は以下の通りである：プロペプチドを有するＣｏｌ１−１３６ｋＤａ、プロペプチドを有さないＣｏｌ１−９５ｋＤａ、プロペプチドを有するＣｏｌ２−１２７ｋＤａ、プロペプチドを有さないＣｏｌ２−９２ｋＤａ。
【０１６７】
図４からわかるように、形質転換体３−５及び３−４９中のＣｏｌ１バンドは他の植物中のＣｏｌ１バンドより大きく見える。これは、これらの植物中で共発現されてヒトコラーゲン鎖と同じ細胞内区画（例えば液胞）に対して標的化されたアルファ及びベータサブユニットからなるヒトプロリン−４−ヒドロキシラーゼホロ酵素によってコラーゲン鎖中でプロリンがヒドロキシル化されることを示す。
【０１６８】
実施例４
コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中での熱安定性
コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中でのらせん熱安定性は、トランスジェニック植物の全粗タンパク質抽出物の熱変性及び続くトリプシン又はペプシン消化によってテストされた（図６ａ〜ｂ）。第一の実験では、タバコ２−９（Ｃｏｌアルファ１のみを発現し、Ｐ４Ｈを発現しない）及びタバコ３−５（Ｃｏｌアルファ＋２及びＰ４Ｈの両方を発現する）からの全可溶性タンパク質は、０．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５中で５００ｍｇの葉を粉砕して１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを収集することによって抽出された。５０μｌの上澄みは熱処理（３３℃又は４３℃で１５分間）に供され、次に直ちに氷上に置かれた。トリプシン消化は、各サンプルに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５中の１ｍｇ／ｍｌトリプシン６μｌを添加することによって開始された。サンプルは室温（約２２℃）で２０分間インキュベートされた。消化は、１０％ベータメルカプトエタノール及び８％ＳＤＳを含む２０μｌの４Ｘサンプル適用緩衝液の添加によって停止され、サンプルは７分間沸騰され、１３０００ｒｐｍで７分間遠心分離された。５０μｌの上澄みは１０％ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた。陽性コントロールは、ｗ．ｔ．タバコから抽出された５０μｌの全可溶性タンパク質に添加された約５００ｎｇのヒトコラーゲンＩ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０であり、ペプシン消化によってヒト胎盤から抽出されたもの）のサンプルであった。
【０１６９】
図６ａに示されるように、植物＃３−５中で形成されたコラーゲン三重らせん並びにコントロールのヒトコラーゲンは３３℃での変性に対して抵抗性であった。対照的に、植物＃２−９によって形成されたコラーゲンは３３℃で変性した。熱安定性におけるこの相違は、コラーゲンアルファ１及びコラーゲンアルファ２並びにＰ４Ｈベータ及びアルファサブユニットの両方を発現する形質転換体＃３−５中での成功した三重らせん会合及び翻訳後のプロリンヒドロキシル化を示唆する。
【０１７０】
形質転換体＃２−９における二つのバンドはダイマー又はトリマーを表すかもしれず、これらはＳＤＳ及びメルカプトエタノールを使用した７分間の沸騰後も安定である。同様のバンドがヒトのコラーゲン（上部パネル）において及び形質転換体＃３−５において見ることができる。可能な説明は、異なる三重らせん中の二つのペプチドの間の等価なバンド（クロスリンク）がリシンオキシダーゼによる二つのリシンの酸化的脱アミノ化後に形成されたということである。第二の実験では、トランスジェニックタバコ１３−６（コラーゲンＩアルファ１及びアルファ２鎖（矢印によって示される）、ヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びヒトＬＨ３を発現する）からの全可溶性タンパク質は、０．５ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５及び３００ｍＭ ＮａＣｌ中で５００ｍｇの葉を粉砕して１００００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上澄みを収集することによって抽出された。５０μｌの上澄みは熱処理（３３℃、３８℃又は４２℃で２０分間）に供され、次に直ちに氷上に置かれた。ペプシン消化は、各サンプルに０．１Ｍ ＨＣｌ４．５μｌ及び１０ｍＭ酢酸中の２．５ｍｇ／ｍｌペプシン４μｌを添加することによって開始された。サンプルは室温（約２２℃）で３０分間インキュベートされた。消化は、５μｌの非緩衝化１Ｍ Ｔｒｉｓを添加することによって停止された。各サンプルは、１０％ベータメルカプトエタノール及び８％ＳＤＳを含む２２μｌの４Ｘサンプル適用緩衝液と混合され、７分間沸騰され、１３０００ｒｐｍで７分間遠心分離された。４０μｌの上澄みは１０％ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた。陽性コントロールは、ｗ．ｔ．タバコから抽出された全可溶性タンパク質に添加された約５０ｎｇのヒトコラーゲン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０であり、ペプシン消化によってヒト胎盤から抽出されたもの）のサンプルであった。
【０１７１】
図６ｂに示されるように、植物＃１３−６中で形成されたコラーゲン三重らせんは４２℃での変性に対して抵抗性であった。プロペプチドの開裂は、３３℃でまず見ることができ、温度が３８℃に上昇したとき及び４２℃に上昇したとき再び効果的に徐々に増大する。開裂されたコラーゲン三重らせんドメインは、ペプシン処理されたヒトコラーゲンのゲル上での移動と同様の移動を示す。この実験で使用されたヒトコラーゲンは、ペプシンタンパク質分解によってヒト胎盤から抽出されたものであり、従ってプロペプチド及びいくつかのテロペプチドを欠いている。
【０１７２】
実施例５
植物のＰ４Ｈ発現
生来的な植物Ｐ４Ｈの誘導
タバコＰ４Ｈ ｃＤＮＡは、クローニングされ、内因性Ｐ４Ｈ発現を誘導する条件及び処理を決定するためのプローブとして使用された。ノーザンブロット分析（図７）は、Ｐ４Ｈは茎頂では比較的高レベルでそして葉では低レベルで発現されることを明らかに示す。Ｐ４Ｈレベルは擦傷処理（下方パネルの「傷つけられた」）の４時間後に葉で有意に誘導された。同様の結果が他のストレス条件を使用して達成された（図示せず）。
【０１７３】
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びコラーゲンアルファ１及びアルファ２の検出
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びコラーゲンアルファ１及びアルファ２鎖の検出は、抗ヒトＰ４Ｈアルファサブユニット抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．からの＃６３−１６３）、抗ヒトＰ４Ｈベータサブユニット抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＭＡＢ２７０１）及び抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して行われた。これらの抗体でプローブされたウェスタンブロットの結果は図８に示される。
【０１７４】
Ｐ４Ｈアルファ、Ｐ４Ｈベータ及びコラーゲンＩアルファ１及びアルファ２バンドの発現は植物１３−６（ヒトＬＨ３でも形質転換されている）中で確認された。液胞シグナルペプチドを含むＰ４Ｈアルファ及びベータの計算された分子量はそれぞれ、６５．５ｋＤａ及び５３．４ｋＤａである。プロペプチドを有する、ヒドロキシル化又はグリコシル化を有さないコラーゲンアルファ１及びアルファ２鎖の計算された分子量はそれぞれ、１３６ｋＤａ及び１２７ｋＤａである。
【０１７５】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１７６】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０１７７】
【配列表フリーテキスト】
【０１７８】
配列番号１は、ヒトコラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２及び３は、ヒトコラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号４及び６は、ヒトコラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号５は、ヒトコラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号７は、アラビドプシスタリアーナのエンド−１，４−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナルのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号８及び９は、アラビドプシスタリアーナのエンド−１，４−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナル及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号１０は、キクｒｂｃＳ１プロモーター及び５′ＵＴＲの配列である。
配列番号１１は、キクｒｂｃＳ１ ３′ＵＴＲ及びターミネーターの配列である。
配列番号１２は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼベータサブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１３は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼベータサブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１４は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼアルファ−１サブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１５は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼアルファ−１サブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１６は、植物プロリル４−ヒドロキシラーゼに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１７は、植物プロリル４−ヒドロキシラーゼに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１８及び１９は、ヒトプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２０及び２１は、ヒトプロコラーゲンＩ Ｎ−プロテイナーゼのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２２は、ヒトリシルヒドロキシラーゼ３に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２３は、ヒトリシルヒドロキシラーゼ３に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２４は、チオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列である。
配列番号２５〜２８は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン生産植物及びその作成方法及びその使用に関する。特に、本発明は、生来的な三重らせんＩ型コラーゲン線維を形成することができる高レベルにヒドロキシル化されたコラーゲン鎖を生産することができる植物を作成するための新規のアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、脊椎動物及び多くの他の多細胞生物の構造的完全性を担う主要な構造タンパク質である。Ｉ型コラーゲンは原型線維状コラーゲンを表し、大部分の組織における主要なコラーゲン型である。
【０００３】
Ｉ型コラーゲンは、骨及び腱の優勢なコラーゲン成分であり、皮膚、大動脈及び肺に多量に見出される。Ｉ型コラーゲン線維は、大きな引張り強度及び限定された伸度を与える。Ｉ型コラーゲンの最も豊富な分子形態は、二つの異なるアルファ鎖［アルファ１（Ｉ）］２及びアルファ２（Ｉ）からなるヘテロトリマーである（Ｉｎｋｉｎｅｎ、２００３年）。すべての線維状コラーゲン分子は、繰返しＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットから構築される三つのポリペプチド鎖を含み、ここでＸ及びＹはいかなるアミノ酸であることができるが、イミノ酸プロリン及びヒドロキシプロリンであることが多い。
【０００４】
原線維形成コラーゲン（線維状コラーゲン）は、球状Ｎ及びＣ末端延長プロペプチドを含む前駆体プロコラーゲンとして合成される。プロコラーゲンの生合成は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化及び鎖内及び鎖間ジスルフィド結合の形成を含む多数の異なる翻訳後修飾が関与する複雑な過程である。これらの修飾を行う酵素は、協調した様式で作用し、正確にアラインメントされた熱的に安定な三重らせん分子の折畳み及び会合を確実にする。
【０００５】
各プロコラーゲン分子は、三つの構成的ポリペプチド鎖から大まかな小胞体内で会合する。ポリペプチド鎖が小胞体の膜を横切って共翻訳的に転位されるにつれて、プロリン及びリシン残基のヒドロキシル化がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ繰返し領域内で起こる。一旦ポリペプチド鎖が小胞体の管腔中に十分に転位されたら、Ｃプロペプチドが折畳まれる。次に三つのプロアルファ鎖がそれらのＣプロペプチドを介して会合し、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ繰返し領域がそのＣ末端に核形成点を形成して鎖の正確なアラインメントを確実にすることを可能にするトリマー分子を形成する。次にＧｌｙ−Ｘ−Ｙ領域はＣからＮ方向に折畳まれ、三重らせんを形成する。
【０００６】
ポリペプチド鎖修飾と三重らせん形成との間の時間的な関係は重大である。何故なら、プロリン残基のヒドロキシル化は体温での三重らせんの安定性を確実にするために必要であり、一旦形成されると三重らせんはヒドロキシル化酵素のための基質としてもはや作用しないからである。Ｃプロペプチド（及びより少ない程度のＮプロペプチド）は、プロコラーゲンが細胞を通過する間、プロコラーゲンを可溶性に維持する（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。細胞外マトリックス中へのプロコラーゲン分子の分泌後又は分泌中、プロペプチドはプロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによって除去され、それにより原線維へのコラーゲン分子の自発的な自己会合を引き起す（Ｈｕｌｍｅｓ、２００２年）。プロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによるプロペプチドの除去は、プロコラーゲンの可溶性を１００００倍以上低下させ、コラーゲンの線維への自己会合を開始するのに必要かつ十分である。この会合過程にとって重要なのは、三重らせんドメインの終わりに位置する短い非三重らせんペプチド（テロペプチドと称される）であり、これは、原線維構造内のコラーゲン分子の正確な位置決めを確実にし、自己会合のための臨界濃度を低下させる（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。天然では、コラーゲンの三重らせん構造の安定性は、酵素プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）によりプロリンがヒドロキシル化されてコラーゲン鎖内にヒドロキシプロリン残基を形成することを必要とする。
【０００７】
コラーゲン鎖を発現する植物は当該技術分野で知られており、例えば米国特許第６６１７４３１号及び（Ｍｅｒｌｅら、２００２年、Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、２０００年）を参照できる。植物はヒドロキシプロリン含有タンパク質を合成することができるが、植物細胞中のヒドロキシプロリンの合成のために必要なプロリルヒドロキシラーゼは、哺乳類のＰ４Ｈと比較して比較的ゆるい基質配列特異性を示し、従って、Ｇｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置のみにヒドロキシプロリンを含むコラーゲンの生産は、コラーゲン及びＰ４Ｈ遺伝子の植物中での共発現を必要とする（Ｏｌｓｅｎら、２００３年）。
【０００８】
植物中に天然に存在するヒドロキシル化作用機構に依存してヒトコラーゲンを生産する試みは、プロリンのヒドロキシル化が不十分なコラーゲンを生じた（Ｍｅｒｌｅら、２００２年）。かかるコラーゲンは、３０℃より下の温度で溶解するか又はその三重らせん構造を失う。コラーゲン及びプロリルヒドロキシラーゼの共発現は、体温での用途のために生物学的に意味のある安定なヒドロキシル化コラーゲンを生じる（Ｍｅｒｌｅら、２０００２年）。
【０００９】
リシルヒロドキシラーゼ（ＬＨ，ＥＣ １．１４．１１．４）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．５０）及びグルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．６６）は、コラーゲンの翻訳後修飾に関与する酵素である。これらは特定位置のリシル残基をヒドロキシシリル、ガラクトシルヒドロキシリシル及びグルコシルガラクトシルヒドロキシリシル残基へと連続的に修飾する。これらの構造は、コラーゲンにとって特異的であり、それらの機能的活性のために必須である（Ｗａｎｇら、２００２年）。単一のヒト酵素であるリシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）は、ヒドロキシリシンに結合された炭水化物形成において三つのすべての連続的ステップを触媒することができる（Ｗａｎｇら、２００２年）。
【００１０】
タバコ中で発現されるヒトコラーゲンのヒドロキシリシンは、ウシコラーゲン中で見出されるヒドロキシリシンの２％未満を形成する（０．０４％の残基／１．８８％の残基）。これは、植物に内在するリシルヒドロキシラーゼはコラーゲン中のリシンを十分にヒドロキシル化することができないということを示唆する。
【００１１】
本発明を実施に移す際に、本発明者らは、コラーゲン鎖の効果的なヒドロキシル化は、このポリペプチドを正確に修飾することができる酵素に沿ってコラーゲン鎖を封鎖することに依存するということを発見した。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の一つの側面によれば、植物又は単離された植物細胞中でコラーゲンを生産する方法であって、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び外因性Ｐ４Ｈが蓄積することを可能にする態様で、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び前記外因性Ｐ４Ｈを植物又は単離された植物細胞中で発現させ、それにより植物中でコラーゲンを生産することを含む方法が提供される。
【００１３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるさらなる特徴によれば、方法は、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く前記細胞内区画中で外因性ＬＨ３を発現させることをさらに含む。
【００１４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００１５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００１６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００１７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００１８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００１９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００２０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ１鎖である。
【００２１】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ２鎖である。
【００２２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む。
【００２３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、植物は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、ニンジン及び綿からなる群から選択される。
【００２４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖又は前記外因性Ｐ４Ｈは、前記植物の一部分のみで発現される。
【００２５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記植物の前記一部分は、葉、種子、根、塊茎又は茎である。
【００２６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができる。
【００２７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである。
【００２８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記植物は、ストレス条件に供される。
【００２９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、寒さ及びストレス誘導性化合物の噴霧からなる群から選択される。
【００３０】
本発明の別の側面によれば、コラーゲンアルファ鎖がヒト細胞中で発現される場合に生産されるヒドロキシル化パターンと同一のヒドロキシルパターンを有するコラーゲンアルファ鎖を蓄積することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００３１】
本発明のなお別の側面によれば、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中にコラーゲンアルファ鎖を蓄積することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００３２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、遺伝的に改変された植物は、外因性Ｐ４Ｈをさらに含む。
【００３３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００３４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００３５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００３６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００３７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００３８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００３９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ鎖は、アルファ１鎖である。
【００４０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ鎖は、アルファ２鎖である。
【００４１】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む。
【００４２】
本発明のなお別の側面によれば、コラーゲンアルファ１鎖を蓄積することができる第一の遺伝的に改変された植物と、コラーゲンアルファ２鎖を蓄積することができる第二の遺伝的に改変された植物とを含む植物システムが提供される。
【００４３】
本発明のさらに別の側面によれば、コラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖を蓄積することができる第一の遺伝的に改変された植物と、Ｐ４Ｈを蓄積することができる第二の遺伝的に改変された植物とを含む植物システムが提供される。
【００４４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記第一の遺伝的に改変された植物及び前記第二の遺伝的に改変された植物の少なくとも一つは外因性Ｐ４Ｈをさらに含む。
【００４５】
本発明のさらに別の側面によれば、線維状コラーゲンの生産方法であって、（ａ）第一植物中でコラーゲンアルファ１鎖を発現させ；（ｂ）第二植物中でコラーゲンアルファ２鎖を発現させ、ただし、前記第一植物及び前記第二植物中での発現は、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖がそれぞれ、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができるように構成されており、そして（ｃ）前記第一植物と前記第二植物を交配させ、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖を発現する子孫を選択し、それにより線維状コラーゲンを生産することを含む方法が提供される。
【００４６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、方法は前記第一植物及び前記第二植物のそれぞれにおいて外因性Ｐ４Ｈを発現させることをさらに含む。
【００４７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００４８】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００４９】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中の発現を介して行われる。
【００５０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、アポプラスト又は液胞に対して標的化するためのシグナルペプチドを含む。
【００５１】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ標的化又は残留配列を欠く。
【００５２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、植物のＤＮＡ含有オルガネラ中で発現される。
【００５３】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む。
【００５４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができる。
【００５５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである。
【００５６】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記植第一植物及び前記第二植物は、ストレス条件に供される。
【００５７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、重金属毒性及び寒さストレスからなる群から選択される。
【００５８】
本発明のさらに別の側面によれば、線維状コラーゲンの生産方法であって、（ａ）第一植物中でコラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖を発現させ、ただし、前記第一植物中での発現は、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖がそれぞれ、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができるように構成されており；（ｂ）第二植物中で、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く前記細胞内区画中に蓄積することができる外因性Ｐ４Ｈを発現させ；そして（ｃ）前記第一植物と前記第二植物を交配させ、前記コラーゲンアルファ１鎖、前記コラーゲンアルファ２鎖及び前記Ｐ４Ｈを発現する子孫を選択し、それにより線維状コラーゲンを生産することを含む方法が提供される。
【００５９】
本発明のさらに別の側面によれば、植物細胞中で機能的なプロモーターの転写制御下に配置されたヒトＰ４Ｈをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
【００６０】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記プロモーターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎプロモーター、ｒｂｃＳプロモーター及びＳＶＢＶプロモーターからなる群から選択される。
【００６１】
本発明のさらに別の側面によれば、コラーゲンアルファ１鎖、コラーゲンアルファ２鎖、Ｐ４Ｈ、ＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はプロテアーゼＮを発現することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００６２】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖はそれぞれ、内因性の植物Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができる。
【００６３】
本発明のさらに別の側面によれば、哺乳類のコラーゲンの温度安定性特性と同一の温度安定性特性を有するコラーゲンを蓄積することができる遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞が提供される。
【００６４】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである。
【００６５】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンは、ヒトのコラーゲンである。
【００６６】
本発明のさらに別の側面によれば、植物中での発現のために最適化されたコラーゲンコード配列が提供される。
【００６７】
以下に記述される本発明の好ましい実施態様におけるなおさらなる特徴によれば、前記コラーゲンコード配列は配列番号１によって規定されるものである。
【００６８】
本発明は、ヒトコラーゲンの特性と同様の特性を有するコラーゲンへと会合することができる正確にヒドロキシル化されたコラーゲン鎖を発現することができる植物を提供することによって、現在知られている構成の欠点を成功裏に克服する。
【００６９】
本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似の又は均等の方法と材料は本発明を実施又は試験するのに使用できるが、適切な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法及び実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００７１】
【図１ａ】図１ａは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図１ｂ】図１ｂは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図１ｃ】図１ｃは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図１ｄ】図１ｄは、試験植物を形質転換するために使用される様々な発現カセット及びベクターの構造を示す。本研究の一部として合成されたすべてのコード配列は、タバコ中での発現のために最適化された。
【図２】図２は、様々な共形質転換アプローチを示す。それぞれの発現カセットは、コード配列の短い名称によって表される。コード配列は、表１中で特定される。それぞれの共形質転換は、二つのｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクターによって行われた。それぞれの長方形は、一つ、二つ又は三つの発現カセットを担持する単一のｐＢＩＮＰＬＵＳベクターを表す。プロモーター及びターミネーターは、実施例１で特定される。
【図３】図３は、コラーゲンアルファ１（３２４ｂｐフラグメント）又はコラーゲンアルファ２（５３７ｂｐフラグメント）又は両者について陽性である植物を示す形質転換体のマルチプレックスＰＣＲスクリーニングである。
【図４】図４は、共形質転換２，３及び４によって作成されたトランスジェニック植物のウェスタンブロット分析である。全可溶性タンパク質は、タバコ形質転換体＃２、＃３及び＃４から抽出され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を用いて試験された。サイズマーカーは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．からの＃ＳＭ０６７１であった。Ｗ．Ｔ．は野生型タバコである。陽性のコラーゲンバンドは、コラーゲンＩ型アルファ１又はアルファ２又は両者についてＰＣＲ陽性である植物において見ることができる。ヒト胎盤（ペプシン消化によってヒトの胎盤から抽出されたＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）からの５００ｎｇのコラーゲンＩ型の陽性コントロールバンドは、トランスジェニック植物からのサンプル中の全可溶性タンパク質の約０．３％（約１５０μｇ）を表す。ヒトコラーゲンサンプル中の約１４０ｋＤａの大きなバンドは、コラーゲンＩ型抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＭＡＢ１９１３）の抗カルボキシ末端プロペプチドによって検出されるようにそのＣプロペプチドを有するプロコラーゲンである。ヒトコラーゲンサンプル中の約１２０ｋＤａの小さなバンドは、プロペプチドを有さないコラーゲンである。それらの異常な組成のため、プロリンリッチタンパク質（コラーゲンを含む）は、予測されたより高い分子量を有するバンドとしてポリアクリルアミドゲル上を一貫して移動する。それ故、約９５ｋＤａの分子量のプロペプチドを有さないコラーゲン鎖は、約１２０ｋＤａのバンドとして移動する。
【図５】図５は、共形質転換によって作成されたトランスジェニック植物＃８（コラーゲン鎖に翻訳的に融合されたアポプラストシグナルを担持する）のウェスタンブロット分析である。全可溶性タンパク質は、トランスジェニックタバコの葉から抽出され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を用いて試験された。陽性のコラーゲンアルファ２バンドが植物８−１４１で見ることができる。ヒト胎盤（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）からのコラーゲンＩ型は、コントロールとして使用された。
【図６ａ】図６ａは、加熱処理及びトリプシン又はペプシン消化によって定性決定されるようなコラーゲン三重らせん会合体及び熱安定性を示す。図６ａでは、タバコ２−９（コラーゲンアルファ１鎖のみを発現し、Ｐ４Ｈを発現しない）及び３−５（コラーゲンアルファ１鎖及びアルファ２鎖並びにヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニットの両方を発現する）からの全可溶性タンパク質は、加熱処理（３８℃又は４３℃で１５分間）に供され、続いてトリプシン消化（室温で２０分間）に供され、抗コラーゲンＩ抗体を用いてウェスタンブロット手順で試験された。陽性コントロールは、５００ｎｇのヒトコラーゲンＩ＋ｗ．ｔ．タバコの全可溶性タンパク質のサンプルであった。
【図６ｂ】図６ｂは、加熱処理及びトリプシン又はペプシン消化によって定性決定されるようなコラーゲン三重らせん会合体及び熱安定性を示す。図６ｂでは、全可溶性タンパク質はトランスジェニックタバコ１３−６（矢印によって示されるコラーゲンＩアルファ１及びアルファ２鎖、ヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びヒトＬＨ３を発現する）から抽出され、加熱処理（３３℃、３８℃又は４２℃で２０分間）に供され、直ちに氷上で冷却されて三重らせんの再会合を防止され、そしてペプシンと共に３０分間室温（約２２℃）でインキュベートされ、続いて抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を用いて標準的なウェスタンブロット手順で試験された。陽性コントロールは、ｗ．ｔ．タバコから抽出された全可溶性タンパク質に添加された約５０ｎｇのヒトコラーゲンＩ（ペプシン消化によってヒトの胎盤から抽出されたＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）のサンプルであった。
【図７】図７は、野生型タバコで行われたノーザンブロット分析を示す。ブロットは、タバコＰ４ＨのｃＤＮＡを用いてプローブされた。
【図８】図８は、共形質転換２，３及び１３によって作成されたトランスジェニック植物のウェスタンブロット分析である。全可溶性タンパク質は、タバコ共形質転換体から抽出され、抗ヒトＰ４Ｈアルファ及びベータ並びに抗コラーゲンＩ抗体を用いて試験された。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明は、哺乳類のコラーゲンの特徴を示すコラーゲン及びコラーゲン線維を生産するために使用されることができるコラーゲンを発現して蓄積する植物の発明である。
【００７３】
本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解することができる。
【００７４】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７５】
コラーゲン生産植物は、当該技術分野で知られている。かかる植物は、コラーゲン鎖ならびにコラーゲンを生産するために使用されることができるが、かかる鎖は不正確にヒドロキシル化されており、従って、その自己会合は、植物中で生じるか否かにかかわらず、本来不安定なコラーゲンに導く。
【００７６】
本発明を実施に移す際に、本発明者らは、コラーゲン鎖の正確なヒドロキシル化を確実にし、従ってヒトＩ型コラーゲンの特徴（例えば温度安定性）を良く模倣するコラーゲンの植物中での生産を可能にする植物発現アプローチを案出した。
【００７７】
従って、本発明の一つの側面によれば、少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖を発現することができかつそれを内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中に蓄積することができる遺伝的に改変された植物が提供される。
【００７８】
本明細書で使用される通り、「遺伝的に改変された植物（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｌａｎｔ）」は、外因性ポリヌクレオチド配列で安定に又は一過的に形質転換されるいかなる下等植物（例えば苔）又は高等植物（維管束植物）、又はその組織もしくは単離された細胞（例えば細胞懸濁液）に言及する。植物の例は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、綿並びに苔の如き下等植物を含む。
【００７９】
本明細書で使用される通り、句「コラーゲン鎖」は、コラーゲン線維のアルファ１又は２鎖の如きコラーゲンサブユニット、好ましくはＩ型線維に言及する。本明細書で使用される通り、句「コラーゲン」は、会合したコラーゲントリマーに言及し、これはＩ型コラーゲンの場合、二つのアルファ１鎖及び一つのアルファ２鎖を含む。コラーゲン線維は、末端プロペプチドＣ及びＮを欠くコラーゲンである。
【００８０】
本明細書で使用される通り、句「内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画」は、植物のＰ４Ｈ又は植物様Ｐ４Ｈ活性を有する酵素を含まない細胞のいかなる区画化された領域に言及する。かかる細胞内区画の例は、液胞、アポプラスト及び細胞質並びにクロロプラスト、ミトコンドリアなどのオルガネラを含む。
【００８１】
いかなる種類のコラーゲン鎖も本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されることができる。その例は、原線維形成コラーゲン（Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｖ及びＸＩ型）、網状組織形成コラーゲン（ＩＶ，ＶＩＩＩ及びＸ型）、原線維表面に結合するコラーゲン（ＩＸ，ＸＩＩ及びＸＩＶ型）、膜貫通タンパク質として生じるコラーゲン（ＸＩＩＩ及びＸＶＩＩ型）、又は１１ｎｍの周期でビーズを有するフィラメント（ＶＩ型）を含む。さらなる記述については、Ｈｕｌｍｅｓ、２００２年を参照されたい。
【００８２】
好ましくは、発現されるコラーゲン鎖は、Ｉ型コラーゲンのアルファ１及び／又は２鎖である。発現されるコラーゲンアルファ鎖は、いかなる哺乳類から由来するいかなるポリヌクレオチド配列によってコードされることができる。好ましくは、コラーゲンアルファ鎖をコードする配列は、ヒトのものであり、配列番号１及び４によって規定されるものである。
【００８３】
典型的には、植物中で発現されるアルファコラーゲン鎖は、それらの末端ポリペプチド（即ち、プロペプチドＣ及びプロペプチドＮ）を含んでいてもよく、又は含まなくてもよい。
【００８４】
Ｒｕｇｇｉｅｒｏら（２０００年）は、植物のタンパク質分解活性によるプロコラーゲンの処理は、ヒトにおける正常な処理とは異なること、及び開裂部位は不明であるが、プロペプチドＣは、植物のタンパク質分解活性によって除去されることに気付いた。Ｃプロペプチドの開裂は、トリマーの会合の前にプロコラーゲンペプチドに対して生じるであろう（三つのＣプロペプチドの会合がトリマーの会合を開始するために必須である）。
【００８５】
植物のタンパク質分解活性によるＮプロペプチドの開裂は、成熟した植物では生じるが苗木では生じない。かかる開裂は、Ｎテロペプチドから２個のアミノ酸を除去する（１７個のうちの２個）。
【００８６】
Ｃプロペプチド（及びより少ない程度のＮプロペプチド）は、プロコラーゲンが動物細胞を通過する間、プロコラーゲンを可溶性に維持し（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）、植物細胞でも同様の効果を有すると予測される。細胞外マトリックス中へのプロコラーゲン分子の分泌後又は分泌中、プロペプチドはプロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによって除去され、それにより原線維へのコラーゲン分子の自発的な自己会合を引き起す（Ｈｕｌｍｅｓ、２００２年）。プロコラーゲンＮ及びＣプロテイナーゼによるプロペプチドの除去は、プロコラーゲンの可溶性を１００００倍以上低下させ、コラーゲンの線維への自己会合を開始するのに必要かつ十分である。この会合過程にとって重要なのは、三重らせんドメインの終わりに位置する短い非三重らせんペプチド（テロペプチドと称される）であり、これは、原線維構造内のコラーゲン分子の正確な位置決めを確実にし、自己会合のための臨界濃度を低下させる（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。従来技術は、コラーゲンの生産中にプロペプチドを開裂させるためのペプシンの使用を記述する（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。しかし、ペプシンはテロペプチドを損傷させ、結果としてペプシン抽出されたコラーゲンは、整列された線維状構造を形成することができない（Ｂｕｌｌｅｉｄら、２０００年）。
【００８７】
ヒトＰ４Ｈのベータサブユニットを形成するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、トリマー会合に先立ってＣプロペプチドに結合し、それにより鎖会合の間の分子シャペロンとしても作用することが示されている（Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、２０００年）。様々な植物中で発現されるヒトＩ型プロコラーゲンＮプロテイナーゼ及びプロコラーゲンＣプロテイナーゼの使用は、生来的なヒトのコラーゲンに一層類似しかつ整列された原線維構造を形成することができるコラーゲンを生産することができるであろう。
【００８８】
ＮもしくはＣプロペプチド又はこれらの両方が、発現されるコラーゲン鎖に含まれる場合、本発明の遺伝的に改変された植物はそれぞれのプロテアーゼ（即ちＣもしくはＮ又はこれらの両方）を発現することもできる。かかるプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１８（プロテアーゼＣ）及び２０（プロテアーゼＮ）によって例示される。かかるプロテアーゼは、それらがコラーゲン鎖と同じ細胞内区画中に蓄積されるように発現されることができる。
【００８９】
内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く細胞内区画中での発現されるコラーゲン鎖の蓄積は、いくつかのアプローチのいずれか一つによって実行されることができる。
【００９０】
例えば、発現されるコラーゲン鎖は、発現されるタンパク質をアポプラスト又はオルガネラ（例えば葉緑体）の如き細胞内区画へと標的化するためのシグナル配列を含むことができる。好適なシグナル配列の例は、葉緑体輸送ペプチド（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ０７６８９、アミノ酸１〜５７に含まれる）及びミトコンドリア輸送ペプチド（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ４６６４３、アミノ酸１〜２８に含まれる）を含む。以下の実施例セクションは、好適なシグナル配列の追加の例示並びにかかるシグナル配列を植物細胞中でのコラーゲン鎖の発現において使用するためのガイドラインを与える。
【００９１】
代わりに、コラーゲン鎖の配列は、植物中で発現されたときにコラーゲンの細胞内局在化を変化させるような方法で改変されることができる。
【００９２】
上述の通り、植物のＥＲは、コラーゲン鎖を正確にヒドロキシル化することができないＰ４Ｈを含む。コラーゲンアルファ鎖は、発現されるコラーゲンをＥＲ中に指向させるＥＲ標的化配列を生来的に含み、発現されるコラーゲンはＥＲ中で翻訳後修飾される（不正確なヒドロキシル化を含む）。従って、ＥＲ標的化配列の除去は、いかなるヒドロキシル化も含む翻訳後修飾を欠くコラーゲン鎖の細胞質内蓄積に導くであろう。
【００９３】
以下の実施例セクションの実施例１は、ＥＲ配列を欠くコラーゲン配列の生成を記述する。
【００９４】
また代わりに、コラーゲン鎖は、葉緑体又はミトコンドリアの如きＤＮＡ含有オルガネラ中に発現されて蓄積されることができる。葉緑体発現のさらなる記述は以下に与えられる。
【００９５】
上述の通り、アルファ鎖のヒドロキシル化は、安定なＩ型コラーゲンの会合のために要求される。本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるアルファ鎖は、内因性Ｐ４Ｈ活性を欠く、細胞内区画中に蓄積するので、かかる鎖は、植物、植物組織又は細胞から単離されなければならず、インビトロでヒドロキシル化されなければならない。かかるヒドロキシル化は、Ｔｕｒｐｅｅｎｎｉｅｍｉ−Ｈｕｊａｎｅｎ及びＭｙｌｌｙｌａによって記述される方法（Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９８４ Ｊｕｌ １６：８００（１）５９−６５）によって達成されることができる。
【００９６】
かかるインビトロヒドロキシル化は、正確にヒドロキシル化されたコラーゲン鎖に導くことができるが、達成するのが困難である場合があり費用がかかる場合がある。
【００９７】
インビトロヒドロキシル化の制限を克服するため、本発明の遺伝的に改変された植物は、コラーゲンアルファ鎖を正確にヒドロキシル化する（即ち、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットのプロリン（Ｙ）位置のみをヒドロキシル化する）ことができるＰ４Ｈを共発現することが好ましい。Ｐ４Ｈは、二つのサブユニットアルファ及びベータからなる酵素である。これら両方が活性酵素を形成するのに必要であるが、ベータサブユニットはシャペロン機能をも担持する。
【００９８】
本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるＰ４Ｈは、例えば配列番号１２及び１４によってコードされるヒトＰ４Ｈであることが好ましい。加えて、増大された基質特異性を示すＰ４Ｈ突然変異体又はＰ４Ｈ相同体も使用されることができる。
【００９９】
好適なＰ４Ｈ相同体は、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ １７９３６３によって同定されるアラビドプシスのオキシドレダクターゼによって例示される。本発明者らによって行われたこのタンパク質の配列とヒトＰ４Ｈアルファサブユニットの対様式アラインメントは、植物のいかなる公知のＰ４Ｈ相同体の機能性ドメイン間の最高の相同性を明らかにした。
【０１００】
Ｐ４Ｈは、発現されたコラーゲン鎖と共蓄積される必要があるので、そのコード配列は、それに応じて改変されることが好ましい（シグナル配列の付加、ＥＲ標的化を防止することができる欠失など）。
【０１０１】
哺乳類細胞では、コラーゲンはリシルヒドロキシラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ及びグルコシルトランスフェラーゼによっても修飾される。これらの酵素は、特定位置のリシル残基をヒドロキシリシル、ガラクトシルヒドロキシリシル及びグルコシルガラクトシルヒドロキシリシル残基へと連続的に修飾する。単一のヒト酵素であるリシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）は、ヒドロキシリシンに関連する炭水化物形成における三つの連続的ステップすべてを触媒することができる。
【０１０２】
従って、本発明の遺伝的に改変された植物は、哺乳類のＬＨ３も発現することが好ましい。配列番号２２によって規定されるようなＬＨ３コード配列が、かかる目的のために使用されることができる。
【０１０３】
上述のコラーゲン鎖及び修飾酵素は、植物の機能的プロモーターの転写制御下に配置されたアルファ鎖及び／又は修飾酵素（例えばＰ４Ｈ及びＬＨ３）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、安定に組込まれた又は一過的に発現される核酸構築物から発現されることができる。かかる核酸構築物（本明細書では発現構築物とも称される）は、植物全体での発現のために、又は限定された植物組織もしくは限定された植物細胞での発現のために、又は植物の限定された発生段階での発現のために構成されることができる。かかる構築物は、選択マーカー（例えば抗生物質耐性）、エンハンサーエレメント及び細菌での複製のための複製起点も含むことができる。
【０１０４】
二つの発現性挿入物（例えば二つのアルファ鎖型又はアルファ鎖及びＰ４Ｈ）を含む構築物は、それぞれの挿入物について個別のプロモーターを含むことが好ましいことは理解されるであろう。又は代わりにかかる構築物は、単一のプロモーターから両方の挿入物配列を含む単一の転写キメラを発現することができる。かかる場合、キメラ転写物は、下流の挿入物が翻訳されることができるように二つの挿入物の間にＩＲＥＳ配列を含む。
【０１０５】
組織特異的、発生段階特異的、構成的、又は誘導性であることができる多数の植物機能的発現プロモーター及びエンハンサーが本発明の構築物によって利用されることができ、いくつかの例が以下に与えられる。
【０１０６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される通り、句「植物プロモーター」又は「プロモーター」は、植物細胞（ＤＮＡ含有オルガネラを含む）中での遺伝子発現を指図することができるプロモーターを含む。かかるプロモーターは、植物、細菌、ウイルス、真菌又は動物起源のものであることができる。かかるプロモーターは、構成的、即ち複数の植物組織中での高レベルの遺伝子発現を指図することができるか、又は組織特異的、即ち特定の植物組織での遺伝子発現を指図することができるか、又は誘導性、即ち刺激の下で遺伝子発現を指図することができるか、又はキメラ、即ち少なくとも二つの異なるプロモーターの部分から形成されるものであることができる。
【０１０７】
従って、使用される植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、又はキメラプロモーターであることができる。
【０１０８】
構成的植物プロモーターの例は、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＦＭＶ３４Ｓプロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルスプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、アラビドプシスＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチンプロモーター、アラビドプシスユビキチンＵＢＱ１プロモーター、大麦葉チオニンＢＴＨ６プロモーター、及びイネアクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
組織特異的プロモーターの例は、マメファゼオリン貯蔵タンパク質プロモーター、ＤＬＥＣプロモーター、ＰＨＳプロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質プロモーター、ダイズからのコングルチンガンマプロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子プロモーター、アラビドプシスからのＡＣＴ１１アクチンプロモーター、ブラシカ ナプスからのｎａｐＡプロモーター、及びジャガイモパタチン遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０１１０】
誘導性プロモーターは、例えば光、温度、化学物質、渇水、高塩分、浸透圧ショック、酸化的条件又は病原体を含むストレス条件の如き特定の刺激によって誘導されるプロモーターであり、エンドウマメｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子由来のプロモーター、渇水時に活性となるプロモーターＤＲＥ，ＭＹＣ及びＭＹＢ、高塩分及び浸透圧ストレス時に活性となるプロモーターＩＮＴ，ＩＮＰＳ，ｐｒｘＥａ，Ｈａ ｈｓｐ１７．７Ｇ４及びＲＤ２１、及び病原体ストレス時に活性となるプロモーターｈｓｒ２０３Ｊ及びｓｔｒ２４６Ｃを含むがこれらに限定されない。
【０１１１】
好ましくは、本発明によって利用されるプロモーターは、挿入された構築物の過剰発現が植物の形質転換後に行われるような強い構成的プロモーターである。
【０１１２】
本発明で使用されるいかなる構築物型も、各構築物型において同一又は異なる選択マーカーを使用して同一植物中へと共形質転換されることができることは理解されるであろう。代わりに、第一の構築物型が第一植物中に導入され、第二の構築物型が第二同系植物中に導入され、その後、生じたトランスジェニック植物が交配され、子孫が二重形質転換体について選択されることができる。かかる子孫のさらなる自家交配は、両方の構築物について同型接合体である遺伝系統を作成するために使用されることができる。
【０１１３】
単子葉植物及び双子葉植物の両方に核酸構築物を導入する様々な方法がある（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４−２７６）。かかる方法は、核酸構築物又はその一部の植物ゲノム中への安定な組込み又は核酸構築物の一過性発現に依存しており、後者の場合、これらの配列は植物の子孫には遺伝しない。
【０１１４】
加えて、核酸構築物が、葉緑体の如きＤＮＡ含有オルガネラのＤＮＡ中に直接導入されることができるいくつかの方法がある。
【０１１５】
本発明の核酸構築物の中に含まれるような外因性配列を植物ゲノム中に安定に組込むためには二つの原理的な方法がある：
【０１１６】
（ｉ）アグロバクテリウムによって媒介される遺伝子移入：Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７−４８６；Ｋｌｅｅ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ，ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．２−２５；Ｇａｔｅｎｂｙ，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｋｕｎｇ，Ｓ．ａｎｄ Ａｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９８９）ｐ．９３−１１２。
【０１１７】
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｅｎｅｓ ｅｄｓ．Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．，ａｎｄ Ｖａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．５２−６８；この方法は、プロトプラストへＤＮＡを直接取込むための方法を含む：Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０７２−１０７４。植物細胞の短い電気ショックによって誘導されるＤＮＡ取込み：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９−３８４．Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１−７９３。粒子衝撃による植物細胞又は組織中へのＤＮＡ注入：Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９−５６３；ＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３−９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６−２０９。マイクロピペット系の使用による植物細胞又は組織中へのＤＮＡ注入：Ｎｅｕｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０−３６；Ｎｅｕｈａｕｓ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３−２１７。又は発芽花粉とのＤＮＡの直接培養による植物細胞又は組織中へのＤＮＡ注入：ＤｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ，ｅｄｓ．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ Ｍａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，（１９８５）ｐ．１９７−２０９；ａｎｄ Ｏｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５−７１９。
【０１１８】
アグロバクテリウム系は、植物ゲノムＤＮＡ中に組込まれる限定されたＤＮＡセグメントを含むプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の接種方法は、植物種及びアグロバクテリウム送達系によって異なる。幅広く使用されているアプローチは、リーフディスク手順であり、これは植物全体への分化を開始するのに良好な源を提供するいかなる組織外植体を用いて行われることができる。Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）ｐ．１−９参照。補助的なアプローチは、アグロバクテリウム送達系を減圧浸潤との組合せで使用する。アグロバクテリウム系は、トランスジェニック双子葉植物の作成において特に実行可能である。
【０１１９】
植物細胞中への直接ＤＮＡ移入には様々な方法がある。エレクトロポレーションでは、プロトプラストは強い電場に短時間さらされる。マイクロ注入では、ＤＮＡは極めて小さいマイクロピペットを使用して細胞中へ直接機械的に注入される。微小粒子衝撃では、ＤＮＡは硫酸マグネシウムの結晶、タングステン粒子又は金粒子の如き微小投射物に吸着され、この微小投射物が細胞又は植物組織中へと物理的に加速される。
【０１２０】
形質転換後、植物の繁殖が行われる。植物繁殖の最も一般的な方法は種子による方法である。しかし、種子繁殖による再生は、異型接合性のため作物には均一性の欠失があるという欠点を有する。何故なら種子は、メンデルの法則によって支配される遺伝的変異に従って植物によって生産されるからである。基本的に、各種子は遺伝的に異なり、各種子はそれ自身の特異的な形質を有して成長するであろう。従って、形質転換植物は、再生された植物が親のトランスジェニック植物と同一の形質及び特徴を有するように生産されることが好ましい。それ故、形質転換植物は、形質転換植物の迅速で一貫した再生を与える微小繁殖によって再生されることが好ましい。
【０１２１】
本発明の核酸構築物内に含まれる単離された核酸を一過的に発現させるために利用されることができる一過的発現方法は、上述のマイクロ注入及び衝撃（しかし一過的発現が好ましい条件下で）、及びウイルスによって媒介される発現を含むがこれらに限定されない。ウイルスによって媒介される発現では、核酸構築物を含むパッケージ化された又はパッケージ化されていない組換えウイルスベクターが植物組織又は細胞を感染させるために利用され、そこに確立された繁殖する組換えウイルスが非ウイルス性核酸配列を発現する。
【０１２２】
植物宿主の形質転換のために有用であることが示されているウイルスはＣａＭＶ，ＴＭＶ及びＢＶを含む。植物ウイルスを使用した植物の形質転換は、米国特許第４８８５２３７号（ＢＧＶ），ＥＰ−Ａ６７５５３（ＴＭＶ）、日本国公開特許公報第６３−１４６９３号（ＴＭＶ），ＥＰＡ第１９４８０９号（ＢＶ），ＥＰＡ第２７８６６７号（ＢＶ）及びＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７２−１８９（１９８８）に記述されている。植物を含む多くの宿主中で外来ＤＮＡを発現させるのに使用するためのシュードウイルス粒子は、ＷＯ ８７／０６２６１に記述されている。
【０１２３】
植物中に非ウイスル性外因性核酸配列を導入して発現させるための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上述の文献並びにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ｅｒ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５−２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：３０７−３１１；Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４−１２９７；ａｎｄ Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３−７６によって示されている。
【０１２４】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、構築はウイルス自体に対してなされることができる。代わりに、ウイルスは、外来ＤＮＡを有する望ましいウイルスベクターを構築するのが容易なように細菌プラスミド中へとまずクローニングされることができる。次にウイルスはプラスミドから切り出されることができる。もしウイルスがＤＮＡウイルスであるなら、細菌の複製起点がウイルスＤＮＡに取付けられることができ、ウイルスＤＮＡは細菌によって複製されることができる。このＤＮＡの転写及び翻訳は、ウイルスＤＮＡを包囲するコートタンパク質を生産するであろう。もしウイルスがＲＮＡウイルスであるなら、ウイルスは一般的にｃＤＮＡとしてクローニングされ、プラスミド中に挿入される。次にプラスミドは構築物のすべてを作るために使用される。次にＲＮＡウイルスは、プラスミドのウイルス配列を転写することよって及びウイルス遺伝子を翻訳してウイルスＲＮＡを包囲するコートタンパク質を生産することによって生産される。
【０１２５】
本発明の構築物中に含まれるような非ウイルス性外因性核酸配列の植物中への導入及び発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上述の文献並びに米国特許第５３１６９３１号によって示されている。
【０１２６】
一つの実施態様では、生来的コートタンパク質コード配列がウイルス核酸から欠失されており、かつ植物宿主中での発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージング及び組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染を確実にすることができる非生来的プロモーター、好ましくは非生来的コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターが挿入されている植物ウイルス核酸が提供される。代わりに、コートタンパク質遺伝子は、タンパク質が生産されるようにその中に非生来的核酸を挿入することによって不活性化されることができる。組換え植物ウイルス核酸は一以上の追加の非生来的サブゲノムプロモーターを含むことができる。それぞれの非生来的サブゲノムプロモーターは、植物宿主中の隣接遺伝子又は核酸配列を転写又は発現させることができるが、相互に及び生来的サブゲノムプロモーターと組換えられることができない。非生来的（外来性）核酸配列は、一以上の核酸配列が含められる場合、生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーター又は生来的な及び非生来的な植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入されることができる。非生来的核酸配列はサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物中で転写又は発現され、望ましい生成物を生産する。
【０１２７】
第二の実施態様では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列の代わりに非生来的なコートタンパク質サブゲノムプロモーターの一つに隣接して配置されていることを除いては第一の実施態様と同様の組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０１２８】
第三の実施態様では、生来的なコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接されておりかつ一以上の非生来的サブゲノムプロモーターがウイルス核酸中に挿入されている組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非生来サブゲノムプロモーターは、隣接遺伝子を転写又は発現させることができるが、相互に及び生来的サブゲノムプロモーターと組換えられることができない。非生来的な核酸配列は、前記配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物中で転写又は発現され、望ましい生成物を生産するように非生来的なサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入されることができる。
【０１２９】
第四の実施態様では、生来的なコートタンパク質コード配列が非生来的なコートタンパク質コード配列によって置換されていることを除いては第三の実施態様と同様の組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０１３０】
ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸によってコードされるコートタンパク質によって包囲されて組換え植物ウイルスを生産する。組換え植物ウイルス核酸又は組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物を感染させるために使用される。組換え植物ウイルス核酸は、宿主中で複製し、宿主中に全身的に広がり、宿主中で外来遺伝子（単離された核酸）を転写又は発現させて望ましいタンパク質を生産することができる。
【０１３１】
外因性核酸配列を葉緑体のゲノムに導入するための技術が知られている。この技術は下記の手順を伴う。第１に、植物細胞が、細胞あたりの葉緑体の数を約１個に減らすように化学的に処理される。その後、外因性核酸が、少なくとも１つの外因性核酸分子を葉緑体に導入することを目指して、粒子衝撃によって細胞に導入される。外因性核酸は、相同的組換え（これは葉緑体に固有の酵素によって容易に行われる）による葉緑体ゲノムへの組込みを可能にするように選択される。この目的のために、外因性核酸は、目的とする遺伝子に加えて、葉緑体ゲノムに由来する少なくとも１つの核酸配列を含む。加えて、外因性核酸は選択マーカーを含み、そのような選択マーカーは、逐次的な選抜手法によって、そのような選抜の後の葉緑体ゲノムのすべてまたは実質的にすべてのコピー体が外因性核酸を含むことを確認するために役立つ。この技術に関するさらなる詳細が、米国特許第４９４５０５０号および同第５６９３５０７号に見出される（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。従って、ポリペプチドを葉緑体のタンパク質発現系によって産生させることができ、かつ、葉緑体の内膜に一体化させることができる。
【０１３２】
上述の形質転換アプローチは、いかなる種の植物又はそこから由来する植物組織もしくは単離された植物細胞においてコラーゲン鎖及び／又は修飾酵素並びに会合されたコラーゲン（プロペプチドあり又はなし）を生産するために使用されることができる。
【０１３３】
好ましい植物は、本明細書に記述されたコラーゲン鎖、コラーゲン及び／又は処理酵素を多量に蓄積することができるものである。かかる植物は、ストレス条件に対するそれらの抵抗性及び発現された成分又は会合されたコラーゲンが抽出される容易さに従って選択されることもできる。好ましい植物の例は、タバコ、トウモロコシ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、小麦、大麦、カノーラ、ニンジン及び綿を含む。
【０１３４】
コラーゲン線維は、食品及び化粧品産業で広範囲に使用される。従って、植物によって発現されるコラーゲン線維成分（アルファ鎖）及び修飾酵素はコラーゲンの産業的合成において有用性を見出し、植物中での完全なコラーゲンの生産は、その簡単さ及び費用効率のために好ましい。
【０１３５】
植物中でＩ型コラーゲンを生成するためにいくつかのアプローチが使用されることができる。例えば、コラーゲンアルファ１鎖は、コラーゲンアルファ１及びＰ４Ｈ（及び所望によりＬＨ３）を発現する植物から単離されることができ、コラーゲンアルファ２及びＰ４Ｈ（及び所望によりＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する植物から単離されるコラーゲンアルファ２鎖と混合されることができる。コラーゲンアルファ１鎖はそれ自身によって三重らせんへと自己会合するため、混合前にかかるホモトリマーを変性させてコラーゲンアルファ２鎖と共に再生することが必要であるかもしれない。
【０１３６】
好ましくは、コラーゲンアルファ１及びＰ４Ｈ（及び所望によりＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する第一植物は、コラーゲンアルファ２を発現する第二（及び好ましくは同系の）植物と交配されることができるか、又は代わりに両アルファ鎖を発現する第一植物は、Ｐ４Ｈ及び所望によりＬＨ３及びプロテアーゼＣ及び／又はＮを発現する第二植物と交配されることができる。
【０１３７】
上述の植物育種アプローチは二つの個別に形質転換された植物を利用するが、それぞれが一つ又は二つの成分を発現する三つ以上の個別に形質転換された植物を利用するアプローチも利用できるということは注意されるべきである。
【０１３８】
当業者は様々な植物育種技術に精通しているであろう。従って、かかる技術のさらなる記述は本明細書中では与えられない。
【０１３９】
植物育種アプローチが好ましいが、コラーゲンアルファ１及び２、Ｐ４Ｈ及びＬＨ３（及び所望によりプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する単一の植物が、それぞれが一以上の発現可能な成分を細胞中に導入するために設計されているいくつかの形質転換事象を介して作成されることができることに注意すべきである。かかる場合には、各形質転換事象の安定性は特異的な選択マーカーを使用して確認されることができる。
【０１４０】
いかなる場合でも、形質転換及び植物育種アプローチはいかなる数の成分を発現するいかなる植物を作成するために使用されることができる。現在好まれているものはコラーゲンアルファ１及び２鎖、Ｐ４Ｈ，ＬＨ３及び少なくとも一つのプロテアーゼ（例えばプロテアーゼＣ及び／又はＮ）を発現する植物である。以下の実施例の節でさらに記述されるように、かかる植物は４２℃までの温度で安定性を示すコラーゲンを蓄積する。
【０１４１】
育種から生じた子孫又は代わりに多数回形質転換植物は、核酸又はタンパク質プローブ（例えば抗体）を使用して外因性ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの存在を確認することによって選択されることができる。後者のアプローチが好ましい。何故なら、それは発現されたポリペプチド成分の局在化を可能にし（例えば分別された植物抽出物をプロービングすることによって）、従って、正確な処理及び会合についての可能性も確認するからである。好適なプローブの例は以下の実施例の節に与えられる。
【０１４２】
一旦コラーゲンを発現する子孫が同定されたら、かかる植物はコラーゲン鎖ならびに修飾酵素の発現を最大にする条件下でさらに栽培される。
【０１４３】
遊離プロリンの蓄積は、本発明の遺伝的に改変された植物によって発現されるコラーゲン鎖を含む様々なプロリンリッチタンパク質の過剰生産を容易にすることができ、好ましい栽培条件は栽培された植物中での遊離プロリンの蓄積を増大させるようなものである。
【０１４４】
遊離プロリンの蓄積は、渇水、塩分、低温、高温、病原体感染、重金属毒性、嫌気生活、栄養欠乏、大気汚染及びＵＶ照射を含む広範囲の環境ストレスに対する応答において様々な植物中に蓄積する（Ｈａｒｅ ａｎｄ Ｃｒｅｓｓ，１９９７年）。
【０１４５】
遊離プロリンは、ＡＢＡの如き化合物での植物又は土壌の処理に対する応答において又は銅、塩、パラコート、サリチル酸などの如き化合物を含むストレスに対する応答においても蓄積することがあり得る。
【０１４６】
従って、コラーゲンを発現する子孫は様々なストレス条件（例えば５０ｍＭから２５０ｍＭまでの範囲のＮａＣｌの異なる濃度）下で生長させられることができる。コラーゲン生産をさらに増大させるために、コラーゲン発現に対する様々なストレス条件の影響が調査され、植物の生存性、バイオマス及びコラーゲン蓄積に関して最適化されるであろう。
【０１４７】
植物組織／細胞は成熟時に収穫されることが好ましく、コラーゲン線維は周知の従来技術の抽出アプローチを使用して単離され、一つのかかるアプローチが以下に詳述される。
【０１４８】
形質転換植物の葉は液体窒素下で粉末へと磨砕され、ホモジネートは０．２ＭのＮａＣｌを含む０．５Ｍ酢酸中で６０時間４℃で抽出される。不溶性材料は遠心分離によって除去される。組換えコラーゲンを含む上澄みは０．４Ｍ及び０．７ＭのＮａＣｌで塩分画される。組換えヘテロトリマーコラーゲンを含む０．７Ｍ ＮａＣｌ沈殿は０．１Ｍの酢酸中に溶解されてこれに対して透析され、−２０℃で貯蔵される（Ｒｕｇｇｉｅｒｏら、２０００年に従う）。
【０１４９】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１５０】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１５１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ著、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（第３版）Ｎ．Ｙ．（１９９４年）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１５２】
実施例１
構築及び形質転換スキーム
本研究で使用された発現カセットの構築は図１ａ−ｄに示されている。本研究におけるコード配列のすべては、タバコ中での発現のために最適化され、望ましいフランキング領域（配列番号１，４，７，１２，１４，１６，１８，２０，２２）を有するように化学的に合成された。図１ａ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合された又はシグナルなしのＣｏｌ１及びＣｏｌ２（配列番号１，４）をコードする合成遺伝子は、キクｒｂｃＳ１プロモーター及び５′ＵＴＲ（配列番号１０）並びにキクｒｂｃＳ１ ３′ＵＴＲ及びターミネーター（配列番号１１）からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはｐＢＩＮＰＬＵＳ植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ４：２８８−２９０）。図１ｂ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合された又はシグナルなしのＰ４Ｈベータヒト、Ｐ４Ｈアルファヒト及びＰ４Ｈ植物（配列番号１２，１４及び１６）をコードする合成遺伝子は、ベクターｐＪＤ３３０によって担持されるＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター及びＴＭＶオメガ配列及びアグロバクテリウムノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ターミネーターからなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットは、Ｃｏｌ１又はＣｏｌ２の発現ベクターを担持するｐＢＩＮＰＬＵＳベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図１ｃ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合されたプロテイナーゼＣ及びプロテイナーゼＮ（配列番号１８，２０）をコードする合成遺伝子は、キクｒｂｃＳ１プロモーター及び５′ＵＴＲ（配列番号１０）並びにキクｒｂｃＳ１ ３′ＵＴＲ及びターミネーター（配列番号１１）からなる発現カセット中にクローニングされた。完全な発現カセットはｐＢＩＮＰＬＵＳ植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。図１ｄ：液胞シグナルもしくはアポプラストシグナル（配列番号７によってコードされる）に融合された又はシグナルなしのＬＨ３（配列番号２２）をコードする合成遺伝子（フランキングイチゴツル結合ウイルス（ＳＶＢＶ）プロモーター（ＮＣＢＩアクセッションＡＦ３３１６６６ ＲＥＧＩＯＮ：６２３．．９５０バージョンＡＦ３３１６６６．１ ＧＩ：１３３４５７８８）を有しかつアグロバクテリウムオクトピン合成酵素（ＯＣＳ）ターミネーター（ＮＣＢＩアクセッションＺ３７５１５ ＲＥＧＩＯＮ：１３４４．．１５３８バージョンＺ３７５１５．１ ＧＩ：８８６８４３）で末端停止されている）は、Ｃｏｌ１及びＰ４Ｈベータの発現カセットを担持するｐＢＩＮＰＬＵＳベクターのマルチクローニングサイト中にクローニングされた。
【０１５３】
図１に記述される発現カセットを利用した宿主植物中への共形質転換スキームは図２に図示される。各発現カセット挿入物はコード配列の短い名前によって表される。コード配列及び関連する配列番号は表１に記載されている。それぞれの共形質転換は二つのｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリーベクターによって行われる。それぞれの長方形は一つ、二つ又は三つの発現カセットを担持する単一のｐＢＩＮＰＬＵＳベクターを表す。プロモーター及びターミネーターは図１で特定される。
【０１５４】
実施例２
植物コラーゲン発現
以下の表１に提示されるタンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド配列が設計され、タバコ植物中での発現のために最適化された。
【０１５５】
【０１５６】
シグナルペプチド
（ｉ）チオールプロテアーゼアレウレイン（ａｌｅｕｒａｉｎ）前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列（ＮＣＢＩアクセッションＰ０５１６７ ＧＩ：１１３６０３）
（ｉｉ）アラビドプシスタリアーナのエンド１，４−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナル（Ｃｅｌ１、ＮＣＢＩアクセッションＣＡＡ６７１５６．１ ＧＩ：２４４００３３）；配列番号９、配列番号７によってコードされる
【０１５７】
プラスミドの構築
植物発現ベクターは実施例１に教示されるようにして構築された。それぞれの構築された発現ベクターの組成は制限酵素分析及び配列決定を介して確認された。
【０１５８】
以下の発現カセットを含む発現ベクターが構築された：
１．コラーゲンアルファ１
２．コラーゲンアルファ１＋ヒトＰ４Ｈベータサブユニット
３．コラーゲンアルファ１＋ヒトＰ４Ｈベータサブユニット＋ヒトＬＨ３
４．コラーゲンアルファ２
５．コラーゲンアルファ２＋ヒトＰ４Ｈアルファサブユニット
６．コラーゲンアルファ２＋アラビドプシスＰ４Ｈ
７．ヒトＰ４Ｈベータサブユニット＋ヒトＬＨ３
８．ヒトＰ４Ｈアルファサブユニット
上述のコード配列のそれぞれは、液胞輸送ペプチドもしくはアポプラスト輸送ペプチドに翻訳的に融合されたか、又はいかなる輸送ペプチド配列も欠いており、その場合、細胞質蓄積が期待される。
【０１５９】
植物形質転換及びＰＣＲスクリーニング
タバコ植物（ニコチアーナ・タバクム、Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ）は、図２に教示される形質転換スキームに従って上述の発現ベクターで形質転換された。
【０１６０】
生じた形質転換植物は、コラーゲンアルファ１の３２４ｂｐフラグメント及びコラーゲンアルファ２の５３７ｂｐフラグメントを増幅することができるように設計された四つのプライマー（表２）を使用したマルチプレックスＰＣＲを介してスクリーニングされた。図３は一つのマルチプレックスＰＣＲスクリーニングの結果を示す。
【０１６１】
【０１６２】
実施例３
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトコラーゲンの検出
全可溶性タンパク質は、「完全な」プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨからの製造＃１８３６１４５、５０ｍｌの緩衝液あたり一錠）を使用して０．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中で５００ｍｇの葉を粉砕することによってタバコ形質転換体２，３及び４から抽出された。粗抽出物は、１０％ベータ−メルカプト−エタノール及び８％ＳＤＳを含む２５０μｌの４Ｘサンプル適用緩衝液と混合され、サンプルは７分間沸騰され、１３０００ｒｐｍで８分間遠心分離された。２０μｌの上澄みは１０％ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンＩ（変性）抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた（図４）。Ｗ．Ｔ．は野生型タバコである。陽性コラーゲンバンドは、コラーゲンＩ型アルファ１又はアルファ２又は両方についてＰＣＲ陽性である植物において見ることができる。ヒト胎盤（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０）からの５００ｎｇのコラーゲンＩ型の陽性コントロールバンドは、トランスジェニック植物からのサンプル中の約０．３％の全可溶性タンパク質（約１５０μｇ）を表す。
【０１６３】
全可溶性タンパク質の１％までの予測される分子量でコラーゲンを発現する植物は、コラーゲンが液胞に対して標準化された場合に検出された（図４）。アポプラストに対する全長コラーゲンの細胞内標的化は成功裏に達成された（図５）。細胞質中でコラーゲンを発現する植物（即ち標的化ペプチドなし）は、コラーゲンを検出可能なレベルに蓄積せず、植物中でのコラーゲンの細胞内標的化は成功のために重要であることを示した。
【０１６４】
Ｎ−プロペプチドを欠くコラーゲンが有意なタンパク質分解に供されることを示すＲｕｇｇｉｅｒｏら２０００年及びＭｅｒｌｅら２００２年の研究に加えて及びこれらの研究とは対照的に、現在のアプローチを使用すると、Ｃ−プロペプチド及びＮ−プロペプチドを有する全長コラーゲンタンパク質は高レベルで細胞内区画中に蓄積した。
【０１６５】
本データはまた、それぞれが異なるコラーゲン鎖型を発現する二つの植物を交配することは、それぞれの鎖型を最適レベルで発現する植物の選択及び望ましいコラーゲン生産植物を達成するための続く植物交配を可能にする点で有利であるということを明らかに示す。
【０１６６】
本発明の植物によって生産されるコラーゲンは、生来的なプロペプチドを含み、従って、タンパク質分解によって精製されたヒトのコントロールタンパク質より大きなタンパク質を形成すると予測される。ヒドロキシル化又はグリコシル化を有さないコラーゲンアルファ１及びアルファ２鎖の計算される分子量は以下の通りである：プロペプチドを有するＣｏｌ１−１３６ｋＤａ、プロペプチドを有さないＣｏｌ１−９５ｋＤａ、プロペプチドを有するＣｏｌ２−１２７ｋＤａ、プロペプチドを有さないＣｏｌ２−９２ｋＤａ。
【０１６７】
図４からわかるように、形質転換体３−５及び３−４９中のＣｏｌ１バンドは他の植物中のＣｏｌ１バンドより大きく見える。これは、これらの植物中で共発現されてヒトコラーゲン鎖と同じ細胞内区画（例えば液胞）に対して標的化されたアルファ及びベータサブユニットからなるヒトプロリン−４−ヒドロキシラーゼホロ酵素によってコラーゲン鎖中でプロリンがヒドロキシル化されることを示す。
【０１６８】
実施例４
コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中での熱安定性
コラーゲン三重らせん会合及びトランスジェニック植物中でのらせん熱安定性は、トランスジェニック植物の全粗タンパク質抽出物の熱変性及び続くトリプシン又はペプシン消化によってテストされた（図６ａ〜ｂ）。第一の実験では、タバコ２−９（Ｃｏｌアルファ１のみを発現し、Ｐ４Ｈを発現しない）及びタバコ３−５（Ｃｏｌアルファ＋２及びＰ４Ｈの両方を発現する）からの全可溶性タンパク質は、０．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５中で５００ｍｇの葉を粉砕して１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを収集することによって抽出された。５０μｌの上澄みは熱処理（３３℃又は４３℃で１５分間）に供され、次に直ちに氷上に置かれた。トリプシン消化は、各サンプルに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５中の１ｍｇ／ｍｌトリプシン６μｌを添加することによって開始された。サンプルは室温（約２２℃）で２０分間インキュベートされた。消化は、１０％ベータメルカプトエタノール及び８％ＳＤＳを含む２０μｌの４Ｘサンプル適用緩衝液の添加によって停止され、サンプルは７分間沸騰され、１３０００ｒｐｍで７分間遠心分離された。５０μｌの上澄みは１０％ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた。陽性コントロールは、ｗ．ｔ．タバコから抽出された５０μｌの全可溶性タンパク質に添加された約５００ｎｇのヒトコラーゲンＩ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０であり、ペプシン消化によってヒト胎盤から抽出されたもの）のサンプルであった。
【０１６９】
図６ａに示されるように、植物＃３−５中で形成されたコラーゲン三重らせん並びにコントロールのヒトコラーゲンは３３℃での変性に対して抵抗性であった。対照的に、植物＃２−９によって形成されたコラーゲンは３３℃で変性した。熱安定性におけるこの相違は、コラーゲンアルファ１及びコラーゲンアルファ２並びにＰ４Ｈベータ及びアルファサブユニットの両方を発現する形質転換体＃３−５中での成功した三重らせん会合及び翻訳後のプロリンヒドロキシル化を示唆する。
【０１７０】
形質転換体＃２−９における二つのバンドはダイマー又はトリマーを表すかもしれず、これらはＳＤＳ及びメルカプトエタノールを使用した７分間の沸騰後も安定である。同様のバンドがヒトのコラーゲン（上部パネル）において及び形質転換体＃３−５において見ることができる。可能な説明は、異なる三重らせん中の二つのペプチドの間の等価なバンド（クロスリンク）がリシンオキシダーゼによる二つのリシンの酸化的脱アミノ化後に形成されたということである。第二の実験では、トランスジェニックタバコ１３−６（コラーゲンＩアルファ１及びアルファ２鎖（矢印によって示される）、ヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びヒトＬＨ３を発現する）からの全可溶性タンパク質は、０．５ｍｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５及び３００ｍＭ ＮａＣｌ中で５００ｍｇの葉を粉砕して１００００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上澄みを収集することによって抽出された。５０μｌの上澄みは熱処理（３３℃、３８℃又は４２℃で２０分間）に供され、次に直ちに氷上に置かれた。ペプシン消化は、各サンプルに０．１Ｍ ＨＣｌ４．５μｌ及び１０ｍＭ酢酸中の２．５ｍｇ／ｍｌペプシン４μｌを添加することによって開始された。サンプルは室温（約２２℃）で３０分間インキュベートされた。消化は、５μｌの非緩衝化１Ｍ Ｔｒｉｓを添加することによって停止された。各サンプルは、１０％ベータメルカプトエタノール及び８％ＳＤＳを含む２２μｌの４Ｘサンプル適用緩衝液と混合され、７分間沸騰され、１３０００ｒｐｍで７分間遠心分離された。４０μｌの上澄みは１０％ポリアクリルアミドゲル中に添加され、抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して標準的なウェスタンブロット手順でテストされた。陽性コントロールは、ｗ．ｔ．タバコから抽出された全可溶性タンパク質に添加された約５０ｎｇのヒトコラーゲン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＣＣ０５０であり、ペプシン消化によってヒト胎盤から抽出されたもの）のサンプルであった。
【０１７１】
図６ｂに示されるように、植物＃１３−６中で形成されたコラーゲン三重らせんは４２℃での変性に対して抵抗性であった。プロペプチドの開裂は、３３℃でまず見ることができ、温度が３８℃に上昇したとき及び４２℃に上昇したとき再び効果的に徐々に増大する。開裂されたコラーゲン三重らせんドメインは、ペプシン処理されたヒトコラーゲンのゲル上での移動と同様の移動を示す。この実験で使用されたヒトコラーゲンは、ペプシンタンパク質分解によってヒト胎盤から抽出されたものであり、従ってプロペプチド及びいくつかのテロペプチドを欠いている。
【０１７２】
実施例５
植物のＰ４Ｈ発現
生来的な植物Ｐ４Ｈの誘導
タバコＰ４Ｈ ｃＤＮＡは、クローニングされ、内因性Ｐ４Ｈ発現を誘導する条件及び処理を決定するためのプローブとして使用された。ノーザンブロット分析（図７）は、Ｐ４Ｈは茎頂では比較的高レベルでそして葉では低レベルで発現されることを明らかに示す。Ｐ４Ｈレベルは擦傷処理（下方パネルの「傷つけられた」）の４時間後に葉で有意に誘導された。同様の結果が他のストレス条件を使用して達成された（図示せず）。
【０１７３】
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びコラーゲンアルファ１及びアルファ２の検出
トランスジェニックタバコ植物中でのヒトＰ４Ｈアルファ及びベータサブユニット及びコラーゲンアルファ１及びアルファ２鎖の検出は、抗ヒトＰ４Ｈアルファサブユニット抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．からの＃６３−１６３）、抗ヒトＰ４Ｈベータサブユニット抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＭＡＢ２７０１）及び抗コラーゲンＩ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．からの＃ＡＢ７４５）を使用して行われた。これらの抗体でプローブされたウェスタンブロットの結果は図８に示される。
【０１７４】
Ｐ４Ｈアルファ、Ｐ４Ｈベータ及びコラーゲンＩアルファ１及びアルファ２バンドの発現は植物１３−６（ヒトＬＨ３でも形質転換されている）中で確認された。液胞シグナルペプチドを含むＰ４Ｈアルファ及びベータの計算された分子量はそれぞれ、６５．５ｋＤａ及び５３．４ｋＤａである。プロペプチドを有する、ヒドロキシル化又はグリコシル化を有さないコラーゲンアルファ１及びアルファ２鎖の計算された分子量はそれぞれ、１３６ｋＤａ及び１２７ｋＤａである。
【０１７５】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１７６】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はすべて、個々の刊行物、特許、特許願及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０１７７】
【配列表フリーテキスト】
【０１７８】
配列番号１は、ヒトコラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２及び３は、ヒトコラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号４及び６は、ヒトコラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号５は、ヒトコラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号７は、アラビドプシスタリアーナのエンド−１，４−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナルのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号８及び９は、アラビドプシスタリアーナのエンド−１，４−ベータ−グルカナーゼのアポプラストシグナル及びフランキング領域の合成配列である。
配列番号１０は、キクｒｂｃＳ１プロモーター及び５′ＵＴＲの配列である。
配列番号１１は、キクｒｂｃＳ１ ３′ＵＴＲ及びターミネーターの配列である。
配列番号１２は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼベータサブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１３は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼベータサブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１４は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼアルファ−１サブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１５は、ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼアルファ−１サブユニットに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１６は、植物プロリル４−ヒドロキシラーゼに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１７は、植物プロリル４−ヒドロキシラーゼに融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号１８及び１９は、ヒトプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２０及び２１は、ヒトプロコラーゲンＩ Ｎ−プロテイナーゼのコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２２は、ヒトリシルヒドロキシラーゼ３に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列のコード領域及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２３は、ヒトリシルヒドロキシラーゼ３に融合されたチオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列及びフランキング領域を含む合成配列である。
配列番号２４は、チオールプロテアーゼアレウレイン前駆体についての大麦遺伝子の液胞シグナル配列である。
配列番号２５〜２８は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物又は単離された植物細胞中で生産された組み換えコラーゲンであって、植物又は単離された植物細胞の液胞に少なくとも一種のコラーゲン鎖及び外因性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）を標的化して、前記外因性Ｐ４Ｈによるが植物又は単離された植物細胞の内因性Ｐ４Ｈによらない前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のヒドロキシル化を可能にすることによって生産された組み換えコラーゲン。
【請求項２】
ウェスタンブロットによってアッセイされた場合に３３℃で１５分間安定である請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項３】
前記植物又は植物細胞は、リシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）、プロテアーゼＮ及びプロテアーゼＣからなる群から選択される外因性ポリペプチドを発現する請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項４】
Ｉ型コラーゲンである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項５】
前記Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項６】
前記コラーゲンは、哺乳類のコラーゲンである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項７】
前記哺乳類のコラーゲンは、ヒトのコラーゲンである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項８】
アルファ１鎖及びアルファ２鎖を含む請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項９】
前記少なくとも一種のコラーゲン鎖は、アルファ鎖を含む請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１０】
前記少なくとも一種のコラーゲン鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１１】
組み換えコラーゲンのコラーゲン鎖がＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置でヒドロキシル化されている請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１２】
前記哺乳類のＰ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである請求項５に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１３】
植物又は単離された植物細胞中でコラーゲンを生産する方法であって、少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び外因性Ｐ４Ｈを植物又は単離された植物細胞中で発現させ、それにより植物中でコラーゲンを生産させることを含み、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である、方法。
【請求項１４】
少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＰ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞であって、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である、植物又は単離された植物細胞。
【請求項１５】
以下のものを含む植物システム：
（ｉ）コラーゲンアルファ１鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び（ｉｉ）Ｐ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物；及び
（ｉ）コラーゲンアルファ２鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び（ｉｉ）Ｐ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物
ただし、前記コラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である。
【請求項１６】
（ａ）請求項１５の植物システムを得ること；
（ｂ）前記第一植物と前記第二植物を交配させること；及び
（ｃ）前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖を発現する子孫を選択し、それによりコラーゲンを生産すること
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
以下のものを含む植物システム：
（ｉ）コラーゲンアルファ１鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び（ｉｉ）コラーゲンアルファ２鎖をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物；及び
Ｐ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物
ただし、前記コラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である。
【請求項１８】
ヒトのＰ４Ｈ及び液胞に標的化するためのシグナルペプチドをコードし、かつＥＲ残留配列を欠いているポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能的なプロモーターの転写制御下に配置されている、核酸構築物。
【請求項１９】
前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである請求項１４に記載の植物又は単離された植物細胞。
【請求項２０】
外因性ＬＨ３を発現させることをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ１鎖を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ２鎖を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記植物は、ストレス条件に供される請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、寒さ、及びストレス誘導化合物の噴霧からなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
外因性ＬＨ３を発現させることをさらに含む請求項１４に記載の植物又は植物細胞。
【請求項２８】
前記少なくとも一種のコラーゲン鎖の配列は、配列番号１又は４に規定される配列である請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項２９】
前記コラーゲンアルファ鎖は、コラーゲンＥＲシグナルを欠く請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖は、コラーゲンＥＲシグナルを欠く請求項１５又は１７に記載の植物システム。
【請求項１】
植物又は単離された植物細胞中で生産された組み換えコラーゲンであって、植物又は単離された植物細胞の液胞に少なくとも一種のコラーゲン鎖及び外因性プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）を標的化して、前記外因性Ｐ４Ｈによるが植物又は単離された植物細胞の内因性Ｐ４Ｈによらない前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のヒドロキシル化を可能にすることによって生産された組み換えコラーゲン。
【請求項２】
ウェスタンブロットによってアッセイされた場合に３３℃で１５分間安定である請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項３】
前記植物又は植物細胞は、リシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）、プロテアーゼＮ及びプロテアーゼＣからなる群から選択される外因性ポリペプチドを発現する請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項４】
Ｉ型コラーゲンである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項５】
前記Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項６】
前記コラーゲンは、哺乳類のコラーゲンである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項７】
前記哺乳類のコラーゲンは、ヒトのコラーゲンである請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項８】
アルファ１鎖及びアルファ２鎖を含む請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項９】
前記少なくとも一種のコラーゲン鎖は、アルファ鎖を含む請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１０】
前記少なくとも一種のコラーゲン鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１１】
組み換えコラーゲンのコラーゲン鎖がＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置でヒドロキシル化されている請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１２】
前記哺乳類のＰ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈである請求項５に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項１３】
植物又は単離された植物細胞中でコラーゲンを生産する方法であって、少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖及び外因性Ｐ４Ｈを植物又は単離された植物細胞中で発現させ、それにより植物中でコラーゲンを生産させることを含み、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である、方法。
【請求項１４】
少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＰ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、遺伝的に改変された植物又は単離された植物細胞であって、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である、植物又は単離された植物細胞。
【請求項１５】
以下のものを含む植物システム：
（ｉ）コラーゲンアルファ１鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び（ｉｉ）Ｐ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物；及び
（ｉ）コラーゲンアルファ２鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び（ｉｉ）Ｐ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物
ただし、前記コラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である。
【請求項１６】
（ａ）請求項１５の植物システムを得ること；
（ｂ）前記第一植物と前記第二植物を交配させること；及び
（ｃ）前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖を発現する子孫を選択し、それによりコラーゲンを生産すること
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
以下のものを含む植物システム：
（ｉ）コラーゲンアルファ１鎖をコードする外因性ポリヌクレオチド及び（ｉｉ）コラーゲンアルファ２鎖をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第一の遺伝的に改変された植物；及び
Ｐ４Ｈをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、第二の遺伝的に改変された植物
ただし、前記コラーゲンアルファ１鎖及びコラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、液胞に標的化させるためのシグナルペプチドを含み、前記外因性Ｐ４Ｈは、ＥＲ残留配列を欠いており、前記外因性Ｐ４Ｈは、前記少なくとも一種のコラーゲン鎖のＧｌｙ−Ｘ−ＹトリプレットのＹ位置を特異的にヒドロキシル化することができ、前記外因性Ｐ４Ｈは、ヒトのＰ４Ｈ又はその相同体である。
【請求項１８】
ヒトのＰ４Ｈ及び液胞に標的化するためのシグナルペプチドをコードし、かつＥＲ残留配列を欠いているポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、植物細胞中で機能的なプロモーターの転写制御下に配置されている、核酸構築物。
【請求項１９】
前記コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンである請求項１４に記載の植物又は単離された植物細胞。
【請求項２０】
外因性ＬＨ３を発現させることをさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ１鎖を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、アルファ２鎖を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも一種のコラーゲンアルファ鎖は、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記植物は、ストレス条件に供される請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ストレス条件は、渇水、塩分、傷害、寒さ、及びストレス誘導化合物の噴霧からなる群から選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖のそれぞれは、Ｃ末端及び／又はＮ末端プロペプチドを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
外因性ＬＨ３を発現させることをさらに含む請求項１４に記載の植物又は植物細胞。
【請求項２８】
前記少なくとも一種のコラーゲン鎖の配列は、配列番号１又は４に規定される配列である請求項１に記載の組み換えコラーゲン。
【請求項２９】
前記コラーゲンアルファ鎖は、コラーゲンＥＲシグナルを欠く請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
前記コラーゲンアルファ１鎖及び前記コラーゲンアルファ２鎖は、コラーゲンＥＲシグナルを欠く請求項１５又は１７に記載の植物システム。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−８５６４４（Ｐ２０１２−８５６４４Ａ）
【公開日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５９６７８（Ｐ２０１１−２５９６７８）
【出願日】平成２３年１１月２９日（２０１１．１１．２９）
【分割の表示】特願２００７−５３４１７６（Ｐ２００７−５３４１７６）の分割
【原出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【出願人】（５０７１０１７４９）コルプラント リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月２９日（２０１１．１１．２９）
【分割の表示】特願２００７−５３４１７６（Ｐ２００７−５３４１７６）の分割
【原出願日】平成１７年９月２８日（２００５．９．２８）
【出願人】（５０７１０１７４９）コルプラント リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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