コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、しわ改善剤
【課題】コラーゲン、ヒアルロン酸産生抑制剤およびシワ改善剤を提供する。
【解決手段】デヒドロコスツスラクトンを含有するコラーゲン、ヒアルロン酸産生抑制剤およびシワ改善剤。
【解決手段】デヒドロコスツスラクトンを含有するコラーゲン、ヒアルロン酸産生抑制剤およびシワ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はデヒドロコスツスラクトンを含有するコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、しわ改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オゾン層の破壊や地球環境の変化によって、地上に届く紫外線量は増加する傾向にあり、これにより、紫外線による肌のしわ、シミ、ソバカス等の問題が以前にも増して大きくなっている。紫外線が皮膚に照射されると、皮膚内のチロシンがチロシナーゼの働きにより酸化された結果、メラニン色素が産生される。これが過剰となるとシミ、ソバカスなどの現象となって表れる。このメラニン色素の過剰な産生を抑制しシミ、ソバカスを予防する方法として、種々の成分が考案されてきた。例えば、皮膚化粧料にコウジ酸配糖体(特許文献１)を配合するものや、L-アスコルビン酸やその誘導体であるL-アスコルビン酸グルコースを添加する(例えば、特許文献２)、など多く提案されている。しかしながら、これらの物質は美白効果が必ずしも十分とは言えないものであったり、美白効果を認める濃度で配合すると、製剤の安全性や安定性に問題が生じることがあった。
また、デヒドロコスツスラクトンは抗腫瘍剤の有効成分として使用されることは特許文献３に記載されているように公知ではあるが、メラニン産生抑制能を有することまでは知られていない。
また、特許文献４に記載されているように、ウルソール酸が紫外線照射により生じた真皮コラーゲン繊維束の異常を正常化することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０４−０１９８１１号公報
【特許文献２】特許第２９８１５２３号公報
【特許文献３】特開平０７−１３８１５７号公報
【特許文献４】特開平１１−５７２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、優れたコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、しわ改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（１）下記化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【化１】
（２）上記化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
（３）上記化学式（Ｉ）で表されるデヒドロコスツスラクトンを含有するしわ改善剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明で用いる化学式（Ｉ）で表される、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進、しわ改善を有するデヒドロコスツスラクトンの性質を利用したコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、しわ改善剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】紫外線照射による単位細胞あたりのコラーゲンとヒアルロン酸生成の低下を示すグラフである。
【図２】UVA照射における単位細胞あたりコラーゲン生成
【図３】UVB照射における単位細胞あたりコラーゲン生成
【図４】UVA照射における単位細胞あたりヒアロルン酸生成
【図５】UVB照射における単位細胞あたりヒアロルン酸生成
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明に用いるデヒドロコスツスラクトンはフラノンの構造を有するセスキテルペノイドであり、ＩＵＰＡＣ名称、およびCASRNは以下に示す通りである。
IUPAC名称 Decahydro-3,6,9-tris(methylene)azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one
CASRN [477-43-0]
【０００９】
本発明に用いる前記化合物のデヒドロコスツスラクトンは、化学式（Ｉ）にて示される、フラノン環を有するセスキテルペンラクトンである。室温における性状は、白色結晶性粉末であり、木香(Saussurea lappa Clarke)、アーティチョーク、月桂樹、オオヤマレンゲ、ハマグリゼニゴケなどに含まれるとの報告がある。
また、市販の一般試薬を入手して用いることができる。(例 和光純薬工業製 商品番号No.040-21881など)
デヒドロコスツスラクトンはフラノン環を有するセスキテルペンラクトンであり、高い紫外線誘発変異抑制能を有し、紫外線により異常化した細胞機能を正常化する事により、美白、抗シワなど種々の有用性が期待される。培養細胞による試験結果で示されるように、紫外線照射により低下したコラーゲン、ヒアルロン酸生成の回復効果を有するものである。
【００１０】
本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤を直接化粧料成分として配合することにより、しわ改善剤を調製することができる。このしわ改善剤には、植物油、脂肪酸類、高級アルコール、シリコーン類、界面活性成分、水溶性合成高分子、増粘成分、粉体成分、保湿成分、紫外線吸収剤、紫外線遮蔽物、香料、金属キレート剤、pH調製剤などの公知の化粧料用成分を含有させることができる。さらには、抗炎症成分、活性酸素消去成分、血行促進成分、美白成分あるいは、その他の公知の添加剤である有効成分を配合することもできる。
【００１１】
しわ改善剤の形態としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、メイクアップベースクリームやファンデーション類(乳液状、クリーム状、粉状、あるいは軟膏タイプのものなど)等のメイクアップ化粧料、さらには、ハンドクリーム、ボディクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等が該当する。
【００１２】
このようなしわ改善剤は通常の方法に従って調製することができる。しわ改善剤におけるデヒドロコスツスラクトンの配合量は特に限定されるものではないが、例えば、化粧料全質量の０．０００１〜０．０５質量％、好ましくは０．００１〜０．０３質量％が適当である。
【実施例１】
【００１３】
紫外線照射により低下したコラーゲン、ヒアロルン酸生成の回復試験
（材料）
試薬
・ Ｄ−ＭＥＭ培地(Low Glucose) 和光純薬工業株式会社 No.041-29775
・ 仔牛血清(FBS) Hyclone
・ リン酸緩衝末(PBS(-) 0.01mol/L pH7.2-7.4) 和光純薬工業株式会社 No.162- 10321
・ MTT試薬 同人化学研究所 No.341-01823
・ 2-プロパノール
・ ハンクス平衡塩溶液(HBSS) 日水製薬株式会社
・ Procollagen type IC-peptide(PIP) EIA Kit タカラバイオ株式会社 No.MK101
・ Hyaluronan Assay Kit 生化学バイオビジネス株式会社 No.280566
【００１４】
評価物質
・ デヒドロコスツスラクトン 和光純薬工業株式会社 No.040-21881
・ ウルソール酸(対照として実施) 和光純薬工業株式会社 No.321-32831
【００１５】
細胞
・ 正常ヒト繊維芽細胞(NHFB) 三光純薬製
購入後数回継代して増殖し、アンプルに小分けして液体窒素または、-80℃フリーザーにて凍結保存した。使用前に３〜４回継代して供試した。
【００１６】
（培地の調製）
・ 細胞継代用培地
Ｄ−ＭＥＭ(Low Glucose)培地に非同化処理(56℃30分)した仔牛血清を10w/w％となるように添加して調製した。
・ コラーゲン測定用培地
Ｄ−ＭＥＭ(Low Glucose)培地に非同化処理(56℃30分)した仔牛血清を0.5w/w％となる様に添加して調製した。
【００１７】
（紫外線の照射条件）
・ ＵＶＡ
発光管は株式会社東芝製 FL20S-BLB 20W 4本を使用し、強度5mW/cm2にて、180秒間照射した。(9000mJ/cm2)
・ ＵＶＢ
三共電気株式会社製G40T10E 40W (ピーク波長 306nm)を使用し、強度0.7mW/cm2にて、80秒間照射した。(56mJ/cm2)
なお、紫外線量測定装置はClinical Supply Co.,Ltd. 製DRM-UV-M-2 を、センサーは同社のDMR-UV-ABBNB-2を使用した。
【００１８】
（試験方法）
正常ヒト繊維芽細胞を、細胞継代用培地にて37℃、CO２濃度5％のインキュベータで培養した。培養後、細胞継代用培地にて直径35mmのプレートに 8×104cells/プレート(4×104cells/mLを2mL)となるように播種し、同条件にて2日間培養した。その後、培地を除去しＰＢＳ（−）にて洗浄した後、HBSS 1mLを添加し、各条件の紫外線を照射した。紫外線を照射しないプレートも照射したプレートと同条件となるようにHBSS 1mLに置換し、同時間室温に置いた。処理後、速やかに、HBSSを除去し、各濃度の被験物質を含むコラーゲン測定用培地を添加した後、再び37℃、CO２濃度5％のインキュベータで4日間培養した。
なお、ＵＶＢを照射したヘアレスマウスの真皮コラーゲン繊維束を改善する効果が知られているウルソール酸（特許文献４）を対照として本発明の効果を検討した。
【００１９】
培養終了後、培養液を分取し、-80℃にて速やかに凍結した。(コラーゲン、ヒアルロン酸の測定に使用した。) 細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄した後、MTT試薬1mg/mLを溶解した継代用培地2mLを加えた。37℃、CO２濃度5％のインキュベータで3時間培養後培地を除去しＰＢＳ（−）にて洗浄した。2-プロパノール2mLを添加し、均一となるよう十分に攪拌した後、96ウェルプレートに100μLずつ分注した。570nmと650nmの波長における吸光度を測定し、以下の式にて細胞生存率を算出した。
細胞生存率(％)=（ｓ570−s650）／（c570−c650）×100
s570: 被験物質を添加したプレートの570nmの吸光度
s650: 被験物質を添加したプレートの650nmの吸光度
c570: 被験物質を添加しなかったプレートの570nmの吸光度
c650: 被験物質を添加しなかったプレートの650nmの吸光度
【００２０】
（Ｉ型コラーゲンの測定）(Procollagen typeIC-peptide(PIP) EIA Kitを使用)
培養液を室温にて解凍し、希釈液(1%ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ)にて4倍に希釈したものを測定に供した。
PIPモノクローナル抗体プレートの各ウェルにペルオキシダーゼ標識抗PIPモノクローナル抗体液100μLを入れた後、プロコラーゲン標準液(320ng/mLを最高濃度として、公比2にて6濃度を設定) または、検体20μLを添加し、37℃にて3時間反応した。反応後、液を捨てＰＢＳ（−）で十分に洗浄後、各ウェルに3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン溶液100μLを加え室温にて15分反応させた。その後、各ウェルに1Ｎ硫酸100μLを加え反応を停止させた。よく、混和した後、すみやかに450nmにて吸光度を測定した。なお、標準液については、各濃度3ウェルずつ、検体については各4ウェルずつ設定した。
【００２１】
（ヒアルロン酸の測定）(Hyaluronan Assay Kitを使用)
培養液を室温にて解凍し、反応液緩衝液にて4倍に希釈したものを検体液として測定に供した。 ヒアルロン酸固相化マイクロプレートをＰＢＳ（−）にて十分に洗浄後、ヒアルロン酸標準液(400ng/mLを最高濃度として、公比2にて7濃度設定)および検体液を各ウェルに50μLずつ添加した。次に、各ウェルにビオチン標識ＨＡＢＰ溶液50μLずつ添加後、37℃にて1時間反応した。反応後、液を捨てＰＢＳ（−）で十分に洗浄後、各ウェルにＨＲＰ標識ストレプトアジビン溶液100μLを加えた後、37℃にて1時間反応した。反応後、液を捨てＰＢＳ（−）で十分に洗浄後、各ウェルに酵素基質溶液100μLを加えた後、遮光下室温にて30分間静置した。その後、各ウェルに反応停止液100μLを添加し、混和後すみやかに測定波長492nmと対照波長630nmにて吸光度を測定した。なお、標準液については、各濃度3ウェルずつ、検体については各4ウェルずつ設定した。
【００２２】
（結果）
ＵＶＡ、ＵＶＢ照射によるコラーゲンとヒアロルン酸生成の低下
図１に各紫外線照射時のコラーゲンとヒアルロン生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。コラーゲン生成は非照射と比べ単位細胞あたりＵＶＡ照射時は73％に、ＵＶＢ照射時は57％に低下した。また、ヒアルロン酸生成は非照射と比べ単位細胞あたりＵＶＡ照射時は81％に、ＵＶＢ照射時は53％に低下した。この結果は、ＵＶＡ、ＵＶＢの照射によって、細胞内におけるコラーゲン及びヒアルロン酸の生成量が明らかに低下することを示している。
【００２３】
（コラーゲン生成）
図２にＵＶＡ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のコラーゲン生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.5μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。対照のウルソール酸も、20μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
図３にＵＶＢ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のコラーゲン生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.5μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。対照のウルソール酸も、25μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
この結果によれば、ＵＶＡ、ＵＶＢの照射によるコラーゲンの生成量の低下は、デヒドロコスツスラクトンの添加によって改善され、3.5μｇ/mLの量の添加によりＵＶＡやＵＶＢを照射しない状態と同様の状態となることが理解できる。さらにこの効果は、ウルソール酸の場合よりもはるかに少量の添加で良いことが明らかである。
【００２４】
（ヒアルロン酸生成）
図４にＵＶＡ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のヒアルロン酸生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.0μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。対照のウルソール酸も、25μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
図５にＵＶＢ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のヒアルロン酸生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.5μg/mLにて非照射時と同レベルまで増加した。
対照のウルソール酸は、25μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
この結果によれば、コラーゲンの生成と同様に、ＵＶＡ、ＵＶＢの照射によるヒアルロン酸の生成量の低下は、デヒドロコスツスラクトンの添加によって改善され、3.0〜3.5μｇ/mLの量の添加によりＵＶＡやＵＶＢを照射しない状態と同様の状態となることが理解できる。さらにこの効果は、ウルソール酸の場合よりもはるかに少量の添加で良いことが明らかである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はデヒドロコスツスラクトンを含有するコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、しわ改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オゾン層の破壊や地球環境の変化によって、地上に届く紫外線量は増加する傾向にあり、これにより、紫外線による肌のしわ、シミ、ソバカス等の問題が以前にも増して大きくなっている。紫外線が皮膚に照射されると、皮膚内のチロシンがチロシナーゼの働きにより酸化された結果、メラニン色素が産生される。これが過剰となるとシミ、ソバカスなどの現象となって表れる。このメラニン色素の過剰な産生を抑制しシミ、ソバカスを予防する方法として、種々の成分が考案されてきた。例えば、皮膚化粧料にコウジ酸配糖体(特許文献１)を配合するものや、L-アスコルビン酸やその誘導体であるL-アスコルビン酸グルコースを添加する(例えば、特許文献２)、など多く提案されている。しかしながら、これらの物質は美白効果が必ずしも十分とは言えないものであったり、美白効果を認める濃度で配合すると、製剤の安全性や安定性に問題が生じることがあった。
また、デヒドロコスツスラクトンは抗腫瘍剤の有効成分として使用されることは特許文献３に記載されているように公知ではあるが、メラニン産生抑制能を有することまでは知られていない。
また、特許文献４に記載されているように、ウルソール酸が紫外線照射により生じた真皮コラーゲン繊維束の異常を正常化することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０４−０１９８１１号公報
【特許文献２】特許第２９８１５２３号公報
【特許文献３】特開平０７−１３８１５７号公報
【特許文献４】特開平１１−５７２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、優れたコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、しわ改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（１）下記化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【化１】
（２）上記化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
（３）上記化学式（Ｉ）で表されるデヒドロコスツスラクトンを含有するしわ改善剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明で用いる化学式（Ｉ）で表される、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進、しわ改善を有するデヒドロコスツスラクトンの性質を利用したコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、しわ改善剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】紫外線照射による単位細胞あたりのコラーゲンとヒアルロン酸生成の低下を示すグラフである。
【図２】UVA照射における単位細胞あたりコラーゲン生成
【図３】UVB照射における単位細胞あたりコラーゲン生成
【図４】UVA照射における単位細胞あたりヒアロルン酸生成
【図５】UVB照射における単位細胞あたりヒアロルン酸生成
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明に用いるデヒドロコスツスラクトンはフラノンの構造を有するセスキテルペノイドであり、ＩＵＰＡＣ名称、およびCASRNは以下に示す通りである。
IUPAC名称 Decahydro-3,6,9-tris(methylene)azuleno[4,5-b]furan-2(3H)-one
CASRN [477-43-0]
【０００９】
本発明に用いる前記化合物のデヒドロコスツスラクトンは、化学式（Ｉ）にて示される、フラノン環を有するセスキテルペンラクトンである。室温における性状は、白色結晶性粉末であり、木香(Saussurea lappa Clarke)、アーティチョーク、月桂樹、オオヤマレンゲ、ハマグリゼニゴケなどに含まれるとの報告がある。
また、市販の一般試薬を入手して用いることができる。(例 和光純薬工業製 商品番号No.040-21881など)
デヒドロコスツスラクトンはフラノン環を有するセスキテルペンラクトンであり、高い紫外線誘発変異抑制能を有し、紫外線により異常化した細胞機能を正常化する事により、美白、抗シワなど種々の有用性が期待される。培養細胞による試験結果で示されるように、紫外線照射により低下したコラーゲン、ヒアルロン酸生成の回復効果を有するものである。
【００１０】
本発明のコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤を直接化粧料成分として配合することにより、しわ改善剤を調製することができる。このしわ改善剤には、植物油、脂肪酸類、高級アルコール、シリコーン類、界面活性成分、水溶性合成高分子、増粘成分、粉体成分、保湿成分、紫外線吸収剤、紫外線遮蔽物、香料、金属キレート剤、pH調製剤などの公知の化粧料用成分を含有させることができる。さらには、抗炎症成分、活性酸素消去成分、血行促進成分、美白成分あるいは、その他の公知の添加剤である有効成分を配合することもできる。
【００１１】
しわ改善剤の形態としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、メイクアップベースクリームやファンデーション類(乳液状、クリーム状、粉状、あるいは軟膏タイプのものなど)等のメイクアップ化粧料、さらには、ハンドクリーム、ボディクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等が該当する。
【００１２】
このようなしわ改善剤は通常の方法に従って調製することができる。しわ改善剤におけるデヒドロコスツスラクトンの配合量は特に限定されるものではないが、例えば、化粧料全質量の０．０００１〜０．０５質量％、好ましくは０．００１〜０．０３質量％が適当である。
【実施例１】
【００１３】
紫外線照射により低下したコラーゲン、ヒアロルン酸生成の回復試験
（材料）
試薬
・ Ｄ−ＭＥＭ培地(Low Glucose) 和光純薬工業株式会社 No.041-29775
・ 仔牛血清(FBS) Hyclone
・ リン酸緩衝末(PBS(-) 0.01mol/L pH7.2-7.4) 和光純薬工業株式会社 No.162- 10321
・ MTT試薬 同人化学研究所 No.341-01823
・ 2-プロパノール
・ ハンクス平衡塩溶液(HBSS) 日水製薬株式会社
・ Procollagen type IC-peptide(PIP) EIA Kit タカラバイオ株式会社 No.MK101
・ Hyaluronan Assay Kit 生化学バイオビジネス株式会社 No.280566
【００１４】
評価物質
・ デヒドロコスツスラクトン 和光純薬工業株式会社 No.040-21881
・ ウルソール酸(対照として実施) 和光純薬工業株式会社 No.321-32831
【００１５】
細胞
・ 正常ヒト繊維芽細胞(NHFB) 三光純薬製
購入後数回継代して増殖し、アンプルに小分けして液体窒素または、-80℃フリーザーにて凍結保存した。使用前に３〜４回継代して供試した。
【００１６】
（培地の調製）
・ 細胞継代用培地
Ｄ−ＭＥＭ(Low Glucose)培地に非同化処理(56℃30分)した仔牛血清を10w/w％となるように添加して調製した。
・ コラーゲン測定用培地
Ｄ−ＭＥＭ(Low Glucose)培地に非同化処理(56℃30分)した仔牛血清を0.5w/w％となる様に添加して調製した。
【００１７】
（紫外線の照射条件）
・ ＵＶＡ
発光管は株式会社東芝製 FL20S-BLB 20W 4本を使用し、強度5mW/cm2にて、180秒間照射した。(9000mJ/cm2)
・ ＵＶＢ
三共電気株式会社製G40T10E 40W (ピーク波長 306nm)を使用し、強度0.7mW/cm2にて、80秒間照射した。(56mJ/cm2)
なお、紫外線量測定装置はClinical Supply Co.,Ltd. 製DRM-UV-M-2 を、センサーは同社のDMR-UV-ABBNB-2を使用した。
【００１８】
（試験方法）
正常ヒト繊維芽細胞を、細胞継代用培地にて37℃、CO２濃度5％のインキュベータで培養した。培養後、細胞継代用培地にて直径35mmのプレートに 8×104cells/プレート(4×104cells/mLを2mL)となるように播種し、同条件にて2日間培養した。その後、培地を除去しＰＢＳ（−）にて洗浄した後、HBSS 1mLを添加し、各条件の紫外線を照射した。紫外線を照射しないプレートも照射したプレートと同条件となるようにHBSS 1mLに置換し、同時間室温に置いた。処理後、速やかに、HBSSを除去し、各濃度の被験物質を含むコラーゲン測定用培地を添加した後、再び37℃、CO２濃度5％のインキュベータで4日間培養した。
なお、ＵＶＢを照射したヘアレスマウスの真皮コラーゲン繊維束を改善する効果が知られているウルソール酸（特許文献４）を対照として本発明の効果を検討した。
【００１９】
培養終了後、培養液を分取し、-80℃にて速やかに凍結した。(コラーゲン、ヒアルロン酸の測定に使用した。) 細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄した後、MTT試薬1mg/mLを溶解した継代用培地2mLを加えた。37℃、CO２濃度5％のインキュベータで3時間培養後培地を除去しＰＢＳ（−）にて洗浄した。2-プロパノール2mLを添加し、均一となるよう十分に攪拌した後、96ウェルプレートに100μLずつ分注した。570nmと650nmの波長における吸光度を測定し、以下の式にて細胞生存率を算出した。
細胞生存率(％)=（ｓ570−s650）／（c570−c650）×100
s570: 被験物質を添加したプレートの570nmの吸光度
s650: 被験物質を添加したプレートの650nmの吸光度
c570: 被験物質を添加しなかったプレートの570nmの吸光度
c650: 被験物質を添加しなかったプレートの650nmの吸光度
【００２０】
（Ｉ型コラーゲンの測定）(Procollagen typeIC-peptide(PIP) EIA Kitを使用)
培養液を室温にて解凍し、希釈液(1%ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ)にて4倍に希釈したものを測定に供した。
PIPモノクローナル抗体プレートの各ウェルにペルオキシダーゼ標識抗PIPモノクローナル抗体液100μLを入れた後、プロコラーゲン標準液(320ng/mLを最高濃度として、公比2にて6濃度を設定) または、検体20μLを添加し、37℃にて3時間反応した。反応後、液を捨てＰＢＳ（−）で十分に洗浄後、各ウェルに3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン溶液100μLを加え室温にて15分反応させた。その後、各ウェルに1Ｎ硫酸100μLを加え反応を停止させた。よく、混和した後、すみやかに450nmにて吸光度を測定した。なお、標準液については、各濃度3ウェルずつ、検体については各4ウェルずつ設定した。
【００２１】
（ヒアルロン酸の測定）(Hyaluronan Assay Kitを使用)
培養液を室温にて解凍し、反応液緩衝液にて4倍に希釈したものを検体液として測定に供した。 ヒアルロン酸固相化マイクロプレートをＰＢＳ（−）にて十分に洗浄後、ヒアルロン酸標準液(400ng/mLを最高濃度として、公比2にて7濃度設定)および検体液を各ウェルに50μLずつ添加した。次に、各ウェルにビオチン標識ＨＡＢＰ溶液50μLずつ添加後、37℃にて1時間反応した。反応後、液を捨てＰＢＳ（−）で十分に洗浄後、各ウェルにＨＲＰ標識ストレプトアジビン溶液100μLを加えた後、37℃にて1時間反応した。反応後、液を捨てＰＢＳ（−）で十分に洗浄後、各ウェルに酵素基質溶液100μLを加えた後、遮光下室温にて30分間静置した。その後、各ウェルに反応停止液100μLを添加し、混和後すみやかに測定波長492nmと対照波長630nmにて吸光度を測定した。なお、標準液については、各濃度3ウェルずつ、検体については各4ウェルずつ設定した。
【００２２】
（結果）
ＵＶＡ、ＵＶＢ照射によるコラーゲンとヒアロルン酸生成の低下
図１に各紫外線照射時のコラーゲンとヒアルロン生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。コラーゲン生成は非照射と比べ単位細胞あたりＵＶＡ照射時は73％に、ＵＶＢ照射時は57％に低下した。また、ヒアルロン酸生成は非照射と比べ単位細胞あたりＵＶＡ照射時は81％に、ＵＶＢ照射時は53％に低下した。この結果は、ＵＶＡ、ＵＶＢの照射によって、細胞内におけるコラーゲン及びヒアルロン酸の生成量が明らかに低下することを示している。
【００２３】
（コラーゲン生成）
図２にＵＶＡ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のコラーゲン生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.5μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。対照のウルソール酸も、20μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
図３にＵＶＢ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のコラーゲン生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.5μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。対照のウルソール酸も、25μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
この結果によれば、ＵＶＡ、ＵＶＢの照射によるコラーゲンの生成量の低下は、デヒドロコスツスラクトンの添加によって改善され、3.5μｇ/mLの量の添加によりＵＶＡやＵＶＢを照射しない状態と同様の状態となることが理解できる。さらにこの効果は、ウルソール酸の場合よりもはるかに少量の添加で良いことが明らかである。
【００２４】
（ヒアルロン酸生成）
図４にＵＶＡ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のヒアルロン酸生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.0μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。対照のウルソール酸も、25μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
図５にＵＶＢ照射におけるデヒドロコスツスラクトン添加時のヒアルロン酸生成を、非照射時を100％とした時の比率で示す。デヒドロコスツスラクトン添加時における単位細胞あたりのコラーゲン生成率は3.5μg/mLにて非照射時と同レベルまで増加した。
対照のウルソール酸は、25μg/mLにて、非照射時と同レベルまで増加した。
この結果によれば、コラーゲンの生成と同様に、ＵＶＡ、ＵＶＢの照射によるヒアルロン酸の生成量の低下は、デヒドロコスツスラクトンの添加によって改善され、3.0〜3.5μｇ/mLの量の添加によりＵＶＡやＵＶＢを照射しない状態と同様の状態となることが理解できる。さらにこの効果は、ウルソール酸の場合よりもはるかに少量の添加で良いことが明らかである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【化１】
【請求項２】
次の化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【化１】
【請求項３】
次の化学式（Ｉ）で表されるデヒドロコスツスラクトンを含有するしわ改善剤。
【化１】
【請求項１】
次の化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【化１】
【請求項２】
次の化学式（Ｉ）で表される、デヒドロコスツスラクトンを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【化１】
【請求項３】
次の化学式（Ｉ）で表されるデヒドロコスツスラクトンを含有するしわ改善剤。
【化１】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−６２２８７（Ｐ２０１２−６２２８７Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０９０７３（Ｐ２０１０−２０９０７３）
【出願日】平成２２年９月１７日（２０１０．９．１７）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１７日（２０１０．９．１７）
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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