コラーゲン産生促進剤
【課題】コラーゲン産生細胞からのコラーゲンの産生を促進し、しかも体に優しい植物由来の成分からなるコラーゲン産生促進剤、化粧料、コラーゲン産生促進のための経口用組成物を提供する。
【解決手段】ピセアタンノールをコラーゲン産生促進のための有効成分とする。ピセアタンノールは、天然物由来であることが好ましく、植物由来であることがより好ましい。パッションフルーツの種子にはピセアタンノールが高含有に含まれているので、その抽出物を用いることが好ましい。本発明は、コラーゲン産生促進のための化粧料や、経口用組成物として好ましく用いられる。
【解決手段】ピセアタンノールをコラーゲン産生促進のための有効成分とする。ピセアタンノールは、天然物由来であることが好ましく、植物由来であることがより好ましい。パッションフルーツの種子にはピセアタンノールが高含有に含まれているので、その抽出物を用いることが好ましい。本発明は、コラーゲン産生促進のための化粧料や、経口用組成物として好ましく用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピセアタンノールを有効成分とするコラーゲン産生促進剤に関し、より詳細には、パッションフルーツ種子由来のピセアタンノールを有効成分とするコラーゲン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌荒れや小じわなどを予防・改善するためには皮膚の潤いと張りを保持することが重要であり、肌の保湿性や弾力性の維持効果を有する様々な成分を配合した化粧品が市販されている。皮膚の構成成分であるコラーゲンは、真皮層に多く存在して保水性や弾力性に大きく関与している。加齢などにより、これらの量が減少すると皮膚の保水性や弾力性が失われてしまい、肌荒れや小じわ等の原因となる。また、コラーゲンは結合組織や軟骨組織などにも多く分布し、細胞の機能や形態を維持するのに役立っている。したがって、若さを保ち美容及び健康を維持する上では、コラーゲン産生細胞によるコラーゲン産生を促進して、加齢などによるコラーゲンの減少を抑えることが望ましい。
【０００３】
下記非特許文献１には、ぶどう由来のポリフェノール類化合物であるレスベラトロール(Resveratrol)やピセアタンノール(Piceatannol)には、メラニン産生細胞によるメラニンの生成を抑制する作用効果があることが開示されている。
【非特許文献１】Takako Yokozawa and You Jung Kim, Piceatannol Inhibits Melanogenesis by Its Antioxidative Actions, Biological & Pharmaceutical Bulletin Vol. 30 (2007) No. 11 p2007-2011
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、皮膚組織、結合組織、軟骨組織などでのコラーゲンの産生を促進し、しかも体に優しい植物由来の成分からなるコラーゲン産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、パッションフルーツ種子由来のピセアタンノールが、コラーゲン産生細胞によるコラーゲンの産生を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の構成を有するコラーゲン産生促進剤を提供する。
［１］ピセアタンノールを有効成分とすることを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
［２］固形状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
［３］液状又はゲル状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
［４］前記化合物はピセアタンノールである前記［２］又は［３］記載のコラーゲン産生促進剤。
［５］化粧料として用いられる前記［１］〜［４］のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
［６］経口用組成物として用いられる前記［１］〜［４］のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、皮膚組織、結合組織、軟骨組織などでのコラーゲン産生を促進し、皮膚組織においては、肌の保湿性や弾力性の維持効果を有する組織の機能を維持・促進し、結合組織、軟骨組織などにおいては、それらの組織を構成する細胞の機能を維持・促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において用いられるピセアタンノール（Piceatannol）は下記化学式で表される。
【０００９】
【化１】
ピセアタンノールは化学合成品であってもよいが、天然物由来であることが好ましく、植物由来であることがより好ましい。例えば、後述する実施例で示すように、パッションフルーツの種子にはピセアタンノールが高含有に含まれているので、その抽出物を用いることが好ましい。
【００１０】
また、上記化学式で表されるピセアタンノールは、２個のフェニル基がトランス型のアルケン基で連結した構造の、トランス型ピセアタンノールであるが、上記化学式において、２個のフェニル基がシス型のアルケン基で連結した構造の、シス型ピセアタンノールを用いることもできる。
【００１１】
パッションフルーツは、パッシフローラ属トケイソウ科の植物であり、別名：クダモノトケイソウ(果物時計草)とよばれ、その実は甘酸っぱく果物として実をそのまま食したり、その果汁をジュースにして飲んだり、ゼリー、ケーキ等の飲食品に配合して、風味付けに用いられたりされている。パッションフルーツの種子は硬く、ジュースなどにする場合には果実から取り除かれ、果実を種ごと飲食した場合であってもその外皮は硬く消化を受けにくいのでそのまま排泄されてしまう。このような背景のなか、パッションフルーツの種子を有効利用するという面でも、ピセアタンノールの起源としては、パッションフルーツの種子であることが好ましい。パッションフルーツの種子抽出物は、パッションフルーツの食経験からも裏付けられるように、安全性には問題がないものである。
【００１２】
パッションフルーツの種子抽出物の調製方法は特に限定されが、例えば、種子を細断、破砕、又は磨砕等し、種々の溶媒を用いて抽出する方法があげられる。抽出温度は適宜設定することができる。また、上記種子は、抽出効率をよくするため、適宜、酸又はアルカリ分解、酵素分解等の化学的処理を施してから抽出することもできる。
【００１３】
抽出溶媒としては、水、エタノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。これらの中で、熱水又はエタノール含有水は、後述するポリフェノール関連化合物を含む有効成分を効率よく抽出することができるので好ましい。
【００１４】
パッションフルーツの種子抽出物は、上記の方法で得られた抽出液を、そのまま又は濃縮して液体のまま用いてもよく、更に上記抽出液を凍結乾燥又は噴霧乾燥により粉末化して用いることもできる。抽出物中に含まれる不溶物は、適宜、濾過などで除くことができる。不溶物はさらに粉砕し、微細粒子状にしてもよい。
【００１５】
パッションフルーツの種子抽出物は、上記のようにして得られる一次抽出物をそのまま用いてもよいが、これをイオン交換、サイズ排除カラムクロマト法、ＨＰＬＣ法、ゲルろ過、膜分離等により、分画、精製して用いることもできる。特に、後述する実施例で示されるように、ピセアタンノールがコラーゲン産生促進活性の有効成分であることから、ＨＰＬＣ等その他の公知の方法で、ピセアタンノールを基準にして高度に精製し、これを用いることができる。
【００１６】
具体的には、例えば、パッションフルーツの種子抽出物の一次抽出物を下記条件でＨＰＬＣにかけたときの保持時間が１９〜２２分に溶出される化合物であり、質量分析装置によるマススペクトル測定によってネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する化合物を基準にして、ＨＰＬＣ等により分画、分取して、これを用いることができる。
［ＨＰＬＣ条件］
・ カラム：Mightysil RP-18 GP250-10 径10mm、長さ250mm（関東化学株式会社製）
・ カラム温度：40℃
・ 溶出条件：流速3ml/min、0％メタノール→30％メタノール（10min）
・ ＵＶ検出：280nm
本発明のコラーゲン産生促進剤の使用形態としては、肌のつややはりの衰えを予防したい部位、又はこれらを改善したい部位、乾燥肌の部位などに塗布することができる。あるいは、経口的に摂取して、体の中から作用させるようにしてもよい。
【００１７】
本発明のコラーゲン産生促進剤の有効投与量は、皮膚に塗布する場合には、ピセアタンノール換算で、単位面積あたり一回およそ1.25〜2500μｇ／ｃｍ２である。経口摂取する場合には、ピセアタンノール換算で、成人１日当りおよそ125〜250000μｇである。
【００１８】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、液剤、軟膏剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ゼリー状剤等に製剤化することができる。これらの製剤化は常法に従って行なえばよい。
【００１９】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生促進のための経口用組成物とすることができ、皮膚に適用される化粧料、医薬部外品等の製品形態とすることもできる、また、本発明のコラーゲン産生促進剤を、各種飲食品に添加して、コラーゲン産生促進効果が期待できる飲食品とすることもできる。各製品形態とした場合におけるパッションフルーツの種子抽出物の含有量は、その製品が使用される量と有効投与量との関係を勘案して適宜定めればよく、特に制限されるものではないが、通常、固形状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.00005〜5質量％含有させることが好ましく、0.00005〜1質量％含有させることがより好ましい。そして、液状又はゼリー状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.00005〜5質量％含有させることが好ましく、0.00005〜1質量％含有させることがより好ましい。
【実施例】
【００２０】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２１】
＜試験例１＞
パッションフルーツの部位ごとに抽出物を調製し、そのコラーゲン産生促進効果を検討した。
【００２２】
[サンプル調整方法]
パッションフルーツは果皮・果肉・種子の３つの部位に分け、それぞれをフリーズドライして粉砕し、各部位を８０％エタノールで抽出した。遠心後その上清をとりエバポレートで濃縮後、フリーズドライして粉末にした。この粉末を水に溶かして抽出物とした。
【００２３】
[培養細胞を用いたアッセイ方法]
９６−ウェルプレートにヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を1×104/well播種し、MEMα（10％FBS）で２４時間培養した。２４時間後、培地を吸引除去し、固形分濃度換算で0〜1000μg/mlの抽出物濃度となるように上記抽出物を低血清のM106培地（Cascade Biologics社製）に添加して調製した培地を、各１ウェル中に０．２ｍｌずつ添加した。３日間培養後、培地を回収して10000rpm、4℃で5分間遠心分離し、その上清について、コラーゲン定量キットである「Sircol soluble collagen assayキット」（商品名、英国Biocolor社製）を用いて水溶性コラーゲン濃度を定量した。図１には、抽出物を添加しない対照（コントロール）に対するコラーゲン生成量の比を示す。
【００２４】
図１（ａ）及び図１（ｂ）に示すように、パッションフルーツの果皮又は果肉からの抽出物においては、最大濃度1000μg/mlでも、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）からのコラーゲン産生を促進する効果は認められなかった。また、100〜500μg/mlの濃度範囲では、その原因は明らかではないが、産生阻害効果が見られた。これに対し、図１（ｃ）に示すように、パッションフルーツの種子抽出物には、100〜200μg/mlの濃度範囲で、コラーゲン産生促進効果が認められた。なお、上記の試験における抽出物の濃度範囲で、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）に対する細胞毒性がないことは別途確認した。
【００２５】
＜試験例２＞
パッションフルーツの種子抽出物の活性成分を探るため、以下のような実験を行った。
【００２６】
すなわち、活性のあった種子抽出物を、ポリフェノールを吸着する樹脂であるポリビニルポリピロリドン（PVPP：Polyvinylpolypyrrolidone）を水で膨潤させたものとともに３０分間攪拌し、15000rpmで１５分遠心分離し、上清を種子抽出物のPVPP処理サンプルとした。なお、サンプル中のポリフェノール濃度をFolin-Ciocalteu法で測定した結果、このPVPP処理によりポリフェノール濃度は９５％以上低下していた。したがって、PVPP処理により大部分のポリフェノールは除かれたことが確認された。
【００２７】
図２に示すように、PVPP処理を行った結果、種子抽出物にコラーゲン産生促進効果が見られなくなった。したがって、種子抽出物中のポリフェノールが主な活性成分であることが示唆された。
【００２８】
＜試験例３＞
パッションフルーツの種子抽出物の活性成分の同定を、以下のようにして行った。
【００２９】
まず、試験例１と同様にして調製されたパッションフルーツの種子抽出物（４ｍｌ）を、ODSカラムを用いたＨＰＬＣによって分画した。
【００３０】
ＨＰＬＣ条件は、以下のとおりとした。
・ カラム：Mightysil RP-18 GP250-10 径10mm、長さ250mm（関東化学株式会社製）
・ カラム温度：40℃
・ 溶出条件：流速3ml/min、0％メタノール→30％メタノール（10min）
・ ＵＶ検出：280nm
ODSカラムからの溶出フラクションを図３に示すように、フラクション１、フラクション２、フラクション３の３つに分け、得られたフラクションの溶媒をエバポレート後に凍結乾燥し、水によってもとの粗抽出物の体積に戻した。そして、試験例１、２と同様にして、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）によるコラーゲン産生に与える影響を調べた。
【００３１】
具体的には、９６−ウェルプレートにヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を７×103/well播種し、MEM（10％FBS）で２４時間培養した。２４時間後、培地を吸引除去し、もとの粗抽出液の固形分濃度換算で100μg/ml相当の濃度となるように、上記フラクションからの溶出フラクション組成物を低血清のM106培地（Cascade Biologics社製）に添加して培地を調製し、各１ウェル中に０．２ｍｌずつ添加した。３日間培養後、培地を回収し、試験例１と同様にして水溶性コラーゲン濃度を定量した。図４には、抽出物を添加しない対照（コントロール）に対するコラーゲン生成量の比を示す。
【００３２】
図４に明らかなように、フラクション１とフラクション３からの溶出フラクション組成物にはコラーゲン生成促進効果は認められなかった。一方、フラクション２からの溶出フラクション組成物には粗抽出物とほぼ同等の活性が認められた。したがって、上記ＨＰＬＣにおいて保持時間２０．６分に溶出する成分が、パッションフルーツの種子抽出物によるコラーゲン生成促進効果の活性成分であると考えられた。
【００３３】
そこで、上記保持時間２０．６分に溶出する成分について、ＨＰＬＣ／質量分析装置（サーモエレクトロン株式会社製、装置名「Thermo-LCQ-MS/MS」）を用いて、そのマススペクトルを測定した（図５Ａ）。なお、ポジティブ、ネガティブの両イオンモードで検討したがネガティブに良好なイオンが見出されたので、そのデータを用いた。その結果、主要シグナルｍ／ｚ２４３は、（Ｍ−Ｈ）−であり、その他のピークｍ／ｚ２７９は（Ｍ＋２Ｈ２Ｏ−Ｈ）−と帰属され、ｍ／ｚ４８７は（Ｍ×２−Ｈ）−と帰属できた。したがって、分子量が２４４と決定できた。また、ＵＶスペクトルを取ると、λｍａｘとして、220nm、304nm、322nmが観察された（図５Ｂ）。
【００３４】
これらのマススペクトルやＵＶスペクトルの結果は、ピーナッツ果皮に含まれるポリフェノールであるレスベラトロール(Resveratrol、分子量228)に類似していた（図６Ａ，Ｂ参照）。また、上記ＨＰＬＣ条件でのレスベラトロールの保持時間が２４．５分であり、未知化合物はレスベラトロールよりも逆相カラムでの保持時間が小さいことから、水酸基１個分の分子量が大きい、下記式（１）で表されるピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)であることが推定された。
【００３５】
【化２】
そこで、ピセアタンノールの純化合物（シグマ社製）について、上記と同じ条件でのＨＰＬＣ分析を行ない（図７）、さらにマススペクトルやＵＶスペクトルを得た（図８Ａ，Ｂ）。その結果、ＨＰＬＣにおける保持時間や、マススペクトルやＵＶスペクトルの帰属が全て一致した。よって、パッションフルーツの種子抽出物の活性成分が、ピセアタンノールであることが明らかとなった。
【００３６】
＜試験例４＞
試験例１と同様にして調製されたパッションフルーツの種子抽出物について、そのピセアタンノール含量を、上記ＨＰＬＣ分析によるピーク面積を利用した標準濃度の検量線から求めた。その含有量は約１．９μｇ／１００μｇ粗抽出物（１．９質量％）であった。また、パッションフルーツの種子抽出物中の含有量から原料とされたパッションフルーツの種子のフリーズドライ乾燥物中の含有量を算出すると、約１ｍｇ／ｇであった。そこで、ピセアタンノール換算で０、４．５、９、１８μＭの濃度となるように培養液に添加した以外は、試験例３と同様にして、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）によるコラーゲン産生に与える影響を調べた。また、ピセアタンノールの純化合物についても同様にコラーゲン産生に与える影響を調べた。その結果を図９に示す。
【００３７】
図９に明らかなように、パッションフルーツの種子抽出物と、ピセアタンノールの純化合物の両者は、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）によるコラーゲン産生促進効果ついて、ピセアタンノール換算で０〜１８μＭの濃度範囲において、ほぼ同等の濃度依存性を示した。よって、パッションフルーツの種子抽出物の活性成分がピセアタンノールであることが明らかであった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】果皮（ａ）、果肉（ｂ）及び種子（ｃ）からの抽出物のコラーゲン産生促進効果を示す図表である。
【図２】種子抽出物及びポリフェノールを除いた種子抽出物のコラーゲン産生促進効果を示す図表である。
【図３】種子抽出物のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す図表である。
【図４】ＨＰＬＣで分画された種子抽出物の各溶出フラクション組成物によるコラーゲン産生促進効果を示す図表である。
【図５】種子抽出物中の未知化合物のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図６】レスベラトロール(Resveratrol、分子量228)のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図７】ピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す図表である。
【図８】ピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図９】パッションフルーツの種子抽出物によるコラーゲン産生促進効果とピセアタンノールの純化合物によるコラーゲン産生促進効果とを比較した図表である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピセアタンノールを有効成分とするコラーゲン産生促進剤に関し、より詳細には、パッションフルーツ種子由来のピセアタンノールを有効成分とするコラーゲン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌荒れや小じわなどを予防・改善するためには皮膚の潤いと張りを保持することが重要であり、肌の保湿性や弾力性の維持効果を有する様々な成分を配合した化粧品が市販されている。皮膚の構成成分であるコラーゲンは、真皮層に多く存在して保水性や弾力性に大きく関与している。加齢などにより、これらの量が減少すると皮膚の保水性や弾力性が失われてしまい、肌荒れや小じわ等の原因となる。また、コラーゲンは結合組織や軟骨組織などにも多く分布し、細胞の機能や形態を維持するのに役立っている。したがって、若さを保ち美容及び健康を維持する上では、コラーゲン産生細胞によるコラーゲン産生を促進して、加齢などによるコラーゲンの減少を抑えることが望ましい。
【０００３】
下記非特許文献１には、ぶどう由来のポリフェノール類化合物であるレスベラトロール(Resveratrol)やピセアタンノール(Piceatannol)には、メラニン産生細胞によるメラニンの生成を抑制する作用効果があることが開示されている。
【非特許文献１】Takako Yokozawa and You Jung Kim, Piceatannol Inhibits Melanogenesis by Its Antioxidative Actions, Biological & Pharmaceutical Bulletin Vol. 30 (2007) No. 11 p2007-2011
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、皮膚組織、結合組織、軟骨組織などでのコラーゲンの産生を促進し、しかも体に優しい植物由来の成分からなるコラーゲン産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、パッションフルーツ種子由来のピセアタンノールが、コラーゲン産生細胞によるコラーゲンの産生を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の構成を有するコラーゲン産生促進剤を提供する。
［１］ピセアタンノールを有効成分とすることを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
［２］固形状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
［３］液状又はゲル状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
［４］前記化合物はピセアタンノールである前記［２］又は［３］記載のコラーゲン産生促進剤。
［５］化粧料として用いられる前記［１］〜［４］のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
［６］経口用組成物として用いられる前記［１］〜［４］のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、皮膚組織、結合組織、軟骨組織などでのコラーゲン産生を促進し、皮膚組織においては、肌の保湿性や弾力性の維持効果を有する組織の機能を維持・促進し、結合組織、軟骨組織などにおいては、それらの組織を構成する細胞の機能を維持・促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において用いられるピセアタンノール（Piceatannol）は下記化学式で表される。
【０００９】
【化１】
ピセアタンノールは化学合成品であってもよいが、天然物由来であることが好ましく、植物由来であることがより好ましい。例えば、後述する実施例で示すように、パッションフルーツの種子にはピセアタンノールが高含有に含まれているので、その抽出物を用いることが好ましい。
【００１０】
また、上記化学式で表されるピセアタンノールは、２個のフェニル基がトランス型のアルケン基で連結した構造の、トランス型ピセアタンノールであるが、上記化学式において、２個のフェニル基がシス型のアルケン基で連結した構造の、シス型ピセアタンノールを用いることもできる。
【００１１】
パッションフルーツは、パッシフローラ属トケイソウ科の植物であり、別名：クダモノトケイソウ(果物時計草)とよばれ、その実は甘酸っぱく果物として実をそのまま食したり、その果汁をジュースにして飲んだり、ゼリー、ケーキ等の飲食品に配合して、風味付けに用いられたりされている。パッションフルーツの種子は硬く、ジュースなどにする場合には果実から取り除かれ、果実を種ごと飲食した場合であってもその外皮は硬く消化を受けにくいのでそのまま排泄されてしまう。このような背景のなか、パッションフルーツの種子を有効利用するという面でも、ピセアタンノールの起源としては、パッションフルーツの種子であることが好ましい。パッションフルーツの種子抽出物は、パッションフルーツの食経験からも裏付けられるように、安全性には問題がないものである。
【００１２】
パッションフルーツの種子抽出物の調製方法は特に限定されが、例えば、種子を細断、破砕、又は磨砕等し、種々の溶媒を用いて抽出する方法があげられる。抽出温度は適宜設定することができる。また、上記種子は、抽出効率をよくするため、適宜、酸又はアルカリ分解、酵素分解等の化学的処理を施してから抽出することもできる。
【００１３】
抽出溶媒としては、水、エタノール等の低級アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。これらの中で、熱水又はエタノール含有水は、後述するポリフェノール関連化合物を含む有効成分を効率よく抽出することができるので好ましい。
【００１４】
パッションフルーツの種子抽出物は、上記の方法で得られた抽出液を、そのまま又は濃縮して液体のまま用いてもよく、更に上記抽出液を凍結乾燥又は噴霧乾燥により粉末化して用いることもできる。抽出物中に含まれる不溶物は、適宜、濾過などで除くことができる。不溶物はさらに粉砕し、微細粒子状にしてもよい。
【００１５】
パッションフルーツの種子抽出物は、上記のようにして得られる一次抽出物をそのまま用いてもよいが、これをイオン交換、サイズ排除カラムクロマト法、ＨＰＬＣ法、ゲルろ過、膜分離等により、分画、精製して用いることもできる。特に、後述する実施例で示されるように、ピセアタンノールがコラーゲン産生促進活性の有効成分であることから、ＨＰＬＣ等その他の公知の方法で、ピセアタンノールを基準にして高度に精製し、これを用いることができる。
【００１６】
具体的には、例えば、パッションフルーツの種子抽出物の一次抽出物を下記条件でＨＰＬＣにかけたときの保持時間が１９〜２２分に溶出される化合物であり、質量分析装置によるマススペクトル測定によってネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する化合物を基準にして、ＨＰＬＣ等により分画、分取して、これを用いることができる。
［ＨＰＬＣ条件］
・ カラム：Mightysil RP-18 GP250-10 径10mm、長さ250mm（関東化学株式会社製）
・ カラム温度：40℃
・ 溶出条件：流速3ml/min、0％メタノール→30％メタノール（10min）
・ ＵＶ検出：280nm
本発明のコラーゲン産生促進剤の使用形態としては、肌のつややはりの衰えを予防したい部位、又はこれらを改善したい部位、乾燥肌の部位などに塗布することができる。あるいは、経口的に摂取して、体の中から作用させるようにしてもよい。
【００１７】
本発明のコラーゲン産生促進剤の有効投与量は、皮膚に塗布する場合には、ピセアタンノール換算で、単位面積あたり一回およそ1.25〜2500μｇ／ｃｍ２である。経口摂取する場合には、ピセアタンノール換算で、成人１日当りおよそ125〜250000μｇである。
【００１８】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、液剤、軟膏剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ゼリー状剤等に製剤化することができる。これらの製剤化は常法に従って行なえばよい。
【００１９】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生促進のための経口用組成物とすることができ、皮膚に適用される化粧料、医薬部外品等の製品形態とすることもできる、また、本発明のコラーゲン産生促進剤を、各種飲食品に添加して、コラーゲン産生促進効果が期待できる飲食品とすることもできる。各製品形態とした場合におけるパッションフルーツの種子抽出物の含有量は、その製品が使用される量と有効投与量との関係を勘案して適宜定めればよく、特に制限されるものではないが、通常、固形状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.00005〜5質量％含有させることが好ましく、0.00005〜1質量％含有させることがより好ましい。そして、液状又はゼリー状の製品の場合には、ピセアタンノール換算で、0.00005〜5質量％含有させることが好ましく、0.00005〜1質量％含有させることがより好ましい。
【実施例】
【００２０】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２１】
＜試験例１＞
パッションフルーツの部位ごとに抽出物を調製し、そのコラーゲン産生促進効果を検討した。
【００２２】
[サンプル調整方法]
パッションフルーツは果皮・果肉・種子の３つの部位に分け、それぞれをフリーズドライして粉砕し、各部位を８０％エタノールで抽出した。遠心後その上清をとりエバポレートで濃縮後、フリーズドライして粉末にした。この粉末を水に溶かして抽出物とした。
【００２３】
[培養細胞を用いたアッセイ方法]
９６−ウェルプレートにヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を1×104/well播種し、MEMα（10％FBS）で２４時間培養した。２４時間後、培地を吸引除去し、固形分濃度換算で0〜1000μg/mlの抽出物濃度となるように上記抽出物を低血清のM106培地（Cascade Biologics社製）に添加して調製した培地を、各１ウェル中に０．２ｍｌずつ添加した。３日間培養後、培地を回収して10000rpm、4℃で5分間遠心分離し、その上清について、コラーゲン定量キットである「Sircol soluble collagen assayキット」（商品名、英国Biocolor社製）を用いて水溶性コラーゲン濃度を定量した。図１には、抽出物を添加しない対照（コントロール）に対するコラーゲン生成量の比を示す。
【００２４】
図１（ａ）及び図１（ｂ）に示すように、パッションフルーツの果皮又は果肉からの抽出物においては、最大濃度1000μg/mlでも、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）からのコラーゲン産生を促進する効果は認められなかった。また、100〜500μg/mlの濃度範囲では、その原因は明らかではないが、産生阻害効果が見られた。これに対し、図１（ｃ）に示すように、パッションフルーツの種子抽出物には、100〜200μg/mlの濃度範囲で、コラーゲン産生促進効果が認められた。なお、上記の試験における抽出物の濃度範囲で、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）に対する細胞毒性がないことは別途確認した。
【００２５】
＜試験例２＞
パッションフルーツの種子抽出物の活性成分を探るため、以下のような実験を行った。
【００２６】
すなわち、活性のあった種子抽出物を、ポリフェノールを吸着する樹脂であるポリビニルポリピロリドン（PVPP：Polyvinylpolypyrrolidone）を水で膨潤させたものとともに３０分間攪拌し、15000rpmで１５分遠心分離し、上清を種子抽出物のPVPP処理サンプルとした。なお、サンプル中のポリフェノール濃度をFolin-Ciocalteu法で測定した結果、このPVPP処理によりポリフェノール濃度は９５％以上低下していた。したがって、PVPP処理により大部分のポリフェノールは除かれたことが確認された。
【００２７】
図２に示すように、PVPP処理を行った結果、種子抽出物にコラーゲン産生促進効果が見られなくなった。したがって、種子抽出物中のポリフェノールが主な活性成分であることが示唆された。
【００２８】
＜試験例３＞
パッションフルーツの種子抽出物の活性成分の同定を、以下のようにして行った。
【００２９】
まず、試験例１と同様にして調製されたパッションフルーツの種子抽出物（４ｍｌ）を、ODSカラムを用いたＨＰＬＣによって分画した。
【００３０】
ＨＰＬＣ条件は、以下のとおりとした。
・ カラム：Mightysil RP-18 GP250-10 径10mm、長さ250mm（関東化学株式会社製）
・ カラム温度：40℃
・ 溶出条件：流速3ml/min、0％メタノール→30％メタノール（10min）
・ ＵＶ検出：280nm
ODSカラムからの溶出フラクションを図３に示すように、フラクション１、フラクション２、フラクション３の３つに分け、得られたフラクションの溶媒をエバポレート後に凍結乾燥し、水によってもとの粗抽出物の体積に戻した。そして、試験例１、２と同様にして、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）によるコラーゲン産生に与える影響を調べた。
【００３１】
具体的には、９６−ウェルプレートにヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）を７×103/well播種し、MEM（10％FBS）で２４時間培養した。２４時間後、培地を吸引除去し、もとの粗抽出液の固形分濃度換算で100μg/ml相当の濃度となるように、上記フラクションからの溶出フラクション組成物を低血清のM106培地（Cascade Biologics社製）に添加して培地を調製し、各１ウェル中に０．２ｍｌずつ添加した。３日間培養後、培地を回収し、試験例１と同様にして水溶性コラーゲン濃度を定量した。図４には、抽出物を添加しない対照（コントロール）に対するコラーゲン生成量の比を示す。
【００３２】
図４に明らかなように、フラクション１とフラクション３からの溶出フラクション組成物にはコラーゲン生成促進効果は認められなかった。一方、フラクション２からの溶出フラクション組成物には粗抽出物とほぼ同等の活性が認められた。したがって、上記ＨＰＬＣにおいて保持時間２０．６分に溶出する成分が、パッションフルーツの種子抽出物によるコラーゲン生成促進効果の活性成分であると考えられた。
【００３３】
そこで、上記保持時間２０．６分に溶出する成分について、ＨＰＬＣ／質量分析装置（サーモエレクトロン株式会社製、装置名「Thermo-LCQ-MS/MS」）を用いて、そのマススペクトルを測定した（図５Ａ）。なお、ポジティブ、ネガティブの両イオンモードで検討したがネガティブに良好なイオンが見出されたので、そのデータを用いた。その結果、主要シグナルｍ／ｚ２４３は、（Ｍ−Ｈ）−であり、その他のピークｍ／ｚ２７９は（Ｍ＋２Ｈ２Ｏ−Ｈ）−と帰属され、ｍ／ｚ４８７は（Ｍ×２−Ｈ）−と帰属できた。したがって、分子量が２４４と決定できた。また、ＵＶスペクトルを取ると、λｍａｘとして、220nm、304nm、322nmが観察された（図５Ｂ）。
【００３４】
これらのマススペクトルやＵＶスペクトルの結果は、ピーナッツ果皮に含まれるポリフェノールであるレスベラトロール(Resveratrol、分子量228)に類似していた（図６Ａ，Ｂ参照）。また、上記ＨＰＬＣ条件でのレスベラトロールの保持時間が２４．５分であり、未知化合物はレスベラトロールよりも逆相カラムでの保持時間が小さいことから、水酸基１個分の分子量が大きい、下記式（１）で表されるピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)であることが推定された。
【００３５】
【化２】
そこで、ピセアタンノールの純化合物（シグマ社製）について、上記と同じ条件でのＨＰＬＣ分析を行ない（図７）、さらにマススペクトルやＵＶスペクトルを得た（図８Ａ，Ｂ）。その結果、ＨＰＬＣにおける保持時間や、マススペクトルやＵＶスペクトルの帰属が全て一致した。よって、パッションフルーツの種子抽出物の活性成分が、ピセアタンノールであることが明らかとなった。
【００３６】
＜試験例４＞
試験例１と同様にして調製されたパッションフルーツの種子抽出物について、そのピセアタンノール含量を、上記ＨＰＬＣ分析によるピーク面積を利用した標準濃度の検量線から求めた。その含有量は約１．９μｇ／１００μｇ粗抽出物（１．９質量％）であった。また、パッションフルーツの種子抽出物中の含有量から原料とされたパッションフルーツの種子のフリーズドライ乾燥物中の含有量を算出すると、約１ｍｇ／ｇであった。そこで、ピセアタンノール換算で０、４．５、９、１８μＭの濃度となるように培養液に添加した以外は、試験例３と同様にして、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）によるコラーゲン産生に与える影響を調べた。また、ピセアタンノールの純化合物についても同様にコラーゲン産生に与える影響を調べた。その結果を図９に示す。
【００３７】
図９に明らかなように、パッションフルーツの種子抽出物と、ピセアタンノールの純化合物の両者は、ヒト皮膚線維芽細胞（SF-TY）によるコラーゲン産生促進効果ついて、ピセアタンノール換算で０〜１８μＭの濃度範囲において、ほぼ同等の濃度依存性を示した。よって、パッションフルーツの種子抽出物の活性成分がピセアタンノールであることが明らかであった。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】果皮（ａ）、果肉（ｂ）及び種子（ｃ）からの抽出物のコラーゲン産生促進効果を示す図表である。
【図２】種子抽出物及びポリフェノールを除いた種子抽出物のコラーゲン産生促進効果を示す図表である。
【図３】種子抽出物のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す図表である。
【図４】ＨＰＬＣで分画された種子抽出物の各溶出フラクション組成物によるコラーゲン産生促進効果を示す図表である。
【図５】種子抽出物中の未知化合物のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図６】レスベラトロール(Resveratrol、分子量228)のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図７】ピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)のＨＰＬＣ溶出プロファイルを示す図表である。
【図８】ピセアタンノール(Piceatannol、分子量244)のマススペクトル（Ａ）及びＵＶスペクトル（Ｂ）を示す図表である。
【図９】パッションフルーツの種子抽出物によるコラーゲン産生促進効果とピセアタンノールの純化合物によるコラーゲン産生促進効果とを比較した図表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピセアタンノールを有効成分とすることを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
固形状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
液状又はゲル状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
前記化合物はピセアタンノールである請求項２又は３記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
化粧料として用いられる請求項１〜４のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項６】
経口用組成物として用いられる請求項１〜４のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項１】
ピセアタンノールを有効成分とすることを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
固形状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
液状又はゲル状であり、パッションフルーツの種子抽出物を含有し、且つ、前記パッションフルーツの種子抽出物に含まれる化合物であって質量分析装置によるマススペクトル測定においてネガティブイオンモードのシグナルとしてｍ／ｚ２４３を呈する該化合物を0.00005〜5質量％含有することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
前記化合物はピセアタンノールである請求項２又は３記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
化粧料として用いられる請求項１〜４のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項６】
経口用組成物として用いられる請求項１〜４のいずれか１つに記載のコラーゲン産生促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−３０９１１（Ｐ２０１０−３０９１１Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９２０９８（Ｐ２００８−１９２０９８）
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２５日（２００８．７．２５）
【出願人】（０００００６１１６）森永製菓株式会社 (130)
【Ｆターム（参考）】
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