コラーゲン関連ペプチド及びその使用

本発明は、コラーゲン模倣3重らせん及びその原線維に非共有的自己集合できる、N−及びC−末端に疎水性アミノ酸を有するコラーゲン関連ペプチド(CRP)、並びにその合成、使用方法及び組成物に関する。

【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、N−及びC−末端に疎水性アミノ酸を有するコラーゲン関連ペプチド(CRP)及び、コラーゲン模倣3量体及びその原線維、並びにその合成、使用方法及び組成物を目的とする。
【0002】
〔背景技術〕
コラーゲンは、哺乳類で最も豊富なタンパク質であり、体内に広く分布し、そのロープ様3重らせん及び集合した原線維の剛性により、コラーゲンは、本質的な構造的役割を果たすことが可能になり、組織に機械的強度を与えるのを補助する。最も豊富な線維状コラーゲン、I型、II型及びIII型は、皮膚、骨、軟骨、腱、靱帯、血管及び眼のガラス体で発生する。IV型及びVI型のようなより複雑な非線維性コラーゲンは、2及び3次元ネットワークを形成し、体の間質組織を支持し、上皮及び内皮細胞層が結合できる、基底膜の基本要素である。
【0003】
一般に、線維性コラーゲンは、互いの周りに巻き付いた3つの別々のペプチド鎖を含有して、3重らせんを形成する(リッチ(Rich)A及びクリック(Crick)FHC、J.Mol.Biol.、1961年、3巻、483〜506頁)。幾何学的制約及びコラーゲン3重らせんの安定性は、3つのアミノ酸全てがグリシン(Gly又はG)であることを必要とし、結果として反復性−GXY−配列(式中、X及びYはそれぞれプロリン(Pro又はP)及びヒドロキシプロリン(Hyp又はO)を表すことが多い)が生じる。コラーゲンの3重らせんは、典型的には、長さが300nm超であり、1000アミノ酸を超える。このようなコラーゲン3重らせんの集合体から得られる線維は、長さ1μmを超える。
【0004】
健康で、損傷を受けていない組織では、コラーゲンは血管壁及びその周囲の組織を支持し、内皮細胞層により隠され、凝固プロセスを制御する血流内で循環している血小板と接触することはできない。しかしながら、血管壁への損傷が、罹患血管壁における物理的外傷又はアテローム斑の破裂のいずれかの結果として生じ、これは内皮細胞層を取り除いて、コラーゲンを血小板及び他の血漿タンパク質と相互作用させ、それにより凝集及び接着のために血小板を活性化することができる。これらのプロセスは、凝固反応に必須であり、当該技術分野においてよく理解されている。
【0005】
3重らせん構成
コラーゲンは、長く科学者を魅了しているが、それは、これらのタンパク質の並外れた構造特性及び生物学的重要性のためである。コラーゲンの3重らせんの構造、安定性及び機能の研究は、合成コラーゲン関連ペプチドの使用により促進されている(フェン(Feng)Y、メラシーニ(Melacini)G、タウレーン(Taulane)JP及びグッドマン(Goodman)M、J.Am.Chem.Soc.、1996年、118巻、10351〜10358頁;フィールド(Fields)GB及びプロコップ(Prockop)DJ、Biopolymers、1996年、40巻、345〜357頁、及び本明細書に引用されている参考文献;ホルムグレン(Holmgren)SK、タイラー(Taylor)KM、ブレッチェル(Bretscher)LE及びレインズ(Raines)RT、Nature、1998年、392巻、666〜667頁;ジェンキンス(Jenkins)CL及びレインズ(Raines)RT、Nat.Prod.Rep.、2002年、19巻、49〜59頁;並びにシャー(Shah)NK、ラムショー(Ramshaw)JAM、カークパトリック(Kirkpatrick)A、シャー(Shah)C及びブロツキー(Brodsky)、B.Biochemistry、1996年、35巻、10262〜10268頁)。例えば、特異的認識モチーフを含む合成3重らせんペプチドの使用により、コラーゲンの受容体結合特性を詳細に調査することが可能になっている。更に、コラーゲンの3重らせん構成は、血小板及び他のコラーゲン受容体がそれを認識するための必要条件である場合がある。特定の3重らせん配列は、更に、反復するトリプレットであるグリシン−プロリン−ヒドロキシプロリン(GPO)配列を含む、GpVIのような血小板受容体と直接相互作用することができる。単純なコラーゲン関連ペプチドでは、(GPO)10配列は、融解温度が58〜70℃である、熱的に安定な3重らせんを形成する。ヒドロキシプロリンアミノ酸は、水介在水素結合の形成を促進することにより、及び立体電子効果を提供することにより、3重らせん構造を安定化させる。
【0006】
更に、国際公開第07/052067号は、血小板のフォン・ヴィレブランド因子のA3ドメインに対する親和性に基づいて、III型コラーゲンドメインを覆い、血小板接着活性を有する、一連の短い3重らせんコラーゲンペプチドについて記載している。国際公開第07/017671号は、ペプチド間を架橋することなく、血小板を活性化することができる、GPO繰り返しを含む3量体ペプチドについて記載している。国際公開第06/098326号は、POGポリペプチド及びリン酸カルシウム化合物から調製された合成コラーゲンフィルムについて記載している。特開2005206542号は、ポリペプチド配列Pro−X−Gly及びY−Z−Gly(式中、X及びZはプロリン(Pro)及びヒドロキシプロリン(Hyp)を表し、Yはカルボキシル基を有するアミノ酸残基を表す)を含むコラーゲン組織構造について記載している。特開2005126360号は、コラゲナーゼを阻害するために、固相合成により調製される、ポリペプチド配列Pro−Y−Gly−Z−Ala−Gly(式中、YはGln、Asn、Leu、Ile、Val又はAlaを表し;ZはIle又はLeuを表す)を含む化粧品及び食品組成物について記載している。米国特許公開第2003/162941号(特開2003321500号に相当する)は、3重らせん構造を有する、配列Pro−Y−Gly(式中、YはPro又はHypを表す)を有するコラーゲン性ポリペプチドについて記載している。米国特許第5,973,112号(国際公開第99/10381号に相当する)は、配列Xaa−Xbb−Gly(式中、Xaaはアミノ酸残基を表し;Xbbは4(R)−フルオロ−L−プロリン(Flp)、4(S)−フルオロ−L−プロリン、4,4−ジフルオロプロリン、又はアセチル、メシル、若しくはトリフルオロメチルで修飾したヒドロキシプロリンを表す)のトリペプチドコラーゲン模倣物について記載している。コラーゲン模倣物(Pro−Flp−Gly)10は、コラーゲン関連3重らせんPro−Pro−Gly及びPro−Hyp−Glyに対する安定性が増加したことを示した。
【0007】
自己集合
単離したコラーゲンリガンド配列で3重らせん構造形成を誘発するために、いくつかのストラテジが使用されている(国際公開第98/007752号に相当する、米国特許第6,096,863号及びその参考文献で論じられているような)。単離したコラーゲンリガンド配列における3重らせん構造形成は、多数のGly−Pro−Hyp反復を、コラーゲンの配列の両端に付加することにより誘発できる。しかしながら、50%を超えるペプチド配列がGly−Pro−Hyp反復から成る場合でさえ、得られる3重らせんは、生理学的条件で生存するための安定した熱安定性を有しない場合がある。3重らせん構造の実質的な安定化は3本のペプチド鎖のC−末端領域間に共有結合を導入することにより達成できるが、大きなサイズ(90〜125アミノ酸残基)の「分岐」3重らせんペプチド化合物が得られることにより、それを合成及び精製するのが困難になる(米国特許第6,096,863号及びその参考文献で論じられているような)。デンドリマー集合又は共有架橋を介して、オリゴマー化されたCRPは、この特性を欠く、(POG)10配列を有するもののような、固定化された、それほど組織化されていないCRPになることなく、血小板凝集を有効に誘発できる(ラオ(Rao)GHR、フィールズ(Fields)CG、ホワイト(White)JG及びフィールズ(Fields)GB、J.Biol.Chem.、1994年、269巻、13899〜13903頁;モートン(Morton)LF、ハーグリーブス(Hargreaves)PG、ファーンデール(Farndale)RW、ヤング(Young)RD及びバーンズ(Barnes)MJ、Biochem.J.、1995年、306巻、337〜344頁;ナイト(Knight)CG、モートン(Morton)LF、オンリー(Onley)DJ、ピーチー(Peachey)AR、イチノヘ(Ichinohe)T、オクマ(Okuma)M、ファーンデール(Farndale)RW及びバーンズ(Barnes)MJ、Cardiovasc.Res.、1999年、41巻、450〜457頁)。自己集合できるCRPの利用可能性及び有用性は、その調製の容易さ、CRP構造の単純性及び安定性、並びに凝集活性の可能性に依存する。合成は挑戦的なものであり、比較的複雑である場合があるが、マイクロメートルスケールのCRP系材料は、システインノットを使用することにより、共有的に結合した三重鎖実体の自己集合から得られた(コイデ(Koide)T、ホンマ(Homma)DL、アサダ(Asada)S及びキタガワ(Kitagawa)K、Bioorg.Med.Chem.Lett.、2005年、15巻、5230〜5233頁;並びにコッチ(Kotch)F及びレインズ(Raines)RT、Proc.Natl.Acad.Sci USA、2006年、103巻、3028〜3033頁)。
【0008】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、ペプチドの整列並びに、原線維の開始及び成長を促進するコラーゲン様構造モチーフの構築に対する単純なアプローチが依然として必要とされている。具体的には、合成が容易であり、コラーゲン模倣特性を有する3量体に非共有自己集合できる、比較的短い、一本鎖CRPが必要とされている。
【0009】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、広く、コラーゲン模倣特性を有する3量体に非共有自己集合できる、コラーゲン関連ポリペプチド(CRP)に関する。
【0010】
CRPは、各末端に、N−末端及びC−末端合成又は天然疎水性アミノ酸を有し、前記アミノ酸は原線維の成長を開始させて、コラーゲン様原線維を形成することができる。
【0011】
本発明はまた、式(I):
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択されるトリプレットであり、
Jは、各トリプレットZについて、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から独立して選択され、
mは、8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
例えば、ZがGly−Pro−Jであり、かつmが8である場合、8つのJ置換基のそれぞれは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から独立して選択され、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)のCRPに関する。
【0012】
本明細書に記載するCRPは、血小板凝集を開始させ、出血性障害を治療及び診断するために用いることができる、合成コラーゲンの作製に有用である。本発明のCRPは、止血剤のような組成物で更に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】血小板凝集の刺激について、コラーゲンと比較した、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号34及び配列番号35を有するCRPの活性を示す用量反応曲線。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明は、広く、コラーゲン模倣特性を有する3量体に非共有自己集合できる、CRPに関する。
【0015】
CRPは、各末端に、N−末端及びC−末端合成又は天然疎水性アミノ酸を有し、前記アミノ酸は原線維の成長を開始させて、コラーゲン様原線維を形成することができる。
【0016】
本発明はまた、式(I):
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択されるトリプレットであり、
Jは、各トリプレットZについて、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から独立して選択され、
mは、8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
例えば、ZがGly−Pro−Jであり、かつmが8である場合、8つのJ置換基のそれぞれは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から独立して選択され、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、phenyl−Gly、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)のCRPに関する。
【0017】
本発明のCRPは、3量体に非共有自己集合することができる。得られるCRP 3量体は、更に、非共有、芳香環スタッキング及び定序疎水性相互作用により、コラーゲン様原線維に高次自己集合できる。
【0018】
本発明の実施形態は、複数の本発明のCRPを含むコラーゲン様原線維物質を含む。
【0019】
本発明の実施形態は、複数の本発明のCRPを含むコラーゲン様原線維物質を含み、前記CRPは複数のCRP 3量体の形でコラーゲン様原線維物質中に存在する。
【0020】
本発明の実施形態では、CRP 3量体はホモ3量体であり、3つのCRPは相同である。
【0021】
本発明の実施形態では、CRP 3量体はヘテロ3量体であり、3つのCRPは非相同である。
【0022】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択されたトリプレットであり、Jは少なくとも4つの連続したトリプレットZ中のHypである)のCRPである。
【0023】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、Jは、各トリプレットZについて、Hyp、fPro及びProから成る群から独立して選択される)のCRPである。
【0024】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、Jは、各トリプレットZについて、Hyp及びProから成る群から独立して選択される)のCRPである。
【0025】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、mは10である)のCRPである。
【0026】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)のCRPである。
【0027】
本発明の実施形態は、式(I)(B及びXは、F−Phe、Phe及びLeuから成る群から独立して選択される)のCRPである。
【0028】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、Bは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg及びLeuから成る群から選択される)のCRPである。
【0029】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、Bは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、及びLeuから成る群から選択される)のCRPである。
【0030】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、Bは、F−Phe、Phe及びLeuから成る群から選択される)のCRPである。
【0031】
本発明の実施形態は、式(I)(式中、Xは、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から選択される)のCRPである。
【0032】
本発明の実施形態は、式(I)(式(I)XはPheである)のCRPである。
【0033】
本発明の実施形態は、
配列番号1:B−(Gly−Pro−Hyp)4−(Gly−Pro−J)n−X(式中、nは4、5、6、7、8、9、10又は11から選択される整数である);
配列番号2:B−(Gly−Pro−Hyp)8−(Gly−Pro−J)p−X(式中、pは0、1、2、3、4、5、6又は7から選択される整数である);
配列番号3:B−(Gly−Pro−Hyp)12−(Gly−Pro−J)q−X(式中、qは0、1、2又は3から選択される整数である);
配列番号4:B−(Pro−Hyp−Gly)4−(Pro−J−Gly)n−X(式中、nは4、5、6、7、8、9、10又は11から選択される整数である);
配列番号5:B−(Pro−Hyp−Gly)8−(Pro−J−Gly)p−X(式中、pは0、1、2、3、4、5、6又は7から選択される整数である);
配列番号6:B−(Pro−Hyp−Gly)12−(Pro−J−Gly)q−X(式中、qは0、1、2又は3から選択される整数である);
配列番号7:B−(Hyp−Gly−Pro)4−(J−Gly−Pro)n−X(式中、nは4、5、6、7、8、9、10又は11から選択される整数である);
配列番号8:B−(Hyp−Gly−Pro)8−(J−Gly−Pro)p−X(式中、pは0、1、2、3、4、5、6又は7から選択される整数である);又は
配列番号9:B−(Hyp−Gly−Pro)12−(J−Gly−Pro)q−X(式中、qは0、1、2又は3から選択される整数である);から選択される式(I)のCRPである。
【0034】
代替実施形態では、式(I)のCRPは、
配列番号10:B−(Gly−Pro−J)n−(Gly−Pro−Hyp)4−X(式中、nは4、5、6、7、8、9、10又は11から選択される整数である);
配列番号11:B−(Gly−Pro−J)p−(Gly−Pro−Hyp)8−X(式中、pは0、1、2、3、4、5、6又は7から選択される整数である);
配列番号12:B−(Gly−Pro−J)q−(Gly−Pro−Hyp)12−X(式中、qは0、1、2又は3から選択される整数である);
配列番号13:B−(Pro−J−Gly)n−(Pro−Hyp−Gly)4−X(式中、nは4、5、6、7、8、9、10又は11から選択される整数である);
配列番号14:B−(Pro−J−Gly)p−(Pro−Hyp−Gly)8−X(式中、pは0、1、2、3、4、5、6又は7から選択される整数である);
配列番号15:B−(Pro−J−Gly)q−(Pro−Hyp−Gly)12−X(式中、qは0、1、2又は3から選択される整数である);
配列番号16:B−(J−Gly−Pro)n−(Hyp−Gly−Pro)4−X(式中、nは4、5、6、7、8、9、10又は11から選択される整数である);
配列番号17:B−(J−Gly−Pro)p−(Hyp−Gly−Pro)8−X(式中、pは0、1、2、3、4、5、6又は7から選択される整数である);又は
配列番号18:B−(J−Gly−Pro)q−(Hyp−Gly−Pro)12−X(式中、qは0、1、2又は3から選択される整数である)から選択される。
【0035】
更に他の実施形態では、式(I)のCRPは、
配列番号19:B−(Gly−Pro−J)r−(Gly−Pro−Hyp)4−(Gly−Pro−J)s−X(式中、r及びsはそれぞれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10から選択される整数であり、(Gly−Pro−J)r、(Gly−Pro−J)s及び(Gly−Pro−Hyp)4の組み合わせは、(Z)15を超えない);
配列番号20:B−(Gly−Pro−J)t−(Gly−Pro−Hyp)8−(Gly−Pro−J)u−X(式中、t及びuはそれぞれ、1、2、3、4、5又は6から選択される整数であり、(Gly−Pro−J)t、(Gly−Pro−J)u及び(Gly−Pro−Hyp)8の組み合わせは、(Z)15を超えない);
配列番号21:B−(Pro−J−Gly)r−(Pro−Hyp−Gly)4−(Pro−J−Gly)s−X(式中、r及びsはそれぞれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10から選択される整数であり、(Pro−J−Gly)r、(Pro−J−Gly)s及び(Gly−Pro−Hyp)4の組み合わせは、(Z)15を超えない);
配列番号22:B−(Pro−J−Gly)t−(Pro−Hyp−Gly)8−(Pro−J−Gly)u−X(式中、t及びuはそれぞれ、1、2、3、4、5又は6から選択される整数であり、(Pro−J−Gly)t、(Pro−J−Gly)u及び(Gly−Pro−Hyp)8の組み合わせは、(Z)15を超えない);
配列番号23:B−(J−Gly−Pro)r−(Hyp−Gly−Pro)4−(J−Gly−Pro)s−X(式中、r及びsはそれぞれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10から選択される整数であり、(J−Gly−Pro)r、(J−Gly−Pro)s及び(Gly−Pro−Hyp)4の組み合わせは、(Z)15を超えない);
配列番号24:B−(J−Gly−Pro)t−(Hyp−Gly−Pro)8−(J−Gly−Pro)u−X(式中、t及びuはそれぞれ、1、2、3、4、5又は6から選択される整数であり、(J−Gly−Pro)t、(J−Gly−Pro)u及び(Gly−Pro−Hyp)8の組み合わせは、(Z)15を超えない)から選択される。
【0036】
特定の実施形態では、式(I)のCRPは、
配列番号25:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe;
配列番号26:Phe−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe;
配列番号27:Leu−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe;
配列番号31:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)9−Phe;
配列番号32:Phe−(Gly−Pro−Hyp)9−Phe;及び
配列番号33:Leu−(Gly−Pro−Hyp)9−Pheから選択される。
【0037】
本発明の議論では、特定の他のポリペプチド配列としては、
比較配列番号28:Gly−(Gly−Pro−Hyp)10−Gly;
比較配列番号29:Ac−(Gly−Pro−Hyp)10−Gly;
参照配列番号30:(Pro−Hyp−Gly)4−(Pro−Hyp−Ala)−(Pro−Hyp−Gly)5;
参照配列番号34:(Pro−Hyp−Gly)10;及び
比較配列番号35:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)5−Phが挙げられる。
【0038】
1例として、配列番号25を有する式(I)のCRPは、以下の構造:
【化1】

を有する。
【0039】
本発明は更に、複数の式(I)のCRPを選択する工程と、複数のCRPを、複数の3量体、超分子複合材及びコラーゲン様原線維の形成の開始及び成長に適した水性条件下で混合する工程と、を含む、コラーゲン様原線維物質の形成方法に関する。
【0040】
本方法の実施形態では、複数のCRP 3量体は、複数のホモ3量体、ヘテロ3量体又はこれらの混合物から選択される。
【0041】
本方法の実施形態では、コラーゲン様原線維物質は、複数の超分子複合材又はコラーゲン様原線維から選択される。
【0042】
本方法の実施形態では、適した水性条件は、約50℃未満の温度で、水中又は水性塩溶液中にて、複数のコラーゲン関連ペプチドを混合することを更に含む。
【0043】
本方法の実施形態では、水性塩溶液は、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ヘペス緩衝生理食塩水及びこれらの混合物から選択される。
【0044】
本方法の実施形態では、水性塩溶液はPBSである。
【0045】
定義
本発明の実施形態に関して、以下の定義及び本明細書を通して提供される他の定義は、当業者の知識の範囲内であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【0046】
用語「トリプレット」は、3つのアミノ酸Gly、Pro及びJを有する組Gly−Pro−J、3つのアミノ酸Pro、J及びGlyを有する組Pro−J−Gly、及び3つのアミノ酸J、Gly及びProを有する組J−Gly−Proにより定義されるような、3つのアミノ酸の組を指す。
【0047】
用語「ホモ3量体」は、3つの同一の式(I)のCRPにより形成される3重らせん体を指す。
【0048】
用語「ヘテロ3量体」は、式(I)のCRPにより形成される3重らせん体を指す。
【0049】
用語「3量体」は、3つの式(I)のCRPにより形成される3重らせん体を指す。
【0050】
用語「超分子複合材」は、コラーゲン様原線維及び原線維構造を含む、種々の形態の集合したCRP 3量体を指す。
【0051】
用語「Ala」又は「A」はアミノ酸のアラニンを指し;「Cha」は模倣アミノ酸シクロヘキシル−アラニンを指し;「Chg」は模倣アミノ酸シクロヘキシル−グリシンを指し;「F−Phe」は、模倣アミノ酸1,2,3,4,5−F−フェニル−アラニン」を指し;「fPro」は模倣アミノ酸(4R)−フルオロプロリンを指し;「Gly」又は「G」はアミノ酸のグリシンを指し;「Hyp」又は「O」は模倣アミノ酸(4R)−ヒドロキシプロリンを指し;「Met」はアミノ酸のメチオニンを指し;「mPro」は模倣アミノ酸(4S)−メチルプロリンを指し;「Phe」又は「F」はアミノ酸のフェニルアラニンを指し;「Pro」又は「P」はアミノ酸のプロリンを指し;「Tyr」はアミノ酸のチロシンを指す。
【0052】
本発明の議論
特定の自己集合モノマーが説明されており、ここではメタ置換フェニレンオキサミン酸ジエチルエステルモノマーは、固体状態のx線により、隣接するらせんがπスタッキングにより側−側(side-to-side)整列した状態で、水素結合(端−端(end-to-end))を介してらせん鎖に自己集合することが示されている(ブライ(Blay)G、フェルナンデス(Fernandez)I、ペドロ(Pedro)JR、ルイス−ガルシア(Ruiz-Garcia)R、ムニョス(Munoz)MC、カノ(Cano)J及びカラスコ(Carrasco)R、Eur.J.Org.Chem.、2003年、1627〜1630頁)。本発明の発明者らによる、自己集合CRP 3量体の初期設計は、(GPO)10配列のN−及びC−末端の両方にフェニルオキサミンエステルアミド基を結合させて、水素結合による端−端集合を促進することを含んでいた。
【0053】
しかしながら、ベンゼンとヘキサフルオロベンゼンとの間の強力な非共有芳香環スタッキング相互作用に起因して(ハンター(Hunter)CA及びサンダース(Sanders)JKM、J.Am.Chem.Soc.、1990年、112巻、5525〜5534頁;グダニーク(Gdaniec)M、ヤンコフスキ(Jankowski)W、ミレフスカ(Milewska)MJ及びポロンスキ(Polonski)T、Angew.Chem.Int.Ed.、2003年、42巻、3903〜3906頁(また、本明細書に引用されている参照文献9及び10);並びにロズマン(Lozman)OR、ブシュビー(Bushby)RJ及びビンター(Vinter)JG、J.Chem.Soc.,Perkin Trans.、2巻、2001年、1446〜1453頁)、本発明の発明者らは、芳香環スタッキング(端−端及び側−側)及び定序疎水性相互作用が、本発明のCRP 3量体がコラーゲン様原線維及び繊維に高次自己集合するのを更に可能にすると仮定した。
【0054】
結果として、水素結合自己集合設計は、芳香族基と疎水基との間の相互作用がπスタッキング及び定序疎水性相互作用による端−端自己集合に利用される、本発明の設計に発展した。本発明の直鎖CRPの配列は、3量体に、続いて非共有的な手段により超分子複合材及び原線維に自己集合することができる。他のものは、コラーゲン配列が、特にTyr、Phe及びLeuのような芳香族及び疎水性アミノ酸残基を含むテロペプチド領域を含むことに留意すべきである。3重らせん自己集合に対するこのような芳香族及び疎水性残基の重要性が示されている(ヘルセス(Helseth)DL,Jr及びベイス(Veis)A、J.Biol.Chem.、1981年、256巻、7118〜7128頁;プロコップ(Prockop)DJ及びファータラ(Fertala)A、J.Biol.Chem.、1998年、273巻、15598〜15604頁;並びにトラウブ(Traub)W、FEBS Letters、1978年、92巻、114〜120頁)。
【0055】
したがって、本発明のCRP 3量体により、例えば、配列番号25:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)10−Pheを有するCRP 3量体により、原線維の成長を開始させる可能性について調査した。実施例3に示すように、コンピュータによる分子モデリングを用いて、配列番号25を有する2つの頭−尾(head-to-tail)CRP 3量体の間の干渉を評価した。XED(広がった電子分布)力場を用いて、互いに向かって2つの3重らせんを引いた。3重らせん体が互いに接近するにつれて、フェニル/ペンタフルオロフェニル対が正面(FTF)配向を採用し、−55.2kcal/molの総界面結合エネルギーが生じた。芳香環を縁−面(edge-to-face)配向で置いたとき、再最小化された集合体は面−面(face-to-face)配向に戻った。
【0056】
配列番号26:Phe−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe及び配列番号27:Leu−(Gly−Pro−Hyp)10−Pheを有する類似のCRP 3量体の界面についても調べた。比較的、配列番号26の場合、対称的なFTF相互作用が観察されることなく、低い界面結合エネルギーが観察された(総エネルギー:−49.2kcal/mol)。配列番号27では更に結合エネルギーが低下した(総エネルギー:−32.5kcal/mol)。配列番号25を有するCRP 3量体の両端の間の強力な相互作用、並びに、配列番号26及び配列番号27を有するCRP 3量体の両端の間の相互作用は、本発明のCRP 3量体のポテンシャルが、CRP 3量体間の芳香環スタッキング及び定序疎水性相互作用により、原線維の成長を開始させるという発明者らの仮説を支持する。
【0057】
モデリング研究では原線維の成長を開始させるためのCRP 3量体の端−端界面を調べたが、本発明の範囲は、コラーゲンテロペプチドの場合と同様に、疎水性相互作用が、CRP 3量体内の異なる箇所でCRP間の端−端配向で、及び、疎水性相互作用により可能になる場合、隣接するCRP 3量体との側−側相互作用で生じるねじれ型界面のような、他の可能な界面を含むことを意図する。
【0058】
CRPの構成
前述の非限定的な実施形態に加えて、本発明はまた、式(I)の任意の代表的な組み合わせの配列から成る、CRP並びにそのホモ3量体及びヘテロ3量体を包含する。
【0059】
本明細書に記載のようなCRPの全長は、26アミノ酸から最大47アミノ酸の範囲であってよい。本発明の実施形態では、CRPの全長は最大32アミノ酸であってよい。
【0060】
本明細書に記載のようなCRPは、エフェクタ分子、標識、マーカー、薬物、毒素、担体若しくは輸送分子、又は抗体若しくはその結合断片若しくは他のリガンドのような標的化分子等であるが、これらに限定されない、ペプチジル若しくは非ペプチジルカップリングパートナーと重合又は結合する場合がある。CRPポリペプチドをペプチジル及び非ペプチジルカップリングパートナーの両方にカップリングする技術は、当該技術分野において周知である。
【0061】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようなCRPを、固体表面又は不溶性支持体上にコーティングしてもよい。支持体は、例えば、プレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルタ、布地、ポリマー又は膜が挙げられる、微粒子又は固体状であってよい。CRPポリペプチドを固体表面又は不溶性支持体上に固定する方法は、当業者に既知である。
【0062】
いくつかの実施形態では、支持体は、例えば、免疫グロブリン若しくはフィブロネクチンのような、血漿タンパク質又は組織タンパク質等のタンパク質であってよい。他の実施形態では、支持体は、合成であってよく、例えば、生体適合性、生分解性ポリマーであってよい。好適なポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリオルソエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン及びポリウレタンが挙げられる。本発明の別の態様は、不活性ポリマーに結合した、本明細書に記載のようなポリペプチドを含むコンジュゲートを提供する。
【0063】
CRPの1端に反応基を含むことにより、得られる産物が、血流に入ることなく、慢性創傷又は急性外傷部位のような病変に送達し得るように、不活性担体にケミカルカップリングすることが可能になる。
【0064】
本発明のCRPは、例えば、確立された標準的な液相又は好ましくは固相ペプチド合成法に従って、化学合成により全体的に又は部分的に生成することができ、その概要は広く利用可能である(例えば、J.M.スチュアート(Stewart)及びJ.D.ヤング(Young)、固相ペプチド合成(Solid Phase Peptide Synthesis)第2版、ピアース・ケミカル・カンパニー(Pierce Chemical Company)、ロックフォード(Rockford)、イリノイ州(1984年)、M.ボダンツキー(Bodanzsky)及びA.ヨダンツキー(Eodanzsky)、ペプチド合成の実務(The Practice of Peptide Synthesis)、スプリンガー出版(Springer Verlag)、ニューヨーク(New York)(1984年);J.H.ジョーンズ(Jones)、ペプチドの化学合成(The Chemical Synthesis of Peptides.)、オックスフォード大学出版局(Oxford University Press)、オックスフォード(Oxford)、1991年;応用バイオシステム430Aユーザーマニュアル(Applied Biosystems 430A Users Manual)、ABI社(ABI Inc.)、フォスターシティー(Foster City)、カリフォルニア州、G.A.グラント(Grant)編、合成ペプチド、ユーザーガイド(Synthetic Peptides, A User's Guide)、W.H.フリーマン社(Freeman & Co.)、ニューヨーク(New York)1992年、E.アサートン(Atherton)及びR.C.シェパード(Sheppard)、固相ペプチド合成、実践的アプローチ(Solid Phase PeptideSynthesis, A Practical Approach.)、IRLプレス(IRL Press)、1989年、並びにG.E.フィールズ(Fields)編、固相ペプチド合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)(Methods in Enzymology 289巻)、アカデミック・プレス(Academic Press)、ニューヨーク(New York)及びロンドン(London)、1997年)、又は液相法により、若しくは固相、液相及び溶液化学の任意の組み合わせにより、溶液中で調製することができる。
【0065】
CRP構造の修飾
本明細書に記載のようなCRPは、例えば、1つ又はそれ以上のポリエチレングリコール分子、糖、リン酸塩、及び/又は他のこのような分子を付加することにより化学的に修飾してもよく、この場合分子は野性型のコラーゲンタンパク質に自然には結合しない。CRPの好適な化学修飾及び化学合成によりCRPを作製する方法は、当業者に周知であり、また本発明に包含される。CRPのいくつかの部位に同じ又は異なる程度の同種の化学修飾が存在してもよい。更に、修飾は、CRP骨格鎖、又はいずれかのアミノ酸側鎖、及びアミノ若しくはカルボキシル末端を含む、CRP配列のいずれで起こることもできる。したがって、所与のCRPは、多くの種の修飾を含むことができる。
【0066】
上述のように、本明細書に記載のようなCRPは構造的に修飾してもよい。構造的に修飾されたCRPは、本明細書に記載のCRPと、3次元形状及び生物活性の両方で実質的に類似しており、好ましくは、CRP配列の活性基の3次元配置に非常に類似する反応化学部分の空間的配置を含む。アミノ酸の化学基を類似の構造の他の化学基と置換することにより、更に修飾することもできる。
【0067】
更に、本明細書に記載のようなCRPは、1つ又はそれ以上のD−アミノ酸を含むよう構造的に修飾してもよい。例えば、CRPは、CRPのアミノ酸配列中の1つ又はそれ以上のL−アミノ酸残基が、対応するD−アミノ酸残基又は逆−Dポリペプチドに置換された鏡像異性体であってよく、逆−Dポリペプチドとは、上述のL−アミノ酸に比べて逆の順序で配置されたD−アミノ酸から成るポリペプチドである(スミス(Smith)CSら、Drug Development Res.、1988年、15巻、371〜379頁)。好適な構造的に修飾されたポリペプチドの生成方法は、当該技術分野において周知である。
【0068】
CRP組成物
本発明のCRPは、単離及び/又は精製し、その後必要に応じて使用してよい。本発明の実施形態では、CRPは、当該技術分野において既知である1種又はそれ以上の賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない、1種又はそれ以上の任意成分を含んでよい、医薬組成物又は医療用デバイスとして使用するのに好適な組成物のような、組成物中で用いてもよい。このような非限定的な実施形態に加えて、本発明はまた、このような組成物中の式(I)の任意の代表的な組み合わせの配列から成る、CRP、並びにそのホモ3量体及びヘテロ3量体をも包含する。
【0069】
特定のポリペプチドの、種々の医薬組成物、医療用デバイス及び併用製品での使用が記載されている。例えば、国際公開第07/044026号は、損傷を受けた軟骨を修復するための、コラーゲン模倣ペプチド−ポリエチレングリコールジアクリレートヒドロゲルスカフォールドについて記載している。米国特許公開第2006/073207号は、種々の医療用途のためのウシコラーゲン/エラスチン/ナトリウムヘパリネート(heparinate)非晶質コアセルベート組成物について記載している。米国特許公開第2005/147690号は、人工血管として使用するためのコラーゲン/エラスチン/ヘパリンが埋め込まれた表面を有する修飾ポリウレタンフィルムについて記載している。特開2005060550号は、分子量100,000〜600,000の、3重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Pro−Y−Gly(式中、YはPro又はHypを表す)を含有する基材に付着する組成物について記載している。特開2005060315号は、分子量100,000〜600,000の、3重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Pro−Y−Gly(式中、YはPro又はHypを表す)、及びビタミンCを含有する医薬組成物について記載している。特開2005060314号は、分子量100,000〜600,000の、3重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Pro−Y−Gly(式中、YはPro又はHypを表す)を含有する化粧品組成物について記載している。特開2005058499号は、分子量100,000〜600,000の、3重らせん構造を有する、配列Pro−Y−Gly(式中、YはPro又はHypを表す)のポリペプチドを含浸させた不織布組成物であって、コラゲナーゼにより分解できる、組成物について記載している。特開2005058106号は、分子量100,000〜600,000の、3重らせん構造を有する、ポリペプチド配列Pro−Y−Gly(式中、YはPro又はHypを表す)を含有する食用組成物であって、コラゲナーゼにより分解できる、組成物について記載している。特開2005053878号は、分子量70,000〜600,000の、3重らせん構造を有する、配列Pro−X−Gly及びPro−Y−Gly−Z−Ala−Gly(式中、XはPro又はHypを表し;YはGln、Asn、Leu、Ile、Val又はAlaを表し;XはIle又はLeuを表す)を有するポリペプチドであって、コラゲナーゼにより分解できる、ポリペプチドについて記載している。国際公開第98/52620号は、インプラントのプロテーゼとして使用するための、生体適合性バルク材料の表面に共有結合した配列Gly−Pro−Nleuを有する、バイオポリマー化合物について記載している。米国特許第6,096,863号は、親油性部分及び、固相合成を介して調製される、コラーゲン様配列RC(CHCH(CO)NHCO(CHCO(Gly−Pro−Hyp)0〜4−[ペプチド]−(Gly−Pro−Hyp)0〜4(式中、R及びRは、それぞれ独立して1〜20個のヒドロカルビル基である)を有するペプチドを有するペプチド部分を有する、ペプチド−両親媒性物質複合体について記載している。米国特許第6,096,710号及び同第6,329,506号は、反復アミノ酸トリプレットGly−Xp−Pro、Gly−Pro−Yp、Gly−Pro−Hyp及びGly−Pro−Pro(式中、Xp及びYpはN−置換アミノ酸から選択されるペプトイド残基である)を有する3重らせん合成コラーゲン誘導体について記載している。
【0070】
本発明は、種々の局面で、所望により他の分子、ペプチド、ポリペプチド及び特異的結合メンバーにカップリングした、本明細書に記載のようなCRPに及ぶだけではなく、医薬組成物、薬剤、薬物、医療用デバイス若しくはその構成要素、又はそのようなCRP等を含む他の組成物も含む。このような医薬組成物、薬剤、薬物、医療用デバイス若しくはその構成要素、又は他の組成物は、診断、治療及び/又は予防目的が挙げられるが、これらに限定されない、種々の目的のために用いてよい。
【0071】
本発明はまた、このような組成物の製造におけるこのようなCRPの使用、並びに、所望の任意賦形剤及び他の任意成分とこのようなCRPを混合することを含む、このような組成物の製造方法にも拡大適用する。好適な賦形剤の例としては、当該技術分野において周知である、ビヒクル、担体、緩衝剤、安定剤等のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【0072】
組成物が医薬組成物である実施形態では、組成物は、このようなCRPに加えて、二次的な製薬的活性剤を含有してよく、ここで得られる併用製品は、当該技術分野において製薬上許容できるものとして周知であるような賦形剤と更に混合してもよい。このような好適な賦形剤の例は、例えば、製薬賦形剤ハンドブック(Handbook of Pharmaceutical Excipients)(第5版、2005年10月、ファーマシューティカル・プレス(Pharmaceutical Press)、ロー(Rowe)RC、シェスキー(Sheskey)PJ及びウェラー(Weller)P編)に開示されている。このような材料は、非毒性であるべきであり、このようなCRP又は二次的な製薬的活性剤の効果を干渉すべきではない。本発明のこのような組成物は、局部的方式で所望の部位へ投与してもよく、又はCRP若しくは二次的な製薬的活性剤が特定の細胞若しくは組織を標的化する方式で送達してもよい。好適な二次的製薬的活性剤としては、止血剤(トロンビン、フィブリノーゲン、ADP、ATP、カルシウム、マグネシウム、TXA、セロトニン、エピネフリン、血小板因子4、第V因子、第XI因子、PAI−1、トロンボスポンジン等及びこれらの組み合わせのような)、抗感染剤(抗体、抗原、抗生物質、抗ウイルス剤等及びこれらの組み合わせのような)、鎮痛剤及び鎮痛剤の組み合わせ、又は抗炎症剤(抗ヒスタミン剤等のような)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
このような組成物の広範な用途では、組成物は、例えば製剤処方としてのような止血剤として、又は創傷被覆材の構成要素として、創傷部位に局所的に適用してよい。組成物は、単独で投与してもよく又は、治療すべき病状に応じて実質的に同時に若しくは連続的に、他の治療と併用してもよい。このようなCRPは、単独で、又は創傷被覆材を含む、このようなCRPを含む物品若しくはデバイスで、例えば外部環境から内容物を保護する好適な容器に密封されたキットで提供してもよい。このようなキットは、使用説明書を含んでもよい。
【0074】
1つの実施形態では、本明細書に記載のようなCRPは、致命的な失血を引き起こす創傷に局部的に適用することにより、例えば道路交通事故又は戦場での傷害後の、急性外傷における止血を促進するのに有用である場合がある。このような創傷部位で止血を促進する方法は、部位に、本明細書に記載のようなCRPから構成される組成物を接触させることを含んでよく、ここで組成物は、CRPが止血を誘発し、維持するのに十分な量で、基材表面上に存在するように、所望により基材を含んでもよい。
【0075】
別の実施形態では、本明細書に記載のようなCRPは、潰瘍のような慢性創傷で止血を促進するのに有用である場合がある。提案された機構に関して理論に束縛されるものではないが、我々は、CRPがまず細胞接着を強化するよう作用して、次いで活性化血小板顆粒成分の放出が、血流からの及び治癒プロセスに寄与する付近の損傷を受けた組織からの、細胞の遊走を刺激できると考える。個体のこのような慢性創傷部位で止血を促進する方法は、その部位を本明細書に記載のようなCRPから構成される組成物と接触させることを含み、ここで組成物は、CRPが止血を誘発するのに十分な量で、基材表面上に存在するように、所望により基材を含んでもよい。
【0076】
本明細書に記載のような本発明のこのようなCRPは、出血性障害の診断用が挙げられる、多数の研究室及び臨床環境で、価値のある試薬として広く有用である場合がある。例えば、本明細書に記載のようなこのようなCRPは、その後使用されて血小板の凝集を開始させることができる、合成コラーゲンの構成で有用である場合がある。別の例では、このようなCRPは、血小板の凝集及び活性化、並びに/又は血液凝固を阻害する試験化合物の研究又はスクリーニングで有用である場合がある。更なる例では、このようなCRPは、血小板の活性化及び/又は凝集に関する調査用の試薬として有用である場合がある。血小板の活性化及び/又は凝集方法は、本明細書に記載のようなこのようなCRPで血小板を治療することを含んでよい。
【0077】
1つの実施形態では、血小板は、血漿の存在下にて、インビトロで治療されてもよい。治療される血小板、すなわち、本明細書に記載のようなCRPと接触後の血小板の活性は、当該技術分野において予想されるような、好適な対照実験を使用して、例えば、関心因子若しくは薬剤、試験組成物、若しくは物質の存在下又は非存在下で、測定又は決定してよい。血小板の活性化及び/又は凝集に対する因子の効果は、本明細書に記載のようなこのようなCRPで血小板を治療することと、血小板の活性化及び/又は凝集に対する因子の効果を決定することと、を含む方法により決定できる。血小板の活性化及び/又は凝集は、因子の存在下若しくは非存在下で、又は異なる濃度の因子により決定してよい。
【0078】
本発明の別の実施形態では、本発明のこのようなCRPは、血小板凝集測定法で試薬として動物組織から抽出したコラーゲン原線維、又は血小板機能分析装置及び他の機器等で固定化したコラーゲン製剤を日常的に使用する診断のような、血小板障害の診断で有用である場合がある。例えば、このようなCRPを使用して、血小板の活性若しくは機能を調査する、又は、本明細書に記載のようなこのようなCRPで処理された試料中の血小板の活性化及び/若しくは凝集を決定することにより、血小板活性の機能不全を診断することができる。例えば、本明細書に記載のようなこのようなCRPを、個体から得られた血液試料と接触させてよく、次いで血小板の凝集を、当該技術分野において周知である方法に従って決定できる。
【0079】
本発明の別の実施形態では、本発明のこのようなCRPは、他の生理活性分子の産生及び放出に寄与することによる等、直接細胞接着を確実にする、並びに局部的に血小板を凝集及び活性化するよう作用する、生理活性表面コーティングとして有用である場合がある。1つの方法は、例えば、本明細書に記載のようなこのようなCRPに血小板を接触させることを含んでよく、前記CRPは、支持体で若しくはその付近で血小板を凝集及び/又は活性化させるために、血漿の存在下で、固体又は半固体支持体上に固定してもよい。
【0080】
本発明のCRPは、出血性障害の治療で広く有用である場合もある。
【0081】
1つの実施形態では、本明細書に記載のようなこのようなCRPが、不活性ポリマー支持体のような、固体若しくは半固体支持体上に吸着する、又は前記支持体内若しくは上に他の方法で含有され、得られる支持体は、自己免疫血小板減少症(thrombocytopaenia)から、又は癌治療で見られるような骨髄の治療的切除から、並びにグランツマン病のような他の原因による出血性障害から生じる場合がある、血小板不全の場合、血小板輸血の補助剤又は代替物として機能するのに有用である場合がある。この実施形態では、固体若しくは半固体支持体上に吸着した、又は固体若しくは半固体支持体内若しくは上に他の方法で含有されたこのようなCRPを、例えば、血小板不全を有する、及び/又は上記のような病状を有する個体のような、それを必要としている個体に投与してよい。
【0082】
本明細書に記載のようなこのようなCRPは、固体若しくは半固体支持体上に吸着した、又は固体若しくは半固体支持体内若しくは上に他の方法で含有されているが、大動脈瘤の血栓形成を誘発するのに有用である場合もある。例えば、このようなCRPは、塞栓性コイルの外側上にコーティングして、組織を固定する、及び/又は、拡張した動脈が更に伸展するのを防ぐことができる。この実施形態では、個体の損傷を受けた血管組織における血栓形成は、血管組織を、本明細書に記載のようなこのようなCRPに接触させることにより誘発でき、前記CRPは、不活ポリマー支持体のような、固体若しくは半固体支持体上に吸着している、又は固体若しくは半固体支持体内若しくは上に他の方法で含有されている。好適な不活ポリマー支持体の例としては、ステント、塞栓性コイル等が挙げられるが、これらに限定されない。このような個体は、例えば、拡張した動脈若しくは他の血管、及び/又は大動脈瘤のような医学的問題に苦しんでいる場合がある。1つの実施形態では、支持体は、タンパク質、ポリエチレングリコール、又はリポソームから構成される不活性ポリマー支持体であってよく、これは支持体に吸着するインスタントCRPでコーティングされている。
【0083】
本明細書に記載のような本発明のこのようなCRPは、胚幹細胞の指向性分化のために、前記コラーゲン関連ペプチドを追加した、化学的に定義された三次元ポリマーマトリックスを含む組成物中で更に有用である場合がある。国際公開第07/075807号は、全ての目的のために、その全文が参考として本明細書に組み込まれているが、胚幹細胞の指向性分化を支持するコラーゲンIVポリペプチドを追加した、化学的に定義された三次元ポリマーマトリックスを含む組成物について記載している。
【0084】
本発明の更に別の実施形態は、本発明のCRPを含む組成物を投与することを含む、止血症状の治療を必要としている被験体の止血症状を治療する方法であって、前記組成物としては本明細書に記載のようなこのようなCRPが挙げられるが、これらに限定されない、方法を目的とする。ポリペプチド組成物は、所望により、投与中基材を含んでもよい。このような組成物は、典型的には、被験体に対して効果を示すのに十分なレジメンに従って投与してよい。投与する実際の量、並びに投与速度及び時間経過は、例えば、治療される疾患又は病状の性質及び重篤度のようないくつかの要因に依存する。組成物は、治療される疾患又は病状に依存して、同時に又は連続的に、単独で又は他の治療の補助療法と併用して投与してよい。
【0085】
止血症状を治療するためのこの方法に従って、本明細書に記載のようなCRP組成物は、単独で、又は賦形剤及び止血をもたらす他の任意成分と併せて用いてもよい。別の実施形態では、このようなCRPは、止血剤として使用するために好適な基材と組み合わせてもよい。止血剤CRP組成物は、粉末、繊維、フィルム又は発泡体が挙げられるが、これらに限定されない、種々の形態であってよい。
【0086】
CRPを含有する発泡体は、例えば、凍結乾燥又は超臨界溶媒発泡のようなプロセスにより調製できる。これらのプロセスの詳細は、当該技術分野において周知であり、例えば、S.マツダ、Polymer J.、1991年、23(5)、435〜444頁(凍結乾燥)及び欧州特許出願第464,163(B1)号(超臨界溶媒発泡)に開示されている。一般に、本発明のCRPを含有する凍結乾燥された発泡体は、まず、このような溶解に十分な温度下にて好適な溶媒中で、CRP及び、例えば、可塑剤のような当該技術分野において既知である任意成分のいずれかを溶解させ、次いでCRP含有溶液を型に注ぐことにより調製できる。CRPは、CRP含有溶液の総重量に基づいて、約0.1mg/mL〜約10mg/mLの範囲、又は約0.1mg/mL〜約1mg/mL、又は約0.3mg/mLの量、CRP含有溶液中に存在してよい。好適な可塑剤としては、グリセロール;ポリエチレングリコール;グリセリン;プロピレングリコール;グリセロールの一酢酸塩;グリセロールの二酢酸塩;グリセロールの三酢酸塩及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されず、CRP含有発泡体の最終乾燥重量に基づいて、約0.5パーセント〜約15パーセントの範囲、又は約1パーセント〜約5パーセントの範囲の量で用いてよい。CRPに対して可能性のある有害な影響を最小限に抑えるために、溶解温度は約50℃を超えるべきではない。溶解は、水、又は緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ハンクス平衡塩類溶液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリス緩衝生理食塩水、ヘペス緩衝生理食塩水、及びこれらの混合物のような、水性塩溶液が挙げられるが、これらに限定されない好ましい水性条件下で実施してよい。
【0087】
1つの実施形態では、溶媒は、約6〜約8のpH範囲に緩衝化してよい。型に所望の量の溶液を充填した後、型を次いで凍結乾燥機に移動させ(いずれ凍結する)次いで、得られる発泡体から溶媒を除去するために溶液を真空乾燥させる。得られる発泡体の厚さは、例えば、型内の溶液量、溶液中のCRP濃度等に依存して変動してよいが、典型的には、得られる発泡体は、約0.5mm〜約10mmの範囲、又は約1mm〜約5mmの範囲の厚さ、及び約1マイクロメートル〜約500マイクロメートルの孔径を有してよい。発泡体は、出血部位の止血問題に取り組むために用いるのに好適であってよい種々の大きさで製造してよい。
【0088】
CRP含有フィルムは、例えば、好適な溶媒からのフィルムの流延のようなプロセスにより調製できる。このプロセスの詳細は当該技術分野において周知であり、例えば、バグロディア(Bagrodia)S及びウィルキンス(Wilkes)GL、「機械的特性に関する溶媒流延コポリマー材料の効果(Effects of Solvent Casting Copolymer Materials As Related to Mechanical Properties)」、J Biomed Mater Res.、1976年(1月)、10(1)、101−11頁に開示されている。この実施形態に従って、本発明のCRPは、例えば可塑剤のような当該技術分野において既知の任意成分のいずれかとともに、十分な量の水性溶媒に溶解できる。CRPは、溶液の総重量に基づいて、約0.1mg/mL〜約10mg/mLの範囲、又は約0.1mg/mL〜約1mg/mLの範囲、又は約0.3mg/mLの量で、溶液中に存在してよい。好適な可塑剤としては、グリセロール;ポリエチレングリコール;グリセリン;プロピレングリコール;グリセロールの一酢酸塩;グリセロールの二酢酸塩;グリセロールの三酢酸塩及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されず、CRP含有フィルムの最終乾燥重量に基づいて、約0.5パーセント〜約15パーセントの範囲、又は約1パーセント〜約5パーセントの範囲の量で用いてよい。
【0089】
好適な水性溶媒の例としては、水、混和性有機溶媒、アルコール、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好適な混和性有機溶媒の例としては、アセトン、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、メタノール等及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。CRPに対して可能性のある有害な影響を最小限に抑えるために、溶解温度は約50℃を超えるべきではない。CRP含有溶液を、次いで、例えば液滴添加し、又は他の方法で好適な量を注いで、流延基材上の所望の表面領域を覆うこともできる。
【0090】
好適な流延基材の例としては、CRP含有フィルムを容易に放出する材料を含むものが挙げられ、ガラス、金属から製造されたもの、テフロンコーディングされた容器等を挙げることができるが、これらに限定されない。このような基材の大きさ及び形状は、組成物の必要性に従って変動してよい。溶媒は、次いで、蒸発又は空気乾燥によりCRP含有溶液から除去してよく、次いで所望により、得られるフィルムを、真空乾燥を介する等の種々の方法により乾燥して、任意の残留溶媒を除去してよい。より厚いフィルムが望ましい場合、既に流延されたフィルムの上面上にCRP含有溶液の1つ又はそれ以上の層を流延することにより、プロセスを繰り返してもよい。得られるフィルムの厚さは、例えば、流延基材に注がれる溶液の量、溶液中のCRP濃度等に依存して変動してよいが、典型的には、各フィルム層の厚さは、約50マイクロメートル〜約150マイクロメートルの範囲であってよい。発泡体に関して上述したように、フィルムはまた、種々の大きさで調製できる。
【0091】
CRP含有粉末は、当該技術分野において周知のプロセスを用いて、本発明のCRPから構成される、繊維、フィルム又は発泡体を、手動で若しくは機械的に粉砕する又は細かく砕くことにより、得ることができる。CRP繊維、フィルム又は発泡体を粉末に粉砕する又は細かく砕く代表的な技術としては、乳鉢及び乳棒、回転刃、ボールミルのような衝撃粉砕機が挙げられるが、これらに限定されない。CRPを粉末に粉砕するためのこれらの及び他の手段は、室温で達成できる、又は低温粉砕プロセスの手段は、CRPの凝固点を下回る温度で達成できる。得られるCRP含有粉末は、所望により、約1マイクロメートル〜約2000マイクロメートルの範囲、又は約10マイクロメートル〜約500マイクロメートルの範囲の粒度を有する粉末を得るために篩い分けしてもよい。
【0092】
CRP含有粉末、フィルム、及び/又は発泡体は、止血を強化する又は止血を起こす止血剤として出血部位に直接適用してよい。あるいは、本明細書に記載のCRPは、基材の構成要素と併せて適用してよく、このような実施形態では、CRPを以後CRP止血剤成分と称する。基材は、個体に植え込むのに好適な基材であってよく、又は植え込みできない基材であってもよい。
【0093】
好適な植え込み可能な基材の例としては、縫合アンカー、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、プレート、ねじ、及びフィルムのような医療用デバイス;不織布フェルト、織布メッシュ又は布地;発泡体;及び粉末のような組織工学スカフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。これらの植え込み可能な基材は、体内に植え込むのに好適な任意の材料であってよく、脂肪族ポリエステル、ポリ(L−リジン及びポリ(グルタミン酸)のようなポリ(アミノ酸)、コポリ(エーテル−エステル)、1〜10個の炭素原子の長さのアルキル基を有するもののようなポリアルキレンオキザラート、ポリオキサアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ(イミノカーボネート)、ポリオルソエステル、ポリオキサエステル、ポリエステルアミド、アミノ基を含有するポリオキサエステル、ポリ(無水物)、ポリホスファゼン、生体分子(コラーゲン、エラスチン及びゼラチンのようなバイオポリマー、デンプン、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、酸化再生セルロース等のような多糖類を含む)、並びにそのコポリマー及びブレンドに加えて、木綿、亜麻布、絹、ナイロン6−6のようなナイロン、及びE.I.デュポン・ド・ヌムール・アンド・カンパニー(E.I. du Pont de Nemours and Company)から商品名「ケブラー(KEVLAR)」又はノメックス(NOMEX)として市販されているもののような芳香族ポリアミドが挙げられるが、これらに限定されない非吸収性材料、ポリ(エチレンテレフタレート)のようなポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化ポリ(エチレン−プロピレン)(FEP)及びポリビニリデンフッ化物(PFA)のようなフルオロポリマー、ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらの組み合わせのような生体適合性、生体吸収性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0094】
本明細書で使用するとき、「生体吸収性」は、比較的短期間内に体組織に曝露したとき、酵素的又は加水分解的反応を介して容易に分解する材料を指す。「分解」は、材料が、体により実質的に代謝又は排除できる小セグメントに崩壊することを意味する。完全な生体吸収は、約12ヶ月内に起こるべきであるが、生体吸収は、例えば、約9ヶ月内、約6ヶ月内、又は約3ヶ月内又はそれ未満で完了する場合もある。
【0095】
本発明の目的において、ポリ(イミノカーボネート)には、ドーム(Domb)ら編「生分解性ポリマーの手引き(Handbook of Biodegradable Polymers)」、ハードウッド・アカデミック・プレス(Hardwood Academic Press)、251〜272頁(1997年)にケムニッツァー(Kemnitzer)及びコーン(Kohn)により記載されたポリマーが挙げられると理解される。本発明の目的において、コポリ(エーテル−エステル)には、コーン(Cohn)及びユーネス(Younes)によるジャーナル・オブ・バイオマテリアル・リサーチ(Journal of Biomaterials Research)、22巻、993〜1009頁、1988年に、及びコーン(Cohn)によるポリマー・プレプリント(Polymer Preprints)(ポリマー・ケミストリー(Polymer Chemistry)のACS部門)、30巻(1号)、498頁、1989年に記載されているコポリエステル−エーテル(例えば、PEO/PLA)が挙げられると理解される。本発明の目的のために、ポリアルキレンオキザラートとしては、米国特許第4,208,511号、同第4,141,087号、同第4,130,639号、同第4,140,678号、同第4,105,034号及び同第4,205,399号に記載されているものが挙げられる。本発明の目的のために、チロシン由来ポリカーボネートとしては、プラプラ(Pulapura)ら、Biopolymers、32巻、4号、411〜417頁、及びエールテル(Ertel)ら、J.Biomed.Mater.Res.、1994年、28巻、919〜930頁に記載のようなポリマーを含むと理解される。本発明の目的のために、ポリホスファゼン、L−ラクチド、D,L−ラクチド、乳酸、グリコリド、グリコール酸、パラ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート及びε−カプロラクトンから作製されるコ−、ター−及びより高次の混合モノマーをベースとするポリマーは、「高分子科学工学百科事典(Encyclopedia of Polymer Science)」、13巻、31〜41頁、ワイリー・インターサイエンシズ(Wiley Intersciences)、ジョン・ワイリー&サンズ(John Wiley & Sons)、1988年に、オールコック(Allcock)により、及び、ドーム(Domb)編「生分解性ポリマーの手引き(Handbook of Biodegradable Polymers)」、ハードウッド・アカデミック・プレス(Hardwood Academic Press)、161〜182頁(1997年)にバンドルペ(Vandorpe)らにより、記載されているものを含むと理解される。本発明の目的ために、ポリエステルアミドは、米国特許出願第20060188547号及び米国特許第5,919,893号に記載のようなポリマーを含むと理解される。ポリ(無水物)としては、HOOC−C−O−(CH−O−C−COOH(mは2〜8の範囲の整数である)の二酸に由来するもの及び、12個以下の炭素原子の脂肪族α−ω二酸を有するそのコポリマーが挙げられる。アミン及び/又はアミド基を含むポリオキサエステル、ポリオキサアミド及びポリオキサエステルは、米国特許第5,464,929号、同第5,595,751号、同第5,597,579号、同第5,607,687号、同第5,618,552号、同第5,620,698号、同第5,645,850号、同第5,648,088号、同第5,698,213号、同第5,700,583号及び同第5,859,150号の1つ又はそれ以上に記載されている。本発明の目的のためのポリオルソエステルは、ヘラー(Heller)の生分解性ポリマーハンドブック(Handbook of Biodegradable Polymers)、ドン(Domb)ら編、ハードウッド・アカデミック・プレス(Hardwood Academic Press)、99〜118頁(1997年)に記載のポリマーを含むと理解される。本発明の目的ために、ポリウレタンは、米国特許第6,326,410号、同第6019996号、同第5571529及び同第4,960,594号に記載のようなポリマーを含むと理解される。
【0096】
本発明の目的ために、脂肪ポリエステルとしては、ラクチド(乳酸D−、L−及びメソラクチドが挙げられる)、グリコリド(グリコール酸を含む)、ε−カプロラクトン、p−ジオキサノン(1,4−ジオキサン−2−オン)、トリメチレンカーボネート(1,3−ジオキサン−2−オン)、米国特許第5,412,068号に記載のようなトリメチレンカーボネートのアルキル誘導体、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン、ε−デカラクトン、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、1,4−ジオキセパン−2−オン(そのダイマー1,5,8,12−テトラオキサシクロテトラデカン−7,14−ジオンを含む)、1,5−ジオキセパン−2−オン、6,6−ジメチル−1,4−ジオキサン−2−オンのホモポリマー及びコポリマー、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されないと理解される。
【0097】
1つの実施形態では、脂肪族ポリエステルはエラストマーコポリマーである。「エラストマーコポリマー」は、室温で、元の長さの少なくとも2倍に繰り返し伸び、応力を即時解放したとき、およそ元の長さに戻る材料として定義される。好適な生体吸収性、生体適合性エラストマーとしては、ε−カプロラクトン及びグリコリドのエラストマーコポリマー(約30:70〜約70:30の範囲、又は約35:65〜約65:35の範囲、約45:55〜約35:65の範囲の、ε−カプロラクトンのグリコリドに対するモル比を有するもののような);ε−カプロラクトン及び、L−ラクチド、D−ラクチド、これらのブレンド、又は乳酸コポリマーが挙げられるラクチドのエラストマーコポリマー(約35:65〜約65:35の範囲、又は約45:55〜約30:70の範囲の、ε−カプロラクトンのグリコリドに対するモル比を有するもののような);p−ジオキサノン(1,4−ジオキサン−2−オン)並びに、L−ラクチド、D−ラクチド及び乳酸が挙げられるラクチドのエラストマーコポリマー(約40:60〜約60:40の範囲の、p−ジオキサノンのラクチドに対するモル比を有するもののような);ε−カプロラクトン及びp−ジオキサノンのエラストマーコポリマー(約30:70〜約70:30の範囲の、ε−カプロラクトンのp−ジオキサノンに対するモル比を有するもののような);p−ジオキサノン及びトリメチレンカーボネートのエラストマーコポリマー(約30:70〜約70:30の範囲の、p−ジオキサノンのトリメチレンカーボネートに対するモル比を有するもののような);トリメチレンカーボネート及びグリコリドのエラストマーコポリマー(約30:70〜約70:30の範囲の、トリメチレンカーボネートのグリコリドに対するモル比を有するもののような);トリメチレンカーボネート及び、L−ラクチド、D−ラクチド、これらのブレンド、又は乳酸コポリマーが挙げられるラクチドのエラストマーコポリマー(約30:70〜約70:30の範囲の、トリメチレンカーボネートのラクチドに対するモル比を有するもののような);並びにこれらのブレンドから成る群から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、エラストマーコポリマーは、約35:65〜約65:35の範囲の、ε−カプロラクトンのグリコリドに対するモル比を有する、ε−カプロラクトン及びグリコリドのエラストマーコポリマーである。更に別の実施形態は、エラストマーコポリマーは、約35:65のモル比を有するε−カプロラクトン及びグリコリドのエラストマーコポリマーである。
【0098】
好適な植え込み不可能な基材の例としては、包帯及び創傷被覆材が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用するとき、「包帯」は、体の罹患若しくは傷害部分に巻き付ける又はそれを包むために用いることができる、布又は他の材料の小片を意味する。包帯は、創傷に対して直接定置する、又は包帯を用いて創傷に創傷被覆材を巻き付ける。本明細書で使用するとき、「創傷被覆材」は、創傷に対して直接定置し、創傷を保護する;治癒を促進する;及び/又は水分を提供する、保つ若しくは除去する目的を果たし、所望により包帯を用いて所定の位置に保持される、布又は他の材料の小片を意味する。
【0099】
植え込み不可能な基材は、布地、発泡体、ガーゼ、フィルム、接着ガーゼ包帯、ヒドロコロイド、ゲル及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない種々の形態であってよい。これらの植え込み不可能な基材は、体への適用(植え込みなし)に好適な任意の材料で構成されてよく、脂肪族ポリエステル、ポリ(L−リジン)及びポリ(グルタミン酸)のようなポリ(アミノ酸)、コポリ(エーテル−エステル)、1〜10個の炭素原子の長さのアルキル基を有するもののようなポリアルキレンオキザラート、ポリオキサアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ(イミノカーボネート)、ポリオルソエステル、ポリオキサエステル、ポリエステルアミド、アミノ基を含有するポリオキサエステル、ポリ(無水物)、ポリホスファゼン、生体分子(コラーゲン、エラスチン及びゼラチンのようなバイオポリマー、デンプン、アルギン酸、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、酸化再生セルロース等のような多糖類を含む)、並びにそのコポリマー及びブレンドに加えて、木綿、亜麻布、絹、ナイロン6−6のようなナイロン、及びE.I.デュポン・ド・ヌムール・アンド・カンパニー(E.I. du Pont de Nemours and Company)から商品名「ケブラー(KEVLAR)」又は「ノメックス(NOMEX)」として市販されているもののような芳香族ポリアミドが挙げられる、非生体吸収性材料、ポリ(エチレンテレフタレート)のようなポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化ポリ(エチレン−プロピレン)(FEP)及びポリビニリデンフッ化物(PFA)のようなフルオロポリマー、ポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらの組み合わせのような生体適合性、生体吸収性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。これらの材料は上記のように定義される。
【0100】
CRP止血剤成分は、ディップコーティング、スプレーコーティング、凍結乾燥コーティング、及び静電コーティング技術のような、従来のコーティング技術を介してこのような基材の表面に適用できる。これらのコーティング技術の詳細は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第6,669,980号;ユン(Yun)JHら、40(3)ASAIO J.M、401〜5(1994年7〜9月);及びクローガーズ(Krogars)Kら、Eur J Pharm Sci.、2002年(10月)、17(1〜2)、23〜30頁に開示されている。一般に、所望の量のCRP止血剤を含有する溶液を調製し、選択したコーティング技術を介して所望の基材の表面に適用することができる。基材を、次いで、空気乾燥、真空オーブン内での真空乾燥、又は凍結乾燥が挙げられるが、これらに限定されない従来の乾燥プロセスを介して乾燥してよい。CRPは、血液凝固、血小板凝集等のような所望の止血特性を達成するのに必要な量で用いるべきであるが、一般に、CRPは、基材をコーティングする目的のために、約0.01mg/cm〜約1mg/cmの範囲の基材、又は約0.1mg/cm〜約0.5mg/cmの範囲、又は約0.4mg/cmの範囲の量で存在する。
【0101】
基材は注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又はゲル形成液体、CRP止血剤成分(粉末又はコラーゲン様原線維物質の形態であってよい)である別の実施形態では、当該技術分野において既知の従来の混合技術を介して、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体と組み合わせてもよい。注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又はゲル形成液体は、水性塩溶液及びゲル化材料から構成されてよい。
【0102】
好適な水性塩溶液の例としては、生理学的緩衝溶液、生理食塩水、水、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、ハンクス平衡塩類溶液、PBS、トリス緩衝生理食塩水、ヘペス緩衝生理食塩水、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。1つの実施形態では、水性塩溶液は、リン酸緩衝溶液又はPBSであってよい。
【0103】
好適なゲル化材料の例としては、コラーゲン、エラスチン、トロンビン、フィブロネクチン、ゼラチン、フィブリン、トロポエラスチン、ポリペプチド、ラミニン、プロテオグリカン、フィブリン糊、フィブリンクロット、多血小板血漿(PRP)塊、乏血小板血漿(PPP)塊、自己集合ペプチドヒドロゲル、及びアテロコラーゲンのようなタンパク質;デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース(例えば、メチルセルロース)、アルキルヒドロキシアルキルセルロース(例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース)、ヒドロキシアルキルセルロース(例えば、ヒドロキシエチルセルロース)、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネートアルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−N−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸ポリグルクロン酸、及び誘導体のような多糖類;リボ核酸、デオキシリボ核酸、並びにポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(オキシアルキレン)、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(プロピレンオキシド)のコポリマー、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリレート、モノステアロイルグリセロールco−スクシネート/ポリエチレングリコール(MGSA/PEG)コポリマーのような他のもののようなポリヌクレオチド、並びにこれらのコポリマー及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
本明細書に記載のセルロース材料の定義では、用語「アルキル」は、約1〜約7個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖であってよい炭化水素鎖を指し、特定の実施例で特に断らない限り、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、2,3−ジメチルブチル、ネオヘキシル又はヘプチルである。
【0105】
1つの実施形態では、ゲル化材料は多糖類から構成される。別の実施形態では、ゲル化材料は、カルボキシメチルセルロースナトリウムから構成される。
【0106】
注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体は、水性塩溶液に有効量のゲル化材料を溶解させて、初期ゲルを形成することにより調製できる。
【0107】
「有効量」のゲル化材料は、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体を、患部に注入又は噴霧し、適用後も所定の位置に実質的に留まることを可能にするのに十分必要なゲル化材料の量として定義される。有効量のゲル化材料は、例えば、選択されたゲル化材料、所望のCRP量等に応じて変動するが、当業者は過度な実験を行うことなく、ゲル化材料の有効量を容易に決定できる。ゲル化材料がカルボキシメチルセルロースナトリウムである、1つの実施形態では、ゲル化材料は、溶液の総重量に基づいて、約0.1パーセント〜約5パーセントの範囲、又は約0.5パーセント〜約3パーセントの範囲の量で存在してよい。
【0108】
CRP止血剤成分は、次いで、スパチュラによる手動混合、電磁攪拌又はモータ及び回転パドル若しくは刃を用いる機械混合が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知である、任意の従来の混合技術により初期ゲルと組み合わせてよい。可能性のあるCRPに対する有害な影響を最小限に抑えるために、混合温度は約50℃を超えるべきではない。CRP止血剤は、出血部位に適用したとき、止血を誘発するのに有効な量で、得られるゲル中に存在し、典型的には、最終ゲルの総重量に基づいて、約0.1mg/mL〜約10mg/mLの範囲、又は約0.1mg/mL〜約1mg/mLの範囲、又は約0.3mg/mLである。1つの実施形態では、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体は、注入前にゲル状であってよく、一方、代替実施形態では、注入可能な若しくは噴霧可能なゲル又は液体は、注入前に液体状であってよいが、所望の箇所に投与したとき、ゲル状になり、実質的に所定の位置に留まることもできる。
【0109】
CRP止血剤成分が粉末状である実施形態では、CRPを当該技術分野において既知である任意の好適な粉末担体と組み合わせてもよい。1つの実施形態では、担体は、例えば、マー(Maa)YFら、SJ Curr Pharm Biotechnol.、2000年(11月)、1(3)、283〜302頁に開示されている方法を用いて、粉末粒子上に噴霧コーティングしてもよい。CRP止血剤成分は、総粉末重量に基づいて、約0.5パーセント〜約100パーセントの範囲、又は約2パーセント〜約10パーセンの範囲の量で、粉末中に存在してもよい。
【0110】
好適な粉末担体の例としては、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキルセルロース(例えば、メチルセルロース)、アルキルヒドロキシアルキルセルロース(例えば、エチルヒドロキシエチルセルロース)、ヒドロキシアルキルセルロース(例えば、ヒドロキシエチルセルロース)、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネートアルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−N−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、マンニトール、多孔質溶岩、ポリエステル、及びコポリマーのような多糖類、並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0111】
一般的なCRP合成
本発明のCRPは、種々の固相又は溶液技術により製造できる。例えば、CRPは他の方法(例えば、溶液法)により調製し、次いでその後のカップリングのために支持材料に付着させることもできるが、固相ポリペプチド合成(SPPS)技術のような標準的な固相有機合成技術を用いることが好ましい。つまり、本発明のCRPを合成し、その後支持材料に付着させ、種々の試薬とカップリングし、次いで種々の技術を用いて支持材料から取り除くことができる。しかしながら、CRPを支持材料上で合成し、試薬とカップリングし、次いで種々の技術を用いて支持材料から取り除くことが好ましい。
【0112】
CRPの調製では(オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質)、固相ペプチド合成は、新生CRP鎖を、結合のための適切な官能基を含む支持材料(典型的には不溶性ポリマー支持体)に結合させる共有結合工程(すなわち、アンカリング)を含む。その後、アンカリングされたCRPは、CからN−方向に段階的にN−保護及び側鎖保護アミノ酸を付加することを含む、一連の付加(脱保護/カップリング)サイクルにより伸びる。一旦鎖の組立が完了すると、保護基を取り除き、CRPを支持体から切断する。場合によっては、保護基を取り除く前に、他の基をCRPに付加する。
【0113】
典型的には、SPPSは、ハンドルを用いて、初期アミノ酸残基を官能化支持材料に結合することにより開始する。ハンドル(すなわちリンカー)は、一端に、平滑に切断可能な保護基の特性を組み込み、他端に、官能化支持材料へのカップリングを可能にするために活性化できる官能基、多くはカルボキシル基の特性を組み込む、二官能性スペーサである。既知のハンドルとしては、酸に不安定なp−アルコキシベンジル(PAB)ハンドル、感光性o−ニトロベンジルエステルハンドル、並びにアルベリシオ(Albericio)ら、J.Org.Chem.、55巻、3730〜3743頁(1990年)及び本明細書に引用する参考文献、米国特許第5,117,009号(バラニー(Barany))及び同第5,196,566号(バラニーら)に記載されているもののようなハンドルが挙げられる。
【0114】
例えば、支持材料がアミノ官能モノマーで調製される場合、典型的には、適切なハンドルは、一段階でアミノ官能化支持体に定量的に結合して、ポリペプチド鎖集合体について明確に定義された構造の一般的な起点を提供する。ハンドル保護基は取り除かれ、N’−保護第1アミノ酸のC−末端残基はハンドルに定量的に結合する。一旦ハンドルが支持材料にカップリングし、初期アミノ酸がハンドルに結合すると、一般的な合成サイクルが進行する。合成サイクルは、一般に、支持材料上のアミノ酸のN−保護アミノ基の脱保護、洗浄、及び必要に応じて中和工程、続く次のN−保護アミノ酸のカルボキシル活性化型との反応から成る。サイクルを繰り返して、関心CRPを形成する。官能化不溶性支持材料を用いる固相ペプチド合成法は周知である。
【0115】
SPPS技術を用いて支持材料上でCRPを合成するとき、Fmoc方法論は、塩基に不安定な9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)保護基を用いる、穏やかな直交性技術(mild orthogonal technique)の使用を含む。Fmocアミノ酸は、フルオレニルメチルスクシンイミジルカーボネート(Fmoc−OSu)、Fmoc塩化物、又は[4−(9−フルオレニルメチルオキシカルボニルオキシ)フェニル]ジメチルスルホニウムメチルスルフェート(Fmoc−ODSP)を用いて調製できる。Fmoc基は、ジメチルホルムアミド(DMF)若しくはN−メチルピロリドン中のピペリジンを用いて、又はDMF中の1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ−7−エン(DBU)を用いて取り除くことができる。Fmoc除去後、支持された樹脂の解放されたN−アミンは、遊離しており、中和工程が介在することなく、いつでも脂質を即座に結合できる状態になっている。所望のCRPの固定化された疎水性類似体を、次いで、例えば室温でトリフルオロ酢酸(TFA)を用いて取り除くことができる。このようなFmoc固相ポリペプチド合成方法論は、当業者に周知である。
【0116】
本発明の複合体の調製のために種々の支持材料を用いることができる。それらは、無機又は有機材料であってよく、種々の形態(膜、粒子、球体ビーズ、繊維、ゲル、ガラス等)であってよい。例としては、多孔質ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリジメチルアクリルアミド、木綿、紙等が挙げられる。アミノ官能化ポリスチレン、アミノメチルポリスチレン、アミノアシルポリスチレン、p−メチルベンズヒドラミンポリスチレン又はポリエチレングリコール−ポリスチレン樹脂のような官能化ポリスチレンを、この目的のために用いてもよい。
【0117】
具体的なCRP合成
当業者であれば、本明細書の記載に基づけば本発明を最大限利用することができるものと考えられる。以下の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、いかなることがあっても以下の開示を限定するものではない。
【0118】
材料及び方法:Fmocアミノ酸、HBTU/HOBT、DIEA、NMP及びDCMは、アプライド・バイオシステム社(Applied Biosystems, Inc.)から購入した。ピペリジンはシグマ・アルドリッチから購入した。Fmoc−Gly−Wang樹脂はベイケム(Bachem)及びFmoc−Phe−Wang樹脂はノババイオケム(Novabiochem)から購入した。MALDI−TOF質量分析は、マトリックスとしてα−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸を用いる、ディレイド・エクストラクションレーザー脱離質量分析計に連結した、アプライド・バイオシステム・ボイジャー−DE PRO生体分光ワークステーション(Applied Biosystems Voyager-DE PRO Biospectrometry workstation)を用いて、M−スキャン社(M-Scan Inc.)で実施した。アミノ酸分析は、ベックマン6300 Liベースのアミノ酸分析計(Beckman 6300 Li-based amino acid analyzer)を用いて、U.C.デービス(U.C.Davis)の分子構造施設(Molecular Structural Facility)で実施した。得られるCRPの純度は>90%であり、ポリペプチド含量は各実験の溶液を調製するために考慮した。更に、214(PBS中でε=6.0×10−1cm−1)又は215nm(水中でε=6.5×10−1cm−1)での吸収を測定し、CRP濃度を確認した。電子顕微鏡実験のためのポリペプチド濾過は全て、ワットマン(Whatman)製のヌクルポア(Nuclepore)フィルタ(0.4−μm;ポリカーボネート膜)を用いて実施し、残りの濾過はポール(Palll)製のアクロディスク・シリンジ・フィルタ(Acrodisc syringe filters)(0.45−μm;ポリテトラフルオロエチレン膜)を用いて行った。
【0119】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語はすべて、発明が属する技術分野における当業者によって一般的に解釈されるのと同じ意味を有するものである。本明細書で用いる略記は以下の通りである。
【表1】

【実施例】
【0120】
(実施例1)
配列番号25:(F)−Phe−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe
比較配列番号29:Ac−(Gly−Pro−Hyp)10−Gly
比較配列番号35:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)5−Phe
配列番号25を有するCRP並びに、配列番号29及び配列番号35を有する比較ポリペプチドを、標準的なFastMoc化学により合成し、逆相HPLCにより精製し、特徴付けた。
【0121】
配列番号25を有するCRPを、FastMoc化学(0.1mmolスケール)及びFmoc−Phe−Wang樹脂(0.74mmol/g、100〜200メッシュ)を用いて、ABI 431合成装置で合成した。TFA/トリイソプロピルシラン/水(95:2.5:2.5)を用いて、2時間、樹脂からCRPを切断した。HPLC精製を、50mL/分の流速で60分間にわたって10〜95%の直線勾配のB(A:0.2%TFA/HO;B:0.16%TFA/MeCN)を用いて、フェノメネックス(Phenomenex)C−18逆相カラム(25×5cm)で実施した。全収率32%で、白色粉末としてCRPを得た。配列番号25:(F)−Phe−(Gly−Pro−Hyp)10−Pheの場合:MALDI−TOF−MS(M+Na)1381853243の計算値3096.3;実測値3096.8。配列番号35を有する比較ポリペプチド:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)5−Pheを、配列番号25を有するCRP:(F)−Phe−(Gly−Pro−Hyp)10−Pheと同様に合成した。
【0122】
配列番号29を有する比較ポリペプチド:Ac−(Gly−Pro−Hyp)10−Glyを、FastMoc化学(0.1mmolスケール)及びFmoc−Phe−Wang樹脂(0.7mmol/g、100〜200メッシュ)を用いて、ABI 433A合成装置で合成した。95%TFAを用いて、2時間、樹脂からCRP比較ポリペプチドを切断した。HPLC精製を、6mL/分の流速で90分間にわたって0〜100%の段階的勾配のB(A:0.1%TFA/HO;B:0.1%TFAを含有する80%MeCN/HO)を用いて、2つのバイダック(Vydac)C−18逆相カラム(25×2.5cm)で実施した。全収率34%で、白色粉末として比較ポリペプチドを得た。配列番号29:Ac−(Gly−Pro−Hyp)10−Glyの場合:MALDI−TOF−MS(M+Na)1241773143の計算値2811.3;実測値2812.2。
【0123】
円偏光二色性(CD)分光法
配列番号25を有するCRP並びに配列番号29及び配列番号35を有する比較ポリペプチドの溶液(水中0.25mM及び0.013mM)を4℃に24時間保管し、3量体形成を監視した。100nm/分のスキャン速度で、10又は20回のスキャンの平均の信号により、路長0.1cmのセルを用いて、ジャスコ(Jasco)J−710機器で25℃にてCDスペクトルを測定した。CD分光法(θmax=225nm)により、配列番号25を有するCRP及び配列番号29を有する比較ポリペプチドは、3重らせん構造を採用することが分かった。ペルチェ温度制御システムを装備するAviv215分光計で、CD融解曲線を得た。225nmにおける楕円率を、20〜100℃、速度1℃/分、増分3℃、平衡時間5分及び路長0.1cmで監視した。
【0124】
配列番号25を有するCRPホモポリマーのTは約57℃であると決定された。配列番号25を有するCRP 3量体の結果は、温度依存性1H NMR研究により確認され、ここでプロリンのδ−Hの特徴的な低磁場シフト(元々δ3.0〜3.5ppm)は、約55℃〜約65℃で生じた(平衡で)。したがって、配列番号25を有するCRP 3量体は室温超で安定であった。対照的に、配列番号25を有するCRP 3量体の熱安定性は、1対のジスルフィド結合により共有結合した3本のペプチド鎖を有する、最近記載されたコラーゲン模倣化合物(T=47℃)よりわずかに高かった(コッチ(Kotch)F及びレインズ(Raines)RT、Proc.Natl.Acad.Sci USA、2006年、103巻、3028〜3033頁)。配列番号29を有する参照ポリペプチド3量体(T70℃)に比べて、配列番号25を有するCRP 3量体の融解温度がより低いことは、フェニル及びペンタフルオロフェニル基による配列番号25を有するCRP 3量体の末端のいくつかの構造的破損(「ほころび(fraying)」の原因となる場合がある。
【0125】
動的光散乱(DLS)
633nmのレーザー(He−Ne、4.0mW)を装備するマルバーン・ゼータサイザー・ゼン(Malvern Zetasizer Zen)1600機器及び173℃における後方散乱検出によりDLS測定を行った。配列番号25を有するCRP及び配列番号29を有する参照ポリペプチド(水中0.5mg/mL)の溶液を70℃で10分間加熱し、0.45μmのフィルタを通して加熱濾過し、溶液が室温に達したとき(時間=0)及び24時間後にプラスチックのキュベット(1.0cm)内で測定した。
【0126】
DLS測定を行って、25℃の水中の配列番号25を有するCRP及び配列番号29を有する比較ポリペプチドにより形成された超分子複合材の大きさを決定した。24時間後、3nm及び190nmの2種を含む配列番号25を有するCRPの新鮮溶液を、およそ1000nmの大きさを有する凝集体材料に変換された。対照的に、配列番号29を有する比較ポリペプチドは、およそ4及び100nmの大きさの2種を示したが、この大きさは同じ期間では増加しなかった。これらの結果は、仮定したフェニルペンタフルオロフェニル芳香環スタッキング機構は、配列番号25を有するCRPからの超分子複合材の形成を促進することを示唆する。
【0127】
透過電子顕微鏡(TEM)
配列番号25を有するCRPの超分子複合材の大きさ及び形態を、TEMフィリップス(Philips)EM 300で撮影したTEM像で評価した。配列番号25を有するCRP(0.05mg/mL)の水溶液を0.4μmのフィルタを通して濾過し、炭素フィルムでコーティングされた銅格子上に沈着させた。溶液を40℃で乾燥させ、80kVで画像を記録した。マウスの動脈を2%グルタルアルデヒドで染色し、TEM用にエポキシブロック内に定置した。エポキシブロック内の動脈の薄切片(寸法およそ200〜500nm)を、ダイヤモンド切断具を用いて切断した。切片を銅格子上に実装し、60kVで画像を記録した。各実験では、長さμmの、複合材原線維(平均直径:0.26μm)(マウスの動脈組織で見られるコラーゲン原線維(平均直径:0.05μm)に類似する)を観察した。配列番号25を有するCRPの原線維寸法は、各方向に少なくとも100個の配列番号25を有するCRP 3量体の端端(線形)及び側側(側方)集合体の組み合わせを必要とした。
【0128】
プロトンNMR分光法
配列番号25を有するCRP(24時間4℃でインキュベートしたDO中1mM)のプロトンNMRスペクトルを、三重共鳴(H、13C、15N)、三重軸、勾配プローブを装備した、DMX−600 NMR分光計(ブリューカー・バイオスピン(Bruker Biospin, Inc.)、ビルリカ(Billeric)、マサチューセッツ州、MA 01821−3991)で回収した。リサイクルディレイ及び混合時間中、プレサチュレーションで1方向NOESYを用いてデータを収集した。温度を10℃ずつ上昇させ、平衡の15分後スペクトルを測定した。
【0129】
(実施例2)
配列番号25:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe
配列番号26:Phe−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe
配列番号27:Leu−(Gly−Pro−Hyp)10−Phe
配列番号28:Gly−(Gly−Pro−Hyp)10−Gly
配列番号25、配列番号26及び配列番号27を有するCRP、並びに配列番号28を有する比較ポリペプチドを、標準的なFastMoc化学により合成し、逆相HPLCにより精製し、特徴付けた。
【0130】
ペプチド合成
配列番号25、配列番号26及び配列番号27を有するCRP、並びに配列番号28を有する比較ポリペプチド、FastMoc化学(0.1mmolスケール)及びFmoc−Phe−Wang樹脂(0.74mmol/g、100〜200メッシュ)又はFmoc−Gly−Wang樹脂(0.66mmol/g、100−200メッシュ)を用いて、ABI 431合成装置で合成した。TFA/トリイソプロピルシラン/水(95:2.5:2.5)を用いて、2時間、樹脂からCRPおよりポリペプチドを切断した。精製を、20mL/分の流速で15分間にわたって5〜95%の直線勾配のB(A:0.05%TFA/水;B:0.05%TFA/MeCN)を用いて、RP−HPLC(ゾルバックス(Zorbax)300SB−C18、21.2×150mm、60℃で)により実施した。画分を、1mL/分の流速で20分間にわたって5〜95%の直線勾配のB(A:0.02%ギ酸/水;B:0.02%ギ酸/MeCN)を用いて、60℃にて、ゾルバックス(Zorbax)300SB−C18カラム(3.5μm4.6×150nm)を用いてフィニガン(Finnigan)LCQ検出器に連結されたアギレント(Agilent)1100でLC/MSにより分析した。
【0131】
表1に示すように、純(>90%)物質を含有する画分を組み合わせ、凍結乾燥して、白色粉末としてペプチドを得た。215nmにおける吸収を測定し、参照ペプチド配列番号34:(Pro−Hyp−Gly)10(ベンダー:ペプチド・インターナショナル(Peptides International))に対して測定した吸光計数(ε=6.5×10−1cm−1)を用いてペプチド含量を決定した。計算及び実測MS値を、MALDI−TOF−MS(M+Na)を用いて決定した。
【表2】

【0132】
CRP分析
CD分光法:配列番号25、配列番号26及び配列番号27を有するCRPの溶液、並びに配列番号28を有する参照ポリペプチドの溶液(水中0.25mM及び0.013mM)を4℃に24時間保管し、3重らせん体形成を監視した。100nm/分のスキャン速度で、10又は20回のスキャンの平均の信号により、路長0.1cmのセルを用いて、ジャスコ(Jasco)J−710機器で25℃にてCDスペクトルを測定した。ペルチェ温度制御システムを装備するAviv 215分光計で、CD融解曲線を得た。225nmにおける楕円率を、20〜100℃、速度1℃/分、増分3℃、平衡時間5分及び路長0.1cmで監視した。
【0133】
25℃における3つのCRP(水中0.25mM)のCDスペクトルは、コラーゲン3重らせんに特徴的な225nm(θmax)バンドを示した。配列番号25、配列番号26及び配列番号27を有するCRPにより形成される3重らせんの熱安定性もまた、20〜100℃、増分3℃及び平衡時間5分で、225nmにおける楕円率を監視することにより比較研究した。3つのCRPの融解温度は、非常に類似しており(56〜59℃の範囲で)、これは、N−末端の構造的差とは独立に、全て安定な3量体を形成したことを示す。
【0134】
(実施例3)
配列番号31:FPhe−(Gly−Pro−Hyp)9−Phe
配列番号32:Phe−(Gly−Pro−Hyp)9−Phe
配列番号33:Leu−(Gly−Pro−Hyp)9−Phe
以下でより詳細に説明するように、本発明のCRP 3量体のモデル構造は、配列番号30:(Pro−Hyp−Gly)−(Pro−Hyp−Ala)−(Pro−Hyp−Gly)を有するコラーゲン様ポリペプチド3量体のX線構造から構築した(ベラ(Bella)J、イートン(Eaton)M、ブロツキー(Brodsky)B及びバーマン(Berman)HM、Science、1994年、266巻、75〜81頁)。配列番号30を有するコラーゲン様ポリペプチド3量体を突然変異させて、N−末端(Proの位置)にFPheを、C−末端(Glyの位置)にPheを組み込んで、配列番号31を有するCRP(配列番号25に類似するが、GPO反復を1つ欠く)を得た。配列番号32及び配列番号33を有するポリペプチドを、それぞれ、Phe及びLeuを用いて同様に調製した。
【0135】
計算機化学
配列番号30を有するコラーゲン様ポリペプチドの結晶構造を、モデリングの起点として用いた。この構造は中央にアラニン残基を含んでいたため、まずその残基をグリシンに突然変異させた。式(I)のB及びX単位のそれぞれ1つを、次いで、配列番号30を有する3重らせんの各鎖のN−末端及びC−末端に付加した。C−末端では、配列番号30のGlyをPhe(配列番号31、配列番号32及び配列番号33)に置換した。N−末端では、Pro−Hypセグメントを、単一のFPhe(配列番号31)、Phe(配列番号32)及びLeu(配列番号33)で置換した。
【0136】
配列の性質により、配列番号31、配列番号32及び配列番号33を有するCRPはそれぞれ1個以下(one less)のGPOモチーフ反復を含んでいたが(配列番号25、配列番号26及び配列番号27と比べて)、配列番号25、配列番号26及び配列番号27の分子モデリングに好適であった。各CRP 3量体を、拘束された骨格鎖、OPLS−AA力場(ヨーアンセン(Jorgensen)WL及びチラド−ライブス(Tirado-Rives)J、J.Am.Chem.Soc.、1988年、110巻、1657〜1666頁)、GB/SA水(キ(Qui)D、スヘンキン(Shenkin)PS、ホリンガー(Hollinger)FP及びスティル(Still)CW、J.Phys.Chem.A.、1997年、101巻、3005〜3014頁)、マクロモデル(Macromodel)9.0(マクロモデル9.0、2005年、シュレーディンガー社(Schrodinger, Inc.,)、1500 SWファーストアベニュー(First Ave.)、Suite 1180、ポートランド(Portland)、オレゴン、97201)を用いて、最小限化して、修飾によりもたらされる任意のひずみを弛緩させた。各CRP 3量体は、次いで、3量体の中心軸に沿って3量体単位の2つを整列させることにより、同じ配列のCRP 3量体と対を形成した。この工程では、注意深く疎水性認識単位をおおまかに整列させた。
【0137】
配列番号31、配列番号32又は配列番号33を有する整列したCRP 3量体対のそれぞれは、自己集合及びXED力場を用いる原線維増殖を評価し、ここで各整列した3量体対を<0.01rmsに最小限化される(束縛のない共役勾配;ハンター(Hunter)CA、サンダース(Sanders)JKM、J.Am.Chem.Soc.、1990年、112巻、5525〜5534頁);ビンター(Vinter)JG、J.Comp.−Aid.Mol.Design、1994年、8巻、653〜668頁;ビンター(Vinter)JG、J.Comp.−Aid.Mol.Design、1996年、10巻、417〜426頁;並びにチェッサリー(Chessari)G、ハンター(Hunter)CA、ロー(Low)CMR、パッカー(Packer)MJ、ビンター(Vinter)JG及びゾンタ(Zonta)C、Chem Eur.J.、2002年、8巻、2860〜2867頁)。全てのカルボキシレート及びアンモニウムイオンは、溶媒和効果の一部を占める、完全充電の1/8で帯電していた。最小化後、2つの3重らせん単位間の相互作用エネルギー(IE)を計算し、クーロン力及びファンデルワールス成分の両方から成っていた。このエネルギーは、各3重らせん単位間の全ての分子内項を含んでいた。分子内項及び同じ3重らせん束の鎖間エネルギーは含まれなかった。認識要素のいくつかの組み合わせの結果を表2に要約する。
【0138】
配列番号31を有する整列したCRP 3量体対のモデル化界面エネルギーを(表2、項目1)に示す。3つの芳香環対は正面配向を採用し、1つの水素結合が界面に観察された。構造は、縁面配置の芳香族を再配向し、次いで再最小化することにより試験した(表2、項目2)。得られる界面構造は、類似の界面エネルギーで正面相互作用に戻った。配列番号32を有するCRP 3量体対の界面は、縁面(表2、項目3)又は変位し、角度を成した正面相互作用のいずれかを示した。配列番号33を有するCRP 3量体対の全体的な界面エネルギーはより低かった(表2、項目4)。
【表3】

配列番号31のPhe−ペンタフルオロフェニルアラニン(体面配向で出発)モデル
配列番号31のPhe−ペンタフルオロフェニルアラニン(T字型配向を出発)モデル、対面配向へ戻るのを最低化
縁縁配向に最低化する。
【0139】
表2に示すように、配列番号31、配列番号32及び配列番号33を有するポリペプチドは、様々な程度に端端を組立ための構造的要件を有する。同じように、配列番号25、配列番号26及び配列番号27を有するポリペプチドもまた、同様に端端を組み立てるために構造的要件を有してもよい。
【0140】
(実施例4)
血小板凝集研究
配列番号25を有するCRPの、コラーゲンの生物学的機能を模倣する能力を、ヒト血小板凝集アッセイで評価した。健常ボランティア由来のヒト多血小板血漿(PRP)濃縮物を、バイオロジカル・スペシャリティーズ(Biological Specialties, Inc.)(コルマル、ペンシルバニア州)から購入した。PRPは5時間より古くなく、なぜなら24時間のPRPはコラーゲン及び配列番号25を有するCRPに対する反応がかなり弱まっていたためである。PRPは730gで15分間遠心分離した。得られる血小板ペレットを1U/mLアピラーゼ(等級V、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)を含有するCGS緩衝剤(13mMクエン酸ナトリウム、30mMグルコース、120mM NaCl、pH6.5)で2回洗浄し、タイロード緩衝剤(140mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO、0.76mM NaHPO、5.5mMデキストロース、5.0mMヘペス、0.2%BSA、pH7.4)に再懸濁した。「洗浄した」血小板を、3×10血小板/mLに希釈し、使用前、>45分間37℃で維持した。
【0141】
このアッセイでは、105μLの洗浄した血小板、2mM CaCl及び2.5mMのフィブリノーゲンを96ウェルマイクロタイタープレートに添加した。血小板凝集は、ネイティブなコラーゲン原線維(ウマI型;ヒトコラーゲン配列と92%同一性;クロノ−ログ社(Chrono-log Corp.)、ハーバータウン(Havertown)、ペンシルバニア州)又は試験ペプチドの連続濃縮物の添加により開始した。緩衝剤を1式の対照ウェルに添加した。アッセイプレートを絶えず攪拌し、及び断続的にマイクロプレートリーダー(ソフトマックス(Softmax)、モレキュラーデバイス(Molecular Device)、メンロパーク(Menlo Park)、カリフォルニア州)に定置し、化合物溶液の添加後0及び5分で光学密度(650nm)を読み取った。凝集を時間−0及び5分の間の光学密度の減少として計算し、凝集の百分率として表した。
【0142】
血小板凝集研究のペプチド調製条件を表3に示す。ペプチドをPBS(pH7)又は水(最終pH5)に溶解させ、2mg/mLに濃縮した。いくつかの試料を水浴(70℃)で10分間加熱し、0.45−μmのフィルタを通して濾過し、24時間又は7日間、4℃でインキュベートした。濾過前後の215nmにおけるUV測定値は、ペプチドの損失がないことを示した。PBS(pH7)又は水中の配列番号25を有するCRPのいくつかの試験溶液を24時間又は7日間(4℃)でインキュベートし、他の試料を変性(H+F)し、4℃で再アニールした。
【表4】

H+Fは70℃10分間加熱し、0.45−μmのフィルタを通して濾過することを表す。
【0143】
配列番号25を有するCRPの様々な溶液は、血小板凝集を誘発したが、短時間のインキュベート、「H+F」サンプルが効力低下を示した。配列番号25を有するCRP(未処理、PBS中で7日間熟成);EC50=0.37μg/mL)は、ウマI型コラーゲン(EC50=0.25μg/mL)とほぼ等効力であり、一方、配列番号34:(Pro−Hyp−Gly)10を有する30メルの参照ポリペプチドは血小板の凝集に失敗した。配列番号34(Pro−Hyp−Gly)10のペプチドは、ペプチド・インターナショナル(Peptides International, Inc.)から購入した。
【0144】
これらの結果は、配列番号25を有するCRP 3量体が経時的に適切な長さ及び高次構造の凝集体に自己集合して、血小板認識のための構造的要件を満たすことができる(恐らく血小板コラーゲン受容体で)ことを示す。更に、非共有的な手段による、配列番号25を有する短い(8−nm)のCRPの、CRP 3量体への、次いでコラーゲン模倣特性を有するコラーゲン様原線維への自己集合が観察された。とりわけ、マイクロメートルの長さの、3重らせんを含む複合材原線維を、CD、DLS及びTEMデータにより決定されたように、形成した。また、配列番号25を有するCRP 3量体は、コラーゲンと同じように血小板凝集を誘発する能力を有する、機能的タンパク質様材料として作用した。式(I)のCRPの芳香環−芳香環及び疎水性−疎水性認識モチーフは、コラーゲン模倣ペプチドの自己集合に対する直接的アプローチを提供し、生物学的に機能する原線維構造に集合することができるCRP 3量体を提供する。
【0145】
(実施例5)
配列番号25を有するCRP 3量体により誘発される血小板凝集の阻害は、インテグリンGPIIb/IIIa拮抗薬エラロフィバンを用いて得た(フックストラ(Hoekstra)WJら、J.Med.Chem.、1999年、42巻、5254〜5265頁)。配列番号25を有するCRP 3量体及びコラーゲンにより誘発される血小板凝集は、エラロフィバン、GPIIb/IIIa阻害剤により阻害された。
【0146】
配列番号25を有するCRP 3量体及びコラーゲンの添加前に、5分間、洗浄した血小板を種々のエラロフィバン用量(10、100及び1000nM)とともにインキュベートした。血小板凝集の用量依存性阻害が観察された。これらのデータは、コラーゲン並びに配列番号25を有するCRP 3量体が、GPIIb/IIIaシグナル伝達を引き起こすことにより、血小板凝集を活性化したことを示唆する。
【0147】
(実施例6)
コラーゲン又は配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配列番号34を有するCRP 3量体により誘発される血小板凝集を、実施例4に記載の方法により実施した。本発明の実施形態に従って、図1は、配列番号25、配列番号26及び配列番号27を有するCRP 3量体が、種々の程度に血小板の凝集を刺激し、配列番号25を有するCRP 3量体及び配列番号26を有するCRP 3量体はより強力であることを示す。配列番号28、配列番号34及び配列番号35を有する参照ポリペプチドは、血小板凝集の刺激については有効でなかった。コラーゲン並びに、配列番号25、配列番号26及び配列番号27を有するCRP 3量体について得られた図1のEC50値(±SEM)(μg/mL)を表4に示す。
【表5】

【0148】
(実施例7)
脾臓傷害モデルにおける、CRPコーティングされた及びPBS対照でコーティングされたPCL/PGA発泡体
工程A.CRPの懸濁
試験懸濁液は、0.33mgCRP/mLPBSの濃度で、pH7.4を有するリン酸緩衝生理食塩水(「PBS」)に、配列番号25を有するCRPを溶解させ、次いで懸濁液を7日間4℃でインキュベートすることにより調製した。
【0149】
工程B.PCL/PGA基材発泡体の調製
厚さ3mmのポリ(ε−カプロラクトン−co−グリコリド)(「PCL/PGA発泡体」)を、約5〜約−5℃の温度条件下で、約3時間、凍結乾燥機(FTSシステム、モデルTD3B2T5100)内で、11.4cm×11.4cm(4.5”×4.5”)アルミニウム型内の1,4−ジオキサン中の35/65(モル/モル)PCL/PGAの3重量パーセント溶液、50グラムを凍結乾燥することにより調製した。得られるPCL/PGA発泡体を型から取り出し、いくつかの5.1cm×5.1cm(2”×2”)の正方形に切断した。
【0150】
工程C.ポリペプチドコーティングされた発泡体の調製
上記工程Bに記載した手順に従って調製したPCL/PGA発泡体の正方形を、5.1cm×5.1cm(2”×2”)のアルミニウム型に入れた。均質になるまで、上記工程Aに記載した手順に従って調製したCRP懸濁液を混合した後、7mLの懸濁液を、次いで、発泡体の上面を実質的に覆うために、型に注いだ。型を、次いで、凍結乾燥機(FTSシステム、モデルTD3B2T5100)に入れ、−50℃に予冷し、−25℃で約44時間凍結乾燥させた。
【0151】
工程D.PBSコーティングされた対照発泡体の調製
発泡体の上面を実質的に覆うために、上記工程Bに記載した手順に従って調製した厚さ3mmのPCL/PGA発泡体を収容している5.1cm×5.1cm(2”×2”)の型に7mLのPBSを添加することにより、PBSコーティングされた発泡体を調製した。型を凍結乾燥機(FTSシステム、モデルTD3B2T5100)に入れ、−50℃に予冷し、−25℃で約44時間凍結乾燥させた。
【0152】
CRPコーティングされた発泡体及びPBSコーティングされた対照発泡体を、次いで、その後の試験のために、2cm×3cmのいくつかの小片に切断した。
【0153】
脾臓傷害モデル
2つの線状裂傷(そのそれぞれが長さ1cm、深さ0.3cmであった)を、ブタの脾臓に作製した。創傷を約3〜5秒間出血させた後、工程Cに従って生産したCRPコーティングした発泡体片を、手で1つの創傷(試験群1)の表面に適用し、工程Dに従って調製したPBSコーティングされた対照発泡体片を手により他の創傷(試験群2)の表面に適用した。同様の下向き圧力を、次いで、それぞれの試験部位に30秒間適用した。コーティングされた発泡体片を取り除いた後、各それぞれの創傷を視覚的に評価して、止血が達成されたかどうかを決定した。必要に応じて、30秒間の間隔で、それぞれ、同様の種類の清潔なコーティングされた発泡体片を用いて、各創傷に圧力を再適用した。各創傷について、止血を達成した時間、出血の停止を以下の表5に示す。
【表6】

【0154】
結果は、CRPコーティングされた発泡体が、対照発泡体より短い時間で止血を達成するのに有用であることを示す。
【0155】
前述の明細書は、例示の目的で提供される実施例とともに、本発明の原理を教示するが、本発明の実施は、以下の特許請求の範囲及びその均等物内の有用な変形、改作、及び/又は修正の全てを包含することが理解されよう。同様に、全ての刊行物、特許出願、特許、及び上記明細書に開示した他の参照文献は、その全文を参考として、あらゆる目的のために本明細書に組み込むものとする。
【0156】
〔実施態様〕
(1) 組成物であって、
式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドから構成され、
発泡体、粉末、繊維又はフィルムの形態である、組成物。
(2) 複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが、複数のコラーゲン関連ペプチド3量体の形で存在する、実施態様1に記載の組成物。
(3) 前記コラーゲン関連ペプチド3量体がホモ3量体である、実施態様2に記載の組成物。
(4) 前記コラーゲン関連ペプチド3量体がヘテロ3量体である、実施態様2に記載の組成物。
(5) 前記組成物が発泡体の形態であり、前記発泡体の総乾燥重量に基づいて、約0.1パーセント〜約15パーセントの可塑剤を更に含む、実施態様1に記載の組成物。
(6) 前記可塑剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、グリセロールの一酢酸塩、グリセロールの二酢酸塩、グリセロールの三酢酸塩及びこれらの混合物から成る群から選択される、実施態様5に記載の組成物。
(7) 前記組成物が、約0.5mm〜約10mmの厚さを有する発泡体の形態である、実施態様1に記載の組成物。
(8) 前記組成物が、約1マイクロメートル〜約500マイクロメートルの孔径を有する発泡体の形態である、実施態様1に記載の組成物。
(9) 前記組成物が、約50マイクロメートル〜約150マイクロメートルの厚さを有するフィルムの形態である、実施態様1に記載の組成物。
(10) 前記組成物が粉末の形態であり、前記粉末が約1マイクロメートル〜約2000マイクロメートルの粒径を有する、実施態様1に記載の組成物。
【0157】
(11) 多糖類、マンニトール、多孔質溶岩、ポリエステル、並びにこれらのコポリマー及び混合物から選択される担体を更に含む、実施態様10に記載の組成物。
(12) 前記多糖類が、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキル基が約1〜約7個の炭素原子を有するアルキルセルロース、アルキル基が約1〜約7個の炭素原子を有するアルキルヒドロキシアルキルセルロース、アルキル基が約1〜約7個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネート、アルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−N−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、並びにこれらのコポリマー及び混合物から成る群から選択される、実施態様11に記載の組成物。
(13) 止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様1に記載の組成物を、前記個体の少なくとも1つの出血部位に適用することから構成される、方法。
(14) 組成物であって、
(a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
(b)基材と、
から構成される、組成物。
(15) 複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド3量体の形で存在する、実施態様14に記載の組成物。
(16) 前記コラーゲン関連ペプチド3量体がホモ3量体である、実施態様15に記載の組成物。
(17) 前記コラーゲン関連ペプチド3量体がヘテロ3量体である、実施態様15に記載の組成物。
(18) 前記基材が人体に植え込むのに好適である、実施態様14に記載の組成物。
(19) 前記基材が、縫合アンカー、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、プレート、ねじ、フィルム;組織工学スカフォールド;発泡体又は粉末である、実施態様18に記載の組成物。
(20) 前記基材が、脂肪族ポリエステル、ポリ(アミノ酸)、コポリ(エーテル−エステル)、アルキル基が約1〜約10個の炭素原子を有するポリアルキレンオキザラート、ポリアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ(イミノカーボネート)、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含有するポリオキシエステル、ポリ(無水物)、ポリホスファゼン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、多糖類、並びにこれらのコポリマー及びブレンドから成る群から選択されるポリマーから構成される、実施態様14に記載の組成物。
【0158】
(21) 前記基材が、木綿、亜麻布、絹、ナイロン、ポリエステル、フルオロポリマー、ポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらのコポリマー及び組み合わせから成る群から選択される材料から構成される、実施態様14に記載の組成物。
(22) 前記基材が人体に植え込まれない基材である、実施態様14に記載の組成物。
(23) 前記基材が、包帯、接着ガーゼ包帯、創傷被覆材である、実施態様22に記載の組成物。
(24) 前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約0.01mg/cm〜約1mg/cmの量で前記組成物中に存在する、実施態様14に記載の組成物。
(25) 前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約0.1mg/cm〜約0.5mg/cmの量で前記組成物中に存在する、実施態様14に記載の組成物。
(26) 前記基材が、ε−カプロラクトン及びグリコリドのコポリマーから構成される発泡体である、実施態様14に記載の組成物。
(27) 止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様14に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
(28) 止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様26に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
(29) ゲルであって、
a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
b)ゲル化剤と、
から構成され、前記コラーゲン関連ペプチドが、前記ゲルの総重量に基づいて、約0.1mg/mL〜約10mg/mLの量で前記ゲル中に存在する、ゲル。
(30) 複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド3量体の形で存在する、実施態様29に記載の組成物。
【0159】
(31) 前記コラーゲン関連ペプチド3量体がホモ3量体である、実施態様30に記載の組成物。
(32) 前記コラーゲン関連ペプチド3量体がヘテロ3量体である、実施態様30に記載の組成物。
(33) 止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
実施態様29に記載のゲルを、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
(34) 組成物であって、
a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
b)少なくとも1種の賦形剤と、
から構成される、組成物。
(35) 実施態様1に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
(36) 実施態様14に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
(37) 実施態様29に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
(38) 実施態様34に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
(39) 出血性障害の治療を必要とする個体において出血性障害を治療する方法であって、
前記個体の所望の部位で血小板凝集を開始させるのに有効な量で、式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドを用いることを含む、方法。
(40) 出血性障害の診断を必要とする個体において出血性障害を診断する方法であって、
(a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドを、前記個体からの血小板を含有する血液又は血漿と組み合わせて、混合物を形成することと、
(b)前記混合物中の血小板凝集を評価するために、前記混合物を血小板凝集計に添加することと、
を含む、方法。
【0160】
(41) 組成物であって、
(a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
(b)製薬的活性物質と、
から構成される、組成物。
(42) 前記製薬的活性物質が、止血剤、抗感染剤、鎮痛剤、抗炎症剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様41に記載の組成物。
(43) 前記止血剤が、トロンビン、フィブリノーゲン、ADP、ATP、カルシウム、マグネシウム、TXA、セロトニン、エピネフリン、血小板因子4、第V因子、第EI因子、PAI−1、トロンボスポンジン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様42に記載の組成物。
(44) 前記抗感染剤が、抗体、抗原、抗生物質、抗ウイルス剤及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、実施態様42に記載の組成物。
(45) 前記抗炎症剤が抗ヒスタミン剤である、実施態様42に記載の組成物。
(46) 組成物であって、
式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドを追加した、化学的に定義された3次元ポリマーマトリックス、を含む、組成物。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
組成物であって、
式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドから構成され、
発泡体、粉末、繊維又はフィルムの形態である、組成物。
【請求項2】
複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが、複数のコラーゲン関連ペプチド3量体の形で存在する、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
前記コラーゲン関連ペプチド3量体がホモ3量体である、請求項2に記載の組成物。
【請求項4】
前記コラーゲン関連ペプチド3量体がヘテロ3量体である、請求項2に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物が発泡体の形態であり、前記発泡体の総乾燥重量に基づいて、約0.1パーセント〜約15パーセントの可塑剤を更に含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項6】
前記可塑剤が、グリセロール、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、グリセロールの一酢酸塩、グリセロールの二酢酸塩、グリセロールの三酢酸塩及びこれらの混合物から成る群から選択される、請求項5に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物が、約0.5mm〜約10mmの厚さを有する発泡体の形態である、請求項1に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物が、約1マイクロメートル〜約500マイクロメートルの孔径を有する発泡体の形態である、請求項1に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物が、約50マイクロメートル〜約150マイクロメートルの厚さを有するフィルムの形態である、請求項1に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物が粉末の形態であり、前記粉末が約1マイクロメートル〜約2000マイクロメートルの粒径を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項11】
多糖類、マンニトール、多孔質溶岩、ポリエステル、並びにこれらのコポリマー及び混合物から選択される担体を更に含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項12】
前記多糖類が、デンプン、ペクチン、セルロース、アルキル基が約1〜約7個の炭素原子を有するアルキルセルロース、アルキル基が約1〜約7個の炭素原子を有するアルキルヒドロキシアルキルセルロース、アルキル基が約1〜約7個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルセルロース、硫酸セルロース、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、架橋アルギネート、アルギン酸、プロピレングリコールアルギネート、グリコーゲン、デキストラン、硫酸デキストラン、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−N−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、並びにこれらのコポリマー及び混合物から成る群から選択される、請求項11に記載の組成物。
【請求項13】
止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
請求項1に記載の組成物を、前記個体の少なくとも1つの出血部位に適用することから構成される、方法。
【請求項14】
組成物であって、
(a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
(b)基材と、
から構成される、組成物。
【請求項15】
複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド3量体の形で存在する、請求項14に記載の組成物。
【請求項16】
前記コラーゲン関連ペプチド3量体がホモ3量体である、請求項15に記載の組成物。
【請求項17】
前記コラーゲン関連ペプチド3量体がヘテロ3量体である、請求項15に記載の組成物。
【請求項18】
前記基材が人体に植え込むのに好適である、請求項14に記載の組成物。
【請求項19】
前記基材が、縫合アンカー、縫合糸、止め金、手術用鋲、クリップ、プレート、ねじ、フィルム;組織工学スカフォールド;発泡体又は粉末である、請求項18に記載の組成物。
【請求項20】
前記基材が、脂肪族ポリエステル、ポリ(アミノ酸)、コポリ(エーテル−エステル)、アルキル基が約1〜約10個の炭素原子を有するポリアルキレンオキザラート、ポリアミド、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ(イミノカーボネート)、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含有するポリオキシエステル、ポリ(無水物)、ポリホスファゼン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、多糖類、並びにこれらのコポリマー及びブレンドから成る群から選択されるポリマーから構成される、請求項14に記載の組成物。
【請求項21】
前記基材が、木綿、亜麻布、絹、ナイロン、ポリエステル、フルオロポリマー、ポリオレフィン、ポリウレタン、並びにこれらのコポリマー及び組み合わせから成る群から選択される材料から構成される、請求項14に記載の組成物。
【請求項22】
前記基材が人体に植え込まれない基材である、請求項14に記載の組成物。
【請求項23】
前記基材が、包帯、接着ガーゼ包帯、創傷被覆材である、請求項22に記載の組成物。
【請求項24】
前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約0.01mg/cm〜約1mg/cmの量で前記組成物中に存在する、請求項14に記載の組成物。
【請求項25】
前記コラーゲン関連ペプチドが、前記基材の総表面積に基づいて、約0.1mg/cm〜約0.5mg/cmの量で前記組成物中に存在する、請求項14に記載の組成物。
【請求項26】
前記基材が、ε−カプロラクトン及びグリコリドのコポリマーから構成される発泡体である、請求項14に記載の組成物。
【請求項27】
止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
請求項14に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
【請求項28】
止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
請求項26に記載の組成物を、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
【請求項29】
ゲルであって、
a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
b)ゲル化剤と、
から構成され、前記コラーゲン関連ペプチドが、前記ゲルの総重量に基づいて、約0.1mg/mL〜約10mg/mLの量で前記ゲル中に存在する、ゲル。
【請求項30】
複数の前記コラーゲン関連ペプチドを更に含み、前記コラーゲン関連ペプチドが複数のコラーゲン関連ペプチド3量体の形で存在する、請求項29に記載の組成物。
【請求項31】
前記コラーゲン関連ペプチド3量体がホモ3量体である、請求項30に記載の組成物。
【請求項32】
前記コラーゲン関連ペプチド3量体がヘテロ3量体である、請求項30に記載の組成物。
【請求項33】
止血の促進を必要とする個体において止血を促進する方法であって、
請求項29に記載のゲルを、前記個体の出血部位に適用することから構成される、方法。
【請求項34】
組成物であって、
a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
b)少なくとも1種の賦形剤と、
から構成される、組成物。
【請求項35】
請求項1に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
【請求項36】
請求項14に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
【請求項37】
請求項29に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
【請求項38】
請求項34に記載の組成物から構成される医療用デバイス。
【請求項39】
出血性障害の治療を必要とする個体において出血性障害を治療する方法であって、
前記個体の所望の部位で血小板凝集を開始させるのに有効な量で、式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドを用いることを含む、方法。
【請求項40】
出血性障害の診断を必要とする個体において出血性障害を診断する方法であって、
(a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドを、前記個体からの血小板を含有する血液又は血漿と組み合わせて、混合物を形成することと、
(b)前記混合物中の血小板凝集を評価するために、前記混合物を血小板凝集計に添加することと、
を含む、方法。
【請求項41】
組成物であって、
(a)式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドと、
(b)製薬的活性物質と、
から構成される、組成物。
【請求項42】
前記製薬的活性物質が、止血剤、抗感染剤、鎮痛剤、抗炎症剤、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項41に記載の組成物。
【請求項43】
前記止血剤が、トロンビン、フィブリノーゲン、ADP、ATP、カルシウム、マグネシウム、TXA、セロトニン、エピネフリン、血小板因子4、第V因子、第EI因子、PAI−1、トロンボスポンジン及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項42に記載の組成物。
【請求項44】
前記抗感染剤が、抗体、抗原、抗生物質、抗ウイルス剤及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項42に記載の組成物。
【請求項45】
前記抗炎症剤が抗ヒスタミン剤である、請求項42に記載の組成物。
【請求項46】
組成物であって、
式(I)
B−(Z)m−X
(式中、
Zは、Gly−Pro−J、Pro−J−Gly及びJ−Gly−Proから成る群から選択され、
Jは、Hyp、fPro、mPro及びProから成る群から選択され、
mは8、9、10、11、12、13、14又は15から選択される整数であり、
B及びXは、F−Phe、Phe(所望により、フェニル上に、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヒドロキシ、メチル又はCFが1置換又は2置換された)、Tyr、3,4−(OH)−Phe、MeO−Tyr、フェニルグリシン、2−ナフチル−Ala、1−ナフチル−Ala、Trp、Cha、Chg、Met、Leu、Ile及びValから成る群から独立して選択される)
のコラーゲン関連ペプチドを追加した、化学的に定義された3次元ポリマーマトリックス、を含む、組成物。

【図1】
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【公表番号】特表2010−535225(P2010−535225A)
【公表日】平成22年11月18日(2010.11.18)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−520093(P2010−520093)
【出願日】平成20年7月25日(2008.7.25)
【国際出願番号】PCT/US2008/071136
【国際公開番号】WO2009/018126
【国際公開日】平成21年2月5日(2009.2.5)
【出願人】(591286579)エシコン・インコーポレイテッド (170)
【氏名又は名称原語表記】ETHICON, INCORPORATED
【Fターム(参考)】