コリネ型細菌による化学品の製造方法
【課題】
コリネ型細菌を用いた好気発酵下で発酵した発酵液を分離膜でろ過する際にろ過性を改善させることを課題とする。
【解決手段】
化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を培養し、得られた発酵培養液を分離膜で濾過処理し、濾液から生産物を回収する化学品の製造法であって、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することで、従来よりも発酵培養液のろ過性が改善され化学品の生産性が向上する。
コリネ型細菌を用いた好気発酵下で発酵した発酵液を分離膜でろ過する際にろ過性を改善させることを課題とする。
【解決手段】
化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を培養し、得られた発酵培養液を分離膜で濾過処理し、濾液から生産物を回収する化学品の製造法であって、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することで、従来よりも発酵培養液のろ過性が改善され化学品の生産性が向上する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を培養し、得られた発酵培養液を分離膜で濾過処理し、濾液から生産物を回収する化学品の製造法であって、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することを特徴とする化学品の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は従来からＬ−リジンまたはＬ−グルタミン酸またはＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の製造とカダベリンなどのポリアミンの製造、コハク酸などの有機酸製造などの化学品製造に良く用いられている（特許文献１〜５参照。）。コリネ型細菌を用いた化学品の製造方法である発酵法は、大きくバッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、連続発酵法とに分類される。
【０００３】
バッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。ただし、バッチ発酵法および流加発酵法において発酵終了後の発酵液から化学品を回収するためには、後続の精製プロセスに移すため発酵液中の菌体細胞を除去する必要があり、従来から発酵液から菌体細胞を除去する固液分離方法として遠心または分離膜によるろ過分離が必要になる。なお、遠心分離による発酵液の固液分離は時間を要し、固液分離に時間が長くなるほど発酵プロセスの稼働率は低下しうることと、外来からの雑菌汚染の可能性が高く得られる化学品の品質の変化が起こりうることから、近来は発酵プロセスの効率化と雑菌汚染防止につながる固液分離の時間を短縮できる分離膜によるろ過分離の検討が進められている。
【０００４】
一方、連続発酵、特に分離膜を用いた連続発酵は、目的化学品を含む発酵液の分離膜を用いた連続的にろ過することにより長時間にわたり安定して効率良く培養製造が可能であり、連続的な発酵により高生産性を維持することができるという利点がある（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−５１４４３９号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２１３８号公報
【特許文献３】特開２００８−２０００４６号公報
【特許文献４】特開２００４−２２２５６９号公報
【特許文献５】特開２００８−０６７６２９号公報
【特許文献６】特開２００８−１０４４５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は分離膜を用いた発酵法による化学品の製造方法において発酵液の固液分離の時間短縮及び化学品の生産性の向上させるためには、膜の目詰まり改善による発酵液のろ過性を向上させる必要があることを見出した。そこで本発明は、コリネ型細菌の発酵による化学品の製造方法において、簡便な方法でコリネ型細菌を用いた発酵液を分離膜でろ過する際にろ過性を改善させることにより、発酵液の固液分離の時間短縮及び生産性を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することで、本発明の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）で構成される。
【０００８】
（１）化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を細胞壁合成抑制剤を含む発酵培地で培養し、得られた発酵培養液を分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用いて濾過処理し、濾液から生産物を回収することを特徴とする、化学品の製造方法。
【０００９】
（２）細胞壁合成抑制剤が、ミコール酸合成抑制剤または細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤である、（１）に記載の化学品の製造方法。
【００１０】
（３）細胞壁合成抑制剤がイソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ）またはエタンブトールである、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
【００１１】
（４）発酵培地中の細胞壁合成抑制剤の含有量が０．１〜２０ｇ／Ｌであることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１２】
（５）コリネ型細菌の培養が、前記濾過処理の未濾過液を前記発酵培養液に保持または還流し、かつ、前記発酵原料を連続的に添加する連続発酵培養であることを特徴とする、請求項（１）〜（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１３】
（６）コリネ型細菌がコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属である、請求項（１）〜（５）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１４】
（７）化学品がアミノ酸またはポリアミンである、（１）〜（６）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１５】
（８）化学品がＬ−リジンまたはカダベリンである、（１）〜（７）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することによりコリネ型細菌の発酵の際、発酵液のろ過性を大きく改善させることができる。発酵液のろ過性の向上は、発酵液から細胞の固液分離の際、分離膜が詰りにくくなり発酵液の時間短縮またはろ過量の向上ができる。また、コリネ型細菌を用いた化学品の連続製造の際、分離膜が詰りにくくなることで長期運転による化学品の生産性を向上させるか連続発酵に用いる分離膜の面積を減らせることにより、発酵装置をコンパクトにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１と比較例１のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図２】図２は、実施例２と比較例２のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図３】図３は、実施例３と比較例３のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図４】図４は、実施例４と比較例４のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図５】図５は、実施例５と比較例５の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図６】図６は、実施例６と比較例６の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図７】図７は、実施例７と比較例７の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図８】図８は、実施例８と比較例８の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を培養して化学品を含む発酵培養液を得ることを特徴としている。
【００１９】
コリネ型細菌とは、１９５０年代にアミノ酸生産菌として分離されたグラム陽性に属する細菌である。本発明で使用されるコリネ型細菌としては、通常の好気的条件下で生育し、本発明の目的とする化学品を生産するものであれば特に限定されないが、具体例として、アグロコッカス（Ａｇｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、グロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラサイバクター（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ）属、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）属、ツリセラ（Ｔｕｒｉｃｅｌｌａ）属に属する細菌が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌、より好ましくはコリネバクテリウム属に属する細菌が挙げられる。また、コリネバクテリウム属に属する細菌の具体例としては、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６が挙げられる。
【００２０】
本発明では所望の化学品を効率的に製造できるよう、当業者にとって公知の手法である変異株スクリーニングや遺伝子組換えによって育種されたコリネ型細菌が好ましく用いられる。そのように育種されたコリネ型細菌が好ましく生産しうる化学品としては、アミノ酸または有機酸、核酸、ポリアミン、ビタミン、各種酵素などのタンパク質、ペプチド、糖、糖アルコール、アルコール、脂質などが挙げられるが、好ましくはアミノ酸またはポリアミンである。
【００２１】
コリネ型細菌が生産しうるアミノ酸の具体例としてはトリプトファン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスバラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシンであり、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸、ＤＬ−アミノ酸であっても良い。
【００２２】
アミノ酸はコリネ型細菌の発酵により生産される。これらのアミノ酸生産できるコリネ型細菌は、自然界よりスクリーニングで単離したコリネ型細菌、あるいは特定遺伝子を破壊させたり、または発現を増強または減少させたりなどの変異操作［例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）またはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）を用いる方法またはＵＶ照射による変異導入法あるいは試験管内変異法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，１９７８年，第１４５巻，ｐ．１０１）］によって該遺伝子に変異を誘起するまたは遺伝子組み換えによりアミノ酸合成能力を増強または導入する等によるコリネ型細菌などが挙げられる。
【００２３】
変異操作あるいは遺伝子組み換えによりコリネ型細菌のアミノ酸合成能力を増強または導入する例として、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）をコーディングする遺伝子に一つ以上の塩基を導入もしくは欠失させる突然変異法、ナンセンス突然変異の導入、または上記ポリペプチドの活性を低下する法などによるコリネバクテリウムを成長させる段階、培地または細胞中にＬ−アミノ酸を濃縮する段階、Ｌ−アミノ酸を分離する段階を含むＬ−アミノ酸を製造する方法（米国特許６８７２５５３号）、またＬ−アミノ酸の生産能を向上させる方法としてＬ−アミノ酸の細胞内への取り込み系の欠失またはその系の活性低下またはＬ−リジン、Ｌ−アルギニンの排出遺伝子（ＬｙｓＥ）などのＬ−アミノ酸の排出系の強化などが挙げられる（欧州特許出願公開１０３８９７０号、ＷＯ０１／００５９５９号、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９ Ｎｏｖ；１（２）：３２７−３６、ＷＯ９７／２３５９７号）。
【００２４】
Ｌ−リジン生産においては、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）活性を増大、マレート・キノン・オキシドレダクターゼ（ｍａｌａｔｅ ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を欠損するなどによりＬ−リジンの生産などが挙げられる（特表２００２−５０８９２１号、ＷＯ２００３／００４４９４３号）。また、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（ＡＥＣ）耐性を有する変異株などを用いる生産、その生産にＬ−ホモセリンなどのアミノ酸を一つ以上要求する株またはＡＥＣとアミノ酸一つ以上を要求する株を用いる生産などが挙げられる（特公昭５６−１９１４号、特公昭５６−１９１５号、特公昭５７−１４１５７号、特公昭５７−１４１５８号、特公昭５７−３０４７４号、特公昭５８−１００７５号、特公昭５９−４９９３号、特公昭６１−３５８４０号、特公昭６２−２４０７４号、特公昭６２−３６６７３号、特公平５−１１９５８号、特公平７−１１２４３７号、特公平７−１１２４３８号、特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号、米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号）。また、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すように変異を導入した株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示す変異株が挙げられる（特開昭５０−５３５８８号、特開昭５０−３１０９３号、特開昭５２−１０２４９８号、特開昭５３−９３９４号、特開昭５３−８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５５−９７５９号、特開昭５６−３２９９５号、特開昭５６−３９７７８号、特公昭５３−４３５９１号、特公昭５３−１８３３号）。また、イノシトールまたは酢酸、フルオロピルビン酸などのビタミンまたは有機酸の一つ以上の組み合わせの要求性を示す変異株、または３４℃以上の温度に対して温度感受性を示す変異株、エチレングリコール耐性株などが挙げられる（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５３−８６０９０号、米国特許第４４１１９９７号）。また、Ｌ−リジン生合成経路に関わる酵素の活性を増強させることによっても、Ｌ−リジン生産能が付与された微生物を得ることができる。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で増やすこと、発現調節配列を変えることによって、達成できる。さらに、Ｌ−リジン以外の物質を生成する反応を触媒する酵素の活性とＬ−リジン生産に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい（ＷＯ９５／２３８６４号、ＷＯ９６／１７９３０号、ＷＯ２００５／０１０１７５号）。
【００２５】
Ｌ−グルタミン生産においては、培地中にビオチンを含有する培養によるＬ−グルタミン生産するコリネ型細菌、プリンアナログ耐性および／又はメチオニンスルホキサイド耐性を有するＬ−グルタミン生産コリネ型細菌、Ｌ−グルタミン生産能を有し、グルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌、または細胞内のグルタミナーゼ活性が低下し、さらに細胞内のグルタミンシンテターゼ活性が増強するように改変されたコリネ型細菌などが挙げられる（特開昭６２−１８６７９６号、特開昭６１−２０２６９４号、特開２００２−３００８８７号、特開２００４−１８７６８４号）。さらに、Ｌ−グルタミン酸濃度を上昇させる方法としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損する方法（ＷＯ９５／３４６７２号）またはグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子を増強させる方法（特開２００２−３００８８７号）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｉｃｄＡ）、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（ａｃｎＡ， ａｃｎＢ）、及びクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）を増強するなどが掲示されている（特開昭６３−２１４１８９号）。その他に、ビオチン制限、または界面活性剤添加、またはペニシリン添加等によってＬ−グルタミン酸生成を誘導した状態で行われるか、界面活性剤温度感受性またはペニシリン感受性株などによりグルタミン酸生産が行われる（欧州特許出願公開１００２８６６号、特開平４−０８８９９４号）。
【００２６】
Ｌ−アラニン発酵においては、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の相同組換えを行うことによりアラニンの生産量を増大させた株、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ活性の欠損株、アスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ遺伝子を増幅させた株などが挙げられる（特開平６−２７７０８２号、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ Ｎｏｖ；５７（４）：５３４−４０、特開平７−１６３３８３号）。
【００２７】
Ｌ−トリプトファン生産においては、Ｌ−フェニルアラニンとＬ−チロシン要求性を持ち、４−メチル‐トリプトフアン、６−フルオロ‐トリプトフアン、４−アミノ−フェニルアラニン、４−フルオロ‐フェニルアラニン、チロシン‐ヒドロキサメート、フェニルアラニン−ヒドロキサメート耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１８５１でのトリプトファン生産が挙げられる（特公平７−５９１９９号）。またトリプトファンシンターゼ活性、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強の内１つ以上の活性が増強されたコリネ型細菌などが挙げられる（ＷＯ９４/０８０３１号または米国特許第４３７１６１４号）。更にトリプトファンオペロンを含む組み換えＤＮＡを導入することによってもＬ−トリプトファン生産能を付与またはトリプトファンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子を欠損させるか、またはそのリプレッサーの活性の低下を引き起こす変異の導入によるＬ−トリプトファン生産の付与することができる（特開昭５７−７１３９７号、特開昭６２−２４４３８２号、米国特許第４３７１６１４号、ＷＯ２００５／０５６７７６号）。また、マレートシンターゼ、イソシトレートリアーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロンが構成的に発現または同オペロンの発現が強化されことが挙げられる。サルフアグアニジンに耐性株、トリプトファンオペロンが導入された株、シキミ酸キナ−ゼをコ−ドする遺伝子を導入した株を用いることができる（特公平３−１４４３６号、特開昭６３−２４０７９４号、特開昭６１−７８３７８号）。
【００２８】
Ｌ−アルギニン生産においては、変異導入によりサルファ剤、２−チアゾールアラニン、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤耐性を有し、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有する株、またはケトマロン酸、フルオロマロン酸またはモノフルオロ酢酸に耐性を有する株、アルギニン耐性を有する株によるＬ−アルギニン生産などが挙げられる（特開昭５４−４４０９６号、特開昭５７−１８９８９号、特開昭６２−２４０７５号）。また、大腸菌由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセチルグルタモキナーゼ、及びアルギニノサクシナーゼの遺伝子を含むＤＮＡ断片をコリネ型細菌に導入することによりＬ−アルギニンの生合成酵素の増強など挙げられる（特公平５−２３７５０号）。更に、Ｌ−アルギニン生産するコリネ型細菌としては、ヒスチジンまたはトリプトファンなどのアナログに耐性を有するように変異を導入した株、アミノ酸またはその前駆体の一つ以上に要求性を有するように変異を導入した株、コハク酸要求性または核酸塩基アナログに耐性な変異株、アザピリミジン誘導体等に耐性を有するように変異を導入した株、アルギニンヒドロキサメート、または／及び２−チオウラシルに耐性を有するように変異を導入した株、アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株、また上記耐性能と要求性の一つ以上の組み合わせを持つ変異株へ育種したコリネ型細菌などが挙げられる（特開昭５２−１１４０９２号、特開昭５２−９９２８９号、特開昭５８−９６９２号、特開昭４９−１２６８１９号、特公昭５１−６７５４号、特開昭５２−８７２９号、特開昭５３−１４３２８８号、特開昭５３−３５８６号）。
【００２９】
Ｌ−スレオニン生産においては、スレオニンオペロンを組み換えることによるスレオニン生産方法（特公平第１−３８４７５号）またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の減衰後に改善された方法（特開第２００１−１９０２９６号）等が挙げられる。
【００３０】
Ｌ−ロイシン生産においては、２−チアゾールアラニンかつβ−ハイドロキシロイシン耐性、またはバリンアナログ耐性、またはバリン要求性、またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）耐性、またはフェニルアラニン、バリンおよびイソロイシン要求性を示すコリネ型細菌による生産が挙げられる（特開平８−２６６２９５号、特開昭６３−２４８３９２号、特公昭３８−４３９５号、特公昭５１−３７３４７号、特公昭５４−３６２３３号）。
【００３１】
Ｌ−イソロイシン生産においては、分枝アミノ酸の排出をコードするヌクレオチド配列を増幅、プロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与、代謝経路のホモセリンデヒドロゲナーゼ強化、薬剤耐性を示すコリネ型細菌による生産が挙げられる（特開２００１−１６９７８８号、特開昭６２−７４２９３号、特開昭６２−９１１９３号、特開昭６２−１９５２９３号、特開昭６１−１５６９５号、特開昭６１−１５６９６号）。
【００３２】
Ｌ−バリンの生産においては、Ｌ−バリン生合成経路に関わる酵素をコーディングする遺伝子の発現強化または変異導入などが挙げられる（ＷＯ００／５０６２４号、アミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年）。
【００３３】
Ｌ−フェニルアラニン生産としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下した株（特開平１−３１７３９５号）、チロシン要求性株（特開昭６３−１０５６８８号）等を使用することができる。
【００３４】
Ｌ−メチオニン生産においては、メチルキャップスルフィド化合物の存在かでメチオニンを生産する株、またはａｓｋｆｂｒ、ｈｏｍｆｂｒ、ｍｅｔＸ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＦ、およびｚｗｆから選択される少なくとも５つ以上の遺伝子のそれぞれに遺伝子改変を含む組換えであって、該遺伝子改変が該少なくとも５つ以上の遺伝子の過剰発現を引き起こした株などが挙げられる（特表２００９−５０１５４８号、特表２００９−５０１５５０号）。または異種ｍｅｔＩ遺伝子を発現するように組換えた株などが挙げられる（特表２００９−５０１５４７号）。
【００３５】
Ｌ−セリン生産においては、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有するＬ−セリン生産可能な株、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強された株、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を示し、かつＬ−セリン分解能を欠失しＬ−セリンを生産する株、グリシンをＬ−セリンに転化することができる微生物の改良された株を好気的条件下で培養することからなり、改良された株が（１）セリンデヒトラターゼ陰性および（２）アミノ酸類似体のセリンヒドロキサメート、グリシンヒドロキサメートおよびメチオニンヒドロキサメートの少なくとも１種に対する抵抗性がある株などが挙げられる（特開平１１−２６６８８１号、特開平１１−２５３１８７号、特開平１０−２４８５８８号、特開昭６０−１２０９９６号）。
【００３６】
Ｌ−システイン生産においては、セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換されたこと、又は細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列が改変されたこと等により、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌、好ましくはさらに、Ｌ−システイン分解系が抑制されたコリネ型細菌などが挙げられる（特開２００２−２３３３８４号）。
【００３７】
Ｌ−プロリン生産においては、ヒボキサンチンおよび、イノシトールの少なくとも一種を生育に必要とするまたはプリンアナログ、または、ピリミジンアナログに耐性を有するＬ一プロリン生産するコリネ型細菌などが挙げられる（特開昭５９−１２００９４号、特開昭５９−１０９１８８号）。
【００３８】
Ｌ−チロシン生産においては、フェニルアラニンを要求し、３−アミノチロシン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメートに耐性を有する変異株、ｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示す変異株、Ｌ−チロシン要求性が消去された組み換えコリネ型細菌などが挙げられる。 （Ｈ．Ｈａｇｉｎｏ， Ｋ． Ｎａｋａｙａｍａ；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７、２００１（１９７３）、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｓｕｃｈｉｄａ、Ｓｈｉｉｏ；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７、２３２７（１９７３）、特開昭６０−７００９３号）。
【００３９】
コリネ型細菌が生産しうるポリアミンの具体例としては、カダベリン、スペルミン、スペルミジンまたはプトレシンあるいはそれらの塩が挙げられるが、好ましくはカダベリンまたはその塩である。カダベリンは１，５−ペンタンジアミンともいう。また、カダベリン塩とは、塩基性のカダベリンを酸で中和する際に生じる塩であり、具体例としてカダベリン二塩酸塩、カダベリン硫酸塩、またはカダベリンジカルボン酸塩が挙げられる。カダベリンまたはその塩（以下、単にカダベリンと称する。）はポリマー原料として有用な化合物である。
【００４０】
ポリアミンはコリネ型細菌の発酵により生産される。これらのポリアミン生産できるコリネ型細菌は、自然界よりスクリーニングで単離したコリネ型細菌または特定遺伝子を破壊させたり、または発現を増強または減少させたりなどの変異操作［例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）またはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）を用いる方法またはＵＶ照射による変異導入法あるいは試験管内変異法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，１９７８年，第１４５巻，ｐ．１０１）］によって該遺伝子に変異を誘起するまたは遺伝子組み換えによりポリアミン合成能力を増強または導入する等によるコリネ型細菌などが上げられる。
【００４１】
変異操作あるいは遺伝子組み換えによりコリネ型細菌のポリアミン合成能力を増強または導入する例として、例えば、オルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物におけるプトレシンの生産、またＯＤＣ活性が増加し、増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成の存在によるプトレシンの生産が挙げられる（特表２００８−５０５６５２号、特表２００８−５０５６５１号）、またスペルミジンアセチルトランスフェラーゼ欠乏細胞におけるスペルミジンの生産、スペルミジン合成経路によるプトレシンの生産などが挙げられる。
【００４２】
なおカダベリンの場合、コリネ型細菌は本来Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有していないため、Ｌ−リジンからカダベリンを生産する菌株をコリネ型細菌の変異株スクリーニングにより得ることはできない。したがって、カダベリンを生産する能力を有するコリネ型細菌を得るためには、遺伝子組換えによりコリネ型細菌にＬ−リジン脱炭酸酵素活性を付与する必要がある。コリネ型細菌にＬ−リジン脱炭酸酵素活性を付与する方法としては特に限定はないが、例えば特開２００４−２２２５６９号に開示される方法が挙げられる。
【００４３】
また、コリネ型細菌の野生型株にはホモセリン栄養要求性はないが、ホモセリン栄養要求性の変異株（以下、ホモセリン栄養要求性株とも言う。）はカダベリンの前駆体となるＬ−リジンの生産性が高いため、本発明において好ましく用いられる。ホモセリン栄養要求性株を取得する方法としては、突然変異誘発法により野生型株に突然変異を誘発し、ホモセリン栄養要求性を指標に選抜する方法や、相同組換えによって野生型株の染色体中のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、ＨＯＭ遺伝子とも言う。）にその他の遺伝子を挿入する方法等によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損させる方法が挙げられるが、相同組換えによりＨＯＭ遺伝子を欠損させる方法が好ましく、特開２００４−２２２５６９号に開示されるようにＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（以下、ＬＤＣ遺伝子とも言う。）によりＨＯＭ遺伝子を欠損させることでコリネ型細菌にＬ−リジン脱炭酸酵素活性とホモセリン栄養要求性を同時に付与できるためより好ましい。
【００４４】
また、コリネ型細菌の野生型株はカダベリンの前駆体であるＬ−リジン、あるいはＬ−リジンとＬ−スレオニンによるフィードバック阻害がかかる、フィードバック阻害の解除された菌株を取得する方法としては、特開２００４−２２２５６９号に開示される方法が挙げられる。例えば、野生型株に、変異操作［例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法；微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社］を施した後、ＡＥＣ耐性を指標に選択され、Ｌ−リジン生産性となった変異株から取得する方法をあげることができる。好適な変異株としては、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型株ＡＴＣＣ１３０３２より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産菌、あるいは野生型ＡＫ遺伝子を取得した後、上記ＮＴＧ法あるいは試験管内変異法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，１９７８年，第１４５巻，ｐ．１０１）によって該遺伝子に変異を誘起し、ＡＥＣ耐性を有し、かつＬ−リジン生産性を指標に脱感作した脱感作型ＡＫ遺伝子を含む株等をあげることができる。野生型株にＡＥＣ耐性を付与する更に好ましい方法として、特開２００４−２２２５６９号に開示されるように遺伝子工学的手法を用いる方法である。遺伝子工学的手法を用いる方法に特に制限はなく、例えばコリネ型細菌で複製可能な組み換え体ＤＮＡを用いる方法、または相同組換えによって染色体中の目的遺伝子を組み換える方法である。配列番号１５記載のアミノ酸配列において３１１番目のアミノ酸残基がＴｈｒ以外のアミノ酸に置換された変異アスパルトキナーゼ遺伝子を有することによりＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を獲得することができる。更に好ましい遺伝子工学的手法は、コリネ型細菌の染色体にあるＡＫ遺伝子を脱感作型ＡＫ遺伝子に相同組み換えにより組み換える方法である。さらに、脱感作型ＡＫ遺伝子は、ＡＫ遺伝子に望みの変異導入する技法（例えば、ストラタジーン社ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅサイトダイレクテッド・ミュータジェネシス・キットを用いる方法）で取得することが好ましい。
【００４５】
前記コリネ型細菌の発酵原料は、発酵培養するコリネ型細菌の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよい。発酵原料としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地等が好ましく用いられる。
【００４６】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、果糖、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉、ジャガイモ、コムギ、トウモロコシ、サツマイモ、コメ、キャッサバ、タピオカ、クズ、カタクリ、緑豆、サゴヤシ、ワラビなどからの澱粉加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、甜菜、ケーンジュース、甜菜糖蜜またはケーンジュースからの抽出物もしくは濃縮液、甜菜糖蜜またはケーンジュースの濾過液、シラップ（ハイテストモラセス）、甜菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖または粗糖、菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された精製糖、更には酢酸やフマル酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなどが使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００４７】
本発明で使用される発酵原料における炭素源の使用濃度は特に制限されず、化学品の製造を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、炭素源の濃度は、発酵培地中に１（ｗ／ｖ）％以上５０（ｗ／ｖ）％以下が好ましく、より好ましくは３（ｗ／ｖ）％以上３０（ｗ／ｖ）％以下である。前記炭素源は、水により濃縮または希釈して使用できる。
【００４８】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００４９】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【００５０】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ビタミンＢ６等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、ポリペプトンＳ、コーンスティープリカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
【００５１】
本発明で使用される微生物や培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて添加使用することができる。
【００５２】
本発明において発酵培養液とは、発酵原料にコリネ型細菌が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更することができる。
【００５３】
コリネ型細菌の培養条件にも特に制限はなく、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。化学品生産性評価に用いる培養形態にも特に制限はなく、試験管培養、フラスコ培養、バッチ培養、流加発酵、連続培養などで行う。培養温度は２５〜４２℃、好ましくは２８〜３８℃である。培養時間に特に制限はなく、通常のバッチ培養は１日から９日間である。
【００５４】
コリネ型細菌培養時の培養ｐＨ調整にはアンモニア、炭酸カルシウム、水酸化カルシウムなどの二価イオンの水酸化物、塩酸、硫酸またはジカルボン酸などを使用することができ、これら中和剤を用いて培養ｐＨを好ましくはｐＨ５．０〜８．０に、より好ましくはｐＨ５．５〜７．５に制御すればよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用されうるが、好ましくは水溶液またはスラリ状である。
【００５５】
本発明の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を好適には２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要があれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【００５６】
また本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌の発酵培養液を分離膜により濾過処理することを特徴としている。
【００５７】
本発明において用いられる分離膜は、発酵に使用されるコリネ型細菌による目詰まりが起こりにくく、そして、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を長時間保持することにより、高い精度と再現性で濾過性能が安定に継続する性能を有する必要がある。そのため、本発明ではそのような性質を持つ分離膜として、平均細孔径の下限が０.０１μｍ以上、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは０．０２μ以上、さらに好ましくは０．０４μｍ以上で、上限が１μｍ未満、好ましくは０．４μｍ以下、より好ましくは０．２μｍ以下の多孔性膜が使用される。
【００５８】
なお、多孔性膜の平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００５９】
また、多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができ、発酵運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が好ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００６０】
【数１】
【００６１】
また、本発明で用いられる多孔性膜では、発酵培養液の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができるが、本発明においては、多孔性膜の純水透過係数は、２５℃の温度の逆浸透膜による精製水を用いてヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したときの多孔性膜の純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、また、純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００６２】
また、多孔性膜の膜表面粗さは、多孔性膜の目詰まりに影響を与える因子であり、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることで目詰まりを抑えることで、安定した連続発酵が可能になる。また、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることで、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。具体的には、膜表面粗さが０.１μｍ以下であれば、多孔性膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で濾過が実施可能である。
【００６３】
ここで、膜表面粗さは、膜表面に対して垂直方向の高さの平均値であり、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定することができる。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件 探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲 １０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００６４】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００６５】
【数２】
【００６６】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。多孔性膜は被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００６７】
多孔質基材の素材は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００６８】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の素材としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられ、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。
【００６９】
中でも、有機高分子膜の膜素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００７０】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、フッ化ビニリデンの単独重合体の他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三フッ化塩化エチレンなどが例示される。
【００７１】
また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。
【００７２】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００７３】
本発明で用いられる分離膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが好ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００７４】
また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００７５】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。多孔性膜を有する分離膜エレメントの形態は特に限定されないが、支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００７６】
本発明で用いられる多孔性膜は、特開２００８−１３１９３１号に記載の多孔性膜の作成方法により作成することができる。
【００７７】
本発明において、コリネ型細菌を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、微生物および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが好ましく、より好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａの範囲である。上記膜間差圧の範囲を外れた場合、微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、濾過運転に不具合を生じることがある。
【００７８】
濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができるから、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がなく、化学品を生産する能力が低下しない。また、発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、膜分離槽と発酵反応槽間で発酵培養液を循環させる動力手段が不要となり、多孔性膜を発酵反応槽内に設置することも可能となる。
【００７９】
また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００８０】
なお本発明では、前記濾過処理の未濾過液を発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を連続的に発酵培養液に添加することによって、コリネ型細菌を連続発酵培養することができる。分離膜を用いたコリネ型細菌の連続発酵培養は、バッチ発酵培養よりも細胞の高密度化が可能であるため生産速度を向上させることができ、また、向上された生産速度を長時間にわたり維持することができるため、本発明の好ましい態様である。
【００８１】
連続発酵を実施する場合、ＷＯ２００７／０９７２６０号に開示される連続発酵法が好ましく採用される。培養初期にバッチ培養または流加培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から発酵原料の供給、濾過および微生物もしくは培養細胞の発酵培養液からの抜き出しを行うことが可能である。発酵原料供給、濾過および微生物もしくは培養細胞の発酵培養液からの抜き出しの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料の供給、濾過および微生物もしくは培養細胞の発酵培養液からの抜き出しは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。
【００８２】
さらに本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を細胞壁合成抑制剤を含む発酵培地中で培養して、化学品を含む発酵培養液を得ることを特徴としている。ここでいう細胞壁合成抑制剤とは、コリネ型細菌がコリネ型細菌の細胞壁の構成成分として知られているミコール酸を合成することを抑制または阻害する、あるいは細胞壁へのミコール酸付着抑制するなどによりコリネ型細菌の細胞壁の合成を阻害する薬剤であり、本発明者は細胞壁合成抑制剤を発酵培地中に添加しながら培養することで、得られる発酵培養液のろ過分離性能が著しく向上することを見出した。
【００８３】
発酵培地に添加する細胞壁合成抑制剤は、特に限定されないが、イソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ、イソニアジドとも呼ばれる）などのミコール酸合成抑制剤、エタンブトールなどの細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤、ピラジンアミド、リファンピシン、エチオナミド、セルレニン、シクロセリンまたはペニシリンなどの細胞壁合成抑制抗生物質、Ｔｗｅｅｎ４０あるいはＴｗｅｅｎ６０が具体例としてあげられ、好ましくはミコール酸合成抑制剤または細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤であり、より好ましくはＩＮＨまたはエタンブトールである。
【００８４】
ＩＮＨ等のミコール酸合成抑制剤は結核症治療薬として知られており、コリネ型細菌であるグラム陽性バクテリアの細胞壁構成成分であるミコール酸合成を阻害するために使用されたり、コリネ型細菌の形質変換効率の向上に使用されたりする（特開２００７−５０８８４０号、Ｊ．ＢＩＯＳＣＩ．ＢＩＯＥＮＧ．９２（３）、２０１−２１３、２００１）。
【００８５】
エタンブトールなどの細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤についても結核治療薬として知られており、細胞壁のアラビノガラクタンの構成要素であるアラビナンの生合成に関連し、アラビナンの合成を抑制することでミコール酸の蓄積を低下させることによってミコール酸が細胞壁のアラビノガラクタンに付着するのを抑制する（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４３７、 ３２５―３３２、１９９９）。
【００８６】
発酵培地への細胞壁合成抑制剤の添加は、コリネ型細菌の発酵培養による化学品の製造を阻害しない範囲においては特に限定されないが、発酵培地中における細胞壁合成抑制剤濃度が０．１〜２０ｇ／Ｌになるように添加されることが好ましい。
【００８７】
細胞壁合成抑制剤としてＩＮＨなどのミコール酸合成抑制剤を使用する場合、発酵培地中のミコール酸合成抑制剤の添加濃度としては、微生物の良好な生育と化学品の生産、トータルコストの観点から、０．１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．３ｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．５ｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。
【００８８】
細胞壁合成抑制剤としてエタンブトールなどの細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤を使用する場合、発酵培地中の細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤の添加濃度としては、微生物の良好な生育と化学品の生産、トータルコストの観点から、０．１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．２ｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．３ｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。
【実施例】
【００８９】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００９０】
［Ｌ−リジンおよびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
・使用カラム ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
・移動相 ０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
・検出 ＵＶ３６０ｎｍ
・サンプル前処理 分析サンプル２５μｌに内標として１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を４００μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００９１】
［グルコース濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
・使用カラム Ｌｕｎａ ＮＨ２ ２５０×４．６ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
・移動相 ミリＱ水：アセトニトリル＝２５：７５
・検出 ＲＩ（示差屈折率）
・サンプル前処理 採集したサンプルを０．２μｍのフィルターによりろ過処理した後１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００９２】
［参考例１］Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
特開２００４−２２２５６９号の実施例２に開示される方法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株に脱感作型ＡＫ遺伝子を染色体上で発現可能ように導入し、ＴＲ−ＡＫ株を作製した。ＴＲ−ＡＫ株のＡＥＣ耐性は特開２００４−２２２５６９号公報の実施例２に開示されるＡＥＣ耐性確認方法によりＡＥＣ耐性を確認した。
【００９３】
［参考例２］Ｌ−リジン脱炭酸活性を有し、かつホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損し、かつＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
特開２００４−２２２５６９号の実施例１および実施例２に開示される方法によりＴＲ−ＣＡＤ２株を作製した。
【００９４】
［実施例１、比較例１］ＴＲ−ＡＫ株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＡＫ株（実施例１、比較例１）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。実施例１は表１の発酵培地に１ｇ／ＬのＩＮＨを添加（以下、ＭＩ１とする）し、比較例１は表１の発酵培地にＩＮＨ添加しなかった。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例１でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。比較例１でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例１と比較例１の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図１は実施例１と比較例１の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図１から、本発明の化学品の製造方法により、ＩＮＨ添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるために濾過時間の短縮あるいはろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【００９５】
【表１】
【００９６】
【表２】
【００９７】
［実施例２、比較例２］ＴＲ−ＡＫ株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＡＫ株（実施例２、比較例２）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。実施例２は表１の発酵培地に５ｇ／ＬのＩＮＨを添加（以下、ＭＩ５とする）し、比較例２は表１の発酵培地にＩＮＨ添加しなく抑泡のため消泡剤ＰＥ−Ｌを０．０５％添加した。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例２でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。比較例２でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例２と比較例２の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図２は実施例２と比較例２の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図２から、本発明の化学品の製造方法により、ＩＮＨ添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるためにろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【００９８】
［実施例３、比較例３］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＣＡＤ２株（実施例３、比較例３）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌ（実施例３は表１の発酵培地に１０ｇ／ＬのＩＮＨを添加（以下、ＭＩ１０とする）、比較例３はＩＮＨ添加なし）に前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例３でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。比較例３でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例３と比較例３の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図３は実施例３と比較例３の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図３から、本発明の化学品の製造方法により、ＩＮＨ添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるためにろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【００９９】
［実施例４、比較例４］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＣＡＤ２株（実施例４、比較例４）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌ（実施例４は表１の発酵培地に５ｇ／Ｌのエタムブトールを添加（以下、ＥＴ５とする）、比較例４はエタムブトール添加なし）に前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例４でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。比較例４でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例４と比較例４の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図４は実施例４と比較例４の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図４から、本発明の化学品の製造方法により、エタムブトール添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるためにろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【０１００】
［実施例５、比較例５］ＴＲ−ＡＫ株を用いた化学品の連続生産
ＷＯ２００７／０９７２６０号の図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−リジンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。発酵培地（実施例５にはＭＩ５培地、比較例４には表１に示す培地）を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメントとしてはＷＯ２００７／０９７２６０に掲示の図３に示される形態を採用し、分離膜には、ＷＯ２００７／０９７２６０の参考例２に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜、分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。この多孔性膜の特性を調べたところ、平均細孔径が０.１μｍであり、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａであった。この実施例５と比較例５における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【０１０１】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．５ｖｖｍ
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・ｐＨ調整：塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）によりｐＨを７．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１０２】
ＴＲ−ＡＫ株（実施例５、比較例５）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々々培養を行った。この前々々培養液を前々々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前々培養を行った。前々培養液を、ＷＯ２００７／０９７２６０号の図１に示す連続発酵装置の滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、１Ｌの発酵培地（実施例５にはＭＩ５倍地、比較例５には表１に示す培地）に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ＭＩ５培地（実施例５）または表１に示す培地（比較例５）の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、３０℃での連続発酵によるＬ−リジンの製造を行った。このとき、気体供給装置から滅菌した空気を発酵反応槽１内に供給した。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１０３】
その結果、比較例５の２２０時間の連続発酵に対し、実施例５では３４０時間の連続発酵となり（図５）、発酵培地にＩＮＨ添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、Ｌ−リジンの生産性が向上した（表３）。
【０１０４】
［実施例６、比較例６］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の連続生産
ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、カダベリンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。発酵培地（実施例６にはＭＩ１培地、比較例６には表１に示す培地）を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜と分離膜エレメントとしては実施例５と比較例５のものを使用した。この実施例６と比較例６における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【０１０５】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．５ｖｖｍ
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・ｐＨ調整：塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）によりｐＨを７．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１０６】
まずＴＲ−ＣＡＤ２株（ 実施例６、比較例６ ）を滅菌Ｌ Ｂ 培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々々培養を行った。この前々々培養液を前々々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前々培養を行った。前々培養液を、ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す連続発酵装置の滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、１Ｌの発酵培地（実施例６にはＭＩ１倍地、比較例６には表１に示す培地）に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ＭＩ１培地（実施例６）または表１に示す培地（比較例６）の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、３０℃での連続発酵によるカダベリンの製造を行った。このとき、気体供給装置から滅菌した空気を発酵反応槽１内に供給した。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１０７】
その結果、比較例６の２００時間の連続発酵に対し、実施例６では３２０時間の連続発酵となり（図６）、発酵培地にＩＮＨ添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、カダベリンの生産性が向上した（表３）。
【０１０８】
［実施例７、比較例７］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の連続生産
実施例５で使用した多孔性膜の代わりに、分離膜としてＷＯ２００７／０９７２６０の参考例１３に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする中空糸膜を用いた。分離膜エレメントとしてはＷＯ２００７／０９７２６０号の図４に示される形態を採用した。また実施例７のためのＭＩ５培地を用いた他は、実施例６と同様にして、連続発酵試験を行った。その結果、比較例７の２１０時間の連続発酵に対し、実施例７では３３０時間の連続発酵となり（図７）、発酵培地にＩＮＨを添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、カダベリンの生産性が向上した（表３）。
【０１０９】
［実施例８、比較例８］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の連続生産
実施例５で使用した多孔性膜の代わりに、分離膜としてＷＯ２００７／０９７２６０の参考例１３に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする中空糸膜を用いた。分離膜エレメントとしてはＷＯ２００７／０９７２６０の図４に示される形態を採用した。また実施例８のためのＥＴ５培地を用いた他は、実施例５と同様にして、連続発酵試験を行った。その結果、比較例８の２２０時間の連続発酵に対し、実施例７では３４０時間の連続発酵となり（図８）、発酵培地にエタムブトールを添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、カダベリンの生産性が向上した（表３）。
【０１１０】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を培養し、得られた発酵培養液を分離膜で濾過処理し、濾液から生産物を回収する化学品の製造法であって、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することを特徴とする化学品の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は従来からＬ−リジンまたはＬ−グルタミン酸またはＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の製造とカダベリンなどのポリアミンの製造、コハク酸などの有機酸製造などの化学品製造に良く用いられている（特許文献１〜５参照。）。コリネ型細菌を用いた化学品の製造方法である発酵法は、大きくバッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、連続発酵法とに分類される。
【０００３】
バッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。ただし、バッチ発酵法および流加発酵法において発酵終了後の発酵液から化学品を回収するためには、後続の精製プロセスに移すため発酵液中の菌体細胞を除去する必要があり、従来から発酵液から菌体細胞を除去する固液分離方法として遠心または分離膜によるろ過分離が必要になる。なお、遠心分離による発酵液の固液分離は時間を要し、固液分離に時間が長くなるほど発酵プロセスの稼働率は低下しうることと、外来からの雑菌汚染の可能性が高く得られる化学品の品質の変化が起こりうることから、近来は発酵プロセスの効率化と雑菌汚染防止につながる固液分離の時間を短縮できる分離膜によるろ過分離の検討が進められている。
【０００４】
一方、連続発酵、特に分離膜を用いた連続発酵は、目的化学品を含む発酵液の分離膜を用いた連続的にろ過することにより長時間にわたり安定して効率良く培養製造が可能であり、連続的な発酵により高生産性を維持することができるという利点がある（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−５１４４３９号公報
【特許文献２】特開２００８−２１２１３８号公報
【特許文献３】特開２００８−２０００４６号公報
【特許文献４】特開２００４−２２２５６９号公報
【特許文献５】特開２００８−０６７６２９号公報
【特許文献６】特開２００８−１０４４５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は分離膜を用いた発酵法による化学品の製造方法において発酵液の固液分離の時間短縮及び化学品の生産性の向上させるためには、膜の目詰まり改善による発酵液のろ過性を向上させる必要があることを見出した。そこで本発明は、コリネ型細菌の発酵による化学品の製造方法において、簡便な方法でコリネ型細菌を用いた発酵液を分離膜でろ過する際にろ過性を改善させることにより、発酵液の固液分離の時間短縮及び生産性を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することで、本発明の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）で構成される。
【０００８】
（１）化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を細胞壁合成抑制剤を含む発酵培地で培養し、得られた発酵培養液を分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用いて濾過処理し、濾液から生産物を回収することを特徴とする、化学品の製造方法。
【０００９】
（２）細胞壁合成抑制剤が、ミコール酸合成抑制剤または細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤である、（１）に記載の化学品の製造方法。
【００１０】
（３）細胞壁合成抑制剤がイソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ）またはエタンブトールである、（１）または（２）に記載の化学品の製造方法。
【００１１】
（４）発酵培地中の細胞壁合成抑制剤の含有量が０．１〜２０ｇ／Ｌであることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１２】
（５）コリネ型細菌の培養が、前記濾過処理の未濾過液を前記発酵培養液に保持または還流し、かつ、前記発酵原料を連続的に添加する連続発酵培養であることを特徴とする、請求項（１）〜（４）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１３】
（６）コリネ型細菌がコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属である、請求項（１）〜（５）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１４】
（７）化学品がアミノ酸またはポリアミンである、（１）〜（６）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【００１５】
（８）化学品がＬ−リジンまたはカダベリンである、（１）〜（７）のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、発酵培地に細胞壁合成抑制剤を添加することによりコリネ型細菌の発酵の際、発酵液のろ過性を大きく改善させることができる。発酵液のろ過性の向上は、発酵液から細胞の固液分離の際、分離膜が詰りにくくなり発酵液の時間短縮またはろ過量の向上ができる。また、コリネ型細菌を用いた化学品の連続製造の際、分離膜が詰りにくくなることで長期運転による化学品の生産性を向上させるか連続発酵に用いる分離膜の面積を減らせることにより、発酵装置をコンパクトにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１と比較例１のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図２】図２は、実施例２と比較例２のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図３】図３は、実施例３と比較例３のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図４】図４は、実施例４と比較例４のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図５】図５は、実施例５と比較例５の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図６】図６は、実施例６と比較例６の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図７】図７は、実施例７と比較例７の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【図８】図８は、実施例８と比較例８の培養時間と膜間差圧を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を培養して化学品を含む発酵培養液を得ることを特徴としている。
【００１９】
コリネ型細菌とは、１９５０年代にアミノ酸生産菌として分離されたグラム陽性に属する細菌である。本発明で使用されるコリネ型細菌としては、通常の好気的条件下で生育し、本発明の目的とする化学品を生産するものであれば特に限定されないが、具体例として、アグロコッカス（Ａｇｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、グロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラサイバクター（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ）属、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）属、ツリセラ（Ｔｕｒｉｃｅｌｌａ）属に属する細菌が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌、より好ましくはコリネバクテリウム属に属する細菌が挙げられる。また、コリネバクテリウム属に属する細菌の具体例としては、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６が挙げられる。
【００２０】
本発明では所望の化学品を効率的に製造できるよう、当業者にとって公知の手法である変異株スクリーニングや遺伝子組換えによって育種されたコリネ型細菌が好ましく用いられる。そのように育種されたコリネ型細菌が好ましく生産しうる化学品としては、アミノ酸または有機酸、核酸、ポリアミン、ビタミン、各種酵素などのタンパク質、ペプチド、糖、糖アルコール、アルコール、脂質などが挙げられるが、好ましくはアミノ酸またはポリアミンである。
【００２１】
コリネ型細菌が生産しうるアミノ酸の具体例としてはトリプトファン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスバラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシンであり、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸、ＤＬ−アミノ酸であっても良い。
【００２２】
アミノ酸はコリネ型細菌の発酵により生産される。これらのアミノ酸生産できるコリネ型細菌は、自然界よりスクリーニングで単離したコリネ型細菌、あるいは特定遺伝子を破壊させたり、または発現を増強または減少させたりなどの変異操作［例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）またはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）を用いる方法またはＵＶ照射による変異導入法あるいは試験管内変異法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，１９７８年，第１４５巻，ｐ．１０１）］によって該遺伝子に変異を誘起するまたは遺伝子組み換えによりアミノ酸合成能力を増強または導入する等によるコリネ型細菌などが挙げられる。
【００２３】
変異操作あるいは遺伝子組み換えによりコリネ型細菌のアミノ酸合成能力を増強または導入する例として、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）をコーディングする遺伝子に一つ以上の塩基を導入もしくは欠失させる突然変異法、ナンセンス突然変異の導入、または上記ポリペプチドの活性を低下する法などによるコリネバクテリウムを成長させる段階、培地または細胞中にＬ−アミノ酸を濃縮する段階、Ｌ−アミノ酸を分離する段階を含むＬ−アミノ酸を製造する方法（米国特許６８７２５５３号）、またＬ−アミノ酸の生産能を向上させる方法としてＬ−アミノ酸の細胞内への取り込み系の欠失またはその系の活性低下またはＬ−リジン、Ｌ−アルギニンの排出遺伝子（ＬｙｓＥ）などのＬ−アミノ酸の排出系の強化などが挙げられる（欧州特許出願公開１０３８９７０号、ＷＯ０１／００５９５９号、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９ Ｎｏｖ；１（２）：３２７−３６、ＷＯ９７／２３５９７号）。
【００２４】
Ｌ−リジン生産においては、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）活性を増大、マレート・キノン・オキシドレダクターゼ（ｍａｌａｔｅ ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を欠損するなどによりＬ−リジンの生産などが挙げられる（特表２００２−５０８９２１号、ＷＯ２００３／００４４９４３号）。また、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（ＡＥＣ）耐性を有する変異株などを用いる生産、その生産にＬ−ホモセリンなどのアミノ酸を一つ以上要求する株またはＡＥＣとアミノ酸一つ以上を要求する株を用いる生産などが挙げられる（特公昭５６−１９１４号、特公昭５６−１９１５号、特公昭５７−１４１５７号、特公昭５７−１４１５８号、特公昭５７−３０４７４号、特公昭５８−１００７５号、特公昭５９−４９９３号、特公昭６１−３５８４０号、特公昭６２−２４０７４号、特公昭６２−３６６７３号、特公平５−１１９５８号、特公平７−１１２４３７号、特公平７−１１２４３８号、特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号、米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号）。また、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すように変異を導入した株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示す変異株が挙げられる（特開昭５０−５３５８８号、特開昭５０−３１０９３号、特開昭５２−１０２４９８号、特開昭５３−９３９４号、特開昭５３−８６０８９号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５５−９７５９号、特開昭５６−３２９９５号、特開昭５６−３９７７８号、特公昭５３−４３５９１号、特公昭５３−１８３３号）。また、イノシトールまたは酢酸、フルオロピルビン酸などのビタミンまたは有機酸の一つ以上の組み合わせの要求性を示す変異株、または３４℃以上の温度に対して温度感受性を示す変異株、エチレングリコール耐性株などが挙げられる（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号、特開昭５５−９７８３号、特開昭５３−８６０９０号、米国特許第４４１１９９７号）。また、Ｌ−リジン生合成経路に関わる酵素の活性を増強させることによっても、Ｌ−リジン生産能が付与された微生物を得ることができる。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で増やすこと、発現調節配列を変えることによって、達成できる。さらに、Ｌ−リジン以外の物質を生成する反応を触媒する酵素の活性とＬ−リジン生産に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい（ＷＯ９５／２３８６４号、ＷＯ９６／１７９３０号、ＷＯ２００５／０１０１７５号）。
【００２５】
Ｌ−グルタミン生産においては、培地中にビオチンを含有する培養によるＬ−グルタミン生産するコリネ型細菌、プリンアナログ耐性および／又はメチオニンスルホキサイド耐性を有するＬ−グルタミン生産コリネ型細菌、Ｌ−グルタミン生産能を有し、グルタミンシンテターゼ活性が増強されたコリネ型細菌、または細胞内のグルタミナーゼ活性が低下し、さらに細胞内のグルタミンシンテターゼ活性が増強するように改変されたコリネ型細菌などが挙げられる（特開昭６２−１８６７９６号、特開昭６１−２０２６９４号、特開２００２−３００８８７号、特開２００４−１８７６８４号）。さらに、Ｌ−グルタミン酸濃度を上昇させる方法としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠損する方法（ＷＯ９５／３４６７２号）またはグルタミンシンテターゼをコードする遺伝子を増強させる方法（特開２００２−３００８８７号）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｉｃｄＡ）、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（ａｃｎＡ， ａｃｎＢ）、及びクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）を増強するなどが掲示されている（特開昭６３−２１４１８９号）。その他に、ビオチン制限、または界面活性剤添加、またはペニシリン添加等によってＬ−グルタミン酸生成を誘導した状態で行われるか、界面活性剤温度感受性またはペニシリン感受性株などによりグルタミン酸生産が行われる（欧州特許出願公開１００２８６６号、特開平４−０８８９９４号）。
【００２６】
Ｌ−アラニン発酵においては、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の相同組換えを行うことによりアラニンの生産量を増大させた株、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ活性の欠損株、アスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ遺伝子を増幅させた株などが挙げられる（特開平６−２７７０８２号、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ Ｎｏｖ；５７（４）：５３４−４０、特開平７−１６３３８３号）。
【００２７】
Ｌ−トリプトファン生産においては、Ｌ−フェニルアラニンとＬ−チロシン要求性を持ち、４−メチル‐トリプトフアン、６−フルオロ‐トリプトフアン、４−アミノ−フェニルアラニン、４−フルオロ‐フェニルアラニン、チロシン‐ヒドロキサメート、フェニルアラニン−ヒドロキサメート耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１８５１でのトリプトファン生産が挙げられる（特公平７−５９１９９号）。またトリプトファンシンターゼ活性、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性の増強の内１つ以上の活性が増強されたコリネ型細菌などが挙げられる（ＷＯ９４/０８０３１号または米国特許第４３７１６１４号）。更にトリプトファンオペロンを含む組み換えＤＮＡを導入することによってもＬ−トリプトファン生産能を付与またはトリプトファンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子を欠損させるか、またはそのリプレッサーの活性の低下を引き起こす変異の導入によるＬ−トリプトファン生産の付与することができる（特開昭５７−７１３９７号、特開昭６２−２４４３８２号、米国特許第４３７１６１４号、ＷＯ２００５／０５６７７６号）。また、マレートシンターゼ、イソシトレートリアーゼ、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロンが構成的に発現または同オペロンの発現が強化されことが挙げられる。サルフアグアニジンに耐性株、トリプトファンオペロンが導入された株、シキミ酸キナ−ゼをコ−ドする遺伝子を導入した株を用いることができる（特公平３−１４４３６号、特開昭６３−２４０７９４号、特開昭６１−７８３７８号）。
【００２８】
Ｌ−アルギニン生産においては、変異導入によりサルファ剤、２−チアゾールアラニン、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤耐性を有し、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有する株、またはケトマロン酸、フルオロマロン酸またはモノフルオロ酢酸に耐性を有する株、アルギニン耐性を有する株によるＬ−アルギニン生産などが挙げられる（特開昭５４−４４０９６号、特開昭５７−１８９８９号、特開昭６２−２４０７５号）。また、大腸菌由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルタミン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセチルグルタモキナーゼ、及びアルギニノサクシナーゼの遺伝子を含むＤＮＡ断片をコリネ型細菌に導入することによりＬ−アルギニンの生合成酵素の増強など挙げられる（特公平５−２３７５０号）。更に、Ｌ−アルギニン生産するコリネ型細菌としては、ヒスチジンまたはトリプトファンなどのアナログに耐性を有するように変異を導入した株、アミノ酸またはその前駆体の一つ以上に要求性を有するように変異を導入した株、コハク酸要求性または核酸塩基アナログに耐性な変異株、アザピリミジン誘導体等に耐性を有するように変異を導入した株、アルギニンヒドロキサメート、または／及び２−チオウラシルに耐性を有するように変異を導入した株、アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株、また上記耐性能と要求性の一つ以上の組み合わせを持つ変異株へ育種したコリネ型細菌などが挙げられる（特開昭５２−１１４０９２号、特開昭５２−９９２８９号、特開昭５８−９６９２号、特開昭４９−１２６８１９号、特公昭５１−６７５４号、特開昭５２−８７２９号、特開昭５３−１４３２８８号、特開昭５３−３５８６号）。
【００２９】
Ｌ−スレオニン生産においては、スレオニンオペロンを組み換えることによるスレオニン生産方法（特公平第１−３８４７５号）またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の減衰後に改善された方法（特開第２００１−１９０２９６号）等が挙げられる。
【００３０】
Ｌ−ロイシン生産においては、２−チアゾールアラニンかつβ−ハイドロキシロイシン耐性、またはバリンアナログ耐性、またはバリン要求性、またはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）耐性、またはフェニルアラニン、バリンおよびイソロイシン要求性を示すコリネ型細菌による生産が挙げられる（特開平８−２６６２９５号、特開昭６３−２４８３９２号、特公昭３８−４３９５号、特公昭５１−３７３４７号、特公昭５４−３６２３３号）。
【００３１】
Ｌ−イソロイシン生産においては、分枝アミノ酸の排出をコードするヌクレオチド配列を増幅、プロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与、代謝経路のホモセリンデヒドロゲナーゼ強化、薬剤耐性を示すコリネ型細菌による生産が挙げられる（特開２００１−１６９７８８号、特開昭６２−７４２９３号、特開昭６２−９１１９３号、特開昭６２−１９５２９３号、特開昭６１−１５６９５号、特開昭６１−１５６９６号）。
【００３２】
Ｌ−バリンの生産においては、Ｌ−バリン生合成経路に関わる酵素をコーディングする遺伝子の発現強化または変異導入などが挙げられる（ＷＯ００／５０６２４号、アミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年）。
【００３３】
Ｌ−フェニルアラニン生産としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはピルビン酸キナーゼ活性が低下した株（特開平１−３１７３９５号）、チロシン要求性株（特開昭６３−１０５６８８号）等を使用することができる。
【００３４】
Ｌ−メチオニン生産においては、メチルキャップスルフィド化合物の存在かでメチオニンを生産する株、またはａｓｋｆｂｒ、ｈｏｍｆｂｒ、ｍｅｔＸ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＦ、およびｚｗｆから選択される少なくとも５つ以上の遺伝子のそれぞれに遺伝子改変を含む組換えであって、該遺伝子改変が該少なくとも５つ以上の遺伝子の過剰発現を引き起こした株などが挙げられる（特表２００９−５０１５４８号、特表２００９−５０１５５０号）。または異種ｍｅｔＩ遺伝子を発現するように組換えた株などが挙げられる（特表２００９−５０１５４７号）。
【００３５】
Ｌ−セリン生産においては、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有するＬ−セリン生産可能な株、ホスホセリンホスファターゼ活性又はホスホセリントランスアミナーゼ活性の少なくとも一方が増強された株、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を示し、かつＬ−セリン分解能を欠失しＬ−セリンを生産する株、グリシンをＬ−セリンに転化することができる微生物の改良された株を好気的条件下で培養することからなり、改良された株が（１）セリンデヒトラターゼ陰性および（２）アミノ酸類似体のセリンヒドロキサメート、グリシンヒドロキサメートおよびメチオニンヒドロキサメートの少なくとも１種に対する抵抗性がある株などが挙げられる（特開平１１−２６６８８１号、特開平１１−２５３１８７号、特開平１０−２４８５８８号、特開昭６０−１２０９９６号）。
【００３６】
Ｌ−システイン生産においては、セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子で形質転換されたこと、又は細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列が改変されたこと等により、細胞内のセリンアセチルトランスフェラーゼ活性が上昇したコリネ型細菌、好ましくはさらに、Ｌ−システイン分解系が抑制されたコリネ型細菌などが挙げられる（特開２００２−２３３３８４号）。
【００３７】
Ｌ−プロリン生産においては、ヒボキサンチンおよび、イノシトールの少なくとも一種を生育に必要とするまたはプリンアナログ、または、ピリミジンアナログに耐性を有するＬ一プロリン生産するコリネ型細菌などが挙げられる（特開昭５９−１２００９４号、特開昭５９−１０９１８８号）。
【００３８】
Ｌ−チロシン生産においては、フェニルアラニンを要求し、３−アミノチロシン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメートに耐性を有する変異株、ｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示す変異株、Ｌ−チロシン要求性が消去された組み換えコリネ型細菌などが挙げられる。 （Ｈ．Ｈａｇｉｎｏ， Ｋ． Ｎａｋａｙａｍａ；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７、２００１（１９７３）、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｓｕｃｈｉｄａ、Ｓｈｉｉｏ；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７、２３２７（１９７３）、特開昭６０−７００９３号）。
【００３９】
コリネ型細菌が生産しうるポリアミンの具体例としては、カダベリン、スペルミン、スペルミジンまたはプトレシンあるいはそれらの塩が挙げられるが、好ましくはカダベリンまたはその塩である。カダベリンは１，５−ペンタンジアミンともいう。また、カダベリン塩とは、塩基性のカダベリンを酸で中和する際に生じる塩であり、具体例としてカダベリン二塩酸塩、カダベリン硫酸塩、またはカダベリンジカルボン酸塩が挙げられる。カダベリンまたはその塩（以下、単にカダベリンと称する。）はポリマー原料として有用な化合物である。
【００４０】
ポリアミンはコリネ型細菌の発酵により生産される。これらのポリアミン生産できるコリネ型細菌は、自然界よりスクリーニングで単離したコリネ型細菌または特定遺伝子を破壊させたり、または発現を増強または減少させたりなどの変異操作［例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）またはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）を用いる方法またはＵＶ照射による変異導入法あるいは試験管内変異法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，１９７８年，第１４５巻，ｐ．１０１）］によって該遺伝子に変異を誘起するまたは遺伝子組み換えによりポリアミン合成能力を増強または導入する等によるコリネ型細菌などが上げられる。
【００４１】
変異操作あるいは遺伝子組み換えによりコリネ型細菌のポリアミン合成能力を増強または導入する例として、例えば、オルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物におけるプトレシンの生産、またＯＤＣ活性が増加し、増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成の存在によるプトレシンの生産が挙げられる（特表２００８−５０５６５２号、特表２００８−５０５６５１号）、またスペルミジンアセチルトランスフェラーゼ欠乏細胞におけるスペルミジンの生産、スペルミジン合成経路によるプトレシンの生産などが挙げられる。
【００４２】
なおカダベリンの場合、コリネ型細菌は本来Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有していないため、Ｌ−リジンからカダベリンを生産する菌株をコリネ型細菌の変異株スクリーニングにより得ることはできない。したがって、カダベリンを生産する能力を有するコリネ型細菌を得るためには、遺伝子組換えによりコリネ型細菌にＬ−リジン脱炭酸酵素活性を付与する必要がある。コリネ型細菌にＬ−リジン脱炭酸酵素活性を付与する方法としては特に限定はないが、例えば特開２００４−２２２５６９号に開示される方法が挙げられる。
【００４３】
また、コリネ型細菌の野生型株にはホモセリン栄養要求性はないが、ホモセリン栄養要求性の変異株（以下、ホモセリン栄養要求性株とも言う。）はカダベリンの前駆体となるＬ−リジンの生産性が高いため、本発明において好ましく用いられる。ホモセリン栄養要求性株を取得する方法としては、突然変異誘発法により野生型株に突然変異を誘発し、ホモセリン栄養要求性を指標に選抜する方法や、相同組換えによって野生型株の染色体中のホモセリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、ＨＯＭ遺伝子とも言う。）にその他の遺伝子を挿入する方法等によりホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損させる方法が挙げられるが、相同組換えによりＨＯＭ遺伝子を欠損させる方法が好ましく、特開２００４−２２２５６９号に開示されるようにＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（以下、ＬＤＣ遺伝子とも言う。）によりＨＯＭ遺伝子を欠損させることでコリネ型細菌にＬ−リジン脱炭酸酵素活性とホモセリン栄養要求性を同時に付与できるためより好ましい。
【００４４】
また、コリネ型細菌の野生型株はカダベリンの前駆体であるＬ−リジン、あるいはＬ−リジンとＬ−スレオニンによるフィードバック阻害がかかる、フィードバック阻害の解除された菌株を取得する方法としては、特開２００４−２２２５６９号に開示される方法が挙げられる。例えば、野生型株に、変異操作［例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法；微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社］を施した後、ＡＥＣ耐性を指標に選択され、Ｌ−リジン生産性となった変異株から取得する方法をあげることができる。好適な変異株としては、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型株ＡＴＣＣ１３０３２より変異処理により誘導されたＬ−リジン生産菌、あるいは野生型ＡＫ遺伝子を取得した後、上記ＮＴＧ法あるいは試験管内変異法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」，１９７８年，第１４５巻，ｐ．１０１）によって該遺伝子に変異を誘起し、ＡＥＣ耐性を有し、かつＬ−リジン生産性を指標に脱感作した脱感作型ＡＫ遺伝子を含む株等をあげることができる。野生型株にＡＥＣ耐性を付与する更に好ましい方法として、特開２００４−２２２５６９号に開示されるように遺伝子工学的手法を用いる方法である。遺伝子工学的手法を用いる方法に特に制限はなく、例えばコリネ型細菌で複製可能な組み換え体ＤＮＡを用いる方法、または相同組換えによって染色体中の目的遺伝子を組み換える方法である。配列番号１５記載のアミノ酸配列において３１１番目のアミノ酸残基がＴｈｒ以外のアミノ酸に置換された変異アスパルトキナーゼ遺伝子を有することによりＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を獲得することができる。更に好ましい遺伝子工学的手法は、コリネ型細菌の染色体にあるＡＫ遺伝子を脱感作型ＡＫ遺伝子に相同組み換えにより組み換える方法である。さらに、脱感作型ＡＫ遺伝子は、ＡＫ遺伝子に望みの変異導入する技法（例えば、ストラタジーン社ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅサイトダイレクテッド・ミュータジェネシス・キットを用いる方法）で取得することが好ましい。
【００４５】
前記コリネ型細菌の発酵原料は、発酵培養するコリネ型細菌の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得るものであればよい。発酵原料としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地等が好ましく用いられる。
【００４６】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、果糖、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉、ジャガイモ、コムギ、トウモロコシ、サツマイモ、コメ、キャッサバ、タピオカ、クズ、カタクリ、緑豆、サゴヤシ、ワラビなどからの澱粉加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、甜菜、ケーンジュース、甜菜糖蜜またはケーンジュースからの抽出物もしくは濃縮液、甜菜糖蜜またはケーンジュースの濾過液、シラップ（ハイテストモラセス）、甜菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖または粗糖、菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された精製糖、更には酢酸やフマル酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなどが使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００４７】
本発明で使用される発酵原料における炭素源の使用濃度は特に制限されず、化学品の製造を阻害しない範囲であれば可能な限り高い濃度であることが好ましい。通常、炭素源の濃度は、発酵培地中に１（ｗ／ｖ）％以上５０（ｗ／ｖ）％以下が好ましく、より好ましくは３（ｗ／ｖ）％以上３０（ｗ／ｖ）％以下である。前記炭素源は、水により濃縮または希釈して使用できる。
【００４８】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００４９】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【００５０】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ビタミンＢ６等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、ポリペプトンＳ、コーンスティープリカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
【００５１】
本発明で使用される微生物や培養細胞が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて添加使用することができる。
【００５２】
本発明において発酵培養液とは、発酵原料にコリネ型細菌が増殖した結果得られる液のことを言う。追加する発酵原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更することができる。
【００５３】
コリネ型細菌の培養条件にも特に制限はなく、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。化学品生産性評価に用いる培養形態にも特に制限はなく、試験管培養、フラスコ培養、バッチ培養、流加発酵、連続培養などで行う。培養温度は２５〜４２℃、好ましくは２８〜３８℃である。培養時間に特に制限はなく、通常のバッチ培養は１日から９日間である。
【００５４】
コリネ型細菌培養時の培養ｐＨ調整にはアンモニア、炭酸カルシウム、水酸化カルシウムなどの二価イオンの水酸化物、塩酸、硫酸またはジカルボン酸などを使用することができ、これら中和剤を用いて培養ｐＨを好ましくはｐＨ５．０〜８．０に、より好ましくはｐＨ５．５〜７．５に制御すればよい。なお中和剤の状態に制限はなく、気体、液体、固体または水溶液で使用されうるが、好ましくは水溶液またはスラリ状である。
【００５５】
本発明の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を好適には２１％以上に保つ、発酵培養液を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要があれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【００５６】
また本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌の発酵培養液を分離膜により濾過処理することを特徴としている。
【００５７】
本発明において用いられる分離膜は、発酵に使用されるコリネ型細菌による目詰まりが起こりにくく、そして、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と、高い透水性を長時間保持することにより、高い精度と再現性で濾過性能が安定に継続する性能を有する必要がある。そのため、本発明ではそのような性質を持つ分離膜として、平均細孔径の下限が０.０１μｍ以上、好ましくは０．０１μｍ以上、より好ましくは０．０２μ以上、さらに好ましくは０．０４μｍ以上で、上限が１μｍ未満、好ましくは０．４μｍ以下、より好ましくは０．２μｍ以下の多孔性膜が使用される。
【００５８】
なお、多孔性膜の平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００５９】
また、多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。更に、平均細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が均一な透過液を得ることができ、発酵運転管理が容易になることから、平均細孔径の標準偏差は小さければ小さい方が好ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００６０】
【数１】
【００６１】
また、本発明で用いられる多孔性膜では、発酵培養液の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができるが、本発明においては、多孔性膜の純水透過係数は、２５℃の温度の逆浸透膜による精製水を用いてヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したときの多孔性膜の純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、また、純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
【００６２】
また、多孔性膜の膜表面粗さは、多孔性膜の目詰まりに影響を与える因子であり、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることで目詰まりを抑えることで、安定した連続発酵が可能になる。また、多孔性膜の膜表面粗さを低くすることで、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。具体的には、膜表面粗さが０.１μｍ以下であれば、多孔性膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で濾過が実施可能である。
【００６３】
ここで、膜表面粗さは、膜表面に対して垂直方向の高さの平均値であり、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定することができる。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件 探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲 １０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００６４】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００６５】
【数２】
【００６６】
本発明で分離膜として用いられる多孔性膜の構成について説明する。多孔性膜は被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能および透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００６７】
多孔質基材の素材は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００６８】
また、多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の素材としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられ、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。
【００６９】
中でも、有機高分子膜の膜素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００７０】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、フッ化ビニリデンの単独重合体の他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三フッ化塩化エチレンなどが例示される。
【００７１】
また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。
【００７２】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００７３】
本発明で用いられる分離膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが好ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００７４】
また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００７５】
本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。多孔性膜を有する分離膜エレメントの形態は特に限定されないが、支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態で、膜面積を大きくすることが困難な場合には、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。
【００７６】
本発明で用いられる多孔性膜は、特開２００８−１３１９３１号に記載の多孔性膜の作成方法により作成することができる。
【００７７】
本発明において、コリネ型細菌を分離膜で濾過処理する際の膜間差圧は、微生物および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが好ましく、より好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲であり、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上５ｋＰａの範囲である。上記膜間差圧の範囲を外れた場合、微生物および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過水量の低下を招き、濾過運転に不具合を生じることがある。
【００７８】
濾過の駆動力としては、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能である。また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の発酵培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は、発酵培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることにより制御することができるから、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がなく、化学品を生産する能力が低下しない。また、発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、膜分離槽と発酵反応槽間で発酵培養液を循環させる動力手段が不要となり、多孔性膜を発酵反応槽内に設置することも可能となる。
【００７９】
また、膜間差圧を発生させるためにポンプを使用する場合には、吸引圧力により膜間差圧を制御することができ、更に発酵培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。これら圧力制御を行う場合には、発酵培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。
【００８０】
なお本発明では、前記濾過処理の未濾過液を発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を連続的に発酵培養液に添加することによって、コリネ型細菌を連続発酵培養することができる。分離膜を用いたコリネ型細菌の連続発酵培養は、バッチ発酵培養よりも細胞の高密度化が可能であるため生産速度を向上させることができ、また、向上された生産速度を長時間にわたり維持することができるため、本発明の好ましい態様である。
【００８１】
連続発酵を実施する場合、ＷＯ２００７／０９７２６０号に開示される連続発酵法が好ましく採用される。培養初期にバッチ培養または流加培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から発酵原料の供給、濾過および微生物もしくは培養細胞の発酵培養液からの抜き出しを行うことが可能である。発酵原料供給、濾過および微生物もしくは培養細胞の発酵培養液からの抜き出しの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、発酵原料の供給、濾過および微生物もしくは培養細胞の発酵培養液からの抜き出しは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。
【００８２】
さらに本発明は、化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を細胞壁合成抑制剤を含む発酵培地中で培養して、化学品を含む発酵培養液を得ることを特徴としている。ここでいう細胞壁合成抑制剤とは、コリネ型細菌がコリネ型細菌の細胞壁の構成成分として知られているミコール酸を合成することを抑制または阻害する、あるいは細胞壁へのミコール酸付着抑制するなどによりコリネ型細菌の細胞壁の合成を阻害する薬剤であり、本発明者は細胞壁合成抑制剤を発酵培地中に添加しながら培養することで、得られる発酵培養液のろ過分離性能が著しく向上することを見出した。
【００８３】
発酵培地に添加する細胞壁合成抑制剤は、特に限定されないが、イソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ、イソニアジドとも呼ばれる）などのミコール酸合成抑制剤、エタンブトールなどの細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤、ピラジンアミド、リファンピシン、エチオナミド、セルレニン、シクロセリンまたはペニシリンなどの細胞壁合成抑制抗生物質、Ｔｗｅｅｎ４０あるいはＴｗｅｅｎ６０が具体例としてあげられ、好ましくはミコール酸合成抑制剤または細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤であり、より好ましくはＩＮＨまたはエタンブトールである。
【００８４】
ＩＮＨ等のミコール酸合成抑制剤は結核症治療薬として知られており、コリネ型細菌であるグラム陽性バクテリアの細胞壁構成成分であるミコール酸合成を阻害するために使用されたり、コリネ型細菌の形質変換効率の向上に使用されたりする（特開２００７−５０８８４０号、Ｊ．ＢＩＯＳＣＩ．ＢＩＯＥＮＧ．９２（３）、２０１−２１３、２００１）。
【００８５】
エタンブトールなどの細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤についても結核治療薬として知られており、細胞壁のアラビノガラクタンの構成要素であるアラビナンの生合成に関連し、アラビナンの合成を抑制することでミコール酸の蓄積を低下させることによってミコール酸が細胞壁のアラビノガラクタンに付着するのを抑制する（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４３７、 ３２５―３３２、１９９９）。
【００８６】
発酵培地への細胞壁合成抑制剤の添加は、コリネ型細菌の発酵培養による化学品の製造を阻害しない範囲においては特に限定されないが、発酵培地中における細胞壁合成抑制剤濃度が０．１〜２０ｇ／Ｌになるように添加されることが好ましい。
【００８７】
細胞壁合成抑制剤としてＩＮＨなどのミコール酸合成抑制剤を使用する場合、発酵培地中のミコール酸合成抑制剤の添加濃度としては、微生物の良好な生育と化学品の生産、トータルコストの観点から、０．１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．３ｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．５ｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。
【００８８】
細胞壁合成抑制剤としてエタンブトールなどの細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤を使用する場合、発酵培地中の細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤の添加濃度としては、微生物の良好な生育と化学品の生産、トータルコストの観点から、０．１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、０．２ｇ／Ｌ以上であることがより好ましく、０．３ｇ／Ｌ以上であることがさらに好ましい。
【実施例】
【００８９】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００９０】
［Ｌ−リジンおよびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
・使用カラム ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
・移動相 ０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
・検出 ＵＶ３６０ｎｍ
・サンプル前処理 分析サンプル２５μｌに内標として１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μｌ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を４００μｌおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００９１】
［グルコース濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
・使用カラム Ｌｕｎａ ＮＨ２ ２５０×４．６ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
・移動相 ミリＱ水：アセトニトリル＝２５：７５
・検出 ＲＩ（示差屈折率）
・サンプル前処理 採集したサンプルを０．２μｍのフィルターによりろ過処理した後１０μｌをＨＰＬＣ分析した。
【００９２】
［参考例１］Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
特開２００４−２２２５６９号の実施例２に開示される方法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株に脱感作型ＡＫ遺伝子を染色体上で発現可能ように導入し、ＴＲ−ＡＫ株を作製した。ＴＲ−ＡＫ株のＡＥＣ耐性は特開２００４−２２２５６９号公報の実施例２に開示されるＡＥＣ耐性確認方法によりＡＥＣ耐性を確認した。
【００９３】
［参考例２］Ｌ−リジン脱炭酸活性を有し、かつホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を欠損し、かつＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
特開２００４−２２２５６９号の実施例１および実施例２に開示される方法によりＴＲ−ＣＡＤ２株を作製した。
【００９４】
［実施例１、比較例１］ＴＲ−ＡＫ株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＡＫ株（実施例１、比較例１）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。実施例１は表１の発酵培地に１ｇ／ＬのＩＮＨを添加（以下、ＭＩ１とする）し、比較例１は表１の発酵培地にＩＮＨ添加しなかった。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例１でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。比較例１でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例１と比較例１の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図１は実施例１と比較例１の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図１から、本発明の化学品の製造方法により、ＩＮＨ添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるために濾過時間の短縮あるいはろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【００９５】
【表１】
【００９６】
【表２】
【００９７】
［実施例２、比較例２］ＴＲ−ＡＫ株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＡＫ株（実施例２、比較例２）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌに前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。実施例２は表１の発酵培地に５ｇ／ＬのＩＮＨを添加（以下、ＭＩ５とする）し、比較例２は表１の発酵培地にＩＮＨ添加しなく抑泡のため消泡剤ＰＥ−Ｌを０．０５％添加した。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例２でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。比較例２でのＬ−リジンの濃度は約９．４ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約０ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例２と比較例２の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図２は実施例２と比較例２の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図２から、本発明の化学品の製造方法により、ＩＮＨ添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるためにろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【００９８】
［実施例３、比較例３］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＣＡＤ２株（実施例３、比較例３）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌ（実施例３は表１の発酵培地に１０ｇ／ＬのＩＮＨを添加（以下、ＭＩ１０とする）、比較例３はＩＮＨ添加なし）に前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例３でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。比較例３でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例３と比較例３の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図３は実施例３と比較例３の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図３から、本発明の化学品の製造方法により、ＩＮＨ添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるためにろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【００９９】
［実施例４、比較例４］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の生産
ＴＲ−ＣＡＤ２株（実施例４、比較例４）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々培養を行った。この前々培養液を前々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前培養を行った。次に表１に示す発酵培地３９００ｍｌ（実施例４は表１の発酵培地に５ｇ／Ｌのエタムブトールを添加（以下、ＥＴ５とする）、比較例４はエタムブトール添加なし）に前培養液全量を植菌し、滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、３０℃、攪拌翼回転数８００ｒｐｍ、ｐＨを７に調整しながら６０時間培養を行った。中和剤として塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）で行った。培養終了後、一部の培養液を取り出し４℃、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで菌体を除去し、培養上清を回収した。この培養上清中のＬ−リジン、カダベリンをＨＰＬＣにより分析した。実施例４でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。比較例４でのＬ−リジンの濃度は約０ｇ／Ｌ、カダベリン濃度は約９．４ｇ／Ｌ生産された。表２に実施例４と比較例４の発酵終了後の発酵液を用い、最速濾過時間を調べた結果を示す。また、図４は実施例４と比較例４の発酵終了後の発酵液を用い、同等な濾過フラックスで濾過処理を行った時のろ過時間と膜間差圧を比較したグラフである。表２と図４から、本発明の化学品の製造方法により、エタムブトール添加は、分離膜が詰りにくくなる効果があり、膜のろ過性が改善されるためにろ過量の向上による化学品の生産性が向上されることが明らかになった。
【０１００】
［実施例５、比較例５］ＴＲ−ＡＫ株を用いた化学品の連続生産
ＷＯ２００７／０９７２６０号の図１に示す連続発酵装置を稼働させることにより、Ｌ−リジンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。発酵培地（実施例５にはＭＩ５培地、比較例４には表１に示す培地）を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメントとしてはＷＯ２００７／０９７２６０に掲示の図３に示される形態を採用し、分離膜には、ＷＯ２００７／０９７２６０の参考例２に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜、分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。この多孔性膜の特性を調べたところ、平均細孔径が０.１μｍであり、純水透過係数が５０×１０-9ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａであった。この実施例５と比較例５における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【０１０１】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．５ｖｖｍ
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・ｐＨ調整：塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）によりｐＨを７．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１０２】
ＴＲ−ＡＫ株（実施例５、比較例５）を滅菌ＬＢ培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前々々培養を行った。この前々々培養液を前々々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前々培養を行った。前々培養液を、ＷＯ２００７／０９７２６０号の図１に示す連続発酵装置の滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、１Ｌの発酵培地（実施例５にはＭＩ５倍地、比較例５には表１に示す培地）に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ＭＩ５培地（実施例５）または表１に示す培地（比較例５）の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、３０℃での連続発酵によるＬ−リジンの製造を行った。このとき、気体供給装置から滅菌した空気を発酵反応槽１内に供給した。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１０３】
その結果、比較例５の２２０時間の連続発酵に対し、実施例５では３４０時間の連続発酵となり（図５）、発酵培地にＩＮＨ添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、Ｌ−リジンの生産性が向上した（表３）。
【０１０４】
［実施例６、比較例６］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の連続生産
ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す連続発酵装置を稼働させることにより、カダベリンが連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。発酵培地（実施例６にはＭＩ１培地、比較例６には表１に示す培地）を用い、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜と分離膜エレメントとしては実施例５と比較例５のものを使用した。この実施例６と比較例６における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
【０１０５】
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０ｃｍ２
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．５ｖｖｍ
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・ｐＨ調整：塩酸水溶液（３Ｍ）およびアンモニア水（３Ｍ）によりｐＨを７．０に調整
・膜透過水量制御：膜分離槽水頭差により流量を制御（水頭差は２ｍ以内で制御した。）。
【０１０６】
まずＴＲ−ＣＡＤ２株（ 実施例６、比較例６ ）を滅菌Ｌ Ｂ 培地（クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）添加）１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃ で２４時間振とうして前々々培養を行った。この前々々培養液を前々々培養と同じ培地１００ｍｌに全量植菌し、３０℃ 、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で２４時間培養して前々培養を行った。前々培養液を、ＷＯ２００７／０９７２６０の図２に示す連続発酵装置の滅菌した空気を０．５ｖｖｍで通気しながら、１Ｌの発酵培地（実施例６にはＭＩ１倍地、比較例６には表１に示す培地）に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整と３０℃の温度に温度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ＭＩ１培地（実施例６）または表１に示す培地（比較例６）の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵培養液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、３０℃での連続発酵によるカダベリンの製造を行った。このとき、気体供給装置から滅菌した空気を発酵反応槽１内に供給した。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたカダベリン濃度および残存グルコース濃度を測定した。
【０１０７】
その結果、比較例６の２００時間の連続発酵に対し、実施例６では３２０時間の連続発酵となり（図６）、発酵培地にＩＮＨ添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、カダベリンの生産性が向上した（表３）。
【０１０８】
［実施例７、比較例７］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の連続生産
実施例５で使用した多孔性膜の代わりに、分離膜としてＷＯ２００７／０９７２６０の参考例１３に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする中空糸膜を用いた。分離膜エレメントとしてはＷＯ２００７／０９７２６０号の図４に示される形態を採用した。また実施例７のためのＭＩ５培地を用いた他は、実施例６と同様にして、連続発酵試験を行った。その結果、比較例７の２１０時間の連続発酵に対し、実施例７では３３０時間の連続発酵となり（図７）、発酵培地にＩＮＨを添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、カダベリンの生産性が向上した（表３）。
【０１０９】
［実施例８、比較例８］ＴＲ−ＣＡＤ２株を用いた化学品の連続生産
実施例５で使用した多孔性膜の代わりに、分離膜としてＷＯ２００７／０９７２６０の参考例１３に従って作製したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする中空糸膜を用いた。分離膜エレメントとしてはＷＯ２００７／０９７２６０の図４に示される形態を採用した。また実施例８のためのＥＴ５培地を用いた他は、実施例５と同様にして、連続発酵試験を行った。その結果、比較例８の２２０時間の連続発酵に対し、実施例７では３４０時間の連続発酵となり（図８）、発酵培地にエタムブトールを添加することによって膜のろ過性が改善されることにより長時間連続発酵が可能となり、カダベリンの生産性が向上した（表３）。
【０１１０】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を細胞壁合成抑制剤を含む発酵培地で培養し、得られた発酵培養液を分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用いて濾過処理し、濾液から生産物を回収することを特徴とする、化学品の製造方法。
【請求項２】
前記細胞壁合成抑制剤が、ミコール酸合成抑制剤または細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤である、請求項１に記載の化学品の製造方法。
【請求項３】
前記細胞壁合成抑制剤がイソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ）またはエタンブトールである、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
【請求項４】
前記発酵培地中の細胞壁合成抑制剤の含有量が０．１〜２０ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項５】
前記コリネ型細菌の培養が、前記濾過処理の未濾過液を前記発酵培養液に保持または還流し、かつ、前記発酵原料を連続的に添加する連続発酵培養であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項６】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属である、請求項１〜５のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項７】
前記化学品がアミノ酸またはポリアミンである、請求項１〜６のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項８】
前記化学品がＬ−リジンまたはカダベリンである、請求項１〜７のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項１】
化学品を生産する能力を有するコリネ型細菌を細胞壁合成抑制剤を含む発酵培地で培養し、得られた発酵培養液を分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用いて濾過処理し、濾液から生産物を回収することを特徴とする、化学品の製造方法。
【請求項２】
前記細胞壁合成抑制剤が、ミコール酸合成抑制剤または細胞壁へのミコール酸付着を抑制する薬剤である、請求項１に記載の化学品の製造方法。
【請求項３】
前記細胞壁合成抑制剤がイソニコチン酸ヒドラジド（ＩＮＨ）またはエタンブトールである、請求項１または２に記載の化学品の製造方法。
【請求項４】
前記発酵培地中の細胞壁合成抑制剤の含有量が０．１〜２０ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項５】
前記コリネ型細菌の培養が、前記濾過処理の未濾過液を前記発酵培養液に保持または還流し、かつ、前記発酵原料を連続的に添加する連続発酵培養であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項６】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属である、請求項１〜５のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項７】
前記化学品がアミノ酸またはポリアミンである、請求項１〜６のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【請求項８】
前記化学品がＬ−リジンまたはカダベリンである、請求項１〜７のいずれかに記載の化学品の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−５０３７２（Ｐ２０１２−５０３７２Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９４３５８（Ｐ２０１０−１９４３５８）
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３１日（２０１０．８．３１）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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