コルジセピンの製造および精製方法
【課題】高純度のコルジセピンを簡便にかつ効率よく製造する方法を提供する。また、コルジセピンを簡便にかつ高回収率で分離精製する方法を提供する。
【解決手段】ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養することにより、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる。また、得られた培養液から分離した培養上清より、温度変化やｐＨ変化による晶析により、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製する。
【解決手段】ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養することにより、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる。また、得られた培養液から分離した培養上清より、温度変化やｐＨ変化による晶析により、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冬虫夏草の培養により、高純度の生理活性物質コルジセピンを簡便かつ効率よく製造および精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
冬虫夏草は、子嚢菌類に分類される菌類で、昆虫に寄生するキノコの総称である。寄生の形態は以下の通りである：（１)飛散した胞子が宿主である昆虫に取り付き、その体内に入り込む。(２)体内に入った胞子が、養分を吸収して菌糸を伸ばしながら成長し、菌糸の固まりである菌核を形成する。(３)成熟後、昆虫の体を突き破って、キノコ（子実体）を生じる。
【０００３】
中国においては、コウモリガ（Ｈｅｐｉａｌｕｓ ａｒｍｏｒｉｃａｎｕｓ）の幼虫に寄生するＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓが、１７００年代から、漢方薬として用いられてきた。近年では、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ以外の冬虫夏草についても抗菌、抗腫瘍、免疫増強、血糖降下、血管拡張作用など様々な薬理活性機能を有することが明らかにされてきており、その有効成分としてコルジセピン、エルゴステロールパーオキシド、ミリオシン、各種多糖および糖タンパク質などの存在が報告されている。これらの有効成分のなかでも、ヌクレオシド（アデノシン）のアナログであるコルジセピンは、抗菌、抗腫瘍作用を示す物質として特に注目を集めている。このように、医薬品や健康食品への利用が期待されている冬虫夏草であるが、それらは極めて小さく、また生息数が少ないため採集が困難であり、天然に生育する冬虫夏草を採集収穫するだけでは、高まりつつある需要を十分に満たすことはできない。
【０００４】
そこで、近年、冬虫夏草の菌糸体や子実体を人工的に培養する方法、さらにはそこから有効成分を抽出する方法として、いくつかの提案がなされている。例えば、冬虫夏草の菌糸体や子実体の人工的な培養方法としては、水を用いて高温加熱下で抽出した蚕の蛹の組成成分の抽出液に、炭素源、アミノ酸類、ミネラル類、またはビタミン類の中から少なくとも一種を添加した培地で冬虫夏草の菌糸体と子実体を培養する方法（特許文献１）、冬虫夏草の菌糸体を合成または天然の培地で培養するに際して、対象とする冬虫夏草の寄生した昆虫と同一種の昆虫の抽出エキスを培地に添加する方法（特許文献２）などが挙げられる。人工的に培養した冬虫夏草の菌糸体や子実体から有効成分を抽出する方法としては、特許文献３〜５などが挙げられる。すなわち、特許文献３には、無菌飼育した蚕の蛹あるいは蜘蛛の体内に、ハナサナギタケ（Ｉｓａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）等の冬虫夏草菌株の胞子懸濁液を接種して子実体を形成させ、得られた子実体からエタノールや水を用いて有効成分を抽出する方法が記載されている。また、特許文献４には、玄米などの穀類と昆虫組織体（寄生した昆虫と同一目、同一科の昆虫を使用）を主成分とし、アミノ酸類、ミネラル類、またはビタミン類の中から少なくとも一種の添加物を添加した固体培地に冬虫夏草菌を接種し、１８〜２６℃、湿度８０％以上全暗で菌糸体を発育させた後、照度１００Ｌｕｘ以上、１日６時間以上照射して子実体を培養し、培養品をそのまま粉砕する、あるいは、必要に応じて有効成分を抽出する方法が記載されている。さらに、特許文献５には、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射して冬虫夏草菌糸体を培養し、得られた菌糸体から、有機溶媒や水等で有効成分を抽出する方法が記載されている。
【０００５】
他にも、最も重要な有効成分の１つであるコルジセピンの生産性を高めるため、好適な培地・培養条件が検討されている（特許文献６および７、非特許文献１〜３等）。すなわち、特許文献６には、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種を０．１〜０．５重量％、あるいはさらに微量のビオチンおよび／またはビタミンＢ類を含有する冬虫夏草用培地を用いて、コルジセピンの含有率を向上させる方法が記載されている。特許文献７には、冬虫夏草用培地にコルジセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、暗所にて５〜２８℃で２０〜９０日間培養する第一工程と、その培養後、照度１００〜１５００００Ｌｕｘの光照射下において、３５℃以下の範囲内で第一工程より温度を上げて培養し、コルジセピンの含有量を向上させる方法が記載されている。また、非特許文献１には、通気攪拌槽を用いた深部培養において、培養開始から溶存酸素濃度（ＤＯ）を飽和の６０％に制御し、コルジセピンの比生産速度が低下する時点で３０％にするという２段階のＤＯ制御方式により、高い生産量と生産性を得る方法が記載され、非特許文献２には、炭素源として、４２ｇ／Ｌ グルコース、窒素源として、１５．８ｇ／Ｌ ペプトンを含む培地を用いて、２５℃、１１０ｒｐｍ、２０日間振盪フラスコによる培養を行い、高いコルジセピン生産性を得る方法が記載されている。さらに、非特許文献３には、窒素源として、４５ｇ／Ｌの酵母エキスを用い、８日間の振盪培養の後、８日間の静置培養を行うことにより、効率的にコルジセピンを得る方法が記載されている。
【０００６】
しかしながら、従来の冬虫夏草の人工培養法は、培地に蛹粉、蛹の抽出液、および／または昆虫の抽出液を用いたり、昆虫の体内に菌を接種したり、温度、ｐＨ、光照射を細かく制御したりするなど、操作が煩雑で実用化を考慮した大量生産は困難である。また、コルジセピンを得ようとした場合、その収量は、非特許文献１に記載の方法で培地中に０．１９５ｇ／Ｌ、非特許文献２に記載の方法で０．３４５ｇ／Ｌ、非特許文献３に記載の方法で２．２ｇ／Ｌ、特許文献６に記載の方法では菌体１ｇあたり０．０２〜０．１ｇ、特許文献７に記載の方法では菌体１ｇあたり０．０５〜０．１ｇと、いずれも十分であるとはいえない。
【０００７】
また、生産したコルジセピンの精製方法については、検討例が少なく効率的な方法が知られていない。例えば特許文献８では、はじめに冬虫夏草を粉末化した後エタノールで抽出し、抽出物を濃縮乾固させ、次に乾固物を蒸留水に溶解した後、ブタノールで抽出し抽出物を濃縮乾固させた後、さらに、この乾固物をシリカゲルクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分画するという、非常に煩雑な方法によって、高純度のコルジセピンを得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−４２６９１号公報
【特許文献２】特開平１０−１１７７７０号公報
【特許文献３】特開２００２−２７２２６７号公報
【特許文献４】特開２００３−１１６５２２号公報
【特許文献５】特開２００４−３４４０２７号公報
【特許文献６】特開２００４−２４２５０６号公報
【特許文献７】特開２００４−２６７００４号公報
【特許文献８】特表２０１０−５０３７２９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biotechnol. Prog. 20, 1408-1413 (2004)
【非特許文献２】Process Biochemistry 40, 1667-1672 (2005)
【非特許文献３】Biochem. Eng. J. 33, 193-201 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、高純度のコルジセピン（３’−デオキシアデノシン）を簡便にかつ効率よく製造する方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、コルジセピンを簡便にかつ高回収率で分離精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、冬虫夏草の培養条件を鋭意検討した結果、ろ過滅菌した培養液を用いることによって、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させ得ることを見いだした。また、得られた培養液から培養上清を分離し、晶析により、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである：
［１］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養し、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる工程を含む、コルジセピンの製造方法。
［２］冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、上記［１］に記載の製造方法。
［３］冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、上記［２］に記載の製造方法。
［４］冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］さらに、冬虫夏草を培養して得た培養液から培養上清を分離し、該培養上清から晶析によりコルジセピンを分離精製する工程を含む、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］コルジセピンを分離精製する工程が、培養上清を粉末化して溶媒に再溶解する工程を含む、上記［５］に記載の製造方法。
［７］粉末化が凍結乾燥により行われる、上記［６］に記載の製造方法。
［８］溶媒が水である、上記［６］または［７］に記載の製造方法。
［９］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、３０〜９０℃で水に再溶解して得た水溶液を、０〜１０℃に冷却して析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
［１０］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５として、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
［１１］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に３０〜９０℃で再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５とし、０〜１０℃に冷却して、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
［１２］冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、上記［９］〜［１１］のいずれかに記載の分離精製方法。
［１３］冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、上記［１２］に記載の分離精製方法。
［１４］冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、上記［９］〜［１３］のいずれかに記載の分離精製方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、冬虫夏草の培養により、高純度のコルジセピンを簡便にかつ効率よく製造することができる。
また、冬虫夏草の培養液より分離した培養上清から、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１−３及び比較例１−３の製造方法により、培地中に産生されるコルジセピンの濃度の経時変化を比較したグラフである。オープンサークルは実施例１−３、クローズドサークルは比較例１−３についての結果を示す。
【図２】実施例１−３の製造方法により製造されたコルジセピンのＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図３】実施例２の製造方法により分離精製されたコルジセピンのＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図４】実施例３−１の製造方法により分離精製されたコルジセピンのＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明のコルジセピンの製造方法は、ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養し、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる工程を含む。
【００１７】
本発明に用いる冬虫夏草は、野生株の冬虫夏草であっても、人工栽培されている冬虫夏草であってもコルジセピンを産生するものであれば、特に限定されない。好ましくは、産生したコルジセピンを菌体外に排出するものがよい。例えば、コルジセプス属のＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ３０３７７、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ２６８４８、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ３４１６４、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ３４１６５等が適している。コルジセピン産生量の観点から、さらに好ましくは、特開２００９−３４０４５号公報に開示した、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株を用いることができる。「親株と菌学的性質の異なる菌株」としては、８−アザアデニン、８−アザグアニン等のアデニンおよび／またはグアニンのアナログ存在下で生存可能な菌株が、高いコルジセピン産生性を有する可能性があるため、好ましく選抜される。本発明においては、コルジセピン高産生株として、コルジセピン産生量が親株の１．３倍以上のものを用いることが好ましく、１．５倍以上のものを用いることがより好ましい。かかる突然変異株としては、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７より得られた変異株がより好ましく、茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５株（受託日：２００７年７月５日）が、特に好ましい。
【００１８】
本発明の冬虫夏草の培養では、通常菌糸体の培養に用い得る培養液を用いることができ、該培養液は成分として炭素源および窒素源、ならびに／または他の添加物を含む。利用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、糖蜜等が挙げられ、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスティープ、小麦胚芽等が利用可能であるが、酵母エキスが好ましい。また、グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、システイン等のアミノ酸、アデニン、グアニン、アデノシン等の核酸関連物質のいずれか１種、または複数種を添加してもよい。
【００１９】
上記培地成分の配合量としては、例えば炭素源は、水を含む培地全重量の１〜２０重量％、好ましくは２〜１５重量％であり、窒素源は培地全重量の０．２５〜２０重量％、好ましくは０．５〜１５重量％である。アミノ酸を添加する場合は、その配合量は培地全重量の０．５〜５重量％、好ましくは１〜３重量％であり、核酸関連物質を添加する場合は、その配合量は培地全重量の０．０５〜０．６重量％、好ましくは０．１〜０．４重量％である。
【００２０】
具体的には、例えばポテトデキストロース寒天プレート、またはグルコース ２０ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、および酵母エキス ７．５ｇ／Ｌを含有する寒天プレートの中心に、一白金耳の菌糸体を接種し、１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃で、７〜２１日間、好ましくは１０〜１６日間静置培養したものを種菌として用いることができる。上記のプレート上に増殖した菌蓋の周縁部の菌糸体をくり抜き、培養瓶内の培養液表面に浮かべることによって、コルジセピン産生のための液体表面培養を行うことができる。培養温度は、１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃である。前記培養液の量は、液深さが１〜１０ｃｍ、好ましくは２〜５ｃｍとなるように設定することによって、コルジセピン産生量が増大する。前記培養液の滅菌法としては、高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）や低温滅菌、ろ過滅菌などの様々な方法を採用することが可能であるが、グルコースなどの還元性を有する物質を含む培養液の場合には、高圧蒸気滅菌が好ましくない場合がある。特に高濃度の培地成分を含有する培養液の場合には、発酵阻害物を生じる可能性があるため、培養によるコルジセピンの製造においては、コルジセピン産生量を向上させるためには、ろ過滅菌が好ましい。ろ過滅菌については、通常、孔径０．２０μmのメンブランフィルターを用いて雑菌等の除去を行うが、雑菌等の混入が認められなければ、他の材質、孔径のものを用いてもよい。
【００２１】
冬虫夏草の菌糸体は、上記培養液中の成分を栄養源として、培養液表面において増殖し、コルジセピンを産生する。ここで、産生されたコルジセピンの９０％以上は培養液中に分泌される。従って、産生されたコルジセピンを回収するには、はじめに培養液から菌糸体を分離して、培養上清を得る必要がある。菌糸体を分離する方法としては、遠心分離やろ過など様々な方法が利用可能であり、特に限定されない。
【００２２】
分離した培養上清には、コルジセピンが高濃度で含まれており、コルジセピンの溶解度差を利用した様々な晶析法でコルジセピンの回収が可能である。例えば、培養上清を減圧濃縮することにより、溶解度を超えて上清液中に析出したコルジセピンを沈殿として回収することができる。また、予め凍結乾燥や真空乾燥などによりコルジセピンを含む培養上清を粉末化した後、これを高濃度となるように溶媒に溶解し、次いで晶析させることも可能である。高濃度に溶解したコルジセピンの晶析方法としては、溶液の温度を変化させる方法やｐＨを変化させる方法、コルジセピン溶液にコルジセピンの貧溶媒を加える方法などを用いることが可能である。本発明において用い得るコルジセピンの貧溶媒としては、アセトン、エタノール、プロパノール等が挙げられる。
【００２３】
コルジセピンを溶解する溶媒としては、コルジセピンと反応せず毒性の低いもの、また沸点の低いものであれば特に限定されないが、水が好ましい。コルジセピンの水に対する溶解度は、高温で高く、低温で低くなる。従って、高温でコルジセピンを溶解した後に冷却することによって、コルジセピンの晶析を行うことができる。コルジセピンを溶解する温度としては、コルジセピンの加水分解等が生じない限り特に限定されないが、溶媒として水を用いた場合には３０〜９０℃が適しており、好ましくは４０〜８０℃である。また、溶解したコルジセピンを析出させる温度としては、溶液が凍結しない範囲であれば特に限定されないが、２０℃以下が適しており、好ましくは０〜１０℃である。
【００２４】
また、コルジセピンの水に対する溶解度は、中性付近で低く、酸性領域やアルカリ性領域で高い。従って、コルジセピンを酸性あるいはアルカリ性の水溶液に高濃度に溶解した後、水溶液のｐＨを中性付近に変化させることにより、コルジセピンの晶析を行うことができる。コルジセピンを溶解させるｐＨとしては、４未満、あるいは１２．５超が好ましく、３未満或いは１３超がより好ましい。また、溶解したコルジセピンを析出させるｐＨとしては、４〜１２．５が好ましく、５〜１０がより好ましい。
【００２５】
さらに本発明においては、上記した温度変化とｐＨ変化を組み合わせて、コルジセピンの晶析を行うこともできる。
すなわち、培養上清の凍結乾燥粉末を、ｐＨが好ましくは４未満、より好ましくは３未満の酸性の水溶液、またはｐＨが好ましくは１２．５、より好ましくは１３を超えるアルカリ性の水溶液に、３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃で再溶解し、次いで水溶液のｐＨを好ましくは４〜１２．５、より好ましくは５〜１０とし、２０℃以下、好ましくは０〜１０℃に冷却して、析出するコルジセピンを回収する。
【００２６】
析出したコルジセピンは、遠心分離やろ過により回収することができる。なお、遠心分離やろ過は、一般的に析出した結晶を分取する際に行われる方法、条件等で行うことができる。たとえば遠心分離は、製造スケールに応じて、小型遠心分離機、卓上遠心分離機、工業用遠心分離機等により、９０００〜１５０００×ｇにて１５〜３０分程度行う。またろ過は沈殿物のろ過分取に適するろ紙を用いて行うことができるが、ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙等、ＪＩＳ規格Ｐ ３８０１［ろ紙（化学分析用）］に規定される５種Ａに相当するろ紙等を用いて行うことが好ましい。
さらに、回収したコルジセピンを低温の水で洗浄することにより、コルジセピン純度を向上させることができる。
【００２７】
回収したコルジセピンは、風乾、凍結乾燥等により乾燥する。保存安定性等の観点からは、凍結乾燥することが好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明について、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］冬虫夏草変異体の液体表面培養によるコルジセピンの製造
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の突然変異体Ｇ８１−３（産総研特許生物寄託センター 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）をポテトデキストロース寒天プレート上にて、２５℃、１３日間前培養し、種菌とした。表１に示す組成の本培養培地１００ｍＬを、メンブランフィルター（「Ａ０２０Ａ０４７Ａ」、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２μｍ）を用いてろ過滅菌した後、静置培養用の容器（容量５００ｍＬ）に入れ、次に、前培養により３．５〜４．５ｃｍに成長した種菌の菌蓋を滅菌済み円筒形カッター（１ｃｍ）でくり抜き、本培養培地に浮かべ、静置培養を行った。
【００３０】
【表１】
【００３１】
培養液を経時的にサンプリングし、孔径０．４５μmのメンブランフィルター（「ＳＬＨＰＸ１３ＮＫ」、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過し、ろ液のコルジセピン濃度をＨＰＬＣにより測定した。コルジセピン濃度が最大値に達したことを確認した後、本培養を終了し、培地より菌体を遠心分離（１５０００×ｇ、２０分間）により除去した後、培地をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙でろ過し培養上清を分離回収した。
【００３２】
ここでＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
カラム：東ソー製ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍ ＩＤ×２５．０ｃｍ）
移動相：メタノール：０．１容量％リン酸＝２：９８（容量比）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２０μＬ
ピーク検出：ＵＶ検出器（２６０ｎｍ）
【００３３】
なお、実施例１において、メンブランフィルターによるろ過滅菌の代わりに、本培養の培地をオートクレーブ滅菌したものを用いて同様に培養し、培養上清を得た（比較例１）。実施例１および比較例１の各製造において、最大コルジセピン産生量（ｇ／Ｌ−培地）と、最大産生量に到達するまでの培養期間を表２に示した。
【００３４】
【表２】
【００３５】
また、表２の実施例１−３および比較例１−３の製造方法におけるコルジセピン濃度の経時変化を図１に、実施例１−３の製造方法において、得られた培養上清についてのＨＰＬＣによる代表的な分析結果の例を図２に示した。表２より、ろ過滅菌した培地を用いた場合（実施例１−１〜１−４）には、オートクレーブ滅菌した培地を用いた場合（比較例１−１〜１−４）の１．３〜２．１倍の最大コルジセピン産生量が得られ、さらに、最大産生量に到達するまでの培養期間も、最大２７％短縮されたことが示された。このように、培地の滅菌法としてろ過滅菌を用いることにより、生産効率を向上させることが可能であった。なお、グルコース１２０．７ｇ／Ｌおよび酵母エキス１３１．３ｇ／Ｌを含有する培地をオートクレーブ滅菌して用いた比較例１−５の製造方法では、菌体の生育が見られなかった。また、図２より、培養上清に含まれる主たる不純物は、保持時間においてコルジセピンの直後に出現するピーク（以下Main impurityと称す）であることが示された。
【００３６】
［実施例２］温度変化による晶析を利用したコルジセピンの精製
コルジセピンの精製は、Main impurityの含有量を減少させることを主目的として行った。実施例１−３の製造方法により得られた培養上清を凍結乾燥し、コルジセピン９．６ｇ相当を含む乾燥品をコルジセピン濃度が約２０ｇ／Ｌとなるように蒸留水４８０ｍＬに添加し６０℃で溶解させた。加温した状態で、微量の不溶物をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いてろ過した後（ろ液の回収量は４２０ｍＬであった）、アルミ製のバットに移し、５℃の冷蔵庫内に静置した。溶液の温度、析出したコルジセピン量および析出物中のMain impurity量の割合を経時的にモニターし、ほぼ定常状態に到達した３６時間後に析出物をろ過により回収した。ろ紙としてＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａを用い、ろ過した後、氷冷水を用いて析出物を洗浄した。洗浄したコルジセピンを凍結乾燥し、６．５４ｇの精製コルジセピンを得た（精製収率６６％）。得られたコルジセピンのＨＰＬＣによる分析結果を図３に示した。２６０ｎｍの紫外線で検出されるピーク面積から算出したMain impurityの含有率は、培養上清では３．８〜４．０％であったが、本実施例による精製後は１．０％に減少した。すなわち、コルジセピンの純度は、約９６％から９９％に上昇した。
【００３７】
［実施例３］温度変化による晶析を利用したコルジセピンの再精製
実施例２の精製方法により得られたコルジセピンには、わずかな着色が見られた。そこで、さらに高純度のコルジセピンを得るために、再度温度変化による晶析を利用した精製を行った。はじめに、実施例２の精製方法により得られたコルジセピン２．００ｇ、１．５０ｇ、１．００ｇに、それぞれ蒸留水４００ｍＬ、３００ｍＬ、２００ｍＬを添加し、溶解させた（それぞれ、実施例３−１、３−２、３−３）。この溶液をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙でろ過することにより、前工程で混入したろ紙繊維等を取り除いた。各ろ液を凍結乾燥後、乾燥品に蒸留水各５０ｍＬを添加し、６０℃に加温して完全に溶解させた。溶液を５℃の冷蔵庫内で２４時間静置した後、析出物をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いてろ過し、回収した。最終的なコルジセピン回収量と精製品の純度を表３に示した。実施例３−１の再精製方法により得られたコルジセピンにおけるMain impurityの含有率は、約０．３％に減少した。すなわち、コルジセピンの純度は約９９．７％まで高めることができた。実施例３−１の再精製方法により得られたコルジセピンのＨＰＬＣによる分析結果を、図４に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】
［実施例４］ｐＨ変化による晶析を利用したコルジセピンの精製
実施例１−３の製造方法により得られた培養上清を凍結乾燥し、得られた乾燥品８．６８ｇ（コルジセピン含有量１．９１ｇ）を２０ｍＬの蒸留水に懸濁した後、５Ｎ塩酸水溶液を少しずつ添加し、温度を２５℃に保ちながら６９ｇ／Ｌのコルジセピン溶液を調製した。この溶液のｐＨは２．７であった。この溶液を９１００×ｇで２０分間遠心分離し、若干含まれている不溶成分を取り除いた。得られた上清の温度を２５℃に保ちながら、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを５．３に調整したところ、多量の沈殿が生成した。この沈殿をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いて回収し、氷冷水を用いて洗浄した後、凍結乾燥し、１．３６ｇの精製品を得た。最終的なコルジセピンの純度と回収率を、表４に示した。ｐＨ変化による晶析により、純度９９％以上のコルジセピンを７０％以上の高い収率で回収できることが確認された。
【００４０】
［実施例５］ｐＨ変化および温度変化による晶析を利用したコルジセピンの精製
実施例４と同様にして得た培養上清の乾燥品７．１４ｇ（コルジセピン含有量１．５７ｇ）を３０ｍＬの蒸留水に懸濁した後、５Ｎ塩酸水溶液を少しずつ添加し、温度を２５℃に保ちながら４２．４ｇ／Ｌのコルジセピン溶液を調製した。この溶液のｐＨは２．７であった。この溶液を９１００×ｇで２０分間遠心分離し、若干含まれている不溶成分を取り除いた。次いで、得られた上清の温度を２５℃に保ちながら５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを６．６に調整した。さらに４℃の冷蔵庫内で３時間冷却したところ、多量の沈殿が生成した。この沈殿をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いて回収し、氷冷水を用いて洗浄した後、凍結乾燥し、１．１７ｇの精製品を得た。最終的なコルジセピンの純度と回収率を、表４に併せて示した。ｐＨ変化と温度変化を組み合わせた晶析により、純度９８％以上のコルジセピンを７５％以上の高い収率で回収できることが確認された。
【００４１】
【表４】
【００４２】
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者であれば、このような具体的技術は好適な実施態様に過ぎず、これらの実施態様に本発明の範囲が制限されるのではないことは明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、高純度のコルジセピンを簡便にかつ効率よく得ることのできる製造方法を提供することができる。
また、冬虫夏草の培養液より分離した培養上清から、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製する方法を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冬虫夏草の培養により、高純度の生理活性物質コルジセピンを簡便かつ効率よく製造および精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
冬虫夏草は、子嚢菌類に分類される菌類で、昆虫に寄生するキノコの総称である。寄生の形態は以下の通りである：（１)飛散した胞子が宿主である昆虫に取り付き、その体内に入り込む。(２)体内に入った胞子が、養分を吸収して菌糸を伸ばしながら成長し、菌糸の固まりである菌核を形成する。(３)成熟後、昆虫の体を突き破って、キノコ（子実体）を生じる。
【０００３】
中国においては、コウモリガ（Ｈｅｐｉａｌｕｓ ａｒｍｏｒｉｃａｎｕｓ）の幼虫に寄生するＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓが、１７００年代から、漢方薬として用いられてきた。近年では、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ以外の冬虫夏草についても抗菌、抗腫瘍、免疫増強、血糖降下、血管拡張作用など様々な薬理活性機能を有することが明らかにされてきており、その有効成分としてコルジセピン、エルゴステロールパーオキシド、ミリオシン、各種多糖および糖タンパク質などの存在が報告されている。これらの有効成分のなかでも、ヌクレオシド（アデノシン）のアナログであるコルジセピンは、抗菌、抗腫瘍作用を示す物質として特に注目を集めている。このように、医薬品や健康食品への利用が期待されている冬虫夏草であるが、それらは極めて小さく、また生息数が少ないため採集が困難であり、天然に生育する冬虫夏草を採集収穫するだけでは、高まりつつある需要を十分に満たすことはできない。
【０００４】
そこで、近年、冬虫夏草の菌糸体や子実体を人工的に培養する方法、さらにはそこから有効成分を抽出する方法として、いくつかの提案がなされている。例えば、冬虫夏草の菌糸体や子実体の人工的な培養方法としては、水を用いて高温加熱下で抽出した蚕の蛹の組成成分の抽出液に、炭素源、アミノ酸類、ミネラル類、またはビタミン類の中から少なくとも一種を添加した培地で冬虫夏草の菌糸体と子実体を培養する方法（特許文献１）、冬虫夏草の菌糸体を合成または天然の培地で培養するに際して、対象とする冬虫夏草の寄生した昆虫と同一種の昆虫の抽出エキスを培地に添加する方法（特許文献２）などが挙げられる。人工的に培養した冬虫夏草の菌糸体や子実体から有効成分を抽出する方法としては、特許文献３〜５などが挙げられる。すなわち、特許文献３には、無菌飼育した蚕の蛹あるいは蜘蛛の体内に、ハナサナギタケ（Ｉｓａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）等の冬虫夏草菌株の胞子懸濁液を接種して子実体を形成させ、得られた子実体からエタノールや水を用いて有効成分を抽出する方法が記載されている。また、特許文献４には、玄米などの穀類と昆虫組織体（寄生した昆虫と同一目、同一科の昆虫を使用）を主成分とし、アミノ酸類、ミネラル類、またはビタミン類の中から少なくとも一種の添加物を添加した固体培地に冬虫夏草菌を接種し、１８〜２６℃、湿度８０％以上全暗で菌糸体を発育させた後、照度１００Ｌｕｘ以上、１日６時間以上照射して子実体を培養し、培養品をそのまま粉砕する、あるいは、必要に応じて有効成分を抽出する方法が記載されている。さらに、特許文献５には、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射して冬虫夏草菌糸体を培養し、得られた菌糸体から、有機溶媒や水等で有効成分を抽出する方法が記載されている。
【０００５】
他にも、最も重要な有効成分の１つであるコルジセピンの生産性を高めるため、好適な培地・培養条件が検討されている（特許文献６および７、非特許文献１〜３等）。すなわち、特許文献６には、グルコース、スクロース、糖蜜、マルトースから選ばれた少なくとも１種を１〜６重量％、ペプトン、イースト、モルト、ミルクから選ばれた少なくとも１種を１〜７重量％、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、ＤＮＡから選ばれた少なくとも１種を０．１〜０．５重量％、あるいはさらに微量のビオチンおよび／またはビタミンＢ類を含有する冬虫夏草用培地を用いて、コルジセピンの含有率を向上させる方法が記載されている。特許文献７には、冬虫夏草用培地にコルジセピンを産生する冬虫夏草菌を接種し、暗所にて５〜２８℃で２０〜９０日間培養する第一工程と、その培養後、照度１００〜１５００００Ｌｕｘの光照射下において、３５℃以下の範囲内で第一工程より温度を上げて培養し、コルジセピンの含有量を向上させる方法が記載されている。また、非特許文献１には、通気攪拌槽を用いた深部培養において、培養開始から溶存酸素濃度（ＤＯ）を飽和の６０％に制御し、コルジセピンの比生産速度が低下する時点で３０％にするという２段階のＤＯ制御方式により、高い生産量と生産性を得る方法が記載され、非特許文献２には、炭素源として、４２ｇ／Ｌ グルコース、窒素源として、１５．８ｇ／Ｌ ペプトンを含む培地を用いて、２５℃、１１０ｒｐｍ、２０日間振盪フラスコによる培養を行い、高いコルジセピン生産性を得る方法が記載されている。さらに、非特許文献３には、窒素源として、４５ｇ／Ｌの酵母エキスを用い、８日間の振盪培養の後、８日間の静置培養を行うことにより、効率的にコルジセピンを得る方法が記載されている。
【０００６】
しかしながら、従来の冬虫夏草の人工培養法は、培地に蛹粉、蛹の抽出液、および／または昆虫の抽出液を用いたり、昆虫の体内に菌を接種したり、温度、ｐＨ、光照射を細かく制御したりするなど、操作が煩雑で実用化を考慮した大量生産は困難である。また、コルジセピンを得ようとした場合、その収量は、非特許文献１に記載の方法で培地中に０．１９５ｇ／Ｌ、非特許文献２に記載の方法で０．３４５ｇ／Ｌ、非特許文献３に記載の方法で２．２ｇ／Ｌ、特許文献６に記載の方法では菌体１ｇあたり０．０２〜０．１ｇ、特許文献７に記載の方法では菌体１ｇあたり０．０５〜０．１ｇと、いずれも十分であるとはいえない。
【０００７】
また、生産したコルジセピンの精製方法については、検討例が少なく効率的な方法が知られていない。例えば特許文献８では、はじめに冬虫夏草を粉末化した後エタノールで抽出し、抽出物を濃縮乾固させ、次に乾固物を蒸留水に溶解した後、ブタノールで抽出し抽出物を濃縮乾固させた後、さらに、この乾固物をシリカゲルクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分画するという、非常に煩雑な方法によって、高純度のコルジセピンを得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−４２６９１号公報
【特許文献２】特開平１０−１１７７７０号公報
【特許文献３】特開２００２−２７２２６７号公報
【特許文献４】特開２００３−１１６５２２号公報
【特許文献５】特開２００４−３４４０２７号公報
【特許文献６】特開２００４−２４２５０６号公報
【特許文献７】特開２００４−２６７００４号公報
【特許文献８】特表２０１０−５０３７２９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biotechnol. Prog. 20, 1408-1413 (2004)
【非特許文献２】Process Biochemistry 40, 1667-1672 (2005)
【非特許文献３】Biochem. Eng. J. 33, 193-201 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、高純度のコルジセピン（３’−デオキシアデノシン）を簡便にかつ効率よく製造する方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、コルジセピンを簡便にかつ高回収率で分離精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、冬虫夏草の培養条件を鋭意検討した結果、ろ過滅菌した培養液を用いることによって、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させ得ることを見いだした。また、得られた培養液から培養上清を分離し、晶析により、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りである：
［１］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養し、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる工程を含む、コルジセピンの製造方法。
［２］冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、上記［１］に記載の製造方法。
［３］冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、上記［２］に記載の製造方法。
［４］冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］さらに、冬虫夏草を培養して得た培養液から培養上清を分離し、該培養上清から晶析によりコルジセピンを分離精製する工程を含む、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］コルジセピンを分離精製する工程が、培養上清を粉末化して溶媒に再溶解する工程を含む、上記［５］に記載の製造方法。
［７］粉末化が凍結乾燥により行われる、上記［６］に記載の製造方法。
［８］溶媒が水である、上記［６］または［７］に記載の製造方法。
［９］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、３０〜９０℃で水に再溶解して得た水溶液を、０〜１０℃に冷却して析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
［１０］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５として、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
［１１］ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に３０〜９０℃で再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５とし、０〜１０℃に冷却して、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
［１２］冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、上記［９］〜［１１］のいずれかに記載の分離精製方法。
［１３］冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、上記［１２］に記載の分離精製方法。
［１４］冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、上記［９］〜［１３］のいずれかに記載の分離精製方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、冬虫夏草の培養により、高純度のコルジセピンを簡便にかつ効率よく製造することができる。
また、冬虫夏草の培養液より分離した培養上清から、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１−３及び比較例１−３の製造方法により、培地中に産生されるコルジセピンの濃度の経時変化を比較したグラフである。オープンサークルは実施例１−３、クローズドサークルは比較例１−３についての結果を示す。
【図２】実施例１−３の製造方法により製造されたコルジセピンのＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図３】実施例２の製造方法により分離精製されたコルジセピンのＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図４】実施例３−１の製造方法により分離精製されたコルジセピンのＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明のコルジセピンの製造方法は、ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養し、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる工程を含む。
【００１７】
本発明に用いる冬虫夏草は、野生株の冬虫夏草であっても、人工栽培されている冬虫夏草であってもコルジセピンを産生するものであれば、特に限定されない。好ましくは、産生したコルジセピンを菌体外に排出するものがよい。例えば、コルジセプス属のＣｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ３０３７７、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ２６８４８、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ３４１６４、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＡＴＣＣ ３４１６５等が適している。コルジセピン産生量の観点から、さらに好ましくは、特開２００９−３４０４５号公報に開示した、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株を用いることができる。「親株と菌学的性質の異なる菌株」としては、８−アザアデニン、８−アザグアニン等のアデニンおよび／またはグアニンのアナログ存在下で生存可能な菌株が、高いコルジセピン産生性を有する可能性があるため、好ましく選抜される。本発明においては、コルジセピン高産生株として、コルジセピン産生量が親株の１．３倍以上のものを用いることが好ましく、１．５倍以上のものを用いることがより好ましい。かかる突然変異株としては、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７より得られた変異株がより好ましく、茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５株（受託日：２００７年７月５日）が、特に好ましい。
【００１８】
本発明の冬虫夏草の培養では、通常菌糸体の培養に用い得る培養液を用いることができ、該培養液は成分として炭素源および窒素源、ならびに／または他の添加物を含む。利用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、糖蜜等が挙げられ、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスティープ、小麦胚芽等が利用可能であるが、酵母エキスが好ましい。また、グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、システイン等のアミノ酸、アデニン、グアニン、アデノシン等の核酸関連物質のいずれか１種、または複数種を添加してもよい。
【００１９】
上記培地成分の配合量としては、例えば炭素源は、水を含む培地全重量の１〜２０重量％、好ましくは２〜１５重量％であり、窒素源は培地全重量の０．２５〜２０重量％、好ましくは０．５〜１５重量％である。アミノ酸を添加する場合は、その配合量は培地全重量の０．５〜５重量％、好ましくは１〜３重量％であり、核酸関連物質を添加する場合は、その配合量は培地全重量の０．０５〜０．６重量％、好ましくは０．１〜０．４重量％である。
【００２０】
具体的には、例えばポテトデキストロース寒天プレート、またはグルコース ２０ｇ／Ｌ、ペプトン ２．５ｇ／Ｌ、および酵母エキス ７．５ｇ／Ｌを含有する寒天プレートの中心に、一白金耳の菌糸体を接種し、１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃で、７〜２１日間、好ましくは１０〜１６日間静置培養したものを種菌として用いることができる。上記のプレート上に増殖した菌蓋の周縁部の菌糸体をくり抜き、培養瓶内の培養液表面に浮かべることによって、コルジセピン産生のための液体表面培養を行うことができる。培養温度は、１５〜３５℃、好ましくは２０〜３０℃である。前記培養液の量は、液深さが１〜１０ｃｍ、好ましくは２〜５ｃｍとなるように設定することによって、コルジセピン産生量が増大する。前記培養液の滅菌法としては、高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）や低温滅菌、ろ過滅菌などの様々な方法を採用することが可能であるが、グルコースなどの還元性を有する物質を含む培養液の場合には、高圧蒸気滅菌が好ましくない場合がある。特に高濃度の培地成分を含有する培養液の場合には、発酵阻害物を生じる可能性があるため、培養によるコルジセピンの製造においては、コルジセピン産生量を向上させるためには、ろ過滅菌が好ましい。ろ過滅菌については、通常、孔径０．２０μmのメンブランフィルターを用いて雑菌等の除去を行うが、雑菌等の混入が認められなければ、他の材質、孔径のものを用いてもよい。
【００２１】
冬虫夏草の菌糸体は、上記培養液中の成分を栄養源として、培養液表面において増殖し、コルジセピンを産生する。ここで、産生されたコルジセピンの９０％以上は培養液中に分泌される。従って、産生されたコルジセピンを回収するには、はじめに培養液から菌糸体を分離して、培養上清を得る必要がある。菌糸体を分離する方法としては、遠心分離やろ過など様々な方法が利用可能であり、特に限定されない。
【００２２】
分離した培養上清には、コルジセピンが高濃度で含まれており、コルジセピンの溶解度差を利用した様々な晶析法でコルジセピンの回収が可能である。例えば、培養上清を減圧濃縮することにより、溶解度を超えて上清液中に析出したコルジセピンを沈殿として回収することができる。また、予め凍結乾燥や真空乾燥などによりコルジセピンを含む培養上清を粉末化した後、これを高濃度となるように溶媒に溶解し、次いで晶析させることも可能である。高濃度に溶解したコルジセピンの晶析方法としては、溶液の温度を変化させる方法やｐＨを変化させる方法、コルジセピン溶液にコルジセピンの貧溶媒を加える方法などを用いることが可能である。本発明において用い得るコルジセピンの貧溶媒としては、アセトン、エタノール、プロパノール等が挙げられる。
【００２３】
コルジセピンを溶解する溶媒としては、コルジセピンと反応せず毒性の低いもの、また沸点の低いものであれば特に限定されないが、水が好ましい。コルジセピンの水に対する溶解度は、高温で高く、低温で低くなる。従って、高温でコルジセピンを溶解した後に冷却することによって、コルジセピンの晶析を行うことができる。コルジセピンを溶解する温度としては、コルジセピンの加水分解等が生じない限り特に限定されないが、溶媒として水を用いた場合には３０〜９０℃が適しており、好ましくは４０〜８０℃である。また、溶解したコルジセピンを析出させる温度としては、溶液が凍結しない範囲であれば特に限定されないが、２０℃以下が適しており、好ましくは０〜１０℃である。
【００２４】
また、コルジセピンの水に対する溶解度は、中性付近で低く、酸性領域やアルカリ性領域で高い。従って、コルジセピンを酸性あるいはアルカリ性の水溶液に高濃度に溶解した後、水溶液のｐＨを中性付近に変化させることにより、コルジセピンの晶析を行うことができる。コルジセピンを溶解させるｐＨとしては、４未満、あるいは１２．５超が好ましく、３未満或いは１３超がより好ましい。また、溶解したコルジセピンを析出させるｐＨとしては、４〜１２．５が好ましく、５〜１０がより好ましい。
【００２５】
さらに本発明においては、上記した温度変化とｐＨ変化を組み合わせて、コルジセピンの晶析を行うこともできる。
すなわち、培養上清の凍結乾燥粉末を、ｐＨが好ましくは４未満、より好ましくは３未満の酸性の水溶液、またはｐＨが好ましくは１２．５、より好ましくは１３を超えるアルカリ性の水溶液に、３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃で再溶解し、次いで水溶液のｐＨを好ましくは４〜１２．５、より好ましくは５〜１０とし、２０℃以下、好ましくは０〜１０℃に冷却して、析出するコルジセピンを回収する。
【００２６】
析出したコルジセピンは、遠心分離やろ過により回収することができる。なお、遠心分離やろ過は、一般的に析出した結晶を分取する際に行われる方法、条件等で行うことができる。たとえば遠心分離は、製造スケールに応じて、小型遠心分離機、卓上遠心分離機、工業用遠心分離機等により、９０００〜１５０００×ｇにて１５〜３０分程度行う。またろ過は沈殿物のろ過分取に適するろ紙を用いて行うことができるが、ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙等、ＪＩＳ規格Ｐ ３８０１［ろ紙（化学分析用）］に規定される５種Ａに相当するろ紙等を用いて行うことが好ましい。
さらに、回収したコルジセピンを低温の水で洗浄することにより、コルジセピン純度を向上させることができる。
【００２７】
回収したコルジセピンは、風乾、凍結乾燥等により乾燥する。保存安定性等の観点からは、凍結乾燥することが好ましい。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明について、実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］冬虫夏草変異体の液体表面培養によるコルジセピンの製造
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の突然変異体Ｇ８１−３（産総研特許生物寄託センター 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）をポテトデキストロース寒天プレート上にて、２５℃、１３日間前培養し、種菌とした。表１に示す組成の本培養培地１００ｍＬを、メンブランフィルター（「Ａ０２０Ａ０４７Ａ」、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２μｍ）を用いてろ過滅菌した後、静置培養用の容器（容量５００ｍＬ）に入れ、次に、前培養により３．５〜４．５ｃｍに成長した種菌の菌蓋を滅菌済み円筒形カッター（１ｃｍ）でくり抜き、本培養培地に浮かべ、静置培養を行った。
【００３０】
【表１】
【００３１】
培養液を経時的にサンプリングし、孔径０．４５μmのメンブランフィルター（「ＳＬＨＰＸ１３ＮＫ」、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過し、ろ液のコルジセピン濃度をＨＰＬＣにより測定した。コルジセピン濃度が最大値に達したことを確認した後、本培養を終了し、培地より菌体を遠心分離（１５０００×ｇ、２０分間）により除去した後、培地をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙でろ過し培養上清を分離回収した。
【００３２】
ここでＨＰＬＣの測定条件は以下の通りである。
カラム：東ソー製ＴＳＫ−ＧＥＬ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍ ＩＤ×２５．０ｃｍ）
移動相：メタノール：０．１容量％リン酸＝２：９８（容量比）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２０μＬ
ピーク検出：ＵＶ検出器（２６０ｎｍ）
【００３３】
なお、実施例１において、メンブランフィルターによるろ過滅菌の代わりに、本培養の培地をオートクレーブ滅菌したものを用いて同様に培養し、培養上清を得た（比較例１）。実施例１および比較例１の各製造において、最大コルジセピン産生量（ｇ／Ｌ−培地）と、最大産生量に到達するまでの培養期間を表２に示した。
【００３４】
【表２】
【００３５】
また、表２の実施例１−３および比較例１−３の製造方法におけるコルジセピン濃度の経時変化を図１に、実施例１−３の製造方法において、得られた培養上清についてのＨＰＬＣによる代表的な分析結果の例を図２に示した。表２より、ろ過滅菌した培地を用いた場合（実施例１−１〜１−４）には、オートクレーブ滅菌した培地を用いた場合（比較例１−１〜１−４）の１．３〜２．１倍の最大コルジセピン産生量が得られ、さらに、最大産生量に到達するまでの培養期間も、最大２７％短縮されたことが示された。このように、培地の滅菌法としてろ過滅菌を用いることにより、生産効率を向上させることが可能であった。なお、グルコース１２０．７ｇ／Ｌおよび酵母エキス１３１．３ｇ／Ｌを含有する培地をオートクレーブ滅菌して用いた比較例１−５の製造方法では、菌体の生育が見られなかった。また、図２より、培養上清に含まれる主たる不純物は、保持時間においてコルジセピンの直後に出現するピーク（以下Main impurityと称す）であることが示された。
【００３６】
［実施例２］温度変化による晶析を利用したコルジセピンの精製
コルジセピンの精製は、Main impurityの含有量を減少させることを主目的として行った。実施例１−３の製造方法により得られた培養上清を凍結乾燥し、コルジセピン９．６ｇ相当を含む乾燥品をコルジセピン濃度が約２０ｇ／Ｌとなるように蒸留水４８０ｍＬに添加し６０℃で溶解させた。加温した状態で、微量の不溶物をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いてろ過した後（ろ液の回収量は４２０ｍＬであった）、アルミ製のバットに移し、５℃の冷蔵庫内に静置した。溶液の温度、析出したコルジセピン量および析出物中のMain impurity量の割合を経時的にモニターし、ほぼ定常状態に到達した３６時間後に析出物をろ過により回収した。ろ紙としてＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａを用い、ろ過した後、氷冷水を用いて析出物を洗浄した。洗浄したコルジセピンを凍結乾燥し、６．５４ｇの精製コルジセピンを得た（精製収率６６％）。得られたコルジセピンのＨＰＬＣによる分析結果を図３に示した。２６０ｎｍの紫外線で検出されるピーク面積から算出したMain impurityの含有率は、培養上清では３．８〜４．０％であったが、本実施例による精製後は１．０％に減少した。すなわち、コルジセピンの純度は、約９６％から９９％に上昇した。
【００３７】
［実施例３］温度変化による晶析を利用したコルジセピンの再精製
実施例２の精製方法により得られたコルジセピンには、わずかな着色が見られた。そこで、さらに高純度のコルジセピンを得るために、再度温度変化による晶析を利用した精製を行った。はじめに、実施例２の精製方法により得られたコルジセピン２．００ｇ、１．５０ｇ、１．００ｇに、それぞれ蒸留水４００ｍＬ、３００ｍＬ、２００ｍＬを添加し、溶解させた（それぞれ、実施例３−１、３−２、３−３）。この溶液をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙でろ過することにより、前工程で混入したろ紙繊維等を取り除いた。各ろ液を凍結乾燥後、乾燥品に蒸留水各５０ｍＬを添加し、６０℃に加温して完全に溶解させた。溶液を５℃の冷蔵庫内で２４時間静置した後、析出物をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いてろ過し、回収した。最終的なコルジセピン回収量と精製品の純度を表３に示した。実施例３−１の再精製方法により得られたコルジセピンにおけるMain impurityの含有率は、約０．３％に減少した。すなわち、コルジセピンの純度は約９９．７％まで高めることができた。実施例３−１の再精製方法により得られたコルジセピンのＨＰＬＣによる分析結果を、図４に示した。
【００３８】
【表３】
【００３９】
［実施例４］ｐＨ変化による晶析を利用したコルジセピンの精製
実施例１−３の製造方法により得られた培養上清を凍結乾燥し、得られた乾燥品８．６８ｇ（コルジセピン含有量１．９１ｇ）を２０ｍＬの蒸留水に懸濁した後、５Ｎ塩酸水溶液を少しずつ添加し、温度を２５℃に保ちながら６９ｇ／Ｌのコルジセピン溶液を調製した。この溶液のｐＨは２．７であった。この溶液を９１００×ｇで２０分間遠心分離し、若干含まれている不溶成分を取り除いた。得られた上清の温度を２５℃に保ちながら、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを５．３に調整したところ、多量の沈殿が生成した。この沈殿をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いて回収し、氷冷水を用いて洗浄した後、凍結乾燥し、１．３６ｇの精製品を得た。最終的なコルジセピンの純度と回収率を、表４に示した。ｐＨ変化による晶析により、純度９９％以上のコルジセピンを７０％以上の高い収率で回収できることが確認された。
【００４０】
［実施例５］ｐＨ変化および温度変化による晶析を利用したコルジセピンの精製
実施例４と同様にして得た培養上清の乾燥品７．１４ｇ（コルジセピン含有量１．５７ｇ）を３０ｍＬの蒸留水に懸濁した後、５Ｎ塩酸水溶液を少しずつ添加し、温度を２５℃に保ちながら４２．４ｇ／Ｌのコルジセピン溶液を調製した。この溶液のｐＨは２．７であった。この溶液を９１００×ｇで２０分間遠心分離し、若干含まれている不溶成分を取り除いた。次いで、得られた上清の温度を２５℃に保ちながら５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを６．６に調整した。さらに４℃の冷蔵庫内で３時間冷却したところ、多量の沈殿が生成した。この沈殿をＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．５Ａろ紙を用いて回収し、氷冷水を用いて洗浄した後、凍結乾燥し、１．１７ｇの精製品を得た。最終的なコルジセピンの純度と回収率を、表４に併せて示した。ｐＨ変化と温度変化を組み合わせた晶析により、純度９８％以上のコルジセピンを７５％以上の高い収率で回収できることが確認された。
【００４１】
【表４】
【００４２】
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者であれば、このような具体的技術は好適な実施態様に過ぎず、これらの実施態様に本発明の範囲が制限されるのではないことは明白であろう。従って、本発明の実質的な範囲は請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、高純度のコルジセピンを簡便にかつ効率よく得ることのできる製造方法を提供することができる。
また、冬虫夏草の培養液より分離した培養上清から、コルジセピンを高純度かつ高回収率で分離精製する方法を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養し、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる工程を含む、コルジセピンの製造方法。
【請求項２】
冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
さらに、冬虫夏草を培養して得た培養液から培養上清を分離し、該培養上清から晶析によりコルジセピンを分離精製する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
コルジセピンを分離精製する工程が、培養上清を粉末化して溶媒に再溶解する工程を含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
粉末化が凍結乾燥により行われる、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
溶媒が水である、請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、３０〜９０℃で水に再溶解して得た水溶液を、０〜１０℃に冷却して析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
【請求項１０】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５として、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
【請求項１１】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に３０〜９０℃で再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５とし、０〜１０℃に冷却して、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
【請求項１２】
冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の分離精製方法。
【請求項１３】
冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、請求項１２に記載の分離精製方法。
【請求項１４】
冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の分離精製方法。
【請求項１】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養し、培養液中に高濃度でコルジセピンを産生させる工程を含む、コルジセピンの製造方法。
【請求項２】
冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
さらに、冬虫夏草を培養して得た培養液から培養上清を分離し、該培養上清から晶析によりコルジセピンを分離精製する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
コルジセピンを分離精製する工程が、培養上清を粉末化して溶媒に再溶解する工程を含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
粉末化が凍結乾燥により行われる、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
溶媒が水である、請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、３０〜９０℃で水に再溶解して得た水溶液を、０〜１０℃に冷却して析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
【請求項１０】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５として、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
【請求項１１】
ろ過滅菌した培養液を用いて冬虫夏草を培養して得た培養液から分離した培養上清を凍結乾燥した後、ｐＨが４未満の酸性またはｐＨが１２．５を超えるアルカリ性の水溶液に３０〜９０℃で再溶解し、次いで水溶液のｐＨを４〜１２．５とし、０〜１０℃に冷却して、析出するコルジセピンを回収する、コルジセピンの分離精製方法。
【請求項１２】
冬虫夏草が、冬虫夏草属菌糸体に高エネルギーイオンビームを照射し、該照射処理をした菌糸体から親株と菌学的性質の異なる菌株を選抜して得られた冬虫夏草の突然変異株である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の分離精製方法。
【請求項１３】
冬虫夏草の突然変異菌株が、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ＮＢＲＣ ９７８７の変異株（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１３１５）である、請求項１２に記載の分離精製方法。
【請求項１４】
冬虫夏草の培養が液体表面培養により行われる、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の分離精製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−１１１０６０（Ｐ２０１３−１１１０６０Ａ）
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６２９９５（Ｐ２０１１−２６２９９５）
【出願日】平成２３年１１月３０日（２０１１．１１．３０）
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月３０日（２０１１．１１．３０）
【出願人】（５０４１４５３２０）国立大学法人福井大学 (287)
【Ｆターム（参考）】
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