本発明は、アテローム硬化性プラーク物質によって生成されるコレステロールオゾン化生成物の検出ならびにコレステロールの蓄積および酸化に関する血管状態の検出方法に関する。本発明によれば、コレステロールオゾン分解生成物は、アテローム硬化性プラーク中に存在する。さらに、患者から採取した組織および体液中のコレステロールのオゾン化生成物の検出および定量は、アテローム硬化性病変が患者に実際に存在するかどうかの正確な指標である。したがって、本発明は、アテローム硬化性病変が患者中に存在するかどうかを簡潔かつ正確に検出する方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年９月５日提出の米国特許仮出願番号６０／５００，５９３号および２００３年１１月６日提出の米国特許仮出願番号６０／５１７，８２１号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（政府の権利に関する記述）
本明細書中に記載の発明を、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＰＯ１ＣＡ ２７４８９の米国政府支援を使用して実施した。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、コレステロールオゾン化（ｏｚｏｎａｔｉｏｎ）生成物がアテローム硬化性病変によって生成されるという発見に関する。本発明は、アテローム性動脈硬化症および／または心血管疾患などのコレステロール関連血管病態を有する患者を診断、検出、およびモニタリングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
全ての人が血清コレステロールレベルを慎重にモニタリングすることを忠告され続けており、且つ自由な食事および運動不足によって動脈プラーク中にコレステロールが蓄積し、アテローム性動脈硬化症および冠状動脈性心疾患のリスクが増大し得ることが常に指摘されている。それにも関わらず、高血清コレステロールレベルがこのようなリスクの指標である一方で、実際に構築された問題のアテローム硬化性プラークが存在するという証拠はない。
【０００５】
血清コレステロールは、主に、低密度リポタンパク質（ＬＤＬコレステロール）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬコレステロール）、および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬコレステロール）中のトリグリセリドと関連することが知られている。多数の長期臨床試験からの統計上の証拠は、ＨＤＬコレステロールの比率が高くてＬＤＬコレステロールの比率が低い場合に相対危険度が低くなることを示す。ＨＤＬコレステロールは、そのレベルが過度に低くない（すなわち、３０ｍｇ／ｄＬ未満）場合に有益である。ＶＬＤＬコレステロールはいかなるリスクの決定要因に関与しないが、高トリグリセリド自体が深刻な問題であり得る。他方では、ＬＤＬコレステロールの比率が高く且つＨＤＬコレステロールの比率が低いことは、アテローム性動脈硬化症および冠状動脈性心疾患のリスクがより高くなることの指標である。
【０００６】
アテローム性動脈硬化症のリスクと高ＬＤＬコレステロールレベルとの間に強い相関関係が存在する場合でさえ、いくつかの研究では、血清ＬＤＬおよびＨＤＬコレステロールレベルの測定が不十分にしか行われておらず、しばしば信頼できない結果が得られていることが示されている。Ｓｕｐｅｒｋｏ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ−−Ａ Ｈｅｌｐ ｏｒ Ｈｉｎｄｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＪＡＭＡ ２５６：２７１４−２７１７（１９８６）；Ｗａｒｎｉｃｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．ＨＤＬ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｅｓｔ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１６９−１７０（１９８０）；ａｎｄ Ｇｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｌａｃｅ ｏｆ ＨＤＬ ｉｎ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ａ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．１４９：５０５−５１０（１９８９）を参照のこと。Ｇｒｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．の論文は、ＨＤＬコレステロールの測定値の研究室間変動係数が３８％もの高さであることを報告している。２０００の研究所による同一のＨＤＬコレステロールサンプルの測定に関するＣｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓによる１９８７年の報告は、３３％を超える測定の基準値が５％を超えて異なっていたことを示した。同一の方法を使用した群の間の研究室間変動係数は１６．５％に改善されたが、このような分散度は、ほとんどの試験結果が不正確すぎて臨床目的でのいかなる予測値も得られないことを依然として示す。この理由のために、総コレステロール：ＨＤＬコレステロール比はもはやリスクアセスメントで使用されない。
【０００７】
典型的な脂質プロフィール研究では、総コレステロールおよびトリグリセリドレベルを血清サンプルから直接測定する。次いで、サンプルを、ＬＤＬコレステロールおよびＶＬＤＬコレステロールを沈殿して取り出す薬剤で処理する。このようなサンプル処理後に上清中に残存したＨＤＬコレステロールを測定する。ＶＬＤＬコレステロールは、トリグリセリドの一定の比率（例えば、０．２）を取る。次いで、ＬＤＬコレステロールを、総コレステロールからＨＤＬコレステロール値およびＶＬＤＬコレステロール値を引くことによって間接的に計算する。これら３つの独立した測定から生じるエラーの増加によってＬＤＬコレステロールの測定値の全体的な精度および正確さが最も小さくなるにもかかわらず、心血管へのリスクの評価に最も有意であり得る。このような不正確さのため、経時的なＬＤＬコレステロール低下療法により臨床的な進展があるかどうか意図的にモニタリングし証明することは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、血清ＬＤＬコレステロールの測定値はしばしば不正確である。このような不正確さは、ＬＤＬコレステロールレベルが実際に問題のあるアテローム硬化性病変が存在することを証明しないという事実と併せて、問題のあるコレステロール負荷アテローム硬化性病変が患者に存在するかどうかを決定するための比較的簡潔であり、信頼でき、且つ再現性のある方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明によれば、コレステロールオゾン分解生成物は、アテローム硬化性プラーク中に存在する。さらに、患者から採取した組織および体液中のコレステロールのオゾン化生成物の検出および定量は、アテローム硬化性病変が患者に実際に存在するかどうかの正確な指標である。したがって、本発明は、アテローム硬化性病変が患者中に存在するかどうかを簡潔かつ正確に検出する方法を提供する。本発明の方法は、コレステロールのオゾン化生成物が患者から採取した試験サンプル中に存在するかどうかを検出する工程を含む。本発明はまた、哺乳動物中のアテローム硬化性プラーク形成の程度の診断およびモニタリングの基準としての生体サンプル中に存在するコレステロールオゾン化生成物の定量を意図する。
【００１０】
本発明の１つの態様は、アテローム硬化性プラーク中で生成されたコレステロールの単離されたオゾン化生成物である。このようなコレステロールのオゾン化生成物は、例えば、式４ａ〜１５ａ、３ｃ、または７ｃ：
【００１１】
【化６７】

【００１２】
【化６８】

【００１３】
【化６９】

【００１４】
【化７０】

【００１５】
【化７１】

のいずれか１つを有し得る。
【００１６】
本発明の別の態様は、亜硫酸水素付加体、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ダンシルヒドラゾン、セミカルバゾン、またはＴｏｌｌｉｎｓ試験の生成物を含むコレステロールオゾン化生成物の検出可能な誘導体であって、前記コレステロールのオゾン化生成物がアテローム硬化性プラーク内に生成される、コレステロールオゾン化生成物の検出可能な誘導体である。
【００１７】
本発明の別の態様は、式４ｂまたは式４ｃ：
【００１８】
【化７２】

を有するコレステロールオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体を含む。
【００１９】
本発明の別の態様は、式５ｂ：
【００２０】
【化７３】

を有するコレステロールオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、式６ｂ〜１５ｂまたは１０ｃ：
【００２２】
【化７４】

【００２３】
【化７５】

【００２４】
【化７６】

【００２５】
【化７７】

【００２６】
【化７８】

のいずれか１つを有するコレステロールオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体である。
【００２７】
本発明の別の態様は、式４ｄ：
【００２８】
【化７９】

を有するコレステロールオゾン化生成物のダンシルヒドラゾン誘導体を含む。
【００２９】
本発明の別の態様は、式５ｃ：
【００３０】
【化８０】

を有するコレステロールオゾン化生成物のダンシルヒドラゾン誘導体を含む。
【００３１】
本発明の別の態様は、式１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、１５ｃ、または３ｃを有するハプテンである。
【００３２】
本発明の別の態様は、コレステロールのオゾン化生成物に結合し得る単離された抗体である。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体が結合し得るコレステロールのオゾン化生成物は、式４ａ〜１５ａ、３ｃ、４ｃ、７ｃのいずれか１つを有する化合物であり得る。いくつかの実施形態では、コレステロールのオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体（例えば、式４ｂ〜１５ｂ、４ｃ、または１０ｃのいずれか１つを有する化合物）に結合し得る単離された抗体。本発明の抗体は、例えば、式１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、１５ｃ、または３ｃを有するハプテンに対して惹起し得る。
【００３３】
本発明の別の態様は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２７またはＰＴＡ−５４２８を有するハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５：６またはＫＡ１−７Ａ６：６に由来する単離された抗体である。
【００３４】
本発明の別の態様は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０を有するハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６：４またはＫＡ２−１Ｅ９：４に由来する単離された抗体である。
【００３５】
本発明の別の態様は、コレステロールのオゾン化生成物が患者から得た試験サンプル中に存在するかどうかの検出による患者のアテローム性動脈硬化症の検出方法である。オゾン化生成物は、アテローム硬化性プラークによって生成され得る。試験サンプルは、例えば、血清、血漿、血液、アテローム硬化性プラーク物質、尿、または脈管組織であり得る。アテローム性動脈硬化症の検出方法はまた、試験サンプル中に存在するコレステロールオゾン化生成物の定量を含み得る。
【００３６】
１つの実施形態では、アテローム性動脈硬化症の検出方法は、試験サンプルと、亜硫酸水素塩、アンモニア、シッフ塩基、芳香族または脂肪族ヒドラジン、ダンシルヒドラジン、ジェラード（Ｇｅｒａｒｄ）試薬、Ｔｏｌｌｉｎｓ試験試薬とを反応させる工程と、このような反応によって形成されたコレステロールのオゾン化生成物の誘導体を検出する工程とを含み得る。
【００３７】
別の実施形態では、アテローム性動脈硬化症の検出方法は、試験サンプルをヒドラジン化合物と反応させてコレステロールのオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体を生成する工程を含み得る。例えば、ヒドラジン化合物は、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンであり得る。
【００３８】
別の実施形態では、アテローム性動脈硬化症の検出方法は、試験サンプルをダンシルヒドラジンと反応させてコレステロールのオゾン化生成物のダンシルヒドラゾン誘導体を生成する工程を含み得る。例えば、ダンシルヒドラゾン誘導体は、式４ｄまたは５ｃを有し得る。
【００３９】
別の実施形態では、アテローム性動脈硬化症の検出方法は、試験サンプルとコレステロールのオゾン化生成物に結合し得る抗体と接触させる工程を含み得る。本明細書中に記載の任意の抗体を、本方法で使用し得る。
【００４０】
本発明の別の態様は、コレステロールのオゾン化生成物が患者から得た試験サンプル中に存在するかどうかを検出する工程と、前記オゾン化生成物が式５ａを有する化合物であることとを含む、コレステロールのオゾン化生成物が患者のアテローム硬化性プラークによって放出されるかどうかを検出する方法を含む。コレステロールのオゾン化生成物がアテローム硬化性プラークによって放出されるかどうかを検出する方法はまた、試験サンプル中に存在するコレステロールオゾン化生成物を定量する工程を含み得る。
【００４１】
本発明の別の態様は、患者由来の試験サンプルに２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを添加する工程と、コレステロールのオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体が試験サンプル中に存在するかどうかを検出する工程を含む、患者のアテローム性動脈硬化症の検出方法を含む。ヒドラゾン誘導体が、式４ｂ、４ｃ、５ｂ、６ｂ、７ｂ、８ｂ、９ｂ、１０ｂ、１０ｃ、１１ｂ、１２ｂ、１３ｂ、１４ｂ、または１５ｂのいずれか１つを有する化合物であり得る。
【００４２】
本発明の別の態様は、マクロファージを試験サンプルと接触させる工程と、前記マクロファージによる脂質取り込みが増加するかどうかを決定する工程とを含む、コレステロールオゾン分解生成物が試験サンプル中に存在するかどうかを検出する方法を含む。
【００４３】
本発明の別の態様は、マクロファージを試験サンプルと接触させる工程と、前記マクロファージによる脂質取り込みが増加するかどうかを決定する工程とを含む、患者のアテローム性動脈硬化症の検出方法を含む。
【００４４】
本発明の別の態様は、低密度リポタンパク質を試験サンプルと接触させる工程と、前記低密度リポタンパク質の二次構造が変化するかどうかを観察する工程とを含む、試験サンプル中のコレステロールオゾン分解生成物の検出方法を含む。
【００４５】
本発明の別の態様は、低密度リポタンパク質を患者から得た試験サンプルと接触させる工程と、前記低密度リポタンパク質の二次構造が変化するかどうかを観察する工程とを含む、患者のアテローム性動脈硬化症の検出方法を含む。
【００４６】
本発明の別の態様は、アポタンパク質Ｂ_１００を試験サンプルと接触させる工程と、前記アポタンパク質Ｂ_１００の二次構造が変化するかどうかを観察する工程とを含む、試験サンプル中のコレステロールオゾン分解生成物の検出方法を含む。
【００４７】
本発明の別の態様は、アポタンパク質Ｂ_１００を患者から得た試験サンプルと接触させる工程と、前記アポタンパク質Ｂ_１００の二次構造が変化するかどうかを観察する工程とを含む、患者のアテローム性動脈硬化症の検出方法を含む。
【００４８】
低密度リポタンパク質またはアポタンパク質Ｂ_１００の二次構造を円偏光二色性によって観察し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、コレステロールのオゾン化生成物の検出方法を提供する。コレステロールのオゾン化生成物の検出のためのキットおよび試薬も提供する。これらの方法、キット、および試薬は、構築されたコレステロールに関連する血管状態の検出に有用である。例えば、方法、キット、および試薬は、アテローム性動脈硬化症などの炎症性動脈疾患の診断および予後のモニタリングに有用である。
【００５０】
（コレステロールのオゾン化）
本発明によれば、コレステロールは、オゾンなどの活性酸素種によってアテローム硬化性動脈内で酸化する。この過程によって多数のコレステロールオゾン化生成物が生成され、アテローム性動脈硬化症患者から採取した組織または流動物サンプル中で検出し得る。コレステロールオゾン化生成物の検出により、アテローム性動脈硬化症などの炎症性動脈疾患が診断される。
【００５１】
コレステロールは、以下の構造（３）：
【００５２】
【化８１】

を有する。このような高レベルの血中コレステロールレベルは、アテローム硬化性プラークの形成尤度と相関する一方で、アテローム硬化性プラークが患者の動脈系に存在することを断定的に示さない。患者が実際にアテローム硬化性病変を有するかどうかを確認するために、迅速なＣＡＴスキャン、画像化手段を使用した色素注入、または浸潤性の内視鏡手順もしくはカテーテル留置手順などの高価な試験が現在使用されている。
【００５３】
しかし、本発明によれば、実際のアテローム硬化性プラークの存在を、コレステロールのオゾン化生成物の検出によって検出し得る。コレステロールが動脈中に蓄積された場合、アテローム硬化性プラークが形成され得る。特定の機構に限定されることを望まないが、マクロファージ、好中球、および他の免疫細胞がアテローム硬化性病変内に陥り、オゾンなどの活性酸素種を放出するようである。生成された活性酸素種は病変中のコレステロールと反応し、コレステロールが患者中で検出し得る多数の生成物に酸化される。したがって、患者から採取したサンプル中でコレステロールオゾン化のための２つの事象が起こるようである。第１に、アテローム硬化性プラーク内でコレステロールが実質的に構築されなければならない。第２に、アテローム性動脈硬化症が、活性酸素種が生成される段階に進行しなければならない。これら２つの事象が並行して起こり、コレステロールオゾン化生成物が形成される。コレステロールの構築およびオゾン生成が実質的に他の状況で起こらないため、コレステロールオゾン化生成物の検出は、アテローム性動脈硬化症などの炎症性動脈病態が患者に存在するかどうかの正確な指標である。さらに、本発明によれば、アテローム性動脈硬化症患者から採取した生体サンプル（例えば、血清）内のコレステロールオゾン化生成物の存在量は、患者のアテローム性動脈硬化症の重症度の指標である。
【００５４】
本発明によれば、多数のコレステロールオゾン化生成物が同定された。例えば、コレステロール３が酸化された場合、ｓｅｃｏ−ケトアルデヒド４ａおよびそのアルドール付加体５ａは、形成された主な生成物である。
【００５５】
【化８２】

さらに、化合物６ａ〜１５ａおよび７ｃのような構造を有するコレステロールオゾン化生成物も認められる。
【００５６】
【化８３】

【００５７】
【化８４】

【００５８】
【化８５】

本発明によれば、ｓｅｃｏ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加体５ａ、および関連化合物６ａ〜１５ａおよび７ｃは、アテローム性動脈硬化症を罹患した患者のアテローム硬化性プラークおよび血流中に存在し得る。さらに、ｓｅｃｏ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加体５ａ、および関連化合物６ａ〜１５ａおよび７ｃの量は、患者におけるアテローム硬化性プラーク形成の範囲および重症度に相関する。例えば、血管内膜切除術を必要とするのに十分に進行したアテローム性動脈硬化症の病態を有する８人のうちの６人で、７０〜１６９０ｎＭの範囲でアルドール５ａが検出された（図５Ｃ）。しかし、一般的な診療所に通院している患者群から無作為に選択された患者由来の１５の血漿サンプルのうちのたった１つで、検出可能な５ａが存在した。
【００５９】
したがって、本発明は、患者がアテローム硬化性病変を有するかどうかの決定および循環コレステロールがアテローム硬化性プラーク中に組み込まれるようになる範囲の決定のためのこれらのコレステロールオゾン化生成物の検出を意図する。
【００６０】
（オゾンおよびコレステロール生成物の検出）
コレステロールオゾン化生成物を、当業者が利用可能な任意の手順によって検出または同定し得る。例えば、これらの生成物を、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、ガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣＭＳ）、高速液体クロマトグラフィ質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、蒸発光散乱検出（ＥＬＳＤ）、ガスクロマトグラフィ質量分析を使用したイオン検出（ＩＤ−ＧＣＭＳ）、可視、紫外線、または赤外線分光法、薄層クロマトグラフィ、電気泳動、液体クロマトグラフィ、核磁気共鳴、湿式化学アッセイ、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光分光学、光分光学もしくは紫外線分光学、または当業者に利用可能な任意の他の手段によって検出または同定し得る。
【００６１】
さらに、コレステロールオゾン化生成物の存在を、これらの生成物が低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、アポタンパク質Ｂ_１００（アポＢ−１００、ＬＤＬのタンパク質成分）、またはマクロファージに及ぼす影響を観察することによって検出することもできる。本明細書中に記載のように、コレステロールオゾン分解生成物４ａおよび５ａは、マクロファージからの泡沫細胞の形成を促進し得る。さらに、コレステロールオゾン分解生成物４ａおよび５ａは、ＬＤＬおよびアポＢ−１００の二次構造を修飾する。したがって、試験サンプル中のコレステロールオゾン分解生成物の存在を、試験サンプルが泡沫細胞形成を促進するか、ＬＤＬまたはアポタンパク質Ｂ_１００の二次構造を変化させることができるかどうかの決定によって検出し得る。これらのアッセイを、以下により詳細に記載する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、試験サンプルを、コレステロールオゾン化生成物の検出および同定を容易にする試薬と反応させる。例えば、試験サンプルを、コレステロールオゾン化生成物と反応する任意の蛍光、リン光、または着色試薬と接触させることができ、反応生成物を、蛍光、可視光、または紫外線検出器を使用して検出し得る。他の実施形態では、このような試薬を使用せず、コレステロールオゾン化生成物を、その物理的性質または化学的性質によって同定する。このような方法を、以下にさらに詳細に記載する。
【００６３】
アテローム硬化性プラーク物質中のオゾンの量は、形成されたアテローム硬化性プラークの量も示す。したがって、本発明は、アテローム硬化性プラークのサイズを評価するためのアテローム硬化性プラーク物質中のオゾンの検出および／または定量を意図する。オゾンを検出し得る任意の試薬の使用によって、アテローム硬化性プラーク物質中のオゾンを検出し得る。例えば、インディゴカルミン１は、オゾンとの反応の際にその青色が脱色する有色試薬である。プロセスでは、下に示すように、イサチンスルホン酸２が形成された。
【００６４】
【化８６】

したがって、オゾン検出方法を使用して、構築されたアテローム硬化性プラークの範囲を評価し得る。
【００６５】
しかし、アテローム硬化性材料中にオゾンを検出し得る一方で、実質的なアテローム硬化性プラーク材料を有する患者の血流中のコレステロールオゾン化生成物を検出し得る。したがって、アテローム硬化性プラーク物質の単離を回避するために、当業者は、血液サンプルを単離するために選択し、その後コレステロールのオゾン化生成物が存在するかどうかを検出し得る。これにより、血管内膜切除術などの高価で煩わしい手順が回避され、患者にアテローム硬化性プラーク物質がどれくらい存在するかを評価するための信頼のおける手順が得られる。
【００６６】
アテローム性動脈硬化症を診断するために、任意のコレステロールオゾン化生成物（例えば、ｓｅｃｏ−ケトアルデヒド４ａ）、そのアルドール付加体５ａ、および／または関連化合物６ａ〜１５ａおよび７ｃを検出し得る。しかし、今日まで行われている研究は、アルドール付加体５ａが血清中で検出し得る主な生成物の１つであることを示す。
【００６７】
いくつかの実施形態では、検出を容易にするために生体サンプルから得たコレステロールオゾン化生成物を化学修飾し得る。このような化学修飾に使用し得る試薬には、亜硫酸水素塩、アンモニア、シッフ塩基（アニリンなどの脂肪族または芳香族アミンを使用する）、芳香族または脂肪族ヒドラジン、ダンシルヒドラジン、ジェラード試薬（セミカルバジド）、Ｔｏｌｌｉｎｓ試験試薬（ホルムアルデヒドおよび水酸化カルシウム）などが含まれる。本発明のコレステロールオゾン化生成物と反応した場合、これらの試薬により、当業者によって容易に検出し得る亜硫酸水素付加体（ナトリウム塩として容易に結晶化される）、イミン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、およびＴｏｌｌｉｎｓ試験生成物などの特徴的な生成物が得られる。
【００６８】
例えば、ｓｅｃｏ−ケトアルデヒド４ａ、そのアルドール付加体５ａ、および関連化合物４ｃ、６ａ〜１５ａおよび７ｃのヒドラゾン誘導体を容易に形成することができ、これらは患者がアテローム硬化性病変を有するかどうかの決定のための有用なマーカーである。これらのヒドロゾン（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ）誘導体には、化合物４ｂ〜１５ｂ、おそらく４ｃまたは１０ｃのような構造を有する化合物が含まれる。
【００６９】
【化８７】

【００７０】
【化８８】

【００７１】
【化８９】

【００７２】
【化９０】

【００７３】
【化９１】

【００７４】
【化９２】

１ｎＭ〜１０ｎＭの低濃度のこれらのヒドロゾン誘導体を、ＨＰＬＣ質量分析を使用して検出した。ガスクロマトグラフィ質量分析を使用して、１０ｆｇ／μＬしかないコレステロールオゾン化生成物を検出し得る。
【００７５】
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンなどのヒドラジン化合物との反応によってコレステロールオゾン化生成物をヒドロゾン誘導体に変換し得る。いくつかの実施形態では、アセトニトリルまたはアルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）などの有機溶媒中で反応させる。酸性環境および非反応性大気を含む非酸素をしばしば使用する。
【００７６】
例えば、患者から血漿を得て、ＥＤＴＡに入れることができる。このサンプルをジクロロメタンで数回洗浄して、コレステロールオゾン化生成物を抽出し得る。ジクロロメタン画分を真空蒸発させ、コレステロールオゾン化生成物を含む残渣をアルコール（例えば、メタノール）に溶解し得る。次いで、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンおよび１ＮＨＣｌを含むエタノール溶液を添加し得る。溶液中に窒素を短時間（例えば、５分間）注入して（ｂｕｂｂｌｅｄ）遊離酸素を除去し得る。溶液を、コレステロールオゾン化生成物のそのヒドラゾン誘導体への変換に十分な時間（例えば、２時間）撹拌し得る。この手順で検出された主産物は、アルドール付加体５ａのヒドラゾン誘導体であると考えられる。さらに、予備調査により、血漿から抽出し得る５ａの量が１日あたり約５％減少することが明らかとなった。したがって、新鮮な血漿サンプルにより、サンプル中のアルドール付加体５ａの実際の量がより正確に測定される。
【００７７】
本発明の試薬および方法を使用して、アテローム性動脈硬化症をその進行の任意の段階で検出し得る。ＡＨＡによって採用され、本研究で使用した新規の分類によれば、アテローム性動脈硬化症の進行時に８つの病変型を区別し得る。
【００７８】
脈管内膜中の小脂質沈着物（細胞内およびマクロファージ泡沫細胞）によってＩ型病変が形成され、動脈壁が最初期且つ最小に変化する。このような変化は、動脈壁を肥厚させない。
【００７９】
ＩＩ型病変は、ミリメートル未満で動脈内膜の厚さが増加する黄色の線条または斑である脂肪線条によって特徴づけられる。これらは、Ｉ型病変で認められる脂肪より蓄積された脂肪からなる。脂質含有率は、病変乾燥重量の約２０〜２５％である。ほとんどの脂質は、細胞内、主にマクロファージ泡沫細胞おおび平滑筋細胞に存在する。細胞外空間は、脂肪滴を含み得るが、これらは細胞内の脂肪滴および小胞粒子（ｓｍａｌｌｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ）よりも小さい。化学的には、脂質は、コレステロールエステル（オレイン酸コレステリルおよびリノレン酸コレステリル）、コレステロール、およびリン脂質からなる。
【００８０】
ＩＩＩ型病変はまた、前アテローマ（ｐｒｅａｔｈｅｒｏｍａ）病変としても記載される。ＩＩＩ型病変では、動脈内膜は、ＩＩ型病変よりもわずかに肥厚するだけである。ＩＩＩ型病変は、動脈の血流を妨害しない。細胞外脂質および小胞粒子は、ＩＩ型病変で見出された小胞粒子と同一であるが、大量に存在し（乾燥重量で約２５〜３５％）、小貯留（ｓｍａｌｌｐｏｏｌ）中に蓄積され始める。
【００８１】
ＩＶ型病変は、アテローマに関連する。これらは、三日月型であり、動脈の厚さを増大させる。この病変は、血漿コレステロールレベルが非常に高い患者以外は動脈内腔を非常に狭めることはないかもしれない（多くの人々において、病変を血管造影法によって視覚化することができない）。ＩＶ型病変は、内膜層中の細胞外脂質の広範な蓄積（乾燥重量で約６０％）からなる。脂質コアは、無機質の小クランプを含み得る。これらの病変は、破裂および壁性血栓の形成の影響を受けやすい。
【００８２】
Ｖ型病変は、フィブロアテローマ（ｆｉｂｒｏａｔｈｅｒｏｍａ）に関連する。これらは、主にＩ型コラーゲンからなる１つまたは複数の線維性組織の層を有する。Ｖ型病変は壁厚が増大し、アテローム性動脈硬化症の進行につれて内腔の減少が進行する。これらの病変は、さらに細分される特徴を有する。Ｖａ病変では、新規の組織は脂質コア内の損傷の一部である。Ｖｂ病変では、脂質コアおよび病変の他の部分が石灰化する（ＶＩＩ型病変に進行する）。Ｖｃ型病変では、脂質コアは存在せず、脂質は一般的に最小である（ＶＩＩＩ型病変に進行する）。一般に、破壊を受けた病変は、Ｖａ型病変である。これらは比較的柔らかく、遊離コレステロール一水和物血漿よりもコレステロールエステル濃度が高い。Ｖ型病変は破裂して壁在血栓を形成し得る。
【００８３】
ＶＩ型病変は、ＩＶ型病変およびＶ型病変に加えて、亀裂、びらん、または潰瘍形成などの病変表面の破壊（ＶＩａ型）、血腫または出血（ＶＩｂ型）、および血栓性沈着物（ＶＩｃ型）を有する複雑性（ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ）病変である。ＶＩ型病変は、病変の厚さが増大し、内腔がしばしば完全に遮断されている。これらの病変は、Ｖ型病変に変換し得るが、これらはより巨大且つ閉塞性を示す。
【００８４】
ＶＩＩ型病変は、より進行した病変の巨大な鉱化作用によって特徴づけられる石灰化病変である。鉱化作用は、死細胞の残遺物および細胞外脂質の蓄積の代わりにリン酸カルシウムおよびアパタイトの形態を取る。
【００８５】
ＶＩＩＩ型病変は、主にコラーゲン層からなり、脂質をほとんど含まない線維性病変である。ＶＩＩＩ型は、コラーゲンに変換される血栓の脂質後退または脂質病変の結果であり得る。これらの病変は、中動脈の内腔を塞ぐ。
【００８６】
本明細書中で使用されるように、コレステロールオゾン分解生成物４ａおよび５ａは、マクロファージからの泡沫細胞の形成を促進し、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）およびアポタンパク質Ｂ_１００（ＬＤＬのタンパク質成分）の構造を修飾し得る。ＬＤＬを、非活性化マウスマクロファージの存在下で４ａまたは５ａとインキュベートした。４ａまたは５ａへの曝露後、これらのマクロファージは、脂質を負荷し始め、泡沫細胞が反応槽中に出現し始める（図７を参照のこと）。さらに、４ａおよび５ａ（１０μＭ）とのヒトＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）のインキュベーションにより、円偏光二色性によって検出したところ、アポＢ−１００の構造が時間依存性に変化した（図８Ｂ、Ｃ）。図８Ａに示すように、正常なＬＤＬのタンパク質含有量は、αヘリックス構造が大部分を占め（約４０±２％）、β構造（約１３±３％）、βターン（約２０±３％）、およびランダムコイル（２７±２％）はより少ない。しかし、ＬＤＬを４ａおよび５ａとインキュベートした場合、二次構造が有意に喪失する。二次構造の喪失は、主に、αヘリックス構造の喪失である（４ａは約２３±５％；５ａは約２０±２％）。相応してより高い比率のランダムコイルが認められる（４ａは約３９±２％；５ａは３２±４％）。したがって、４ａおよび５ａのコレステロールオゾン分解生成物は、問題のあるアテローム性動脈硬化症に関連するいくつかの生理学的変化を直接導き得る。
【００８７】
したがって、本発明は、問題のコレステロールオゾン分解生成物が試験サンプル中に存在するかどうかを診断する方法を提供する。いくつかの実施形態では、このような方法は、試験サンプルがマクロファージによる脂質取り込みを変化させることができるかどうかを決定する工程を含む。試験サンプルとマクロファージとのインキュベーション後に脂質取り込みの増加が認められた場合、試験サンプルはオゾン分解生成物を有し、試験サンプルが得られた患者は問題のアテローム性動脈硬化症を罹患している可能性が高い。別の実施形態では、本発明は、試験サンプルがＬＤＬまたはアポタンパク質Ｂ_１００の二次構造を修飾し得るかどうかの決定によるコレステロールオゾン分解生成物の検出方法を提供する。ＬＤＬまたはアポタンパク質Ｂ_１００の二次構造を、当業者が利用可能な方法（例えば、円偏光二色性または熱量測定）を使用してモニタリングまたは観察し得る。
【００８８】
生体サンプル中のコレステロールオゾン化生成物の定量的測定を使用して、生体サンプルを得た動物中にどのアテローム性動脈硬化症病期および／またはどんな病変型が存在するのかを診断し得る。アテローム性動脈硬化症の別の病変型または別の病期を有することが公知の患者集団由来の生体サンプルを試験し、これらのサンプル中のコレステロールオゾン化生成物の量を集計し得る。このような集計により、アテローム性動脈硬化症の病期（または病変型）と患者サンプル中のコレステロールオゾン化生成物量との間の統計分析し、相関させる。コレステロールオゾン化生成物量の平均値および範囲を、新規の患者サンプル中のコレステロールオゾン化生成物量の知識によって新規の患者中に存在するアテローム性動脈硬化症の病期を予想することが可能なように、各患者集団について計算し得る。同様に、生体サンプルがマクロファージによって脂質負荷させることができる程度または低密度リポタンパク質および／またはアポタンパク質Ｂ_１００の二次構造も定量し、アテローム性動脈硬化症の病期および／またはアテローム性動脈硬化症患者中に存在する病変型と相関させることができる。
【００８９】
患者サンプル中のコレステロールオゾン化生成物量を、任意の利用可能な方法によって定量的に測定し得る。例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）、可視分光法、紫外線分光法、または赤外線分光法、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、または当業者に利用可能な他の手段由来の読出しのピーク下面積の決定によって定量的に測定し得る。他の実施形態では、薄層クロマトグラフィスポットまたは電気泳動バンドのサイズまたは光学密度を使用して、サンプル中のコレステロールオゾン化生成物を定量し得る。湿式化学アッセイ混合物、有色反応、または免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）の光学密度を使用して、サンプル中のコレステロールオゾン化生成物を定量することもできる。試験サンプルへの曝露の際に脂質負荷を示すマクロファージの比率または数を、試験サンプル中のコレステロールオゾン分解生成物量の定量的測定として使用することもできる。同様に、試験サンプルへの曝露の際にＬＤＬまたはアポタンパク質Ｂ_１００の二次構造の変化の範囲または比率を、試験サンプル中のコレステロールオゾン分解生成物量の定量的測定として使用することもできる。
【００９０】
別の実施形態では、このような生成物を、免疫アッセイによって検出し得る。本発明は、式３、４ａ〜１５ａ、４ｂ〜１５ｂ、３ｃ、４ｃ、７ｃ、または１０ｃの任意の化合物に結合し得る抗体および結合構成要素を提供する。本発明は、さらに、コレステロールオゾン化生成物およびこのようなオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体に構造的に関連するハプテンに関する。例えば、本発明は、コレステロールのオゾン化生成物およびヒドラゾン生成物と反応し得る抗体を生成するために使用し得る式３ｃ、１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、または１５ｂを有するハプテンを提供する。
【００９１】
【化９３】

【００９２】
【化９４】

（抗体および結合構成要素）
本発明は、コレステロールオゾン化生成物の検出および同定に有用なコレステロールオゾン化生成物、ハプテン、および関連コレステロール様分子に指向する抗体調製物および結合構成要素を提供する。例えば、本発明の抗体または結合構成要素は、式３、４ａ〜１５ａ、４ｂ〜１５ｂ、３ｃ、４ｃ、７ｃ、または１０ｃの任意の１つを有する化合物を結合し得る。本明細書中で使用される、用語「結合構成要素」には、コレステロールオゾン化生成物に結合し得る抗体および他のポリペプチドが含まれる。
【００９３】
１つの実施形態では、抗体または結合構成要素は、式３、４ａ〜１５ａ、４ｂ〜１５ｂ、３ｃ、４ｃ、７ｃ、または１０ｃの任意の１つを有する化合物に選択的に結合し得る。別の実施形態では、抗体または結合構成要素は、式３、４ａ〜１５ａ、４ｂ〜１５ｂ、３ｃ、４ｃ、７ｃ、または１０ｃを有する１つを超える化合物に結合し得る。抗体調製物の特定の例を、式１３ａ、１４ａ、１３ｂ、１４ｂ、または１５ａを有する抗体に対して惹起した。特に、ハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５およびＫＡ１−７Ａ６は、式１５ａを有する化合物に対して惹起された抗体調製物を提供する。ハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−１Ｅ９は、式１４ａを有する化合物に対して惹起された抗体調製物を提供する。
【００９４】
式１５ａを有する化合物から惹起されたハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５およびＫＡ１−７Ａ６は、ブダペスト条約にしたがって、２００３年８月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９ ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２７およびＰＴＡ−５４２８として受託された。式１４ａを有する化合物から惹起されたハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−ｌＥ９も、ブダペスト条約にしたがって、２００３年８月２９日にＡＴＣＣにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０として受託された。
【００９５】
本発明はまた、利用可能な手順によって作製されたコレステロールのオゾン化生成物に結合し得る抗体を提供する。このような抗体の結合ドメイン（例えば、これらの抗体のＣＤＲ領域）を、任意の従来の結合構成要素の骨格に導入するかこれと共に使用し得る。
【００９６】
免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質ファミリーに属する抗体分子、その基本的構成単位、折り畳まれた免疫グロブリン、またはドメインは、免疫系および他の生体認識系の多数の分子において種々の形態で使用される。標準的な抗体は、２つの同一の免疫グロブリン重鎖および２つの同一の軽鎖からなり、分子量が約１５０，０００ダルトンの四量体構造である。
【００９７】
抗体の重鎖および軽鎖は、異なるドメインからなる。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有し、各重鎖は１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ）を有する。例えば、Ａｌｚａｒｉ，Ｐ．Ｎ．，Ｌａｓｃｏｍｂｅ，Ｍ．−Ｂ．＆ Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．（１９８８）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５５５−５８０を参照のこと。約１１０個のアミノ酸残基からなる各ドメインは、互いに対してパッケージングされた２つのβシートから形成された特徴的なβ−サンドイッチ構造に折り畳まれる（免疫グロブリン折り畳み）。ＶＨドメインおよびＶＬドメインはそれぞれループまたはターンであり、ドメインの片端でβ鎖が連結した３つの相補性決定基（ＣＤＲ１−３）を有する。両軽鎖および重鎖の可変領域は、一般に、抗原特異性に寄与するにもかかわらず、各鎖の特異性への寄与は、常に等しいというわけではない。抗体分子は、６つの無作為化ループ（ＣＤＲ）によって多数の分子と結合するように進化している。
【００９８】
免疫グロブリンを、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して異なるクラスに割り当てることができる。少なくとも以下の５つの主な免疫グロブリンクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ。これらのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２）にさらに分類し得る。免疫グロブリンのＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭクラスに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれアルファ（α）、ベータ（β）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）と呼ぶ。抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ鎖配列に基づいて２つの明確に異なる型（カッパ（κ）およびラムダ（λ））の１つに割り当てることができる。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元高次構造は周知である。
【００９９】
抗体の可変ドメインの文脈における、用語「可変」は、可変ドメインの一定の部分が抗体によって広範に異なるという事実をいう。可変ドメインは結合のために存在し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を決定する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均等に分布していない。代わりに、可変性は、両軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン中の超可変領域としても公知の相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメント中に集中している。
【０１００】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分はβシート楮構造を取り、３つのＣＤＲによって連結され、ループ連結を形成し、いくつかの場合、βシート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって極めて近接して別の鎖由来のＣＤＲと互いに保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【０１０１】
したがって、本発明での使用が意図される抗体は、任意の種々の形態（全免疫グロブリン、抗体フラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂなど）、類似のフラグメント、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む単鎖抗体などの形態が含まれる）であってよく、本明細書中でその全てが広範に用語「抗体」に含まれる。本発明は、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）の任意の特異性の使用を意図し、特定のコレステロールオゾン化生成物またはその誘導体を認識して免疫反応する抗体に限定されない。
【０１０２】
さらに、抗体の結合領域（ＣＤＲ）を、任意の従来の結合構成要素であるポリペプチドの骨格内に配置し得る。好ましい実施形態では、本明細書中に記載の文脈で、式３〜１５の任意の化合物ならびにそのハプテンおよび誘導体（ヒドラゾン誘導体が含まれる）に免疫特異性を示す抗体（結合構成要素またはそのフラグメント）を使用する。
【０１０３】
用語「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般に、抗原結合領域または可変領域をいう。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメントが含まれる。抗体のパパイン消化により、それぞれ１つの抗原結合部位および残りのＦｃフラグメントを有する、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントが産生される。したがって、Ｆａｂフラグメントは、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を有する。ペプシン処理により、抗原に架橋し得る２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）_２フラグメントおよびｐＦｃ’フラグメントと呼ばれる残りのフラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントはペプチド消化抗体の還元後に得られ、インタクトな軽鎖および重鎖の一部からなる。抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端への数個の残基の付加により、Ｆａｂフラグメントと異なる。
【０１０４】
Ｆｖは、完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、強固に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの二量体（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体）からなる。この高次構造では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原結合部位が形成される。集合的に、６つのＣＤＲにより抗体に抗原結合特異性が付与される。しかし、１つの可変ドメイン（すなわち、抗原に特異的なたった３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識して結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性は低い。抗体に関して本明細書中で使用される、「機能的フラグメント」は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントをいう。
【０１０５】
さらなるフラグメントには、抗体フラグメントから形成された直鎖抗体、単鎖抗体分子、および多重特異性抗体が含まれ得る。単鎖抗体は、遺伝的に融合した単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作分子である。このような単鎖抗体を、「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントともいう。一般に、Ｆｖ集団は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にｓＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成し得るポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【０１０６】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有し、前記フラグメントが同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）小抗体フラグメントをいう。短すぎて同一鎖上で２つのドメインの間で対合できないリンカーの使用によって、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させられて２つの抗原結合部位を作製する。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により完全に記載されている。
【０１０７】
したがって、本発明で意図する抗体フラグメントは、全長抗体ではない。しかし、このような抗体フラグメントは、全長抗体と比較して類似しているか改善された免疫学的特性を有し得る。このような抗体フラグメントは、約４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、９アミノ酸、約１２アミノ酸、約１５アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、またはそれ以上ほどの小ささであり得る。
【０１０８】
一般に、本発明の抗体フラグメントは、コレステロールのオゾン化生成物に特異的に結合する抗体と比較して類似しているか改善された免疫原性を有する限り、任意の上限サイズを有し得る。例えば、より小さな結合構成要素および軽鎖抗体フラグメントは、抗体フラグメントが軽鎖抗体サブユニットに関連する場合、約２００アミノ酸未満、約１７５アミノ酸未満、約１５０アミノ酸未満、または約１２０アミノ酸未満であり得る。さらに、より大きな結合構成要素および重鎖抗体フラグメントは、抗体フラグメントが重鎖抗体サブユニットに関連する場合、約４２５アミノ酸未満、約４００アミノ酸未満、約３７５アミノ酸未満、約３５０アミノ酸未満、約３２５アミノ酸未満、または約３００アミノ酸未満であり得る。
【０１０９】
本発明のコレステロールオゾン化生成物に指向する抗体を、任意の利用可能な手順によって作製し得る。ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者に利用可能である。例えば、Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．），ｐａｇｅｓ １−５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｔｉｏｎ ２．４．１（１９９２）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１１０】
モノクローナル抗体を本発明で使用することもできる。本明細書中で使用される、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体集団から得た抗体をいう。言い換えれば、集団を含む各抗体は、いくつかの抗体で少し存在し得る偶発的な天然に存在する変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、１つの抗原部位に指向する。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定基に指向する。その特異性に加えて、他の免疫グロブリンによって汚染されないハイブリドーマ培養によって合成されるという点でモノクローナル抗体は有利である。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の特徴が抗体の実質的に均質の集団から得られた抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生が必要であると解釈されない。
【０１１１】
本明細書中に記載のモノクローナル抗体には、特に、重鎖および／軽鎖の一部が特定の種由来の抗体中の対応する配列と同一または相補的であるか特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属し、残りの鎖が別の種由来の抗体中の配列と同一または相補的であるか別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する「キメラ」抗体が含まれる。所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを使用することもできる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．８１，６８５１−５５（１９８４）を参照のこと。
【０１１２】
モノクローナル抗体の調製は同様に従来のものである。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）；Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．５．１−２．６．７；およびＨａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐａｇｅ ７２６（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．（１９８８））（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。種々の十分に確立された技術によってモノクローナル抗体をハイブリドーマ培養物から単離および精製し得る。このような単離技術には、プロテインＡＳｅｐｈａｒｏｓｅを使用したアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、およびイオン交換クロマトグラフィが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．７．１−２．７．１２ ａｎｄ ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．９．１−２．９．３；Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９−１０４（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照のこと。
【０１１３】
当業者は、抗体のインビトロおよびインビボ操作方法を利用可能である。例えば、本発明で使用されるべきモノクローナル抗体を、上記のハイブリドーマ法によって作製するか、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組換え法によって作製し得る。本発明で使用するためのモノクローナル抗体を、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０１１４】
抗体フラグメントの作製方法はまた、当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。本発明の抗体フラグメントを、抗体のタンパク質分解性加水分解または適切な宿主中での抗体フラグメントをコードする核酸の発現によって調製し得る。従来の全抗体のペプシンまたはパパイン消化方法によって抗体フラグメントを得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、Ｆ（ａｂ’）_２と記載される５Ｓフラグメントが得られるペプシンでの抗体の酵素的切断によって産生し得る。このフラグメントを、チオール還元剤および任意選択的にジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のための保護基を使用してさらに切断して３．５ＳＦａｂ’１価フラグメントを産生し得る。あるいは、ペプシンを使用した酵素切断により、２つの１価のＦａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接産生される。これらの方法は、例えば、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号ならびにこれらの含まれる参考文献に記載されている。これらの特許は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１１５】
フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術などの他の抗体切断方法を使用することもできる。例えば、Ｆｖフラグメントは、Ｖ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖との会合を含む。この会合は、非共有結合であり得るか、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結するか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋し得る。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって連結したＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖を含む。これらの単鎖抗体結合タンパク質（ｓＦｖ）を、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶ_ＨドメインおよびＶ_ＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子の構築によって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、その後大腸菌などの宿主細胞に移入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチド内に１つのポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖの産生方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐａｇｅ ９７（１９９１）；Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｌａｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ，ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９４６，７７８；ａｎｄ Ｐａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−７７（１９９３）に記載されている。
【０１１６】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、しばしば、抗原認識および結合に関与する。ＣＤＲペプチドを、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子のクローニングまたは構築によって得ることができる。このような遺伝子を、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用によって調製する。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，ｐａｇｅ １０６（１９９１）を参照のこと。
【０１１７】
本発明は、ヒト形態および非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態を意図する。このようなヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、または抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど）である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【０１１８】
いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に沈関する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体や移入されたＣＤＲ中に見出されない残基またはフレームワーク配列を含み得る。抗体の製法をさらに洗練および至適化するためにこれらの修飾を行う。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、且つ、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域が非と免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２，５９３−５９６（１９９２）；Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：２１９２−２２０１（１９９７）ａｎｄ Ｖａｓｗａｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１０５−１１５（１９９８）を参照のこと。
【０１１９】
抗体を生成するために標準化された手順を利用可能であるが、抗体のサイズ、抗体の多鎖構造、および抗体中に存在する６つの結合ループの複雑さは、抗体の改良および大量製造の障害となっている。したがって、本発明は、さらに、コレステロールのオゾン化生成物を認識して結合し得るポリペプチドを含む結合構成要素の使用を意図する。
【０１２０】
多数のタンパク質は、コレステロールオゾン化生成物の結合ドメインが結合して適切な結合構成要素を形成し得るタンパク質足場として役立ち得る。結合ドメインは、本発明のコレステロールオゾン化生成物と結合するか相互作用する一方で、タンパク質足場は結合ドメインが結合し得るように結合ドメインを保持して安定化するのみである。多数のタンパク質足場を使用し得る。例えば、ファージキャプシドタンパク質を使用し得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ＆ Ｗｅｌｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１７３−１８４（１９９４）の概説を参照のこと。ファージキャプシドタンパク質は、無作為なペプチド配列（ウシ膵臓トリプシンインヒビター（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９：２４２９−２４３３（１９９２））、ヒト成長ホルモン（Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１）），Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １：７０−７５（１９９４））、およびストレプトコッカスのＩｇＧ結合ドメイン（Ｏ’Ｎｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ（Ｃｒａｂｂ，Ｌ，．ｅｄ．）ｐｐ．５１７−５２４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４））が含まれる）の表示のための足場として使用されている。これらの足場は、コレステロールオゾン化生成物の結合ドメインを含むように修飾し得る単一の無作為化ループまたは領域を表示した。
【０１２１】
研究者らは、線状ファージＭ１３上の提示足場として小さな７４アミノ酸のα−アミラーゼインヒビターであるＴｅｎｄａｍｉｓｔａｔも使用している。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，＆ Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−４７０（１９９５）。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、ストレプトマイセス・テンダエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｔｅｎｄａｅ）由来のβシートタンパク質である。これは、結合ペプチドの魅力的な足場となる多数の特徴（そのサイズ、安定性、高分解能ＮＭＲ、およびＸ線結晶データが含まれる）を有する。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔの全トポロジーは、一連のループによって連結された２つのβシートを有する免疫グロブリンドメインの全トポロジーと類似する。免疫グロブリンドメインと対照的に、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのβシートは１つよりもむしろ２つのジスルフィド結合とともに保持され、これによりタンパク質の相当な安定性が説明される。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔのループは、免疫グロブリンで見出されたＣＤＲループに類似の機能を付与し、インビトロ変異誘発によって容易に無作為化し得る。Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔは、ストレプトマイセス・テンダエに由来し、ヒトで抗原性を示し得る。したがって、Ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔを使用する結合構成要素を、インビトロで使用することが好ましい。
【０１２２】
フィブロネクチンＩＩＩ型を、結合構成要素が結合し得るタンパク質足場としても使用されている。フィブロネクチンＩＩＩ型は、免疫グロブリンスーパーファミリーの巨大なサブファミリーの一部（Ｆｎ３ファミリーまたはｓ型Ｉｇファミリー）である。タンパク質足場または結合構成要素（例えば、ＣＤＲペプチド）としてのこのようなフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの使用のための配列、ベクター、およびクローニング法は、例えば、米国特許公開公報２００２００１９５１７に記載されている。Ｂｏｒｋ，Ｐ．＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．（１９９２）Ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，８９９０−８９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．（１９９３）Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，８４６−８５２；Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｈｏｍ，Ｌ．＆ Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９９４）Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｆｏｌｄ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１．Ｄ．＆ Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ，Ｃ．（１９９４）Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｍｏｄｕｌｅｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２，２３３−３３７；Ｈａｒｐｅｚ，Ｙ．＆ Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．（１９９４）も参照のこと。
【０１２３】
免疫系では、特異的抗体を、巨大ライブラリー（親和性成熟）から選択および増幅する。免疫細胞で使用される組み合わせ技術を、変異誘発および結合構成要素の組み合わせライブラリーの生成によって模倣し得る。したがって、変異結合構成要素、抗体フラグメント、および抗体を、ディスプレイ型技術によって生成することもできる。このようなディスプレイ型テクノロジーには、例えば、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、および他の技術が含まれる。当該分野で利用可能な技術を、結合構成要素ライブラリーの生成、これらのライブラリーのスクリーニングに使用することができ、選択された結合構成要素を、親和性成熟などのさらなる成熟に供し得る。Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，ｓｕｐｒａ．，Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｔｈａｕ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ），Ｐａｒｍｌｅｙ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ），Ｓｃｏｔｔ ＴＩＢＳ １７：２４１−２４５（１９９２），Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２（１９９０），Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１０８１−１０８５（１９９３），Ｈｏｇａｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３０：４３−６８（１９９２），Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ＴＩＢＴＥＣＨ １０：８０−８４（１９９２）、および米国特許第５，７３３，７４３号。
【０１２４】
したがって、本発明は、親和性、選択性、結合強度、および／または他の所望の性質を最適にするための抗体、ＣＤＲ、または結合ドメインの変異方法も提供する。変異結合ドメインは、選択された結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ）のアミノ酸配列変異型をいう。一般に、変異結合ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸残基は、基準結合ドメイン中に存在するアミノ酸残基と異なる。このような変異抗体は、必然的に基準アミノ酸配列と１００％未満配列が同一であるか類似している。一般に、変異結合ドメインは、基準結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列が同一であるか類似している。好ましくは、変異結合ドメインは、基準結合ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列が同一であるか類似している。
【０１２５】
例えば、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を、変異結合ドメインの１つの生成方法として利用し得る。ファージディスプレイを使用した親和性成熟は、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（４５）：１０８３２−１０８３８（１９９１）に記載の過程をいう。Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２５４：８８９−８９６（１９９２）も参照のこと。以下の記述に完全に制限されないが、この過程を、各部位で全ての可能なアミノ酸置換を行う目的で、多数の異なる部位でのいくつかの結合ドメインまたは抗体超可変領域の変異を含むと簡単に説明し得る。このようにして生成された結合ドメイン変異体を、１価様式で融合タンパク質として線状ファージ粒子から表示する。一般に、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に融合する。種々の変異体を発現するファージを、目的の特性（例えば、結合親和性または選択性）のためのいくつかの選択ラウンドによって循環させることができる。目的の変異体を単離し、配列決定する。このような方法は、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第６，２９０，９５７号、およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１３（１１），２５０８−２５１５（１９９４）にさらに詳述されている。
【０１２６】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、コレステロールオゾン化生成物を認識する改良された結合特性を有する結合構成要素、抗体、および抗体フラグメントを生成するための結合構成要素もしくは抗体ポリペプチドまたはこれらをコードする核酸の操作方法を提供する。
【０１２７】
このような既存の結合構成要素または抗体の一部の変異方法は、コレステロールオゾン化生成物の結合ドメインをコードするポリペプチドをコードする核酸をファージの外殻タンパク質をコードする核酸に融合して融合タンパク質をコードする組換え核酸を生成する工程と、融合タンパク質をコードする組換え核酸を変異して変異融合タンパク質をコードする変異核酸を生成する工程と、ファージ表面上で組換え融合タンパク質を発現する工程と、コレステロールのオゾン化生成物に結合するファージを選択する工程とを含む。
【０１２８】
したがって、本発明は、コレステロールオゾン化生成物、ハプテン、またはコレステロール誘導体を認識して結合し得る抗体、抗体フラグメント、および結合構成要素ポリペプチドを提供する。本発明は、さらに、結合特性または他の望ましい特性（例えば、安定性、サイズ、使用しやすさ）を最適にするための抗体、抗体フラグメント、および結合構成要素ポリペプチドの製造方法を提供する。
【０１２９】
このような抗体、抗体フラグメント、および結合構成要素ポリペプチドを、抗体の存在の検出に有用な標識またはレポーター分子を含むように修飾し得る。本明細書中で使用される、標識またはレポーター分子は、抗体に直接または間接的に会合することができ、且つそれにより測定可能且つ検出可能なシグナルが直接または間接的に得られる任意の分子である。当業者に利用可能な多数のこのような標識を、抗体または結合構成要素に組み込むかカップリングし得る。本発明の抗体および結合構成要素との使用に適切な標識の例には、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、二次抗体、およびリガンドが含まれる。
【０１３０】
適切な蛍光標識の例には、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニリノドール（ＤＡＰＩ）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７が含まれる。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。いくつかの実施形態で使用した組み合わせ多色体（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）には、ＦＩＴＣならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７が含まれる。これらの蛍光色素の吸収極大および発光極大は、それぞれ、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）、およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であるため、同時検出が可能である。このような蛍光標識を、種々の販売者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ．ＯＲおよびＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から得ることができる。
【０１３１】
その後、抗体またはビオチンなどの結合構成要素に組み込まれる検出標識を、当該分野で利用可能な感度の高い方法を使用して検出し得る。例えば、ビオチンを、ビオチンに結合するストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体（Ｔｒｏｐｉｘ．，Ｉｎｃ．）を使用して検出することができ、その後、適切な基質（例えば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−［１，２，−ジオキシエタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１．ｓｕｐ．３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．））の化学発光によって検出し得る。
【０１３２】
２つまたはそれ以上のこれらのレポーター分子または検出標識と組み合わせた分子を、本発明で使用することもできる。任意の公知の検出標識を、開示の抗体、抗体フラグメント、結合構成要素、および方法と共に使用し得る。検出標識によって得られたシグナルの検出および測定方法はまた、当業者に利用可能である。例えば、シンチレーションカウンティングまたは直接視覚化によって放射性同位体を検出することができ、蛍光分光光度計を使用して蛍光分子を検出することができ、スキャナまたは分光計を使用してリン高分子を検出するか、カメラで直接視覚化することができ、酵素によって触媒された反応生成物の視覚化によって酵素を検出し得る。このような方法を、開示のコレステロールのオゾン化生成物の検出方法で直接使用し得る。
【０１３３】
（コレステロールオゾン化生成物のアッセイ）
当業者に利用可能な任意のアッセイを、コレステロールオゾン化生成物の検出のために使用することができ、このアッセイには、コレステロールオゾン化を示すコレステロールハプテンまたはコレステロール誘導体の検出アッセイが含まれる。例えば、アッセイは、質量分析、ガスもしくは液体クロマトグラフィ、核磁気共鳴、赤外分光法、紫外分光法、可視分光法、または高速液体クロマトグラフィを使用し得る。いくつかの実施形態では、任意の化合物３、４ａ〜１５ａ、３ｃ、４ｃ、７ｃ、１０ｃ、または４ｂ〜１５ｂの検出のために免疫アッセイを使用し得る。
【０１３４】
アッセイを使用して、種々の供給源（血清、血漿、血液、リンパ、組織（例えば、プラークサンプル）、唾液、尿、便、および哺乳動物由来の他の生体サンプルが含まれる）から得た試験サンプル中のコレステロールのオゾン化生成物を検出し得る。いくつかの実施形態では、試験サンプルは組織サンプルである。しかし、他の実施形態では、試験サンプルは、尿、血液、または血漿などの体液である。哺乳動物被験体由来のこのようなサンプルの評価により、非浸襲性の血管疾患の診断が可能である。例えば、哺乳動物の体液を被験体から採取し、サンプル流動物中の放出因子または細胞上の膜結合因子のいずれかとしてコレステロールオゾン化生成物についてアッセイし得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、免疫アッセイを使用する。このような免疫アッセイは、当業者が利用可能な任意のアッセイ方法を含み得る。免疫アッセイの例には、放射性アッセイ、競合結合アッセイ、サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイが含まれる。本発明の結合構成要素を組み合わせ、本明細書中に記載の検出可能な標識に結合し得る。使用する標識の選択は適用によって変化し、当業者が選択し得る。
【０１３６】
本発明の実施では、検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素、常磁性イオン、常磁性イオンのキレート、ビオチン、フルオロフォア、発色団、重金属、重金属のキレート、Ｘ線を通さない化合物もしくは元素、放射性同位体、または放射性同位体のキレートであり得る。
【０１３７】
検出可能な標識として有用な放射性同位体には、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１２８、ヨウ素−１３１、またはクロム−５１、コバルト−５７、ガリウム−６７、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、水銀−１９７、セレン−７５、タリウム−２０１、テクネチウム−９９ｍ、鉛−２０３、ストロンチウム−８５、ストロンチウム−８７、ガリウム−６８、サマリウム−１５３、ユーロピウム−１５７、イットリウム−１６９、亜鉛−６２、もしくはレニウム−１８８のキレート化金属などの同位体が含まれる。
【０１３８】
検出可能な標識として有用な常磁性イオンには、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジウム（ＩＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）またはイッテルビウム（ＩＩＩ）などのイオンが含まれる。
【０１３９】
放射性免疫アッセイは、典型的には、結合構成要素（例えば、抗体）とコレステロールオゾン化生成物との間の複合体の測定における放射能を使用する。このような方法では、結合構成要素を放射性標識する。結合構成要素を、非標識コレステロールオゾン化生成物と反応させる。次いで、放射性標識複合体を、例えば、沈殿およびその後の遠心分離によって非結合物質から分離する。一旦放射性標識結合構成要素とコレステロールオゾン化生成物との間の複合体が非結合物質から分離されと、複合体を、放射線の直接的測定またはデフェニルオキサゾール（ＤＰＯ）などの蛍光分子に対する放射性標識の効果の観察のいずれかによって定量する。後者のアプローチは、放射能があまり必要なく、より感度が高い。シンチレーションと呼ばれるこのアプローチは、^３Ｈまたは^３２Ｐなどの放射性標識によって励起された色素溶液の蛍光透過を測定する。結合範囲を、蛍光粒子から放出された蛍光強度の測定によって決定する。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）と呼ばれるこの方法は、非結合放射性結合構成要素を洗浄することなくｉｎｓｉｔｕで形成された結合構成要素複合体に結合し得るという利点を有する。
【０１４０】
競合結合アッセイは、標識標準が試験サンプル分析物と一定限度の量の結合構成要素との結合について競合する能力に依存する。標識標準は、コレステロールのオゾン化生成物またはその免疫学的反応性ハプテンもしくは誘導体であり得る。試験サンプルの量は、結合構成要素に結合するようになる標準の量に反比例する。結合するようになる標準の量の決定を容易にするために、一般に、使用される結合構成要素を、競合前または競合後のいずれかで不溶性にする。結合構成要素に結合した標準および分析物を、結合しないままである標準および分析物から都合良く分離し得るようにこれを行う。
【０１４１】
サンドイッチアッセイは、それぞれ検出すべき生成物の異なる免疫学的部分（すなわち、エピトープ）に結合し得る２つの結合構成要素の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル分析物を、固体支持体上に固定された第１の結合構成要素によって結合し、その後第２の結合構成要素が分析物に結合し、それにより不溶性の３つの部分を有する複合体が形成される（Ｄａｖｉｄ＆ Ｇｒｅｅｎｅ、米国特許第４，３７６，１１０号）。検出可能な部分を使用して第２の結合構成要素自体を標識するか（直接サンドイッチアッセイ）、第２の結合構成要素に結合する第３の結合構成要素を使用して測定することができ、検出可能な部分で標識する（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０１４２】
典型的には、サンドイッチアッセイには、固定化結合構成要素とコレステロールオゾン化生成物との間の二成分（ｂｉｎａｒｙ）固相複合体の形成によってサンプルからコレステロールオゾン化生成物を抽出するために固相に結合した結合構成要素を最初に試験されるサンプルと染色させる「順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）」アッセイが含まれる。適切なインキュベーション期間後、固体支持体を洗浄して非結合流動物サンプル（存在する場合、未反応のコレステロールオゾン化生成物）を除去する。次いで、固体支持体を、未知の量の標識した結合構成要素（標識またはレポーター分子として機能する）を含む溶液と接触させる。標識結合構成要素が固定化した結合構成要素とコレステロールオゾン化生成物との複合体と反応させるための第２のインキュベーション期間後、固体支持体を２回洗浄して未反応の標識結合構成要素を除去する。この順方向サンドイッチアッセイ型は、コレステロールオゾン化生成物が試験サンプル中に存在するかどうかを決定するための簡潔な「イエス／ノー」アッセイであり得る。
【０１４３】
使用し得る他のサンドイッチアッセイ型には、いわゆる「同時」および「逆」アッセイが含まれる。同時アッセイは、標識および非標識結合構成要素の両方が同時に試験されるサンプルに曝露される単一のインキュベーション工程を含む。非標識結合構成要素が固体支持体上に固定される一方で、標識結合構成要素は試験サンプルを含む溶液中で遊離する。インキュベーションの完了後、固体支持体を洗浄して、未反応サンプルおよび非複合体化標識結合構成要素を除去する。次いで、固体支持体に会合した標識結合構成要素の存在を、従来の「順方向」サンドイッチアッセイで行われるように決定する。
【０１４４】
「逆」アッセイでは、段階的添加を使用し、最初に標識結合構成要素の溶液を試験サンプルに添加し、その後に固体支持体に結合した非標識結合構成要素の溶液を添加する。第２のインキュベーション後、固相を従来の様式で洗浄して固相から試験されるサンプルの残渣および未反応の標識結合構成要素溶液を遊離する。「同時」および「順方向」アッセイと同様に、固体支持体に会合した標識結合構成要素を決定する。
【０１４５】
その診断的有用性に加えて、本発明の結合構成要素は、組織、細胞、または血清サンプル中のコレステロールオゾン化生成物レベルの長期間の試験による被験体の血管疾患の進行のモニタリングに有用である。長期間にわたるコレステロールオゾン化生成物レベルの変化は、被験体の血管疾患または心疾患のさらなる進行を示し得る。
【０１４６】
（血管疾患）
本発明によって診断される血管疾患は、哺乳動物の血管疾患である。用語「哺乳動物」は、任意の哺乳動物を意味する。哺乳動物のいくつかの例には、ブタ、ウシ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜；マウスおよびラットなどの実験動物；サル、類人猿、およびチンパンジーなどの霊長類；ならびにヒトが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の方法によってヒトを診断することが好ましい。
【０１４７】
本発明は、血管の病態、コレステロールの沈着を含む循環の病態、およびコレステロールのオゾン化を検出または診断する方法に関する。このような病態は、解剖学的部位または系内の血管の喪失、損傷、または破壊に関連する。用語「血管の病態」または「血管疾患」は、血流に障害があるか、障害があるようになり得る脈管組織の状態をいう。
【０１４８】
多数の病的状態により、コレステロール沈着に関連する血管疾患を引き起こし得る。本発明の組成物および方法を使用して検出または診断し得る血管病態の例には、アテローム性動脈硬化症（動脈硬化）、子癇前症、末梢血管疾患、心疾患、および脳卒中が含まれる。したがって、本発明は、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈症候群（不安定狭心症、血栓症、および心筋梗塞が含まれる）、プラークの破裂、冠動脈もしくは末梢動脈の原発性および続発性（ステント内）再狭窄、移植誘導性硬化症、末梢四肢疾患、間欠性跛行症、および糖尿病性合併症（虚血性心疾患、末梢動脈疾患、鬱血性心疾患、網膜症、神経障害、および腎症が含まれる）、または血栓症などの疾患の治療方法に関する。
【０１４９】
（キット）
試験サンプル中のコレステロールオゾン化生成物の検出のためのキットも本発明に含まれる。１つの実施形態では、キットは、コレステロールのオゾン化生成物に特異的に結合する結合構成要素または抗体を含むコンテナを含む。結合構成要素または抗体は、直接結合するか間接的に会合する検出標識またはレポーター分子を有し得る。任意の従来の免疫アッセイ手順で使用するために必要に応じて、結合構成要素または抗体を液体形態で提供することもできるか、固相に結合し得る。
【０１５０】
本発明のキットは、例えば、コレステロールのオゾン化生成物のアッセイにおけるコントロールまたは標準として使用し得るコレステロールのオゾン化生成物を含む別のコンテナも含み得る。
【０１５１】
本発明のキットは、コレステロールと反応して任意の結合構成要素または本発明の抗体によって容易に検出し得る生成物を生成し得る試薬を含む別のコンテナをさらに含み得る。
【０１５２】
本発明のキットはまた、結合構成要素、抗体、または結合構成要素／抗体とコレステロールのオゾン化生成物との複合体の検出のための検出標識またはレポーター分子を含む第３のコンテナを含み得る。
【０１５３】
これらのキットはまた、試験サンプル（血液、血漿、血清、尿、唾液、および便など）の回収に有用なツールを含むコンテナを含み得る。このようなツールには、血液を採取および安定化するための乱切刀、チューブ、および吸湿紙または吸湿布；唾液を採取および安定化するための綿棒；尿または便サンプルの採取および安定化するためのカップが含まれる。チューブ、紙、布、綿棒、およびカップなどの採取用材料を、任意選択的に、サンプルの変性または不可逆的吸収を回避するように処理し得る。これらの採取用材料を、試料の完全性の維持を補助するために防腐剤、安定剤、または抗菌薬で処理するかこれらを含むこともできる。
【０１５４】
本発明は、さらに、以下の非限定的な実施例によって例示する。
【実施例】
【０１５５】
（実施例１：材料および方法）
本実施例は、本明細書中に記載のいくつかの実験のための材料と方法を提供する。
【０１５６】
（アテローム硬化性動脈試料の手術による単離および取扱い。）組織サンプルを、頸動脈内膜摘除術によって得た。サンプルはアテローム硬化性プラークおよびいくつかの接着性動脈内膜および中膜を含んでいた。プラーク分析プロトコールは、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｃｌｉｎｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されており、手術前に患者の承諾を得ていた。新鮮な頸動脈内膜摘除組織を、外科切除の３０分以内に分析した。プラークサンプルは保存も貯蔵も行わなかったことに留意のこと。全ての分析操作を、外科切除から２時間以内に完了した。試料に固定液を添加しなかった。
【０１５７】
（ヒトアテローム硬化性動脈によるインディゴカルミン１の酸化。）上記のように単離した血管内膜切除試料（ｎ＝１５）を、ほぼ同湿重量（±５％）の２つの切片に分割した。各試料を、インディゴカルミン１（２００μＭ、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびウシカタラーゼ（１００μｇ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１．８ｍＬ）に入れた。オゾンの化学的トラップ（ｃｈｅｍｉｃａｌｔｒａｐ）として作用させるためにインディゴカルミン１を添加した。Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ２３０，１８３（１９９０）；Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６１，６１９（１９８９）。プロテインキナーゼＣのアクチベーターとしてミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、４０μｇを含む０．２ｍＬＤＭＳＯ）またはＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）を添加した。各サンプルを、組織ホモジナイザーを使用して１０分間ホモジナイズし、遠心分離した（１０，０００ｒｐｍで１０分間）。上清をデキャントし、フィルター（０．２μｍ）を通過させ、濾過物を、定量的ＨＰＬＣを使用してスルホン酸イサチン２の存在について分析した。
【０１５８】
図１Ｂに示すように、インディゴカルミン１の可視吸光度は漂白され、反応によって新規の化学種が得られ、これを定量的ＨＰＬＣ（表１）を使用して検出し、スルホン酸イサチン２として同定した（図１Ａも参照のこと）。
【０１５９】
（スルホン酸イサチン２の定量のためのＨＰＬＣアッセイ。）Ｌ−７２００オートサンプラー、Ｌ−７１００ポンプ、およびＬ−７４００紫外線検出器（２５４ｎｍ）を具備するＨｉｔａｃｈｉＤ−７０００装置にてＨＰＬＣ分析を行った。Ｄｅｌｌ ＧＸ１５０ ＰＣコンピュータでＨｉｔａｃｈｉ−ＨＳＭソフトウェアを使用して、Ｌ−７１００を制御した。ＬＣ条件は、ＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂＲＰ−Ｃ_１８カラムおよび１．２ｍＬ／分でのアセトニトリル：水（０．１％ＴＦＡ）（８０：２０）移動相であった。スルホン酸イサチン２の保持時間（Ｒ_Ｔ）は約９．４分であった。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈＰａｄｖ３．０ソフトウェアを使用して、標準サンプルの濃度に対するピーク領域と検量線に対するピーク領域との比較によって定量した。（表１）
（表１）
（活性化アテローム硬化性動脈材料によって形成されたスルホン酸イサチン２（ＩＳＡ））
【０１６０】
【表１】

（Ｈ_２^１８Ｏにおけるヒトアテローム硬化性動脈試料によるインディゴカルミン１の酸化。）以下の例外以外は上記のインディゴカルミン１アッセイにおいて本実験を行った。第１に、各プラーク試料（ｎ＝２）を、９５％を超えるＨ_２^１８Ｏを含むリン酸緩衝液（１０ｍＭ（ｐＨ７．４））に添加した。第２に、濾過物を、ＰＤ１０カラムで脱塩し、Ｆｉｎｎｅｇａｎエレクトロスプレー質量分析計による陰イオンエレクトロスプレー質量分析によって分析した。イオン存在率の生データを、プレゼンテーションのためにＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍｖ３．０フォーマットに抽出した。
【０１６１】
これらの実験は、プラーク物質およびＨ_２^１８Ｏ（９５％超の^１８Ｏ）の存在下で、^１８Ｏ同位体がスルホン酸イサチン２のラクタムカルボニルに組み込まれたことを示す。オゾンのみがインディゴカルミン１の二重結合を酸化的に切断してＨ_２^１８Ｏ由来のスルホン酸イサチン２のラクタムカルボニルへの同位体組み込みを促進し得るため、オゾンはインディゴカルミン１を酸化する活性酸素種である可能性が高かった。したがって、アテローム硬化性病変内にオゾンが生成される。Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８，２１９５（２００２）；Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）も参照のこと。
【０１６２】
（アテローム硬化性動脈試料からのアルデヒドの抽出および誘導体化手順。）上記のように単離した血管内膜切除試料を、ほぼ同湿重量（±５％）の２つの切片に分割した。各試料を、ウシカタラーゼ（１００μｇ）およびミリスチン酸ホルボール（４０μｇを含む０．２ｍＬＤＭＳＯ）またはＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）のいずれかを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１．８ｍＬ）に入れた。各サンプルを、組織ホモジナイザーを使用して１０分間ホモジナイズした。次いで、上記のように単離したホモジナイズした血管内膜切除サンプルを、ジクロロメタン（ＤＣＭ、３×５ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を、真空蒸発させた。残渣を、エタノール（０．９ｍＬ）に溶解し、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（１００μＬ、２ｍＭ、および１ＮＨＣｌ）のエタノール溶液を添加した。溶液に窒素を５分間吹き込み、その後溶液を２時間撹拌した。得られた懸濁液を、０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾過物を、ＨＰＬＣアッセイ（以下を参照のこと）によって分析した。コレステロール３（１〜２０μＭ）をこれらの条件下で処理した場合、４ａや５ａは形成されなかった。ＰＭＡ添加の前後でのアテローム性動脈抽出物中の４ｂの検出量を、動脈抽出物中の４ａレベルに対するＰＭＡ添加の有意性（ｐ＜０．０５を有意であると見なした）を決定するために両側スチューデントｔ検定分析に供し、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈＰａｄｖ３．０ソフトウェアを使用して決定した。
【０１６３】
これらの条件下での誘導体化中に、４ａの濃度範囲にわたって（５〜１００μＭ）約２０％の４ａが５ｂに変換された。これらのデータは、５ａの測定量が、同一のプラークサンプル中に存在する４ａの２０％を超えて、３のオゾン分解およびその後のアルドール化から得られたことを示す。使用した誘導体化条件下での４ａの６ｂへの変換範囲は、一貫して、４ａの濃度範囲にわたって２％未満（５〜１００μＭ）であった。これらの所見は、ケトアルデヒド４ａ量の２％を超えるプラーク抽出物内に存在する６ａの量が誘導体化前に存在し、水のβ脱離によってオゾン分解生成物から得られたことを示す。
【０１６４】
３つの主なヒドラゾン生成物４ｂ〜６ｂに加えて、７ａのヒドラゾン誘導体（７ｂと呼ばれる）は、いくつかのプラーク抽出物中にて微量で（５ｐｍｏｌ／ｍｇ未満）検出された（Ｒ_Ｔ約２６分、［Ｍ−Ｈ］⁻５７９、ＳＯＭ図２および４）。化合物７ａは、５ａのＡ環脱水生成物である。誘導体化プラーク抽出物中の７ｂの量は、使用したＨＰＬＣアッセイの検出限界付近であったため、全プラークサンプル中のこの化合物の完全な分析による調査を行わなかった。化合物７ａおよび７ｂの高次構造の割り当ては、合成材料７ｂの^１Ｈ−^１ＨＲＯＥＳＹ実験に基づいていた。
【０１６５】
【化９５】

化合物６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ、および９ａの合成調製物を、図４においてＲ_Ｔ約２６分ピーク［Ｍ−Ｈ］⁻５７９を有する化合物の同定のために使用した。
【０１６６】
（ヒドラゾンのＨＰＬＣ−ＭＳ分析。）Ｌ−７２００オートサンプラー（標準注入体積１０μＬ）、Ｌ−７１００ポンプ、Ｌ−７４００紫外線検出器（３６０ｎｍ）またはＬ−７４５５ダイオードアレイ検出器（２００〜４００ｎｍ）のいずれかおよびインラインＭ−８０００イオントラップ質量分析器（陰イオンモード）を具備するＨｉｔａｃｈｉＤ−７０００装置にてＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行った。Ｄｅｌｌ ＧＸ１５０ ＰＣコンピュータでＨｉｔａｃｈｉ−ＨＳＭソフトウェアを使用して、Ｌ−７１００およびＭ−８０００を制御した。ＶｙｄｅｃＣ_１８逆相カラムを使用してＨＰＬＣを行った。０．５ｍＬ／分で定組成移動相（７５％アセトニトリル、２０％メタノール、および５％水）を使用した。ＨｉｔａｃｈｉＤ７０００クロマトグラフィステーションソフトウェアを使用してピークの高さおよび面積を決定し、標準物質の検量線との比較によって濃度に変換した。これらの条件下で、ヒドラゾン４ｂ〜６ｂの検出限界は１〜１０ｎＭであった。このＨＰＬＣシステムを使用して、シスおよびトランスヒドラゾン異性体は解析されなかった。
【０１６７】
抽出および誘導体化されたアテローム硬化性物質の代表的ＨＰＬＣ−ＭＳを図４に示す。重要なヒドラゾン生成物のいくつかの標準サンプルの保持時間および質量比を表２に示す。
（表２ 標準ヒドラゾンのＬＣＭＳ分析）
【０１６８】
【表２】

^ａ上記の誘導体化手順によって標準アルデヒド８ａのヒドラゾンを調製し、アルデヒド８ａは適切に合成および精製されなかった。^ｂ上記の誘導体化手順によって市販のケトン９ａのヒドラゾンを調製し、適切に合成および精製されなかった。^ｃ上記の誘導体化手順によって標準アルデヒド１０ａのヒドラゾンを調製し、適切に合成および精製されなかった。^ｄ紫外線スペクトルに基づいて８ｂと９ｂとを区別した（ＨｉｔａｃｈｉＬ−７４５５ダイオードアレイ検出器（２００〜４００ｎｍ）によって測定）。α、β不飽和ヒドラゾン８ｂのλ_ｍａｘは４３５ｎｍであり、ヒドラゾン９ｂのλ_ｍａｘは４１６ｎｍであった。
【０１６９】
（アルデヒド４ａおよび５ａについての血漿サンプルの分析。）血漿サンプルを、２４時間以内に頸動脈内膜摘除術を計画している患者（ｎ＝８）から得た。全てのこのような血漿サンプルを、サンプル採取から３日後に４ａおよび５ａの存在について分析した。コントロール血漿サンプルを、一般的な診療所に通院している無作為な患者（ｎ＝１５）から得て、採取から７日後に分析した。典型的な手順では、ＥＤＴＡ（１ｍＬ）中の血漿を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、３×１ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を真空蒸発させた。残渣を、メタノール（０．９ｍＬ）に溶解し、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（１００μＬ、０．０１Ｍ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）および１ＮＨＣｌを含むエタノール溶液を添加した。溶液に窒素を５分間吹き込み、溶液を２時間撹拌した。得られた溶液を、０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾過物を、ＨＰＬＣアッセイ（以下を参照のこと）によって分析した。予備調査により、血漿から抽出し得る５ａの量が１日あたり約５％減少することが明らかとなった。
【０１７０】
（標準サンプル４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａ、および８ｂの調製。）
（一般的方法。）他で記載しない限り、全ての反応を、不活性雰囲気下で、乾燥試薬、溶媒、および火炎乾燥（ｆｌａｍｅ−ｄｒｉｅｄ）ガラス製品を使用して行った。全ての出発材料を、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｆｉｓｈｅｒ、またはＬａｎｃａｓｔｅｒから購入し、入手したままの状態で使用した。ケトン９ａを、Ａｌｄｒｉｃｈから得た。シリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）を使用して、全てのフラッシュカラムクロマトグラフィを行った。Ｍｅｒｃｋ（０．２５、０．５、または１ｍｍ）コーティングシリカゲルＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０Ｆ_２５４プレートを使用して、分離薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行った。Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−６００（６００ ＭＨｚ）、ＡＭＸ−５００（５００ ＭＨｚ）、ＡＭＸ−４００（４００ ＭＨｚ）、またはＡＣ−２５０（２５０ ＭＨｚ）分光計にて^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを記録した。Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００（１２５．７ ＭＨｚ）またはＡＭＸ−４００（１００．６ ＭＨｚ）分光計にて^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを記録した。化学シフトを、内部標準からδスケールにてパーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告する。ＶＧ ＺＡＢ−ＶＳＥにて高分解能質量スペクトルを記録した。
【０１７１】
（３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アール（４ａ））。この化合物を、一般的に、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５８，２２５（１９９３）に記載のように合成した。コレステロール３（１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を含むクロロホルム−メタノール（９：１）溶液（１００ｍＬ）を、ドライアイス温度で１０分間オゾン化した。反応混合物を、蒸発させ、Ｚｎ粉末（６５０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を含む水−酢酸（１：９、５０ｍＬ）と共に室温で３時間撹拌した。還元混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発乾燥させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（２５：７５））を使用して精製して、白色固体として表題化合物４ａ（８２０ｍｇ、７６％）を得た：
【０１７２】
【化９６】

。
【０１７３】
（３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アールの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（４ｂ））。この化合物を、一般的に、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５８，２２５（１９９３）に記載のように合成した。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（５２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）を、ケトアルデヒド４ａ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１０ｍＬ）に添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機物を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：４））によって精製して、黄色固体（１００ｍｇ、７０％）であり、且つシス異性体とトランス異性体との混合物（１：４）として表題化合物４ｂを得た。ヘキサン−塩化メチレンからの結晶化により、黄色ニードル（３０ｍｇ、２１％）としてトランス４ｂを得た：
【０１７４】
【化９７】

。
【０１７５】
（３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキシアルデヒド（５ａ））。この化合物を、一般的に、Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ ４２，６３４９（２００１）に記載のように合成した。ケトアルデヒド４ａ（８００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル−水（２０：１、１００ｍＬ）溶液に、Ｌ−プロリン（２２０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を、酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空蒸発させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：４））によって精製して、白色固体（５８０ｍｇ、７３％）として表題化合物５ａを得た：
【０１７６】
【化９８】

。
【０１７７】
（３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキシアルデヒドの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（５ｂ））。この化合物を、一般的に、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５８，２２５（１９９３）に記載のように合成した。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（５２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）および塩酸（１２Ｍ、２滴）を、アルデヒド５ａ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１０ｍＬ）に添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機物を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：４））によって精製して、黄色固体（９０ｍｇ、６２％）且つトランス５ｂフェニルヒドラゾンとして表題化合物５ｂを得た：
【０１７８】
【化９９】

。
【０１７９】
（５−オキソ−５，６−セココレスト−３−エン−６−アール（６ａ））。この化合物を、一般的に、Ｐ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｓｔｉｖｅｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６６，１２０９（１９８８）に記載のように合成した。メタンスルホニルクロリド（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を、氷浴温度のケトアルデヒド４ａ（３００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６５μＬ、０．８４ｍｍｏｌ）を含むＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）の撹拌溶液に滴下した。得られた溶液を、０℃のアルゴン下で３０分間撹拌し、トリエチルアミン（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温に加温した。２時間後、反応混合物を、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機物を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発乾燥させた。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：９））によって精製した。画分を蒸発させて、無色のオイルとしてアルデヒド６ａ（１５３ｍｇ、５３％）を得た：
【０１８０】
【化１００】

。
【０１８１】
（５−オキソ−５，６−セココレスト−３−エン−６−アールの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（６ｂ））。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（４５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を、ケトアルデヒド６ａ（８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を、塩化メチレン（１０ｍＬ）に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機物を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発乾燥させた。粗残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１５：８５））によって精製して、黄色固体（７０ｍｇ、６０％）として表題化合物６ｂを得た：
【０１８２】
【化１０１】

。
【０１８３】
（５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−３−エン−６β−カルボキシアルデヒド（７ａ））。この化合物を、一般的に、Ｐ．Ｙａｔｅｓ，Ｓ．Ｓｔｉｖｅｅｒ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６６，１２０９（１９８８）に記載のように合成した。ナトリウムメトキシドを含むメタノール（０．５Ｍ、０．１６ｍｍｏｌ）を、室温のアルゴン雰囲気下でケトアルデヒド４ａ（５０ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）の無水メタノール（１０ｍＬ）溶液に滴下した。３０分後、メタノールを真空下で除去し、残渣をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機画分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空蒸発させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：９））によって精製して、無色のオイルとしてアルデヒド７ａ（１６ｍｇ、３２％）を得た：
【０１８４】
【化１０２】

。
【０１８５】
５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−３−エン−６β−カルボキシアルデヒド（７ｂ）の２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン：２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を、アルデヒド７ａ（１５ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を、室温で２時間撹拌し、真空蒸発させ、塩化メチレン（１０ｍＬ）で希釈した。有機相を水（３×２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾燥させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：９））によって精製して、黄色固体としてヒドラゾン７ｂ（９ｍｇ、４１％）を得た：
【０１８６】
【化１０３】

。
【０１８７】
（３β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスト−５−エン−６−カルボキシアルデヒド（８ａ））。アルデヒド５ａ（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびリン酸（８５％、５ｍＬ）のアセトニトリル−塩化メチレン（１：１、４ｍＬ）溶液を、３０分間加熱還流した。反応混合物を真空蒸発させ、塩化メチレン（５０ｍＬ）で希釈し、水（３×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空蒸発させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：４））によって精製して、α，β不飽和アルデヒド８ａの表題アルデヒド１２ｍｇ（２５％）を得た：
【０１８８】
【化１０４】

。
【０１８９】
白色固体としてのＢ−ノルコレスト−３，５−ジエン−６−カルボキシアルデヒド１２ａ（２７ｍｇ、６０％）を、この反応の副生成物として得た：
【０１９０】
【化１０５】

【０１９１】
【化１０５Ａ】

。
【０１９２】
（アミノ酸でのケトアルデヒド４ａのアルドール化）。典型的な手順では、ＮＭＲチューブ中で、ケトアルデヒド４ａ（２ｍｇ、４．８μｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ−ｄ_６（８００μＬ）およびＤ_２Ｏ（８０μＬ）に溶解した。この溶液に、１当量の以下のいずれかを添加した：ａ）Ｌ−プロリン、ｂ）グリシン、ｃ）Ｌ−塩酸リジン、またはｄ）Ｌ−リジンエチルエステルジヒドロクロリド。各時点で、サンプルを、^１Ｈ ＮＭＲによって分析した。反応後、日常的に多数の^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）の共鳴の変化をモニタリングした。^１Ｈ ＮＭＲ ５ａは、以下を示す：
【０１９３】
【化１０６】

これらの条件下では、ＤＭＳＯ−ｄ_６（８００μＬ）およびＤ_２Ｏ（８０μＬ）中で４ａのアルドール化は起こらない。
【０１９４】
（アテローム硬化性動脈および血液画分でのセコケトアルデヒド４ａのアルドール化。）典型的な手順では、ケトアルデヒド４ａ（５ｍｇ、０．００１２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ−ｄ_６（８００μＬ）およびＤ_２Ｏ（８０μＬ）に溶解した。この溶液に、ａ）組織ホモジナイザーにてＰＢＳ（１ｍＬ）中にホモジナイズし、その後凍結乾燥させたアテローム硬化性動脈（２．１ｍｇ）、ｂ）凍結乾燥ヒト血液（１ｍＬ）、ｃ）凍結乾燥ヒト血漿（１ｍＬ）、またはｄ）凍結乾燥ＰＢＳ（１ｍＬ）のいずれかを添加した。各時点で、サンプルを取り出し、^１ＨＮＭＲによって分析した（上を参照のこと）。これらの条件下では、凍結乾燥ＰＢＳの存在下で４ａのアルドール化は起こらなかった。
【０１９５】
（４ａおよび５ａを使用した生物学的調査。）インビボでのコレステロールの酸化によって生成されたいくつかのオキシステロールが記載されている。Ｅ．Ｌｕｎｄ，１．Ｂｊｏｒｋｈｅｍ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８，２４１（１９９５）。さらに、細胞傷害性の天然産物の一般的スクリーニングの一部としてコレスタン側鎖の構造のみが異なる５ａのアナログを、海綿ステレッタ・ヒワサエンシス（Ｓｔｅｌｌｅｔｔａｈｉｗａｓａｅｎｓｉｓ）から単離した。Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４２，６３４９（２００１）；Ｂ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｗｅｉｓｈａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３，４１８７（２００２）。しかし、ステロール４ａおよび５ａのようなステロイド核が破壊された誘導体は、ヒトでは以前に報告されていなかった。
【０１９６】
（細胞傷害性アッセイ。）ＷＩ−Ｌ２ヒトＢリンパ球株、ＨＡＡＥ−１ヒト腹部大動脈内皮株、ＭＨ−Ｓマウス肺胞マクロファージ株、およびＪ７７４Ａ．１マウス組織マクロファージ株を、ＡＴＣＣから得た。ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）およびヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＳ）を、ＣａｍｂｒｅｘＢｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅから得た。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６−１Ｔ−リンパ球は、Ｄｒ．Ｊ．Ｋａｙｅ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から快く提供を受けた。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＡＴＣＣ推奨培地中で培養した。細胞を、５または７％ＣＯ_２を使用した制御された雰囲気下にて３７℃でインキュベートした。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイのために、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡまたは掻き取りのいずれかによって接着細胞を回収した。得られた細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し（２５，０００細胞／ウェル）、２４〜４８時間後に回収した。細胞を穏やかに洗浄し、培地を、５％ウシ胎児血清を含む新鮮な培地と交換した。２連またはそれ以上の数の細胞サンプルを、３、４ａ、または５ａ（０〜１００μＭ）のいずれかで１８時間処理した。次いで、培養物中の細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出の測定によって、細胞傷害性を決定した。簡単に述べれば、ケトアルデヒド４ａ、アルドール５ａ、またはコレステロール３のいずれかでの処理後の９６ウェルプレート中で培養された細胞のＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して、細胞上清中のＬＤＨ活性を測定した。１００％細胞傷害性を、トリパンブルー排除で示された死細胞によるＬＤＨの最大放出量または０．９％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解時に検出された最も高いＬＤＨ量と定義した。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＧｒａｐｈＰａｄ ｖ３．０ソフトウェアを使用した細胞傷害性（％）に対する濃度についての２連の生データと非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット）との比較によってＩＣ_５０値を決定した。
【０１９７】
（脂質負荷アッセイ（泡沫細胞形成）。）Ｊ７７４．１マクロファージを、８ウェルチャンバースライドにおける１０％ウシ胎児血清を含むＡＴＣＣ推奨培地中で５または７％ＣＯ_２を使用した制御された雰囲気下にて３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を、抗酸化剤である２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノールトルエン（１００μＭ）、ジエチルトリアミン五酢酸（１００μＭ）、ならびにＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）および４ａ（２０μＭ）、またはＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）および５ａ（２０μＭ）のいずれかを含む同一の培地中で７２時間インキュベートした。終了時に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。次いで、細胞を、６％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで３０分間固定し、プロピレングリコールで２分間リンスし、脂質を５ｍｇ／ｍＬＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで８分間染色した。細胞を、Ｈａｒｒｉｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで４５秒間対比染色し、６％パラホルムアルデヒドおよびその後のＰＢＳでの１回の洗浄および水道水での１回の洗浄によってバックグラウンド染色を除去した。グリセロールを使用してカバーガラスをスライドガラスの上に置き、スライド調製物を光学顕微鏡で試験した。各スライドの１視野中で計数された全部で少なくとも１００個の細胞から脂質負荷細胞数をスコアリングし、総細胞数に対する比率として示した。１００倍で写真を撮影した。
【０１９８】
（円偏光二色性。）サーモスタットで制御した（±０．１℃）０．１ｃｍの石英キュベットにおけるＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）および４ａ（１０μＭ）、ならびにＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）および５ａ（１０μＭ）を含むＰＢＳ（（ｐＨ７．４）、１％イソプロパノールを含む）の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、Ａｖｉｖ分光偏光計にて３７℃で記録した。ペプチド範囲（２００〜２６０ｎｍ）でスペクトルを記録した。シグナル：ノイズ比を増加させるために、各測定の多スペクトル（３色）を平均した。ＤｅｌｌＰＣでのＣＤＰｒｏソフトウェアスイート（Ｎａｒａｓｈｉｍａ Ｓｒｅｅｒａｍａ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して、各測定についてのモル楕円率の解析を行った。
【０１９９】
（実施例２：アテローム硬化性プラークは、オゾンおよびコレステロールオゾン分解生成物を生成する）
上記方法を使用して、本実施例は、頸動脈内膜摘除術によって１５人の患者（ｎ＝１５）から得たアテローム硬化性組織がインディゴカルミン１との反応によって検出可能なオゾンを生成し得ることを示す。
【０２００】
（アテローム硬化性プラークによって生成されたオゾンによるインディゴカルミンの漂白）
本発明者らは、以前に、抗体コーティング白血球をプロテインキナーゼＣアクチベーターである４−β−ホルボール １２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を含むインディゴカルミン１（オゾンの化学的トラップ）溶液で処理した場合、インディゴカルミン１の可視吸収が漂白され、インディゴカルミン１がスルホン酸イサチン２に変換されることを示した。例えば、Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８，２１９５（２００２）；Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）を参照のこと。スルホン酸イサチン２の構造を、図１Ａに示す。これらの実験をＨ_２^１８Ｏ（９５％超の^１８Ｏ）で行う場合、スルホン酸イサチン２のラクタムカルボニルへの同位体組み込みが認められた。同上。炎症に関連すると考えられる酸化剤のうちで、オゾンのみがインディゴカルミン１の二重結合を切断してスルホン酸イサチン２のラクタムカルボニルに同位体組み込む（Ｈ_２^１８Ｏ由来）ため、この手順によって、オゾンとインディゴカルミン１も酸化し得る他の酸化剤由来の^１Ｏ_２^＊とが区別された。（同上および図１Ａ参照）
実施例１に記載するように、頸動脈内膜摘除術によって問題のあるアテローム性動脈硬化症を有すると考えられる１５人の患者からプラーク物質を得た。各プラークを、２つの等しい部分（１ｍＬ ＰＢＳ中に懸濁した湿重量約５０ｍｇ）に分けた。各プラーク物質部分を、インディゴカルミン１（２００μＭ）およびウシカタラーゼ（５０μｇ／ｍＬ）のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（１ｍＬ）溶液に添加した。懸濁したプラーク物質の一方または他方のアリコートへんＤＭＳＯ（１０μＬ）またはミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、１０μＬ、２０μｇ／ｍＬ）の添加によって分析を開始した。
【０２０１】
ＰＭＡ添加時に１５個のプラークサンプルのうちの１４個で１の可視吸収の漂白が認められた（図１Ｂ）。逆相ＨＰＬＣ分析によって測定したところ、この漂白は、スルホン酸イサチン２の形成を伴っていた（図１ＡおよびＣ）。スルホン酸イサチンの形成量は、試験したプラーク単離物に依存して、１．０〜２６２．１ｎｍｏｌ／ｍｇに変化した。異なる単離物によって生成されたスルホン酸イサチン２の平均量は、７２．６２±２１．６９ｎｍｏｌ／ｍｇであった。
【０２０２】
懸濁されたプラーク物質のＰＭＡ活性化を、インディゴカルミン１（２００μＭ）を含むＨ_２^１８Ｏ含有ＰＢＳ（９５％超の^１８Ｏ）（ｎ＝２）中で行う場合、単離された切断生成物であるスルホン酸イサチン２の質量スペクトルにおける［Ｍ−Ｈ］⁻２２８および２３０質量フラグメントピークの相対強度によって示すように（図１Ｄ）、インディゴカルミン１の約４０％のラクタムカルボニル酸素が^１８Ｏを組み込んだ。
【０２０３】
インディゴカルミン１を使用したこれらの研究は、活性化されたアテローム硬化性プラーク物質によってオゾンが生成されたことを示す。
【０２０４】
（コレステロールのオゾン分解生成物。）アテローム硬化性プラーク中に存在する主な脂質の１つは、コレステロール３である。Ｄ．Ｍ．Ｓｍａｌｌ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ８，１０３（１９８８）。化学モデル研究では、研究者らは、^３Ｏ_２、^１Ｏ_２^＊、・Ｏ_２⁻、Ｏ_２^２−、ヒドロキシルラジカル、Ｏ_３、および・Ｏ_２^＋、およびＯ_３などの酸化剤のパネルのうち、オゾンのみがコレステロール３のΔ^５，６二重結合を切断して５，６−セコステロール４ａを生成することを示した（図２Ａ）。この所見は、５，６−セコステロール４ａがコレステロール３オゾン分解の主な生成物であることも示す他の化学分野の報告と一致する。Ｇｕｍｕｌｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，１９７２（１９８３）；Ｊａｗｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ５３，５４５（１９８８）；Ｐａｒｙｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．ｌ，１２２２（１９９０）；Ｃｏｒｎｆｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．５４，５９０（１９５３）。
【０２０５】
したがって、さらなる実験は、５，６−セコステロール４ａまたはコレステロールの他のオゾン分解生成物がアテローム硬化性プラーク中に存在するかどうかの検出および同定に関する。したがって、１４人（ｎ＝１４）のヒトアテローム硬化性プラークを、ＰＭＡでの活性化前後の５，６−セコステロール４ａの存在について調査した。
【０２０６】
Ｐｒｙｏｒ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓによって開発された分析手順の修正形態を、これらの研究で使用した。Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５８，２２５（１９９３）を参照のこと。この修正された過程は、ホモジナイズしたプラーク物質（湿重量約５０ｍｇ）のＰＢＳ（１ｍＬ、ｐＨ７）の懸濁液の有機溶媒（塩化メチレン、３×５ｍＬ）での抽出およびその後の有機画分の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンヒドロクロリド（ＤＮＰＨＨＣｌ）（２ｍＭを含むエタノール（ｐＨ６．５））のエタノール溶液での室温で２時間の処理を含んでいた。この反応混合物を、４ｂ（オゾン分解生成物４ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体）の存在についてのＨＰＬＣ（直接注入、３６０ｎｍでの紫外線検出）およびインライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析によって分析した（図３）。ヒドラゾン４ｂは、１４個の非活性化プラーク抽出物（６．８ｐｍｏｌ／ｍｇと６１．３ｐｍｏｌ／ｍｇとの間）のうちの１１個および全ての活性化プラーク抽出物（１．４ｐｍｏｌ／ｍｇと２００．６ｐｍｏｌ／ｍｇとの間）で検出された。さらに、４ｂの平均量で判断したところ、プラーク物質中の４ａの量は、ＰＭＡでの活性化時に有意に増加した。特に、ＰＭＡを使用しなかった場合、４ｂの平均量は、１８．７±５．７ｐｍｏｌ／ｍｇであった。対照的に、ＰＭＡを添加した場合、４ｂの平均量は、４２．５±１３．６ｐｍｏｌ／ｍｇ（ｎ＝１４、ｐ＜０．０５）であった（図３Ａ〜Ｂ）。
【０２０７】
４ｂに加えて、プラーク抽出物のＨＰＬＣ分析時に２つの他の主なヒドラゾンピークが認められた。第１のピークは、Ｒ_Ｔ約２０．５分および［Ｍ−Ｈ］⁻＝５９７であり、第２のピークは、Ｒ_Ｔ約１８．０分および［Ｍ−Ｈ］⁻５９７であった（図３Ａ、Ｂ）。ヒドラゾン４ｂの保持時間は約１３．８分であるため（Ｒ_Ｔ約１３．８分、［Ｍ−Ｈ］⁻５９７）、これらのピークと容易に区別可能であった（図３Ａ、Ｂ）。標準サンプルとの比較によって、Ｒ_Ｔ約２０．８分のピークは、アルドール縮合生成物５ａのヒドラゾン誘導体５ｂであると判断した（図２および３Ｅ）。化学モデル研究では、Ｐｒｙｏｒは、４ａのヒドラジン誘導体の主な副生成物がアルドール縮合生成物５ａのヒドラゾン誘導体５ｂであり、その相対量が酸濃度および反応時間の両方の関数であることを以前に示していた。Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５８，２２５（１９９３）。
【０２０８】
使用した誘導化条件下での４ａの５ｂへの変換範囲は、試験した４ａ濃度範囲（５〜１００μＭ）にわたり約２０％であった。しかし、２０％を超える変換もしばしば認められた。同一のプラークサンプル中に存在する４ａが２０％を超えた５ａの測定量は、３のオゾン分解の後のアルドール化からに起因する可能性が高かった。
【０２０９】
アミノ基またはカルボキシル基を含む多数の生化学構成要素は、アルドール化反応を触媒し得る。このような成分は、プラークおよび血液中に存在し、４ａの５ａへの変換を容易にし得る。さらなる実験により、以下のアミノ酸および材料が４ａの５ａへの変換を容易にすることが示された：Ｌ−Ｐｒｏ（２時間、完全な変換）、Ｇｌｙ（２４時間、完全な変換）、Ｌ−Ｌｙｓ・ＨＣｌ（２４時間、完全な変換）、Ｌ−Ｌｙｓ（ＯＥｔ）／２ＨＣｌ（１００時間、６２％変換）、ならびにアテローム性動脈（２２時間、完全な変換）、全血（１５時間、完全な変換）、血漿（１５時間、完全な変換）、および血清（１５時間、完全な変換）由来の抽出物。バックグラウンド反応と比較して、このような薬剤は全て４ａの５ａへの変換を促進した。
【０２１０】
上記のように、プラーク内のケトアルデヒド４ａ量は、ＰＭＡ活性化時に増加した。しかし、５ａの形成におけるＰＭＡの効果はあまり明確ではなかった。いくつかの場合、５ａレベルは、ＰＭＡ活性化後に増加する一方で（図５Ｂ、患者ＦおよびＨ）、他の場合、５ａレベルはＰＭＡ活性化後に減少した（図５Ｂ、患者Ｃ、Ｇ、およびＮ）。
【０２１１】
質量スペクトル（図２Ｂ）における２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体のピーク［Ｍ−Ｈ］⁻が５７９であった多数のカルボニル含有ステロイド誘導体６ａ〜９ａを合成し、１８分での５７９のピーク［Ｍ−Ｈ］⁻５７９の同定を補助するために分析した（図３Ａ、Ｂ）。ＨＰＬＣ同時注入、標準サンプルの陰イオンエレクトロスプレー質量分析、および紫外線スペクトルとの比較により、約１８分のピークは、６ｂ、６ａのヒドラゾン誘導体、および４ａのＡ環脱水生成物であると判断された（図３Ｄ）。誘導体化のために選択した標準的条件下で４ａの６ｂへの変換範囲を調査した。この変換範囲は、試験した４ａ濃度範囲（５〜１００μＭ）にわたり２％未満であることが見出された。これらのデータは、抽出物内のケトアルデヒド４ａ量の２％を超えるプラーク抽出物内の６ａの存在量が誘導体化前に存在し、水のβ脱離によるオゾン分解生成物４ａに起因することを示す。
【０２１２】
３つの主なヒドラゾン生成物４ｂ〜６ｂに加えて、別の生成物７ｂを検出し、７ａのヒドラゾン誘導体および５ａのＡ環脱水生成物であると判断した。この生成物（７ｂ）は、いくつかのプラーク抽出物中にて微量で（５ｐｍｏｌ／ｍｇ未満）存在し、保持時間は、約２６分であった（［Ｍ−Ｈ］⁻５７９、図４）。しかし、プラーク抽出物中の７ｂの量は、使用したＨＰＬＣアッセイの検出限界付近であったため、全プラークサンプル中のこの化合物の有無に関する完全な分析による調査を依然として行わなかった。
【０２１３】
活性化プラーク物質がオゾンの化学的サイン（ｃｈｅｍｉｃａｌｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を伴ってインディゴカルミン１の二重結合を酸化的に切断し、公知の化学的性質にしたがってオゾンに固有の経路によってコレステロール３のΔ^５，６二重結合が切断されるという実験的証拠により、アテローム硬化性プラークがオゾンを生成し得るという有力な証拠が得られる。さらに、プラーク活性化前にコレステロールのこれらの固有の酸化生成物も存在するため、アテローム硬化性プラークの発生時にもオゾンが生成される可能性が高い。
【０２１４】
外因的に投与したオゾンが、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−８、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、血小板凝集因子（ＰＡＦ）、成長関連癌遺伝子（Ｇｒｏ）−α、核因子（ＮＦ）−κＢ、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの活性化によってインビボで炎症性を示すことが十分に確立されている。これらの一般に公知の炎症におけるオゾンの効果に加えて、この部位で生成された場合に疾患の開始および永久化についての内因的に生成されたオゾンの病理学的役割が増大し得るアテローム硬化性プラークに固有の環境が存在する。任意の生成されたオゾンを捕捉し得る他の反応性物質の非存在下で必須の高濃度のオゾンおよびコレステロールがプラーク部位のみで生じるため、コレステロールのオゾン分解はプラークに固有であり得る。
【０２１５】
アテローム硬化性動脈が抗体および^１Ｏ_２^＊生成系の両方を含む範囲で、活性化マクロファージおよびミエロペルオキシダーゼの形態で、アテローム硬化性病変が抗体触媒水酸化経路を介してＯ_３を生成し得る可能性が高い。実際、３のΔ^５，６二重結合が切断されて４ａが得られるという所見は、炎症における抗体触媒によるオゾン生成のさらなる証拠である。多数のオキシステロールが、インビボでのコレステロールの酸化によって生成されることが知られており、細胞傷害性の天然産物の一般的スクリーニングの一部としてコレスタン側鎖の構造のみが異なる５ａのアナログを、海綿ステレッタ・ヒワサエンシスから単離した。Ｔ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋｏｄａｍａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｗ．Ｍ．Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ ４２，６３４９（２００１）；Ｂ．Ｌｉｕ，Ｚ．Ｗｅｉｓｈａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４３，４１８７（２００２）。しかし、ステロール４ａから６ａのようなステロイド核が破壊された誘導体は、本発明者らの知る限り、ヒトでは以前に全く報告されていなかった。したがって、他のこのようなステロイドおよびその誘導体の検索を促し、その生物学的機能を調査することが重要である。
【０２１６】
（実施例３：コレステロールオゾン分解生成物は、アテローム性動脈硬化症患者の血流中に存在する）
本発明者らは、以前に、抗体触媒水酸化経路でオゾンが生成され、オゾンが強い酸化剤として炎症で役割を果たし得ることを示している。Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８，２１９５（２００２）；Ｂ．Ｍ．Ｂａｂｉｏｒ，Ｃ．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｊ．Ｒｕｅｄｉ，Ａ．Ｇｕｉｔｉｅｒｒｅｚ，Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，３９２０（２００３）；Ｐ．Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，１４９０（２００３）
炎症は、アテローム性動脈硬化症の病原因子と考えられる。Ｒ．Ｒｏｓｓ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０，１１５（１９９９）；Ｇ．Ｋ．Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｐ．Ｌｉｂｂｙ，Ｕ．Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，Ｚ．−Ｑ．Ｙａｎ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１，２８１（２００２）。しかし、本発明の前に、炎症性動脈疾患と他の炎症性過程とを区別し得る特異的な非浸襲性の方法は利用できなかった。アテローム硬化性プラークの固有の組成物およびアテローム硬化性プラーク物質によって血流に放出された生成物は、このような方法を提供し得る。特に、アテローム硬化性病変は、高濃度のコレステロールを含む。本明細書中に示すように、オゾンはアテローム硬化性病変によって生成され、４ａなどのコレステロールオゾン分解生成物および／またはそのアルドール化生成物５ａもアテローム硬化性病変によって生成される。したがって、このようなコレステロールオゾン分解生成物がアテローム性動脈硬化症などの炎症性動脈疾患のマーカーであり得るかどうかを確認するためにさらなる実験を行った。
【０２１７】
患者の２つのコホート由来の血漿サンプルを、４ａまたは５ａのいずれかの存在について分析した。コホートＡは、血管内膜切除術を必要とするのに十分に進行したアテローム性動脈硬化症の病態を有する患者（ｎ＝８）から構成された。コホートＢ患者は、一般的な診療所に通院している無作為に選択された患者であった。コホートＡの８人の患者のうちの６人で、７０〜１６９０ｎＭ（約１〜１０ｎＭがアッセイの検出限界である）の範囲の量でアルドール５ａが検出された（図５Ａ〜Ｃ）。コホートＢ由来の１５の血漿サンプルのうちのたった１つで、検出可能な５ａが存在した。ケトアルデヒド４ａは、いかなる患者の血液サンプル中でも検出されなかった（約１〜１０ｎＭがアッセイの検出限界である）。これらのデータは、４ａが血液中に含まれる触媒によって５ａに変換されるか、血漿内の成分が４ａおよび５ａに対して異なる親和性を有することを示す。
【０２１８】
以前は、「オキシステロール」の血清分析は、コレステロールの自己酸化の問題によって困難に満ちていた。Ｈ．Ｈｉｅｔｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｐ．Ｂｅｃｋ，Ｇ．Ｏｕｒｉｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌｕｕ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９，７５（１９８６）。しかし、本明細書中に記載のように、コレステロール３の生物学的に関連する酸化によって生成されたコレステロールの全ての酸化生成物のうち、ステロイド誘導体４ａおよび５ａはオゾンに固有である。これらの研究は、どのＤＮＰヒドラゾン誘導体５ｂとして検出された血漿中のアルドール化生成物５ａの存在がアテローム性動脈硬化症のマーカーであり得ることを示す。したがって、オゾンの抗体触媒生成は、アテローム性動脈硬化症を引き起こす病理学的カスケードへのコレステロール蓄積、炎症、酸化、および細胞損傷の一見独立した別の因子と関連し得る。
【０２１９】
いくつかの研究は、コレステロール酸化生成物が細胞傷害性、アテローム発生性、および変異原性などの生物活性を有することを示す。Ｈ．Ｈｉｅｔｔｅｒ，Ｐ．Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｐ．Ｂｅｃｋ，Ｇ．Ｏｕｒｉｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌｕｕ，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９，７５（１９８６）；Ｊ．Ｌ．Ｌｏｒｅｎｓｏ，Ｍ．Ａｌｌｏｒｉｏ，Ｆ．Ｂｅｒｎｉｎｉ，Ａ．Ｃｏｒｓｉｎｉ，Ｒ．Ｆｕｍａｇａｌｌｉ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１８，７７（１９８７）；Ａ．Ｓｅｖａｎｉａｎ，Ａ．Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，４１９８（１９８４）。コレステロール酸化生成物４ａおよび５ａが以前にヒトで生じると見なされていなかったことから考えると、アテローム発生の重要な局面に対するこれらの化合物の効果を下記のようにさらに調査した。
【０２２０】
（実施例４：コレステロールオゾン分解生成物の細胞傷害性）
いくつかのコレステロール酸化生成物は、細胞傷害性、アテローム発生性、および変異原性などの生物活性を有する。本実施例では、種々の細胞株に対する４ａおよび５ａの細胞傷害効果を分析した。
【０２２１】
以下の細胞株を本研究で使用した：Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ２２，５１７（１９６８）に記載のヒトＢリンパ球（ＷＩ−Ｌ２）；Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１２３（１９８４）に記載のＴリンパ球細胞株（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）；Ｆｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，５２１７（１９７９）に記載の血管平滑筋細胞株（ＶＳＭＣ）および腹大動脈内皮（ＨＡＥＣ）細胞株；Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４３，１５２８（１９７６）に記載のマウス組織マクロファージ（Ｊ７７４Ａ．１）；およびＭｂａｗｕｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４６，１１９（１９８９）に記載の肺胞マクロファージ細胞株（ＭＨ−Ｓ）。
【０２２２】
化学合成された４ａおよび５ａは、アテローム硬化性プラーク内に存在することが公知の一定範囲の細胞型（白血球、血管平滑筋細胞、および内皮細胞）に対して細胞傷害性を示す。結果を図６および表３に示す。
【０２２３】
（表３）
【０２２４】
【表３】

４ａおよび５ａのＩＣ_５０値は、試験した全細胞株で非常に類似している。さらに、試験最多細胞株に対する化合物４ａおよび５ａの細胞傷害性プロフィールは非常に類似していた。これらの結果は、４ａと５ａとの間の有意な構造の相違を考慮すれば驚くべきものであった。しかし、４ａおよび５ａは、アミノ酸などの細胞成分によって促進される過程で互いに釣り合っており（上記を参照のこと）、４ａおよび５ａは、細胞傷害アッセイの時間枠内で互いに釣り合い得る。したがって、化合物４ａおよび５ａは、インビボで類似の細胞傷害性を有し得る。
【０２２５】
類似の手順を使用して、化合物６ａ、７ａ、７ｃ、１０ａ、１１ａ、および１２ａは、白血球細胞株に細胞傷害性を示すことが本発明者らによって示され、セコケトアルデヒド４ａおよびそのアルドール付加体５ａは、神経細胞株に細胞傷害性を示すことが示された。７ｃ化合物は以下の構造を有する。
【０２２６】
【化１０７】

オゾンおよびコレステロールの並列により、ｉｎ ｓｉｔｕで生成される細胞傷害ステロイド４ａ〜１２ａおよび７ｃを得ることができ、内皮または平滑筋の細胞損傷の促進またはアテローマ内の炎症細胞のアポトーシスの誘発による損傷の進行で役割を果たし得る（上記を参照のこと）。前に記載したアテローム硬化性プラークの結晶相内のコレステロールのオゾン分解は、動脈閉塞前の最終工程であると考えられるプラークの不安定化に寄与し得る。
【０２２７】
（実施例５：コレステロールオゾン分解生成物は、泡沫細胞形成を促進し、ＬＤＬおよびアポタンパク質Ｂ_１００構造を変化させる）
そのアテローム発生性を増大させる低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の修飾は、心血管疾患の発症における極めて重要な事象と考えられる。Ｄ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２０９６３（１９９７）。例えば、ＬＤＬまたはＣＤ３６および他のマクロファージスカベンジャー受容体を介したマクロファージへのＬＤＬ取り込みを増大させるアポタンパク質Ｂ_１００（アポＢ−１００、ＬＤＬのタンパク質成分）に対する酸化的修飾は、アテローム性動脈硬化症の発症における重要な原因となる病理学的事象と見なされる。本実施例は、コレステロールオゾン分解生成物４ａおよび５ａがマクロファージからの泡沫細胞の形成を促進し、ＬＤＬおよびアポＢ−１００の構造を修飾し得ることを示す実験を記載する。
【０２２８】
実施例１に記載のように、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を、非活性化マウスマクロファージ（Ｊ７７４．１）の存在下で４ａおよび５ａとインキュベートした。４ａまたは５ａへの曝露後、これらのマクロファージは脂質負荷を開始し、泡沫細胞が反応容器中に出現し始める（図７）。
【０２２９】
さらに、ヒトＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）の４ａおよび５ａ（１０μＭ）とのインキュベーションにより、円偏光二色性によって検出したところ、アポＢ−１００の構造が時間依存性に変化した（図８Ｂ、Ｃ）。４ａおよび５ａを含まない総ＬＤＬの円偏光二色性分析により、ＬＤＬの二次構造が一般に実験期間（４８時間）にわたり安定していることが明らかとなった（図８Ａ）。図８Ａに示すように、正常なＬＤＬのタンパク質含有量は、αヘリックス構造が大部分を占め（約４０±２％）、β構造（約１３±３％）、βターン（約２０±３％）、およびランダムコイル（２７±２％）はより少ない。しかし、４ａおよび５ａとインキュベートしたＬＤＬのスペクトルの形状が天然のＬＤＬと幾らか類似している一方で（図８ＢおよびＣ）、二次構造が有意に喪失し、主に、αヘリックス構造が喪失し（４ａ、約２３±５％；５ａ、約２０±２％）、同様にランダムコイルはより高い比率で喪失する（４ａ、約３９±２％；５ａ、３２±４％）。したがって、４ａおよび５ａコレステロールオゾン分解生成物は、ＬＤＬの構造完全性を損なわせるようである。
【０２３０】
ＬＤＬ構造を修飾するために、４ａおよび５ａのコレステロールオゾン分解生成物のアルデヒド部分とアポＢ−１００リジン残基のε−アミノ側鎖との間で共有結合性反応が起こりシッフ塩基またはエナンチオマー中間体が形成され得るが、これらはマロンジアルデヒドおよび４−ヒドロキシノネナールのアポＢ−１００との反応で以前に見出された化合物に類似する。Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，３８８３（１９８４）；Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １，１３５（１９８７）；Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．２８，１４６６（１９８７）。このようなシッフ塩基またはエナミン中間体は、有意な寿命を有し、誘導体化ＬＤＬをマクロファージスカベンジャー受容体によって認識される形態にし得る。したがって、４ａおよび５ａコレステロールオゾン分解生成物とポＢ−１００−ＬＤＬとの間の共有反応により、マクロファージスカベンジャー受容体によってより早い速度で認識および取り込まれ、それにより図７で認められる泡沫細胞を生成する誘導化アポＢ−１００−ＬＤＬ複合体を生成し得る。
【０２３１】
アルデヒド成分を含むコレステロールの唯一の公知の酸化形成は、４ａおよび５ａオゾン分解生成物である。したがって、このようなコレステロール誘導体とＬＤＬ／アポＢ−１００との間の反応により、これまで見逃されていたコレステロール間の結合、泡沫細胞形成、動脈プラーク形成を得ることができる。したがって、患者の血流中の高レベルの４ａおよび５ａのオゾン分解生成物の検出により、患者のアテローム性動脈硬化症の範囲を直接測定し得る。
【０２３２】
（実施例６：コレステロールオゾン化生成物に対する抗体の精製）
本実施例は、コレステロールのオゾン化生成物およびヒドラゾン生成物と反応し得る式１３ａ、１４ａ、または１５ａを有するハプテンに対して生成された抗体を記載する。式１３ａ、１４ａ、または１５ａを有するハプテンの構造を以下に示す。
【０２３３】
【化１０８】

化合物１３ａは、４−［４−ホルミル−５−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソ−シクロヘキシル）−７ａ−メチル−オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル］ペンタン酸である。
【０２３４】
【化１０９】

（方法）
化合物１３ａ、１４ａ、または１５ａのＫＬＨ抱合体を調製した。標準的な手順によって、マウスをこれらのＫＬＨ抱合体で免疫化した。マウスから脾臓を取り出し、抗体産生細胞として脾臓細胞を得るために懸濁した。
【０２３５】
脾臓細胞およびマウス骨髄腫由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１）を、予め３７℃に加温した無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に同時懸濁して、それぞれ３×１０^４細胞／ｍＬおよび１×１０^４細胞／ｍＬの細胞密度を得た。懸濁液を遠心分離して沈殿を回収した。沈殿に、５０ｗ／ｖ％ポリエチレングリコールを含む１ｍＬの無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）を１分間滴下し、その後得られた混合物を３７℃で１分間インキュベートした。無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）を混合物にさらに滴下して最終体積を５０ｍＬとし、遠心分離によって沈殿を回収した。沈殿をＨＡＴ培地中に懸濁し、２００μＬアリコートを９６ウェルマイクロプレートに分注した。マイクロプレートを３７℃で１週間インキュベートし、約１，２００型のハイブリドーマが形成された。ハイブリドーマ由来の上清を、免疫アッセイによってコレステロールオゾン化生成物への結合について分析した。
【０２３６】
式１５ａを有する化合物から惹起されたハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５およびＫＡ１−７Ａ６は、ブダペスト条約にしたがって、２００３年８月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９ ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２７およびＰＴＡ−５４２８として受託された。式１４ａを有する化合物から惹起されたハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−ｌＥ９も、ブダペスト条約にしたがって、２００３年８月２９日にＡＴＣＣにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０として受託された。
【０２３７】
ハプテン１５ａのＫＬＨ抱合体に対して産生されたモノクローナル抗体調製物ＫＡ１−７Ａ６：６およびＫＡ１−１１Ｃ５：６ならびにハプテン１４ａのＫＬＨ抱合体に対して産生されたＫＡ２−８Ｆ６およびＫＡ２−１Ｅ９のプールを生成した。オゾン化生成物５ａおよびコレステロールハプテン３ｃに対する１５ａに対して誘発されたＫＡ１−７Ａ６：６およびＫＡ１−１１Ｃ５：６モノクローナル抗体の結合力価をＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。１３ｂ、１４ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃに対する（オゾン化生成物５ａに対して誘発された）ＫＡ２−８Ｆ６：４およびＫＡ２−１Ｅ９：４抗体の結合力価を決定するためにもＥＬＩＳＡアッセイを行った。
【０２３８】
コレステロールハプテン３ｃの構造を以下に提供する。
【０２３９】
【化１１０】

ＥＬＩＳＡアッセイを以下のように行った。１３ａ、１４ａ、３ｃ、１３ｂ、１４ｂ、または１５ａのＢＳＡ抱合体を、個別にハイバインド９６ウェルマイクロタイタープレート（ＦｉｓｃｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ．）に添加し、４℃で一晩静置した。プレートを、ＰＢＳで十分に洗浄し、ミルク溶液（１％ｗ／ｖを含むＰＢＳ、１００μＬ）を添加した。プレートを室温で２時間静置し、その後ＰＢＳで洗浄した。異なる抗体調製物を含む培養物をＰＢＳで連続希釈し、５０μＬの各希釈物を個別に各列の第１のウェルに添加した。混合および希釈後、プレートを４℃で一晩静置した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（０．０１μｇ、５０μＬ）を添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質溶液（５０μＬ）（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（０．１ｍｇを含む１０ｍＬの酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）および過酸化水素（０．０１％％ｗ／ｖ）））を添加した。プレートを、暗所で３０分間発色させた。硫酸（１．０Ｍ、５０μＬ）を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０２４０】
報告した力価は、５０％の最大光学密度に対応する血清希釈物である。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ ｖ３．０を使用して分析し、少なくとも２連の測定値の平均値として報告する。
【０２４１】
（結果）
ＥＬＩＳＡ試験の結果を、表４および５に示す。
【０２４２】
（表４：１５ａ、オゾン化生成物５ａ、およびコレステロールハプテン３ｃに対する抗１５ａ抗体ＫＡ１−７Ａ６：６およびＫＡ１１１Ｃ５：６の結合力価）
【０２４３】
【表４】

^＊力価を、１５ａ、５ａ、および３ｃのＢＳＡ抱合体に対するＥＬＩＳＡによって測定した。絶対値は、結合した場合に５０％の最大吸収に対応する抗体の組織培養上清液の希釈係数である。
【０２４４】
表４に示すように、上記のように測定した見かけ上の結合親和性はほとんど同一である。
【０２４５】
（表５：１５ｂ、１４ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃに対して５ａに誘発されたＫＡ２−８Ｆ６：４およびＫＡ２−１Ｅ９：４の結合力価）
【０２４６】
【表５】

^＊力価を、１５ｂ、１４ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃのＢＳＡ抱合体に対するＥＬＩＳＡによって測定した。絶対値は、１３ｂ、１５ｂ、およびコレステロールハプテン３ｃのＢＳＡ抱合体に結合した場合に５０％の最大吸収に対応する抗体の組織培養上清液の希釈係数である。
【０２４７】
これらの結果は、高親和性抗体調製物をコレステロールオゾン化生成物に対して生成し得ることを示す。
【０２４８】
（実施例７：コレステロールオゾン化生成物のさらなる検出方法）
本実施例は、コレステロールオゾン化生成物を種々の手順（これらのオゾン化生成物上の遊離アルデヒド基の蛍光部分への抱合およびこれらのオゾン化生成物と反応性を示す抗体の使用が含まれる）によって検出し得ることを例示する。
【０２４９】
（材料および方法）
（一般的方法）
他で記載しない限り、全ての反応を、乾燥試薬、溶媒、および火炎乾燥（ｆｌａｍｅ−ｄｒｉｅｄ）ガラス製品を使用して行った。他で記載しない限り、出発材料を、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入し、入手したままの状態で使用した。コレステロール−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ_６］を、ＭＥＤＩＣＡＬ ＩＳＯＴＯＰＥＳ，ＩＮＣから購入した。フラッシュカラムクロマトグラフィを、シリカゲル６０（２３０−４００メッシュ）を使用して行った。コレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａならびにオゾン化生成物４ａおよび５ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（それぞれ４ｂおよび５ｂ）を、前の実施例に記載のように合成した。Ｍｅｒｃｋ（０．２５ｍｍ）コーティングシリカゲルＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ_２５４プレートを使用して薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行い、パラアニスアルデヒド色素で視覚化した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−６００（６００ ＭＨｚ）分光計で記録した。^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−６００（１５０ ＭＨｚ）分光計で記録した。化学シフトを、外部標準からδスケールにてパーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で報告する。
【０２５０】
（３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セココレスタン−６−アールのダンシルヒドラゾン（４ｄ）の合成）
ダンシルヒドラゾン（５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ）を、コレステロールオゾン化生成物４ａ（６５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（８ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を、アルゴン雰囲気下にて室温で２時間撹拌し、真空下で蒸発乾燥させた。残渣を塩化メチレン（１０ｍＬ）に溶解し、水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮した。粗黄色オイルを、シリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−ヘキサン（１：１；７：３））によって精製して、幾何異性体の混合物（シス：トランス＝８：９２）として表題化合物４ｄ（７０ｍｇ、６８％）を得た：
【０２５１】
【化１１１】

^＊２Ｃは、このシグナルがダンシル部分由来の２つの炭素シグナル（ｇＨＳＱＣあたりＣ_０）に対応すると考えられることを示す。
【０２５２】
（３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレスタン−６β−カルボキシアルデヒドのダンシルヒドラゾン（５ｃ）の合成）
コレステロールオゾン化生成物５ａ（３０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）溶液に、ダンシルヒドラジン（２５ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）および塩酸（濃縮、０．０５ｍＬ）を添加した。直後に形成された白色沈殿を、水（０．２ｍＬ）の添加によって溶解した。均質な反応混合物を、アルゴン雰囲気下にて室温で３時間撹拌し、蒸発乾燥させた。赤色残渣を、酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空蒸発させた。粗黄色オイルを、最初にシリカゲルクロマトグラフィ（酢酸エチル−塩化メチレン（１：４〜１：１））によって精製し、その後分離ＨＰＬＣ（Ｃ１８Ｚｏｒｂａｘ ２１．２２ｍｍおよび２５ｃｍ、１００％アセトニトリル）によって精製して、幾何異性体の混合物（シス：トランス＝１７：８３）として表題化合物５ｃ（１４．５ｍｇ、３０％）を得た：
【０２５３】
【化１１２】

。
【０２５４】
（３β−ヒドロキシ−５−オキソ−５，６−セコ−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ_６］−コレスタン−６−アール（Ｄ_６−４ａ）の合成）
オゾンと酸素の気体混合物を、−７８℃のＤ_６−コレステロール（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の５ｍＬクロロホルム−メタノール（９：１）溶液に１分間吹き込み、それにより溶液がわずかに青色に変わった。反応混合物を、蒸発させ、Ｚｎ粉末（４０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）の２．５ｍＬ酢酸−水（９：１）と室温で３時間撹拌した。この不均一な混合物を、塩化メチレン（１０ｍＬ）で希釈し、水（３×５ｍＬ）およびブライン（５ｍＬ）で洗浄した。有機画分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン−酢酸エチル（５：１、３：１、および２：１））によって精製して、白色固体（４４ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）として表題化合物を得た：
【０２５５】
【化１１３】

。
【０２５６】
（３β−ヒドロキシ−５β−ヒドロキシ−Ｂ−ノルコレステロール−［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ_６］−６β−カルボキシアルデヒド（Ｄ_６−５ａ）の合成）
Ｄ_６−４ａ（２６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル−水（２０：１、５ｍＬ）溶液に、Ｌ−プロリン（１１ｍｇ）を添加した。反応混合物を室温で２．５時間撹拌し、真空蒸発させた。残渣を、酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（２×５ｍＬ）およびブラインで洗浄した。有機画分を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、ＮＭＲ分析で純粋な白色固体（２６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、収率：１００％）を得た：
【０２５７】
【化１１４】

。
【０２５８】
（４−（５−（４−ヒドロキシ−１−メチル−２−オキソシクロヘキシル）−７α−メチル−４−（２−オキソエチル）−オクタヒドロ−１Ｈ−インデン−１−イル）ペンタン酸１５ａの合成）
Ｄ_６−５ａに記載のように、３β−ヒドロキシコレスト−５−エン−２４−イン酸３ｃのオゾン分解を行った。
【０２５９】
【化１１５】

。
【０２６０】
（コレステロールオゾン化生成物の抽出）
修正Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ法を使用して、血液および組織サンプルの両方から総脂質を抽出した。Ｂｌｉｇｈ ＥＧ，Ｄ．Ｗ．Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９５９，３７，９１１−１７を参照のこと。抗凝固剤としてクエン酸塩およびＥＤＴＡを含むＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ中に採取し、４℃で保存したヒト血漿（２００μＬ）を、リン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５Ｍ、３００μＬ）を含む蓋付きガラスチューブに添加した。メタノール（５００μＬ）を添加し、サンプルを短時間ボルテックスした。クロロホルム（１ｍＬ）を添加し、サンプルを２分間ボルテックスし、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、有機相を除去した。このクロロホルム添加プロセス、ボルテックス、および遠心分離を繰り返した。合わせた有機画分を合わせ、真空蒸発させた。日常的適用のために頸動脈内膜摘除術を受けた患者から血管内膜切除試料を得た。ＳｃｒｉｐｐｓＧｒｅｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄは、ヒト被験体プロトコールを承認した。試料を凍結し、分析前に−７０℃で保存した。分析のために、組織サンプルを室温に加温し、組織ホモジナイザー（Ｔｅｋｍａｒ）を使用して、水性緩衝液（ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５Ｍ、１〜２ｍＬ）中でホモジナイズした。ホモジネートを、メタノール：クロロホルム（１：３、６ｍＬ）溶液に添加し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。有機画分を回収した。クロロホルム（６ｍＬ）を残存する水混和性画分に添加し、サンプルを遠心分離した（３０００ｒｐｍで５分間）。次いで、合わせた有機画分を、真空蒸発させた。
【０２６１】
（ダンシルヒドラジンでの誘導体化および抽出されたコレステロールオゾン化生成物のＨＰＬＣ分析）
蒸発させた血液または組織抽出物（上記を参照のこと）を、ダンシルヒドラジン（２００μＭ）およびＨ_２ＳＯ_４（１００μＭ）を含むイソプロパノール（２００μＬ）中に再懸濁し、３７℃で４８時間インキュベートした。分析方法は、蛍光検出（励起波長３６０ｎｍ、放射波長４５０ｎｍ）を使用したアセトニトリル：水（９０：１０、０．５ｍＬ／分）の定組成移動相を使用したＶｙｄｅｃＣ−１８ ＲＰカラムに接続されたＨｉｔａｃｈｉ Ｄ−７０００ ＨＰＬＣシステムでのＨＰＬＣ分析を含んでいた。オゾン化生成物５ａのダンシル誘導体（５ｃ）の保持時間（Ｒ_Ｔ）は、約８．１分であった。５ａ（５ｂ）のヒドラジン誘導体の保持時間は、約１０．７分であった。ＭａｃｉｎｔｏｓｈＰＣおよびＰｒｉｓｍ ４．０ソフトウェアを使用して標品を参照したピーク面積計算によって、濃度を日常的に決定した。
【０２６２】
（ガスクロマトグラフィ−質量分析）
蒸発させた試料を、塩化メチレンで１ｍＬに再構成し、濃縮プラーク抽出物への１％トリメチルクロロシランを含む１００μＬピリジンおよび１００μＬＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）−トリフルオロアセトアミドの添加によってシリル化した。サンプルを、３７℃で２時間インキュベートし、回転蒸発によって蒸発乾燥させた。分析前に各サンプルを１００μＬ塩化メチレンに再懸濁した。２．５μＬのサンプルをスプリットレス注入（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（Ａｇｉｌｅｎｔ ７６７３オートサンプラー）でＨＰ−５ｍｓカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ×０．２５μｍフィルム厚、流速１．２ｍＬ／分）に注入し、インジェクター温度は２９０℃であり、温度プログラムは５０℃から開始し、５分間保持し、その後３００℃まで２０℃／分でランプ制御し、１２分間保持した。Ａｇｉｌｅｎｔｍｏｄｅｌ ５９７３ ｉｎｅｒｔ（スキャン範囲５０〜７００ｍ／ｚ、その後の選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）はｍ／ｚ ３５４および３６０をスキャンする）で質量分析を行った。ＭＳの四重極（ｑｕａｄ）温度は１５０℃であり、ＭＳソース温度は２８０℃であった。
【０２６３】
（キャリアタンパク質ＫＬＨおよびＢＳＡへのハプテン１５ａのカップリング）
１−エチル−３，３’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ、１．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）およびスルホＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．８ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を、０．０１ｍＬＨ_２Ｏに溶解し、ハプテン（２．５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）の０．１ｍＬ ＤＭＦ溶液に添加した。混合物をボルテックスし、室温で２４時間保持し、その後ＢＳＡ（５ｍｇ）を含むＰＢＳ緩衝液（０．９ｍＬ、０．０５ｍＭ、ｐＨ７．５）に４℃で添加した。この最終混合物を、４℃で２４時間保持し、−２０℃で保存した。化合物１５ａのＫＬＨまたはＢＳＡ抱合体の合成に関与する反応を以下に示す。
【０２６４】
【化１１６】

反応ａは、上記のように、Ｏ_３／Ｏ_２での化合物３ｃのオゾン分解を含んでいた。反応ｂは、ＥＤＣおよびＨＯＢｔを含むＤＭＦでの化合物１５ａの一晩の処理およびその後のＢＳＡまたはＫＬＨを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）とのインキュベーションを含んでいた。
【０２６５】
標準的な方法によって、モノクローナル抗体を産生した。８週齢の１２９ＧＩＸ＋マウスを、同体積のＲＩＢＩアジュバントと混合したマウスあたり１０μｇＫＬＨ−１５ａ抱合体を含む５０μＬ ＰＢＳを、３日毎に全部で５回のＩＰ注射による免疫化によって免疫化した。血清力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。３０日後、５０μｇＫＬＨ−１５ａ抱合体を含む１００μＬ ＰＢＳの最終の静脈内（ＩＶ）注射を外側の尾静脈に行った。動物を屠殺し、融合のために脾臓を３日後に取り出した。免疫化動物由来の脾臓細胞を、遠心分離したＲＰＭＩ培地中でＸ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と５：１で混合し、３７℃の１ｍＬＰＥＧ １５００に再懸濁した。ＰＥＧを、９ｍＬのＲＰＭＩで３分間にわたって希釈し、３７℃で１０分間インキュベートし、遠心分離し、培地に再懸濁し、１５×９６ウェルプレートに入れた。コレステロールオゾン化生成物４ａまたは５ａに結合するがコレステロールに結合しない抗体をスクリーニングするために、ＥＬＩＳＡを行った。選択されたハイブリドーマを、２世代サブクローニングして単一クローン性を保証した。
【０２６６】
（ＡｐｏＥノックアウトマウスの上行大動脈由来の組織学的切片の調製）
試料を液体窒素中で瞬間凍結した。１０ミクロンの切片を採取し、スライドガラス上に置いた。試料を、１：１エチルアルコール：ジエチルエーテル中に２０分間、１００％エタノール中に１０分間、および９５％エタノール中に１０分間の連続浸漬によって固定した。ＰＢＳでの洗浄後、コレステロールオゾン化生成物に特異的の２００倍希釈の抗体を適用し、組織と１時間インキュベートした。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の４０倍希釈物で二次標識を行った。オプトエレクトロニクスマイクロファイアデジタルカメラを使用して画像を得て、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して処理した。
【０２６７】
（結果）
（コレステロールオゾン化生成物のダンシルヒドラゾンの蛍光検出）
前の実施例に記載のように、コレステロールオゾン化生成物を、Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５８，２２５（１９９３）による化学的研究で開発された分析手順の修正形態を使用してインビボで検出し得る。この修正プロセスは、ホモジナイズしたプラーク物質（湿重量約５０ｍｇ）のＰＢＳ（１ｍＬ）（ｐＨ７．４）の懸濁液の有機溶媒（塩化メチレン、３×５ｍＬ）への抽出、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンヒドロクロリド（ＤＮＰＨＨＣｌ）（２ｍＭ、ｐＨ６．５）のエタノール溶液での室温で２時間の処理を含んでいた。この反応混合物を、４ｂ（４ａの２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン（２，４−ＤＮＰ）誘導体）および５ｂ（５ａの２，４−ＤＮＰ誘導体）の存在についての逆相ＨＰＬＣ（直接注入、３６０ｎｍでの紫外線検出）およびインライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析によって分析した。この技術は迅速且つ感度が高い。しかし、生体サンプルに適用する場合、このアッセイは多数の制限事項が存在する。これらには、３６０ｎｍで紫外線吸収を有する他の生物学的化合物による妨害、抱合反応時の４ｂの５ｂへの変換、および低濃度のコレステロールオゾン化生成物での抱合反応効率の減少が含まれる。
【０２６８】
したがって、アッセイ感度を増加させることができるかどうかを確認するために新たな手順を試験した。この手順は、コレステロールオゾン化生成物の蛍光発色団を有しているヒドラジンへの抱合ならびにその後の蛍光検出およびおＨＰＬＣ分析を含んでいた。選択した蛍光発色団は、ダンシル基であった。アッセイは、上記の酸性条件下でのダンシルヒドラジンでの抽出されたコレステロールオゾン化生成物の誘導体化を含んでいた。コレステロールオゾン化生成物４ａとのダンシルヒドラジンの反応生成物は４ｄであり、以下に示す。
【０２６９】
【化１１７】

コレステロールオゾン化生成物５ａとのダンシルヒドラジンの反応生成物は５ｃであり、以下に示す。
【０２７０】
【化１１８】

ダンシルヒドラジン誘導体の反応効率を、一定範囲の溶媒（ヘキサン、メタノール、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、およびイソプロパノール（ＩＰＡ）など）中で評価した。この分析より、反応効率およびコレステロールオゾン化生成物４ａの５ａへの同時アルドール化率の低さの点から見て、ＩＰＡが至適な溶媒であると判断された。反応効率を、化学合成した標準ダンシルヒドラゾン標準４ｄおよび５ｃを使用したＨＰＬＣによって定量した（図９）。保持時間（Ｒ_Ｔ）約１１．２分で４ａのヒドラゾン誘導体４ｄを形成するためのダンシルヒドラジン（２００μＭ）および硫酸（１００μＭ）を含むＩＰＡを使用した３７℃で４８時間のコレステロールオゾン化生成物４ａの誘導体化効率は、８６．０±８．０％であった。重要には、誘導体化プロセス中に４ａまたは４ｄのアルドール化によってたった１．３％しか５ｃが形成されなかった。５ａのそのダンシルヒドラゾン誘導体５ｃ（Ｒ_Ｔ約１９．４分）への変換効率は、０．０１〜１００μＭの濃度範囲については８３±１１％であった。ダンシルヒドラゾン４ｄおよび５ｃの感度レベルは、約１０ｎＭである。
【０２７１】
４ａおよび５ａコレステロールオゾン化生成物を血漿サンプルから抽出して誘導体化する効率を決定するために、ヒト血漿サンプルに５ａを急上昇させ、抽出し、２，４−ＤＮＰまたはダンシルヒドラジンのいずれかと抱合した。いずれかの方法で検出された抱合ヒドラゾンの量に有意差は認められなかった；３７．５±１．９％がダンシルヒドラゾン５ｃとして誘導体化され、３１±８．９％が２，４−ＤＮＰヒドラゾン５ｂとして回収された。
【０２７２】
（インライン質量分析を使用した同位体希釈ガスクロマトグラフィ（ＩＤ−ＧＣＭＳ））
現在、血液（血漿）およびアテローム硬化性動脈などのコレステロールが豊富な組織中のオキシステロールの最も分析的な測定方法は、炎イオン化検出（ＦＩＤ）または選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）を使用したＧＣに基づく。ＦＩＤ法を超えるＳＩＭ法の利点は、検出の特異性である。この特異性は、生物学的マトリクス中のオキシステロールの分析に必要である。ＳＩＭストラテジーの重要な態様は、内部標準の使用である。５α−コレスタンが最も一般的である。Ｊｉａｌｉｌ，Ｉ．；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄ．Ａ．；Ｇｒｕｎｄｙ，Ｓ．Ｍ．Ａｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１９９１，１ｌ，４８２−４８８；Ｈｏｄｉｓ，Ｈ．Ｎ．；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｄ．Ｗ．；Ｓｅｖａｎｉａｎ，Ａ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９１，８９，１１７−１２６を参照のこと。しかし、重水素標識内部標準を使用したＧＣ−ＭＳは、高感度且つ特異的で、個となる分析物の異なる回収率を補正するため、好ましい方法である。Ｄｚｅｌｅｔｏｖｉｃ，Ｓ．；Ｂｒｕｅｕｅｒ，Ｏ．；Ｌｕｎｄ，Ｅ．；Ｄｉｓｚｆａｌｕｓｙ，Ｕ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２２５，７３−８０。重水素内部標準の役割は、２つある。第１に、これらは、濃縮を使用した同位体の存在比の補正によって定量可能である。第２に、抽出手順前の既知量の重水素分子の添加により、コレステロールオゾン化生成物の抽出効率を評価可能である。Ｌｅｏｎｉ，Ｖ．；Ｍａｓｔｅｒｍａｎ，Ｔ．；Ｐａｔｅｌ，Ｐ．；Ｍｅａｎｅｙ，Ｓ．；Ｄｉｃｚｆａｌｕｓｙ，Ｕ．；Ｂｊｏｒｋｈｅｌｍ，Ｉ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．２００３，４４，７９３−７９９。
【０２７３】
以下に概説のように、６重水素化（ｈｅｘａｄｅｕｔｅｒａｔｅｄ）コレステロールオゾン化生成物Ｄ_６−４ａおよびＤ_６−５ａを、［２６，２６，２６，２７，２７，２７−Ｄ］−コレステロール（重水素化３ｃ）から調製した。
【０２７４】
【化１１９】

第１の合成工程（ａ）では、オゾンを、７８℃のＤ_６−３ｃのクロロホルム−メタノール（９：１）溶液に吹き込んで、Ｄ_６−４ａを生成した。第２の工程（ｂ）では、ＤＭＳＯにＤ_６−４ａを溶解し、室温で２．５時間プロリンと反応させてＤ_６−５ａを生成した。
【０２７５】
実験室内Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣ／ＭＳでのＧＣ／ＭＳ法の感度を試験するために、内部標準としてＤ_６−４ａおよびＤ_６−５ａを使用した。典型的な手順では、標準コレステロールサンプル４ａ、５ａ、Ｄ_６−コレステロール、Ｄ_６−４ａ、およびＤ_６−５ａを、アルゴン下での３７℃で２時間のピリジンおよびＢＳＴＦＡでの処理によってそのトリメチルシリルエーテルに変換した。揮発性物質の除去後（真空下）、残渣を塩化メチレンに溶解し、オートサンプラーバイアルに移した。
【０２７６】
次いで、５９７３ Ｉｎｅｒｔ ＭＳＤに連結したＡｇｉｌａｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６８９０ ＧＣ（スプリット／スプリッター流入システムおよび７６８３オートインジェクターモジュールを備える）でＧＣ−ＭＳを行った。質量分析計を、フルイオンスキャンモードで操作した。認められた保持時間（Ｒ_Ｔ）およびＭ^＋イオンは以下である：オゾン化生成物４ａおよび５ａ（Ｒ_Ｔ＝２９．６分、Ｍ^＋３５４）；Ｄ_６−４ａおよびＤ_６−５ａ（Ｒ_Ｔ＝２９．６分、Ｍ^＋３６０）；コレステロール（Ｒ_Ｔ＝２７．２分、Ｍ^＋３２９）；Ｄ_６−コレステロール（Ｒ_Ｔ＝２７．２分、Ｍ^＋３３５）。ＧＣ−ＭＳ内のコレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａの推定断片化を以下に示す。
【０２７７】
【化１２０】

上記のように、コレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａは、約Ｍ＋３５４のフラグメントを生じる。重水素化（Ｄ_６）４ａおよび５ａコレステロールオゾン化生成物は、約Ｍ＋３６０のフラグメントを生じる。
【０２７８】
したがって、ＧＣ−ＭＳアッセイでコレステロールオゾン化生成物４ａと５ａとの間に相違は認められず、おそらくシリル化工程でコレステロールオゾン化生成物４ａが５ａに変換したためである。したがって、Ｍ＋３５４（または３６０）の量は、標準４ａおよび５ａコレステロールオゾン化生成物の濃度基準である。３５４イオンピーク面積は、濃度に比例し、したがってコレステロールオゾン化生成物の測定されたより低い感度レベルは１０ｆｇ／μＬである（前の実施例に記載のＬＣ／ＭＳ由来の検出限界の評価された２ｌｏｇ増加に等価）。
【０２７９】
臨床的に切除した頸動脈プラーク物質からのコレステロールオゾン化生成物の抽出によってＧＣＭＳアッセイをさらに立証した。日常的分析のために頸動脈内膜摘除術を受けた患者から得た頸動脈内膜摘除組織（ｎ＝２）を、組織ホモジナイザーを使用して１０分間ホモジナイズし（アルゴン下）、ＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨに抽出した。抽出物を上記のようにシリル化し、ＧＣ−ＭＳ分析に供した（図１０および１１）。時間に対するイオン存在率のＧＣ−ＭＳの軌跡は、依然として定義されていない多数のオキシステロールの存在を示す。しかし、オゾン化生成物４ａおよび５ａの組み合わせ（Ｒ_Ｔ＝２２．４９分）は明確に解析されていた。
【０２８０】
これらのデータは、生体サンプル中の４ａおよび５ａコレステロールオゾン化生成物の分析についての全抽出およびＧＣ−ＭＳの実行可能性を明確に確立し、前の実施例におけるアテローム硬化性プラーク物質の分析で記載した結果を立証する。
【０２８１】
（コレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａの免疫組織学的局在化）
上記のように、マウスを、コレステロールオゾン化生成物４ａのアナログである化合物１５ａのＫＬＨ抱合体で免疫化した。ハイブリドーマ法によってモノクローナル抗体を生成した。２つのマウスモノクローナル抗体（１１Ｃ５および７Ａ７）は、コレステロールオゾン化生成物５ａに対して良好な結合親和性（１μＭ未満）を有し、コレステロールを超える優れた特異性を有していた（１／１０００未満の特異性）。
【０２８２】
上記のように、血液へのコレステロールオゾン化生成物４ａの添加によって５ａに迅速に変換されるため、４ａアナログであるハプテンに対する抗５ａ抗体の精製は、あまり驚くべきことではない。
【０２８３】
抗体１１Ｃ５およびＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧに底歌いでのＡｐｏＥ欠損マウス由来の大動脈の凍結固定切片の免疫組織学的染色により、非特異的マウス抗体で染色した連続切片と比較した場合に、血管の内膜下層内のアテローム性動脈硬化症領域中にコレステロールオゾン化生成物５ａの局在が示された。可溶性コレステロールでの抗体の吸収は、内膜下に蛍光を発しなかった。
【０２８４】
（参考文献）
【０２８５】
【表６】

【０２８６】
【表７】

【０２８７】
【表８】

。
【０２８８】
本明細書中に参照または記載した全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者の技術レベルを示し、このような各々の特許または刊行物は、その全体が個別に参考として援用されるかその全体が本明細書中に記載されているのと同一の範囲で本明細書中で参考として援用される。出願人は、任意のこのような引用した特許または刊行物からの任意のおよび全ての材料および情報を本明細書中に物理的に援用する権利を留保する。
【０２８９】
本明細書中に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表および例示し、本発明の範囲を制限すると解釈することを意図しない。本明細書を考慮して、当業者は他の目的、態様、および実施形態を実施し、これらは特許請求の範囲に記載の本発明の精神の範囲内に含まれる。本発明の範囲および精神を逸脱することなく本明細書中に開示の本発明を様々に置換および修飾し得ることが当業者に容易に自明である。本明細書中に例示的に記載の本発明を、不可欠であると本明細書中で特に開示されていない任意の要素または制限の非存在下で実施し得る。本明細書中に例示的に記載されている方法およびプロセスを、工程の順序を変えて適切に実施することができ、本明細書中または特許請求の範囲に示した工程の順序に必ずしも制限されない。本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、他で明確に記載されていない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば、「宿主細胞（ａｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」には、このような宿主細胞の複数形（例えば、培養物または集団）などが含まれる。いかなる場合でも、本特許を、本明細書中に開示の特定の例、実施形態、または方法に制限されると解釈されない。いかなる場合でも、本特許を、任意の審査官、特許庁の任意の他の職員によって作製された記述が具体的に留保（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）または保留（ｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）することなく出願人の応答書で明確に採用されない限り、このような記述に制限されると解釈されない。
【０２９０】
使用した用語および表現は、説明のために使用し、本発明を制限せず、表示および記載した特徴の任意の等価物またはその一部を排除するためのこのような用語および表現の使用を意図しないが、特許請求の範囲に記載の発明の範囲内で種々の修正形態が可能であると認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態および最適な特徴によって具体的に開示しているが、当業者は本明細書中に開示の概念の修正形態および変形形態を使用することができ、このような修正形態および変形形態は添付の特許請求の範囲に定義の本発明の範囲内に含まれると見なされると理解される。
【０２９１】
本発明を、本明細書中に広範且つ一般的に記載している。属概念の開示内に含まれるそれぞれのより狭い種概念および下位概念も本発明の一部を形成する。これには、除外された要素が具体的に本明細書中で引用されるかどうかに関係なく、類概念から任意の主題を除く条件または消極的限定を含む本発明の属概念の記述が含まれる。
【０２９２】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に含まれる。さらに、本発明の特長または態様がマーカッシュ形式で記載されているが、当業者は、マーカッシュ形式により、本発明がマーカッシュ形式の任意の各選択肢（ｍｅｍｂｅｒ）または選択肢の下位集団に関して記載されると認識する。
【図面の簡単な説明】
【０２９３】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、４−β−ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）処置ヒトアテローム硬化症病変によってインディゴカルミン１が酸化されてイサチンスルホン酸２を形成し得ることを示す。図１Ａは、オゾンによるインディゴカルミン１のイサチンスルホン酸２への変換時に起こる化学変化を示す。図１Ｂは、ＰＭＡ活性化アテローム硬化症病変によるインディゴカルミン１の脱色を示す。各ガラスバイアルは、インディゴカルミン１溶液（２００μＭ）およびウシカタラーゼ（５０μｇ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ）（ｐＨ７．４）中に等量のアテローム硬化性プラークの分散物（湿重量約５０ｍｇ）を含んでいた。バイアルへのＰＭＡ（１０μＬ、４０μｇ／ｍＬ）のＤＭＳＯ溶液の添加３０分後に写真を撮った（右）。ＰＭＡを含まない同体積のＤＭＳＯをバイアルに添加した（左）。反応混合物の総体積は１ｍＬであった。図１Ｃは、逆相ＨＰＬＣによって分析したところ、図１Ｂに示す＋ＰＭＡバイアルの上清中で新規のＨＰＬＣピークが得られることを示す。新規のピークは、イサチンスルホン酸２に対応し、保持時間（Ｒ_Ｔ）は約９．７１分であった。図１Ｄは、上の図１Ｂに記載するインディゴカルミン１と反応した遠心分離したＰＭＡ活性化ヒトアテローム硬化性プラーク物質由来の上清の陰イオンエレクトロスプレー質量分析を示す。懸濁プラーク物質のＰＭＡ活性化が指標インディゴカルミン１を使用してＨ_２^１８Ｏ中有で行われた場合、単離された切断生成物であるイサチンスルホン酸２のマススペクトル中の［Ｍ−Ｈ］⁻２３０マスフラグメントピークの概観および相対強度によって示されるように、約４０％のインディゴカルミン１のラクタムカルボニル酸素^１８Ｏに組み込まれた。通常の水（Ｈ_２^１６Ｏ）の存在下でのインディゴカルミン１から形成されたイサチンスルホン酸２のマスフラグメントピーク［Ｍ−Ｈ］⁻は２２８である。
【図２Ａ】図２Ａは、５ａへのアルドール化（ａｌｄｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によって変換し得る５，６−セコステロール４ａを得るためのコレステロール３のオゾン分解に関与する化学的工程を示す。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２ｍＭを含む０．０８％ＨＣｌ）での誘導化により、ヒドラゾン誘導体４ｂおよび５ｂがそれぞれ得られた。誘導過程中の４ａから形成された５ｂの量は、約２０％であった。Ｋ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｂｅｒｍｕｄｅｚ，Ｗ．Ａ．Ｐｒｙｏｒ，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ５８，２２５（１９９３）に記載のように、５ａおよび５ｂの高次構造を割り当てた。
【図２Ｂ】図２Ｂは、オキシステロール６ａ〜９ａおよび図３中の約１８分で［Ｍ−Ｈ］⁻５７９にて溶離したピークの標準として調査された２，４−塩酸ジニトロフェニルヒドラジン誘導体６ｂ〜７ｂの構造を示す。７ａ〜７ｂの高次構造割り当ては、標準合成７ｂ材料を使用した^１Ｈ−^１ＨＲＯＥＳＹ実験に基づいた。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｅは、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）を使用したプラーク物質およびヒドラゾン４ｂ、５ｂ、および６ｂの化学合成された標準サンプルの分析を示す。条件：２，４−塩酸ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨＨＣｌ）での誘導体化後のプラーク抽出物のＡｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ−ＨＳ ＲＰ−Ｃ１８カラム、７５％アセトニトリル、２０％水、５％メタノール、流速０．５ｍＬ／分、３６０ｎｍでの検出、インライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）（ＨｉｔａｃｈｉＭ８０００装置）。図３Ａは、ＰＭＡ活性化を使用しないが、本明細書中に記載の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンでの誘導体化後のプラーク物質のＬＣＭＳ分析を示す。化合物４ｂ（ＲＴ薬１４．１分）、５ｂ（ＲＴ約２０．５分）、および６ｂ（ＲＴ約１８分）を、ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）での活性化前にアテローム硬化性病変中で検出した。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｅは、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）を使用したプラーク物質およびヒドラゾン４ｂ、５ｂ、および６ｂの化学合成された標準サンプルの分析を示す。条件：２，４−塩酸ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨＨＣｌ）での誘導体化後のプラーク抽出物のＡｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ−ＨＳ ＲＰ−Ｃ１８カラム、７５％アセトニトリル、２０％水、５％メタノール、流速０．５ｍＬ／分、３６０ｎｍでの検出、インライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）（ＨｉｔａｃｈｉＭ８０００装置）。図３Ｂは、上記のＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）での活性化、抽出、および２，４−ジニトロフェニルヒドラジンでの誘導体化後のプラーク物質のＬＣＭＳ分析を示す。ＰＭＡ（４０μｇ／ｍＬ）での活性化後のアテローム硬化性病変中に大量の化合物４ｂ（ＲＴ約１４．１分）だけでなく、少量の化合物６ｂ（ＲＴ約１８分）も検出された。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｅは、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）を使用したプラーク物質およびヒドラゾン４ｂ、５ｂ、および６ｂの化学合成された標準サンプルの分析を示す。条件：２，４−塩酸ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨＨＣｌ）での誘導体化後のプラーク抽出物のＡｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ−ＨＳ ＲＰ−Ｃ１８カラム、７５％アセトニトリル、２０％水、５％メタノール、流速０．５ｍＬ／分、３６０ｎｍでの検出、インライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）（ＨｉｔａｃｈｉＭ８０００装置）。図３Ｃは、標準４ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は質量分析を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｅは、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）を使用したプラーク物質およびヒドラゾン４ｂ、５ｂ、および６ｂの化学合成された標準サンプルの分析を示す。条件：２，４−塩酸ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨＨＣｌ）での誘導体化後のプラーク抽出物のＡｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ−ＨＳ ＲＰ−Ｃ１８カラム、７５％アセトニトリル、２０％水、５％メタノール、流速０．５ｍＬ／分、３６０ｎｍでの検出、インライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）（ＨｉｔａｃｈｉＭ８０００装置）。図３Ｄは、標準６ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は質量分析を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｅは、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣＭＳ）を使用したプラーク物質およびヒドラゾン４ｂ、５ｂ、および６ｂの化学合成された標準サンプルの分析を示す。条件：２，４−塩酸ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨＨＣｌ）での誘導体化後のプラーク抽出物のＡｄｓｏｒｂｏｓｐｈｅｒｅ−ＨＳ ＲＰ−Ｃ１８カラム、７５％アセトニトリル、２０％水、５％メタノール、流速０．５ｍＬ／分、３６０ｎｍでの検出、インライン陰イオンエレクトロスプレー質量分析（ＭＳ）（ＨｉｔａｃｈｉＭ８０００装置）。図３Ｅは、標準５ｂのＨＰＬＣ分析を示し、挿入図は質量分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｄは、１００μＬの注入体積を使用して微量のヒドラゾンを検出した抽出および誘導体化したアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。図４Ａは、上に詳述の条件を使用した強度に対するＬＣの時間の軌跡を示す。Ｒ_Ｔ２６．７は、７ｂである（標準物質との比較による）。Ｒ_Ｔ約２４．７でのピークは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の未知のヒドラゾンである。図４Ｂは、［Ｍ−Ｈ］⁻５９７の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｃは、［Ｍ−Ｈ］⁻５７９の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｄは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の単一イオンモニタリングを示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｄは、１００μＬの注入体積を使用して微量のヒドラゾンを検出した抽出および誘導体化したアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。図４Ａは、上に詳述の条件を使用した強度に対するＬＣの時間の軌跡を示す。Ｒ_Ｔ２６．７は、７ｂである（標準物質との比較による）。Ｒ_Ｔ約２４．７でのピークは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の未知のヒドラゾンである。図４Ｂは、［Ｍ−Ｈ］⁻５９７の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｃは、［Ｍ−Ｈ］⁻５７９の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｄは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の単一イオンモニタリングを示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｄは、１００μＬの注入体積を使用して微量のヒドラゾンを検出した抽出および誘導体化したアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。図４Ａは、上に詳述の条件を使用した強度に対するＬＣの時間の軌跡を示す。Ｒ_Ｔ２６．７は、７ｂである（標準物質との比較による）。Ｒ_Ｔ約２４．７でのピークは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の未知のヒドラゾンである。図４Ｂは、［Ｍ−Ｈ］⁻５９７の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｃは、［Ｍ−Ｈ］⁻５７９の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｄは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の単一イオンモニタリングを示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｄは、１００μＬの注入体積を使用して微量のヒドラゾンを検出した抽出および誘導体化したアテローム硬化性物質のＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。図４Ａは、上に詳述の条件を使用した強度に対するＬＣの時間の軌跡を示す。Ｒ_Ｔ２６．７は、７ｂである（標準物質との比較による）。Ｒ_Ｔ約２４．７でのピークは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の未知のヒドラゾンである。図４Ｂは、［Ｍ−Ｈ］⁻５９７の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｃは、［Ｍ−Ｈ］⁻５７９の単一イオンモニタリングを提供する。図４Ｄは、［Ｍ−Ｈ］⁻４６１の単一イオンモニタリングを示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｃは、患者Ａ〜Ｎについてのアテローム硬化性抽出物中のコレステロールオゾン化生成物の濃度を示す。図５Ａは、ＰＭＡでの活性化前後の患者のアテローム硬化性病変からの抽出および４ａの誘導後のヒドラゾン４ｂの測定濃度を示す棒グラフである。棒グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ Ｖ３ ｆｏｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈを使用したスチューデントｔ検定（両側）（ｐ＜０．０５、ｎ＝１４）によって決定した活性化前後に検出された量の数値を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｃは、患者Ａ〜Ｎについてのアテローム硬化性抽出物中のコレステロールオゾン化生成物の濃度を示す。図５Ｂは、ＰＭＡでの活性化前後の患者のアテローム硬化性病変からの抽出および５ａの誘導後のヒドラゾン５ｂの測定濃度を示す棒グラフである（ｎ＝１４）。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、患者Ａ〜Ｎについてのアテローム硬化性抽出物中のコレステロールオゾン化生成物の濃度を示す。図５Ｃは、患者から採取した結晶サンプルからの抽出および５ａの誘導化後の５ｂの測定濃度を示す棒グラフである。コホートＡ（ｎ＝８）患者に、２４時間以内に頸動脈内膜摘除術を行った（サンプル採取３日後に血漿分析を行った）。コホートＢ（ｎ＝１５）患者を、一般的な診療所に通院している患者から無作為に選択した（サンプル採取７日後に血漿分析を行った）。予備調査血漿レベルの５ａで、１日あたり約５％減少することに留意のこと。このアッセイ条件下で、４ｂおよび５ｂの検出限界は１〜１０ｎＭであった。したがって、４ｂまたは５ｂが明らかでない場合、４ｂまたは５ｂのレベルは１０ｎＭ未満であった。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｂ細胞（ＷＩ−Ｌ２）細胞株に対する３、４ａ、および５ａの細胞傷害性を示す。各データポイントは、少なくとも２つの測定値の平均である。４ａ（黒四角）および５ａ（黒上三角）のＩＣ_５０±標準誤差を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ｖ３．０ ｆｏｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ｃｏｍｐｕｔｅｒを使用した非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット分析）を使用して計算した。この濃度範囲で、３を使用した細胞傷害性（黒下三角）が認められなかった。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）細胞株に対する３、４ａ、および５ａの細胞傷害性を示す。各データポイントは、少なくとも２つの測定値の平均である。４ａ（黒四角）および５ａ（黒上四角）のＩＣ_５０±標準誤差を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ｖ３．０ ｆｏｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ｃｏｍｐｕｔｅｒを使用した非線形回帰分析（Ｈｉｌｌプロット分析）を使用して計算した。この濃度範囲で、３を使用した細胞傷害性（黒下四角）が認められなかった。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｂは、コレステロールオゾン分解生成物４ａおよび５ａがマクロファージによって脂質負荷が増加して泡沫細胞を産生することを示す。図７Ａは、Ｊ７７４．１マクロファージとインキュベートしたＬＤＬがこのマクロファージの脂質負荷にほとんど影響を受けないことを示す。マクロファージを最初に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間成長させ、その後、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）を含む同一の培地中で７２時間インキュベートした。細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、脂質粒子が暗赤色に染色されるようにヘマトキシリンおよびオイルレッドＯで染色した。倍率は１００倍である。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、コレステロールオゾン分解生成物４ａおよび５ａがマクロファージによって脂質負荷が増加して泡沫細胞を産生することを示す。図７Ｂは、オゾン分解生成物４ａとインキュベートしたＬＤＬによりマクロファージの脂質負荷が誘導されて泡沫細胞が産生されることを示す。Ｊ７７４．１マクロファージを、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間成長させた。次いで、細胞を、ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）およびオゾン分解生成物４ａ（２０μＭ）を含む同一の培地中で７２時間インキュベートした。細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、脂質粒子が暗赤色に染色されるようにヘマトキシリンおおよびオイルレッドＯで染色した。倍率は１００倍である。マクロファージに対するオゾン分解生成物４ａの効果はオゾン分解生成物５ａの効果と区別不可能であることに留意のこと。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｃは、円偏光二色性によって検出したところ、ＬＤＬ中のタンパク質の二次構造がオゾン分解生成物４ａまたは５ａへの曝露によって変化することを示す。報告した結果は、各サンプルについて少なくとも２つの実験に由来する。図８Ａは、正常ＬＤＬのタンパク質含有量はαヘリックス構造が大部分を占め（約４０±２％）、β構造（約１３±３％）、βターン（約２０±３％）、およびランダムコイル（２７±２％）はより少ないことを示す。図８Ａは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）の時間依存円偏光二色性を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｃは、円偏光二色性によって検出したところ、ＬＤＬ中のタンパク質の二次構造がオゾン分解生成物４ａまたは５ａへの曝露によって変化することを示す。報告した結果は、各サンプルについて少なくとも２つの実験に由来する。図８Ｂは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのオゾン分解生成物４ａとのＬＤＬのインキュベーションによってアポＢ−１００の二次構造が喪失することを示す。図８Ａは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）の時間依存円偏光二色性および４ａ（１０μＭ）を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、円偏光二色性によって検出したところ、ＬＤＬ中のタンパク質の二次構造がオゾン分解生成物４ａまたは５ａへの曝露によって変化することを示す。報告した結果は、各サンプルについて少なくとも２つの実験に由来する。図８Ｃは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのオゾン分解生成物５ａとのＬＤＬのインキュベーションによってアポＢ−１００の二次構造が喪失することを示す。図８Ａは、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）の時間依存円偏光二色性および５ａ（１０μＭ）を示す。
【図９】図９は、ダンシルヒドラジンコレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａの構造（それぞれ４ｄおよび５ｃ）ならびにこれらのヒドラジン誘導体のＨＰＬＣ溶離パターンを示す。示すように、コレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａにより、異なるＨＰＬＣの保持時間を有するダンシルヒドラゾン抱合体が得られる。
【図１０】図１０は、コレステロールオゾン化生成物を、ガスクロマトグラフィ質量分析（ＧＣＭＳ）によってヒト頸動脈試料で検出し得ることを示す。示したクロマトグラムは、典型的なアテローム硬化性抽出物である。２２．４９分で溶離されたピークは、コレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａの両方に対応するピークである。挿入した質量分析クロマトグラフは、２２．４９分で溶離された種がｍ／ｚ３５４であることを示す。
【図１１】図１１は、ＩＤ−ＧＣＭＳによる２つのアテローム硬化性プラーク（Ｐ１およびＰ２）の定量分析を提供する。コレステロールオゾン化生成物４ａおよび５ａの検出量は約８０〜１００ｐｍｏｌ／ｍｇ組織であり、これはＬＣ−ＭＳ分析によって検出された量に類似した。各バーは、２連の抽出物を示し、平均±ＳＥＭとして報告する。
【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム硬化性プラーク中に生成された、コレステロールの単離されたオゾン化生成物。
【請求項２】
式４ａ：
【化１】

を有する、請求項１に記載のオゾン化生成物。
【請求項３】
式５ａ：
【化２】

を有する、請求項１に記載のオゾン化生成物。
【請求項４】
式６ａ〜１５ａまたは７ｃ：
【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

のいずれか１つを有する、請求項１に記載のオゾン化生成物。
【請求項５】
亜硫酸水素付加体、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ダンシルヒドラゾン、セミカルバゾン、またはＴｏｌｌｉｎｓ試験の生成物を含むコレステロールオゾン化生成物の検出可能な誘導体であって、該コレステロールのオゾン化生成物がアテローム硬化性プラーク内に生成される、コレステロールオゾン化生成物の検出可能な誘導体。
【請求項６】
前記コレステロールのオゾン化生成物がアテローム硬化性プラーク内に生成される、コレステロールのオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体。
【請求項７】
式４ｂまたは式４ｃ：
【化７】

を有する、請求項６に記載のヒドラゾン誘導体。
【請求項８】
式５ｂ：
【化８】

を有する、請求項６に記載のヒドラゾン誘導体。
【請求項９】
式６ｂ〜１５ｂまたは１０ｃ：
【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

のいずれか１つを有する、請求項６に記載のヒドラゾン誘導体。
【請求項１０】
式４ｄ：
【化１３】

を有する、請求項６に記載のダンシルヒドラゾン誘導体。
【請求項１１】
式５ｃ：
【化１４】

を有する、請求項６に記載のダンシルヒドラゾン誘導体。
【請求項１２】
式１３ａまたは１３ｂ：
【化１５】

【化１６】

を有するハプテンであって、該ハプテンを使用してコレステロールのオゾン化生成物またはヒドラゾン生成物と反応し得る抗体を生成し得る、ハプテン。
【請求項１３】
式１４ａまたは１４ｂ：
【化１７】

を有するハプテンであって、該ハプテンを使用してコレステロールのオゾン化生成物またはヒドラゾン生成物と反応し得る抗体を生成し得る、ハプテン。
【請求項１４】
式３ｃ：
【化１８】

を有するハプテンであって、該ハプテンを使用してコレステロールのオゾン化生成物またはヒドラゾン生成物と反応し得る抗体を生成し得る、ハプテン。
【請求項１５】
式１５ａ：
【化１９】

を有するハプテンであって、該ハプテンを使用してコレステロールのオゾン化生成物またはヒドラゾン生成物と反応し得る抗体を生成し得る、ハプテン。
【請求項１６】
コレステロールのオゾン化生成物に結合し得る、単離された抗体。
【請求項１７】
コレステロールのオゾン化生成物に結合し得る、モノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記コレステロールのオゾン化生成物が、式４ａ：
【化２０】

を有する、請求項１６または請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
前記コレステロールのオゾン化生成物が、式５ａ：
【化２１】

を有する、請求項１６または請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
前記コレステロールのオゾン化生成物が、式６ａ〜１４ａまたは７ｃ：
【化２２】

【化２３】

【化２４】

【化２５】

のいずれか１つを有する、請求項１６または請求項１７に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、式１５ａ：
【化２６】

を有するハプテンに対して惹起された、請求項１６または請求項１７に記載の抗体。
【請求項２２】
コレステロールのオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体に結合し得る、単離された抗体。
【請求項２３】
前記ヒドラゾン誘導体が、式４ｂまたは式４ｃ：
【化２７】

【化２８】

を有する、請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
前記ヒドラゾン誘導体が、式５ｂ：
【化２９】

を有する、請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
前記ヒドラゾン誘導体が、式６ｂ〜１５ｂまたは式１０ｃ：
【化３０】

【化３１】

【化３２】

【化３３】

のいずれか１つを有する、請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
前記単離された抗体が、式１３ａまたは１４ａ：
【化３４】

【化３５】

を有するハプテンに対して惹起される、請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２７】
前記単離された抗体が、式１５ａ：
【化３６】

を有するハプテンに対して惹起される、請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２８】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２７またはＰＴＡ−５４２８を有するハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５：６またはＫＡ１−７Ａ６：６に由来する、単離された抗体。
【請求項２９】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０を有するハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６：４またはＫＡ２−１Ｅ９：４に由来する、単離された抗体。
【請求項３０】
患者においてアテローム性動脈硬化症を検出するための方法であって、コレステロールのオゾン化生成物が患者から得た試験サンプル中に存在するかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記オゾン化生成物がアテローム硬化性プラークによって生成される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試験サンプルが、血清、血漿、血液、アテローム硬化性プラーク物質、尿、または脈管組織である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記オゾン化生成物が、式４ａ：
【化３７】

を有する化合物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記オゾン化生成物が、式５ａ：
【化３８】

を有する化合物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記オゾン化生成物が、式６ａ〜１５ａまたは７ｃ：
【化３９】

【化４０】

【化４１】

のいずれか１つを有する化合物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、前記試験サンプルと、亜硫酸水素塩、アンモニア、シッフ塩基、芳香族ヒドラジンまたは脂肪族ヒドラジン、ダンシルヒドラジン、ジェラード（Ｇｅｒａｒｄ）試薬、Ｔｏｌｌｉｎｓ試験試薬とを反応させる工程、およびこのような反応によって形成されるコレステロールのオゾン化生成物の誘導体を検出する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、前記試験サンプルをヒドラジン化合物と反応させてコレステロールのオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体を生成する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒドラジン化合物が２，４−ジニトロフェニルヒドラジンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒドラゾン誘導体が、式４ｂまたは式４ｃ：
【化４２】

を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒドラゾン誘導体が、式５ｂ：
【化４３】

を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヒドラゾン誘導体が、式６ｂ〜１５ｂまたは式１０ｃ：
【化４４】

【化４５】

【化４６】

【化４７】

【化４８】

のいずれか１つを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、前記試験サンプルをダンシルヒドラジンと反応させてコレステロールのオゾン化生成物のダンシルヒドラゾン誘導体を生成する工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ダンシルヒドラゾン誘導体が、式４ｄまたは５ｃ：
【化４９】

【化５０】

を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、試験サンプルとコレステロールのオゾン化生成物に結合し得る抗体と接触させる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体が、式１３ａまたは１４ａ：
【化５１】

【化５２】

を有するハプテンに対して惹起される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体が、式１５ａ：
【化５３】

を有するハプテンに対して惹起される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２７またはＰＴＡ−５４２８を有するハイブリドーマＫＡ１−１１Ｃ５：６またはＫＡ１−７Ａ６：６に由来する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５４２９およびＰＴＡ−５４３０を有するハイブリドーマＫＡ２−８Ｆ６：４またはＫＡ２−１Ｅ９：４に由来する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、式４ａ：
【化５４】

を有する化合物に結合し得る、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、式５ａ：
【化５５】

を有する化合物に結合し得る、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、式６ａ〜１５ａまたは７ｃ：
【化５６】

【化５７】

【化５８】

【化５９】

のいずれか１つを有する化合物に結合し得る、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
患者のアテローム硬化性プラークによってコレステロールのオゾン化生成物が放出されるかどうかを検出するための方法であって、
コレステロールのオゾン化生成物が患者から得た試験サンプル中に存在するかどうかを検出する工程であって、ここで、該オゾン化生成物が式５ａ：
【化６０】

を含む化合物である、工程
を包含する、方法。
【請求項５３】
患者のアテローム性動脈硬化症を検出するための方法であって、
患者由来の試験サンプルに２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを添加する工程、および
コレステロールのオゾン化生成物のヒドラゾン誘導体が該試験サンプル中に存在するかどうかを検出する工程
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記ヒドラゾン誘導体が、式４ｂ、４ｃ、５ｂ、６ｂ、７ｂ、８ｂ、９ｂ、１０ｂ、１０ｃ、１１ｂ、１２ｂ、１３ｂ、１４ｂ、または１５ｂ：
【化６１】

【化６２】

【化６３】

【化６４】

【化６５】

を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
患者のアテローム性動脈硬化症を検出するための方法であって、
患者由来の試験サンプルにダンシルヒドラジンを添加する工程、および
コレステロールのオゾン化生成物のダンシルヒドラゾン誘導体が前記試験サンプル中に存在するかどうかを検出する工程
を包含する、方法。
【請求項５６】
前記ダンシルヒドラゾン誘導体が、式４ｄまたは５ｃ：
【化６６】

を有する化合物である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
コレステロールオゾン分解生成物が試験サンプル中に存在するかどうかを検出するための方法であって、
マクロファージを該試験サンプルと接触させる工程、および
マクロファージによる脂質取り込みが増加するかどうかを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項５８】
患者のアテローム性動脈硬化症を検出するための方法であって、
マクロファージを該患者由来の試験サンプルと接触させる工程、および
マクロファージによる脂質取り込みが増加するかどうかを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項５９】
試験サンプル中のコレステロールオゾン分解生成物を検出するための方法であって、
低密度リポタンパク質を該試験サンプルと接触させる工程、および
該低密度リポタンパク質の二次構造が変化するかどうかを観察する工程
を包含する、方法。
【請求項６０】
患者のアテローム性動脈硬化症を検出するための方法であって、
低密度リポタンパク質を該患者から得た試験サンプルと接触させる工程、および
該低密度リポタンパク質の二次構造が変化するかどうかを観察する工程
を包含する、方法。
【請求項６１】
試験サンプル中のコレステロールオゾン分解生成物を検出するための方法であって、
アポタンパク質Ｂ_１００を該試験サンプルと接触させる工程、および
該アポタンパク質Ｂ_１００の二次構造が変化するかどうかを観察する工程
を包含する、方法。
【請求項６２】
患者のアテローム性動脈硬化症を検出するための方法であって、
アポタンパク質Ｂ_１００を該患者から得た試験サンプルと接触させる工程、および
該アポタンパク質Ｂ_１００の二次構造が変化するかどうかを観察する工程
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記低密度リポタンパク質またはアポタンパク質Ｂ_１００の二次構造が、円偏光二色性によって観察される、請求項５７〜請求項６２のいずれか１項に記載の方法。

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図３Ｅ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【公表番号】特表２００７−５０４２５０（Ｐ２００７−５０４２５０Ａ）
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２５５１７（Ｐ２００６−５２５５１７）
【出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９０６３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３８３１
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ　スクリプス　リサーチ　インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】