コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤及びその製造方法
【課題】ろ過性及び粒子径特性に優れ、生体への投与に適したＣＳ・鉄コロイド製剤を提供する。
【解決手段】ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させることによってＣＳ・鉄コロイド製剤を製造する。
【解決手段】ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させることによってＣＳ・鉄コロイド製剤を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤の製造方法およびそれによって得られるコンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
貧血などの症状を示す患者に鉄を供給するための製剤として鉄コロイド製剤が知られており、鉄コロイド製剤としてグリコサミノグリカンの一種であるコンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」と略記する。）と鉄を含むＣＳ・鉄コロイド製剤が知られていた（特許文献１〜４等）。
このようなＣＳ・鉄コロイド製剤は、生体への投与における目的、用法等に応じ、一定の分子量特性を有するＣＳを原料として用いて製造され、且つ一定の粒子径特性を有することが、品質が保証された製剤を安定的に供給する観点から好ましいことが知られている。
一方で近年、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、口蹄疫等の人畜共通感染症に対して万全を期すための配慮から、サメ等のウシ以外の生物に由来するＣＳを原料としたＣＳ・鉄コロイド製剤が望まれているが、ＣＳの由来によっては、目的とする用途において好ましいとされる粒子径特性を有するＣＳ・鉄コロイド製剤が得られないことがあることが知られていた（特許文献２）。
【０００３】
ＣＳを分解する酵素としては、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣ（非特許文献１参照。）等が知られている。
非特許文献２には、上記の酵素によってＣＳから不飽和二糖を生成させ、これを検出することにより、当該酵素の活性を測定する方法が開示されている。しかし、上記のような酵素を用いて、ある程度のサイズを保持しつつ低分子化されたＣＳ画分を製造すること、及びこのようにして得られた低分子化されたＣＳ画分を医薬原料として利用することについては、記載も示唆もない。
【特許文献１】特公昭３６−１５２９６号公報
【特許文献２】特開２００４−１９６６９５号公報
【特許文献３】特開２００４−２６３１０９号公報
【特許文献４】特開２００４−３４６０３８号公報
【非特許文献１】ハマイら、１９９７年、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７２巻、第１４号、ｐ．９１２３−９１３０
【非特許文献２】ヤマガタら、１９６８年、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２４３巻、第７号、ｐ．１５２３−１５３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ろ過性及び粒子径特性に優れ、生体への投与に適したＣＳ・鉄コロイド製剤およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った。その結果、塩酸による化学的分解により低分子化したサメ由来のＣＳを原料として用いた場合、好ましいろ過性及び粒子径特性を有するＣＳ・鉄コロイド製剤が得られないことがあるという新たな課題を見出した。さらに本発明者らは、上記の新たな課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分を原料として用いる
ことによって、ろ過性及び粒子径特性に優れたＣＳ・鉄コロイド製剤が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、上記ＣＳ分解酵素がリアーゼであることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記ＣＳ分解酵素がコンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣであることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、上記画分が、下記（１）〜（３）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（１）硫黄含量が６．５〜８％である。
（２）ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
（３）ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
【０００９】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（４）の性質を有するものである、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（４）ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２である。
【００１０】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（５）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（５）極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）である。
【００１１】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（６）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（６）：二糖分析の結果が以下の通りである。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
【００１２】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（７）〜（１１）の性質を有するものである、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（７）塩化物含量が０．１４２％以下である。
（８）無機硫酸塩含量が０．２４％以下である。
（９）重金属含量が２０ｐｐｍ以下である。
（１０）ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である。
（１１）窒素含量が２〜４％である。
【００１３】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記性質（１２）を有するものである、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（１２）前記画分１gを１００mlの水溶液としたときのｐＨが６〜７である。
【００１４】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（１３）〜（１７）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（１３）旋光度が−１５°〜−１８°である。
（１４）本画分１gを１００mlの水溶液としたときに、無色澄明である。
（１５）粉末状態としたときに、白色である。
（１６）乾燥減量が１〜７％である。
（１７）強熱残分が２３〜３１％である。
【００１５】
本発明はまた、上記ＣＳ又はその塩がサメ由来であることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、上記画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を、ｐＨ８〜９の溶液中で接触させることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、上記画分に第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程によって得られた画分のｐＨを７〜１０に調整する工程をさらに含むことを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、上記製造方法によって製造される、ＣＳ・鉄コロイド製剤を提供する。
本発明はまた、下記（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤を提供する；
（ａ）光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が、６０〜３００ｎｍである。
（ｂ）該製剤１リットルを、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）に対してろ過に供した後に、ポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）に対してろ過に供したときに、全量が通過可能である。
【００１９】
本発明はまた、注射液であることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の製造方法によって得られるＣＳ・鉄コロイド製剤は、ろ過性及び粒子径特性に優れており、生体への投与に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。なお、本出願書類での「％」表記の単位は、特にことわらない限り「重量％」を意味する。ただし二糖分析における不飽和二糖の含有率については、不飽和二糖の含有モル比を「％」で表す。
【００２２】
また、本出願書類において、以下に述べる性質（１）〜（１７）に記載されているパラメータは、特にことわりのない場合、本明細書中の実施例に記載した分析方法によって決定されるものである。特に、性質（７）に記載されている塩化物含量は、後述する（f）塩化物含量（実施例２）の方法により決定される値である。また、性質（８）に記載されている無機硫酸塩含量は、後述する（g）無機硫酸塩含量（実施例２）に記載の方法により決定される値である。
【００２３】
本発明においては、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させることによって、ＣＳ・鉄コロイド製剤を製造する。
【００２４】
前記画分は、ＣＳ又はその塩のどちらか一方にＣＳ分解酵素を作用させて得られるものでもよく、ＣＳおよびその塩の混合物にＣＳ分解酵素を作用させて得られるものでもよい。
ここで、ＣＳの塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩や、ジエタノールアミン塩、シクロへキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが例示される。
【００２５】
ＣＳ又はその塩は、例えば天然資源から公知の方法で抽出したＣＳ又はその塩が挙げられる。天然資源から抽出したＣＳ又はその塩は市販のものでもよい。ＣＳ又はその塩の原料として用いることができる天然資源としては、具体的にはサメ、サケ、エイ及びイカ等の水産動物の軟骨、鯨の軟骨（特に鼻軟骨）、ウシ、豚等の哺乳動物又は鳥類の気管等が例示される。なかでも水産動物としてはサメが好ましく、哺乳動物としては、ウシが好ましい。これらの天然資源から抽出したＣＳ又はその塩はいずれも十分に安全性が高いものであるが、人畜共通感染症（例えばウシについては牛海綿状脳症（BSE）、牛痘、偽牛痘等が挙げられる）が見出されていない動物という観点では、サメであることが好ましい。サメとしては、具体的には吉切サメ等のいわゆる水物、アオザメ及びメジロザメ等のいわゆる堅物等が例示される。また、使用するサメの部位も特に限定されないが、ＣＳ又はその塩を豊富に含有するという観点では、軟骨又はヒレであることが好ましい。
上記の様な天然資源からＣＳ又はその塩を抽出する方法としては、粉砕、中性塩法、アルカリ法、タンパク質分解酵素を用いる方法、オートクレーブを用いる方法、第四級アンモニウム塩を用いる方法に例示される、公知の方法を用いることが出来る。
【００２６】
本発明の製造方法において使用する画分は、このようにして取得したＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させて低分子化することによって得ることが出来る。ＣＳ分解酵素を用いることにより、ＣＳが均一に低分子化され、より高い割合で硫酸基を保持したＣＳ又はその塩の画分が得られ、且つＣＳ・鉄コロイド製剤としたときに非常に優れた製剤学的特性（例えば、ろ過性が高い、製剤学的に問題となる異物を生じない、優れた粒子径を有するコロイドを形成する等）を発揮しうる。
【００２７】
ＣＳ分解酵素としては、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ（コンドロイチンＡＣリアーゼ、ともいう。）、Ｉ型及びＩＩ型のコンドロイチナーゼＡＢＣ（コンドロイチンＡＢＣリアーゼ、ともいう。）が例示される。なかでも、コンドロイチナーゼＡＢＣ（特に、Ｉ型のコンドロイチナーゼＡＢＣ）又はコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いることが好ましく、コンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いることが、均一に低分子化され、より高い割合で硫酸基を保持したＣＳ又はその塩の画分が得られ、且つＣＳ・鉄コロイド製剤としたときに非常に優れた製剤学的特性（例えば、ろ過性が高い、製剤学的に問題となる異物を生じない、優れた粒子径を有するコロイドを形成する等）を発揮しうるという観点からより好ましい。
【００２８】
ここで、ＣＳまたはその塩にＣＳ分解酵素を「作用させる」方法や条件は、上記画分の原料となる前記ＣＳ又はその塩の分子と、ＣＳ分解酵素の分子とが接触することにより、当該ＣＳ分解酵素の分子が当該ＣＳ又はその塩の分子に作用して、ＣＳ又はその塩の低分子化が惹起される限りにおいて特に限定されない。作用させる際の温度も、用いるＣＳ分解酵素が作用しうる限りにおいて特に限定されないが、当該ＣＳ分解酵素の至適温度付近が好ましい。例えば、２０〜４０℃で行うことが好ましく、３０℃〜４０℃で行うことがより好ましく、３７℃で行うことが最も好ましい。また、作用させる際のｐＨも、同様に
当該酵素が作用しうる限りにおいて特に限定されないが、当該酵素の至適ｐＨ付近が好ましい。例えば、ｐＨ５〜９の溶液中で行うことが好ましい。
【００２９】
例えばコンドロイチナーゼＡＢＣを用いる場合においては、ｐＨ７〜９の溶液中で行うことが好ましく、ｐＨ７．５〜８．５の溶液中で行うことがより好ましく、ｐＨ８で行うことが最も好ましい。例えばコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いる場合においては、ｐＨ５〜７の溶液中で行うことが好ましく、ｐＨ５．５〜６．５の溶液中で行うことがより好ましく、ｐＨ６で行うことが最も好ましい。また、上記接触を行う際の溶液も、ＣＳ分解酵素のＣＳ又はその塩に対する作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、水性溶液が好ましい。水性溶液としては、水、緩衝液、生理的塩類溶液等が例示される。また、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩の量も、適宜調節することが出来る。また、反応に使用するＣＳ分解酵素のユニット数（例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣを使用する場合、「３７℃、ｐＨ８．０の条件下で、ＣＳＣ（サメ軟骨由来）から１分間あたり１ μmoleの不飽和二糖を生成する酵素量」を１ユニットとし、コンドロイチナーゼＡＣＩＩを使用する場合、「３７℃、ｐＨ６．０の条件下で、ＣＳＣ（サメ軟骨由来）から１分間あたり１ μmoleの不飽和二糖を生成する酵素量」を１ユニットとする。）並びに反応時間は、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩や、所望するＣＳ又はその塩の量に応じて適宜調節することが出来る。ＣＳ分解酵素のユニット数は、例えば１ｇのＣＳ又はその塩に対して、０．５〜３．０ユニットのＣＳ分解酵素を使用することが好ましく、０．５〜１．５ユニットのＣＳ分解酵素を使用することがより好ましい。また、使用するＣＳ分解酵素のユニット数は、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩や、所望するＣＳ又はその塩の量に応じて適宜調節することが出来る。また、反応時間は、１〜２０時間であることが好ましく、１〜１０時間であることがより好ましく、１〜６時間であることが最も好ましい。より具体的な方法の例示については、実施例を参照されたい。
【００３０】
このようにして低分子化したＣＳ又はその塩を含む画分を本発明の製造方法に使用してもよいが、低分子化したＣＳ又はその塩を含む画分からタンパク質等の不純物を除去した画分を本発明の製造方法における画分として使用することが好ましい。なお本出願書類において「除去」とは、ある物質を完全に除き去ることのみならず、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことをも意味する用語として用いる。
タンパク質の除去は、ＣＳ分解酵素を作用させる前のＣＳまたはその塩に対して行ってもよく、低分子化後のＣＳ又はその塩を含有する画分に対して行ってもよいが、少なくとも低分子化後のＣＳ又はその塩を含有する画分に対して行うことが好ましい。なかでも、低分子化の前後にそれぞれ行うことがより好ましい。尚、ＣＳ分解酵素は、加熱等により失活させることもできる。
また、タンパク質を除去するステップを行うことによって、同時に、塩化物、無機硫酸塩、重金属、ヒ素といった不純物を除去することも出来る。
【００３１】
タンパク質を除去する方法としては、有機溶媒（例えばアルコール）による沈殿及び分画、塩析、活性炭処理、タンパク質分解酵素を用いた除タンパク質処理が例示され、またこれらの方法を組み合わせることによっても行うことが出来るが、アルコール沈殿による分画及び活性炭処理により行うことが好ましい。
【００３２】
以上のように、本発明における「画分」は、ＣＳ分解酵素によって低分子化されたＣＳまたはその塩を含むものであればよいが、ＣＳ又はその塩を含む溶液にＣＳ分解酵素を作用させて得られる溶液に対して分画操作を行い、上記ＣＳ分解酵素及びその他の不純物を除去することにより得られる画分であることが好ましい。
また、ＣＳ又はその塩を含む溶液にＣＳ分解酵素を作用させて得られる溶液を乾燥したり、濃縮したり、溶媒を置換したり、脱塩を行うなどして得られるものを画分として用いてもよい。
本出願書類において「画分」という場合、その状態も特に限定されず、精製水、緩衝液、生理食塩水等の適当な溶媒に溶解した溶液状態でもよく、固体の状態（粉末等や、溶液が凍結した状態等）でもよい。
【００３３】
本発明の製造方法に用いる上記画分は、下記性質（１）〜（３）を有することが好ましい。
性質（１）：硫黄含量が、６．５〜８％である。
なかでも、硫黄含量が、６．８〜８％であることが好ましく、６．８〜７．５％であることがより好ましく、６．９〜７．５％であることがより好ましく、７〜７．５％であることがより好ましく、７．１〜７．５％であることがより好ましく、７．１〜７．３％であることがより好ましく、７．１〜７．２％であることが最も好ましい。また、硫黄含量が７〜８％であることも好ましく、なかでも７〜７．５％であることがより好ましく、７〜７．３％であることがさらに好ましい。硫黄含量の測定は、自動分析装置を用いることによって行うことが出来る。具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。ＣＳ分解酵素を作用させることによる低分子化は、塩酸等による化学的分解と比較して、よりマイルドな条件でＣＳ又はその塩を低分子化することができる。このような酵素を用いたマイルドな条件下での低分子化は、原料として用いるＣＳ又はその塩の分子中に存在する硫酸基の脱離がなるべく惹起されない低分子化の実現に貢献しており、結果として本発明は上記のような高い硫黄含量を有する画分を提供することができる。
【００３４】
性質（２）：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
なかでも、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、１０，０００〜１８，０００であることが好ましく、１２，０００〜１６，０００であることがより好ましく、１４，０００〜１５，０００であることが最も好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーによる重量平均分子量は、後述の実施例に記載の通り、重量平均分子量が既知の標準物質をゲル濾過カラムに付して、溶出時間と重量平均分子量との関係についての検量線を作成しておき、次いで重量平均分子量測定の対象とするＣＳ又はその塩を同一条件下でゲル濾過カラムに付して、溶出時間を測定し、この測定値と前記検量線を用いて求めることが出来る。具体的には実施例を参照されたい。
【００３５】
性質（３）：ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
なかでも、ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．０５％以下であることが好ましく、０．０２％以下であることがより好ましく、０．０１％以下であることが最も好ましい。ローリー法によるタンパク質含量の測定は、公知の方法により行うことが出来る。具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。
なお、ここでいうタンパク質含量とは、不純物としてのタンパク質の含量を意味し、キャリア、安定化剤又はコンドロイチン硫酸・鉄コロイド以外の有効成分などとしてタンパク質を加える場合、その含量は計算に入れない。
【００３６】
また、上記画分は、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２であることが好ましい（性質（４））。なかでも、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．６〜２．２であることがより好ましく、１．６〜２．０であることが最も好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーによる、分子量分散度の測定方法については、実施例を参照されたい。
【００３７】
また、上記画分は、極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）であることが好ましい（性質（５））。なかでも極限粘度が０．４〜０．５（dl/g）であるものが好ましく、０．３５〜０．４５（dl/g）であることがさらに好ましく、０．３８〜０．４２（dl/g）であることが最も好ましい。極限粘度の具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。
【００３８】
また、上記画分は、二糖分析の結果が以下の通りのものであることが好ましい（性質（６））。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
なお、本出願書類におけるΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉＳD、ΔＤｉ−ｄｉＳE、ΔＤｉ−ｔｒｉＳは、Analytical Biochemistry 177, p327-332(1989)の定義に従って表記した。
なお、本出願書類における「二糖分析」の用語は、ＣＳまたはその塩に作用して不飽和二糖を生成させる酵素（リアーゼ）でＣＳ又はその塩を酵素処理し、該ＣＳまたはその塩の構成二糖を反映して生成する不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、同定及び定量することを意味する。より具体的な二糖分析の方法は、実施例を参照されたい。
【００３９】
また、上記画分は、塩化物含量が０．１４２％以下であるものが好ましい（性質（７））。
また、上記画分は、無機硫酸塩含量が０．２４％以下であるものが好ましい（性質（８））。
また、上記画分は、重金属含量が２０ｐｐｍ以下であるものが好ましい（性質（９））。
また、上記画分は、ヒ素含量が２ｐｐｍ以下であるものが好ましい（性質（１０））。
また、上記画分は、窒素含量が２〜４％であるものが好ましい（性質（１１））。なかでも窒素含量が２〜３％であるものが好ましく、２．５〜２．７％であるものがより好ましい。
上記塩化物含量、無機硫酸塩含量、重金属含量、ヒ素含量及び窒素含量の具体的な測定方法は、実施例を参照されたい。
【００４０】
さらに上記画分は、上記画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときのｐＨが６〜７であるものが好ましい（性質（１２））。なかでも上記画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときのｐＨが６．５〜７であることがより好ましい。ここで、「画分１ｇ」とは、乾燥状態の画分１ｇを意味する。ｐＨは、公知の方法により測定することが出来る。具体的には、実施例を参照されたい。
【００４１】
また、上記画分は、旋光度が−１５〜−１８°であるものが好ましい（性質（１３））。なかでも旋光度が−１５．５〜−１７．５°であるものがより好ましく、−１６．０〜−１７．０°であるものが最も好ましい。旋光度は、公知の方法により測定することが出来る。より具体的には、実施例を参照されたい。
【００４２】
また、上記画分は、上記画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときに、無色澄明であるものが好ましい（性質（１４））。ここで、「画分１ｇ」とは、乾燥状態の画分１ｇを意味する。
【００４３】
また、上記画分は、粉末状態としたときに、白色であるものが好ましい（性質（１５））。
【００４４】
また、上記画分は、乾燥減量が１〜７％であるものが好ましい（性質（１６））。なか
でも乾燥減量が３〜６％であるものがより好ましく、４〜５．５％であるものが最も好ましい。
【００４５】
また、上記画分は、強熱残分が２３〜３１％であるものが好ましい（性質（１７））。なかでも強熱残分が２８〜３０％であるものがより好ましい。上記乾燥減量及び強熱残分の具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。
【００４６】
本発明においては、上記の画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させることによって、ＣＳ・鉄コロイド製剤を製造する。より具体的には、例えばＣＳナトリウムの３〜１０％水溶液に、１ｍｌ中に鉄１０〜１００ｍｇを含有する第二鉄塩を攪拌下常温で滴下した後に、アルカリ金属水酸化物の水溶液を滴下し、ｐＨを好ましくは７〜１０に、より好ましくは８．５〜９．５に、最も好ましくは９に調整することにより、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤を製造することができる。
ここで、第二鉄塩としては、塩化第二鉄、クエン酸第二鉄、ピロリン酸第二鉄、グルコン酸第二鉄、硫酸第二鉄などが挙げられるが、なかでも塩化第二鉄が好ましい。
アルカリ金属水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられるが、なかでも水酸化ナトリウムが好ましい。
【００４７】
上記画分に第二鉄塩を接触させる際の条件は特に制限されないが、例えば、上記画分の溶液に水酸化ナトリウムに例示されるアルカリ金属水酸化物の固体または溶液（好ましくは溶液）を加えて溶液のｐＨを好ましくはｐＨ８〜９のアルカリ性にし、そこに固体または溶液（好ましくは溶液）の第二鉄塩を滴下することにより接触させることが好ましい。さらに上記の滴下は、水酸化ナトリウムに例示されるアルカリ金属水酸化物を用いて、常にｐＨが８〜９となるように調整しながら行うことが好ましい。また第二鉄塩の接触後の溶液は、水酸化ナトリウムに例示されるアルカリ金属水酸化物を用いてｐＨ８．５〜９．５、より好ましくはｐＨ９に調整することが好ましい。
【００４８】
上記のようにして得られたＣＳ・鉄コロイド溶液は、優れたろ過性及び粒子径特性を有しており、好ましくは以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する。
（ａ）光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が、６０〜３００ｎｍである。
（ｂ）該製剤１リットルを、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）に対してろ過に供した後に、ポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）に対してろ過に供したときに、全量が通過可能である。
【００４９】
本発明の製造方法によれば、例えば光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が約２００ｎｍ又は２５０ｎｍである場合のように、比較的大きい粒子径を有するコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを含有するＣＳ・鉄コロイド製剤であっても、上記（ｂ）のような高いろ過性を有する製剤とすることも可能である。より具体的には、後述する実施例、特に、表４中の調整後の平均粒子径を参照されたい。
【００５０】
上記のようにして得られるＣＳ・鉄コロイド溶液は、必要に応じて希釈、濃縮、溶液の置換、滅菌、ろ過等の処理を行った後にＣＳ・鉄コロイド製剤として用いてもよい。また、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、ＣＳ・鉄コロイド以外の成分をさらに含有していても良い。そのような成分としては、医薬、医薬原料、試薬、試薬原料、化粧品、化粧品原料、食品添加物、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝剤や安定化剤など。）等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、これが含有する鉄の量によって限定されるべきものではないが、例えば１ｍｌ中に３〜５ｍｇの鉄を含有することが好ましく、約４ｍｇの鉄を含有することがより好ましい。
【００５２】
本発明の製造方法によって得られたＣＳ・鉄コロイド製剤の剤型は特に制限されないが、注射剤として特に好適に使用することができる。
【００５３】
本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、その投与方法、投与量によって限定されるべきものではないが、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤を例えば鉄欠乏性貧血の予防、緩和、治療等の目的で、あるいは増血又は貯蔵鉄の不足を補う目的で用いる場合、患者のヘモグロビン量と体重から公知の方法により必要鉄量を算出し、適当な量のＣＳ・鉄コロイド製剤を投与することができ。より具体的には、例えば鉄として一日２０〜４０ｍｇとなるように投与すること、すなわち、例えば本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤が、１ｍｌ中に４ｍｇの鉄を含有する場合、一日５〜１０ｍｌの本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤を静脈注射することにより投与することが好ましい。上記の投与量は患者の年齢、症状等によっても適宜調整することができる。
なお、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、鉄欠乏性貧血の治療に有用であり、ラットによる静脈内反復投与試験により安全性が確認されている。
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に限定されない。
【実施例１】
【００５５】
ＣＳナトリウム画分の調製
サメ軟骨を粉砕し、これにタンパク質分解酵素（エスペラーゼ；ノボザイムズ社製）を作用させることにより、ＣＳナトリウム１３７．６ｋｇを含有する溶液を得た。この溶液を約１４００Lに調整し、約10.4万ユニットのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）を加え、混合した後、３７℃にて約６時間作用させた。得られた反応後の溶液に対して、アルコール沈殿による分画を行い、続いて活性炭処理を行った。得られた画分の脱塩を行い、低分子化した精製ＣＳナトリウム９５．３ｋｇを含有する溶液１５２０リットル（濃度６２．７ｍｇ/ｍｌ）を得た。このようにして得られたＣＳナトリウム溶液を、約６０℃にて減圧乾燥し、ＣＳナトリウム（ロット１）を得た。
上記精製ステップにおける各種パラメータは、表１（ロット１）にまとめた。また、上記の精製ステップにおける各種パラメータを、表１（ロット２〜５）の通りに変えて、精製を行い、ＣＳナトリウム（ロット２〜５）を得た。ロット１〜５において、乾燥後のＣＳナトリウムは白色であり、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。
【００５６】
【表１】
【実施例２】
【００５７】
ＣＳナトリウム画分の分析
実施例１で得られたＣＳナトリウム（ロット１〜５）を、下記の方法により分析した。（a）重量平均分子量
下記の条件で測定を行い、分子量既知の標準試料と溶出時間を比較することにより、重量平均分子量を算出した。
測定試料：実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム 5 mgを精製水に溶解し、10 mlにメスアップした後、0.22 μmのフィルターで濾過した。測定においては、得られた上記測定試料の内、100 μlをインジェクションした。
カラム：TSK-GEL（東ソー製、TSKgel G4000PWXLとTSKgel G3000PWXLを連結して使用した。）
バッファー：0.2 mol/L NaCl溶液（0.22 μmのフィルターで濾過したもの。）
流速：0.5 ml/min
測定時間：５５分
測定温度：40 ℃
検出器：ＲＩ（示差屈折計）
標準試料：分子量52200、31400、20000、10200、6570のＣＳナトリウム（生化学工業株式会社製）を使用した。
解析ソフトウェア：Waters ミレニアム32 Ver 3.01（日本ウォーターズ株式会社）
（b）分子量分散度（MW/MN）
（a）と同様の条件で測定した数平均分子量（MN）に対する重量平均分子量（MW）の割合を、上記（a）記載の解析ソフトウェアを用いて自動計算し、求めた。
（c）硫黄含量
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウムについて、堀場硫黄分析装置（EMIA-120）を使用し、硫黄含量を測定した（３回の測定により得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとにそれぞれ無水物換算し、得られた値の平均値を測定結果とした）。
（d）タンパク質含量
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム（濃度既知）に対し、標準物質としてウシ血清アルブミンを用い、ローリー法によりタンパク質含量を測定した（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（e）極限粘度
第十四改正日本薬局方（４５．粘度測定法 第１法 毛細管粘度計法（p.66〜67））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（f）塩化物含量
日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（２）塩化物（p.296））に記載の方法に従って測定を行った。測定試料としては、実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 0.1 gを使用した（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（g）無機硫酸塩含量
日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（３）硫酸塩（p.296））に記載の方法に従って測定を行った。（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（h）重金属含量
第十四改正日本薬局方（２６．重金属試験法 (2)第２法（p.36〜37））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（i）ヒ素含量
第十四改正日本薬局方（５１．ヒ素試験法 (3)第３法（p.78〜79））に記載の方法に従っ
て、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（j）窒素含量
第十四改正日本薬局方（３６．窒素定量法（セミミクロケルダール法）（p.53〜54））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（k）ｐＨ
第十四改正日本薬局方（４８．ｐＨ測定法（p.69〜71））に記載の方法に従って、測定を行った。試料溶液としては、実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 1gを水に溶解し、100 ccとした溶液を使用した。
（l）旋光度
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム 0.5 g（(m)乾燥減量記載の方法により得た乾燥減量をもとに無水物換算した値）を水 50 mLに溶解し、100 mmセルにて測定した。
上記測定は、第十四改正日本薬局方（３５．旋光度測定法（p.53））に記載の方法に従って行った。
（m）乾燥減量
第十四改正日本薬局方（１０．乾燥減量試験法（p.25〜26））に記載の方法に従って、測定を行った（0.1 g、減圧 0.67 kpa以下、五酸化リン、６０℃、４時間）。
（n）強熱残分
第十四改正日本薬局方（１６．強熱残分試験法（p.27〜28））に記載の方法に従って、測定を行った（1g、乾燥後）。
（a）〜（n）の分析結果を、表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
(o) 二糖分析
（測定試料の調製）
実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 100 mgを精製水に溶解させ、10 mlにメスアップした。氷浴中において、コンドロイチナーゼＡＢＣ 10 ユニット/50 μlに試料溶液 100 μlを添加し、攪拌した。更にTris-HCl緩衝液（pH 7.9）200 μlを添加し、攪拌した。これを３７℃において１時間インキュベーションした後、沸騰浴中において３０秒間加熱処理し、酵素を失活させた。精製水 650 μlを添加し、攪拌した後、0.22 μmのフィルターで濾過した。測定においては、上記試料10 μlをインジェクションした。
（測定条件）
カラム：YMC-GEL PA-120-S5（株式会社ワイエムシィ）
標準試料：不飽和ＣＳナトリウム ＨＰＬＣ用（ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉＳD、ΔＤｉ−ｄｉＳE、ΔＤｉ−ｔｒｉＳ）（生化学工業株式会社）バッファー；水と0.8 mol/L NaH2PO4水溶液の濃度勾配により行った（水と0.8 mol/L NaH2PO4水溶液の割合は、４５分の間に、９８：２→２５：７５に変化させた）。
流速：1.0 ml/min
測定温度：４０℃
検出器：ＵＶ（230 nm）
各二糖単位の含量（％）は、その溶出パターンの積分値（面積）を、濃度既知の上記標準試料の溶出パターンの積分値（面積）と比較することにより求めた。
二糖分析結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
以上の実施例によって、ＣＳナトリウムをＣＳ分解酵素を作用させて低分子化することにより、重量平均分子量（ゲル濾過クロマトグラフィー）が、５，０００〜２０，０００の範囲に均一に低分子化され、硫黄含量が６．５〜８％に保持され、且つ高純度に精製された、非常に高品質なＣＳナトリウムの画分が得られることが明らかになった。
【実施例３】
【００６２】
ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製
実施例１で調製したＣＳナトリウムを材料として用い、ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製を行った。
ＣＳナトリウムの４重量％水溶液５００ｍｌを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８〜９に調整した。水酸化ナトリウム水溶液を用いて水溶液のｐＨを８〜９の間に保ちつつ、上記調整後のＣＳナトリウム水溶液に、１ｍｌ中に鉄 約20mgを含有する塩化第二鉄液２００ｍｌを攪拌下常温で滴下した。上記滴下後の溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いて９に調整し、蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌに調整し、ＣＳ・鉄コロイド製剤を得た。本品は、１ｍｌ中に鉄４mgを含有する。
得られた製剤各１リットルを、それぞれステンレス製フィルターホルダー（ミリポア社）を用い、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、プレフィルターとしてポ
リエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（アドバンテック社、品名：Y008A124A、孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）を用いてろ過に供した後に、ファイナルフィルターとしてポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（ミリポア社、品名：デュラポアメンブレンフィルター、孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）を用いてろ過に供したとき、全量が通過可能であった。さらにろ過後の各製剤を、耐圧瓶に入れてオートクレーブ（102℃、90分）により滅菌した。
各ＣＳナトリウム画分を材料として用いた場合に得られた各製剤の平均粒子径を、光散乱法濃厚系粒径アナライザー：FPAR-1000（大塚電子株式会社）によって測定した。結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
*1 実施例中、蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌに調整し、ＣＳ・鉄コロイド製剤を得た後に測定した平均粒子径を示す。
【００６４】
［参考例１］
塩酸を用いたＣＳナトリウムの画分の調製及び分析
以下、塩酸を用いて低分子化を行う場合について、参考例を示す。
コンドロイチナーゼＡＣＩＩに代えて、塩酸を用いてＣＳナトリウムを低分子化するという点以外は、上記実施例１と基本的に同様の方法によって、ＣＳナトリウム画分の調製を行った。塩酸による低分子化を経て得られたＣＳナトリウム溶液を、約６０℃にて減圧乾燥した。乾燥後のＣＳナトリウムは白色であった。また、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。
実施例２に記載の（a）〜（n）の分析を行った。結果を表２（ロット６）に示す。
【００６５】
［参考例２］
ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製
参考例１で調製したＣＳナトリウムを材料として用いることの他、実施例３と同様の方法により、ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製を行った。
得られた製剤１リットルを、実施例３と同様の方法によりろ過に供したところ、２００ｍｌが通過可能であり、残りの８００ｍｌは通過しなかった。また、調製した各製剤の平均粒子径を、実施例３と同様の方法によって測定した。結果を表４（ロット６）に示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤の製造方法およびそれによって得られるコンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
貧血などの症状を示す患者に鉄を供給するための製剤として鉄コロイド製剤が知られており、鉄コロイド製剤としてグリコサミノグリカンの一種であるコンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」と略記する。）と鉄を含むＣＳ・鉄コロイド製剤が知られていた（特許文献１〜４等）。
このようなＣＳ・鉄コロイド製剤は、生体への投与における目的、用法等に応じ、一定の分子量特性を有するＣＳを原料として用いて製造され、且つ一定の粒子径特性を有することが、品質が保証された製剤を安定的に供給する観点から好ましいことが知られている。
一方で近年、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、口蹄疫等の人畜共通感染症に対して万全を期すための配慮から、サメ等のウシ以外の生物に由来するＣＳを原料としたＣＳ・鉄コロイド製剤が望まれているが、ＣＳの由来によっては、目的とする用途において好ましいとされる粒子径特性を有するＣＳ・鉄コロイド製剤が得られないことがあることが知られていた（特許文献２）。
【０００３】
ＣＳを分解する酵素としては、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣ（非特許文献１参照。）等が知られている。
非特許文献２には、上記の酵素によってＣＳから不飽和二糖を生成させ、これを検出することにより、当該酵素の活性を測定する方法が開示されている。しかし、上記のような酵素を用いて、ある程度のサイズを保持しつつ低分子化されたＣＳ画分を製造すること、及びこのようにして得られた低分子化されたＣＳ画分を医薬原料として利用することについては、記載も示唆もない。
【特許文献１】特公昭３６−１５２９６号公報
【特許文献２】特開２００４−１９６６９５号公報
【特許文献３】特開２００４−２６３１０９号公報
【特許文献４】特開２００４−３４６０３８号公報
【非特許文献１】ハマイら、１９９７年、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７２巻、第１４号、ｐ．９１２３−９１３０
【非特許文献２】ヤマガタら、１９６８年、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２４３巻、第７号、ｐ．１５２３−１５３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ろ過性及び粒子径特性に優れ、生体への投与に適したＣＳ・鉄コロイド製剤およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った。その結果、塩酸による化学的分解により低分子化したサメ由来のＣＳを原料として用いた場合、好ましいろ過性及び粒子径特性を有するＣＳ・鉄コロイド製剤が得られないことがあるという新たな課題を見出した。さらに本発明者らは、上記の新たな課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分を原料として用いる
ことによって、ろ過性及び粒子径特性に優れたＣＳ・鉄コロイド製剤が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【０００７】
本発明はまた、上記ＣＳ分解酵素がリアーゼであることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記ＣＳ分解酵素がコンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣであることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、上記画分が、下記（１）〜（３）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（１）硫黄含量が６．５〜８％である。
（２）ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
（３）ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
【０００９】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（４）の性質を有するものである、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（４）ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２である。
【００１０】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（５）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（５）極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）である。
【００１１】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（６）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（６）：二糖分析の結果が以下の通りである。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
【００１２】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（７）〜（１１）の性質を有するものである、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（７）塩化物含量が０．１４２％以下である。
（８）無機硫酸塩含量が０．２４％以下である。
（９）重金属含量が２０ｐｐｍ以下である。
（１０）ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である。
（１１）窒素含量が２〜４％である。
【００１３】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記性質（１２）を有するものである、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（１２）前記画分１gを１００mlの水溶液としたときのｐＨが６〜７である。
【００１４】
本発明はまた、上記画分が、さらに、下記（１３）〜（１７）の性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する；
（１３）旋光度が−１５°〜−１８°である。
（１４）本画分１gを１００mlの水溶液としたときに、無色澄明である。
（１５）粉末状態としたときに、白色である。
（１６）乾燥減量が１〜７％である。
（１７）強熱残分が２３〜３１％である。
【００１５】
本発明はまた、上記ＣＳ又はその塩がサメ由来であることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、上記画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を、ｐＨ８〜９の溶液中で接触させることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、上記画分に第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程によって得られた画分のｐＨを７〜１０に調整する工程をさらに含むことを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤の製造方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、上記製造方法によって製造される、ＣＳ・鉄コロイド製剤を提供する。
本発明はまた、下記（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有することを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤を提供する；
（ａ）光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が、６０〜３００ｎｍである。
（ｂ）該製剤１リットルを、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）に対してろ過に供した後に、ポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）に対してろ過に供したときに、全量が通過可能である。
【００１９】
本発明はまた、注射液であることを特徴とする、上記ＣＳ・鉄コロイド製剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の製造方法によって得られるＣＳ・鉄コロイド製剤は、ろ過性及び粒子径特性に優れており、生体への投与に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。なお、本出願書類での「％」表記の単位は、特にことわらない限り「重量％」を意味する。ただし二糖分析における不飽和二糖の含有率については、不飽和二糖の含有モル比を「％」で表す。
【００２２】
また、本出願書類において、以下に述べる性質（１）〜（１７）に記載されているパラメータは、特にことわりのない場合、本明細書中の実施例に記載した分析方法によって決定されるものである。特に、性質（７）に記載されている塩化物含量は、後述する（f）塩化物含量（実施例２）の方法により決定される値である。また、性質（８）に記載されている無機硫酸塩含量は、後述する（g）無機硫酸塩含量（実施例２）に記載の方法により決定される値である。
【００２３】
本発明においては、ＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させることによって、ＣＳ・鉄コロイド製剤を製造する。
【００２４】
前記画分は、ＣＳ又はその塩のどちらか一方にＣＳ分解酵素を作用させて得られるものでもよく、ＣＳおよびその塩の混合物にＣＳ分解酵素を作用させて得られるものでもよい。
ここで、ＣＳの塩としては、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩や、ジエタノールアミン塩、シクロへキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが例示される。
【００２５】
ＣＳ又はその塩は、例えば天然資源から公知の方法で抽出したＣＳ又はその塩が挙げられる。天然資源から抽出したＣＳ又はその塩は市販のものでもよい。ＣＳ又はその塩の原料として用いることができる天然資源としては、具体的にはサメ、サケ、エイ及びイカ等の水産動物の軟骨、鯨の軟骨（特に鼻軟骨）、ウシ、豚等の哺乳動物又は鳥類の気管等が例示される。なかでも水産動物としてはサメが好ましく、哺乳動物としては、ウシが好ましい。これらの天然資源から抽出したＣＳ又はその塩はいずれも十分に安全性が高いものであるが、人畜共通感染症（例えばウシについては牛海綿状脳症（BSE）、牛痘、偽牛痘等が挙げられる）が見出されていない動物という観点では、サメであることが好ましい。サメとしては、具体的には吉切サメ等のいわゆる水物、アオザメ及びメジロザメ等のいわゆる堅物等が例示される。また、使用するサメの部位も特に限定されないが、ＣＳ又はその塩を豊富に含有するという観点では、軟骨又はヒレであることが好ましい。
上記の様な天然資源からＣＳ又はその塩を抽出する方法としては、粉砕、中性塩法、アルカリ法、タンパク質分解酵素を用いる方法、オートクレーブを用いる方法、第四級アンモニウム塩を用いる方法に例示される、公知の方法を用いることが出来る。
【００２６】
本発明の製造方法において使用する画分は、このようにして取得したＣＳ又はその塩にＣＳ分解酵素を作用させて低分子化することによって得ることが出来る。ＣＳ分解酵素を用いることにより、ＣＳが均一に低分子化され、より高い割合で硫酸基を保持したＣＳ又はその塩の画分が得られ、且つＣＳ・鉄コロイド製剤としたときに非常に優れた製剤学的特性（例えば、ろ過性が高い、製剤学的に問題となる異物を生じない、優れた粒子径を有するコロイドを形成する等）を発揮しうる。
【００２７】
ＣＳ分解酵素としては、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ（コンドロイチンＡＣリアーゼ、ともいう。）、Ｉ型及びＩＩ型のコンドロイチナーゼＡＢＣ（コンドロイチンＡＢＣリアーゼ、ともいう。）が例示される。なかでも、コンドロイチナーゼＡＢＣ（特に、Ｉ型のコンドロイチナーゼＡＢＣ）又はコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いることが好ましく、コンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いることが、均一に低分子化され、より高い割合で硫酸基を保持したＣＳ又はその塩の画分が得られ、且つＣＳ・鉄コロイド製剤としたときに非常に優れた製剤学的特性（例えば、ろ過性が高い、製剤学的に問題となる異物を生じない、優れた粒子径を有するコロイドを形成する等）を発揮しうるという観点からより好ましい。
【００２８】
ここで、ＣＳまたはその塩にＣＳ分解酵素を「作用させる」方法や条件は、上記画分の原料となる前記ＣＳ又はその塩の分子と、ＣＳ分解酵素の分子とが接触することにより、当該ＣＳ分解酵素の分子が当該ＣＳ又はその塩の分子に作用して、ＣＳ又はその塩の低分子化が惹起される限りにおいて特に限定されない。作用させる際の温度も、用いるＣＳ分解酵素が作用しうる限りにおいて特に限定されないが、当該ＣＳ分解酵素の至適温度付近が好ましい。例えば、２０〜４０℃で行うことが好ましく、３０℃〜４０℃で行うことがより好ましく、３７℃で行うことが最も好ましい。また、作用させる際のｐＨも、同様に
当該酵素が作用しうる限りにおいて特に限定されないが、当該酵素の至適ｐＨ付近が好ましい。例えば、ｐＨ５〜９の溶液中で行うことが好ましい。
【００２９】
例えばコンドロイチナーゼＡＢＣを用いる場合においては、ｐＨ７〜９の溶液中で行うことが好ましく、ｐＨ７．５〜８．５の溶液中で行うことがより好ましく、ｐＨ８で行うことが最も好ましい。例えばコンドロイチナーゼＡＣＩＩを用いる場合においては、ｐＨ５〜７の溶液中で行うことが好ましく、ｐＨ５．５〜６．５の溶液中で行うことがより好ましく、ｐＨ６で行うことが最も好ましい。また、上記接触を行う際の溶液も、ＣＳ分解酵素のＣＳ又はその塩に対する作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、水性溶液が好ましい。水性溶液としては、水、緩衝液、生理的塩類溶液等が例示される。また、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩の量も、適宜調節することが出来る。また、反応に使用するＣＳ分解酵素のユニット数（例えば、コンドロイチナーゼＡＢＣを使用する場合、「３７℃、ｐＨ８．０の条件下で、ＣＳＣ（サメ軟骨由来）から１分間あたり１ μmoleの不飽和二糖を生成する酵素量」を１ユニットとし、コンドロイチナーゼＡＣＩＩを使用する場合、「３７℃、ｐＨ６．０の条件下で、ＣＳＣ（サメ軟骨由来）から１分間あたり１ μmoleの不飽和二糖を生成する酵素量」を１ユニットとする。）並びに反応時間は、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩や、所望するＣＳ又はその塩の量に応じて適宜調節することが出来る。ＣＳ分解酵素のユニット数は、例えば１ｇのＣＳ又はその塩に対して、０．５〜３．０ユニットのＣＳ分解酵素を使用することが好ましく、０．５〜１．５ユニットのＣＳ分解酵素を使用することがより好ましい。また、使用するＣＳ分解酵素のユニット数は、低分子化の対象となるＣＳ又はその塩や、所望するＣＳ又はその塩の量に応じて適宜調節することが出来る。また、反応時間は、１〜２０時間であることが好ましく、１〜１０時間であることがより好ましく、１〜６時間であることが最も好ましい。より具体的な方法の例示については、実施例を参照されたい。
【００３０】
このようにして低分子化したＣＳ又はその塩を含む画分を本発明の製造方法に使用してもよいが、低分子化したＣＳ又はその塩を含む画分からタンパク質等の不純物を除去した画分を本発明の製造方法における画分として使用することが好ましい。なお本出願書類において「除去」とは、ある物質を完全に除き去ることのみならず、部分的に除き去る（その物質の量を減少させる）ことをも意味する用語として用いる。
タンパク質の除去は、ＣＳ分解酵素を作用させる前のＣＳまたはその塩に対して行ってもよく、低分子化後のＣＳ又はその塩を含有する画分に対して行ってもよいが、少なくとも低分子化後のＣＳ又はその塩を含有する画分に対して行うことが好ましい。なかでも、低分子化の前後にそれぞれ行うことがより好ましい。尚、ＣＳ分解酵素は、加熱等により失活させることもできる。
また、タンパク質を除去するステップを行うことによって、同時に、塩化物、無機硫酸塩、重金属、ヒ素といった不純物を除去することも出来る。
【００３１】
タンパク質を除去する方法としては、有機溶媒（例えばアルコール）による沈殿及び分画、塩析、活性炭処理、タンパク質分解酵素を用いた除タンパク質処理が例示され、またこれらの方法を組み合わせることによっても行うことが出来るが、アルコール沈殿による分画及び活性炭処理により行うことが好ましい。
【００３２】
以上のように、本発明における「画分」は、ＣＳ分解酵素によって低分子化されたＣＳまたはその塩を含むものであればよいが、ＣＳ又はその塩を含む溶液にＣＳ分解酵素を作用させて得られる溶液に対して分画操作を行い、上記ＣＳ分解酵素及びその他の不純物を除去することにより得られる画分であることが好ましい。
また、ＣＳ又はその塩を含む溶液にＣＳ分解酵素を作用させて得られる溶液を乾燥したり、濃縮したり、溶媒を置換したり、脱塩を行うなどして得られるものを画分として用いてもよい。
本出願書類において「画分」という場合、その状態も特に限定されず、精製水、緩衝液、生理食塩水等の適当な溶媒に溶解した溶液状態でもよく、固体の状態（粉末等や、溶液が凍結した状態等）でもよい。
【００３３】
本発明の製造方法に用いる上記画分は、下記性質（１）〜（３）を有することが好ましい。
性質（１）：硫黄含量が、６．５〜８％である。
なかでも、硫黄含量が、６．８〜８％であることが好ましく、６．８〜７．５％であることがより好ましく、６．９〜７．５％であることがより好ましく、７〜７．５％であることがより好ましく、７．１〜７．５％であることがより好ましく、７．１〜７．３％であることがより好ましく、７．１〜７．２％であることが最も好ましい。また、硫黄含量が７〜８％であることも好ましく、なかでも７〜７．５％であることがより好ましく、７〜７．３％であることがさらに好ましい。硫黄含量の測定は、自動分析装置を用いることによって行うことが出来る。具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。ＣＳ分解酵素を作用させることによる低分子化は、塩酸等による化学的分解と比較して、よりマイルドな条件でＣＳ又はその塩を低分子化することができる。このような酵素を用いたマイルドな条件下での低分子化は、原料として用いるＣＳ又はその塩の分子中に存在する硫酸基の脱離がなるべく惹起されない低分子化の実現に貢献しており、結果として本発明は上記のような高い硫黄含量を有する画分を提供することができる。
【００３４】
性質（２）：ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
なかでも、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、１０，０００〜１８，０００であることが好ましく、１２，０００〜１６，０００であることがより好ましく、１４，０００〜１５，０００であることが最も好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーによる重量平均分子量は、後述の実施例に記載の通り、重量平均分子量が既知の標準物質をゲル濾過カラムに付して、溶出時間と重量平均分子量との関係についての検量線を作成しておき、次いで重量平均分子量測定の対象とするＣＳ又はその塩を同一条件下でゲル濾過カラムに付して、溶出時間を測定し、この測定値と前記検量線を用いて求めることが出来る。具体的には実施例を参照されたい。
【００３５】
性質（３）：ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
なかでも、ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．０５％以下であることが好ましく、０．０２％以下であることがより好ましく、０．０１％以下であることが最も好ましい。ローリー法によるタンパク質含量の測定は、公知の方法により行うことが出来る。具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。
なお、ここでいうタンパク質含量とは、不純物としてのタンパク質の含量を意味し、キャリア、安定化剤又はコンドロイチン硫酸・鉄コロイド以外の有効成分などとしてタンパク質を加える場合、その含量は計算に入れない。
【００３６】
また、上記画分は、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２であることが好ましい（性質（４））。なかでも、ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．６〜２．２であることがより好ましく、１．６〜２．０であることが最も好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーによる、分子量分散度の測定方法については、実施例を参照されたい。
【００３７】
また、上記画分は、極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）であることが好ましい（性質（５））。なかでも極限粘度が０．４〜０．５（dl/g）であるものが好ましく、０．３５〜０．４５（dl/g）であることがさらに好ましく、０．３８〜０．４２（dl/g）であることが最も好ましい。極限粘度の具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。
【００３８】
また、上記画分は、二糖分析の結果が以下の通りのものであることが好ましい（性質（６））。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
なお、本出願書類におけるΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉＳD、ΔＤｉ−ｄｉＳE、ΔＤｉ−ｔｒｉＳは、Analytical Biochemistry 177, p327-332(1989)の定義に従って表記した。
なお、本出願書類における「二糖分析」の用語は、ＣＳまたはその塩に作用して不飽和二糖を生成させる酵素（リアーゼ）でＣＳ又はその塩を酵素処理し、該ＣＳまたはその塩の構成二糖を反映して生成する不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、同定及び定量することを意味する。より具体的な二糖分析の方法は、実施例を参照されたい。
【００３９】
また、上記画分は、塩化物含量が０．１４２％以下であるものが好ましい（性質（７））。
また、上記画分は、無機硫酸塩含量が０．２４％以下であるものが好ましい（性質（８））。
また、上記画分は、重金属含量が２０ｐｐｍ以下であるものが好ましい（性質（９））。
また、上記画分は、ヒ素含量が２ｐｐｍ以下であるものが好ましい（性質（１０））。
また、上記画分は、窒素含量が２〜４％であるものが好ましい（性質（１１））。なかでも窒素含量が２〜３％であるものが好ましく、２．５〜２．７％であるものがより好ましい。
上記塩化物含量、無機硫酸塩含量、重金属含量、ヒ素含量及び窒素含量の具体的な測定方法は、実施例を参照されたい。
【００４０】
さらに上記画分は、上記画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときのｐＨが６〜７であるものが好ましい（性質（１２））。なかでも上記画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときのｐＨが６．５〜７であることがより好ましい。ここで、「画分１ｇ」とは、乾燥状態の画分１ｇを意味する。ｐＨは、公知の方法により測定することが出来る。具体的には、実施例を参照されたい。
【００４１】
また、上記画分は、旋光度が−１５〜−１８°であるものが好ましい（性質（１３））。なかでも旋光度が−１５．５〜−１７．５°であるものがより好ましく、−１６．０〜−１７．０°であるものが最も好ましい。旋光度は、公知の方法により測定することが出来る。より具体的には、実施例を参照されたい。
【００４２】
また、上記画分は、上記画分１ｇを１００ｍｌの水溶液としたときに、無色澄明であるものが好ましい（性質（１４））。ここで、「画分１ｇ」とは、乾燥状態の画分１ｇを意味する。
【００４３】
また、上記画分は、粉末状態としたときに、白色であるものが好ましい（性質（１５））。
【００４４】
また、上記画分は、乾燥減量が１〜７％であるものが好ましい（性質（１６））。なか
でも乾燥減量が３〜６％であるものがより好ましく、４〜５．５％であるものが最も好ましい。
【００４５】
また、上記画分は、強熱残分が２３〜３１％であるものが好ましい（性質（１７））。なかでも強熱残分が２８〜３０％であるものがより好ましい。上記乾燥減量及び強熱残分の具体的な測定方法については、実施例を参照されたい。
【００４６】
本発明においては、上記の画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させることによって、ＣＳ・鉄コロイド製剤を製造する。より具体的には、例えばＣＳナトリウムの３〜１０％水溶液に、１ｍｌ中に鉄１０〜１００ｍｇを含有する第二鉄塩を攪拌下常温で滴下した後に、アルカリ金属水酸化物の水溶液を滴下し、ｐＨを好ましくは７〜１０に、より好ましくは８．５〜９．５に、最も好ましくは９に調整することにより、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤を製造することができる。
ここで、第二鉄塩としては、塩化第二鉄、クエン酸第二鉄、ピロリン酸第二鉄、グルコン酸第二鉄、硫酸第二鉄などが挙げられるが、なかでも塩化第二鉄が好ましい。
アルカリ金属水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどが挙げられるが、なかでも水酸化ナトリウムが好ましい。
【００４７】
上記画分に第二鉄塩を接触させる際の条件は特に制限されないが、例えば、上記画分の溶液に水酸化ナトリウムに例示されるアルカリ金属水酸化物の固体または溶液（好ましくは溶液）を加えて溶液のｐＨを好ましくはｐＨ８〜９のアルカリ性にし、そこに固体または溶液（好ましくは溶液）の第二鉄塩を滴下することにより接触させることが好ましい。さらに上記の滴下は、水酸化ナトリウムに例示されるアルカリ金属水酸化物を用いて、常にｐＨが８〜９となるように調整しながら行うことが好ましい。また第二鉄塩の接触後の溶液は、水酸化ナトリウムに例示されるアルカリ金属水酸化物を用いてｐＨ８．５〜９．５、より好ましくはｐＨ９に調整することが好ましい。
【００４８】
上記のようにして得られたＣＳ・鉄コロイド溶液は、優れたろ過性及び粒子径特性を有しており、好ましくは以下の（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する。
（ａ）光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が、６０〜３００ｎｍである。
（ｂ）該製剤１リットルを、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）に対してろ過に供した後に、ポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）に対してろ過に供したときに、全量が通過可能である。
【００４９】
本発明の製造方法によれば、例えば光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が約２００ｎｍ又は２５０ｎｍである場合のように、比較的大きい粒子径を有するコンドロイチン硫酸・鉄コロイドを含有するＣＳ・鉄コロイド製剤であっても、上記（ｂ）のような高いろ過性を有する製剤とすることも可能である。より具体的には、後述する実施例、特に、表４中の調整後の平均粒子径を参照されたい。
【００５０】
上記のようにして得られるＣＳ・鉄コロイド溶液は、必要に応じて希釈、濃縮、溶液の置換、滅菌、ろ過等の処理を行った後にＣＳ・鉄コロイド製剤として用いてもよい。また、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、ＣＳ・鉄コロイド以外の成分をさらに含有していても良い。そのような成分としては、医薬、医薬原料、試薬、試薬原料、化粧品、化粧品原料、食品添加物、薬学的に許容される担体（例えば、緩衝剤や安定化剤など。）等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、これが含有する鉄の量によって限定されるべきものではないが、例えば１ｍｌ中に３〜５ｍｇの鉄を含有することが好ましく、約４ｍｇの鉄を含有することがより好ましい。
【００５２】
本発明の製造方法によって得られたＣＳ・鉄コロイド製剤の剤型は特に制限されないが、注射剤として特に好適に使用することができる。
【００５３】
本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、その投与方法、投与量によって限定されるべきものではないが、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤を例えば鉄欠乏性貧血の予防、緩和、治療等の目的で、あるいは増血又は貯蔵鉄の不足を補う目的で用いる場合、患者のヘモグロビン量と体重から公知の方法により必要鉄量を算出し、適当な量のＣＳ・鉄コロイド製剤を投与することができ。より具体的には、例えば鉄として一日２０〜４０ｍｇとなるように投与すること、すなわち、例えば本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤が、１ｍｌ中に４ｍｇの鉄を含有する場合、一日５〜１０ｍｌの本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤を静脈注射することにより投与することが好ましい。上記の投与量は患者の年齢、症状等によっても適宜調整することができる。
なお、本発明のＣＳ・鉄コロイド製剤は、鉄欠乏性貧血の治療に有用であり、ラットによる静脈内反復投与試験により安全性が確認されている。
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に限定されない。
【実施例１】
【００５５】
ＣＳナトリウム画分の調製
サメ軟骨を粉砕し、これにタンパク質分解酵素（エスペラーゼ；ノボザイムズ社製）を作用させることにより、ＣＳナトリウム１３７．６ｋｇを含有する溶液を得た。この溶液を約１４００Lに調整し、約10.4万ユニットのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）を加え、混合した後、３７℃にて約６時間作用させた。得られた反応後の溶液に対して、アルコール沈殿による分画を行い、続いて活性炭処理を行った。得られた画分の脱塩を行い、低分子化した精製ＣＳナトリウム９５．３ｋｇを含有する溶液１５２０リットル（濃度６２．７ｍｇ/ｍｌ）を得た。このようにして得られたＣＳナトリウム溶液を、約６０℃にて減圧乾燥し、ＣＳナトリウム（ロット１）を得た。
上記精製ステップにおける各種パラメータは、表１（ロット１）にまとめた。また、上記の精製ステップにおける各種パラメータを、表１（ロット２〜５）の通りに変えて、精製を行い、ＣＳナトリウム（ロット２〜５）を得た。ロット１〜５において、乾燥後のＣＳナトリウムは白色であり、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。
【００５６】
【表１】
【実施例２】
【００５７】
ＣＳナトリウム画分の分析
実施例１で得られたＣＳナトリウム（ロット１〜５）を、下記の方法により分析した。（a）重量平均分子量
下記の条件で測定を行い、分子量既知の標準試料と溶出時間を比較することにより、重量平均分子量を算出した。
測定試料：実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム 5 mgを精製水に溶解し、10 mlにメスアップした後、0.22 μmのフィルターで濾過した。測定においては、得られた上記測定試料の内、100 μlをインジェクションした。
カラム：TSK-GEL（東ソー製、TSKgel G4000PWXLとTSKgel G3000PWXLを連結して使用した。）
バッファー：0.2 mol/L NaCl溶液（0.22 μmのフィルターで濾過したもの。）
流速：0.5 ml/min
測定時間：５５分
測定温度：40 ℃
検出器：ＲＩ（示差屈折計）
標準試料：分子量52200、31400、20000、10200、6570のＣＳナトリウム（生化学工業株式会社製）を使用した。
解析ソフトウェア：Waters ミレニアム32 Ver 3.01（日本ウォーターズ株式会社）
（b）分子量分散度（MW/MN）
（a）と同様の条件で測定した数平均分子量（MN）に対する重量平均分子量（MW）の割合を、上記（a）記載の解析ソフトウェアを用いて自動計算し、求めた。
（c）硫黄含量
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウムについて、堀場硫黄分析装置（EMIA-120）を使用し、硫黄含量を測定した（３回の測定により得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとにそれぞれ無水物換算し、得られた値の平均値を測定結果とした）。
（d）タンパク質含量
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム（濃度既知）に対し、標準物質としてウシ血清アルブミンを用い、ローリー法によりタンパク質含量を測定した（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（e）極限粘度
第十四改正日本薬局方（４５．粘度測定法 第１法 毛細管粘度計法（p.66〜67））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（f）塩化物含量
日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（２）塩化物（p.296））に記載の方法に従って測定を行った。測定試料としては、実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 0.1 gを使用した（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（g）無機硫酸塩含量
日本薬局方外医薬品規格２００２（コンドロイチン硫酸ナトリウム、純度試験（３）硫酸塩（p.296））に記載の方法に従って測定を行った。（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（h）重金属含量
第十四改正日本薬局方（２６．重金属試験法 (2)第２法（p.36〜37））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（i）ヒ素含量
第十四改正日本薬局方（５１．ヒ素試験法 (3)第３法（p.78〜79））に記載の方法に従っ
て、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（j）窒素含量
第十四改正日本薬局方（３６．窒素定量法（セミミクロケルダール法）（p.53〜54））に記載の方法に従って、測定を行った（得られた実測値を、乾燥減量（下記(m)参照）をもとに無水物換算し、測定結果とした）。
（k）ｐＨ
第十四改正日本薬局方（４８．ｐＨ測定法（p.69〜71））に記載の方法に従って、測定を行った。試料溶液としては、実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 1gを水に溶解し、100 ccとした溶液を使用した。
（l）旋光度
実施例１で得られた乾燥後のＣＳナトリウム 0.5 g（(m)乾燥減量記載の方法により得た乾燥減量をもとに無水物換算した値）を水 50 mLに溶解し、100 mmセルにて測定した。
上記測定は、第十四改正日本薬局方（３５．旋光度測定法（p.53））に記載の方法に従って行った。
（m）乾燥減量
第十四改正日本薬局方（１０．乾燥減量試験法（p.25〜26））に記載の方法に従って、測定を行った（0.1 g、減圧 0.67 kpa以下、五酸化リン、６０℃、４時間）。
（n）強熱残分
第十四改正日本薬局方（１６．強熱残分試験法（p.27〜28））に記載の方法に従って、測定を行った（1g、乾燥後）。
（a）〜（n）の分析結果を、表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
(o) 二糖分析
（測定試料の調製）
実施例１で得られた、乾燥後のＣＳナトリウム 100 mgを精製水に溶解させ、10 mlにメスアップした。氷浴中において、コンドロイチナーゼＡＢＣ 10 ユニット/50 μlに試料溶液 100 μlを添加し、攪拌した。更にTris-HCl緩衝液（pH 7.9）200 μlを添加し、攪拌した。これを３７℃において１時間インキュベーションした後、沸騰浴中において３０秒間加熱処理し、酵素を失活させた。精製水 650 μlを添加し、攪拌した後、0.22 μmのフィルターで濾過した。測定においては、上記試料10 μlをインジェクションした。
（測定条件）
カラム：YMC-GEL PA-120-S5（株式会社ワイエムシィ）
標準試料：不飽和ＣＳナトリウム ＨＰＬＣ用（ΔＤｉ−０Ｓ、ΔＤｉ−６Ｓ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉ−ｄｉＳD、ΔＤｉ−ｄｉＳE、ΔＤｉ−ｔｒｉＳ）（生化学工業株式会社）バッファー；水と0.8 mol/L NaH2PO4水溶液の濃度勾配により行った（水と0.8 mol/L NaH2PO4水溶液の割合は、４５分の間に、９８：２→２５：７５に変化させた）。
流速：1.0 ml/min
測定温度：４０℃
検出器：ＵＶ（230 nm）
各二糖単位の含量（％）は、その溶出パターンの積分値（面積）を、濃度既知の上記標準試料の溶出パターンの積分値（面積）と比較することにより求めた。
二糖分析結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
【００６１】
以上の実施例によって、ＣＳナトリウムをＣＳ分解酵素を作用させて低分子化することにより、重量平均分子量（ゲル濾過クロマトグラフィー）が、５，０００〜２０，０００の範囲に均一に低分子化され、硫黄含量が６．５〜８％に保持され、且つ高純度に精製された、非常に高品質なＣＳナトリウムの画分が得られることが明らかになった。
【実施例３】
【００６２】
ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製
実施例１で調製したＣＳナトリウムを材料として用い、ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製を行った。
ＣＳナトリウムの４重量％水溶液５００ｍｌを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ８〜９に調整した。水酸化ナトリウム水溶液を用いて水溶液のｐＨを８〜９の間に保ちつつ、上記調整後のＣＳナトリウム水溶液に、１ｍｌ中に鉄 約20mgを含有する塩化第二鉄液２００ｍｌを攪拌下常温で滴下した。上記滴下後の溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いて９に調整し、蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌに調整し、ＣＳ・鉄コロイド製剤を得た。本品は、１ｍｌ中に鉄４mgを含有する。
得られた製剤各１リットルを、それぞれステンレス製フィルターホルダー（ミリポア社）を用い、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、プレフィルターとしてポ
リエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（アドバンテック社、品名：Y008A124A、孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）を用いてろ過に供した後に、ファイナルフィルターとしてポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（ミリポア社、品名：デュラポアメンブレンフィルター、孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）を用いてろ過に供したとき、全量が通過可能であった。さらにろ過後の各製剤を、耐圧瓶に入れてオートクレーブ（102℃、90分）により滅菌した。
各ＣＳナトリウム画分を材料として用いた場合に得られた各製剤の平均粒子径を、光散乱法濃厚系粒径アナライザー：FPAR-1000（大塚電子株式会社）によって測定した。結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
*1 実施例中、蒸留水を加えて全量を１０００ｍｌに調整し、ＣＳ・鉄コロイド製剤を得た後に測定した平均粒子径を示す。
【００６４】
［参考例１］
塩酸を用いたＣＳナトリウムの画分の調製及び分析
以下、塩酸を用いて低分子化を行う場合について、参考例を示す。
コンドロイチナーゼＡＣＩＩに代えて、塩酸を用いてＣＳナトリウムを低分子化するという点以外は、上記実施例１と基本的に同様の方法によって、ＣＳナトリウム画分の調製を行った。塩酸による低分子化を経て得られたＣＳナトリウム溶液を、約６０℃にて減圧乾燥した。乾燥後のＣＳナトリウムは白色であった。また、乾燥後のＣＳナトリウム1.0 gに水を加えて100 mｌとしたとき、無色澄明であった。
実施例２に記載の（a）〜（n）の分析を行った。結果を表２（ロット６）に示す。
【００６５】
［参考例２］
ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製
参考例１で調製したＣＳナトリウムを材料として用いることの他、実施例３と同様の方法により、ＣＳ・鉄コロイド製剤の調製を行った。
得られた製剤１リットルを、実施例３と同様の方法によりろ過に供したところ、２００ｍｌが通過可能であり、残りの８００ｍｌは通過しなかった。また、調製した各製剤の平均粒子径を、実施例３と同様の方法によって測定した。結果を表４（ロット６）に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸又はその塩にコンドロイチン硫酸分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤の製造方法。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸分解酵素がリアーゼである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記画分が、下記（１）〜（３）の性質を有するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法；
（１）硫黄含量が６．５〜８％である。
（２）ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
（３）ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
【請求項５】
前記画分が、さらに、下記（４）の性質を有するものである、請求項４に記載の製造方法；
（４）ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２である。
【請求項６】
前記画分が、さらに、下記（５）の性質を有するものである、請求項４または５に記載の製造方法；
（５）極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）である。
【請求項７】
前記画分が、さらに、下記（６）の性質を有するものである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の製造方法；
（６）：二糖分析の結果が以下の通りである。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
【請求項８】
前記画分が、さらに、下記（７）〜（１１）の性質を有するものである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の製造方法；
（７）塩化物含量が０．１４２％以下である。
（８）無機硫酸塩含量が０．２４％以下である。
（９）重金属含量が２０ｐｐｍ以下である。
（１０）ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である。
（１１）窒素含量が２〜４％である。
【請求項９】
前記画分が、さらに、下記性質（１２）を有するものである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の製造方法；
（１２）前記画分１gを１００mlの水溶液としたときのｐＨが６〜７である。
【請求項１０】
前記画分が、さらに、下記（１３）〜（１７）の性質を有するものである、請求項４〜９のいずれか一項に記載の製造方法；
（１３）旋光度が−１５°〜−１８°である。
（１４）本画分１gを１００mlの水溶液としたときに、無色澄明である。
（１５）粉末状態としたときに、白色である。
（１６）乾燥減量が１〜７％である。
（１７）強熱残分が２３〜３１％である。
【請求項１１】
コンドロイチン硫酸又はその塩がサメ由来である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を、ｐＨ８〜９の溶液中で接触させることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記画分に第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程によって得られた画分のｐＨを７〜１０に調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤。
【請求項１５】
下記（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する、請求項１４に記載のコンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤；
（ａ）光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が、６０〜３００ｎｍである。
（ｂ）該製剤１リットルを、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）に対してろ過に供した後に、ポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）に対してろ過に供したときに、全量が通過可能である。
【請求項１６】
注射液である、請求項１４または１５に記載のコンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤。
【請求項１】
コンドロイチン硫酸又はその塩にコンドロイチン硫酸分解酵素を作用させることによって得られる画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤の製造方法。
【請求項２】
コンドロイチン硫酸分解酵素がリアーゼである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
コンドロイチン硫酸分解酵素が、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、又はコンドロイチナーゼＡＢＣである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記画分が、下記（１）〜（３）の性質を有するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法；
（１）硫黄含量が６．５〜８％である。
（２）ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量が、５，０００〜２０，０００である。
（３）ローリー法によって測定したタンパク質含量が、０．１％以下である。
【請求項５】
前記画分が、さらに、下記（４）の性質を有するものである、請求項４に記載の製造方法；
（４）ゲル濾過クロマトグラフィーで測定した分子量分散度が、１．５〜２．２である。
【請求項６】
前記画分が、さらに、下記（５）の性質を有するものである、請求項４または５に記載の製造方法；
（５）極限粘度が０．３〜０．５（dl/g）である。
【請求項７】
前記画分が、さらに、下記（６）の性質を有するものである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の製造方法；
（６）：二糖分析の結果が以下の通りである。
ΔＤｉ−０Ｓ：１．８％以上３．５％未満
ΔＤｉ−６Ｓ：４０％以上５０％未満
ΔＤｉ−４Ｓ：２５％以上３３％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳD：１５％以上２２％未満
ΔＤｉ−ｄｉＳE：３％以上４％未満
ΔＤｉ−ｔｒｉＳ：０％以上４％未満
【請求項８】
前記画分が、さらに、下記（７）〜（１１）の性質を有するものである、請求項４〜７のいずれか一項に記載の製造方法；
（７）塩化物含量が０．１４２％以下である。
（８）無機硫酸塩含量が０．２４％以下である。
（９）重金属含量が２０ｐｐｍ以下である。
（１０）ヒ素含量が２ｐｐｍ以下である。
（１１）窒素含量が２〜４％である。
【請求項９】
前記画分が、さらに、下記性質（１２）を有するものである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の製造方法；
（１２）前記画分１gを１００mlの水溶液としたときのｐＨが６〜７である。
【請求項１０】
前記画分が、さらに、下記（１３）〜（１７）の性質を有するものである、請求項４〜９のいずれか一項に記載の製造方法；
（１３）旋光度が−１５°〜−１８°である。
（１４）本画分１gを１００mlの水溶液としたときに、無色澄明である。
（１５）粉末状態としたときに、白色である。
（１６）乾燥減量が１〜７％である。
（１７）強熱残分が２３〜３１％である。
【請求項１１】
コンドロイチン硫酸又はその塩がサメ由来である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記画分に、第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を、ｐＨ８〜９の溶液中で接触させることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記画分に第二鉄塩及びアルカリ金属水酸化物を接触させる工程によって得られた画分のｐＨを７〜１０に調整する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製造方法によって製造される、コンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤。
【請求項１５】
下記（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１つの性質を有する、請求項１４に記載のコンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤；
（ａ）光散乱法によって測定されるコンドロイチン硫酸・鉄コロイドの平均粒子径が、６０〜３００ｎｍである。
（ｂ）該製剤１リットルを、圧力ゲージ １．０〜１．５ｋｇｆ／ｃｍ2において、ポリエステル不織布にセルロースアセテートをコートした多孔質フィルター（孔径０．８μｍ、直径１２４ｍｍ）に対してろ過に供した後に、ポリビニリデンフロライド多孔質フィルター（孔径０．２２μｍ、直径１４２ｍｍ）に対してろ過に供したときに、全量が通過可能である。
【請求項１６】
注射液である、請求項１４または１５に記載のコンドロイチン硫酸・鉄コロイド製剤。
【公開番号】特開２００８−１６１４（Ｐ２００８−１６１４Ａ）
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１７０６７９（Ｐ２００６−１７０６７９）
【出願日】平成１８年６月２０日（２００６．６．２０）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２０日（２００６．６．２０）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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